WO2019151516A1 - 細胞内でのａｔｐ産生を賦活するための補酵素因子の使用 - Google Patents

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朝文 永松
紀生 赤池
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to the use of a coenzyme factor for activating ATP production in a cell, and more particularly to the use of a coenzyme factor that assists an oxidoreductase involved in ATP production.
  • Non-patent Document 1 Research is also progressing on the relationship between the sirtuin gene and mitochondria, and when the sirtuin gene is activated, the amount of mitochondria that are organelles in the cell increases, and it is further activated to prevent dementia, arteriosclerosis, hearing loss prevention, It is considered that not only the burning of fat, cell repair, and removal of active oxygen are promoted to suppress the expression of aging factors, but also the effect of healing mitochondrial disorders can be obtained (Non-patent Document 2).
  • NMN Neurotinamide mononucleotide
  • SIRT2 one of the long-lived protein sirtuin genes discovered by Prof. Imai et al., Is a heterochromatin component that terminates transcription with telomere and ribosomal DNA, and it has become clear that it is a NAD-dependent histone deacetylase. It was. This enzyme restores the binding of DNA to histones weakened by acetylation by deacetylation, enhances the wrapping of DNA around histones, and suppresses transcription, which is thought to be related to longevity. (Non-Patent Document 4).
  • NAD + Natural Acidamide Adenine Dinucleotide
  • NMN + NAD + is an intermediate substance in NAD + synthesis.
  • Non-patent Document 5 has been reported to be involved in the anti-aging action.
  • NAD + is one of the most important molecules of energy production involved in the first stage of oxidative phosphorylation in mitochondria and the oxidation reaction in the TCA cycle.
  • SIRT1 which is one of long-lived protein sirtuin genes, is known to be mainly involved in the repair and regeneration of damaged mitochondria while expressed in the nucleus. Furthermore, it has been clarified that SIRT3, SIRT4, and SIRT5 are mainly expressed in mitochondria among the seven sirtuin genes of mammals that have been discovered so far (Non-patent Documents 7 and 8). Summing up these results, it is considered that various sirtuin genes are involved in the life extension action through activation of mitochondrial function (Non-patent Document 9).
  • NMN a precursor compound of NAD + (nicotine, amide, adenine, dinucleotide)
  • NAD + oxidative phosphorylation by the electron transfer system in mitochondria and ATP (adenosine triphosphate) which is a life-sustaining energy source produced by the glycolytic system in the cytoplasmic substrate are reduced (Non-patent Document 10).
  • NADH Dihydro-nicotinamide adenine dinucleotide
  • FADH 2 Dihydro-flavin adenine dinucleotide
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NAD + nicotinamide mononucleotide
  • the primary source of FAD in eukaryotic metabolism is the cytoplasmic substrate on which mitochondrial citrate cycle and ⁇ -oxidation take place.
  • FAD functions as a coenzyme for succinate dehydrogenase that oxidizes succinic acid to fumaric acid, and in ⁇ -oxidation, it functions as a coenzyme for the enzyme reaction of acyl CoA dehydrogenase.
  • NMN and NAD + belonging to the redox (oxidation-reduction) system are easily decomposed in the metabolic system and are chemically unstable, and it is considered difficult to develop them as future medicines.
  • combines it will become expensive. Therefore, there is a strong demand for the development of chemicals that are sufficiently satisfactory as pharmaceuticals in that they have an excellent ATP production function activation action and exhibit excellent pharmacokinetics (absorbability in the body, transferability into the brain, etc.).
  • a 5-deazaflavin (pyrimido [4,5-b] quinoline-2,4 (3H, 10H) -dione) derivative having a unique chemical structure in which N at the 5-position of riboflavin is substituted with CH was introduced in 1970 It is the first compound synthesized as an analog.
  • derivatives of 5-deazaflavin those showing excellent anticancer activity and those having antiherpesvirus activity are known, and some are used as anticancer agents and antiherpesvirus agents (Patent Documents 1 to 5). ).
  • Non-patent Document 11 Catalytic function for the conversion reaction of alcohols to ketones and aldehydes accompanying the change in structure, conversion reaction of amines to imines (ketones), reduction of carbonyl compounds to alcohols, reduction of imines to amines and asymmetry Reductions and similarities with NAD + (nicotinamide nucleotide) have also been studied (Non-patent Document 11).
  • Various patent literatures have been published on mitochondrial function activators (Patent Literatures 6 to 8). However, there is no literature that focuses on the redox catalytic activity of this 5-deazaflavin derivative and applied to the mitochondrial function activation action.
  • 5-deazaflavin derivatives have redox catalytic activity, it is clear that they influence the ATP production function in mitochondrial oxidative phosphorylation.
  • 5 Deazafurabin skeleton is found in a redox reaction involving the coenzyme coenzyme F 420 methane fermentation (Coenzyme F 420), are also analogs of flavin. Its redox behavior is similar to NAD (P) + rather than flavin.
  • NAD (P) + One of the resonance limit formulas has a NAD (P) + structure built into the molecule, and the electron density (determined by molecular orbital calculation chemistry) is “flavin type NAD (P) + ”. Can be considered.
  • 5-deazaflavin has the same redox (redox) function as NAD + and FAD, and therefore activates ATP production in the cell and further directly or indirectly activates the sirtuin gene.
  • redox redox
  • 5-deazaflavin compounds with a specific structural formula are chemically very stable, can be synthesized at low cost, activate ATP production, and activate sirtuin genes that control mitochondrial functions As a result, the present invention has been completed.
  • An object of the present invention is to provide a 5-deazaflavin compound having a structural formula effective to activate ATP production in cells among various 5-deazaflavin derivatives.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems, prepared 5-deazaflavin derivative compounds having various different structural formulas as specimens, and used them to conduct various experiments in vitro. As a result, a compound having a structural formula that increases ATP production in cells was found.
  • the present inventors have replaced the nitrogen at the 5-position of the flavin skeleton of riboflavin (vitamin B 2 ), which is known as a growth factor and is a water-soluble vitamin, with a methylene group as an analog of NMN (see FIG. 17). Focused on deazaflavin. 5-Deazariboflavin antagonized riboflavin and showed potent anticoccidial activity. Recently, coenzyme F 420 (see Fig. 18) with a 5-deazaflavin skeleton was found from methanogens, and it plays an important role in the process of reducing carbon dioxide to methane and biosynthesis of antibiotics. I understand that.
  • the redox behavior of 5-deazaflavin is similar to NAD (P) + (see FIG. 19) rather than flavin.
  • One of the resonance limit formulas has a NAD (P) + structure built into the molecule, and the electron density (determined by molecular orbital calculation chemistry) is “flavin type NAD (P) + ”.
  • P the electron density (determined by molecular orbital calculation chemistry) is “flavin type NAD (P) + ”.
  • the 5-position of the 5-deazaflavin ring is very ⁇ -electron deficient (net charge net charge: +0.24)
  • the 4-position of nicotinamide nucleotide is similarly ⁇ -electron deficient (net charge: +0.210).
  • the 5-deazaflavin ring is considered to belong to both the NAD (+) and FAD (see FIG. 21) electron transport systems.
  • Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is an electron carrier used in all eukaryotes, many archaea, and eubacteria.
  • this 5-deazaflavin compound which has a redox function similar to NAD + and FAD, is chemically very stable and inexpensive compared to ⁇ -NMN, which is currently being studied for use in pharmaceuticals supplemented with NMN.
  • the inventors thought that they could be synthesized, activated NAD + , and also directly or indirectly activated mitochondrial longevity genes (SIRT1 and SIRT3). That is, the inventors have activated FOXO1, which is a target transcription factor of SIRT1, for the purpose of evaluating the activation of the longevity gene SIRT1, which is activated depending on NAD + and has already been revealed as an important gene for maintaining mitochondrial function. Screening evaluation of mRNA increase was performed by q-RT-PCR method using HCT116 cells with expression as an activity index.
  • the compound according to the present invention has the ability to activate SIRT1 at a lower dose as compared with ⁇ -NMN. Therefore, it can be expected that the compound according to the present invention directly activates NAD + and continuously produces ATP even under pathological conditions such as ischemia, and the effect is sustained and strong. Therefore, it is considered that the compound according to the present invention has sufficient requirements for development as a pharmaceutical product.
  • the chemical structure is functionally and electronically close to the combined structure of the core part of NAD + and FAD coenzyme, that is, a hybrid structure of nicotinamide and flavin, the side effect is expressed. I can guess that there will be almost none.
  • the structure of the compound according to the present invention has a higher redox potential and superior redox ability than NAD and FAD as coenzymes, as judged from the measured redox potential.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the compounds represented by the following formulas (I) to (IV) were identified as effective coenzyme factors for activating ATP production in cells according to the present invention.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or a phenyl group
  • R 2 represents an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group
  • R 3 and R 4 represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, a halogen atom, a hydroxyl group, Represents a nitro group, a cyano group, a lower alkoxy group, a phenyl-substituted lower alkoxy, a lower alkylamino group, a phenyl
  • R 1 and R 3 are substituted with a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or one of a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 2 is substituted with one of an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or a phenyl group substituted with one of a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 2 represents an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group, a phenyl group substituted with one of a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group, and a lower alkyl disubstituted phenyl group.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or a phenyl group substituted with one of a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 2 represents an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group, a phenyl group substituted with one of a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group, and a lower alkyl disubstituted phenyl group.
  • the coenzyme factor that activates ATP production provided by the present invention, it is possible to improve the functional decline of energy production in cells. Therefore, it is extremely useful as a prophylactic / therapeutic agent for Alzheimer's disease, Parkinson's disease, neurodegenerative diseases and depression associated with cerebral hemorrhage / infarction.
  • FIG. 1 shows the results of fluorescence measurement of the ATP concentration inside and outside the cell after adding specimen 1 to cultured cells of human-derived neuroblastoma (neuroblastoma) SH-SY5Y strain.
  • FIG. 2A is a diagram showing the result of fluorescence measurement by adding specimen 1 to a type of central nervous system glial cell, cultured astrocyte cells.
  • FIG. 2B is a diagram quantifying the measurement results in FIG. 2A.
  • FIG. 3 is a diagram showing a relative comparison with the case where the specimens 1 and 2 were added to cultured cells of human glioma U251 (Sig1-R transfected cells) and the intracellular ATP concentration was not added (Cont.). It is.
  • FIG. 1 shows the results of fluorescence measurement of the ATP concentration inside and outside the cell after adding specimen 1 to cultured cells of human-derived neuroblastoma (neuroblastoma) SH-SY5Y strain.
  • FIG. 2A is a diagram showing the result
  • FIG. 4 shows the hippocampal neuron (neuron) nerve axis after collecting hippocampal cultured cells from a young (day 0) ICR mouse brain, culturing the neurons in a culture dish, and adding the specimen 1 It is an immuno-staining image showing the extension, development, and branching of the cord (Axon).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of measuring the number of branches of the hippocampal nerve cell axon (Axon) by adding the specimen 1 in the same manner as in FIG.
  • FIG. 6 is an immunostained image showing the extension / development / branching of hippocampal neuronal dendrites (Dentrite) after addition of specimen 1 as in FIG.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) by adding specimen 1 as in FIG.
  • FIG. 8 is an immunostained image of a synapse in an autopsy specimen cultured as in FIG. 4 and immunostained for excitatory synapses on the 14th day.
  • FIG. 9 is a diagram in which the number of excitatory synapses on the 14th day was quantified after culturing in the same manner as in FIG.
  • FIG. 10 is an immunostained image of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) quantified 3 days later (day 14 of culture) after sample 1 was administered once to mature cultured hippocampal cells (day 11 of culture).
  • FIG. 11 is a diagram in which the number of branches of dendrites (Dendrite) was measured by immunostaining with the MAP2 antibody during the development period of the 14th day of culture, as in the case of FIG.
  • FIG. 12 shows that adult C57BL / 6N mice (10 to 17 weeks old, body weight 28 to 31 g) were administered physiological saline (control) and specimen 3 (10 ⁇ g / kg) intraperitoneally, and after 22 hours the cortex and cortex A brain thin slice (slice) specimen containing the hippocampus region was prepared, and 80 mM KCl (80 K) was added to the external solution to cause depolarization of the cell membrane, and in the cerebral cortical neurons (neuronal cells) generated by K + depolarization
  • FIG. 12 shows that adult C57BL / 6N mice (10 to 17 weeks old, body weight 28 to 31 g) were administered physiological saline (control) and specimen 3 (10 ⁇ g / kg) intraperitoneally, and after 22 hours the cortex and cortex A
  • FIG. 6 is a diagram in which the Ca 2+ concentration increase in mitochondria existing in the urine and the inhibitory effect by the specimen 3 are measured.
  • FIG. 13 is a diagram in which the increase in intramitochondrial Ca 2+ concentration due to K + depolarization of hippocampal neurons (neurons) and its inhibitory effect by specimen 3 were measured, as in FIG.
  • FIG. 14 shows that after making a small hole in the skull of a Wistar adult rat (200 to 230 g body weight) under inhalation anesthesia, the right brain striatum is filled with 0.24 U collagenase (in the control group, physiological saline, and in the bleeding group).
  • FIG. 15 shows that, in order to verify the brain cell protective effect of specimen 4 on intracerebral hemorrhage model rats, 100 ⁇ g / kg of specimen 4 was injected into a spot in the brain 1 hour after administration of collagenase, and the exercise footprint of the rat was quantitatively determined.
  • FIG. FIG. 16 is a diagram in which the daily change in the exercise distance and exercise speed of the rat with or without sample 4 administration was measured in the same manner as in FIG.
  • FIG. 17 shows the chemical structural formula of ⁇ -NMN.
  • FIG. 18 is a diagram showing the chemical structural formulas of coenzyme F 420.
  • FIG. 19 is a diagram for explaining the chemical structural formula of NAD (P) + and its redox reaction (Redox).
  • FIG. 20 is a graph showing electron densities obtained by molecular orbital calculation chemistry of 5-deazaflavin and NAD (P) + flavin ring.
  • FIG. 21 is a diagram for explaining the structural similarity with FAD as a comparison with NAD + .
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 5.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 6.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 7.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 8.
  • FIG. 26 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) with the addition of specimen 9.
  • FIG. 27 is a diagram showing the result of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) with the specimen 10 added.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) with the specimen 10 added.
  • FIG. 29 is a diagram showing the analysis result of intramitochondrial Ca 2+ in the brain specimen of a mouse subcutaneously administered with ⁇ -NMN 24 hours ago. Samples stained with the mitochondrial selective Ca 2+ indicator Xrhod-1 were exposed to 80K ACFS for 5 minutes—washing for 5 minutes was repeated three times.
  • a dose of ⁇ -NMN was administered subcutaneously, and whole brain slices were prepared 24 hours later and stained with a mitochondrial-specific Ca 2+ indicator Xrhod-1. From the red (> 600 nm) fluorescence image upon excitation at 580 nm, the intramitochondrial Ca 2+ increase obtained by three 80K ACSF stimulations was measured over time.
  • FIG. 30 is a diagram showing the analysis result of intra-mitochondrial Ca 2+ in the brain specimen of a mouse to which specimen 1 (TND1128) was subcutaneously administered 24 hours ago. The specimen stained with the mitochondrial selective Ca 2+ indicator Xrhod-1 was repeatedly exposed to 80K ACFS for 5 minutes—washing for 5 minutes three times as in FIG.
  • FIG. 31 is a graph showing the dose-response relationship of the protective effect on the mitochondrial Ca 2+ concentration when ⁇ -NMN is exposed to 80K ACSF.
  • the data in FIG. 29 were quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • CX cerebral cortex
  • CA1 hippocampus
  • FIG. 32 is a graph showing the amount-response relationship of the protective effect on the mitochondrial Ca 2+ concentration when the specimen 1 (TND1128) is exposed to 80K ACSF.
  • the data in FIG. 29 were quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • FIG. 33 is a diagram showing the analysis results of cytoplasmic Ca 2+ in a brain specimen of a mouse subcutaneously administered with ⁇ -NMN 24 hours ago.
  • Each dose of ⁇ -NMN was administered subcutaneously, and 24 hours later, whole brain slice specimens were prepared, and the brain slice specimens were stained with Ca 2+ indicator Fura-4F that remained in the cytoplasm.
  • the ratio of the fluorescence intensity (F360 and F380) of blue-green color (> 500 nm) when excitation light of 360 nm and 380 nm is given from this brain specimen is obtained over time every 10 seconds, and is obtained by three 80K-ACSF stimulations. Time course of cytosolic Ca 2+ increase.
  • FIG. 34 is a view showing the analysis results of cytoplasmic Ca 2+ in a brain specimen of a mouse subcutaneously administered with Specimen 1 (TND1128) 24 hours ago. The specimen stained with cytoplasm-selective Ca 2+ indicator Fura-4F was subjected to 3 times of 5 minutes 80K ACFS exposure and 5 minutes washing operation as in FIG.
  • FIG. 35 is a graph showing a dose-response relationship of protective effect on cytoplasmic Ca 2+ concentration when ⁇ -NMN is exposed to 80K ACSF.
  • the data in FIG. 33 was quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • A ⁇ relative to the amount of Ca 2+ uptake in cytoplasm in the cerebral cortex (CTX) (white) and hippocampus (CA1) (black) over the entire 80K ACSF three consecutive exposures.
  • action of -NMN B 80K ACSF exposure in the cerebral cortex, the dose-response relationship of Ca 2+ uptake in the cytoplasm in each time
  • C 80K ACSF exposure in the hippocampus, the dose-response relationship of Ca 2+ uptake in the cytoplasm in each time
  • FIG. 36 is a graph showing the amount-response relationship of the protective effect on the cytosolic Ca 2+ concentration when the specimen 1 (TND1128) is exposed to 80K ACSF.
  • the data of FIG. 34 were quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • CTX cerebral cortex
  • CA1 hippocampus
  • FIG. 37 is a diagram illustrating a method for quantifying the amount of Ca 2+ increase in mitochondria or cytoplasm when exposed to 80K for three consecutive times.
  • the 5-deazaflavin compounds (I-1 to I-118) (3) represented by the general formula I can be synthesized by the production methods described in known literatures (1 to 14).
  • most derivatives can be synthesized by the general production method described in Document (1) described in (Production Method A). That is, 6-N-substituted-aminouracils (1) and appropriate o-halogenobenzaldehyde (2) are heated to reflux in dimethylformamide (DMF). The heating time is suitably 3-7 hours.
  • the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the residue is recrystallized from an appropriate solvent (alcohol, dioxane, DMF, etc.) to obtain the corresponding 5-deazaflavin (3).
  • the pyridodipyrimidine compounds (II) (II-1 to II-32) (5) represented by the general formula II can be synthesized by the production methods described in known literatures (15 to 19).
  • most derivatives can be synthesized by the general production method described in Document (15) described in (Production Method B). That is, 6-N-substituted-aminouracils (1) and a suitable 3-substituted-6-chlorouracil-5-carbaldehyde (4) are heated to reflux in dimethylformamide or acetic acid. The heating time is suitably 2 to 5 hours.
  • the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the residue is recrystallized with a suitable solvent (alcohol, acetic acid, DMF, etc.) to obtain the corresponding pyridodipyrimidine (5).
  • the deazaflavinotestosterone compounds (III) (III-1 to III-2) (7) represented by the general formula III can be synthesized by the production method described in the known literature (20, 21).
  • the unknown compounds (III-3 to III-23) can also be synthesized by the same method. That is, 6-N-monosubstituted-aminouracils (1) and 2-hydroxymethylene testosterone (6) were added to diphenyl ether, and p-toluenesulfonic acid was added to the mixture, and then at 180 ° C. in an argon atmosphere. Stir for 30 to 60 minutes under heating. After the reaction, the reaction product is purified by column chromatography. This reaction can also be synthesized by heating under pressure for several hours in dioxane.
  • Tables 5 and 6 show the instrumental analysis values of the new compounds (III-3 to III-23).
  • the pyridodipyrimidine compounds (IV) (IV-1 to IV-26) (9) represented by the general formula IV can be synthesized by the production method described in the known literature (22) (Production method D). That is, p-toluenesulfonic acid, 3-substituted-6-monosubstituted aminouracil (1) and 2-hydroxymethylenecholest-4-en-3-one (8) are added to diphenyl ether, and the mixture is heated at 180 ° C. in a nitrogen atmosphere. Heat and stir for 45 minutes. After the reaction, this is separated and purified by column chromatography (Fuji Silysia 230-400mesh; eluent: ethyl acetate) to obtain powder crystals.
  • Example 1 Specimen 1 was added to cultured cells of human-derived neuroblastoma (neuroblastoma) SH-SY5Y strain, and ATP concentrations inside and outside the cells were measured by fluorescence. The result is shown in FIG. In the cells, an increase in ATP production (increase in fluorescence intensity) is observed from 5 hours after the addition of specimen 1 (1 ⁇ M), and the action disappears after 12 hours. There is no change in the morphology of the cultured cells due to the specimen treatment. Even outside the cells, an increase in ATP production was observed from immediately after the addition of specimen 1 (1 ⁇ M) to 5 hours later, and the ATP concentration increased. This is probably because ATP increased in the cell flowed out of the cell.
  • FIG. 2A and FIG. 2B show the results of fluorescence measurement of specimen 1 added to cultured astrocyte cells, a type of central nervous system glial cells.
  • the amount of ATP in glial cells significantly increased after 12 hours and 24 hours when Sample 1 was administered at 1 ⁇ M, and the same trend was also observed extracellularly.
  • Example 3 Samples 1 and 2 were added to cultured cells of human glioma U251 (Sig1-R transfected cells), respectively, and compared with the case where the intracellular ATP concentration after addition was not added (Cont.). As a result, it was verified that sample 1 and sample 2 significantly increased the amount of ATP produced by human glioma U251 cells as shown in FIG. Specimen 2 with high fat solubility is more effective than Specimen 1. The fluorescence measurement was performed 6 hours after administration of the specimen.
  • Examples 1 to 3 are experiments on brain neurons (neurons), but brain neurons (neurons) require oxygen (O 2 ) and glucose. These two substances are first taken up into glia (astrocytes) from the blood and then transmitted from glia to neurons. The same applies to the specimen. Therefore, an increase in the amount of ATP in glia due to the specimen indicates that the function of glia is directly promoted and suggests that neurons are indirectly activated.
  • Example 4 Hippocampal cultured cells were collected from young (day 0) ICR mouse brains, and neurons were cultured in a culture dish. Specimen 1 is added once to cells in early development (culture day 1), and after 3 days (culture day 4), hippocampal neurons (neurons) nerve axons (Axon), dendrites (Dendrite) and development The number of synapses to be quantified. Sample 1 (0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1.0 ⁇ M) was added only once on the first day of culture. Three days after the addition (4th day of culture), Axon and Dendrite were immunostained with tau antibody and MAP2 antibody, respectively, and morphology observation was performed.
  • FIG. 4 shows an immunostained image of hippocampal nerve cell axon (Axon).
  • the axon was immunostained with the tau antibody on the 4th day of culture.
  • the left shows the Control (control group), and the right shows the sample-treated nerve cells to which the sample 1 (1 ⁇ M) was added only once on the first day of culture.
  • FIG. 5 shows the number of branches of hippocampal nerve cell axon (Axon).
  • the number of axon branches was quantified with the tau antibody on the 4th day of culture.
  • concentric circles (not shown) were drawn around the cell body at intervals of 10 ⁇ m, and the number of axons crossing the circles was measured.
  • 4 and 5 show that specimen 1 increases the axon extension / development and the number of branches in a concentration-dependent manner. It should be noted that the maximum drug efficacy was almost the same at the specimen concentrations of 0.3 ⁇ M and 1.0 ⁇ M.
  • FIG. 6 shows an immunostained image of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite).
  • Dendrite hippocampal neuronal dendrites
  • FIG. 7 shows the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite). Immunostaining was performed with the MAP2 antibody on the fourth day of culture, and the number of branches of dendrites was quantified. In the experiment, concentric circles (not shown) were drawn at intervals of 10 ⁇ m around the cell body, and the number of dendrites intersecting the circles was measured. From FIG. 6 and FIG. 7, it was shown that the specimen 1 increased the dendrite extension and the number of branches in a concentration-dependent manner. The specimen concentrations of 0.3 ⁇ M and 1.0 ⁇ M showed almost the same maximum efficacy. Next, excitatory synapses on the 14th day of culture were immunostained using VGLUT1 antibody, and the number of synapses was quantified.
  • FIG. 8 shows an immunostained image of synapse in an autopsy specimen.
  • the left is Control (control group)
  • the right is sample 1 (1 ⁇ M) added once on the first day of culture, and the 14th day of culture.
  • the neuron which immunostained excitatory synapse with VGLUT1 antibody is shown.
  • FIG. 9 is a diagram in which an increase in excitatory synapses projected on hippocampal neurons is measured.
  • the brain has two synapses of glutamatergic and GABAergic that quickly transmit nerve excitement and suppression, but FIG. 9 is immunostained with VGLUT1 antibody on the 14th day of culture to determine the number of excitatory synapses. Quantified. From FIG. 8 and FIG. 9, it was shown that Sample 1 significantly increased the number of excitatory synapses to the maximum value by the addition of 0.3 ⁇ M.
  • Example 5 In the same manner as in Example 4, hippocampal cultured cells were collected from young (0-day-old) ICR mouse brain and cultured on neurons in a culture dish. Sample 1 was administered once to mature cultured hippocampal cells (cultured day 11), and after 3 days (cultured day 14), hippocampal neurons (neurons) nerve axons (Axon), dendrites (Dendrite) was observed. Since the axons on the 14th day of culture were markedly extended and crossed between axons, and the number of axons could not be determined, only the morphology of dendrites was observed.
  • FIG. 10 shows immunostained images of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite).
  • the left is an image of Control (control group), the right is an image on the 14th day of culture, and the sample 1 is administered, and the 14th day of culture Eyes were immunostained with MAP2 antibody.
  • FIG. 11 shows immunostaining with the MAP2 antibody at the late stage of development on the 14th day of culture, and the number of dendrites (Dendrite) is quantified at a specimen concentration of 0.1 to 1 ⁇ M. 10 ⁇ m centering on the cell body. Concentric circles were drawn at intervals of, and the number of dendrites intersecting the circles was measured. The number of dendrites growing from the cell body is increased depending on the number of days of culture (FIG. 11), compared to dendrites on the fourth day of juvenile cultured cells (FIG. 7).
  • Example 6 Adult C57BL / 6N mice (10 to 17 weeks of age, body weight 28 to 31 g) were administered intraperitoneally with physiological saline (Control) on one side and specimen 3 (10 ⁇ g / kg) on the other side. Brain thin slice (slice) specimens containing mouse cortex and hippocampus regions were prepared. 80 mM KCl (80K) was added to the external solution to cause depolarization of the cell membrane, and the resulting increase in Ca 2+ concentration in the mitochondria was measured by a fluorescent method using Rhod-2 (Note 1). In brain slices, it is indirectly shown that the sample 3 is actively involved in ATP activity in mitochondria, using as an index how the Ca 2+ concentration (Note 2) increased by 80K is suppressed by the sample 3. It was verified (Note 3).
  • Rhod-2 Ca 2+ fluorescent dye that is selectively taken up by mitochondria
  • Depolarization of nerve cell membrane by 80K is caused by influx of Ca 2+ from the outside into the cell and from intracellular Ca store. It occurs by both the release of Ca 2+ . Increased free Ca 2+ in the cell easily flows into mitochondria, which is an independent organ in the cell. As a result, the Ca 2+ concentration in mitochondria increases.
  • Free Ca 2+ increased in the neurocytoplasm due to depolarization by 80K stimulation is immediately transferred from the cytoplasm into the mitochondria.
  • FIG. 12 is a diagram in which an increase in Ca 2+ concentration in mitochondria present in cerebral cortical neurons (neurons) caused by K + depolarization and its inhibitory effect by specimen 3 are measured.
  • a is a control reaction when 80 mM KCl external solution (washed for 5 minutes after being applied for 5 minutes) was continuously applied 3 times to a brain slice sample obtained from a normal mouse.
  • the vertical axis represents the result of fluorescence measurement of the increase in mitochondrial Ca 2+ concentration.
  • b shows changes in mitochondrial Ca 2+ concentration when 80 K external solution was given to brain slice specimens prepared by excision from rats 22 hours after intraperitoneal (ip) injection of specimen 3 at 10 ⁇ g / kg.
  • FIG. 13 is a diagram in which an increase in mitochondrial Ca 2+ concentration due to K + depolarization of hippocampal neurons (neuronal cells) is measured.
  • a is a control reaction when 80 mM KCl external solution (washed for 5 minutes after being applied for 5 minutes) was continued three times.
  • b is a graph showing changes in mitochondrial Ca 2+ concentration when a brain slice sample was prepared 22 hours after intraperitoneal injection of specimen 3 at 10 ⁇ g / kg and given an 80 K external solution.
  • c is a graph showing a comparison of the inhibitory effect of hippocampal neurons on the control of intramitochondrial Ca 2+ concentration and 10 ⁇ g and 10 mg / kg ip of specimen 3.
  • FIG. The maximum effect is obtained at 10 ⁇ g / kg.
  • N 3 average value: data obtained from three slices obtained from the same individual)
  • Example 7 An experiment was conducted to confirm the effect of sample addition on the reduction of exercise behavior in adult rats with cerebral ischemia. A small hole was made in the skull of a Wistar adult rat (body weight 200 to 230 g) by inhalation anesthesia, and then the right striatum was given saline (control group) for the control group and 0.24 U collagenase (type IV) for the bleeding group. An intracerebral hemorrhage model rat was prepared by injecting 1.2 ⁇ l of physiological saline containing it.
  • FIG. 14 is a view showing a cross section of the brain of an intracerebral hemorrhage model rat.
  • 100 ⁇ g / kg of specimen 4 was injected into a spot in the brain (in the figure / white rhombus) 1 hour after collagenase administration, and the rat's exercise footprint was quantitatively measured.
  • the momentum was measured by moving the rat for 5 minutes.
  • the free behavior (movement distance and speed) for the last 3 minutes of the shooting time was analyzed.
  • FIG. 15 is a diagram in which the exercise footprint of the rat is measured
  • FIG. 16 is a diagram in which the daily change in the exercise distance and exercise speed is measured.
  • Specimen 4 mitigates the decrease in ischemic distance and speed caused by rat cerebral hemorrhage (FIGS. 15 and 16). The effect is also seen on the first day and one week after bleeding. Based on the experimental results, it was shown that Specimen 4 contributes to the prevention of ischemic damage of mature rat brain cells (indirect proof of increased ATP).
  • the number of intersecting dendrites measured for each distance from the cell body is converted into a line graph.
  • the area under the line graph (Area) is Student's t-test, paired (t-test). , Two-sided distribution). For samples with a sufficient number of cases, the maximum and minimum values were removed and the test was performed. The sample concentration to be added was 0.3 ⁇ M in all cases.
  • Whether or not the dendrites are significantly elongated is determined by calculating the p-value from the t-value, and when the p value is p ⁇ 0.05, it is significantly elongated (effect ++), and 0.05 ⁇ p ⁇ An extension (effect +) was distal or proximal at 0.2, and no significant difference (effect ⁇ ) at p> 0.2.
  • FIGS. 22 to 28 are graphs showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrites (Dendride) with the addition of specimens 5 to 10, respectively.
  • a is the figure which showed the number of cross dendrites with respect to the distance from a cell body (soma), and b was the test result which compared AUC.
  • the solid line indicates the case where the sample is added, and the dotted line indicates the case where the sample is not added (control). Note that n is the number of samples.
  • specimen 7 (III-2) and specimen II (IV-23) have a statistically significant difference (p ⁇ 0.05), but other specimen 5 (II -13), 6 (II-31), 8 (III-2), 9 (IV-10), 10 (IV-15), and 11 (IV-23) also show the effect of protrusion extension.
  • specimen 1 (TND1128) was selected, and an action comparison experiment with ⁇ -NMN was conducted.
  • ⁇ -NMN an action comparison experiment with ⁇ -NMN was conducted.
  • SIRT1 was significantly increased in nematodes treated with specimen 1 (TND1128) for 24 hours, so that the same effect was obtained with ⁇ -NMN 24 hours after administration. To compare.
  • ACSF artificial cerebrospinal fluid
  • This specimen was placed in a chamber mounted on the stage of an inverted fluorescence microscope (Olympus IX71), covered with black cotton strips, fixed with a platinum ring, and perfused with O 2 95%, CO 2 5% aerated ACSF (70 ml). / Hr).
  • a fluorescence image of the specimen was acquired with a 4x objective lens, and images of the hippocampal ventral region and the cerebral cortex were displayed on one screen.
  • the intensity change of red fluorescence (> 600 nm) generated by excitation light 580 nm was measured for the measurement of mitochondrial calsim concentration, and the cytosolic calcium measurement was obtained as the ratio of fluorescence (> 500 nm) by 360 nm excitation and 380 nm excitation.
  • Measurement sites were placed in two locations, the hippocampal CA1 site and the cerebral cortex.
  • ⁇ -NMN is dissolved in water to dissolve 10 mg / kg, 30 mg / kg or 100 mg / kg
  • specimen 1 is dissolved in alcohol to 1 mg / ml, which is diluted with water to give 0.01 mg / kg, 0 .1 mg / kg or 1.0 mg / kg was administered subcutaneously (0.1 ml / 10 g) to mice 24 hours before specimen preparation.
  • FIG. 31 and FIG. 32 show the results of quantifying the effect of each concentration of ⁇ -NMN and specimen 1 (TND1128), respectively.
  • FIG. 31 and FIG. 32A shows the magnitude of mitochondrial calcium concentration from AUC (Area under the curve) up to 35 minutes after 3 minutes of exposure to 80K-ACSF after 5 minutes from the start of the administration experiment. (See FIG. 37).
  • B and C are respectively 80K administration for 5 minutes in the cerebral cortex (CTX) and hippocampus (CA1) and subsequent washing for 5 minutes (1st: 5 to 15 minutes, 2nd: 15 to 25 minutes, 3rd: 25 to 35 minutes), respectively (See FIG. 37).
  • CTX cerebral cortex
  • CA1 hippocampus
  • the Tukey method was used for the significant difference test.
  • a dose-response relationship between ⁇ -NMN and TND1128 was observed in the dose range studied.
  • FIG. 33 and FIG. 34 show the effects of ⁇ -NMN and specimen 1 (TND1128) on cytoplasmic calcium fluctuations during three consecutive administrations of 80KACSF.
  • the control reactions shown in FIG. 33 and FIG. 34 show little recovery of the response for each 80K-ACSF administration. At first glance, it seems that the response of the calcium indicator has peaked, but the intracellular calcium concentration indicator used in this test.
  • Non-Patent Document 8 the mitochondria of the mouse brain that was actually administered subcutaneously as in this experiment. There are no reports mentioning its effectiveness on function.
  • Specimen 1 (TND1128) is highly hydrophobic and extremely stable. Using this advantage, it may be possible to adjust the topical medicine and activate the weakened roots to treat gray hair and baldness, and to rejuvenate loose skin cells. Furthermore, it seems that the effect on the brain can be expected by percutaneous absorption.

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Abstract

課題：細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するための賦活剤を提供する。 解決手段：式（Ｉ）で表わされる５－デアザフラビン化合物の使用 （式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ３及びＲ４は、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。）

Description

細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するための補酵素因子の使用
　本発明は、細胞内でＡＴＰ産生を賦活するための補酵素因子の使用に係り、詳しくは、ＡＴＰ産生に関与する酸化還元酵素を補助する補酵素因子の使用に関する。
　アルツハイマー病、パーキンソン病、脳出血・梗塞に伴う神経変性疾患やうつ病は、近年の老齢化社会の到来とともに急激に増加しており、これらの神経変性疾患の予防・治療薬に対する需要が高まっている。
　上記疾患の発症要因の一つとして、細胞内でのエネルギー産生（ＡＴＰ産生）の機能低下が挙げられる。ＡＴＰ産生は細胞質基質でも行なわれるが、有酸素下では主としてミトコンドリア複合体において行なわれる。ミトコンドリアは全ての動物細胞内に存在し、電子伝達システムを介して細胞の治動に必要なエネルギー産生を担っている。ミトコンドリアおよびミトコンドリア遺伝子は、電子伝達異常による酸化的ストレスに対して脆弱なため、その結果、エネルギー代謝の低下、細胞の変性に至る。特に脳細胞においては、エネルギー要求量が高いため、ミトコンドリアはより変性を受け易く、老化に伴うミトコンドリア電子伝達異常による、いわゆる脳ミトコンドリア障害が惹起される。
　一方、最近の研究によりサーチュイン（Sirtuin）遺伝子の活性化により老化の遅延、生物の寿命の延長が可能となると考えられている（非特許文献１）。
　サーチュイン遺伝子とミトコンドリアとの関係についても研究が進んでおり、サーチュイン遺伝子が活性化されると細胞内の小器官であるミトコンドリアの量が増え、さらに賦活され認知症予防、動脈硬化予防、難聴予防、脂肪の燃焼、細胞修復、活性酸素の除去を促進し、老化要因の発現を抑制するだけでなく、ミトコンドリア障害を治癒する効果も得られると考えられている（非特許文献２）。
　例えばマサチューセッツ大学の研究チームは、サーチュイン遺伝子の一つであるSIRT１遺伝子を欠損させたマウスでは記憶障害が見られることから、本遺伝子が記憶に関与する可能性を提唱した。さらにアルツハイマー病と筋委縮性側索硬化症の疾患モデル動物を用いてSIRT１遺伝子活性化の神経変性疾患治療への応用を示唆した。一方２００８年、ワシントン大学医学部今井眞一郎教授は人間の老化をコントロールする物質としてＮＭＮ（Nicotinamide mononucleotide）を同定し、ＮＭＮにより老化し不活性化したランゲルハンス島を再活性化することにも成功した。このＮＭＮはすべての遺伝子を賦活し、ミトコンドリアを活性化することが明らかにされている（非特許文献３）。
　また、今井教授等が発見した長寿命タンパク質サーチュイン遺伝子の１つであるSIRT２はテロメアおよびリボソームＤＮＡで転写を停止させるヘテロクロマチン成分であり、ＮＡＤ依存性ヒストン脱アセチル化酵素であることが明らかとなった。この酵素はアセチル化によって弱められたヒストンへのＤＮＡの結合を脱アセチル化によって元に戻し、ＤＮＡのヒストンへの巻き付けを高め、転写を抑制する働きを持っており、これが長寿に関連すると考えられている（非特許文献４）。
　今井教授等は、この酵素の活性化因子であるＮＡＤ＋（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）の生合成促進剤が抗老化効果を持つ可能性を示唆し、ＮＡＤ＋合成の中間物質である、ＮＭＮがＮＡＤ＋の生合成を促進し、これが抗老化作用に関与する可能性を報告している（非特許文献５）。
　さらに、Ｍills等は、マウスにＮＭＮを加えた食餌を長期間摂取させると、組織中でＮＡＤ＋の産生が高められ、加齢による個体の生理学的機能低下の抑制ができることを報告している（非特許文献６）。
　これはＮＡＤ＋がミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の第一段階およびＴＣＡサイクルにおける酸化反応に係わるエネルギー産生の最も重要な分子の一つであることからも理解できる。
　一方、長寿命タンパク質サーチュイン遺伝子の１つであるSIRT１は主に、核に発現しながらも障害を受けたミトコンドリアの修復・再生にも関わることが知られている。さらに、これまで発見されている哺乳動物の７個のサーチュイン遺伝子の内、SIRT３，SIRT４およびSIRT５が主にミトコンドリアに発現していることが明らかにされている（非特許文献７，８）。
　これらの結果を総合すると、多様なサーチュイン遺伝子がミトコンドリア機能の活性化を介して寿命延長作用に関与していると考えられている（非特許文献９）。
　正常時のミトコンドリアでは、ＮＭＮ（ＮＡＤ＋（ニコチン・アミド・アデニン・ジヌクレオチド）の前駆化合物）は常時継続的に産生されるが、老化や病態時にはその産生量は低下してＮＡＤ＋は減少する。その結果、ミトコンドリアでの電子伝達系による酸化的リン酸化や細胞質基質で解糖系により産生される生命維持のエネルギー源であるＡＴＰ（adenosine triphosphate）が減少する（非特許文献１０）。ＮＡＤ＋の還元型であるＮＡＤＨ(Dihydro-nicotinamide adeninedinucleotide）やＦＡＤＨ２(Dihydro-flavin adenine dinucleotide）はミトコンドリア内のマトリックスのＴＣＡ（クエン酸）回路や細胞質の解糖系で補酵素として機能している。
　ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで、還元型はＮＡＤＨで体内に最も多量に存在する補酵素である。
　ＮＡＤの構造は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）とアデニル酸がホスホジエステル結合している。酸化型ＮＡＤにおけるピリジン環の窒素原子はピリジウムイオンとして存在するので、これをＮＡＤ＋と表現する。ＮＡＤ＋の重要な機能はＡＴＰ産生機構（酸化反応）にＮＡＤ＋の還元が共役している点にある。
　また、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）も酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで、還元型はＦＡＤＨ２で、ミトコンドリアの電子伝達系でのＡＴＰ産生に使用される。
　真核生物の代謝におけるＦＡＤの一次供給先はミトコンドリア内のクエン酸回路とβ酸化が行なわれる細胞質基質である。クエン酸回路では、ＦＡＤがコハク酸をフマル酸に酸化するコハク酸デヒドロゲナーゼの補酵素として機能し、β酸化ではアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼの酵素反応の補酵素として機能している。しかし、redox（酸化還元）系に属するＮＭＮやＮＡＤ＋は代謝系で分解されやすく化学的にも不安定で将来医薬品として開発するのは困難と考えられる。さらに合成するにしても高価となる。
　従って、優れたＡＴＰ産生機能賦活作用を有し、かつ優れた体内動態（体内吸収性、脳内移行性等）を示す点において医薬品として十分満足できる化学物の開発が切望されている。
　ところで、本発明者等は永年に渡ってフラビン骨格を有する化合物の合成及びその薬理作用について鋭意研究を重ねてきた。リボフラビンの５位のＮをＣＨに置換した特有の化学構造を有する５－デアザフラビン（ピリミド［４,５－ｂ］キノリン－２,４（３Ｈ,１０Ｈ）－ジオン）誘導体は、１９７０年にリボフラビンの類似体として始めて合成された化合物である。５－デアザフラビンの誘導体中には優れた制癌活性を示すものや、抗ヘルペスウィルス活性を有するものも知られており、制癌剤や抗ヘルペスウィルス剤として使用されるものもある（特許文献１～５）。
　その構造の変化に伴っておこるアルコールのケトンやアルデヒドへの変換反応に対する触媒的機能、アミンのイミン（ケトン）への変換反応、カルボニル化合物のアルコールへの還元やイミンのアミンへの還元および不斉還元などやＮＡＤ＋（ニコチンアミドヌクレオチド）との類似性も研究されている（非特許文献１１）。ミトコンドリア機能賦活剤についても種々の特許文献が公開されている（特許文献６～８）。しかし、この５－デアザフラビン誘導体の酸化還元触媒活性に着眼し、ミトコンドリア機能賦活作用に適用した文献は見当らない。５－デアザフラビン誘導体は、酸化還元触媒活性を有するため、ミトコンドリアの酸化的リン酸化におけるＡＴＰ産生機能に影響することは明らかである。５－デアザフラビン骨格は、メタン発酵の酸化還元反応に関わる補酵素の補酵素Ｆ420（Coenzyme Ｆ420）に見出され、フラビンの類縁体でもある。その酸化還元挙動はフラビンよりむしろＮＡＤ(Ｐ)＋に類似している。また共鳴極限式の１つはＮＡＤ(Ｐ)＋構造を分子中に内蔵しており、電子密度（分子軌道計算化学で求めたもの）を見ても“ フラビン型のＮＡＤ(Ｐ)＋”とみなし得る。
　発明者等は５－デアザフラビンはＮＡＤ＋やＦＡＤと同様のｒｅｄｏｘ（酸化還元）機能を有することから、細胞内でのＡＴＰ産生を賦活し、さらにサーチュイン遺伝子を直接又は間接的に賦活すると考え、鋭意研究を行った結果、特定の構造式を有する５－デアザフラビン化合物は化学的に非常に安定で、しかも安価に合成でき、ＡＴＰ産生を賦活し、さらにミトコンドリアの機能を制御するサーチュイン遺伝子を賦活することを見出し、本発明を完成するに至った。
特許第３０７３３０９号 特開平６－１９９８５７号 特開平１１－３２２７４６号 特開２０００－２１２０８７号 特開平６－７３０５８号 特開２００１－４８７８４号 特開２００２－３２２０５８号 特開２００８－２５５０５９号
１４０．ミトコンドリア制御による抗老化対策，上原記念生命科学財団研究報告集，２５（２０１１） SIRT１による代謝制御機構の解明，www.mishima-kaiun.or.jp/assist/docs/SNo4-hasegawa.pdf 身体機能を回復し、健康寿命を延ばす。‐‐老化・寿命の研究で解明された物質「ＮＭＮ」の驚きの効用，https://www.mugendai-web.jp/archives/6576 Imai S1,Armstrong CM, Kaeberlein M, Guarente L(2000) Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase.  Nature. 403(6771):795-800. Imai (2010) A possibility of nutriceuticals as an anti-aging intervention: activation of sirtuins by promoting mammalian NAD biosynthesis.  Pharmacol Res. 62(1):42-7. Mills KF, Yoshida S, Stein LR, Grozio A, Kubota S, Sasaki Y, Redpath P, Migaud ME, Apte RS, Uchida K, Yoshino J, Imai SI (2016)Long-Term Administration of Nicotinamide Mononucleotide Mitigates Age-Associated Physiological Declinde in Mice. Cell Metab. 24(6):795-806. Michishita E1, Park JY, Burneskis JM, Barrett JC, Horikawa I.(2005) Evolutionarily conserved and nonconserved cellular localizations and functions of human SIRT proteins. Mol Biol Cell. Oct;16(10):4623-35 Pacholec M, Bleasdale JE, Chrunyk B, Cunningham D, Flynn D, Garofalo RS, Griffith D, Griffor M, Loulakis P, Pabst B, Qiu X, Stockman B, Thanabal V, Varghese A, Ward J, Withka J, Ahn K.(2010) SRT1720, SRT2183, SRT1460, and resveratrol are not direct activators of SIRT1. J Biol Chem. 285(11):8340-51. Tang BL(2016) Sirt1 and the Mitochondria Mol. Cells 39(2):87-95 老化関連疾患におけるＮＡＤ＋合成系の役割と創薬標的としての可能性，https://seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2015.870239/data/index.pdf 「酸化還元機能性を有する複素環化合物の合成」，www.waseda.jp/prj-prac-chem/product/research%20product/2002 nitta.pdf
　本発明の課題は、各種の５－デアザフラビン誘導体の中から細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するのに有効な構造式を有する５－デアザフラビン化合物を提供することにある。
　本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、各種の異なった構造式を有する５－デアザフラビン誘導体化合物を検体として作製し、それを使用してインビトロ（in vitro）で各種実験を重ねた結果、細胞内でのＡＴＰ産生を増加させる構造式を持った化合物を見出した。
　まず本発明者等は、ＮＭＮ（図１７参照）の類縁化合物として、成長因子として知られ水溶性ビタミンであるリボフラビン（ビタミンＢ２）のフラビン骨格の５位の窒素をメチレン基に置き換えた５－デアザフラビンに着目した。５－デアザリボフラビンはリボフラビンと代謝拮抗し、強力な抗コクシジウム活性を示した。最近メタン生成菌から５－デアザフラビン骨格をもった補酵素Ｆ４２０（図１８参照）が見出され、炭酸ガスのメタンへの還元過程や、抗生物質の生合成過程で重要な働きをしていることがわかってきた。５－デアザフラビンの酸化還元挙動はフラビンよりむしろＮＡＤ（Ｐ）＋（図１９参照）に類似している。また共鳴極限式の１つはＮＡＤ（Ｐ）＋構造を分子中に内蔵しており、電子密度（分子軌道計算化学で求めたもの）を見ても“フラビン型のＮＡＤ（Ｐ）＋”とみなし得る（図２０参照）。Huckel ＭＯ法計算で、５－デアザフラビン環の５位が非常にπ電子欠乏（正味荷電net charge:＋０.２４）になっており、ニコチンアミドヌクレオチドの４位も同様にπ電子欠乏（net charge:＋０.２１０）になっている。其れゆえ、５－デアザフラビン環はＮＡＤ（＋）とＦＡＤ（図２１参照）の両方の電子伝達系に属するものと考えられる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ，nicotinamide adenine dinucleotide)は、全ての真核生物と多くの古細菌、真正細菌で用いられる電子伝達体である。
　事実、マイトトラッカー蛍光染色によりミトコンドリア膜電位を蛍光標識したところ、新規ＮＭＮ類縁体（５－デアザフラビン）の処理により顕著にミトコンドリア活性の促進がみられた。サーチュイン遺伝子が活性化されると細胞内の小器官「ミトコンドリア」が活性化され、認知症予防、動脈硬化予防、難聴予防、脂肪の燃焼、細胞修復や遺伝子に有害な活性酸素の除去を促進し、老化要因の発現を抑制する効果が得られると考えられており、この電子伝達系として働く５－デアザフラビンはβ－ＮＭＮに比較して、低容量で長寿遺伝子のサーチュイン遺伝子のスイッチオンにして活性化と同時にミトコンドリアの活性化によりＡＴＰ産生を促す。
　一方、ＮＡＤ＋やＦＡＤ同様のredox機能を持つこの５－デアザフラビン化合物は、現在ＮＭＮを補充する医薬品に用いたいと検討されているβ－ＮＭＮと比較すると、化学的に非常に安定でしかも安価に合成でき、ＮＡＤ＋を活性化し、さらにミトコンドリアの長寿遺伝子（SIRT１およびSIRT３）も直接又は間接的に賦活すると発明者等は考えた。即ち、発明者等はＮＡＤ＋依存的に活性化され、ミトコンドリア機能維持に重要な遺伝子として既に明らかになっている長寿遺伝子SIRT１の活性化を評価する目的で、SIRT１の標的転写因子であるFOXO1の発現を活性指標として、HCT116 細胞を用いｑ－ＲＴ－ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ増加のスクリーニング評価を行った。
　その結果、β－ＮＭＮと比較し本発明に係る化合物がより低用量でSIRT１活性能を有することを明らかにした。よって本発明に係る化合物はＮＡＤ＋を直接活性化し虚血などの病態的条件下でも連続してＡＴＰを産生させ、その効果は持続的で強力であると予想出来る。したがって本発明に係る化合物は医薬品として開発可能な必要条件を十分に備えていると考えられる。また、その化学構造が機能的及び電子論的にＮＡＤ＋とＦＡＤの補酵素のコア部分の合体型構造、即ち、nicotinamideとflavinのハイブリッドで自然界に存在する構造に近いことから、副作用の発現は殆ど無いだろうと推測できる。さらに、本発明に係る化合物の構造は、酸化還元電位測定値より判断すると、補酵素としてのＮＡＤやＦＡＤよりもredoxポテンシャルが高く酸化還元能が優れている。
　本発明は上記の知見を基にして完成したものである。
　即ち、本発明により細胞内でＡＴＰ産生を賦活するために有効な補酵素因子として、下記の式（Ｉ）～式（IV）で示される化合物を特定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ３及びＲ４は、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｒ１及びＲ３は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
　本発明により提供されたＡＴＰ産生を賦活する補酵素因子を使用することにより、細胞内でのエネルギー産生の機能低下を改善することができる。
　従って、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳出血・梗塞に伴う神経変性疾患やうつ病などの予防・治療薬として極めて有用である。
図１は、ヒト由来神経芽細胞（ニューロブラスト－マ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株の培養細胞に検体１を添加し、添加後の細胞内・外のＡＴＰ濃度を蛍光測定した結果を示す図である。 図２Ａは、中枢神経系のグリア細胞の一種、培養アストロサイト細胞に検体１を添加し、蛍光測定した結果を示す図である。 図２Ｂは、図２Ａでの測定結果を定量化した図である。 図３は、ヒトグリオーマＵ２５１の培養細胞（Sig1-R transfected cells）に検体１，２を添加し、添加後の細胞内のＡＴＰ濃度を添加しない場合（Cont.）と相対比較して示した図である。 図４は、幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養し、検体１を添加した後の海馬神経細胞（ニューロン）の神経軸索（Axon）の伸展・発達・分岐を示す免疫染色画像である。 図５は、図４の場合と同様にして検体１を添加し、海馬神経細胞軸索（Axon）の分岐数を計測した結果を示す図である。 図６は、図４の場合と同様に検体１を添加した後の、海馬神経細胞樹状突起（Dentrite）の伸展・発達・分岐を示す免疫染色画像である。 図７は、図６の場合と同様に検体１を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を計測した結果を示す図である。 図８は、図４の場合と同様に培養し、１４日目における興奮性シナプスを免疫染色したオータプス標本におけるシナプスの免疫染色画像である。 図９は、図４の場合と同様に培養し、１４日目における興奮性シナプスの数を定量した図である。 図１０は、成熟培養海馬細胞（培養１１日目）に検体１を１回投与して３日後（培養１４日目）に定量した海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の免疫染色画像である。 図１１は、図１０の場合と同様に、培養１４日目の発達期に、ＭＡＰ２抗体により免疫染色し、樹状突起（Dendrite）の分岐数を計測した図である。 図１２は、成熟Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１０～１７週齢、体重２８～３１ｇ）に生理食塩水（コントロール）と検体３（１０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、２２時間後に皮質（Cortex）と海馬（Hippocampus）領域を含む脳薄切片（スライス）標本を作製し、外液に８０ｍＭＫＣｌ（８０Ｋ）を添加して細胞膜の脱分極を起こし、Ｋ＋脱分極によって生じる大脳皮質ニューロン（神経細胞）内に存在するミトコンドリア内のＣａ２＋濃度上昇と検体３によるその抑制効果を計測した図である。 図１３は、図１２の場合と同様に、海馬ニューロン（神経細胞）のＫ＋脱分極によるミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度上昇と検体３によるその抑制効果を計測した図である。 図１４は、吸入麻酔下のウイスター系成熟ラット（体重２００～２３０ｇ）の頭蓋骨に小穴をあけた後、右脳線条体にコントロール群には生理食塩水、出血群には０．２４Ｕのコラゲナーゼ（typeＮ）を含む生理食塩水１．２μｌを注入した脳内出血モデルラットの脳断面を示す図。 図１５は、脳内出血モデルラットに対する検体４の脳細胞保護作用を検証するためにコラゲナーゼ投与の１時間後に検体４を１００μｇ／ｋｇを脳内のスポットへ注入し、ラットの運動足跡を定量的に測定した図である。 図１６は、図１５の場合と同様にして、検体４投与有無ラットの運動距離と運動スピードの経日変化を計測した図である。 図１７は、β－ＮＭＮの化学構造式を示す図である。 図１８は、補酵素Ｆ４２０の化学構造式を示す図である。 図１９は、ＮＡＤ（Ｐ）＋の化学構造式とその酸化還元反応（Redox）を説明する図である。 図２０は、５－デアザフラビンとＮＡＤ（Ｐ）＋のフラビン環の分子軌道計算化学で求めた電子密度を示す図である。 図２１は、ＮＡＤ＋との比較としてＦＡＤとの構造の類似性を説明した図である。 図２２は、検体５を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２３は、検体６を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２４は、検体７を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２５は、検体８を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２６は、検体９を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２７は、検体１０を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２８は、検体１０を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２９は、２４時間前にβ－ＮＭＮを皮下投与したマウスの脳標本のミトコンドリア内Ｃａ２＋の解析結果を示す図である。ミトコンドリア選択的Ｃａ２＋指示薬Ｘrhod-1で染色された標本を５分間８０Ｋ ＡＣＦＳ暴露－５分間洗浄操作を三回繰返した。この時のミトコンドリア内Ｃａ２＋の変動に及ぼすβ－ＮＭＮの用量反応関係 Ａ：Control, Ｂ：β-ＮＭＮ １０ｍｇ／ｋｇ; Ｃ：β-ＮＭＮ ３０ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：β-ＮＭＮ １００ｍｇ／ｋｇそれぞれの用量のβ－ＮＭＮを皮下投与し、２４時間後に全脳スライス標本を作成し、ミトコンドリア特異的Ｃａ２＋指示薬Ｘrhod-1で染色した。５８０ｎｍ励起時の赤色（＞６００ｎｍ）の蛍光画像から、三回の８０Ｋ ＡＣＳＦ刺激で得られたミトコンドリア内Ｃａ２＋上昇を経時計測した。実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ）；点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５～６例の平均値と標準誤差を示す。 図３０は、２４時間前に検体１(TND1128）を皮下投与したマウスの脳標本のミトコンドリア内Ｃａ２＋　の解析結果を示す図である。ミトコンドリア選択的Ｃａ２＋指示薬Xrhod-１で染色された標本を図２２と同様に、５分間８０Ｋ ＡＣＦＳ暴露－５分間洗浄操作を三回繰り返した。このミトコンドリアＣａ２＋の変動に及ぼす検体１（TND1128）の用量反応関係Ａ：Control, Ｂ：TND1128 0.０１ｍｇ／ｋｇ；Ｃ：TND1128 0.１ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：TND1128 1.０ｍｇ／ｋｇ（皮下投与）。図２２と同様にXrhod-1の５８０ｎｍ励起時の赤色（＞６００ｎｍ）蛍光画像から、三回の８０Ｋ ＡＣＳＦ刺激で得られたミトコンドリア内Ｃａ２＋上昇を経時計測した。実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ），点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５～６例の平均値と標準誤差を示す。 図３１は、β－ＮＭＮの８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時のミトコンドリア内 Ｃａ２＋濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。　図２９のデータを定量的にまとめた（図３７参照）　Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）におけるミトコンドリアのＣａ２＋取り込み量に対するβ－ＮＭＮの作用　Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ２＋取り込みの用量反応関係　Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ２＋取り込みの用量反応関係　＊：Ｔｕｋｅｙ法による多重解析で有意差（P＜0.05） 図３２は、検体１（TND1128）の８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時のミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。　図２９のデータを定量的にまとめた（図３７参照）　Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）におけるミトコンドリアのＣａ２＋取り込み量に対するTND1128の作用　Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ２＋取り込みの用量反応関係　Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ２＋取り込みの用量反応関係　＊：Ｔｕｋｅｙ法による多重解析で有意差（P＜0.05） 図３３は、２４時間前にβ－ＮＭＮを皮下投与したマウスの脳標本の細胞質内Ｃａ２＋ の解析結果を示す図である。それぞれの用量のβ－ＮＭＮを皮下投与し、２４時間後に全脳スライス標本を作成し、脳スライス標本を細胞質に留まるＣａ２＋　指示薬Ｆｕｒａ－４Ｆで染色した。この脳標本から３６０ｎｍと３８０ｎｍの励起光を与えた時の青緑色（＞５００ｎｍ）の蛍光強度（Ｆ３６０とＦ３８０）の比を１０秒毎、経時的に得、三回の８０Ｋ－ＡＣＳＦ刺激で得られた細胞質内Ｃａ２＋ 上昇の時間経過。Ａ：Control, Ｂ：β－ＮＭＮ １０ｍｇ／ｋｇ；Ｃ：β－ＮＭＮ ３０ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：β－ＮＭＮ １００ｍｇ／ｋｇ、実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ）、点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５～６例の平均値と標準誤差を示す。 図３４は、２４時間前に検体１(TND1128）を皮下投与したマウスの脳標本の細胞質内Ｃａ２＋ の解析結果を示す図である。細胞質選択的Ｃａ２＋ 指示薬Ｆｕｒａ－４Ｆで染色された標本を図２９と同様に、５分間８０Ｋ ＡＣＦＳ暴露－５分間洗浄操作を三回繰り返した。この細胞質のＣａ２＋ の変動に及ぼす TND1128の用量反応関係Ａ：Control, Ｂ：TND1128 0.０１ｍｇ／ｋｇ；Ｃ：TND1128 0.１ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：TND1128 1.０ｍｇ／ｋｇ（皮下投与）。図３３と同様に３６０ｎｍと３８０ｎｍの励起光を与えた時のＦｕｒａ－４Ｆの青緑色（＞５００ｎｍ）蛍光の強度（Ｆ３６０とＦ３８０）の比を１０秒毎、経時的に得た。実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ），点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５～６例の平均値と標準誤差を示す。 図３５は、β－ＮＭＮの８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時の細胞質内Ｃａ２＋ 濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。図３３のデータを定量的にまとめた（図３７参照）　Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）における細胞質のＣａ２＋ 取り込み量に対するβ－ＮＭＮの作用　Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ２＋ 取り込みの用量反応関係　Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ２＋ 取り込みの用量反応関係 図３６は、検体１(TND1128）の８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時の細胞質内Ｃａ２＋ 濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。　図３４のデータを定量的にまとめた（図３７参照）　Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）における細胞質のＣａ２＋ 取り込み量に対するβ－ＮＭＮの作用　Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ２＋ 取り込みの用量反応関係　Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ２＋取り込みの用量反応関係　＊Ｔｕｋｅｙ法による多重解析で有意差（P＜0.05） 図３７は、８０Ｋ 連続三回暴露時のミトコンドリアまたは細胞質におけるＣａ２＋ 上昇量の定量法を説明する図である。
（化合物の構造）
　本発明では、式（Ｉ），（II），(III）及び（IV）で示される構造式を有する化合物の使用が細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するのに有効である。
　以下、それらの化合物の具体例とその製法を示す文献を第１表～第４表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（化合物の製造方法）
　一般式Ｉで表される５－デアザフラビン化合物（Ｉ－１～Ｉ－１１８）（３）は既知文献（１～１４）記載の製造方法により合成できる。特に、（製法Ａ）に記した文献（１）の一般製造方法により大半の誘導体が合成できる。即ち、６－Ｎ－置換－アミノウラシル類（１）と適当なｏ－ハロゲノベンズアルデヒド（２）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、加熱還流する。加熱時間は３～７時間が適当である。反応液を減圧下濃縮し、残留物を適当な溶媒（アルコール、ジオキサンやＤＭＦなど）で再結晶し、対応する５－デアザフラビン（３）を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　一般式IIで表されるピリドジピリミジン化合物（II）（II－１～II－３２）（５）は既知文献（１５～１９）記載の製造方法により合成できる。特に、（製法Ｂ）に記した文献（１５）の一般製造方法により大半の誘導体が合成できる。即ち、６－Ｎ－置換－アミノウラシル類（１）と適当な３－置換－６－クロロウラシ－５－カルブアルデヒド（４）をジメチルホルムアミド又は酢酸中で、加熱還流する。加熱時間は２～５時間が適当である。反応液を減圧下濃縮し、残留物を適当な溶媒（アルコール、酢酸やＤＭＦなど）で再結晶し、対応するピリドジピリミジン（５）を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　一般式IIIで表されるデアザフラビノテストステロン化合物（III）（III－１～III－２）（７）は既知文献（２０，２１）記載の製造方法により合成できる。同様の方法で未知化合物（III－３～III－２３）も合成できる。即ち、ジフェニルエーテルに、６－Ｎ－モノ置換－アミノウラシル類（１）と２－ヒドロキシメチレンテストステロン（６）を加え、更に、この混合物へｐ－トルエンスルホン酸を加えた後、１８０℃でアルゴン雰囲気下３０分～６０分間加熱攪拌する。反応後この反応物をカラムクロマトグラフィーに付し精製する。尚、この反応はジオキサン中で数時間加圧下加熱しても合成できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
［製造例１］
　（８’－置換－５’－デアザ－１７β－ヒドロキシ－３’－メチルアンドロスト－２，４－ジエノ［２，３－ｇ］プテリジン－２’，４’（３’Ｈ，８’Ｈ）－ジオン誘導体（III－３～III－１３）の一般合成）
　ジオキサン（５０ｍｌ）にｐ－トルエンスルホン酸（６０ｍｇ，０.３２mmol）と６－モノ置換アミノ－３－メチルウラシル（１）（２.８４mmol）を加え、更に、２－ヒドロキシメチレンテストステロン（６）（１.０ｇ，３.１６mmol）を加えた後、アルゴン雰囲気下で封管中１２時間加熱する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー（Fuji Silysia ２３０～４００mesh；溶出液：酢酸エチル：エタノール＝１２：１又は酢酸エチルのみ）で分離精製し、粉末結晶を得る。更に、再結晶は酢酸エチルとｎ－ヘキサンの混合溶液より行なえる。
　化合物 III-３ (5'-Deaza-8'-ethyl-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione) ; 黄色の粉末結晶（0.77 g, 60%）, mp 260 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 1.00 (3H, s, 19-CH3), 1.41 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH2CH3), 2.46-2.62 (2H, br dd, 6-H), 2.67 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.92 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.43 (3H, s, 3'-CH3), 3.68 (1H, dd, J16α,17α= 8.7 Hz, J16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 4.46-4.73 (1H, m, 8'-CHaHb), 4.73-5.00 (1H, m, 8'-CHaHb), 6.39 (1H, s, 4-H), 8.25  (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-４ (8'-n-Butyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione) ; 黄色の粉末結晶 (0.79 g, 58%), mp 246 ℃ (decomp.)； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 0.99 (3H, s, 19-CH3), 1.50 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH2CH2CH2CH3), 2.46-2.61 (2H, br dd, 6-H), 2.66 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.91 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH3), 3.69 (1H, dd, J16α,17α= 7.8 Hz, J16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 4.28-4.60 (1H, m, 8'-CHaHb), 4.60-4.92 (1H, m, 8'-CHaHb), 6.35 (1H, s, 4-H), 8.25 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-５ (8'-Benzyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine- 2',4'(3'H,8'H)-dione ); 黄色の粉末結晶 (0.63 g, 43%), mp 215 ℃； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH3), 0.95 (3H, s, 19-CH3), 2.37-2.45 (2H, br dd, 6-H), 2.64 (1H, d, J = 15.5 Hz, 1β-H), 2.90 (1H, d, J = 15.5 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH3), 3.66 (1H, dd, J16α,17α=8.4Hz, J16β,17α=8.5 Hz, 17α-H), 5.59 (1H, br d, J = 15.3 Hz, 8'-CHaHb), 6.26 (1H, br d, J = 15.3 Hz, 8'-CHaHb), 6.28 (1H, s, 4-H),  7.07-7.19 (2H, m, Bn-mH), 7.25-7.35 (3H, m, Bn-o, pH), 8.33 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-６ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine- 2',4'(3'H,8'H)-dione)；燈色の粉末結晶 (0.54 g, 38%), mp 215 ℃ (decomp.)； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.01 (3H, s, 19-CH3), 2.20-2.43 (2H, br dd, 6-H), 2.76 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J =15.9 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67(1H, dd, J16α,17α=8.7 Hz, J16β,17α= 8.9 Hz, 17α-H), 5.60 (1H, s, 4-H), 6.90-7.22 (2H, m, Ph-mH), 7.22-7.49 (3H, m, Ph-o, pH), 8.39 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-７ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-(4-methylphenyl)androst-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)；　燈色の粉末結晶 (0.58 g, 40%), mp 205 ℃ (decomp.)；1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ： 0.81 (3H, s, 18-CH3), 1.02 (3H, s, 19-CH3), 2.92 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 3.10 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1α-H), 2.46 (3H, s, 8'-CH3), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 8.4 Hz, J16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 5.56 (1H, s, 4-H), 6.88-7.20 (2H, m, Ar-mH), 7.20-7.47 (2H, m, Ar-oH), 8.37 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-８ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methoxyphenyl)-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.69 g, 47%), mp 220 ℃ (decomp.)；1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.02 (3H, s, 19-CH3), 2.18-2.41 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67(1H, dd, J16α,17α= 8.7Hz, J16β,17α = 8.4 Hz, 17α-H), 3.89 (3H, s, OCH3), 5.61 (1H, s, 4-H), 7.02-7.24 (4H, m, Ar-m, oH), 8.36 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-９ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-(3,4-methylenedioxyphenyl)-androst-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.72 g, 47%), mp 214 ℃; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.01 (3H, s, 19-CH3), 2.22-2.46 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J =15.6 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 9.9 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17β-H), 5.67 (1H, s, 4-H), 6.08 (2H, s, OCH2O), 6.51-7.17 (1H, m, Ar-mH), 6.86-6.98 (2H, m, Ar-oH), 8.36 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-１０ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-hydroxyphenyl)-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.47 g, 32%), mp 280 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.00 (3H, s, 19-CH3), 2.61-2.78 (2H, br dd, 6-H), 2.71 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.98 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 7.6 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.68 (1H, s, 4-H), 6.73-6.98 (4H, m, Ar-m, oH), 8.40 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-１１ (5'-Deaza-8'-(4-fluorophenyl)-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)；燈色の粉末結晶 (0.69 g, 47%), mp 270 ℃ (decomp.)；1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.00 (3H, s, 19-CH3), 2.68 (2H, dd, J = 15.0, 6-H), 2.93 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H), 3.11 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.70 (3H, s, 3'-CH3), 3.56-3.80 (1H,br dd, 17α-H), 6.54 (1H, s, 4-H), 7.12-7.66 (4H, m, Ar-m, oH), 8.50 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-１２ (8'-(4-Chlorophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 黄色の粉末結晶 (0.74 g, 49%), mp 270 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.03 (3H, s, 19-CH3), 2.19-2.42 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 3.96 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.40(3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 8.4 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.53 (1H, s, 4-H), 7.06-7.21 (2H, m, Ar-mH), 7.50-7.60 (2H, m, Ar-oH), 8.37 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-１３ (8'-(4-Bromophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.72 g, 44%), mp 250 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.03 (3H, s, 19-CH3), 2.25-2.42 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.3 Hz, 1β-H), 3.96 (1H, d, J = 15.3 Hz, 1α-H), 3.39(3H, s, 3'-CH3), 3.67(1H, dd, J16α,17α= 8.7 Hz, J16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 5.53 (1H, s, 4-H), 6.99-7.15 (2H, m, Ar-mH), 7.65-7.75 (2H, m, Ar-oH), 8.38 (1H, s, 5'-H)
［製造例２］
　（８’－置換－５’－デアザ－１７β－ヒドロキシ－３’－フェニルアンドロスト－２，４－ジエノ［２，３－ｇ］プテリジン－２’，４’（３’Ｈ，８’Ｈ）－ジオン誘導体（III－１４～III－２３）の一般合成）
　ジフェニルエーテル（１ｍｌ）にｐ－トルエンスルホン酸（６０ｍｇ，０.３２mmol），６－モノ置換アミノ－３－フェニルウラシル（１）（０.６６ｇ，２.８４mmol）及び２－ヒドロキシメチレンテストステロン（６）(１.０g, ３.１６mmol)を加え、窒素雰囲気下１５５℃で４５分撹拌する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー（Fuji Silysia２３０～４００mesh；溶出液：酢酸エチル：エタノール＝１０:１又は酢酸エチルのみ）で分離精製し、粉末結晶を得る。更に、再結晶は酢酸エチルとｎ－ヘキサンの混合溶液より行なえる。
　化合物 III-１４ (5'-Deaza-8'-ethyl-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H, 8'H)-dione)； 黄色の粉末結晶 (0.79g, 54%), mp 240℃ (decomp.)；1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3),  1.01(3H, s, 19-CH3), 1.45 (3H, t, J = 7.5 Hz, 8'-CH2CH3), 2.52-2.61 (2H, br dd, 6-H), 2.67(1H, d, J =15.6 Hz, 1β-H), 2.93(1H, d, J =15.6 Hz, 1α-H), 3.68 (1H, dd, J16α,17α=7.5 Hz, J16β,17α=8.1 Hz, 17α-H), 4.46-4.76(1H, m, 8'-CHaHb), 4.76-5.05(1H, m, 8'-CHaHb), 6.41(1H, s, 4-H), 7.21-7.45 (2H, m, Ph-mH), 7.45-7.52 (3H, m, Ph-o, pH), 8.27 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-１５ (8'-n-Butyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno [2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 黄色の粉末結晶 (0.77g, 50%), mp 200℃；1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH3), 0.99 (3H, s, 19-CH3), 1.18 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH2CH2CH2CH3), 2.45-2.62 (2H, br dd, 6-H), 2.65 (1H, d, J =15.6 Hz, 1β-H), 2.91(1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.63 (1H, dd, J16α,17α= 7.1 Hz, J16β,17α=7.1 Hz, 17α-H), 4.35-4.64 (1H, m, 8'-CHaHb), 4.64-4.94 (1H, m, 8'-CHaHb), 6.39 (1H, s, 4-H), 7.21-7.52 (5H, m, Ph-o, m, pH), 8.27 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-１６ (8'-Benzyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)；　黄色の粉末結晶 (0.72 g, 44%), mp 224 ℃； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 0.92 (3H, s, 19-CH3), 2.30 (2H, dd, J = 10.5 Hz, 6-H), 2.63 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.87 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 8.4 Hz, J16β,17α= 7.8 Hz, 17α-H), 5.37-5.61 (1H, br, 8'-CHaHb), 6.41-6.64 (1H, br, 8'-CHaHb), 7.02 (1H, s, 4-H), 7.24-7.56 (10H, m, Bn-o, m, pH and Ph-o, m, pH), 8.33 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-１７ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3',8'-diphenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione )；　燈色の粉末結晶 (0.57 g, 36%), mp 257 ℃； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.04 (3H, s, 19-CH3), 2.71 (1H, d, J= 15.6 Hz, 1β-H), 2.98 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.65 (1H, dd, J16α,17α= 8.4Hz, J16β,17α= 8.7Hz, 17α-H), 5.57(1H, s, 4-H), 7.16-7.66(10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.40 (1H, s, 5'-H)
　化合物III-１８ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methylphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)；　燈色の粉末結晶 (0.90 g, 55%), mp 246 ℃ (decomp.)； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 0.88 (3H, s, 19-CH3), 2.47 (3H, s, 8'-CH3), 2.58-2.74 (2H, br dd, 6-H), 2.92 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H), 3.16 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.68 (1H, dd, J16α,17α= 8.7 Hz, J16β,17α= 7.8 Hz, 17α-H), 6.61 (1H, s, 4-H), 6.89-7.49 (7H, m, 3'-Ph-m, pH and 8'-Ar-o, mH), 8.40-8.56 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.49 (1H, s, 5'-H)
　化合物III-１９ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(3,4-dimethylphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.90 g, 54%), mp 260 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.77 (3H, s, 18-CH3), 0.80 (3H, s, 19-CH3), 2.33 (3H, s, 8'-Ar-CH3), 2.35 (3H, s, 8'-Ar-CH3) 2.71(1H, d, J=15.0 Hz, 1β-H), 2.97(1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 7.5 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.60 (1H, s, 4-H), 6.88-7.50 (8H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ar-o, mH), 8.38 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-２０ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methoxyphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶(0.96 g, 57%), mp 250 ℃ (decomp.)； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH3), 0.81 (3H, s, 19-CH3), 2.23-2.38 (2H, br dd, 6-H), 2.71 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.93 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.62 (1H, dd, J16α,17α= 6.9 Hz, J16β,17α= 6.6 Hz, 17α-H), 3.87(3H, s, OCH3), 6.19 (1H, s, 4-H), 7.00-7.13 (7H, m, 3'-Ph- m, pH and 8'-Ar-o, mH), 7.17-7.50 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.38 (1H, s, 5'-H)
　化合物III-２１ (5'-Deaza-8'-(4-fluorophenyl)-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶(0.61 g, 37%), mp 260 ℃ (decomp.)； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.04 (3H, s, 19-CH3), 2.70 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 2.97 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1α-H), 3.66(1H, dd, J16α,17α= 8.1 Hz, J16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 5.54(1H, s, 4-H),7.18-7.54 (10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.39 (1H, s, 5'-H)
　化合物III-２２ (8'-(4-Chlorophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.56 g, 33%), mp 241 ℃ (decomp.)； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.77 (3H, s, 18-CH3), 0.85 (3H, s, 19-CH3), 2.29-2.44 (2H, br dd, 6-H), 2.79 (1H, d, J = 16.2 Hz, 1β-H), 3.07 (1H, d, J = 16.2 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 7.8 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 6.46 (1H, s, 4-H), 7.17-7.59 (10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.47 (1H, s, 5'-H)
　化合物 III-２３ (8'-(4-Bromophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione )；　燈色の粉末結晶 (0.93, 51, mp 300 ℃ (decomp.)； 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 0.83(3H, s, 19-CH3), 2.69 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H),  3.12  (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.07(1H, dd, J16α,17α= 7.9 Hz, J16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 6.56 (1H, s, 4-H), 6.69-7.52 (7H, m, 3'-Ph-m, pH and 8'-Ar-o, mH), 7.67-7.79 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.48 (1H, s, 5'-H)
　上記新規化合物（III－３～III－２３）の機器分析値を第５表と第６表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　一般式IVで表されるピリドジピリミジン化合物（IV）（IV－１～IV－２６）（９）は既知文献（２２）記載の製造方法により合成できる（製法Ｄ）。即ち、ジフェニルエーテルにｐ－トルエンスルホン酸，３－置換－６－モノ置換アミノウラシル（１）及び２－ヒドロキシメチレンコレスト－４－エン－３－オン（８）を加え、窒素雰囲気下１８０℃で４５分間加熱撹拌する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー（Fuji Silysia ２３０～４００mesh；溶出液：酢酸エチル）で分離精製し、粉末結晶を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　次に、化合物番号Ｉ－５０（検体１）、Ｉ－５４（検体２）、III－４（検体３）及びＩ－７５（検体４）の化合物を用いて、それらの検体の添加が細胞内でＡＴＰ産生に直接又は間接に貢献していることを実験により検証したので、以下実施例として説明する。
［実施例１］
　ヒト由来神経芽細胞（ニューロブラスト－マ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株の培養細胞に検体１を添加後、細胞内・外のＡＴＰ濃度を蛍光測定した。その結果を図１に示す。細胞内においては、検体１（１μＭ）添加直後から５時間後までＡＴＰ産生の増加（蛍光の強さの増加）がみられ、１２時間後には作用消失する。なお、検体処置による培養細胞の形態変化はない。
　細胞外においても、検体１（１μＭ）添加直後から５時間後までＡＴＰ産生の増加がみられＡＴＰ濃度が増加した。これは細胞内で増加したＡＴＰが細胞外に流出したものと思われる。
［実施例２］
　中枢神経系のグリア細胞の一種、培養アストロサイト細胞に検体１を添加し、蛍光測定した結果を図２Ａと図２Ｂとに示す。
　グリア細胞内のＡＴＰ量は検体１を１μＭ投与したとき、１２時間と２４時間後に有意に増加しており、細胞外についても同様な動向を示している。
［実施例３］
　ヒトグリオーマＵ２５１の培養細胞（Sig1-R transfected cells）に検体１，２をそれぞれ添加し、添加後の細胞内のＡＴＰ濃度を添加しない場合（Cont.）と相対比較した。その結果、図３に示すように検体１と検体２とはヒトグリオーマＵ２５１細胞のＡＴＰ産生量を有意に増加させていることが検証された。脂溶性の高い検体２は検体１に比較して効果が大である。なお蛍光測定は検体の投与後６時間で行った。
　なお、実施例１～３は脳神経細胞（ニューロン）に関して実験したものであるが、脳神経細胞（ニューロン）は酸素（Ｏ２）とグルコースとを必要とする。これらの２物質は血中よりグリア（アストロサイト）にまず取り込まれ、その後グリアからニューロンへと伝達される。検体も同様である。よって検体によるグリア内ＡＴＰ量増加は、グリアの働きを直接的に促進していることを示すと共に、間接的にニューロンを賦活することを示唆する。
［実施例４］
　幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養した。
　発達初期の細胞（培養１日目）に検体１を１回添加し、３日後（培養４日目）に海馬神経細胞（ニューロン）の神経軸索（Axon）、樹状突起（Dendrite）や発達するシナプス数を定量した。検体１（０.１μＭ，０.３μＭ，１.０μＭ）は培養１日目に１回のみ添加した。添加３日後（培養４日目）において、AxonとDendriteをｔａｕ抗体とＭＡＰ２抗体とを用いてそれぞれ免疫染色し、形態観察を行った。
　図４は海馬神経細胞軸索（Axon）の免疫染色画像を示したもので、培養４日目にｔａｕ抗体にて軸索を免疫染色した。左はControl（対照群）、右は培養１日目に検体１（１μＭ）を１回のみ添加した検体処置神経細胞を示す。
　図５は海馬神経細胞軸索（Axon）の分岐数を示したもので、培養４日目にｔａｕ抗体にて軸索の分岐数を定量した。実験は細胞体を中心に１０μｍ間隔で同心円（図示せず）を描き、その円を交差する軸索の本数を計測した。
　図４と図５から、検体１は濃度依存的に神経軸索（Axon）の伸展・発達と、その分岐数を増加させることを示した。なお、検体濃度０．３μＭと１．０μＭではほぼ同程度の最大薬効を示した。
　図６は海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の免疫染色画像を示したもので、培養４日目にＭＡＰ２抗体にて樹状突起を免疫染色した。左はControl（対照群）、右は培養１日目に検体１（１μＭ）を１回のみ添加した神経細胞を示す。
　図７は海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を示したもので、培養４日目にＭＡＰ２抗体にて免疫染色し、樹状突起の分岐数を定量した。実験は、細胞体を中心に１０μｍ間隔で同心円（図示せず）を描き、その円を交差する樹状突起の本数を計測した。
　図６と図７から、検体１は濃度依存的に樹状突起の伸展と、その分岐数を増加させることを示した。なお検体濃度０．３μＭと１．０μＭではほぼ同程度の最大薬効を示した。
　次いで、培養１４日目における興奮性シナプスをＶＧＬＵＴ１抗体を用いて免疫染色し、シナプス数を定量した。
　図８は、オータプス標本におけるシナプスの免疫染色画像を示したもので、左はControl（対照群）、右は培養１日目に検体１（１μＭ）を１回のみ添加し、培養１４日目に、ＶＧＬＵＴ１抗体にて興奮性シナプスを免疫染色した神経細胞を示す。
　図９は、海馬神経細胞に投射する興奮性シナプスの増加を計測した図である。脳には神経の興奮と抑制とを速やかに伝達するグルタミン酸作動性とＧＡＢＡ作動性の２シナプスがあるが、図９は培養１４日目に、ＶＧＬＵＴ１抗体にて免疫染色し、興奮性シナプス数を定量したものである。
　図８と図９から、検体１は０．３μＭの添加により興奮性シナプス数を有意に最大値まで増加させることを示した。
［実施例５］
　実施例４と同様に、幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養した。
　成熟培養海馬細胞（培養１１日目）に検体１を１回投与して３日後（培養１４日目）に海馬神経細胞（ニューロン）の神経軸索（Axon）、樹状突起（Dendrite）の様子を観察した。培養１４日目の軸索は伸展および軸索同士の交差が著しく、軸索本数の定量が不可能であったので、樹状突起の形態のみを観察した。
　図１０は、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の免疫染色画像を示したもので、左はControl（対照群）、右は培養１４日目の画像で、検体１を投与し、培養１４日目にＭＡＰ２抗体にて免疫染色したものである。
　図１１は、培養１４日目の発達後期に、ＭＡＰ２抗体にて免疫染色し、樹状突起（Dendrite）の分岐数を検体濃度０．１～１μＭで定量したもので、細胞体を中心に１０μｍの間隔で同心円を描き、その円と交差する樹状突起の本数を計測した。
　樹状突起は幼若培養細胞４日目（図７）と比較して、細胞体から生える樹状突起の本数は、培養日数に依存して増加している（図１１）。添加される検体濃度（０．３μＭと１μＭ）によって樹状突起は成熟培養細胞でも増加する傾向は認められるものの、培養４日目の細胞でみられた薬効ほどの顕著な分岐数の増加は認められなかった。
　実施例４及び５の実験結果を踏まえると、検体添加によりラットの幼若・成熟培養神経細胞の発達・分岐・シナプス数の増加や促進が神経細胞内のＡＴＰ産生増加で促進されていることを間接的に証明しているといえる。
［実施例６］
　成熟Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１０～１７週齢、体重２８～３１ｇ）に、一方には生理食塩水（Control）を他方には検体３（１０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、２２時間後にそれぞれのマウスの皮質（Cortex）と海馬（Hippocampus）領域を含む脳薄切片（スライス）標本を作製した。外液に８０ｍＭ ＫＣｌ（８０Ｋ）を添加して細胞膜の脱分極を起こし、その結果生じるミトコンドリア内のＣａ２＋濃度の増加をＲｈｏｄ－２（注１）を用いて蛍光的方法にて計測した。脳スライスにおいて、８０Ｋによる増加するＣａ２＋濃度（注２）が検体３により、いかに抑制されるのかを指標とし、ミトコンドリアでのＡＴＰ活性に検体３が積極的に関与していることを間接的に検証した（注３）。
　（注１）Ｒｈｏｄ－２：ミトコンドリアに選択的に取り込まれるＣａ２＋蛍光色素
　（注２）８０Ｋによる神経細胞膜の脱分極は細胞外から細胞内へのＣａ２＋の流入と細胞内のＣａストアーからのＣａ２＋の遊離の両者によって起こる。細胞内に増加した遊離Ｃａ２＋は細胞内の独立器官であるミトコンドリア内へと容易に流れ込む。その結果ミトコンドリア内のＣａ２＋濃度が上昇する。
　（注３）８０Ｋ刺激による脱分極で神経細胞質内に増加した遊離Ｃａ２＋は直ちに細胞質内からミトコンドリア内に速やかに移行する。検体によるミトコンドリア内遊離Ｃａ２＋濃度の減少は神経細胞質膜に存在する外向きＣａポンプによって遊離Ｃａ２＋が細胞外へ汲み出されるか、ミトコンドリア内部の一部に吸着、固定される。そのためのエネルギーはミトコンドリアで産生されるＡＴＰから供給される。よって得られた結果から、腹腔内注射された検体３は血液中からグリア（アストロサイト）細胞を経て大脳皮質や海馬ニューロン内のミトコンドリア内に取り込まれ、このことによりミトコンドリアでのＡＴＰ産生が活性化して神経細胞が活性化され、神経細胞膜上のＣａポンプがエネルギー源のＡＴＰをミトコンドリアから得て、余分な細胞内遊離Ｃａ２＋を細胞外へと排出し、神経細胞を間接的に保護する。
　図１２は、Ｋ＋脱分極によって生じる大脳皮質ニューロン（神経細胞）内に存在するミトコンドリア内のＣａ２＋濃度上昇と検体３によるその抑制効果を計測した図である。
　ａは、正常マウスから得た脳スライス標本に８０ｍＭ ＫＣｌ外液（５分間適用後５分間洗浄）を３回連続した時のコントロール反応。縦軸はミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度の増加の蛍光測定の結果を示す。
　ｂは、検体３を１０μｇ／ｋｇ腹腔内（i.p.）注射後２２時間後にラットより摘出作製した脳スライス標本に８０Ｋ外液を与えた時のミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度の変化。ａと比較してＣａ２＋濃度上昇の抑制と８０Ｋ脱分極によって上昇したＣａ２＋濃度のより速い回復がみられる。
　ｃは、大脳皮質ニューロンのミトコンドリア内におけるＣａ２＋濃度に対するコントロールと検体３の比較。１０μｇ／ｋｇでＣａ２＋濃度抑制の最大効力がみられる。（1000倍量の１０ｍｇ／ｋｇの結果と変わらない。）（ｎ＝３平均値：同一固体から得た３枚のスライスから得たデータ）
　図１３は、海馬ニューロン（神経細胞）のＫ＋脱分極によるミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度上昇を計測した図である。
　ａは、８０ｍＭ ＫＣｌ外液（５分間適用後５分間洗浄）を３回連続した時のコントロール反応。
　ｂは、検体３を１０μｇ／ｋｇ腹腔内注射後２２時間後に脳スライス標本を作製し、これに８０Ｋ外液を与えた時のミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度の変化を示す図。
　ｃは、海馬ニューロンのミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度のコントロールと検体３の１０μｇと１０ｍｇ／ｋｇ i.p.による抑制効果の比較を示す図。１０μｇ／ｋｇで最大効果が得られる。（ｎ＝３平均値：同一個体から得た３枚のスライスから得たデータ）
　実施例６の実験結果を踏まえると、検体３は１０μｇ／ｋｇ i.p.生体内前処置により、マウス皮質と海馬神経細胞（ニューロン）の８０Ｋ脱分極によるそれぞれのミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度の上昇を顕著にしかも最大限に減少する。本結果は検体３が脳虚血時などに生じる神経細胞の損傷を救済することを示唆する。
　即ち、成熟マウス脳細胞（ニューロン）を損傷するミトコンドリア内遊離Ｃａ２＋増加によるＣａ負荷に対して、検体３によるＡＴＰ増加が細胞膜上のＣａポンプを賦活してミトコンドリア内遊離Ｃａ２＋量を減少させ、その結果として神経細胞死の防止に貢献することを示す（ＡＴＰ増加の間接的証明）。
［実施例７］
　脳虚血モデル成体ラットによる運動の行動の低下に対して検体添加が及ぼす効果を確認するための実験を行った。
　ウイスター系成熟ラット（体重２００～２３０ｇ）の頭蓋骨に吸入麻酔科で小穴をあけた後、右脳線条体にコントロール群には生理食塩水、出血群には０．２４Ｕのコラゲナーゼ（type IV）を含む生理食塩水１．２μｌを注入して脳内出血モデルラットを作製した。
　図１４は、脳内出血モデルラットの脳断面を示す図である。
　脳内出血モデルラットに対する検体４の脳細胞保護作用を確認するために、コラゲナーゼ投与の１時間後に検体４を１００μｇ／ｋｇを脳内のスポット（図中／白色菱形）へ注入し、ラットの運動足跡を定量的に量測定した。
　運動量の測定はラットを５分間動画撮影。その撮影時間の後半の３分間の自由行動（運動距離と運動スピード）を解析した。
　図１５はラットの運動足跡を測定した図であり、図１６は運動距離と運動スピードの経日変化を計測した図である。
　検体４はラットの脳出血によって起こる虚血性の運動距離と運動スピードの低下を緩和する（図１５と１６）。その効果は出血１日目と１週間後にもみられる。
　実験結果を踏まえると、成熟ラット脳細胞の虚血損傷の防止に検体４が貢献することが示された（ＡＴＰ増加の間接的証明）。
　次いで、化合物番号II－１３（検体５）、II－３１（検体６）、III－２(検体７）、III－１４(検体１４）、IV－１０（検体９）、IN－１５（検体１０）及びIV－２３（検体１１）の化合物を用いて、それらの検体の添加により海馬神経細胞樹状突起（Dendride）の分岐数が有意に伸長しているかを検定した。
　幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて培養した。
　発達初期の細胞（培養１日目）に各検体を１回添加し、３日後（培養４日目）にＭＡＰ２抗体にて免疫染色し、樹状突起の分岐数を定量した。
　測定は細胞体（ｓｏｍａ）を中心に１０μｍ間隔で２０μｍ～１００μｍの同心円（図示せず）を描き、その円を交差する樹状突起の本数を計測した。
　検定は、細胞体からの距離毎に計測した交差する樹状突起の本数を折線グラフ化し、折線グラフ下の面積（Area Under the Curve：ＡＵＣ）に対し、Student’s  t-test, paired（ｔ－検定、両側分布）で行った。
　例数が十分にある検体に対しては最大値と最小値を外して検定をした。添加する検体濃度はいずれも０．３μＭであった。
　樹状突起が有意に伸長しているか否かの判定は、ｔ－値よりｐ－値を算出し、ｐ値がｐ＜０．０５では有意に伸長（効果＋＋）、０．０５＜ｐ＜０．２では遠位又は近位において伸長（効果＋）、ｐ＞０．２では有意差なし（効果±）とした。
　図２２～図２８はそれぞれ検体５～１０を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendride）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。
　ａは細胞体（ｓｏｍａ）からの距離に対する交差樹状突起の本数を、ｂは、ＡＵＣを比較した検定結果を示した図である。
　また、実線は検体を添加した場合を、点線は検体の添加がなかった場合（control）を示している。なおｎは標本数である。
　図から明らかなように、統計的に有意差が認められる（ｐ＜０．０５）のは検体７（III－２）と検体II（IV－２３）だけであるが、他の検体５(II－１３)、６（II－３１）、８（III－２）、９（IV－１０）、１０（IV－１５）、１１（IV－２３）についても突起伸長の効果が認められる。
　次に、検体１（TND1128）を選び、β－ＮＭＮとの作用比較実験を行った。この実験では、マウス脳スライス標本を激しい脱分極刺激に暴露した場合の引き起こされる著しい細胞質内およびミトコンドリア内Ｃａ２＋ 濃度の変動に対する抑制効果を比較、評価した。これは発明者等の予備実験において、検体１（TND1128）で２４時間処置した線虫においてSIRT１が有意に上昇する知見が得られたので、投与２４時間後においてβ－ＮＭＮでも同様な効果が得られるか比較するためである。
［実験方法］
　脳スライス標本作成とカルシウム濃度計測：２４時間前に検体１を皮下投与したマウス（C57B/6NL）の全脳スライス（３００μｍ）を正中線で半切した全脳半切標本を用いた。この標本をＯ２ ９５％、ＣＯ２ ５％通気した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）内に室温で保存し、ミトコンドリアに選択的に取り込まれるXrhod-１／ＡＭ（Ｋｄ＝７００μＭ）、および細胞質に留まるｆｕｒａ－４Ｆ／ＡＭ（Ｋｄ＝７７０μＭ）で二重染色した。この標本を倒立型蛍光顕微鏡（Olympus IX71）のステージに装着したチェンバーに置き、黒色木綿片でカバーしさらに白金リングで固定して、Ｏ２ ９５％、ＣＯ２ ５％通気ＡＣＳＦで潅流した（７０ｍｌ／ｈｒ）。標本の蛍光画像を４倍の対物レンズで取得し、海馬腹側部と大脳皮質側頭部の画像を一画面に促えた。ミトコンドリア内カルシム濃度の計測には励起光５８０ｎｍにより生ずる赤色蛍光（＞６００ｎｍ）の強度変化を、細胞質のカルシウム計測には３６０ｎｍ励起と３８０ｎｍ励起による蛍光（＞５００ｎｍ）の比として求めた。計測部位（ＲＯＩ）は海馬ＣＡ１部位と大脳皮質の二カ所に置いた。
［薬物調整法と投与法］：
　β－ＮＭＮは水に溶解して、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇを、検体１はアルコールに溶解し、１ｍｇ／ｍｌとし、これを水で希釈し、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇを標本作成２４時間前にマウスに皮下投与した（０．１ｍｌ／１０ｇ）。
［効力評価法］：
　本試験では、二種の薬物の各濃度を投与したマウスから作成した脳標本を等張８０ｍＭ ＫＣｌ－ＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）に５分間暴露し、その後５分間正常ＡＣＳＦに戻す操作を三回連続で行うことで、標本に厳しいカルシウム負荷を与え、その際の、細胞質内とミトコンドリア内のカルシウム濃度の変動を計測した。
［実験結果］
　ミトコンドリア内カルシウム濃度の変動に及ぼすβ－ＮＭＮと検体１(TND1128)の作用
　図２９は、β－ＮＭＮ（Ａ：０(control)（ｎ＝６）、Ｂ：１０（ｎ＝５）、Ｃ：３０（ｎ＝５）およびＤ：１００ｍｇ／ｋｇ(ｎ＝５)）を皮下投与されたマウスから２４時間後に作成した標本を８０Ｋ ＡＣＳＦに三回暴露した時のミトコンドリアにおけるＣａ２＋濃度変動を示している。図３０は同様に８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時の検体１(TND1128）（Ａ：０(control）（ｎ＝６）、Ｂ：0.０１（ｎ＝５）、Ｃ：０．１（ｎ＝５）およびＤ：１．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）s.c.）投与マウスの脳標本におけるミトコンドリアのカルシウム濃度の変動を示す。両薬物のそれぞれの用量で処置された個体から得た標本の反応は第一回目の８０Ｋ投与時点の蛍光強度を基準として標準化(normalize）し、細胞質またはミトコンドリア内Ｃａ２＋  濃度の時間平均値とその標準誤差を示している。この図２９と図３０から両薬物は用いた用量範囲でミトコンドリア内Ｃａ２＋ 上昇を用量依存性に抑制していることは明らかである。
　図３１および図３２はそれぞれ、β－ＮＭＮと検体１(TND1128）の各濃度の作用を定量化した結果である。図３１および図３２のＡは投与時実験開始５分後から８０Ｋ－ＡＣＳＦに三回暴露し、５分洗浄した時点３５分までのミトコンドリア内カルシウム濃度の大きさを、ＡＵＣ（Area under the curve）として計算した結果である（図３７参照）。ＢとＣはそれぞれ、大脳皮質（ＣＴＸ）と海馬（ＣＡ１）における８０Ｋ投与５分間とその後の洗浄５分間（１st：５分から１５分、２nd：１５分から２５分、３rd：２５分から３５分）それぞれに対する薬物作用を示している（図３７参照）。有意差検定はＴｕｋｅｙ法を用いた。検討した用量範囲でβ－ＮＭＮとTND1128 の用量反応関係が見られた。
［細胞質内カルシウム濃度の変動に及ぼすβ－ＮＭＮと検体１(TND1128）の作用］
　図３３および図３４は８０ＫＡＣＳＦ三連続投与時の細胞質内カルシウム変動に及ぼすβ－ＮＭＮおよび検体１(TND1128）の作用を示す。図３３と図３４に示したコントロール反応は８０Ｋ－ＡＣＳＦ投与毎の反応の回復が小さく、一見、カルシウム指示薬の反応が頭打ちになっている様に見えるが、この試験に用いた細胞内カルシウム濃度指示薬ｆｕｒａ－４ＦはＣａ２＋キレート能（Ｋｄ）は７７０ｎＭであり、予想される細胞内カルシウム濃度の激しい上昇にも十分対応できると考えられるので、対照群の細胞内Ｃａ２＋ の動きは細胞質膜のＣａ２＋ ポンプの機能限界に達していることを示すものと考えることができる。β－ＮＭＮの３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ処置されたマウスから得られた標本、また、検体１(TND1128）の０．０１ｍｇ／ｋｇから１．０ｍｇ／ｋｇ処置マウスの標本では投与毎の細胞質内カルシウム濃度の変動に同様な回復が見られている。しかし、図３５および図３６に見られる様に、この値をミトコンドリアと同様な方法で定量化した場合、β－ＮＭＮの１０ｍｇ／ｋｇ投与群以外の濃度で有意な差はみられなかった。
［有効濃度から見た両薬物の作用様式］
　両薬物はほぼ同程度のミトコンドリア内 Ｃａ２＋ 濃度制御作用を示すが、有効濃度からその作用は検体１(TND1128）の方が１００倍強力であった。非特許文献６ではβ－ＮＭＮ投与後、ＮＡＤ＋ が３０分後にはピークに達し、投与されたＮＭＮの血中濃度はそれに対応して減少すると報告しており、投与されたＮＭＮがＮＡＤ＋ 生合成の基質になっている可能性を示している。しかし、本実験で用いた検体１（TND1128）有効量は１．０ｍｇ／ｋｇ以下の微量であり、これをβ－ＮＭＮと同じように生合成の原料と考えることはできない。最終的にミトコンドリアの酸化的エネルギー獲得過程でのＮＡＤ＋ の生合成量が増えているとしても、投与後２４時間後に見られた有意なミトコンドリア機能安定作用はサーチュイン遺伝子群の発現促進によるＮＡＤ＋ 増加によるものと考えるべきであろう。本研究では２４時間前に投与したβ－ＮＭＮで有意なミトコンドリア保護機能が見られたことから、β－ＮＭＮの作用も単純にＮＡＤ＋ の基質として供給された結果ではなく、サーチュイン遺伝子群への作用を介したものと考えるべきであろう。
　一方、細胞質内Ｃａ２＋ 濃度の８０Ｋ－ＡＣＳＦによる激しい上昇に対する作用についてはβ－ＮＭＮおよび検体１(TND1128）共に有意な作用を示さなかった。図２９と図３０に示すβ－ＮＭＮ１００ｍｇ／ｋｇと検体１（TND1128）１ｍｇ／ｋｇのミトコンドリア内Ｃａ２＋濃度変動に対する作用と、図３３と図３４に示すβ－ＮＭＮおよび検体１（TND1128）の細胞質内Ｃａ２＋ 濃度変動に対する作用から、この標本では８０Ｋ－ＡＣＳＦの激しい刺激にもかかわらず、極めて安定した生理学的反応を維持ができる状態であることを示している。これがヒトの脳で再現できれば、強力な脳保護作用を期待することができる。
　すでに赤ワインの成分であるresveratrolやその誘導体としてSRT1720などの合成サーチュイン活性化薬物の薬理作用が報告されているが（非特許文献８）、実際に本実験のように皮下投与されたマウス脳のミトコンドリア機能に対する有効性を言及した報告はない。
　以上から明らかなように、検体１（TND1128）は疎水性が高く、極めて安定な化合物であることが、β－ＮＭＮを凌ぐさらに大きな利点である。
　この利点を利用して、外用薬を調整し、衰えた毛根を活性化して、白髪や禿げの治療に、また、たるんだ皮膚細胞の若返りにも使用可能と思われる。さらに、経皮吸収によって脳への作用も期待できるのではないかと思われる。
　上述の実験結果を踏まえると、式（Ｉ）～（IV）で表わされる５－デアザフラビン化合物は細胞内でのＡＴＰ産生を賦活しているといえる。

Claims (4)

  1. 　細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するための式（Ｉ）で表わされる５－デアザフラビン化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ３及びＲ４は、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。）
  2. 　細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するための式（II）で表わされるピリドジピリミジン化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１及びＲ３は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
  3. 　細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するための式(III）で表わされるデアザフラビノテストステロン化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
  4. 　細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するための式（IV）で表わされるデアザフラビノコレステロール化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
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