WO2019151516A1 - 細胞内でのatp産生を賦活するための補酵素因子の使用 - Google Patents

細胞内でのatp産生を賦活するための補酵素因子の使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2019151516A1
WO2019151516A1 PCT/JP2019/003860 JP2019003860W WO2019151516A1 WO 2019151516 A1 WO2019151516 A1 WO 2019151516A1 JP 2019003860 W JP2019003860 W JP 2019003860W WO 2019151516 A1 WO2019151516 A1 WO 2019151516A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
substituted
phenyl
alkyl group
specimen
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/003860
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
朝文 永松
紀生 赤池
Original Assignee
テラ・ストーン株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2019009224A external-priority patent/JP6717989B2/ja
Priority to EP23217881.4A priority Critical patent/EP4324528A2/en
Priority to US16/637,280 priority patent/US11439644B2/en
Priority to KR1020227043212A priority patent/KR102521763B1/ko
Priority to KR1020227043210A priority patent/KR102521761B1/ko
Priority to KR1020207003037A priority patent/KR102478363B1/ko
Application filed by テラ・ストーン株式会社 filed Critical テラ・ストーン株式会社
Priority to EP19747358.0A priority patent/EP3750543A4/en
Priority to CA3071744A priority patent/CA3071744C/en
Priority to CN201980003658.9A priority patent/CN111032051A/zh
Priority to KR1020227043211A priority patent/KR102521762B1/ko
Publication of WO2019151516A1 publication Critical patent/WO2019151516A1/ja
Priority to US17/738,022 priority patent/US11813265B2/en
Priority to US17/738,027 priority patent/US11806351B2/en

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33Heterocyclic compounds
    • A61K31/395Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16Anti-Parkinson drugs
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24Antidepressants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to the use of a coenzyme factor for activating ATP production in a cell, and more particularly to the use of a coenzyme factor that assists an oxidoreductase involved in ATP production.
  • Non-patent Document 1 Research is also progressing on the relationship between the sirtuin gene and mitochondria, and when the sirtuin gene is activated, the amount of mitochondria that are organelles in the cell increases, and it is further activated to prevent dementia, arteriosclerosis, hearing loss prevention, It is considered that not only the burning of fat, cell repair, and removal of active oxygen are promoted to suppress the expression of aging factors, but also the effect of healing mitochondrial disorders can be obtained (Non-patent Document 2).
  • NMN Neurotinamide mononucleotide
  • SIRT2 one of the long-lived protein sirtuin genes discovered by Prof. Imai et al., Is a heterochromatin component that terminates transcription with telomere and ribosomal DNA, and it has become clear that it is a NAD-dependent histone deacetylase. It was. This enzyme restores the binding of DNA to histones weakened by acetylation by deacetylation, enhances the wrapping of DNA around histones, and suppresses transcription, which is thought to be related to longevity. (Non-Patent Document 4).
  • NAD + Natural Acidamide Adenine Dinucleotide
  • NMN + NAD + is an intermediate substance in NAD + synthesis.
  • Non-patent Document 5 has been reported to be involved in the anti-aging action.
  • NAD + is one of the most important molecules of energy production involved in the first stage of oxidative phosphorylation in mitochondria and the oxidation reaction in the TCA cycle.
  • SIRT1 which is one of long-lived protein sirtuin genes, is known to be mainly involved in the repair and regeneration of damaged mitochondria while expressed in the nucleus. Furthermore, it has been clarified that SIRT3, SIRT4, and SIRT5 are mainly expressed in mitochondria among the seven sirtuin genes of mammals that have been discovered so far (Non-patent Documents 7 and 8). Summing up these results, it is considered that various sirtuin genes are involved in the life extension action through activation of mitochondrial function (Non-patent Document 9).
  • NMN a precursor compound of NAD + (nicotine, amide, adenine, dinucleotide)
  • NAD + oxidative phosphorylation by the electron transfer system in mitochondria and ATP (adenosine triphosphate) which is a life-sustaining energy source produced by the glycolytic system in the cytoplasmic substrate are reduced (Non-patent Document 10).
  • NADH Dihydro-nicotinamide adenine dinucleotide
  • FADH 2 Dihydro-flavin adenine dinucleotide
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • NAD + nicotinamide mononucleotide
  • the primary source of FAD in eukaryotic metabolism is the cytoplasmic substrate on which mitochondrial citrate cycle and ⁇ -oxidation take place.
  • FAD functions as a coenzyme for succinate dehydrogenase that oxidizes succinic acid to fumaric acid, and in ⁇ -oxidation, it functions as a coenzyme for the enzyme reaction of acyl CoA dehydrogenase.
  • NMN and NAD + belonging to the redox (oxidation-reduction) system are easily decomposed in the metabolic system and are chemically unstable, and it is considered difficult to develop them as future medicines.
  • combines it will become expensive. Therefore, there is a strong demand for the development of chemicals that are sufficiently satisfactory as pharmaceuticals in that they have an excellent ATP production function activation action and exhibit excellent pharmacokinetics (absorbability in the body, transferability into the brain, etc.).
  • a 5-deazaflavin (pyrimido [4,5-b] quinoline-2,4 (3H, 10H) -dione) derivative having a unique chemical structure in which N at the 5-position of riboflavin is substituted with CH was introduced in 1970 It is the first compound synthesized as an analog.
  • derivatives of 5-deazaflavin those showing excellent anticancer activity and those having antiherpesvirus activity are known, and some are used as anticancer agents and antiherpesvirus agents (Patent Documents 1 to 5). ).
  • Non-patent Document 11 Catalytic function for the conversion reaction of alcohols to ketones and aldehydes accompanying the change in structure, conversion reaction of amines to imines (ketones), reduction of carbonyl compounds to alcohols, reduction of imines to amines and asymmetry Reductions and similarities with NAD + (nicotinamide nucleotide) have also been studied (Non-patent Document 11).
  • Various patent literatures have been published on mitochondrial function activators (Patent Literatures 6 to 8). However, there is no literature that focuses on the redox catalytic activity of this 5-deazaflavin derivative and applied to the mitochondrial function activation action.
  • 5-deazaflavin derivatives have redox catalytic activity, it is clear that they influence the ATP production function in mitochondrial oxidative phosphorylation.
  • 5 Deazafurabin skeleton is found in a redox reaction involving the coenzyme coenzyme F 420 methane fermentation (Coenzyme F 420), are also analogs of flavin. Its redox behavior is similar to NAD (P) + rather than flavin.
  • NAD (P) + One of the resonance limit formulas has a NAD (P) + structure built into the molecule, and the electron density (determined by molecular orbital calculation chemistry) is “flavin type NAD (P) + ”. Can be considered.
  • 5-deazaflavin has the same redox (redox) function as NAD + and FAD, and therefore activates ATP production in the cell and further directly or indirectly activates the sirtuin gene.
  • redox redox
  • 5-deazaflavin compounds with a specific structural formula are chemically very stable, can be synthesized at low cost, activate ATP production, and activate sirtuin genes that control mitochondrial functions As a result, the present invention has been completed.
  • An object of the present invention is to provide a 5-deazaflavin compound having a structural formula effective to activate ATP production in cells among various 5-deazaflavin derivatives.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems, prepared 5-deazaflavin derivative compounds having various different structural formulas as specimens, and used them to conduct various experiments in vitro. As a result, a compound having a structural formula that increases ATP production in cells was found.
  • the present inventors have replaced the nitrogen at the 5-position of the flavin skeleton of riboflavin (vitamin B 2 ), which is known as a growth factor and is a water-soluble vitamin, with a methylene group as an analog of NMN (see FIG. 17). Focused on deazaflavin. 5-Deazariboflavin antagonized riboflavin and showed potent anticoccidial activity. Recently, coenzyme F 420 (see Fig. 18) with a 5-deazaflavin skeleton was found from methanogens, and it plays an important role in the process of reducing carbon dioxide to methane and biosynthesis of antibiotics. I understand that.
  • the redox behavior of 5-deazaflavin is similar to NAD (P) + (see FIG. 19) rather than flavin.
  • One of the resonance limit formulas has a NAD (P) + structure built into the molecule, and the electron density (determined by molecular orbital calculation chemistry) is “flavin type NAD (P) + ”.
  • P the electron density (determined by molecular orbital calculation chemistry) is “flavin type NAD (P) + ”.
  • the 5-position of the 5-deazaflavin ring is very ⁇ -electron deficient (net charge net charge: +0.24)
  • the 4-position of nicotinamide nucleotide is similarly ⁇ -electron deficient (net charge: +0.210).
  • the 5-deazaflavin ring is considered to belong to both the NAD (+) and FAD (see FIG. 21) electron transport systems.
  • Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is an electron carrier used in all eukaryotes, many archaea, and eubacteria.
  • this 5-deazaflavin compound which has a redox function similar to NAD + and FAD, is chemically very stable and inexpensive compared to ⁇ -NMN, which is currently being studied for use in pharmaceuticals supplemented with NMN.
  • the inventors thought that they could be synthesized, activated NAD + , and also directly or indirectly activated mitochondrial longevity genes (SIRT1 and SIRT3). That is, the inventors have activated FOXO1, which is a target transcription factor of SIRT1, for the purpose of evaluating the activation of the longevity gene SIRT1, which is activated depending on NAD + and has already been revealed as an important gene for maintaining mitochondrial function. Screening evaluation of mRNA increase was performed by q-RT-PCR method using HCT116 cells with expression as an activity index.
  • the compound according to the present invention has the ability to activate SIRT1 at a lower dose as compared with ⁇ -NMN. Therefore, it can be expected that the compound according to the present invention directly activates NAD + and continuously produces ATP even under pathological conditions such as ischemia, and the effect is sustained and strong. Therefore, it is considered that the compound according to the present invention has sufficient requirements for development as a pharmaceutical product.
  • the chemical structure is functionally and electronically close to the combined structure of the core part of NAD + and FAD coenzyme, that is, a hybrid structure of nicotinamide and flavin, the side effect is expressed. I can guess that there will be almost none.
  • the structure of the compound according to the present invention has a higher redox potential and superior redox ability than NAD and FAD as coenzymes, as judged from the measured redox potential.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the compounds represented by the following formulas (I) to (IV) were identified as effective coenzyme factors for activating ATP production in cells according to the present invention.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or a phenyl group
  • R 2 represents an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group
  • R 3 and R 4 represent a hydrogen atom, a lower alkyl group, a halogen atom, a hydroxyl group, Represents a nitro group, a cyano group, a lower alkoxy group, a phenyl-substituted lower alkoxy, a lower alkylamino group, a phenyl
  • R 1 and R 3 are substituted with a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or one of a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 2 is substituted with one of an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or a phenyl group substituted with one of a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 2 represents an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group, a phenyl group substituted with one of a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group, and a lower alkyl disubstituted phenyl group.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group, a halogen-substituted alkyl group, a carboxy-substituted alkyl group, or a phenyl group substituted with one of a phenyl group, a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group.
  • R 2 represents an alkyl group, a cycloalkyl group, a phenyl-substituted lower alkyl group, a phenyl group, a phenyl group substituted with one of a halogen atom, a lower alkyl group, or a lower alkoxy group, and a lower alkyl disubstituted phenyl group.
  • the coenzyme factor that activates ATP production provided by the present invention, it is possible to improve the functional decline of energy production in cells. Therefore, it is extremely useful as a prophylactic / therapeutic agent for Alzheimer's disease, Parkinson's disease, neurodegenerative diseases and depression associated with cerebral hemorrhage / infarction.
  • FIG. 1 shows the results of fluorescence measurement of the ATP concentration inside and outside the cell after adding specimen 1 to cultured cells of human-derived neuroblastoma (neuroblastoma) SH-SY5Y strain.
  • FIG. 2A is a diagram showing the result of fluorescence measurement by adding specimen 1 to a type of central nervous system glial cell, cultured astrocyte cells.
  • FIG. 2B is a diagram quantifying the measurement results in FIG. 2A.
  • FIG. 3 is a diagram showing a relative comparison with the case where the specimens 1 and 2 were added to cultured cells of human glioma U251 (Sig1-R transfected cells) and the intracellular ATP concentration was not added (Cont.). It is.
  • FIG. 1 shows the results of fluorescence measurement of the ATP concentration inside and outside the cell after adding specimen 1 to cultured cells of human-derived neuroblastoma (neuroblastoma) SH-SY5Y strain.
  • FIG. 2A is a diagram showing the result
  • FIG. 4 shows the hippocampal neuron (neuron) nerve axis after collecting hippocampal cultured cells from a young (day 0) ICR mouse brain, culturing the neurons in a culture dish, and adding the specimen 1 It is an immuno-staining image showing the extension, development, and branching of the cord (Axon).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of measuring the number of branches of the hippocampal nerve cell axon (Axon) by adding the specimen 1 in the same manner as in FIG.
  • FIG. 6 is an immunostained image showing the extension / development / branching of hippocampal neuronal dendrites (Dentrite) after addition of specimen 1 as in FIG.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of measuring the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) by adding specimen 1 as in FIG.
  • FIG. 8 is an immunostained image of a synapse in an autopsy specimen cultured as in FIG. 4 and immunostained for excitatory synapses on the 14th day.
  • FIG. 9 is a diagram in which the number of excitatory synapses on the 14th day was quantified after culturing in the same manner as in FIG.
  • FIG. 10 is an immunostained image of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) quantified 3 days later (day 14 of culture) after sample 1 was administered once to mature cultured hippocampal cells (day 11 of culture).
  • FIG. 11 is a diagram in which the number of branches of dendrites (Dendrite) was measured by immunostaining with the MAP2 antibody during the development period of the 14th day of culture, as in the case of FIG.
  • FIG. 12 shows that adult C57BL / 6N mice (10 to 17 weeks old, body weight 28 to 31 g) were administered physiological saline (control) and specimen 3 (10 ⁇ g / kg) intraperitoneally, and after 22 hours the cortex and cortex A brain thin slice (slice) specimen containing the hippocampus region was prepared, and 80 mM KCl (80 K) was added to the external solution to cause depolarization of the cell membrane, and in the cerebral cortical neurons (neuronal cells) generated by K + depolarization
  • FIG. 12 shows that adult C57BL / 6N mice (10 to 17 weeks old, body weight 28 to 31 g) were administered physiological saline (control) and specimen 3 (10 ⁇ g / kg) intraperitoneally, and after 22 hours the cortex and cortex A
  • FIG. 6 is a diagram in which the Ca 2+ concentration increase in mitochondria existing in the urine and the inhibitory effect by the specimen 3 are measured.
  • FIG. 13 is a diagram in which the increase in intramitochondrial Ca 2+ concentration due to K + depolarization of hippocampal neurons (neurons) and its inhibitory effect by specimen 3 were measured, as in FIG.
  • FIG. 14 shows that after making a small hole in the skull of a Wistar adult rat (200 to 230 g body weight) under inhalation anesthesia, the right brain striatum is filled with 0.24 U collagenase (in the control group, physiological saline, and in the bleeding group).
  • FIG. 15 shows that, in order to verify the brain cell protective effect of specimen 4 on intracerebral hemorrhage model rats, 100 ⁇ g / kg of specimen 4 was injected into a spot in the brain 1 hour after administration of collagenase, and the exercise footprint of the rat was quantitatively determined.
  • FIG. FIG. 16 is a diagram in which the daily change in the exercise distance and exercise speed of the rat with or without sample 4 administration was measured in the same manner as in FIG.
  • FIG. 17 shows the chemical structural formula of ⁇ -NMN.
  • FIG. 18 is a diagram showing the chemical structural formulas of coenzyme F 420.
  • FIG. 19 is a diagram for explaining the chemical structural formula of NAD (P) + and its redox reaction (Redox).
  • FIG. 20 is a graph showing electron densities obtained by molecular orbital calculation chemistry of 5-deazaflavin and NAD (P) + flavin ring.
  • FIG. 21 is a diagram for explaining the structural similarity with FAD as a comparison with NAD + .
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 5.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 6.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 7.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite) after adding specimen 8.
  • FIG. 26 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) with the addition of specimen 9.
  • FIG. 27 is a diagram showing the result of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) with the specimen 10 added.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrite (Dendrite) with the specimen 10 added.
  • FIG. 29 is a diagram showing the analysis result of intramitochondrial Ca 2+ in the brain specimen of a mouse subcutaneously administered with ⁇ -NMN 24 hours ago. Samples stained with the mitochondrial selective Ca 2+ indicator Xrhod-1 were exposed to 80K ACFS for 5 minutes—washing for 5 minutes was repeated three times.
  • a dose of ⁇ -NMN was administered subcutaneously, and whole brain slices were prepared 24 hours later and stained with a mitochondrial-specific Ca 2+ indicator Xrhod-1. From the red (> 600 nm) fluorescence image upon excitation at 580 nm, the intramitochondrial Ca 2+ increase obtained by three 80K ACSF stimulations was measured over time.
  • FIG. 30 is a diagram showing the analysis result of intra-mitochondrial Ca 2+ in the brain specimen of a mouse to which specimen 1 (TND1128) was subcutaneously administered 24 hours ago. The specimen stained with the mitochondrial selective Ca 2+ indicator Xrhod-1 was repeatedly exposed to 80K ACFS for 5 minutes—washing for 5 minutes three times as in FIG.
  • FIG. 31 is a graph showing the dose-response relationship of the protective effect on the mitochondrial Ca 2+ concentration when ⁇ -NMN is exposed to 80K ACSF.
  • the data in FIG. 29 were quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • CX cerebral cortex
  • CA1 hippocampus
  • FIG. 32 is a graph showing the amount-response relationship of the protective effect on the mitochondrial Ca 2+ concentration when the specimen 1 (TND1128) is exposed to 80K ACSF.
  • the data in FIG. 29 were quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • FIG. 33 is a diagram showing the analysis results of cytoplasmic Ca 2+ in a brain specimen of a mouse subcutaneously administered with ⁇ -NMN 24 hours ago.
  • Each dose of ⁇ -NMN was administered subcutaneously, and 24 hours later, whole brain slice specimens were prepared, and the brain slice specimens were stained with Ca 2+ indicator Fura-4F that remained in the cytoplasm.
  • the ratio of the fluorescence intensity (F360 and F380) of blue-green color (> 500 nm) when excitation light of 360 nm and 380 nm is given from this brain specimen is obtained over time every 10 seconds, and is obtained by three 80K-ACSF stimulations. Time course of cytosolic Ca 2+ increase.
  • FIG. 34 is a view showing the analysis results of cytoplasmic Ca 2+ in a brain specimen of a mouse subcutaneously administered with Specimen 1 (TND1128) 24 hours ago. The specimen stained with cytoplasm-selective Ca 2+ indicator Fura-4F was subjected to 3 times of 5 minutes 80K ACFS exposure and 5 minutes washing operation as in FIG.
  • FIG. 35 is a graph showing a dose-response relationship of protective effect on cytoplasmic Ca 2+ concentration when ⁇ -NMN is exposed to 80K ACSF.
  • the data in FIG. 33 was quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • A ⁇ relative to the amount of Ca 2+ uptake in cytoplasm in the cerebral cortex (CTX) (white) and hippocampus (CA1) (black) over the entire 80K ACSF three consecutive exposures.
  • action of -NMN B 80K ACSF exposure in the cerebral cortex, the dose-response relationship of Ca 2+ uptake in the cytoplasm in each time
  • C 80K ACSF exposure in the hippocampus, the dose-response relationship of Ca 2+ uptake in the cytoplasm in each time
  • FIG. 36 is a graph showing the amount-response relationship of the protective effect on the cytosolic Ca 2+ concentration when the specimen 1 (TND1128) is exposed to 80K ACSF.
  • the data of FIG. 34 were quantitatively summarized (see FIG. 37).
  • CTX cerebral cortex
  • CA1 hippocampus
  • FIG. 37 is a diagram illustrating a method for quantifying the amount of Ca 2+ increase in mitochondria or cytoplasm when exposed to 80K for three consecutive times.
  • the 5-deazaflavin compounds (I-1 to I-118) (3) represented by the general formula I can be synthesized by the production methods described in known literatures (1 to 14).
  • most derivatives can be synthesized by the general production method described in Document (1) described in (Production Method A). That is, 6-N-substituted-aminouracils (1) and appropriate o-halogenobenzaldehyde (2) are heated to reflux in dimethylformamide (DMF). The heating time is suitably 3-7 hours.
  • the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the residue is recrystallized from an appropriate solvent (alcohol, dioxane, DMF, etc.) to obtain the corresponding 5-deazaflavin (3).
  • the pyridodipyrimidine compounds (II) (II-1 to II-32) (5) represented by the general formula II can be synthesized by the production methods described in known literatures (15 to 19).
  • most derivatives can be synthesized by the general production method described in Document (15) described in (Production Method B). That is, 6-N-substituted-aminouracils (1) and a suitable 3-substituted-6-chlorouracil-5-carbaldehyde (4) are heated to reflux in dimethylformamide or acetic acid. The heating time is suitably 2 to 5 hours.
  • the reaction solution is concentrated under reduced pressure, and the residue is recrystallized with a suitable solvent (alcohol, acetic acid, DMF, etc.) to obtain the corresponding pyridodipyrimidine (5).
  • the deazaflavinotestosterone compounds (III) (III-1 to III-2) (7) represented by the general formula III can be synthesized by the production method described in the known literature (20, 21).
  • the unknown compounds (III-3 to III-23) can also be synthesized by the same method. That is, 6-N-monosubstituted-aminouracils (1) and 2-hydroxymethylene testosterone (6) were added to diphenyl ether, and p-toluenesulfonic acid was added to the mixture, and then at 180 ° C. in an argon atmosphere. Stir for 30 to 60 minutes under heating. After the reaction, the reaction product is purified by column chromatography. This reaction can also be synthesized by heating under pressure for several hours in dioxane.
  • Tables 5 and 6 show the instrumental analysis values of the new compounds (III-3 to III-23).
  • the pyridodipyrimidine compounds (IV) (IV-1 to IV-26) (9) represented by the general formula IV can be synthesized by the production method described in the known literature (22) (Production method D). That is, p-toluenesulfonic acid, 3-substituted-6-monosubstituted aminouracil (1) and 2-hydroxymethylenecholest-4-en-3-one (8) are added to diphenyl ether, and the mixture is heated at 180 ° C. in a nitrogen atmosphere. Heat and stir for 45 minutes. After the reaction, this is separated and purified by column chromatography (Fuji Silysia 230-400mesh; eluent: ethyl acetate) to obtain powder crystals.
  • Example 1 Specimen 1 was added to cultured cells of human-derived neuroblastoma (neuroblastoma) SH-SY5Y strain, and ATP concentrations inside and outside the cells were measured by fluorescence. The result is shown in FIG. In the cells, an increase in ATP production (increase in fluorescence intensity) is observed from 5 hours after the addition of specimen 1 (1 ⁇ M), and the action disappears after 12 hours. There is no change in the morphology of the cultured cells due to the specimen treatment. Even outside the cells, an increase in ATP production was observed from immediately after the addition of specimen 1 (1 ⁇ M) to 5 hours later, and the ATP concentration increased. This is probably because ATP increased in the cell flowed out of the cell.
  • FIG. 2A and FIG. 2B show the results of fluorescence measurement of specimen 1 added to cultured astrocyte cells, a type of central nervous system glial cells.
  • the amount of ATP in glial cells significantly increased after 12 hours and 24 hours when Sample 1 was administered at 1 ⁇ M, and the same trend was also observed extracellularly.
  • Example 3 Samples 1 and 2 were added to cultured cells of human glioma U251 (Sig1-R transfected cells), respectively, and compared with the case where the intracellular ATP concentration after addition was not added (Cont.). As a result, it was verified that sample 1 and sample 2 significantly increased the amount of ATP produced by human glioma U251 cells as shown in FIG. Specimen 2 with high fat solubility is more effective than Specimen 1. The fluorescence measurement was performed 6 hours after administration of the specimen.
  • Examples 1 to 3 are experiments on brain neurons (neurons), but brain neurons (neurons) require oxygen (O 2 ) and glucose. These two substances are first taken up into glia (astrocytes) from the blood and then transmitted from glia to neurons. The same applies to the specimen. Therefore, an increase in the amount of ATP in glia due to the specimen indicates that the function of glia is directly promoted and suggests that neurons are indirectly activated.
  • Example 4 Hippocampal cultured cells were collected from young (day 0) ICR mouse brains, and neurons were cultured in a culture dish. Specimen 1 is added once to cells in early development (culture day 1), and after 3 days (culture day 4), hippocampal neurons (neurons) nerve axons (Axon), dendrites (Dendrite) and development The number of synapses to be quantified. Sample 1 (0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1.0 ⁇ M) was added only once on the first day of culture. Three days after the addition (4th day of culture), Axon and Dendrite were immunostained with tau antibody and MAP2 antibody, respectively, and morphology observation was performed.
  • FIG. 4 shows an immunostained image of hippocampal nerve cell axon (Axon).
  • the axon was immunostained with the tau antibody on the 4th day of culture.
  • the left shows the Control (control group), and the right shows the sample-treated nerve cells to which the sample 1 (1 ⁇ M) was added only once on the first day of culture.
  • FIG. 5 shows the number of branches of hippocampal nerve cell axon (Axon).
  • the number of axon branches was quantified with the tau antibody on the 4th day of culture.
  • concentric circles (not shown) were drawn around the cell body at intervals of 10 ⁇ m, and the number of axons crossing the circles was measured.
  • 4 and 5 show that specimen 1 increases the axon extension / development and the number of branches in a concentration-dependent manner. It should be noted that the maximum drug efficacy was almost the same at the specimen concentrations of 0.3 ⁇ M and 1.0 ⁇ M.
  • FIG. 6 shows an immunostained image of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite).
  • Dendrite hippocampal neuronal dendrites
  • FIG. 7 shows the number of branches of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite). Immunostaining was performed with the MAP2 antibody on the fourth day of culture, and the number of branches of dendrites was quantified. In the experiment, concentric circles (not shown) were drawn at intervals of 10 ⁇ m around the cell body, and the number of dendrites intersecting the circles was measured. From FIG. 6 and FIG. 7, it was shown that the specimen 1 increased the dendrite extension and the number of branches in a concentration-dependent manner. The specimen concentrations of 0.3 ⁇ M and 1.0 ⁇ M showed almost the same maximum efficacy. Next, excitatory synapses on the 14th day of culture were immunostained using VGLUT1 antibody, and the number of synapses was quantified.
  • FIG. 8 shows an immunostained image of synapse in an autopsy specimen.
  • the left is Control (control group)
  • the right is sample 1 (1 ⁇ M) added once on the first day of culture, and the 14th day of culture.
  • the neuron which immunostained excitatory synapse with VGLUT1 antibody is shown.
  • FIG. 9 is a diagram in which an increase in excitatory synapses projected on hippocampal neurons is measured.
  • the brain has two synapses of glutamatergic and GABAergic that quickly transmit nerve excitement and suppression, but FIG. 9 is immunostained with VGLUT1 antibody on the 14th day of culture to determine the number of excitatory synapses. Quantified. From FIG. 8 and FIG. 9, it was shown that Sample 1 significantly increased the number of excitatory synapses to the maximum value by the addition of 0.3 ⁇ M.
  • Example 5 In the same manner as in Example 4, hippocampal cultured cells were collected from young (0-day-old) ICR mouse brain and cultured on neurons in a culture dish. Sample 1 was administered once to mature cultured hippocampal cells (cultured day 11), and after 3 days (cultured day 14), hippocampal neurons (neurons) nerve axons (Axon), dendrites (Dendrite) was observed. Since the axons on the 14th day of culture were markedly extended and crossed between axons, and the number of axons could not be determined, only the morphology of dendrites was observed.
  • FIG. 10 shows immunostained images of hippocampal neuronal dendrites (Dendrite).
  • the left is an image of Control (control group), the right is an image on the 14th day of culture, and the sample 1 is administered, and the 14th day of culture Eyes were immunostained with MAP2 antibody.
  • FIG. 11 shows immunostaining with the MAP2 antibody at the late stage of development on the 14th day of culture, and the number of dendrites (Dendrite) is quantified at a specimen concentration of 0.1 to 1 ⁇ M. 10 ⁇ m centering on the cell body. Concentric circles were drawn at intervals of, and the number of dendrites intersecting the circles was measured. The number of dendrites growing from the cell body is increased depending on the number of days of culture (FIG. 11), compared to dendrites on the fourth day of juvenile cultured cells (FIG. 7).
  • Example 6 Adult C57BL / 6N mice (10 to 17 weeks of age, body weight 28 to 31 g) were administered intraperitoneally with physiological saline (Control) on one side and specimen 3 (10 ⁇ g / kg) on the other side. Brain thin slice (slice) specimens containing mouse cortex and hippocampus regions were prepared. 80 mM KCl (80K) was added to the external solution to cause depolarization of the cell membrane, and the resulting increase in Ca 2+ concentration in the mitochondria was measured by a fluorescent method using Rhod-2 (Note 1). In brain slices, it is indirectly shown that the sample 3 is actively involved in ATP activity in mitochondria, using as an index how the Ca 2+ concentration (Note 2) increased by 80K is suppressed by the sample 3. It was verified (Note 3).
  • Rhod-2 Ca 2+ fluorescent dye that is selectively taken up by mitochondria
  • Depolarization of nerve cell membrane by 80K is caused by influx of Ca 2+ from the outside into the cell and from intracellular Ca store. It occurs by both the release of Ca 2+ . Increased free Ca 2+ in the cell easily flows into mitochondria, which is an independent organ in the cell. As a result, the Ca 2+ concentration in mitochondria increases.
  • Free Ca 2+ increased in the neurocytoplasm due to depolarization by 80K stimulation is immediately transferred from the cytoplasm into the mitochondria.
  • FIG. 12 is a diagram in which an increase in Ca 2+ concentration in mitochondria present in cerebral cortical neurons (neurons) caused by K + depolarization and its inhibitory effect by specimen 3 are measured.
  • a is a control reaction when 80 mM KCl external solution (washed for 5 minutes after being applied for 5 minutes) was continuously applied 3 times to a brain slice sample obtained from a normal mouse.
  • the vertical axis represents the result of fluorescence measurement of the increase in mitochondrial Ca 2+ concentration.
  • b shows changes in mitochondrial Ca 2+ concentration when 80 K external solution was given to brain slice specimens prepared by excision from rats 22 hours after intraperitoneal (ip) injection of specimen 3 at 10 ⁇ g / kg.
  • FIG. 13 is a diagram in which an increase in mitochondrial Ca 2+ concentration due to K + depolarization of hippocampal neurons (neuronal cells) is measured.
  • a is a control reaction when 80 mM KCl external solution (washed for 5 minutes after being applied for 5 minutes) was continued three times.
  • b is a graph showing changes in mitochondrial Ca 2+ concentration when a brain slice sample was prepared 22 hours after intraperitoneal injection of specimen 3 at 10 ⁇ g / kg and given an 80 K external solution.
  • c is a graph showing a comparison of the inhibitory effect of hippocampal neurons on the control of intramitochondrial Ca 2+ concentration and 10 ⁇ g and 10 mg / kg ip of specimen 3.
  • FIG. The maximum effect is obtained at 10 ⁇ g / kg.
  • N 3 average value: data obtained from three slices obtained from the same individual)
  • Example 7 An experiment was conducted to confirm the effect of sample addition on the reduction of exercise behavior in adult rats with cerebral ischemia. A small hole was made in the skull of a Wistar adult rat (body weight 200 to 230 g) by inhalation anesthesia, and then the right striatum was given saline (control group) for the control group and 0.24 U collagenase (type IV) for the bleeding group. An intracerebral hemorrhage model rat was prepared by injecting 1.2 ⁇ l of physiological saline containing it.
  • FIG. 14 is a view showing a cross section of the brain of an intracerebral hemorrhage model rat.
  • 100 ⁇ g / kg of specimen 4 was injected into a spot in the brain (in the figure / white rhombus) 1 hour after collagenase administration, and the rat's exercise footprint was quantitatively measured.
  • the momentum was measured by moving the rat for 5 minutes.
  • the free behavior (movement distance and speed) for the last 3 minutes of the shooting time was analyzed.
  • FIG. 15 is a diagram in which the exercise footprint of the rat is measured
  • FIG. 16 is a diagram in which the daily change in the exercise distance and exercise speed is measured.
  • Specimen 4 mitigates the decrease in ischemic distance and speed caused by rat cerebral hemorrhage (FIGS. 15 and 16). The effect is also seen on the first day and one week after bleeding. Based on the experimental results, it was shown that Specimen 4 contributes to the prevention of ischemic damage of mature rat brain cells (indirect proof of increased ATP).
  • the number of intersecting dendrites measured for each distance from the cell body is converted into a line graph.
  • the area under the line graph (Area) is Student's t-test, paired (t-test). , Two-sided distribution). For samples with a sufficient number of cases, the maximum and minimum values were removed and the test was performed. The sample concentration to be added was 0.3 ⁇ M in all cases.
  • Whether or not the dendrites are significantly elongated is determined by calculating the p-value from the t-value, and when the p value is p ⁇ 0.05, it is significantly elongated (effect ++), and 0.05 ⁇ p ⁇ An extension (effect +) was distal or proximal at 0.2, and no significant difference (effect ⁇ ) at p> 0.2.
  • FIGS. 22 to 28 are graphs showing the results of quantitative test of the number of branches of hippocampal nerve cell dendrites (Dendride) with the addition of specimens 5 to 10, respectively.
  • a is the figure which showed the number of cross dendrites with respect to the distance from a cell body (soma), and b was the test result which compared AUC.
  • the solid line indicates the case where the sample is added, and the dotted line indicates the case where the sample is not added (control). Note that n is the number of samples.
  • specimen 7 (III-2) and specimen II (IV-23) have a statistically significant difference (p ⁇ 0.05), but other specimen 5 (II -13), 6 (II-31), 8 (III-2), 9 (IV-10), 10 (IV-15), and 11 (IV-23) also show the effect of protrusion extension.
  • specimen 1 (TND1128) was selected, and an action comparison experiment with ⁇ -NMN was conducted.
  • ⁇ -NMN an action comparison experiment with ⁇ -NMN was conducted.
  • SIRT1 was significantly increased in nematodes treated with specimen 1 (TND1128) for 24 hours, so that the same effect was obtained with ⁇ -NMN 24 hours after administration. To compare.
  • ACSF artificial cerebrospinal fluid
  • This specimen was placed in a chamber mounted on the stage of an inverted fluorescence microscope (Olympus IX71), covered with black cotton strips, fixed with a platinum ring, and perfused with O 2 95%, CO 2 5% aerated ACSF (70 ml). / Hr).
  • a fluorescence image of the specimen was acquired with a 4x objective lens, and images of the hippocampal ventral region and the cerebral cortex were displayed on one screen.
  • the intensity change of red fluorescence (> 600 nm) generated by excitation light 580 nm was measured for the measurement of mitochondrial calsim concentration, and the cytosolic calcium measurement was obtained as the ratio of fluorescence (> 500 nm) by 360 nm excitation and 380 nm excitation.
  • Measurement sites were placed in two locations, the hippocampal CA1 site and the cerebral cortex.
  • ⁇ -NMN is dissolved in water to dissolve 10 mg / kg, 30 mg / kg or 100 mg / kg
  • specimen 1 is dissolved in alcohol to 1 mg / ml, which is diluted with water to give 0.01 mg / kg, 0 .1 mg / kg or 1.0 mg / kg was administered subcutaneously (0.1 ml / 10 g) to mice 24 hours before specimen preparation.
  • FIG. 31 and FIG. 32 show the results of quantifying the effect of each concentration of ⁇ -NMN and specimen 1 (TND1128), respectively.
  • FIG. 31 and FIG. 32A shows the magnitude of mitochondrial calcium concentration from AUC (Area under the curve) up to 35 minutes after 3 minutes of exposure to 80K-ACSF after 5 minutes from the start of the administration experiment. (See FIG. 37).
  • B and C are respectively 80K administration for 5 minutes in the cerebral cortex (CTX) and hippocampus (CA1) and subsequent washing for 5 minutes (1st: 5 to 15 minutes, 2nd: 15 to 25 minutes, 3rd: 25 to 35 minutes), respectively (See FIG. 37).
  • CTX cerebral cortex
  • CA1 hippocampus
  • the Tukey method was used for the significant difference test.
  • a dose-response relationship between ⁇ -NMN and TND1128 was observed in the dose range studied.
  • FIG. 33 and FIG. 34 show the effects of ⁇ -NMN and specimen 1 (TND1128) on cytoplasmic calcium fluctuations during three consecutive administrations of 80KACSF.
  • the control reactions shown in FIG. 33 and FIG. 34 show little recovery of the response for each 80K-ACSF administration. At first glance, it seems that the response of the calcium indicator has peaked, but the intracellular calcium concentration indicator used in this test.
  • Non-Patent Document 8 the mitochondria of the mouse brain that was actually administered subcutaneously as in this experiment. There are no reports mentioning its effectiveness on function.
  • Specimen 1 (TND1128) is highly hydrophobic and extremely stable. Using this advantage, it may be possible to adjust the topical medicine and activate the weakened roots to treat gray hair and baldness, and to rejuvenate loose skin cells. Furthermore, it seems that the effect on the brain can be expected by percutaneous absorption.

Abstract

課題:細胞内でのATP産生を賦活するための賦活剤を提供する。 解決手段:式(I)で表わされる5-デアザフラビン化合物の使用 (式中、Rは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、R及びRは、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。)

Description

細胞内でのATP産生を賦活するための補酵素因子の使用
 本発明は、細胞内でATP産生を賦活するための補酵素因子の使用に係り、詳しくは、ATP産生に関与する酸化還元酵素を補助する補酵素因子の使用に関する。
 アルツハイマー病、パーキンソン病、脳出血・梗塞に伴う神経変性疾患やうつ病は、近年の老齢化社会の到来とともに急激に増加しており、これらの神経変性疾患の予防・治療薬に対する需要が高まっている。
 上記疾患の発症要因の一つとして、細胞内でのエネルギー産生(ATP産生)の機能低下が挙げられる。ATP産生は細胞質基質でも行なわれるが、有酸素下では主としてミトコンドリア複合体において行なわれる。ミトコンドリアは全ての動物細胞内に存在し、電子伝達システムを介して細胞の治動に必要なエネルギー産生を担っている。ミトコンドリアおよびミトコンドリア遺伝子は、電子伝達異常による酸化的ストレスに対して脆弱なため、その結果、エネルギー代謝の低下、細胞の変性に至る。特に脳細胞においては、エネルギー要求量が高いため、ミトコンドリアはより変性を受け易く、老化に伴うミトコンドリア電子伝達異常による、いわゆる脳ミトコンドリア障害が惹起される。
 一方、最近の研究によりサーチュイン(Sirtuin)遺伝子の活性化により老化の遅延、生物の寿命の延長が可能となると考えられている(非特許文献1)。
 サーチュイン遺伝子とミトコンドリアとの関係についても研究が進んでおり、サーチュイン遺伝子が活性化されると細胞内の小器官であるミトコンドリアの量が増え、さらに賦活され認知症予防、動脈硬化予防、難聴予防、脂肪の燃焼、細胞修復、活性酸素の除去を促進し、老化要因の発現を抑制するだけでなく、ミトコンドリア障害を治癒する効果も得られると考えられている(非特許文献2)。
 例えばマサチューセッツ大学の研究チームは、サーチュイン遺伝子の一つであるSIRT1遺伝子を欠損させたマウスでは記憶障害が見られることから、本遺伝子が記憶に関与する可能性を提唱した。さらにアルツハイマー病と筋委縮性側索硬化症の疾患モデル動物を用いてSIRT1遺伝子活性化の神経変性疾患治療への応用を示唆した。一方2008年、ワシントン大学医学部今井眞一郎教授は人間の老化をコントロールする物質としてNMN(Nicotinamide mononucleotide)を同定し、NMNにより老化し不活性化したランゲルハンス島を再活性化することにも成功した。このNMNはすべての遺伝子を賦活し、ミトコンドリアを活性化することが明らかにされている(非特許文献3)。
 また、今井教授等が発見した長寿命タンパク質サーチュイン遺伝子の1つであるSIRT2はテロメアおよびリボソームDNAで転写を停止させるヘテロクロマチン成分であり、NAD依存性ヒストン脱アセチル化酵素であることが明らかとなった。この酵素はアセチル化によって弱められたヒストンへのDNAの結合を脱アセチル化によって元に戻し、DNAのヒストンへの巻き付けを高め、転写を抑制する働きを持っており、これが長寿に関連すると考えられている(非特許文献4)。
 今井教授等は、この酵素の活性化因子であるNAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)の生合成促進剤が抗老化効果を持つ可能性を示唆し、NAD合成の中間物質である、NMNがNADの生合成を促進し、これが抗老化作用に関与する可能性を報告している(非特許文献5)。
 さらに、Mills等は、マウスにNMNを加えた食餌を長期間摂取させると、組織中でNADの産生が高められ、加齢による個体の生理学的機能低下の抑制ができることを報告している(非特許文献6)。
 これはNADがミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の第一段階およびTCAサイクルにおける酸化反応に係わるエネルギー産生の最も重要な分子の一つであることからも理解できる。
 一方、長寿命タンパク質サーチュイン遺伝子の1つであるSIRT1は主に、核に発現しながらも障害を受けたミトコンドリアの修復・再生にも関わることが知られている。さらに、これまで発見されている哺乳動物の7個のサーチュイン遺伝子の内、SIRT3,SIRT4およびSIRT5が主にミトコンドリアに発現していることが明らかにされている(非特許文献7,8)。
 これらの結果を総合すると、多様なサーチュイン遺伝子がミトコンドリア機能の活性化を介して寿命延長作用に関与していると考えられている(非特許文献9)。
 正常時のミトコンドリアでは、NMN(NAD(ニコチン・アミド・アデニン・ジヌクレオチド)の前駆化合物)は常時継続的に産生されるが、老化や病態時にはその産生量は低下してNADは減少する。その結果、ミトコンドリアでの電子伝達系による酸化的リン酸化や細胞質基質で解糖系により産生される生命維持のエネルギー源であるATP(adenosine triphosphate)が減少する(非特許文献10)。NADの還元型であるNADH(Dihydro-nicotinamide adeninedinucleotide)やFADH(Dihydro-flavin adenine dinucleotide)はミトコンドリア内のマトリックスのTCA(クエン酸)回路や細胞質の解糖系で補酵素として機能している。
 NAD(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)は酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで、還元型はNADHで体内に最も多量に存在する補酵素である。
 NADの構造は、ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)とアデニル酸がホスホジエステル結合している。酸化型NADにおけるピリジン環の窒素原子はピリジウムイオンとして存在するので、これをNADと表現する。NADの重要な機能はATP産生機構(酸化反応)にNADの還元が共役している点にある。
 また、FAD(フラビンアデニンジヌクレオチド)も酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで、還元型はFADHで、ミトコンドリアの電子伝達系でのATP産生に使用される。
 真核生物の代謝におけるFADの一次供給先はミトコンドリア内のクエン酸回路とβ酸化が行なわれる細胞質基質である。クエン酸回路では、FADがコハク酸をフマル酸に酸化するコハク酸デヒドロゲナーゼの補酵素として機能し、β酸化ではアシルCoAデヒドロゲナーゼの酵素反応の補酵素として機能している。しかし、redox(酸化還元)系に属するNMNやNADは代謝系で分解されやすく化学的にも不安定で将来医薬品として開発するのは困難と考えられる。さらに合成するにしても高価となる。
 従って、優れたATP産生機能賦活作用を有し、かつ優れた体内動態(体内吸収性、脳内移行性等)を示す点において医薬品として十分満足できる化学物の開発が切望されている。
 ところで、本発明者等は永年に渡ってフラビン骨格を有する化合物の合成及びその薬理作用について鋭意研究を重ねてきた。リボフラビンの5位のNをCHに置換した特有の化学構造を有する5-デアザフラビン(ピリミド[4,5-b]キノリン-2,4(3H,10H)-ジオン)誘導体は、1970年にリボフラビンの類似体として始めて合成された化合物である。5-デアザフラビンの誘導体中には優れた制癌活性を示すものや、抗ヘルペスウィルス活性を有するものも知られており、制癌剤や抗ヘルペスウィルス剤として使用されるものもある(特許文献1~5)。
 その構造の変化に伴っておこるアルコールのケトンやアルデヒドへの変換反応に対する触媒的機能、アミンのイミン(ケトン)への変換反応、カルボニル化合物のアルコールへの還元やイミンのアミンへの還元および不斉還元などやNAD(ニコチンアミドヌクレオチド)との類似性も研究されている(非特許文献11)。ミトコンドリア機能賦活剤についても種々の特許文献が公開されている(特許文献6~8)。しかし、この5-デアザフラビン誘導体の酸化還元触媒活性に着眼し、ミトコンドリア機能賦活作用に適用した文献は見当らない。5-デアザフラビン誘導体は、酸化還元触媒活性を有するため、ミトコンドリアの酸化的リン酸化におけるATP産生機能に影響することは明らかである。5-デアザフラビン骨格は、メタン発酵の酸化還元反応に関わる補酵素の補酵素F420(Coenzyme F420)に見出され、フラビンの類縁体でもある。その酸化還元挙動はフラビンよりむしろNAD(P)に類似している。また共鳴極限式の1つはNAD(P)構造を分子中に内蔵しており、電子密度(分子軌道計算化学で求めたもの)を見ても“ フラビン型のNAD(P)”とみなし得る。
 発明者等は5-デアザフラビンはNADやFADと同様のredox(酸化還元)機能を有することから、細胞内でのATP産生を賦活し、さらにサーチュイン遺伝子を直接又は間接的に賦活すると考え、鋭意研究を行った結果、特定の構造式を有する5-デアザフラビン化合物は化学的に非常に安定で、しかも安価に合成でき、ATP産生を賦活し、さらにミトコンドリアの機能を制御するサーチュイン遺伝子を賦活することを見出し、本発明を完成するに至った。
特許第3073309号 特開平6-199857号 特開平11-322746号 特開2000-212087号 特開平6-73058号 特開2001-48784号 特開2002-322058号 特開2008-255059号
140.ミトコンドリア制御による抗老化対策,上原記念生命科学財団研究報告集,25(2011) SIRT1による代謝制御機構の解明,www.mishima-kaiun.or.jp/assist/docs/SNo4-hasegawa.pdf 身体機能を回復し、健康寿命を延ばす。‐‐老化・寿命の研究で解明された物質「NMN」の驚きの効用,https://www.mugendai-web.jp/archives/6576 Imai S1,Armstrong CM, Kaeberlein M, Guarente L(2000) Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase.  Nature. 403(6771):795-800. Imai (2010) A possibility of nutriceuticals as an anti-aging intervention: activation of sirtuins by promoting mammalian NAD biosynthesis.  Pharmacol Res. 62(1):42-7. Mills KF, Yoshida S, Stein LR, Grozio A, Kubota S, Sasaki Y, Redpath P, Migaud ME, Apte RS, Uchida K, Yoshino J, Imai SI (2016)Long-Term Administration of Nicotinamide Mononucleotide Mitigates Age-Associated Physiological Declinde in Mice. Cell Metab. 24(6):795-806. Michishita E1, Park JY, Burneskis JM, Barrett JC, Horikawa I.(2005) Evolutionarily conserved and nonconserved cellular localizations and functions of human SIRT proteins. Mol Biol Cell. Oct;16(10):4623-35 Pacholec M, Bleasdale JE, Chrunyk B, Cunningham D, Flynn D, Garofalo RS, Griffith D, Griffor M, Loulakis P, Pabst B, Qiu X, Stockman B, Thanabal V, Varghese A, Ward J, Withka J, Ahn K.(2010) SRT1720, SRT2183, SRT1460, and resveratrol are not direct activators of SIRT1. J Biol Chem. 285(11):8340-51. Tang BL(2016) Sirt1 and the Mitochondria Mol. Cells 39(2):87-95 老化関連疾患におけるNAD+合成系の役割と創薬標的としての可能性,https://seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2015.870239/data/index.pdf 「酸化還元機能性を有する複素環化合物の合成」,www.waseda.jp/prj-prac-chem/product/research%20product/2002 nitta.pdf
 本発明の課題は、各種の5-デアザフラビン誘導体の中から細胞内でのATP産生を賦活するのに有効な構造式を有する5-デアザフラビン化合物を提供することにある。
 本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、各種の異なった構造式を有する5-デアザフラビン誘導体化合物を検体として作製し、それを使用してインビトロ(in vitro)で各種実験を重ねた結果、細胞内でのATP産生を増加させる構造式を持った化合物を見出した。
 まず本発明者等は、NMN(図17参照)の類縁化合物として、成長因子として知られ水溶性ビタミンであるリボフラビン(ビタミンB)のフラビン骨格の5位の窒素をメチレン基に置き換えた5-デアザフラビンに着目した。5-デアザリボフラビンはリボフラビンと代謝拮抗し、強力な抗コクシジウム活性を示した。最近メタン生成菌から5-デアザフラビン骨格をもった補酵素F420(図18参照)が見出され、炭酸ガスのメタンへの還元過程や、抗生物質の生合成過程で重要な働きをしていることがわかってきた。5-デアザフラビンの酸化還元挙動はフラビンよりむしろNAD(P)(図19参照)に類似している。また共鳴極限式の1つはNAD(P)構造を分子中に内蔵しており、電子密度(分子軌道計算化学で求めたもの)を見ても“フラビン型のNAD(P)”とみなし得る(図20参照)。Huckel MO法計算で、5-デアザフラビン環の5位が非常にπ電子欠乏(正味荷電net charge:+0.24)になっており、ニコチンアミドヌクレオチドの4位も同様にπ電子欠乏(net charge:+0.210)になっている。其れゆえ、5-デアザフラビン環はNAD(+)とFAD(図21参照)の両方の電子伝達系に属するものと考えられる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD,nicotinamide adenine dinucleotide)は、全ての真核生物と多くの古細菌、真正細菌で用いられる電子伝達体である。
 事実、マイトトラッカー蛍光染色によりミトコンドリア膜電位を蛍光標識したところ、新規NMN類縁体(5-デアザフラビン)の処理により顕著にミトコンドリア活性の促進がみられた。サーチュイン遺伝子が活性化されると細胞内の小器官「ミトコンドリア」が活性化され、認知症予防、動脈硬化予防、難聴予防、脂肪の燃焼、細胞修復や遺伝子に有害な活性酸素の除去を促進し、老化要因の発現を抑制する効果が得られると考えられており、この電子伝達系として働く5-デアザフラビンはβ-NMNに比較して、低容量で長寿遺伝子のサーチュイン遺伝子のスイッチオンにして活性化と同時にミトコンドリアの活性化によりATP産生を促す。
 一方、NADやFAD同様のredox機能を持つこの5-デアザフラビン化合物は、現在NMNを補充する医薬品に用いたいと検討されているβ-NMNと比較すると、化学的に非常に安定でしかも安価に合成でき、NADを活性化し、さらにミトコンドリアの長寿遺伝子(SIRT1およびSIRT3)も直接又は間接的に賦活すると発明者等は考えた。即ち、発明者等はNAD依存的に活性化され、ミトコンドリア機能維持に重要な遺伝子として既に明らかになっている長寿遺伝子SIRT1の活性化を評価する目的で、SIRT1の標的転写因子であるFOXO1の発現を活性指標として、HCT116 細胞を用いq-RT-PCR法によりmRNA増加のスクリーニング評価を行った。
 その結果、β-NMNと比較し本発明に係る化合物がより低用量でSIRT1活性能を有することを明らかにした。よって本発明に係る化合物はNADを直接活性化し虚血などの病態的条件下でも連続してATPを産生させ、その効果は持続的で強力であると予想出来る。したがって本発明に係る化合物は医薬品として開発可能な必要条件を十分に備えていると考えられる。また、その化学構造が機能的及び電子論的にNADとFADの補酵素のコア部分の合体型構造、即ち、nicotinamideとflavinのハイブリッドで自然界に存在する構造に近いことから、副作用の発現は殆ど無いだろうと推測できる。さらに、本発明に係る化合物の構造は、酸化還元電位測定値より判断すると、補酵素としてのNADやFADよりもredoxポテンシャルが高く酸化還元能が優れている。
 本発明は上記の知見を基にして完成したものである。
 即ち、本発明により細胞内でATP産生を賦活するために有効な補酵素因子として、下記の式(I)~式(IV)で示される化合物を特定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
(式中、Rは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、R及びRは、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
(式中、R及びRは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
(式中、Rは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
(式中、Rは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。)
 本発明により提供されたATP産生を賦活する補酵素因子を使用することにより、細胞内でのエネルギー産生の機能低下を改善することができる。
 従って、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳出血・梗塞に伴う神経変性疾患やうつ病などの予防・治療薬として極めて有用である。
図1は、ヒト由来神経芽細胞(ニューロブラスト-マ)SH-SY5Y株の培養細胞に検体1を添加し、添加後の細胞内・外のATP濃度を蛍光測定した結果を示す図である。 図2Aは、中枢神経系のグリア細胞の一種、培養アストロサイト細胞に検体1を添加し、蛍光測定した結果を示す図である。 図2Bは、図2Aでの測定結果を定量化した図である。 図3は、ヒトグリオーマU251の培養細胞(Sig1-R transfected cells)に検体1,2を添加し、添加後の細胞内のATP濃度を添加しない場合(Cont.)と相対比較して示した図である。 図4は、幼若(生後0日目)のICRマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養し、検体1を添加した後の海馬神経細胞(ニューロン)の神経軸索(Axon)の伸展・発達・分岐を示す免疫染色画像である。 図5は、図4の場合と同様にして検体1を添加し、海馬神経細胞軸索(Axon)の分岐数を計測した結果を示す図である。 図6は、図4の場合と同様に検体1を添加した後の、海馬神経細胞樹状突起(Dentrite)の伸展・発達・分岐を示す免疫染色画像である。 図7は、図6の場合と同様に検体1を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を計測した結果を示す図である。 図8は、図4の場合と同様に培養し、14日目における興奮性シナプスを免疫染色したオータプス標本におけるシナプスの免疫染色画像である。 図9は、図4の場合と同様に培養し、14日目における興奮性シナプスの数を定量した図である。 図10は、成熟培養海馬細胞(培養11日目)に検体1を1回投与して3日後(培養14日目)に定量した海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の免疫染色画像である。 図11は、図10の場合と同様に、培養14日目の発達期に、MAP2抗体により免疫染色し、樹状突起(Dendrite)の分岐数を計測した図である。 図12は、成熟C57BL/6Nマウス(10~17週齢、体重28~31g)に生理食塩水(コントロール)と検体3(10μg/kg)を腹腔内投与し、22時間後に皮質(Cortex)と海馬(Hippocampus)領域を含む脳薄切片(スライス)標本を作製し、外液に80mMKCl(80K)を添加して細胞膜の脱分極を起こし、K脱分極によって生じる大脳皮質ニューロン(神経細胞)内に存在するミトコンドリア内のCa2+濃度上昇と検体3によるその抑制効果を計測した図である。 図13は、図12の場合と同様に、海馬ニューロン(神経細胞)のK脱分極によるミトコンドリア内Ca2+濃度上昇と検体3によるその抑制効果を計測した図である。 図14は、吸入麻酔下のウイスター系成熟ラット(体重200~230g)の頭蓋骨に小穴をあけた後、右脳線条体にコントロール群には生理食塩水、出血群には0.24Uのコラゲナーゼ(typeN)を含む生理食塩水1.2μlを注入した脳内出血モデルラットの脳断面を示す図。 図15は、脳内出血モデルラットに対する検体4の脳細胞保護作用を検証するためにコラゲナーゼ投与の1時間後に検体4を100μg/kgを脳内のスポットへ注入し、ラットの運動足跡を定量的に測定した図である。 図16は、図15の場合と同様にして、検体4投与有無ラットの運動距離と運動スピードの経日変化を計測した図である。 図17は、β-NMNの化学構造式を示す図である。 図18は、補酵素F420の化学構造式を示す図である。 図19は、NAD(P)の化学構造式とその酸化還元反応(Redox)を説明する図である。 図20は、5-デアザフラビンとNAD(P)のフラビン環の分子軌道計算化学で求めた電子密度を示す図である。 図21は、NADとの比較としてFADとの構造の類似性を説明した図である。 図22は、検体5を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図23は、検体6を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図24は、検体7を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図25は、検体8を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図26は、検体9を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図27は、検体10を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図28は、検体10を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図29は、24時間前にβ-NMNを皮下投与したマウスの脳標本のミトコンドリア内Ca2+の解析結果を示す図である。ミトコンドリア選択的Ca2+指示薬Xrhod-1で染色された標本を5分間80K ACFS暴露-5分間洗浄操作を三回繰返した。この時のミトコンドリア内Ca2+の変動に及ぼすβ-NMNの用量反応関係 A:Control, B:β-NMN 10mg/kg; C:β-NMN 30mg/kg;D:β-NMN 100mg/kgそれぞれの用量のβ-NMNを皮下投与し、24時間後に全脳スライス標本を作成し、ミトコンドリア特異的Ca2+指示薬Xrhod-1で染色した。580nm励起時の赤色(>600nm)の蛍光画像から、三回の80K ACSF刺激で得られたミトコンドリア内Ca2+上昇を経時計測した。実線:大脳皮質部位(CTX);点線:海馬CA1部位(CA1)の反応。5~6例の平均値と標準誤差を示す。 図30は、24時間前に検体1(TND1128)を皮下投与したマウスの脳標本のミトコンドリア内Ca2+ の解析結果を示す図である。ミトコンドリア選択的Ca2+指示薬Xrhod-1で染色された標本を図22と同様に、5分間80K ACFS暴露-5分間洗浄操作を三回繰り返した。このミトコンドリアCa2+の変動に及ぼす検体1(TND1128)の用量反応関係A:Control, B:TND1128 0.01mg/kg;C:TND1128 0.1mg/kg;D:TND1128 1.0mg/kg(皮下投与)。図22と同様にXrhod-1の580nm励起時の赤色(>600nm)蛍光画像から、三回の80K ACSF刺激で得られたミトコンドリア内Ca2+上昇を経時計測した。実線:大脳皮質部位(CTX),点線:海馬CA1部位(CA1)の反応。5~6例の平均値と標準誤差を示す。 図31は、β-NMNの80K ACSF暴露時のミトコンドリア内 Ca2+濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。 図29のデータを定量的にまとめた(図37参照) A:80K ACSF三連続暴露全体での大脳皮質(CTX)(白)と海馬(CA1)(黒)におけるミトコンドリアのCa2+取り込み量に対するβ-NMNの作用 B:大脳皮質における80K ACSF暴露、各回におけるミトコンドリアのCa2+取り込みの用量反応関係 C:海馬における80K ACSF暴露、各回におけるミトコンドリアのCa2+取り込みの用量反応関係 *:Tukey法による多重解析で有意差(P<0.05) 図32は、検体1(TND1128)の80K ACSF暴露時のミトコンドリア内Ca2+濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。 図29のデータを定量的にまとめた(図37参照) A:80K ACSF三連続暴露全体での大脳皮質(CTX)(白)と海馬(CA1)(黒)におけるミトコンドリアのCa2+取り込み量に対するTND1128の作用 B:大脳皮質における80K ACSF暴露、各回におけるミトコンドリアのCa2+取り込みの用量反応関係 C:海馬における80K ACSF暴露、各回におけるミトコンドリアのCa2+取り込みの用量反応関係 *:Tukey法による多重解析で有意差(P<0.05) 図33は、24時間前にβ-NMNを皮下投与したマウスの脳標本の細胞質内Ca2+ の解析結果を示す図である。それぞれの用量のβ-NMNを皮下投与し、24時間後に全脳スライス標本を作成し、脳スライス標本を細胞質に留まるCa2+ 指示薬Fura-4Fで染色した。この脳標本から360nmと380nmの励起光を与えた時の青緑色(>500nm)の蛍光強度(F360とF380)の比を10秒毎、経時的に得、三回の80K-ACSF刺激で得られた細胞質内Ca2+ 上昇の時間経過。A:Control, B:β-NMN 10mg/kg;C:β-NMN 30mg/kg;D:β-NMN 100mg/kg、実線:大脳皮質部位(CTX)、点線:海馬CA1部位(CA1)の反応。5~6例の平均値と標準誤差を示す。 図34は、24時間前に検体1(TND1128)を皮下投与したマウスの脳標本の細胞質内Ca2+ の解析結果を示す図である。細胞質選択的Ca2+ 指示薬Fura-4Fで染色された標本を図29と同様に、5分間80K ACFS暴露-5分間洗浄操作を三回繰り返した。この細胞質のCa2+ の変動に及ぼす TND1128の用量反応関係A:Control, B:TND1128 0.01mg/kg;C:TND1128 0.1mg/kg;D:TND1128 1.0mg/kg(皮下投与)。図33と同様に360nmと380nmの励起光を与えた時のFura-4Fの青緑色(>500nm)蛍光の強度(F360とF380)の比を10秒毎、経時的に得た。実線:大脳皮質部位(CTX),点線:海馬CA1部位(CA1)の反応。5~6例の平均値と標準誤差を示す。 図35は、β-NMNの80K ACSF暴露時の細胞質内Ca2+ 濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。図33のデータを定量的にまとめた(図37参照) A:80K ACSF三連続暴露全体での大脳皮質(CTX)(白)と海馬(CA1)(黒)における細胞質のCa2+ 取り込み量に対するβ-NMNの作用 B:大脳皮質における80K ACSF暴露、各回における細胞質のCa2+ 取り込みの用量反応関係 C:海馬における80K ACSF暴露、各回における細胞質のCa2+ 取り込みの用量反応関係 図36は、検体1(TND1128)の80K ACSF暴露時の細胞質内Ca2+ 濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。 図34のデータを定量的にまとめた(図37参照) A:80K ACSF三連続暴露全体での大脳皮質(CTX)(白)と海馬(CA1)(黒)における細胞質のCa2+ 取り込み量に対するβ-NMNの作用 B:大脳皮質における80K ACSF暴露、各回における細胞質のCa2+ 取り込みの用量反応関係 C:海馬における80K ACSF暴露、各回における細胞質のCa2+取り込みの用量反応関係 *Tukey法による多重解析で有意差(P<0.05) 図37は、80K 連続三回暴露時のミトコンドリアまたは細胞質におけるCa2+ 上昇量の定量法を説明する図である。
(化合物の構造)
 本発明では、式(I),(II),(III)及び(IV)で示される構造式を有する化合物の使用が細胞内でのATP産生を賦活するのに有効である。
 以下、それらの化合物の具体例とその製法を示す文献を第1表~第4表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
(化合物の製造方法)
 一般式Iで表される5-デアザフラビン化合物(I-1~I-118)(3)は既知文献(1~14)記載の製造方法により合成できる。特に、(製法A)に記した文献(1)の一般製造方法により大半の誘導体が合成できる。即ち、6-N-置換-アミノウラシル類(1)と適当なo-ハロゲノベンズアルデヒド(2)をジメチルホルムアミド(DMF)中で、加熱還流する。加熱時間は3~7時間が適当である。反応液を減圧下濃縮し、残留物を適当な溶媒(アルコール、ジオキサンやDMFなど)で再結晶し、対応する5-デアザフラビン(3)を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 一般式IIで表されるピリドジピリミジン化合物(II)(II-1~II-32)(5)は既知文献(15~19)記載の製造方法により合成できる。特に、(製法B)に記した文献(15)の一般製造方法により大半の誘導体が合成できる。即ち、6-N-置換-アミノウラシル類(1)と適当な3-置換-6-クロロウラシ-5-カルブアルデヒド(4)をジメチルホルムアミド又は酢酸中で、加熱還流する。加熱時間は2~5時間が適当である。反応液を減圧下濃縮し、残留物を適当な溶媒(アルコール、酢酸やDMFなど)で再結晶し、対応するピリドジピリミジン(5)を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 一般式IIIで表されるデアザフラビノテストステロン化合物(III)(III-1~III-2)(7)は既知文献(20,21)記載の製造方法により合成できる。同様の方法で未知化合物(III-3~III-23)も合成できる。即ち、ジフェニルエーテルに、6-N-モノ置換-アミノウラシル類(1)と2-ヒドロキシメチレンテストステロン(6)を加え、更に、この混合物へp-トルエンスルホン酸を加えた後、180℃でアルゴン雰囲気下30分~60分間加熱攪拌する。反応後この反応物をカラムクロマトグラフィーに付し精製する。尚、この反応はジオキサン中で数時間加圧下加熱しても合成できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
[製造例1]
 (8’-置換-5’-デアザ-17β-ヒドロキシ-3’-メチルアンドロスト-2,4-ジエノ[2,3-g]プテリジン-2’,4’(3’H,8’H)-ジオン誘導体(III-3~III-13)の一般合成)
 ジオキサン(50ml)にp-トルエンスルホン酸(60mg,0.32mmol)と6-モノ置換アミノ-3-メチルウラシル(1)(2.84mmol)を加え、更に、2-ヒドロキシメチレンテストステロン(6)(1.0g,3.16mmol)を加えた後、アルゴン雰囲気下で封管中12時間加熱する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー(Fuji Silysia 230~400mesh;溶出液:酢酸エチル:エタノール=12:1又は酢酸エチルのみ)で分離精製し、粉末結晶を得る。更に、再結晶は酢酸エチルとn-ヘキサンの混合溶液より行なえる。
 化合物 III-3 (5'-Deaza-8'-ethyl-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione) ; 黄色の粉末結晶(0.77 g, 60%), mp 260 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 1.00 (3H, s, 19-CH3), 1.41 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH2CH3), 2.46-2.62 (2H, br dd, 6-H), 2.67 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.92 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.43 (3H, s, 3'-CH3), 3.68 (1H, dd, J16α,17α= 8.7 Hz, J16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 4.46-4.73 (1H, m, 8'-CHaHb), 4.73-5.00 (1H, m, 8'-CHaHb), 6.39 (1H, s, 4-H), 8.25  (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-4 (8'-n-Butyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione) ; 黄色の粉末結晶 (0.79 g, 58%), mp 246 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 0.99 (3H, s, 19-CH3), 1.50 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH2CH2CH2CH3), 2.46-2.61 (2H, br dd, 6-H), 2.66 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.91 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH3), 3.69 (1H, dd, J16α,17α= 7.8 Hz, J16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 4.28-4.60 (1H, m, 8'-CHaHb), 4.60-4.92 (1H, m, 8'-CHaHb), 6.35 (1H, s, 4-H), 8.25 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-5 (8'-Benzyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine- 2',4'(3'H,8'H)-dione ); 黄色の粉末結晶 (0.63 g, 43%), mp 215 ℃; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH3), 0.95 (3H, s, 19-CH3), 2.37-2.45 (2H, br dd, 6-H), 2.64 (1H, d, J = 15.5 Hz, 1β-H), 2.90 (1H, d, J = 15.5 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH3), 3.66 (1H, dd, J16α,17α=8.4Hz, J16β,17α=8.5 Hz, 17α-H), 5.59 (1H, br d, J = 15.3 Hz, 8'-CHaHb), 6.26 (1H, br d, J = 15.3 Hz, 8'-CHaHb), 6.28 (1H, s, 4-H),  7.07-7.19 (2H, m, Bn-mH), 7.25-7.35 (3H, m, Bn-o, pH), 8.33 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-6 (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine- 2',4'(3'H,8'H)-dione);燈色の粉末結晶 (0.54 g, 38%), mp 215 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.01 (3H, s, 19-CH3), 2.20-2.43 (2H, br dd, 6-H), 2.76 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J =15.9 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67(1H, dd, J16α,17α=8.7 Hz, J16β,17α= 8.9 Hz, 17α-H), 5.60 (1H, s, 4-H), 6.90-7.22 (2H, m, Ph-mH), 7.22-7.49 (3H, m, Ph-o, pH), 8.39 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-7 (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-(4-methylphenyl)androst-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.58 g, 40%), mp 205 ℃ (decomp.);1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 1.02 (3H, s, 19-CH3), 2.92 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 3.10 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1α-H), 2.46 (3H, s, 8'-CH3), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 8.4 Hz, J16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 5.56 (1H, s, 4-H), 6.88-7.20 (2H, m, Ar-mH), 7.20-7.47 (2H, m, Ar-oH), 8.37 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-8 (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methoxyphenyl)-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.69 g, 47%), mp 220 ℃ (decomp.);1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.02 (3H, s, 19-CH3), 2.18-2.41 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67(1H, dd, J16α,17α= 8.7Hz, J16β,17α = 8.4 Hz, 17α-H), 3.89 (3H, s, OCH3), 5.61 (1H, s, 4-H), 7.02-7.24 (4H, m, Ar-m, oH), 8.36 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-9 (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-(3,4-methylenedioxyphenyl)-androst-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.72 g, 47%), mp 214 ℃; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.01 (3H, s, 19-CH3), 2.22-2.46 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J =15.6 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 9.9 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17β-H), 5.67 (1H, s, 4-H), 6.08 (2H, s, OCH2O), 6.51-7.17 (1H, m, Ar-mH), 6.86-6.98 (2H, m, Ar-oH), 8.36 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-10 (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-hydroxyphenyl)-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.47 g, 32%), mp 280 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.00 (3H, s, 19-CH3), 2.61-2.78 (2H, br dd, 6-H), 2.71 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.98 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 7.6 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.68 (1H, s, 4-H), 6.73-6.98 (4H, m, Ar-m, oH), 8.40 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-11 (5'-Deaza-8'-(4-fluorophenyl)-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione);燈色の粉末結晶 (0.69 g, 47%), mp 270 ℃ (decomp.);1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.00 (3H, s, 19-CH3), 2.68 (2H, dd, J = 15.0, 6-H), 2.93 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H), 3.11 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.70 (3H, s, 3'-CH3), 3.56-3.80 (1H,br dd, 17α-H), 6.54 (1H, s, 4-H), 7.12-7.66 (4H, m, Ar-m, oH), 8.50 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-12 (8'-(4-Chlorophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 黄色の粉末結晶 (0.74 g, 49%), mp 270 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.03 (3H, s, 19-CH3), 2.19-2.42 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 3.96 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.40(3H, s, 3'-CH3), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 8.4 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.53 (1H, s, 4-H), 7.06-7.21 (2H, m, Ar-mH), 7.50-7.60 (2H, m, Ar-oH), 8.37 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-13 (8'-(4-Bromophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.72 g, 44%), mp 250 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH3), 1.03 (3H, s, 19-CH3), 2.25-2.42 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.3 Hz, 1β-H), 3.96 (1H, d, J = 15.3 Hz, 1α-H), 3.39(3H, s, 3'-CH3), 3.67(1H, dd, J16α,17α= 8.7 Hz, J16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 5.53 (1H, s, 4-H), 6.99-7.15 (2H, m, Ar-mH), 7.65-7.75 (2H, m, Ar-oH), 8.38 (1H, s, 5'-H)
[製造例2]
 (8’-置換-5’-デアザ-17β-ヒドロキシ-3’-フェニルアンドロスト-2,4-ジエノ[2,3-g]プテリジン-2’,4’(3’H,8’H)-ジオン誘導体(III-14~III-23)の一般合成)
 ジフェニルエーテル(1ml)にp-トルエンスルホン酸(60mg,0.32mmol),6-モノ置換アミノ-3-フェニルウラシル(1)(0.66g,2.84mmol)及び2-ヒドロキシメチレンテストステロン(6)(1.0g, 3.16mmol)を加え、窒素雰囲気下155℃で45分撹拌する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー(Fuji Silysia230~400mesh;溶出液:酢酸エチル:エタノール=10:1又は酢酸エチルのみ)で分離精製し、粉末結晶を得る。更に、再結晶は酢酸エチルとn-ヘキサンの混合溶液より行なえる。
 化合物 III-14 (5'-Deaza-8'-ethyl-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H, 8'H)-dione); 黄色の粉末結晶 (0.79g, 54%), mp 240℃ (decomp.);1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3),  1.01(3H, s, 19-CH3), 1.45 (3H, t, J = 7.5 Hz, 8'-CH2CH3), 2.52-2.61 (2H, br dd, 6-H), 2.67(1H, d, J =15.6 Hz, 1β-H), 2.93(1H, d, J =15.6 Hz, 1α-H), 3.68 (1H, dd, J16α,17α=7.5 Hz, J16β,17α=8.1 Hz, 17α-H), 4.46-4.76(1H, m, 8'-CHaHb), 4.76-5.05(1H, m, 8'-CHaHb), 6.41(1H, s, 4-H), 7.21-7.45 (2H, m, Ph-mH), 7.45-7.52 (3H, m, Ph-o, pH), 8.27 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-15 (8'-n-Butyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno [2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 黄色の粉末結晶 (0.77g, 50%), mp 200℃;1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH3), 0.99 (3H, s, 19-CH3), 1.18 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH2CH2CH2CH3), 2.45-2.62 (2H, br dd, 6-H), 2.65 (1H, d, J =15.6 Hz, 1β-H), 2.91(1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.63 (1H, dd, J16α,17α= 7.1 Hz, J16β,17α=7.1 Hz, 17α-H), 4.35-4.64 (1H, m, 8'-CHaHb), 4.64-4.94 (1H, m, 8'-CHaHb), 6.39 (1H, s, 4-H), 7.21-7.52 (5H, m, Ph-o, m, pH), 8.27 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-16 (8'-Benzyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 黄色の粉末結晶 (0.72 g, 44%), mp 224 ℃; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 0.92 (3H, s, 19-CH3), 2.30 (2H, dd, J = 10.5 Hz, 6-H), 2.63 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.87 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 8.4 Hz, J16β,17α= 7.8 Hz, 17α-H), 5.37-5.61 (1H, br, 8'-CHaHb), 6.41-6.64 (1H, br, 8'-CHaHb), 7.02 (1H, s, 4-H), 7.24-7.56 (10H, m, Bn-o, m, pH and Ph-o, m, pH), 8.33 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-17 (5'-Deaza-17β-hydroxy-3',8'-diphenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione ); 燈色の粉末結晶 (0.57 g, 36%), mp 257 ℃; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.04 (3H, s, 19-CH3), 2.71 (1H, d, J= 15.6 Hz, 1β-H), 2.98 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.65 (1H, dd, J16α,17α= 8.4Hz, J16β,17α= 8.7Hz, 17α-H), 5.57(1H, s, 4-H), 7.16-7.66(10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.40 (1H, s, 5'-H)
 化合物III-18 (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methylphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.90 g, 55%), mp 246 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 0.88 (3H, s, 19-CH3), 2.47 (3H, s, 8'-CH3), 2.58-2.74 (2H, br dd, 6-H), 2.92 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H), 3.16 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.68 (1H, dd, J16α,17α= 8.7 Hz, J16β,17α= 7.8 Hz, 17α-H), 6.61 (1H, s, 4-H), 6.89-7.49 (7H, m, 3'-Ph-m, pH and 8'-Ar-o, mH), 8.40-8.56 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.49 (1H, s, 5'-H)
 化合物III-19 (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(3,4-dimethylphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.90 g, 54%), mp 260 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.77 (3H, s, 18-CH3), 0.80 (3H, s, 19-CH3), 2.33 (3H, s, 8'-Ar-CH3), 2.35 (3H, s, 8'-Ar-CH3) 2.71(1H, d, J=15.0 Hz, 1β-H), 2.97(1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 7.5 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.60 (1H, s, 4-H), 6.88-7.50 (8H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ar-o, mH), 8.38 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-20 (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methoxyphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶(0.96 g, 57%), mp 250 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH3), 0.81 (3H, s, 19-CH3), 2.23-2.38 (2H, br dd, 6-H), 2.71 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.93 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.62 (1H, dd, J16α,17α= 6.9 Hz, J16β,17α= 6.6 Hz, 17α-H), 3.87(3H, s, OCH3), 6.19 (1H, s, 4-H), 7.00-7.13 (7H, m, 3'-Ph- m, pH and 8'-Ar-o, mH), 7.17-7.50 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.38 (1H, s, 5'-H)
 化合物III-21 (5'-Deaza-8'-(4-fluorophenyl)-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶(0.61 g, 37%), mp 260 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH3), 1.04 (3H, s, 19-CH3), 2.70 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 2.97 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1α-H), 3.66(1H, dd, J16α,17α= 8.1 Hz, J16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 5.54(1H, s, 4-H),7.18-7.54 (10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.39 (1H, s, 5'-H)
 化合物III-22 (8'-(4-Chlorophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.56 g, 33%), mp 241 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.77 (3H, s, 18-CH3), 0.85 (3H, s, 19-CH3), 2.29-2.44 (2H, br dd, 6-H), 2.79 (1H, d, J = 16.2 Hz, 1β-H), 3.07 (1H, d, J = 16.2 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J16α,17α= 7.8 Hz, J16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 6.46 (1H, s, 4-H), 7.17-7.59 (10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.47 (1H, s, 5'-H)
 化合物 III-23 (8'-(4-Bromophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione ); 燈色の粉末結晶 (0.93, 51, mp 300 ℃ (decomp.); 1H-NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH3), 0.83(3H, s, 19-CH3), 2.69 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H),  3.12  (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.07(1H, dd, J16α,17α= 7.9 Hz, J16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 6.56 (1H, s, 4-H), 6.69-7.52 (7H, m, 3'-Ph-m, pH and 8'-Ar-o, mH), 7.67-7.79 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.48 (1H, s, 5'-H)
 上記新規化合物(III-3~III-23)の機器分析値を第5表と第6表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
 一般式IVで表されるピリドジピリミジン化合物(IV)(IV-1~IV-26)(9)は既知文献(22)記載の製造方法により合成できる(製法D)。即ち、ジフェニルエーテルにp-トルエンスルホン酸,3-置換-6-モノ置換アミノウラシル(1)及び2-ヒドロキシメチレンコレスト-4-エン-3-オン(8)を加え、窒素雰囲気下180℃で45分間加熱撹拌する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー(Fuji Silysia 230~400mesh;溶出液:酢酸エチル)で分離精製し、粉末結晶を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 次に、化合物番号I-50(検体1)、I-54(検体2)、III-4(検体3)及びI-75(検体4)の化合物を用いて、それらの検体の添加が細胞内でATP産生に直接又は間接に貢献していることを実験により検証したので、以下実施例として説明する。
[実施例1]
 ヒト由来神経芽細胞(ニューロブラスト-マ)SH-SY5Y株の培養細胞に検体1を添加後、細胞内・外のATP濃度を蛍光測定した。その結果を図1に示す。細胞内においては、検体1(1μM)添加直後から5時間後までATP産生の増加(蛍光の強さの増加)がみられ、12時間後には作用消失する。なお、検体処置による培養細胞の形態変化はない。
 細胞外においても、検体1(1μM)添加直後から5時間後までATP産生の増加がみられATP濃度が増加した。これは細胞内で増加したATPが細胞外に流出したものと思われる。
[実施例2]
 中枢神経系のグリア細胞の一種、培養アストロサイト細胞に検体1を添加し、蛍光測定した結果を図2Aと図2Bとに示す。
 グリア細胞内のATP量は検体1を1μM投与したとき、12時間と24時間後に有意に増加しており、細胞外についても同様な動向を示している。
[実施例3]
 ヒトグリオーマU251の培養細胞(Sig1-R transfected cells)に検体1,2をそれぞれ添加し、添加後の細胞内のATP濃度を添加しない場合(Cont.)と相対比較した。その結果、図3に示すように検体1と検体2とはヒトグリオーマU251細胞のATP産生量を有意に増加させていることが検証された。脂溶性の高い検体2は検体1に比較して効果が大である。なお蛍光測定は検体の投与後6時間で行った。
 なお、実施例1~3は脳神経細胞(ニューロン)に関して実験したものであるが、脳神経細胞(ニューロン)は酸素(O)とグルコースとを必要とする。これらの2物質は血中よりグリア(アストロサイト)にまず取り込まれ、その後グリアからニューロンへと伝達される。検体も同様である。よって検体によるグリア内ATP量増加は、グリアの働きを直接的に促進していることを示すと共に、間接的にニューロンを賦活することを示唆する。
[実施例4]
 幼若(生後0日目)のICRマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養した。
 発達初期の細胞(培養1日目)に検体1を1回添加し、3日後(培養4日目)に海馬神経細胞(ニューロン)の神経軸索(Axon)、樹状突起(Dendrite)や発達するシナプス数を定量した。検体1(0.1μM,0.3μM,1.0μM)は培養1日目に1回のみ添加した。添加3日後(培養4日目)において、AxonとDendriteをtau抗体とMAP2抗体とを用いてそれぞれ免疫染色し、形態観察を行った。
 図4は海馬神経細胞軸索(Axon)の免疫染色画像を示したもので、培養4日目にtau抗体にて軸索を免疫染色した。左はControl(対照群)、右は培養1日目に検体1(1μM)を1回のみ添加した検体処置神経細胞を示す。
 図5は海馬神経細胞軸索(Axon)の分岐数を示したもので、培養4日目にtau抗体にて軸索の分岐数を定量した。実験は細胞体を中心に10μm間隔で同心円(図示せず)を描き、その円を交差する軸索の本数を計測した。
 図4と図5から、検体1は濃度依存的に神経軸索(Axon)の伸展・発達と、その分岐数を増加させることを示した。なお、検体濃度0.3μMと1.0μMではほぼ同程度の最大薬効を示した。
 図6は海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の免疫染色画像を示したもので、培養4日目にMAP2抗体にて樹状突起を免疫染色した。左はControl(対照群)、右は培養1日目に検体1(1μM)を1回のみ添加した神経細胞を示す。
 図7は海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の分岐数を示したもので、培養4日目にMAP2抗体にて免疫染色し、樹状突起の分岐数を定量した。実験は、細胞体を中心に10μm間隔で同心円(図示せず)を描き、その円を交差する樹状突起の本数を計測した。
 図6と図7から、検体1は濃度依存的に樹状突起の伸展と、その分岐数を増加させることを示した。なお検体濃度0.3μMと1.0μMではほぼ同程度の最大薬効を示した。
 次いで、培養14日目における興奮性シナプスをVGLUT1抗体を用いて免疫染色し、シナプス数を定量した。
 図8は、オータプス標本におけるシナプスの免疫染色画像を示したもので、左はControl(対照群)、右は培養1日目に検体1(1μM)を1回のみ添加し、培養14日目に、VGLUT1抗体にて興奮性シナプスを免疫染色した神経細胞を示す。
 図9は、海馬神経細胞に投射する興奮性シナプスの増加を計測した図である。脳には神経の興奮と抑制とを速やかに伝達するグルタミン酸作動性とGABA作動性の2シナプスがあるが、図9は培養14日目に、VGLUT1抗体にて免疫染色し、興奮性シナプス数を定量したものである。
 図8と図9から、検体1は0.3μMの添加により興奮性シナプス数を有意に最大値まで増加させることを示した。
[実施例5]
 実施例4と同様に、幼若(生後0日目)のICRマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養した。
 成熟培養海馬細胞(培養11日目)に検体1を1回投与して3日後(培養14日目)に海馬神経細胞(ニューロン)の神経軸索(Axon)、樹状突起(Dendrite)の様子を観察した。培養14日目の軸索は伸展および軸索同士の交差が著しく、軸索本数の定量が不可能であったので、樹状突起の形態のみを観察した。
 図10は、海馬神経細胞樹状突起(Dendrite)の免疫染色画像を示したもので、左はControl(対照群)、右は培養14日目の画像で、検体1を投与し、培養14日目にMAP2抗体にて免疫染色したものである。
 図11は、培養14日目の発達後期に、MAP2抗体にて免疫染色し、樹状突起(Dendrite)の分岐数を検体濃度0.1~1μMで定量したもので、細胞体を中心に10μmの間隔で同心円を描き、その円と交差する樹状突起の本数を計測した。
 樹状突起は幼若培養細胞4日目(図7)と比較して、細胞体から生える樹状突起の本数は、培養日数に依存して増加している(図11)。添加される検体濃度(0.3μMと1μM)によって樹状突起は成熟培養細胞でも増加する傾向は認められるものの、培養4日目の細胞でみられた薬効ほどの顕著な分岐数の増加は認められなかった。
 実施例4及び5の実験結果を踏まえると、検体添加によりラットの幼若・成熟培養神経細胞の発達・分岐・シナプス数の増加や促進が神経細胞内のATP産生増加で促進されていることを間接的に証明しているといえる。
[実施例6]
 成熟C57BL/6Nマウス(10~17週齢、体重28~31g)に、一方には生理食塩水(Control)を他方には検体3(10μg/kg)を腹腔内投与し、22時間後にそれぞれのマウスの皮質(Cortex)と海馬(Hippocampus)領域を含む脳薄切片(スライス)標本を作製した。外液に80mM KCl(80K)を添加して細胞膜の脱分極を起こし、その結果生じるミトコンドリア内のCa2+濃度の増加をRhod-2(注1)を用いて蛍光的方法にて計測した。脳スライスにおいて、80Kによる増加するCa2+濃度(注2)が検体3により、いかに抑制されるのかを指標とし、ミトコンドリアでのATP活性に検体3が積極的に関与していることを間接的に検証した(注3)。
 (注1)Rhod-2:ミトコンドリアに選択的に取り込まれるCa2+蛍光色素
 (注2)80Kによる神経細胞膜の脱分極は細胞外から細胞内へのCa2+の流入と細胞内のCaストアーからのCa2+の遊離の両者によって起こる。細胞内に増加した遊離Ca2+は細胞内の独立器官であるミトコンドリア内へと容易に流れ込む。その結果ミトコンドリア内のCa2+濃度が上昇する。
 (注3)80K刺激による脱分極で神経細胞質内に増加した遊離Ca2+は直ちに細胞質内からミトコンドリア内に速やかに移行する。検体によるミトコンドリア内遊離Ca2+濃度の減少は神経細胞質膜に存在する外向きCaポンプによって遊離Ca2+が細胞外へ汲み出されるか、ミトコンドリア内部の一部に吸着、固定される。そのためのエネルギーはミトコンドリアで産生されるATPから供給される。よって得られた結果から、腹腔内注射された検体3は血液中からグリア(アストロサイト)細胞を経て大脳皮質や海馬ニューロン内のミトコンドリア内に取り込まれ、このことによりミトコンドリアでのATP産生が活性化して神経細胞が活性化され、神経細胞膜上のCaポンプがエネルギー源のATPをミトコンドリアから得て、余分な細胞内遊離Ca2+を細胞外へと排出し、神経細胞を間接的に保護する。
 図12は、K脱分極によって生じる大脳皮質ニューロン(神経細胞)内に存在するミトコンドリア内のCa2+濃度上昇と検体3によるその抑制効果を計測した図である。
 は、正常マウスから得た脳スライス標本に80mM KCl外液(5分間適用後5分間洗浄)を3回連続した時のコントロール反応。縦軸はミトコンドリア内Ca2+濃度の増加の蛍光測定の結果を示す。
 は、検体3を10μg/kg腹腔内(i.p.)注射後22時間後にラットより摘出作製した脳スライス標本に80K外液を与えた時のミトコンドリア内Ca2+濃度の変化。と比較してCa2+濃度上昇の抑制と80K脱分極によって上昇したCa2+濃度のより速い回復がみられる。
 は、大脳皮質ニューロンのミトコンドリア内におけるCa2+濃度に対するコントロールと検体3の比較。10μg/kgでCa2+濃度抑制の最大効力がみられる。(1000倍量の10mg/kgの結果と変わらない。)(n=3平均値:同一固体から得た3枚のスライスから得たデータ)
 図13は、海馬ニューロン(神経細胞)のK脱分極によるミトコンドリア内Ca2+濃度上昇を計測した図である。
 は、80mM KCl外液(5分間適用後5分間洗浄)を3回連続した時のコントロール反応。
 は、検体3を10μg/kg腹腔内注射後22時間後に脳スライス標本を作製し、これに80K外液を与えた時のミトコンドリア内Ca2+濃度の変化を示す図。
 は、海馬ニューロンのミトコンドリア内Ca2+濃度のコントロールと検体3の10μgと10mg/kg i.p.による抑制効果の比較を示す図。10μg/kgで最大効果が得られる。(n=3平均値:同一個体から得た3枚のスライスから得たデータ)
 実施例6の実験結果を踏まえると、検体3は10μg/kg i.p.生体内前処置により、マウス皮質と海馬神経細胞(ニューロン)の80K脱分極によるそれぞれのミトコンドリア内Ca2+濃度の上昇を顕著にしかも最大限に減少する。本結果は検体3が脳虚血時などに生じる神経細胞の損傷を救済することを示唆する。
 即ち、成熟マウス脳細胞(ニューロン)を損傷するミトコンドリア内遊離Ca2+増加によるCa負荷に対して、検体3によるATP増加が細胞膜上のCaポンプを賦活してミトコンドリア内遊離Ca2+量を減少させ、その結果として神経細胞死の防止に貢献することを示す(ATP増加の間接的証明)。
[実施例7]
 脳虚血モデル成体ラットによる運動の行動の低下に対して検体添加が及ぼす効果を確認するための実験を行った。
 ウイスター系成熟ラット(体重200~230g)の頭蓋骨に吸入麻酔科で小穴をあけた後、右脳線条体にコントロール群には生理食塩水、出血群には0.24Uのコラゲナーゼ(type IV)を含む生理食塩水1.2μlを注入して脳内出血モデルラットを作製した。
 図14は、脳内出血モデルラットの脳断面を示す図である。
 脳内出血モデルラットに対する検体4の脳細胞保護作用を確認するために、コラゲナーゼ投与の1時間後に検体4を100μg/kgを脳内のスポット(図中/白色菱形)へ注入し、ラットの運動足跡を定量的に量測定した。
 運動量の測定はラットを5分間動画撮影。その撮影時間の後半の3分間の自由行動(運動距離と運動スピード)を解析した。
 図15はラットの運動足跡を測定した図であり、図16は運動距離と運動スピードの経日変化を計測した図である。
 検体4はラットの脳出血によって起こる虚血性の運動距離と運動スピードの低下を緩和する(図15と16)。その効果は出血1日目と1週間後にもみられる。
 実験結果を踏まえると、成熟ラット脳細胞の虚血損傷の防止に検体4が貢献することが示された(ATP増加の間接的証明)。
 次いで、化合物番号II-13(検体5)、II-31(検体6)、III-2(検体7)、III-14(検体14)、IV-10(検体9)、IN-15(検体10)及びIV-23(検体11)の化合物を用いて、それらの検体の添加により海馬神経細胞樹状突起(Dendride)の分岐数が有意に伸長しているかを検定した。
 幼若(生後0日目)のICRマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて培養した。
 発達初期の細胞(培養1日目)に各検体を1回添加し、3日後(培養4日目)にMAP2抗体にて免疫染色し、樹状突起の分岐数を定量した。
 測定は細胞体(soma)を中心に10μm間隔で20μm~100μmの同心円(図示せず)を描き、その円を交差する樹状突起の本数を計測した。
 検定は、細胞体からの距離毎に計測した交差する樹状突起の本数を折線グラフ化し、折線グラフ下の面積(Area Under the Curve:AUC)に対し、Student’s  t-test, paired(t-検定、両側分布)で行った。
 例数が十分にある検体に対しては最大値と最小値を外して検定をした。添加する検体濃度はいずれも0.3μMであった。
 樹状突起が有意に伸長しているか否かの判定は、t-値よりp-値を算出し、p値がp<0.05では有意に伸長(効果++)、0.05<p<0.2では遠位又は近位において伸長(効果+)、p>0.2では有意差なし(効果±)とした。
 図22~図28はそれぞれ検体5~10を添加し、海馬神経細胞樹状突起(Dendride)の分岐数を定量検定した結果を示す図である。
 aは細胞体(soma)からの距離に対する交差樹状突起の本数を、bは、AUCを比較した検定結果を示した図である。
 また、実線は検体を添加した場合を、点線は検体の添加がなかった場合(control)を示している。なおnは標本数である。
 図から明らかなように、統計的に有意差が認められる(p<0.05)のは検体7(III-2)と検体II(IV-23)だけであるが、他の検体5(II-13)、6(II-31)、8(III-2)、9(IV-10)、10(IV-15)、11(IV-23)についても突起伸長の効果が認められる。
 次に、検体1(TND1128)を選び、β-NMNとの作用比較実験を行った。この実験では、マウス脳スライス標本を激しい脱分極刺激に暴露した場合の引き起こされる著しい細胞質内およびミトコンドリア内Ca2+ 濃度の変動に対する抑制効果を比較、評価した。これは発明者等の予備実験において、検体1(TND1128)で24時間処置した線虫においてSIRT1が有意に上昇する知見が得られたので、投与24時間後においてβ-NMNでも同様な効果が得られるか比較するためである。
[実験方法]
 脳スライス標本作成とカルシウム濃度計測:24時間前に検体1を皮下投与したマウス(C57B/6NL)の全脳スライス(300μm)を正中線で半切した全脳半切標本を用いた。この標本をO 95%、CO 5%通気した人工脳脊髄液(ACSF)内に室温で保存し、ミトコンドリアに選択的に取り込まれるXrhod-1/AM(Kd=700μM)、および細胞質に留まるfura-4F/AM(Kd=770μM)で二重染色した。この標本を倒立型蛍光顕微鏡(Olympus IX71)のステージに装着したチェンバーに置き、黒色木綿片でカバーしさらに白金リングで固定して、O 95%、CO 5%通気ACSFで潅流した(70ml/hr)。標本の蛍光画像を4倍の対物レンズで取得し、海馬腹側部と大脳皮質側頭部の画像を一画面に促えた。ミトコンドリア内カルシム濃度の計測には励起光580nmにより生ずる赤色蛍光(>600nm)の強度変化を、細胞質のカルシウム計測には360nm励起と380nm励起による蛍光(>500nm)の比として求めた。計測部位(ROI)は海馬CA1部位と大脳皮質の二カ所に置いた。
[薬物調整法と投与法]:
 β-NMNは水に溶解して、10mg/kg、30mg/kgまたは100mg/kgを、検体1はアルコールに溶解し、1mg/mlとし、これを水で希釈し、0.01mg/kg、0.1mg/kgまたは1.0mg/kgを標本作成24時間前にマウスに皮下投与した(0.1ml/10g)。
[効力評価法]:
 本試験では、二種の薬物の各濃度を投与したマウスから作成した脳標本を等張80mM KCl-ACSF(人工脳脊髄液)に5分間暴露し、その後5分間正常ACSFに戻す操作を三回連続で行うことで、標本に厳しいカルシウム負荷を与え、その際の、細胞質内とミトコンドリア内のカルシウム濃度の変動を計測した。
[実験結果]
 ミトコンドリア内カルシウム濃度の変動に及ぼすβ-NMNと検体1(TND1128)の作用
 図29は、β-NMN(A:0(control)(n=6)、B:10(n=5)、C:30(n=5)およびD:100mg/kg(n=5))を皮下投与されたマウスから24時間後に作成した標本を80K ACSFに三回暴露した時のミトコンドリアにおけるCa2+濃度変動を示している。図30は同様に80K ACSF暴露時の検体1(TND1128)(A:0(control)(n=6)、B:0.01(n=5)、C:0.1(n=5)およびD:1.0mg/kg(n=5)s.c.)投与マウスの脳標本におけるミトコンドリアのカルシウム濃度の変動を示す。両薬物のそれぞれの用量で処置された個体から得た標本の反応は第一回目の80K投与時点の蛍光強度を基準として標準化(normalize)し、細胞質またはミトコンドリア内Ca2+  濃度の時間平均値とその標準誤差を示している。この図29と図30から両薬物は用いた用量範囲でミトコンドリア内Ca2+ 上昇を用量依存性に抑制していることは明らかである。
 図31および図32はそれぞれ、β-NMNと検体1(TND1128)の各濃度の作用を定量化した結果である。図31および図32のAは投与時実験開始5分後から80K-ACSFに三回暴露し、5分洗浄した時点35分までのミトコンドリア内カルシウム濃度の大きさを、AUC(Area under the curve)として計算した結果である(図37参照)。BとCはそれぞれ、大脳皮質(CTX)と海馬(CA1)における80K投与5分間とその後の洗浄5分間(1st:5分から15分、2nd:15分から25分、3rd:25分から35分)それぞれに対する薬物作用を示している(図37参照)。有意差検定はTukey法を用いた。検討した用量範囲でβ-NMNとTND1128 の用量反応関係が見られた。
[細胞質内カルシウム濃度の変動に及ぼすβ-NMNと検体1(TND1128)の作用]
 図33および図34は80KACSF三連続投与時の細胞質内カルシウム変動に及ぼすβ-NMNおよび検体1(TND1128)の作用を示す。図33と図34に示したコントロール反応は80K-ACSF投与毎の反応の回復が小さく、一見、カルシウム指示薬の反応が頭打ちになっている様に見えるが、この試験に用いた細胞内カルシウム濃度指示薬fura-4FはCa2+キレート能(Kd)は770nMであり、予想される細胞内カルシウム濃度の激しい上昇にも十分対応できると考えられるので、対照群の細胞内Ca2+ の動きは細胞質膜のCa2+ ポンプの機能限界に達していることを示すものと考えることができる。β-NMNの30mg/kgおよび100mg/kg処置されたマウスから得られた標本、また、検体1(TND1128)の0.01mg/kgから1.0mg/kg処置マウスの標本では投与毎の細胞質内カルシウム濃度の変動に同様な回復が見られている。しかし、図35および図36に見られる様に、この値をミトコンドリアと同様な方法で定量化した場合、β-NMNの10mg/kg投与群以外の濃度で有意な差はみられなかった。
[有効濃度から見た両薬物の作用様式]
 両薬物はほぼ同程度のミトコンドリア内 Ca2+ 濃度制御作用を示すが、有効濃度からその作用は検体1(TND1128)の方が100倍強力であった。非特許文献6ではβ-NMN投与後、NAD が30分後にはピークに達し、投与されたNMNの血中濃度はそれに対応して減少すると報告しており、投与されたNMNがNAD 生合成の基質になっている可能性を示している。しかし、本実験で用いた検体1(TND1128)有効量は1.0mg/kg以下の微量であり、これをβ-NMNと同じように生合成の原料と考えることはできない。最終的にミトコンドリアの酸化的エネルギー獲得過程でのNAD の生合成量が増えているとしても、投与後24時間後に見られた有意なミトコンドリア機能安定作用はサーチュイン遺伝子群の発現促進によるNAD 増加によるものと考えるべきであろう。本研究では24時間前に投与したβ-NMNで有意なミトコンドリア保護機能が見られたことから、β-NMNの作用も単純にNAD の基質として供給された結果ではなく、サーチュイン遺伝子群への作用を介したものと考えるべきであろう。
 一方、細胞質内Ca2+ 濃度の80K-ACSFによる激しい上昇に対する作用についてはβ-NMNおよび検体1(TND1128)共に有意な作用を示さなかった。図29と図30に示すβ-NMN100mg/kgと検体1(TND1128)1mg/kgのミトコンドリア内Ca2+濃度変動に対する作用と、図33と図34に示すβ-NMNおよび検体1(TND1128)の細胞質内Ca2+ 濃度変動に対する作用から、この標本では80K-ACSFの激しい刺激にもかかわらず、極めて安定した生理学的反応を維持ができる状態であることを示している。これがヒトの脳で再現できれば、強力な脳保護作用を期待することができる。
 すでに赤ワインの成分であるresveratrolやその誘導体としてSRT1720などの合成サーチュイン活性化薬物の薬理作用が報告されているが(非特許文献8)、実際に本実験のように皮下投与されたマウス脳のミトコンドリア機能に対する有効性を言及した報告はない。
 以上から明らかなように、検体1(TND1128)は疎水性が高く、極めて安定な化合物であることが、β-NMNを凌ぐさらに大きな利点である。
 この利点を利用して、外用薬を調整し、衰えた毛根を活性化して、白髪や禿げの治療に、また、たるんだ皮膚細胞の若返りにも使用可能と思われる。さらに、経皮吸収によって脳への作用も期待できるのではないかと思われる。
 上述の実験結果を踏まえると、式(I)~(IV)で表わされる5-デアザフラビン化合物は細胞内でのATP産生を賦活しているといえる。

Claims (4)

  1.  細胞内でのATP産生を賦活するための式(I)で表わされる5-デアザフラビン化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    (式中、Rは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、R及びRは、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。)
  2.  細胞内でのATP産生を賦活するための式(II)で表わされるピリドジピリミジン化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    (式中、R及びR3は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。)
  3.  細胞内でのATP産生を賦活するための式(III)で表わされるデアザフラビノテストステロン化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    (式中、Rは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。)
  4.  細胞内でのATP産生を賦活するための式(IV)で表わされるデアザフラビノコレステロール化合物の使用
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    (式中、Rは、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Rは、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。)
PCT/JP2019/003860 2018-02-05 2019-02-04 細胞内でのatp産生を賦活するための補酵素因子の使用 WO2019151516A1 (ja)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020227043211A KR102521762B1 (ko) 2018-02-05 2019-02-04 세포 내에서 atp 생산을 활성화하기 위한 보효소 인자의 사용
US16/637,280 US11439644B2 (en) 2018-02-05 2019-02-04 Use of coenzyme factor for activation of ATP production in cell
KR1020227043212A KR102521763B1 (ko) 2018-02-05 2019-02-04 세포 내에서 atp 생산을 활성화하기 위한 보효소 인자의 사용
KR1020227043210A KR102521761B1 (ko) 2018-02-05 2019-02-04 세포 내에서 atp 생산을 활성화하기 위한 보효소 인자의 사용
KR1020207003037A KR102478363B1 (ko) 2018-02-05 2019-02-04 세포 내에서 atp 생산을 활성화하기 위한 보효소 인자의 사용
EP23217881.4A EP4324528A2 (en) 2018-02-05 2019-02-04 Use of coenzyme factor for activation of atp production in cell
EP19747358.0A EP3750543A4 (en) 2018-02-05 2019-02-04 USE OF COENZYME FACTOR TO ACTIVATE ATP PRODUCTION IN A CELL
CA3071744A CA3071744C (en) 2018-02-05 2019-02-04 Use of coenzyme factor for activation of atp production in cell
CN201980003658.9A CN111032051A (zh) 2018-02-05 2019-02-04 用于激活细胞中atp产生的辅酶因子的使用
US17/738,022 US11813265B2 (en) 2018-02-05 2022-05-06 Use of coenzyme factor for activation of ATP production in cell
US17/738,027 US11806351B2 (en) 2018-02-05 2022-05-06 Use of coenzyme factor for activation of ATP production in cell

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-018388 2018-02-05
JP2018018388 2018-02-05
JP2019-009224 2019-01-23
JP2019009224A JP6717989B2 (ja) 2018-02-05 2019-01-23 細胞内でのatp産生を賦活するための補酵素因子の使用

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/637,280 A-371-Of-International US11439644B2 (en) 2018-02-05 2019-02-04 Use of coenzyme factor for activation of ATP production in cell
US17/738,027 Division US11806351B2 (en) 2018-02-05 2022-05-06 Use of coenzyme factor for activation of ATP production in cell
US17/738,022 Division US11813265B2 (en) 2018-02-05 2022-05-06 Use of coenzyme factor for activation of ATP production in cell

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019151516A1 true WO2019151516A1 (ja) 2019-08-08

Family

ID=67478260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/003860 WO2019151516A1 (ja) 2018-02-05 2019-02-04 細胞内でのatp産生を賦活するための補酵素因子の使用

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11806351B2 (ja)
EP (1) EP4324528A2 (ja)
KR (3) KR102521762B1 (ja)
CA (1) CA3071744C (ja)
TW (2) TW202313054A (ja)
WO (1) WO2019151516A1 (ja)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0381276A (ja) * 1989-08-24 1991-04-05 Fumio Yoneda 5−デアザフラビン系化合物を有効成分とする制癌剤
JPH0673058A (ja) 1992-08-26 1994-03-15 Nippon Soda Co Ltd 5−デアザフラビン誘導体、その製造法
JPH06199857A (ja) 1993-01-07 1994-07-19 Taisho Pharmaceut Co Ltd 5−デアザフラボ−6,9−キノン誘導体及びその製造方法
JP2000212087A (ja) 1999-01-20 2000-08-02 Fujimoto Brothers:Kk ニトロ―5―デアザフラビン誘導体を有効成分とする放射線増感剤。
JP3073309B2 (ja) 1992-03-27 2000-08-07 雪印乳業株式会社 シアル酸結合5−デアザフラビン系化合物
JP2001048784A (ja) 1999-08-11 2001-02-20 Takeda Chem Ind Ltd ミトコンドリア機能賦活剤
JP2002322058A (ja) 2001-02-26 2002-11-08 Toyama Chem Co Ltd ミトコンドリア機能賦活剤
JP2005104868A (ja) * 2003-09-29 2005-04-21 Okayama Univ ピリドピリミジン骨格とステロイド骨格を内蔵する融合化合物及びその製造方法
JP2008255059A (ja) 2007-04-05 2008-10-23 Cosmo Oil Co Ltd ミトコンドリア障害脳疾患治療剤及び診断剤
JP2013234178A (ja) * 2012-04-12 2013-11-21 Kracie Seiyaku Kk 細胞死抑制組成物

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11322746A (ja) 1998-05-12 1999-11-24 Fujimoto Brothers:Kk 抗ヘルペスウイルス剤
IT1311627B1 (it) 1999-01-18 2002-03-14 Benetton Spa Struttura di supporto, particolarmente per calzature.
KR100359918B1 (ko) 1999-11-29 2002-11-04 엘지전자 주식회사 멀티미디어 객체 검색방법과 멀티미디어 객체의 특징정보 생성방법 및 그 특징정보가 기록된 기록매체

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0381276A (ja) * 1989-08-24 1991-04-05 Fumio Yoneda 5−デアザフラビン系化合物を有効成分とする制癌剤
JP3073309B2 (ja) 1992-03-27 2000-08-07 雪印乳業株式会社 シアル酸結合5−デアザフラビン系化合物
JPH0673058A (ja) 1992-08-26 1994-03-15 Nippon Soda Co Ltd 5−デアザフラビン誘導体、その製造法
JPH06199857A (ja) 1993-01-07 1994-07-19 Taisho Pharmaceut Co Ltd 5−デアザフラボ−6,9−キノン誘導体及びその製造方法
JP2000212087A (ja) 1999-01-20 2000-08-02 Fujimoto Brothers:Kk ニトロ―5―デアザフラビン誘導体を有効成分とする放射線増感剤。
JP2001048784A (ja) 1999-08-11 2001-02-20 Takeda Chem Ind Ltd ミトコンドリア機能賦活剤
JP2002322058A (ja) 2001-02-26 2002-11-08 Toyama Chem Co Ltd ミトコンドリア機能賦活剤
JP2005104868A (ja) * 2003-09-29 2005-04-21 Okayama Univ ピリドピリミジン骨格とステロイド骨格を内蔵する融合化合物及びその製造方法
JP2008255059A (ja) 2007-04-05 2008-10-23 Cosmo Oil Co Ltd ミトコンドリア障害脳疾患治療剤及び診断剤
JP2013234178A (ja) * 2012-04-12 2013-11-21 Kracie Seiyaku Kk 細胞死抑制組成物

Non-Patent Citations (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. R. SHRESTHAT. SHINDON. ASHIDAT, NAGAMATSU, BIOORG. & MED. CHEM., vol. 16, 2008, pages 8685 - 8696
ALI I. HAMED ET AL.: "Antitumor studies - Part 2: Structure - activity relationship study for Flavin analogs including investigations on their in vitro antitumor assay and docking simulation into protein tyrosine kinase", EUROPEAN JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 43, no. 7, 14 October 2007 (2007-10-14) - July 2008 (2008-07-01), pages 1376 - 1389, XP022795982 *
F. YONEDAH. YAMATOT. NAGAMATSUH. EGAWA, J. POLYMER SCI.:PLYMER LETT. ED., vol. 20, 1982, pages 667 - 670
F. YONEDAK. MORIS. MATSUOY, KADOKAWAY. SAMUMA, J. CHEM. SOC., PERKIN TRANS., vol. 1, 1981, pages 1836 - 1839
F. YONEDAK. MORIY. SAKUMA, J. CHEM. SOC., PERKIN TRANS, vol. 1, 1980, pages 978 - 981
F. YONEDAK. TANAKAH. YAMATOK. MORIYAMAT. NAGAMATSU, J. AM. CHEM. SOC., vol. 111, 1989, pages 9199 - 9202
F. YONEDAK. TSUKUDAK. SHINOZUKAF. HIRAYAMAK. UEKAMAA. KOSHIRO, CHEM. PHARM. BULL., vol. 28, 1980, pages 3514 - 3520
F. YONEDAT. NAGAMATSUM. TAKAMOTO, CHEM. PHARM. BULL., vol. 31, 1983, pages 344 - 347
F. YONEDAY. SAKUMAS. MIZUMOTOR. ITO, J. CHEM. SOC., PERKIN TRANS., vol. 1, 1976, pages 1805 - 1808
IMAI S1ARMSTRONG CMKAEBERLEIN MGUARENTE L: "Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase", NATURE, vol. 403, no. 6771, 2000, pages 795 - 800
IMAI: "A possibility of nutriceuticals as an anti-aging intervention: activation of sirtuins by promoting mammalian NAD biosynthesis", PHARMACOL RES., vol. 62, no. 1, 2010, pages 42 - 7, XP027046798
K. KURODAT, NAGAMATSUR. YANADAF. YONEDA, J. CHEM. SOC., PERKIN TRANS., vol. 1, 1993, pages 547 - 550
K. KURODAT. NAGAMATSUY. SAKUMAF. YONEDA, J. HETEROCYCLIC CHEM., vol. 19, 1982, pages 945 - 947
K. MORIK. SHINOZUKAY SAKUMAF. YONEDA: "J. Chem. Soc.", CHEM. COMM., 1978, pages 764
K. TANAKAT. KIMURAX. CHENT. KAWAMOTOF. YONEDA, CHEM. PHARM. BULL., vol. 38, 1990, pages 312 - 317
MICHISHITA E1PARK JYBURNESKIS JMBARRETT JCHORIKAWA I.: "Evolutionarily conserved and nonconserved cellular localizations and functions of human SIRT proteins", MOL BIOL CELL, vol. 16, no. 10, October 2005 (2005-10-01), pages 4623 - 35, XP002430110, DOI: 10.1091/mbc.E05-01-0033
MILLS KFYOSHIDA SSTEIN LRGROZIO AKUBOTA SSASAKI YREDPATH PMIGAUD MEAPTE RSUCHIDA K: "Long-Term Administration of Nicotinamide Mononucleotide Mitigates Age-Associated Physiological Declinde in Mice", CELL METAB., vol. 24, no. 6, 2016, pages 795 - 806, XP029847468, DOI: 10.1016/j.cmet.2016.09.013
PACHOLEC MBLEASDALE JECHRUNYK BCUNNINGHAM DFLYNN DGAROFALO RSGRIFFITH DGRIFFOR MLOULAKIS PPABST B: "SRT1720, SRT2183, SRT1460, and resveratrol are not direct activators of SIRT1", J BIOL CHEM., vol. 285, no. 11, 2010, pages 8340 - 51, XP008162683, DOI: 10.1074/jbc.M109.088682
R. HIRAYAMAM. KAWASET. KIMACHIK. TANAKAF. YONEDA, J., HETEROCYCLIC CHEM., vol. 26, 1989, pages 1255 - 1259
SHRESTHA R. AJAYA ET AL.: "Synthesis, biological active molecular design, and molecular docking study of novel deazaflavin-cholestane hybrid compounds", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 16, no. 18, 22 August 2008 (2008-08-22) - 15 September 2008 (2008-09-15), pages 8685 - 8696, XP025427664 *
SYNTHESIS OF HETEROCYCLIC COMPOUND HAVING REDOX FUNCTIONALITY, Retrieved from the Internet <URL:www.waseda.jp/prj-prac-chem/product/research%20product/2002nitta.pdf>
T, NAGAMATSUH. YAMATOM. ONOS. TAKARADAF. YONEDA, J. CHEM. SOC., PERKIN TRANS, vol. 1, 1992, pages 2101 - 2109
T. KIMACHIK. TANAKAF. YONEDA, J. HETEROCYCLIC CHEM., vol. 28, 1991, pages 439 - 443
T. NAGAMATSUY. HASHIGUCBIY. YONEDA, J. CHEM. SOC., PERKIN TRANS., vol. 1, 1984, pages 561 - 565
T. NAGAMATSUY. SAKUMAY. YONEDA, SYNTHESIS, 1983, pages 923 - 924
TANG BL: "Sirt1 and the Mitochondria Mol", CELLS, vol. 39, no. 2, 2016, pages 87 - 95
TANIGAWA AKIE ET AL.: "Stimulation of Nerve Growth Factor Synthesis/Secretion by 5-Deazaflavoquinone in Mouse Astrocytes", JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, MOLECULAR BIOLOGY AND BIOPHYSICS, vol. 3, no. 3, January 1999 (1999-01-01), pages 231 - 237, XP009518519, ISSN: 1025-8140 *
Y. EIKYUY. NAKAMURAT. AKIYAMAF. YONEDAK. TANAKAK. FUJI, CHEM. PHARM. BULL., vol. 40, 1992, pages 291 - 293

Also Published As

Publication number Publication date
US11806351B2 (en) 2023-11-07
CA3071744C (en) 2022-01-04
TW202313061A (zh) 2023-04-01
US11813265B2 (en) 2023-11-14
KR20230004893A (ko) 2023-01-06
CA3071744A1 (en) 2019-08-08
TW202313054A (zh) 2023-04-01
KR20230004894A (ko) 2023-01-06
KR102521761B1 (ko) 2023-04-14
KR102521763B1 (ko) 2023-04-14
US20220265661A1 (en) 2022-08-25
KR20230003307A (ko) 2023-01-05
US20220265662A1 (en) 2022-08-25
EP4324528A2 (en) 2024-02-21
KR102521762B1 (ko) 2023-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Heretsch et al. Cyclopamine and hedgehog signaling: chemistry, biology, medical perspectives
Toescu et al. Neuronal ageing from an intraneuronal perspective: roles of endoplasmic reticulum and mitochondria
JP2012529432A (ja) アミノピロリジノン誘導体及びその使用
Chen et al. Cytoprotective effects of fisetin against hypoxia-induced cell death in PC12 cells
Zhang et al. Fucoxanthin mitigates subarachnoid hemorrhage-induced oxidative damage via sirtuin 1-dependent pathway
JP2003519654A (ja) 脈管形成を抑制するためのエピガロカテキンガラートの使用
Inoguchi et al. A possible target of antioxidative therapy for diabetic vascular complications-vascular NAD (P) H oxidase
Xiyang et al. COX5A plays a vital role in memory impairment associated with brain aging via the BDNF/ERK1/2 signaling pathway
Liu et al. Red yeast rice protects circulating bone marrow-derived proangiogenic cells against high-glucose-induced senescence and oxidative stress: The role of heme oxygenase-1
Cao et al. The protective effect of hydroxylated fullerene pretreatment on pilocarpine-induced status epilepticus
JP2016537426A (ja) 概日性タンパク質関連状態の治療または予防のための組成物および方法
He et al. The Potential Role of Voltage-Dependent Anion Channel in the Treatment of Parkinson’s Disease
Elmazoglu et al. Protective effects of novel substituted triazinoindole inhibitors of aldose reductase and epalrestat in neuron-like PC12 cells and BV2 rodent microglial cells exposed to toxic models of oxidative stress: comparison with the pyridoindole antioxidant stobadine
JP6717989B2 (ja) 細胞内でのatp産生を賦活するための補酵素因子の使用
WO2019151516A1 (ja) 細胞内でのatp産生を賦活するための補酵素因子の使用
Shim et al. Discovery of a NADPH oxidase inhibitor,(E)-3-cyclohexyl-5-(4-((2-hydroxyethyl)(methyl) amino) benzylidene)-1-methyl-2-thioxoimidazolidin-4-oneone, as a novel therapeutic for Parkinson's disease
CN114478450A (zh) 苄氧基苯酞类化合物、其制备方法和用途
Monir et al. Anti-hypertensive activity of punica granatum peels ethyl acetate extract on fludrocortisones induced hypertension in wistar rats
EP2808023A1 (en) New drug for the treatment and/or prevention of depressive disorders
Du et al. Design, synthesis and biological evaluation of indoline derivatives as multifunctional agents for the treatment of ischemic stroke
RU2799454C2 (ru) Терапевтический препарат для лечения нейродегенеративных заболеваний и его применение
Maiese The Impact of Sirtuins, Erythropoietin, and Hypoxia-inducible Factor-1 on Neurovascular Disease
Sutherland et al. The Age-Dependent Decline in Neuron Growth Potential in the CNS is Associated with an Age-Related Dysfunction of Neuronal Mitochondria
Liu et al. Research Article Red Yeast Rice Protects Circulating Bone Marrow-Derived Proangiogenic Cells against High-Glucose-Induced Senescence and Oxidative Stress: The Role of Heme Oxygenase-1
Wu et al. VDR agonist prevents diabetic endothelial dysfunction through inhibition of prolyl isomerase-1 mediated mitochondrial oxidative stress and inflammation

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19747358

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3071744

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20207003037

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019747358

Country of ref document: EP

Effective date: 20200907