TWI846686B - Ａｔｐ產生激活劑 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種用於激活細胞中ATP產生的激活劑。一種式(I)所示的5-去氮黃素化合物的用途。式中，R1表示氫原子、烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、或苯基，R2表示烷基、環烷基、苯基取代低級烷基、苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基、低級烷基二取代苯基，R3及R4表示氫原子、低級烷基、鹵素原子、羥基、硝基、氰基、低級烷氧基、苯基取代低級烷氧基、低級烷基胺基、苯基取代低級烷基胺基、或低級烷基磺醯基。
Description
本發明是有關於一種用於在細胞中激活ATP產生的輔酶因子的用途，詳細而言，是有關於一種輔助參與ATP產生的氧化還原酶的輔酶因子的用途。
伴隨阿茲海默症(Alzheimer's disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、腦出血．栓塞的神經變性疾病或抑鬱症近年來隨著老齡化社會的到來而急劇增加，對該些神經變性疾病的預防、治療藥物的需求越來越高。
作為所述疾病的發病原因之一，可列舉細胞中能量產生(三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)產生)的功能下降。ATP產生雖於細胞質基質中進行，但於有氧的情況下主要於粒線體(mitochondria)複合體中進行。粒線體存在於所有動物細胞內，經由電子傳遞系統而負責產生細胞活動所需要的能量。粒線體及粒線體基因相對於由電子傳遞異常所致的氧化壓力(oxidative stress)而言是脆弱的，因此，結果導致能量代謝下降、細胞變性。特別是於腦細胞中，能量需求量高，因此粒線體更容易受到變性的影響，藉由伴隨衰老而產生的粒線體電子傳遞異常而引起所謂的大腦粒線體障礙。
另一方面，根據最近的研究，認為藉由去乙醯化酶(Sirtuin)基因的活化，能夠延緩衰老、延長生物壽命(非專利文獻1)。
亦針對去乙醯化酶基因與粒線體的關係進行了研究，認為若使去乙醯化酶基因活化，則細胞內的胞器即粒線體的量增加，進而被激活，促進失智預防、動脈硬化預防、聽覺障礙預防、脂肪燃燒、細胞修復、活性氧的去除，從而抑制衰老因素的表現，不僅如此，亦獲得治癒粒線體障礙的效果(非專利文獻2)。
例如，麻薩諸塞大學的研究團隊於缺損了作為去乙醯化酶基因之一的SIRT1基因的小鼠中發現了記憶障礙，因此提出了本基因參與記憶的可能性。進而，使用阿茲海默症與肌肉萎縮性脊髓側索硬化症的疾病的動物模型暗示了SIRT1基因活化於神經變性疾病治療中的應用。另一方面，2008年，華盛頓大學醫學部今井真一郎教授鑑定出菸鹼醯胺單核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)作為控制人類衰老的物質，亦成功地藉由NMN使老化而失活的蘭氏小島(Langerhan's island)再活化。明確了該NMN激活所有基因並使粒線體活化(非專利文獻3)。
另外明確提到，今井教授等人發現的作為長壽命蛋白質去乙醯化酶基因之一的SIRT2是一種於端粒(telomere)及核糖體(ribosome)去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)中停止轉錄的異染色質(heterochromatin)成分，且為菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD)依賴性組蛋
白去乙醯酶(histone deacetylase)。DNA與組蛋白的鍵結因乙醯化而減弱，所述酶藉由去乙醯化使DNA與組蛋白的鍵結恢復原狀，提高DNA向組蛋白的纏繞，並抑制轉錄的作用，認為其與長壽有關(非專利文獻4)。
今井教授等人暗示了所述酶的活化因子即NAD+(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)的生物合成促進劑具有抗衰老效果的可能性，並報告了NAD+合成的中間物質即NMN促進NAD+的生物合成，且其參與抗衰老作用的可能性(非專利文獻5)。
進而，米爾斯(Mills)等人報告，若使小鼠長期攝取添加有NMN的食物，則會提高組織中NAD+的產生，且可抑制因年齡增長導致的個體生理學功能的下降(非專利文獻6)。
所述情況亦可根據以下來理解：NAD+是與粒線體中的氧化磷酸化的第一階段及三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle，TCA cycle)中的氧化反應有關的能量產生最重要的分子之一。
另一方面，已知作為長壽命蛋白質去乙醯化酶基因之一的SIRT1雖然主要發現存在於核中，但亦與受到損傷的粒線體的修復、再生有關。進而明確提到，於至今為止所發現的哺乳動物的7個去乙醯化酶基因中，SIRT3、SIRT4及SIRT5主要發現存在於粒線體中(非專利文獻7、非專利文獻8)。
綜合該些結果，認為多種多樣的去乙醯化酶基因經由粒線體功能的活化而參與壽命延長作用(非專利文獻9)。
於正常時的粒線體中，NMN(NAD+(菸鹼醯胺腺嘌呤
二核苷酸)的前驅化合物)始終持續地產生，但於衰老或病態時其產生量下降，NAD+減少。結果，藉由利用粒線體中的電子傳遞系統實現的氧化磷酸化或於細胞質基質中藉由糖酵解系統而產生的維持生命的能量源即ATP(adenosine triphosphate)減少(非專利文獻10)。NAD+的還原型即二氫菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(Dihydro-nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)或二氫黃素腺嘌呤二核苷酸(Dihydro-flavin adenine dinucleotide，FADH2)於粒線體內的基質(matrix)的TCA(檸檬酸)迴路或細胞質的糖酵解系統中作為輔酶而發揮作用。
NAD(菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸)是與氧化還原酶有關的輔酶之一，還原型是NADH，且為體內存在量最多的輔酶。
NAD的結構是菸鹼醯胺單核苷酸(NMN)與腺苷酸(adenyl acid)進行了磷酸二酯鍵結。氧化型NAD中的吡啶環的氮原子是以吡啶鎓離子的形式存在，因此將其表達為NAD+。NAD+的重要功能在於ATP產生機制(氧化反應)與NAD+的還原共軛這一點。
另外，黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)亦為與氧化還原酶有關的輔酶之一，還原型是FADH2，且被用於利用粒線體的電子傳遞系統進行的ATP產生。
真核生物代謝中的FAD的一次供給目的地是進行粒線體內的檸檬酸循環與β氧化的細胞質基質。於檸檬酸循環中，FAD作為將琥珀酸氧化為富馬酸的琥珀酸去氫酶(dehydrogenase)的輔酶而發揮作用，於β氧化中，作為醯基CoA去氫酶的酶反應的
輔酶而發揮作用。但是，屬於氧化還原(redox)系統的NMN或NAD+於代謝系統中容易被分解，於化學上亦不穩定，認為將來難以作為醫藥品進行開發。進而，合成亦變得昂貴。
因此，迫切期望開發一種於具有優異的ATP產生功能激活作用、且顯示出優異的體內動態(體內吸收性、腦內移動性等)的方面，作為醫藥品可充分令人滿意的化學物質。
但是，本發明者等人長年對具有黃素骨架的化合物的合成及其藥理作用反覆進行了努力研究。具有將核黃素(riboflavin)的5位的N取代為CH的特有化學結構的5-去氮黃素(5-deaza flavin)(嘧啶并[4,5-b]喹啉-2,4(3H,10H)-二酮)衍生物是1970年作為核黃素的類似物而首次合成的化合物。於5-去氮黃素的衍生物中亦已知有顯示出優異的抗癌活性的物質、或具有抗皰疹(herpes)病毒活性的物質，亦有被用作抗癌劑或抗皰疹病毒劑的物質(專利文獻1~專利文獻5)。
亦對以下方面進行了研究：伴隨所述結構的變化而產生的針對由醇向酮或醛的轉化反應而言的觸媒功能、由胺向亞胺(酮)的轉化反應、由羰基化合物向醇的還原或由亞胺向胺的還原以及不對稱還原等、或者與NAD+(菸鹼醯胺核苷酸(nicotinamide nucleotide))的相似性(非專利文獻11)。關於粒線體功能激活劑，亦公開了各種專利文獻(專利文獻6~專利文獻8)。但是，未找到著眼於所述5-去氮黃素衍生物的氧化還原觸媒活性並應用於粒線體功能激活作用的文獻。明確到5-去氮黃素衍
生物由於具有氧化還原觸媒活性，因此對粒線體的氧化磷酸化中的ATP產生功能有影響。5-去氮黃素骨架可見於作為與甲烷發酵的氧化還原反應相關的輔酶的輔酶F420(Coenzyme F420)，且亦為黃素的類似物。其氧化還原行為相較於黃素，反而類似於NAD(P)+。另外，共振極限式的一個於分子中內置有NAD(P)+結構，即使看到電子密度(利用分子軌域計算化學求出)，亦能夠看作是「黃素型的NAD(P)+」。
發明者等人認為，5-去氮黃素由於具有與NAD+或FAD相同的redox(氧化還原)功能，因此激活細胞中ATP產生，進而直接或間接地激活去乙醯化酶基因，並進行了努力研究，結果發現，具有特定結構式的5-去氮黃素化合物於化學上非常穩定，而且可廉價地合成，並激活ATP產生，進而激活對粒線體的功能進行控制的去乙醯化酶基因，從而完成了本發明。
[現有技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第3073309號
[專利文獻2]日本專利特開平6-199857號
[專利文獻3]日本專利特開平11-322746號
[專利文獻4]日本專利特開2000-212087號
[專利文獻5]日本專利特開平6-73058號
[專利文獻6]日本專利特開2001-48784號
[專利文獻7]日本專利特開2002-322058號
[專利文獻8]日本專利特開2008-255059號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]140.藉由粒線體控制而實施的抗衰老對策，上原紀念生命科學財團研究報告集，25(2011)
[非專利文獻2]對藉由SIRT1實現的代謝控制機制的闡明，www.mishima-kaiun.or.jp/assist/docs/SNo4-hasegawa.pdf
[非專利文獻3]恢復身體功能，延長健康壽命。--於衰老．壽命的研究中闡明的物質「NMN」的神奇功效，https：//www.mugendai-web.jp/archives/6576
[非專利文獻4]今井(Imai)S1，阿姆斯特朗(Armstrong)CM，凱博萊(Kaeberlein)M，瓜倫特(Guarente)L(2000)轉錄去乙醯化長壽蛋白質Sir2為一種NAD-依賴性組蛋白去乙醯酶(Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase).自然(Nature).403(6771)：795-800.
[非專利文獻5]今井(Imai)(2010)營養劑作為抗衰老干預的可能性：藉由促進哺乳動物NAD生物合成來激活去乙醯化酶基因(A possibility of nutriceuticals as an anti-aging intervention：activation of sirtuins by promoting mammalian NAD biosynthesis).藥理研究(Pharmacol Res).62(1)：42-7.
[非專利文獻6]米爾斯(Mills)KF，吉田(Yoshida)S，斯泰因(Stein)LR，格羅吉奧(Grozio)A，久保田(Kubota)S，佐
佐木(Sasaki)Y，雷德帕斯(Redpath)P，米高德(Migaud)ME，艾普特(Apte)RS，內田(Uchida)K，吉野(Yoshino)J，今井(Imai)SI(2016)菸鹼醯胺單核苷酸的長期施用減緩小鼠的年齡相關的生理衰退(Long-Term Administration of Nicotinamide Mononucleotide Mitigates Age-Associated Physiological Decline in Mice).細胞代謝(Cell Metab).24(6)：795-806.
[非專利文獻7]道下(Michishita)E1，帕克(Park)JY，伯納斯基(Burneskis)JM，巴雷特(Barrett)JC，堀川(Horikawa)I.(2005)人類SIRT蛋白的進化保守與非保守的細胞定位與功能(Evolutionarily conserved and nonconserved cellular localizations and functions of human SIRT proteins).細胞的分子生物學(Mol Biol Cell).10月(Oct)；16(10)：4623-35
[非專利文獻8]帕克萊(Pacholec)M，布萊斯蒂(Bleasdale)JE，克朗尼克(Chrunyk)B，康寧漢(Cunningham)D，弗林(Flynn)D，加羅法洛(Garofalo)RS，格里菲斯(Griffith)D，格里弗(Griffor)M，路拉克斯(Loulakis)P，帕布斯特(Pabst)B，邱(Qiu)X，斯托克曼(Stockman)B，塔納巴爾(Thanabal)V,瓦吉斯(Varghese)A，瓦爾德(Ward)J，韋斯卡(Withka)J，阿恩(Ahn)K.(2010)SRT1720、SRT2183、SRT1460、以及白藜蘆醇並非SIRT1的直接激活劑(SRT1720,SRT2183,SRT1460,and resveratrol are not direct activators of SIRT1).生物化學雜誌(J Biol Chem.)285(11)：8340-51.
Tang)BL(2016)Sirt1與粒線體(Sirt1 and the Mitochondria)分子與細胞(Mol.Cells)39(2)：87-95
[非專利文獻10]衰老相關疾病中NAD+合成系統的作用與作為藥物靶標的可能性，https：//seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2015.870239/data/index.pdf
[非專利文獻11]「具有氧化還原功能性的雜環化合物的合成」，www.waseda.jp/prj-prac-chem/product/research%20product/2002nitta.pdf
本發明的課題在於自各種5-去氮黃素衍生物中提供一種具有對於激活細胞內ATP產生而言有效的結構式的5-去氮黃素化合物。
本發明者等人為了解決所述課題而進行了努力研究，將各種具有不同結構式的5-去氮黃素衍生物化合物製作成樣本，並使用其於生物體外(in vitro)反覆進行了各種實驗，結果發現了一種具有使細胞中ATP產生增加的結構式的化合物。
首先，作為NMN(參照圖17)的類似化合物，本發明者等人著眼於作為生長因子而為人所知、且將作為水溶性維生素
的核黃素(維生素B2)的黃素骨架的5位的氮取代為亞甲基的5-去氮黃素。5-去氮核黃素與核黃素進行代謝對抗，顯示出強大的抗球蟲病活性。最近自甲烷生成菌中發現了具有5-去氮黃素骨架的輔酶F420(參照圖18，氧化還原輔酶因子420，自甲烷生成菌中發現，輔酶F420於由二氧化碳向甲烷還原的過程中、或抗生素的生物合成過程中發揮重要作用。L.D.艾里奇，G.D.沃格爾斯，與R.S.沃爾夫，生物化學，17,4583(1978).；R.P.霍斯格，W.H.奧姆-詹森，與C.沃爾什，生物化學，24,1629(1985).)，得知於由二氧化碳向甲烷還原的過程中、或抗生素的生物合成過程中發揮著重要作用。5-去氮黃素的氧化還原行為相較於黃素(flavin)，反而類似於NAD(P)+(參照圖19，菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)與菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(NADP+)的氧化形式的結構；以及NAD(P+)的氧化還原)。另外，共振極限式的一個於分子中內置有NAD(P)+結構，即使看到電子密度(利用分子軌域計算化學求出)，亦能夠看作是「黃素型的NAD(P)+」(參照圖20)。藉由海格耳分子軌域法(Hückel molecular orbital method，Hückel MO法)計算，5-去氮黃素環的5位非常缺乏π電子(淨電荷net charge：+0.24)，菸鹼醯胺核苷酸的4位亦同樣缺乏π電子(淨電荷(net charge)：+0.210)。因此，認為5-去氮黃素環屬於NAD(+)與FAD(參照圖21，黃素輔酶的結構與名稱)兩者的電子傳遞系統。菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，nicotinamide adenine dinucleotide)是於所有真核生物與許多古細菌、真細菌(eubacteria)中使用的
電子傳遞體。
事實上，藉由米托追蹤器(Mito Tracker)螢光染色對粒線體膜電位進行螢光標記後，藉由新穎NMN類似物(5-去氮黃素)的處理而明顯觀察到對粒線體活性的促進。若使去乙醯化酶基因活化，則認為細胞內的胞器「粒線體」被活化，促進失智預防、動脈硬化預防、聽覺障礙預防、脂肪燃燒、細胞修復或對基因有害的活性氧的去除，從而獲得抑制衰老因素表現的效果，作為所述電子傳遞系統而起作用的5-去氮黃素相較於β-NMN而為低容量，並開啟作為長壽基因的去乙醯化酶基因而活化，同時藉由粒線體的活化而促進ATP產生。
另一方面，發明者等人認為，關於具有與NAD+或FAD相同的氧化還原(redox)功能的5-去氮黃素化合物，與當前正研究欲用於補充NMN的醫藥品中的β-NMN相比，於化學上非常穩定，而且可廉價地合成，使NAD+活化，進而亦直接或間接地激活粒線體的長壽基因(SIRT1及SIRT3)。即，發明者等人為了評價以NAD+依賴性的方式被激活且作為對於維持粒線體功能而言重要的基因而已經明確的長壽基因SIRT1的活化，以作為SIRT1的靶標轉錄因子的FOXO1的表達為活性指標，使用HCT116細胞並藉由定量即時聚合酶鏈鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction，q-RT-PCR)法對傳訊核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)的增加進行了篩選評估。
結果表明，與β-NMN相比，本發明的化合物以更低的
劑量具有SIRT1活性能力。因此可預想，本發明的化合物使NAD+直接活化，即便於缺血等病態條件下亦連續產生ATP，其效果持續且強大。因此認為，本發明的化合物充分具備可作為醫藥品來開發的必要條件。另外，由於其化學結構於功能及電子學上與NAD+及FAD的輔酶的核部分的合體型結構、即以菸鹼醯胺(nicotinamide)與黃素(flavin)的混合物(hybrid)的形式存在於自然界的結構相近，因此可推測，幾乎沒有表現出副作用。進而，本發明的化合物的結構若根據氧化還原電位測定值來判斷，則相較於作為輔酶的NAD或FAD，redox電位(potential)高，氧化還原能力優異。
本發明是基於所述見解而完成的。
即，根據本發明，作為對於在細胞中激活ATP產生而言有效的輔酶因子，確定了下述式(I)~式(IV)所示的化合物。
(式中，R1表示氫原子、烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、或苯基，R2表示烷基、環烷基、苯基取代低級烷基、苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基、低級烷基二取代苯基，R3及R4表示氫原子、低級烷基、鹵素原子、羥基、硝基、氰基、低級烷氧基、苯基取代低級烷氧基、低級烷基胺基、苯基取代低級烷基胺基、或低級烷基磺醯基)
(式中，R1及R3表示氫原子、烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、或苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基、低級烷基二取代苯基，R2表示烷基、環烷基、苯基取代低級烷基、苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基、低級烷基二取代苯基)
[化3]
(式中，R1表示氫原子、烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、或苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基，R2表示烷基、環烷基、苯基取代低級烷基、苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基、低級烷基二取代苯基)
[化4]
(式中，R1表示氫原子、烷基、鹵素取代烷基、羧基取代烷基、或苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基，R2表示烷基、環烷基、苯基取代低級烷基、苯基、經鹵素原子或低級烷基或低級烷氧基中的一個取代而成的苯基、低級烷基二取代苯基)
藉由使用由本發明提供的激活ATP產生的輔酶因子，可改善細胞中能量產生功能的下降。
因此，作為伴隨阿茲海默症、帕金森病、腦出血、栓塞的神經變性疾病或抑鬱症等的預防、治療藥物而言極其有用。
圖1是表示向人由來神經母細胞(神經母細胞瘤
(neuroblastoma))SH-SY5Y株的培養細胞中添加樣本1並對添加後的細胞內．外的ATP濃度進行螢光測定而得的結果的圖。
圖2A是表示向中樞神經系統的膠細胞(glial cell)的一種、即培養星狀細胞(astrocyte)中添加樣本1並進行螢光測定而得的結果的圖。
圖2B是對圖2A中的測定結果進行定量化的圖。
圖3是向人神經膠瘤(human glioma)U251的培養細胞(Sig1-R轉染細胞(Sig1-R transfected cells))中添加樣本1、樣本2，並與未添加添加後的細胞內ATP濃度的情況(對照組(Cont.))進行相對比較而示出的圖。
圖4是表示自幼小(出生後第0天)的ICR(癌症研究學會(Institute for Cancer Research))小鼠(mouse)腦中採集海馬迴培養細胞，於培養皿中培養神經細胞，並添加樣本1後的海馬迴神經細胞(神經元(neuron))的神經軸突(Axon)的延伸、發育、分支的免疫染色圖像。
圖5是表示與圖4的情況同樣地添加樣本1，並測量海馬迴神經細胞軸突(Axon)的分支數量的結果的圖。
圖6是表示與圖4的情況同樣地添加樣本1後，海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)的延伸、發育、分支的免疫染色圖像。
圖7是表示與圖6的情況同樣地添加樣本1，並測量海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)的分支數量的結果的圖。
圖8是與圖4的情況同樣地進行培養並對第14天的興奮性突
觸(synapse)進行免疫染色的自突觸(autapse)標本中的突觸的免疫染色圖像。
圖9是與圖4的情況同樣地進行培養，並對第14天的興奮性突觸的數量進行定量的圖。
圖10是對成熟培養海馬迴細胞(培養第11天)施用1次樣本1，並於3天後(培養第14天)定量的海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)的免疫染色圖像。
圖11是與圖10的情況同樣地於培養第14天的發育期藉由MAP2抗體進行免疫染色，並測量樹突(Dendrite)的分支數量的圖。
圖12是對成熟C57BL/6N小鼠(10週齡~17週齡、體重28g~31g)腹腔內施用生理鹽水(對照組(control))與樣本3(10μg/kg)，22小時後製作包含皮質(Cortex)與海馬迴(Hippocampus)區域的腦薄切片(slice)標本，於細胞外液中添加80mM KCl(80K)而引起細胞膜的去極化，測量因K+去極化而產生的存在於大腦皮質神經元(神經細胞)內的粒線體內Ca2+濃度上升與藉由樣本3對其進行抑制的效果的圖。
圖13是與圖12的情況同樣地測量海馬迴神經元(神經細胞)的K+去極化所引起的粒線體內Ca2+濃度上升與藉由樣本3對其進行抑制的效果的圖。
圖14是表示於吸入麻醉下的韋斯(Wistar)系成熟大鼠(rat)(體重200g~230g)的頭骨上開設小孔後，向對照組的右腦紋狀
體中注入生理鹽水1.2μl，向出血組的右腦紋狀體中注入包含0.24U的膠原酶(collagenase)(類型N(typeN))的生理鹽水1.2μl後的腦內出血模型大鼠的腦剖面的圖。
圖15是為了驗證樣本4對腦內出血模型大鼠的腦細胞保護作用，於膠原酶施用後的1小時後，將100μg/kg的樣本4注入至腦內的點(spot)，並定量測定大鼠運動足跡的圖。
圖16是與圖15的情況同樣地測量有無施用樣本4的大鼠的運動距離與運動速度的經日變化的圖。
圖17是表示β-NMN的化學結構式的圖。
圖18是表示輔酶F420的化學結構式的圖。
圖19是對NAD(P)+的化學結構式與其氧化還原反應(Redox)進行說明的圖。
圖20是表示5-去氮黃素與NAD(P)+的黃素環的利用分子軌域計算化學求出的電子密度的圖。
圖21是作為與NAD+的比較，對與FAD的結構相似性進行說明的圖。
圖22是表示添加樣本5，並定量檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
圖23是表示添加樣本6，並定量檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
圖24是表示添加樣本7，並定量檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
圖25是表示添加樣本8，並定量檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
圖26是表示添加樣本9，並定量檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
圖27是表示添加樣本10，並定量檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
圖28是表示添加樣本11，並定量檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
圖29是表示24小時前皮下施用了β-NMN的小鼠腦標本的粒線體內Ca2+的分析結果的圖。對利用粒線體選擇性Ca2+指示劑Xrhod-1染色而成的標本重覆進行三次5分鐘80K人工腦脊髓液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)暴露-5分鐘清洗操作。皮下施用引起此時的粒線體內Ca2+變動的β-NMN的劑量反應關係A：對照組(Control)，B：β-NMN 10mg/kg；C：β-NMN 30mg/kg；D：β-NMN 100mg/kg各劑量的β-NMN，24小時後製作全腦切片標本，並利用粒線體特異性Ca2+指示劑Xrhod-1進行染色。根據580nm激發時的紅色(>600nm)螢光圖像，對三次80K ACSF刺激中得到的粒線體內Ca2+增加進行經時測量。實線：大腦皮質部位(CTX)；虛線：海馬迴CA1部位(CA1)的反應。示出5例~6例的平均值與標準誤差。
圖30是表示24小時前皮下施用了樣本1(TND1128)的小鼠腦標本的粒線體內Ca2+的分析結果的圖。與圖22同樣地，對利
用粒線體選擇性Ca2+指示劑Xrhod-1染色而成的樣本重覆進行三次5分鐘80K ACSF暴露-5分鐘清洗操作。引起所述粒線體Ca2+變動的樣本1(TND1128)的劑量反應關係A：對照組(Control)，B：TND1128 0.01mg/kg；C：TND1128 0.1mg/kg；D：TND1128 1.0mg/kg(皮下施用)。與圖22同樣地，根據Xrhod-1的580nm激發時的紅色(>600nm)螢光圖像，對三次80K ACSF刺激中得到的粒線體內Ca2+增加進行經時測量。實線：大腦皮質部位(CTX)，虛線：海馬迴CA1部位(CA1)的反應。示出5例~6例的平均值與標準誤差。
圖31是表示β-NMN對80K ACSF暴露時的粒線體內Ca2+濃度的保護作用的量反應關係的圖，於由80K暴露引起的粒線體Ca2+增加的情況下β-NMN效果的統計分析。
定量彙總了圖29的資料(參照圖37)
A：β-NMN對連續三次80K ACSF暴露的大腦皮質(CTX)(白)與海馬迴(CA1)(黑)中的粒線體的總的Ca2+取入量的作用
B：大腦皮質中的每次80K ACSF暴露時的粒線體的Ca2+取入的劑量反應關係
C：海馬迴中的每次80K ACSF暴露時的粒線體的Ca2+取入的劑量反應關係
*：於利用圖基(Tukey)法進行的多重分析中存在顯著差異(P<0.05)
圖32是表示樣本1(TND1128)對80K ACSF暴露時的粒線
體內Ca2+濃度的保護作用的量反應關係的圖，於藉由三次80K挑戰而引起粒線體Ca2+增加的情況下，1128的效果的劑量反應關係。
定量彙總了圖30的資料(參照圖37)
A：TND1128對連續三次80K ACSF暴露的大腦皮質(CTX)(白)與海馬迴(CA1)(黑)中的粒線體的總的Ca2+取入量的作用
B：大腦皮質中的每次80K ACSF暴露時的粒線體的Ca2+取入的劑量反應關係
C：海馬迴中的每次80K ACSF暴露時的粒線體的Ca2+取入的劑量反應關係
*：於利用Tukey法進行的多重分析中存在顯著差異(P<0.05)
圖33是表示24小時前皮下施用了β-NMN的小鼠腦標本的細胞質內Ca2+的分析結果的圖。皮下施用各劑量的β-NMN，24小時後製作全腦切片標本，利用停留於細胞質中的Ca2+指示劑芙拉(Fura)-4F對腦切片標本進行染色。以10秒為單位自所述腦標本經時地獲得賦予360nm與380nm的激發光時的藍綠色(>500nm)的螢光強度(F360與F380)之比，於三次80K-ACSF刺激中得到的細胞質內Ca2+增加的時間經過。A：對照組(Control)，B：β-NMN 10mg/kg；C：β-NMN 30mg/kg；D：β-NMN 100mg/kg，實線：大腦皮質部位(CTX)、虛線：海馬迴CA1部位(CA1)的反應。示出5例~6例的平均值與標準誤差。
圖34是表示24小時前皮下施用了樣本1(TND11128)的小
鼠腦標本的細胞質內Ca2+的分析結果的圖。與圖29同樣地，對利用細胞質選擇性Ca2+指示劑Fura-4F染色而成的標本重覆進行三次5分鐘80K ACSF暴露-5分鐘清洗操作。引起所述細胞質的Ca2+變動的TND1128的劑量反應關係A：對照組(Control)，B：TND1128 0.01mg/kg；C：TND1128 0.1mg/kg；D：TND1128 1.0mg/kg(皮下施用)。與圖33同樣地，以10秒為單位經時地獲得賦予360nm與380nm的激發光時的Fura-4F的藍綠色(>500nm)螢光的強度(F360與F380)之比。實線：大腦皮質部位(CTX)，虛線：海馬迴CA1部位(CA1)的反應。示出5例~6例的平均值與標準誤差。
圖35是表示β-NMN對80K ACSF暴露時的細胞質內Ca2+濃度的保護作用的量反應關係的圖，於由80K暴露引起的細胞質Ca2+增加的情況下β-NMN效果的統計分析。定量彙總了圖33的資料(參照圖37)
A：β-NMN對連續三次80K ACSF暴露的大腦皮質(CTX)(白)與海馬迴(CA1)(黑)中的細胞質的總的Ca2+取入量的作用
B：大腦皮質中的每次80K ACSF暴露的細胞質的Ca2+取入的劑量反應關係
C：海馬迴中的每次80K ACSF暴露的細胞質的Ca2+取入的劑量反應關係
圖36是表示樣本1(TND1128)對80K ACSF暴露時的細胞質內Ca2+濃度的保護作用的量反應關係的圖，於藉由三次80K挑
戰而引起細胞質Ca2+增加的情況下，1128的效果的劑量反應關係。
定量彙總了圖34的資料(參照圖37)
A：β-NMN對連續三次80K ACSF暴露的大腦皮質(CTX)(白)與海馬迴(CA1)(黑)中的細胞質的總的Ca2+取入量的作用
B：大腦皮質中的每次80K ACSF暴露的細胞質的Ca2+取入的劑量反應關係
C：海馬迴中的每次80K ACSF暴露的細胞質的Ca2+取入的劑量反應關係
*：於利用Tukey法進行的多重分析中存在顯著差異(P<0.05)
圖37是對連續三次80K暴露時的粒線體或細胞質中的Ca2+增加量的定量法進行說明的圖，Ca2+增加的定量化：連續三次80K暴露時的粒線體或細胞質中的Ca2+增加量的定量法；以第一次施用時的值為基準將全部資料標準化；第1次：自最初的80 ACSF施用
起至第二次施用
為止；第2次：自第二次80 ACSF施用
起至第三次施用
為止；第3次：自第三次80 ACSF施用
起至第四次施用
為止；總的反應：第1次+第2次+第3次。AUC的求出方法：作為自以10秒為單位加以標準化的Ca2+反應的總和中減去測定數量(於10分鐘的情況下為60；於全部的情況下為180)所得的值，求出曲線下面積Area Under the Curve(AUC)。
(化合物的結構)
本發明中，具有式(I)、式(II)、式(III)及式(IV)所示
結構式的化合物的使用對於激活細胞中ATP產生是有效的。
以下，將示出該些化合物的具體例及其製法的文獻示於第1表~第4表中。
[表1-1]
[表1-2]
[表1-3]
[表1-4]文獻：(1)T.永松, Y.橋口, 與Y.米田, 化學學會會刊(J.Chem.Soc.),
[表2-1]
[表2-2]
[表3]
[表4]
(化合物的製造方法)
通式I所示的5-去氮黃素化合物(I-1~I-118)(3)可藉由已知文獻(1~14)記載的製造方法而合成。特別是藉由(製法A)
中記載的文獻(1)的一般製造方法可合成大部分的衍生物。即，於二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)中對6-N-取代-胺基尿嘧啶類(1)與適當的鄰鹵代苯甲醛(2)進行加熱回流。加熱時間適宜為3小時~7小時。將反應液於減壓下濃縮，將殘留物於適當的溶媒(醇、二噁烷或DMF等)中再結晶，獲得對應的5-去氮黃素(3)。
通式II所示的吡啶并二嘧啶化合物(II)(II-1~II-32)(5)可藉由已知文獻(15~19)記載的製造方法而合成。特別是藉由(製法B)中記載的文獻(15)的一般製造方法可合成大部分的衍生物。即，於二甲基甲醯胺或乙酸中對6-N-取代-胺基尿嘧啶類(1)與適當的3-取代-6-氯尿嘧啶-5-甲醛(carbaldehyde)(4)進行加熱回流。加熱時間適宜為2小時~5小時。將反應液於減壓下濃縮，將殘留物於適當的溶媒(醇、乙酸或DMF等)中再結晶，獲得對應的吡啶并二嘧啶(5)。
通式III所示的去氮黃素并睪固酮化合物(III)(III-1~III-2)(7)可藉由已知文獻(20、21)記載的製造方法而合成。以同樣的方法亦可合成未知化合物(III-3~III-23)。即，向二苯醚中加入6-N-單取代-胺基尿嘧啶類(1)與2-羥基亞甲基睪固酮(6)，進而向該混合物中加入對甲苯磺酸後，於180℃下，於氬氣環境下加熱攪拌30分鐘~60分鐘。反應後，藉由管柱層析法對該生成物進行精製。再者，亦能夠於二噁烷中於加壓下將該生成物加熱數小時而合成。
[化7]
[製造例1]
(8'-取代-5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮衍生物(III-3~III-13)的一般合成)
向二噁烷(50ml)中加入對甲苯磺酸(60mg，0.32mmol)與6-單取代胺基-3-甲基尿嘧啶(1)(2.84mmol)，進而加入2-羥基亞甲基睪固酮(6)(1.0g，3.16mmol)後，於氬氣環境下於封管中加熱12小時。反應後，利用管柱層析法(富士矽(Fuji Silysia)230目~400目；洗出液：乙酸乙酯：乙醇=12：1或者僅乙酸乙酯)對其進行分離精製，獲得粉末結晶。進而，再結晶能夠藉由乙酸乙酯與正己烷的混合溶液來進行。
化合物III-3(5'-去氮-8'-乙基-17β-羥基-3'-甲基雄甾
-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；黃色的粉末結晶(0.77g,60%)，熔點(mp)260℃(分解(decomp.))；1H-核磁共振(1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ：0.81(3H,s,18-CH3),1.00(3H,s,19-CH3),1.41(3H,t,J=7.2Hz,8'-CH2CH3),2.46-2.62(2H,br dd,6-H),2.67(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.92(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.43(3H,s,3'-CH3),3.68(1H,dd,J16α,17α=8.7Hz,J16β,17α=8.1Hz,17α-H),4.46-4.73(1H,m,8'-CHaHb),4.73-5.00(1H,m,8'-CHaHb),6.39(1H,s,4-H),8.25(1H,s,5'-H)
化合物III-4(8'-正丁基-5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；黃色的粉末結晶(0.79g,58%)，熔點246℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.81(3H,s,18-CH3),0.99(3H,s,19-CH3),1.50(3H,t,J=7.2Hz,8'-CH2CH2CH2CH3),2.46-2.61(2H,br dd,6-H),2.66(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.91(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.45(3H,s,3'-CH3),3.69(1H,dd,J16α,17α=7.8Hz,J16β,17α=8.1Hz,17α-H),4.28-4.60(1H,m,8'-CHaHb),4.60-4.92(1H,m,8'-CHaHb),6.35(1H,s,4-H),8.25(1H,s,5'-H)
化合物III-5(8'-苄基-5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；黃色的粉末結晶(0.63g,43%)，熔點215℃；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.78(3H,s,18-CH3),0.95(3H,s,19-CH3),2.37-2.45(2H,br dd,6-H),2.64(1H,d,J=15.5Hz,1β-H),2.90(1H,d,J=15.5Hz,1α-H),3.45(3H,
s,3'-CH3),3.66(1H,dd,J16α,17α=8.4Hz,J16β,17α=8.5Hz,17α-H),5.59(1H,br d,J=15.3Hz,8'-CHaHb),6.26(1H,br d,J=15.3Hz,8'-CHaHb),6.28(1H,s,4-H),7.07-7.19(2H,m,Bn-mH),7.25-7.35(3H,m,Bn-o,pH),8.33(1H,s,5'-H)
化合物III-6(5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基-8'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.54g,38%)，熔點215℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.80(3H,s,18-CH3),1.01(3H,s,19-CH3),2.20-2.43(2H,br dd,6-H),2.76(1H,d,J=15.9Hz,1β-H),2.96(1H,d,J=15.9Hz,1α-H),3.40(3H,s,3'-CH3),3.67(1H,dd,J16α,17α=8.7Hz,J16β,17α=8.9Hz,17α-H),5.60(1H,s,4-H),6.90-7.22(2H,m,Ph-mH),7.22-7.49(3H,m,Ph-o,pH),8.39(1H,s,5'-H)
化合物III-7(5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基-8'-(4-甲基苯基)雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.58g,40%)，熔點205℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.81(3H,s,18-CH3),1.02(3H,s,19-CH3),2.92(1H,d,J=15.9Hz,1β-H),3.10(1H,d,J=15.9Hz,1α-H),2.46(3H,s,8'-CH3),3.40(3H,s,3'-CH3),3.67(1H,dd,J16α,17α=8.4Hz,J16β,17α=8.7Hz,17α-H),5.56(1H,s,4-H),6.88-7.20(2H,m,Ar-mH),7.20-7.47(2H,m,Ar-oH),8.37(1H,s,5'-H)
化合物III-8(5'-去氮-17β-羥基-8'-(4-甲氧基苯基)-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.69g,47%)，熔點220℃(分解)；1H-NMR(300MHz,
CDCl3)δ：0.80(3H,s,18-CH3),1.02(3H,s,19-CH3),2.18-2.41(2H,br dd,6-H),2.70(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.96(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.40(3H,s,3'-CH3),3.67(1H,dd,J16α,17α=8.7Hz,J16β,17α=8.4Hz,17α-H),3.89(3H,s,OCH3),5.61(1H,s,4-H),7.02-7.24(4H,m,Ar-m,oH),8.36(1H,s,5'-H)
化合物III-9(5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基-8'-(3,4-亞甲基二氧基苯基)-雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.72g,47%)，熔點214℃；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.79(3H,s,18-CH3),1.01(3H,s,19-CH3),2.22-2.46(2H,br dd,6-H),2.70(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.96(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.40(3H,s,3'-CH3),3.67(1H,dd,J16α,17α=9.9Hz,J16β,17α=8.4Hz,17β-H),5.67(1H,s,4-H),6.08(2H,s,OCH2O),6.51-7.17(1H,m,Ar-mH),6.86-6.98(2H,m,Ar-oH),8.36(1H,s,5'-H)
化合物III-10(5'-去氮-17β-羥基-8'-(4-羥基苯基)-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.47g,32%)，熔點280℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.79(3H,s,18-CH3),1.00(3H,s,19-CH3),2.61-2.78(2H,br dd,6-H),2.71(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.98(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.45(3H,s,3'-CH3),3.67(1H,dd,J16α,17α=7.6Hz,J16β,17α=8.4Hz,17α-H),5.68(1H,s,4-H),6.73-6.98(4H,m,Ar-m,oH),8.40(1H,s,5'-H)
化合物III-11(5'-去氮-8'-(4-氟苯基)-17β-羥基-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶
(0.69g,47%)，熔點270℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.80(3H,s,18-CH3),1.00(3H,s,19-CH3),2.68(2H,dd,J=15.0,6-H),2.93(1H,d,J=15.0Hz,1β-H),3.11(1H,d,J=15.0Hz,1α-H),3.70(3H,s,3'-CH3),3.56-3.80(1H,br dd,17α-H),6.54(1H,s,4-H),7.12-7.66(4H,m,Ar-m,oH),8.50(1H,s,5'-H)
化合物III-12(8'-(4-氯苯基)-5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；黃色的粉末結晶(0.74g,49%)，熔點270℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.80(3H,s,18-CH3),1.03(3H,s,19-CH3),2.19-2.42(2H,br dd,6-H),2.70(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),3.96(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.40(3H,s,3'-CH3),3.67(1H,dd,J16α,17α=8.4Hz,J16β,17α=8.4Hz,17α-H),5.53(1H,s,4-H),7.06-7.21(2H,m,Ar-mH),7.50-7.60(2H,m,Ar-oH),8.37(1H,s,5'-H)
化合物III-13(8'-(4-溴苯基)-5'-去氮-17β-羥基-3'-甲基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.72g,44%)，熔點250℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.80(3H,s,18-CH3),1.03(3H,s,19-CH3),2.25-2.42(2H,br dd,6-H),2.70(1H,d,J=15.3Hz,1β-H),3.96(1H,d,J=15.3Hz,1α-H),3.39(3H,s,3'-CH3),3.67(1H,dd,J16α,17α=8.7Hz,J16β,17α=8.1Hz,17α-H),5.53(1H,s,4-H),6.99-7.15(2H,m,Ar-mH),7.65-7.75(2H,m,Ar-oH),8.38(1H,s,5'-H)
[製造例2]
(8'-取代-5'-去氮-17β-羥基-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋
啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮衍生物(III-14~III-23)的一般合成)
向二苯醚(1ml)中加入對甲苯磺酸(60mg，0.32mmol)、6-單取代胺基-3-苯基尿嘧啶(1)(0.66g，2.84mmol)及2-羥基亞甲基睪固酮(6)(1.0g，3.16mmol)，於氮氣環境下於155℃下攪拌45分鐘。反應後，利用管柱層析法(富士矽(Fuji Silysia)230目~400目；洗出液：乙酸乙酯：乙醇=10：1或者僅乙酸乙酯)對其進行分離精製，獲得粉末結晶。進而，再結晶能夠藉由乙酸乙酯與正己烷的混合溶液來進行。
化合物III-14(5'-去氮-8'-乙基-17β-羥基-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；黃色的粉末結晶(0.79g,54%)，熔點240℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.81(3H,s,18-CH3),1.01(3H,s,19-CH3),1.45(3H,t,J=7.5Hz,8'-CH2CH3),2.52-2.61(2H,br dd,6-H),2.67(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.93(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.68(1H,dd,J16α,17α=7.5Hz,J16β,17α=8.1Hz,17α-H),4.46-4.76(1H,m,8'-CHaHb),4.76-5.05(1H,m,8'-CHaHb),6.41(1H,s,4-H),7.21-7.45(2H,m,Ph-mH),7.45-7.52(3H,m,Ph-o,pH),8.27(1H,s,5'-H)
化合物III-15(8'-正丁基-5'-去氮-17β-羥基-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；黃色的粉末結晶(0.77g,50%)，熔點200℃；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.78(3H,s,18-CH3),0.99(3H,s,19-CH3),1.18(3H,t,J=7.2Hz,8'-CH2CH2CH2CH3),2.45-2.62(2H,br dd,6-H),2.65(1H,d,J=15.6
Hz,1β-H),2.91(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.63(1H,dd,J16α,17α=7.1Hz,J16β,17α=7.1Hz,17α-H),4.35-4.64(1H,m,8'-CHaHb),4.64-4.94(1H,m,8'-CHaHb),6.39(1H,s,4-H),7.21-7.52(5H,m,Ph-o,m,pH),8.27(1H,s,5'-H)
化合物III-16(8'-苄基-5'-去氮-17β-羥基-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；黃色的粉末結晶(0.72g,44%)，熔點224℃；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.81(3H,s,18-CH3),0.92(3H,s,19-CH3),2.30(2H,dd,J=10.5Hz,6-H),2.63(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.87(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.67(1H,dd,J16α,17α=8.4Hz,J16β,17α=7.8Hz,17α-H),5.37-5.61(1H,br,8'-CHaHb),6.41-6.64(1H,br,8'-CHaHb),7.02(1H,s,4-H),7.24-7.56(10H,m,Bn-o,m,pH與Ph-o,m,pH),8.33(1H,s,5'-H)
化合物III-17(5'-去氮-17β-羥基-3',8'-二苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.57g,36%)，熔點257℃；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.79(3H,s,18-CH3),1.04(3H,s,19-CH3),2.71(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.98(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.65(1H,dd,J16α,17α=8.4Hz,J16β,17α=8.7Hz,17α-H),5.57(1H,s,4-H),7.16-7.66(10H,m,3'-Ph-o,m,pH與8'-Ph-o,m,pH),8.40(1H,s,5'-H)
化合物III-18(5'-去氮-17β-羥基-8'-(4-甲基苯基)-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.90g,55%)，熔點246℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.79(3H,s,18-CH3),0.88(3H,s,19-CH3),2.47(3H,s,8'-CH3),
2.58-2.74(2H,br dd,6-H),2.92(1H,d,J=15.0Hz,1β-H),3.16(1H,d,J=15.0Hz,1α-H),3.68(1H,dd,J16α,17α=8.7Hz,J16β,17α=7.8Hz,17α-H),6.61(1H,s,4-H),6.89-7.49(7H,m,3'-Ph-m,pH與8'-Ar-o,mH),8.40-8.56(2H,m,3'-Ph-oH),8.49(1H,s,5'-H)
化合物III-19(5'-去氮-17β-羥基-8'-(3,4-二甲基苯基)-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.90g,54%)，熔點260℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.77(3H,s,18-CH3),0.80(3H,s,19-CH3),2.33(3H,s,8'-Ar-CH3),2.35(3H,s,8'-Ar-CH3)2.71(1H,d,J=15.0Hz,1β-H),2.97(1H,d,J=15.0Hz,1α-H),3.67(1H,dd,J16α,17α=7.5Hz,J16β,17α=8.4Hz,17α-H),5.60(1H,s,4-H),6.88-7.50(8H,m,3'-Ph-o,m,pH與8'-Ar-o,mH),8.38(1H,s,5'-H)
化合物III-20(5'-去氮-17β-羥基-8'-(4-甲氧基苯基)-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.96g,57%)，熔點250℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.78(3H,s,18-CH3),0.81(3H,s,19-CH3),2.23-2.38(2H,br dd,6-H),2.71(1H,d,J=15.6Hz,1β-H),2.93(1H,d,J=15.6Hz,1α-H),3.62(1H,dd,J16α,17α=6.9Hz,J16β,17α=6.6Hz,17α-H),3.87(3H,s,OCH3),6.19(1H,s,4-H),7.00-7.13(7H,m,3'-Ph-m,pH與8'-Ar-o,mH),7.17-7.50(2H,m,3'-Ph-oH),8.38(1H,s,5'-H)
化合物III-21(5'-去氮-8'-(4-氟苯基)-17β-羥基-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.61g,37%)，熔點260℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：
0.79(3H,s,18-CH3),1.04(3H,s,19-CH3),2.70(1H,d,J=15.9Hz,1β-H),2.97(1H,d,J=15.9Hz,1α-H),3.66(1H,dd,J16α,17α=8.1Hz,J16β,17α=8.7Hz,17α-H),5.54(1H,s,4-H),7.18-7.54(10H,m,3'-Ph-o,m,pH與8'-Ph-o,m,pH),8.39(1H,s,5'-H)
化合物III-22(8'-(4-氯苯基)-5'-去氮-17β-羥基-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.56g,33%)，熔點241℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.77(3H,s,18-CH3),0.85(3H,s,19-CH3),2.29-2.44(2H,br dd,6-H),2.79(1H,d,J=16.2Hz,1β-H),3.07(1H,d,J=16.2Hz,1α-H),3.67(1H,dd,J16α,17α=7.8Hz,J16β,17α=8.4Hz,17α-H),6.46(1H,s,4-H),7.17-7.59(10H,m,3'-Ph-o,m,pH與8'-Ph-o,m,pH),8.47(1H,s,5'-H)
化合物III-23(8'-(4-溴苯基)-5'-去氮-17β-羥基-3'-苯基雄甾-2,4-二烯并[2,3-g]喋啶-2',4'(3'H,8'H)-二酮)；橙色的粉末結晶(0.93,51，熔點300℃(分解)；1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ：0.81(3H,s,18-CH3),0.83(3H,s,19-CH3),2.69(1H,d,J=15.0Hz,1β-H),3.12(1H,d,J=15.0Hz,1α-H),3.07(1H,dd,J16α,17α=7.9Hz,J16β,17α=8.7Hz,17α-H),6.56(1H,s,4-H),6.69-7.52(7H,m,3'-Ph-m,pH與8'-Ar-o,mH),7.67-7.79(2H,m,3'-Ph-oH),8.48(1H,s,5'-H)
將所述新穎化合物(III-3~III-23)的設備分析值示於第5表與第6表。
[表5]
[表6]
通式IV所示的吡啶并二嘧啶化合物(IV)(IV-1~IV-26)(9)可藉由已知文獻(22)記載的製造方法而合成(製法D)。即，向二苯醚中加入對甲苯磺酸、3-取代-6-單取代胺基尿嘧啶(1)及2-羥基亞甲基膽甾-4-烯-3-酮(8)，於氮氣環境下於180℃下加熱攪拌45分鐘。反應後，利用管柱層析法(富士矽(Fuji Silysia)
230目~400目；洗出液：乙酸乙酯)對其進行分離精製，獲得粉末結晶。
繼而，使用化合物編號I-50(樣本1)、化合物編號I-54(樣本2)、化合物編號III-4(樣本3)及化合物編號I-75(樣本4)的化合物，藉由實驗驗證了該些樣本的添加直接或間接地有助於細胞內ATP產生，因此，以下作為實施例來加以說明。
[實施例1]
向人由來神經母細胞(神經母細胞瘤)SH-SY5Y株的培養細胞中添加樣本1後，對細胞內．外的ATP濃度進行螢光測定。將其
結果示於圖1。於細胞內，自樣本1(1μM)剛添加起至5小時後觀察到ATP產生的增加(螢光強度的增加)，12小時後作用消失。再者，樣本處理並未引起培養細胞的形態變化。
於細胞外，自樣本1(1μM)剛添加起至5小時後亦觀察到ATP產生的增加，從而ATP濃度增加。認為其是細胞內所增加的ATP流出至細胞外。
[實施例2]
向中樞神經系統的膠細胞的一種、即培養星狀細胞中添加樣本1，將進行螢光測定所得的結果示於圖2A與圖2B。
關於膠細胞內的ATP量，於施用1μM的樣本1時，於12小時與24小時後顯著增加，細胞外亦顯示出同樣的趨勢。
[實施例3]
向人神經膠瘤U251的培養細胞(Sig1-R轉染細胞)中分別添加樣本1、樣本2，並與未添加添加後的細胞內ATP濃度的情況(對照組(Cont.))進行相對比較。結果，如圖3所示，驗證了樣本1與樣本2使人神經膠瘤U251細胞的ATP產生量顯著增加。脂溶性高的樣本2與樣本1相比效果大。再者，螢光測定是於施用樣本後6小時內進行。
再者，實施例1~實施例3是對腦神經細胞(神經元)進行的實驗，腦神經細胞(神經元)需要氧(O2)與葡萄糖。所述兩種物質自血液中首先被取入至膠細胞(星狀細胞)中，然後自膠細胞被傳遞至神經元。樣本亦同樣。因此，由樣本引起的膠
細胞內ATP量增加顯示出直接促進膠細胞的作用，並且暗示了間接激活神經元。
[實施例4]
自幼小(出生後第0天)的ICR小鼠腦中採集海馬迴培養細胞，並於培養皿中培養神經細胞。
向發育初期的細胞(培養第1天)中添加1次樣本1，3天後(培養第4天)對海馬迴神經細胞(神經元)的神經軸突(Axon)、樹突(Dendrite)或發育的突觸數量進行定量。樣本1(0.1μM，0.3μM，1.0μM)於培養第1天僅添加1次。添加3天後(培養第4天)，使用tau抗體與MAP2抗體對Axon與Dendrite分別進行免疫染色，並進行形態觀察。
圖4表示海馬迴神經細胞軸突(Axon)的免疫染色圖像，於培養第4天利用tau抗體對軸突進行免疫染色。左側表示Control(對照組)，右側表示培養第1天僅添加1次樣本1(1μM)的樣本處理神經細胞。
圖5表示海馬迴神經細胞軸突(Axon)的分支數量，於培養第4天利用tau抗體對軸突的分支數量進行定量。實驗是以細胞體為中心，以10μm為間隔描繪同心圓(未圖示)，測量與所述圓交叉的軸突的根數。
自圖4與圖5中顯示出，樣本1以濃度依賴性的方式使神經軸突(Axon)的延伸．發育、及其分支數量增加。再者，樣本濃度為0.3μM與1.0μM時，顯示出大致相同程度的最大藥效。
圖6表示海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)的免疫染色圖像，於培養第4天利用MAP2抗體對樹突進行免疫染色。左側表示Control(對照組)，右側表示培養第1天僅添加1次樣本1(1μM)的神經細胞。
圖7表示海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)的分支數量，於培養第4天利用MAP2抗體進行免疫染色，並對樹突的分支數量進行定量。實驗是以細胞體為中心，以10μm為間隔描繪同心圓(未圖示)，測量與所述圓交叉的樹突的根數。
自圖6與圖7中顯示出，樣本1以濃度依賴性的方式使樹突的延伸、及其分支數量增加。再者，樣本濃度為0.3μM與1.0μM時，顯示出大致相同程度的最大藥效。
繼而，使用VGLUT1抗體對培養第14天的興奮性突觸進行免疫染色，並對突觸數量進行定量。
圖8表示自突觸標本中的突觸的免疫染色圖像，左側表示Control(對照組)，右側表示培養第1天僅添加1次樣本1(1μM)，於培養第14天利用VGLUT1抗體對興奮性突觸進行了免疫染色的神經細胞。
圖9是對投射於海馬迴神經細胞的興奮性突觸的增加進行測量的圖。腦中存在迅速傳遞神經興奮與抑制的麩胺酸動作性與γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)動作性的兩種突觸，圖9是於培養第14天利用VGLUT1抗體進行免疫染色，並對興奮性突觸數量進行了定量。
自圖8與圖9中顯示出，藉由添加0.3μM的樣本1，使興奮性突觸數量顯著增加至最大值。
[實施例5]
與實施例4同樣地，自幼小(出生後第0天)的ICR小鼠腦中採集海馬迴培養細胞，並於培養皿中培養神經細胞。
對成熟培養海馬迴細胞(培養第11天)施用1次樣本1，3天後(培養第14天)對海馬迴神經細胞(神經元)的神經軸突(Axon)、樹突(Dendrite)的情形進行觀察。培養第14天的軸突由於延伸及軸突彼此的交叉明顯，軸突根數無法定量，因此僅觀察樹突的形態。
圖10表示海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)的免疫染色圖像，左側為Control(對照組)，右側為培養第14天的圖像，且為施用樣本1並於培養第14天利用MAP2抗體進行免疫染色而成者。
圖11是於培養第14天的發育後期，利用MAP2抗體進行免疫染色，以樣本濃度0.1μM~1μM對樹突(Dendrite)的分支數量進行定量，以細胞體為中心，以10μm的間隔描繪同心圓，測量與所述圓交叉的樹突的根數。
關於樹突，與幼小培養細胞第4天(圖7)相比，自細胞體生出的樹突根數隨著培養天數的增加而增加(圖11)。藉由所添加的樣本濃度(0.3μM與1μM)發現了樹突於成熟培養細胞中亦有增加的傾向，但未發現如於培養第4天的細胞中所觀察到的藥效
般明顯的分支數量的增加。
根據實施例4及實施例5的實驗結果，可以說藉由添加樣本，間接證明了大鼠的幼小．成熟培養神經細胞的發育．分支．突觸數量的增加或促進藉由神經細胞內ATP產生的增加而得到促進。
[實施例6]
對於成熟C57BL/6N小鼠(10週齡~17週齡、體重28g~31g)，對其中一者腹腔內施用生理鹽水(對照組)，對另一者腹腔內施用樣本3(10μg/kg)，22小時後製作各個小鼠的包含皮質(Cortex)與海馬迴(Hippocampus)區域的腦薄切片(切片)標本。於細胞外液中添加80mM KCl(80K)而引起細胞膜的去極化，使用Rhod-2(註1)並藉由螢光方法對其結果所產生的粒線體內Ca2+濃度的增加進行測量。於腦切片中，將如何藉由樣本3抑制因80K而增加的Ca2+濃度(註2)作為指標，間接地驗證了樣本3積極參與粒線體內的ATP活性(註3)。
(註1)Rhod-2：選擇性地取入至粒線體內的Ca2+螢光色素
(註2)由80K引起的神經細胞膜的去極化是因Ca2+由細胞外向細胞內的流入與Ca2+自細胞內的Ca庫(store)游離兩者而發生。細胞內增加的游離Ca2+容易流入至細胞內的獨立器官即粒線體內。結果，粒線體內的Ca2+濃度上升。
(註3)因由80K刺激引起的去極化而於神經細胞質內增加
的游離Ca2+立即自細胞質內迅速轉移至粒線體內。關於由樣本引起的粒線體內游離Ca2+濃度的減少，藉由存在於神經細胞質膜中的外向Ca泵而將游離Ca2+抽出至細胞外，或者使其吸附、固定於粒線體內部的一部分。為此所使用的能量是由粒線體中產生的ATP供給。根據藉此所得的結果，腹腔內注射的樣本3自血液中經由膠細胞(星狀細胞)被取入至大腦皮層或海馬迴神經元內的粒線體內，藉此，粒線體內的ATP產生進行活化，並使神經細胞活化，神經細胞膜上的Ca泵自粒線體獲得能量源ATP，將多餘的細胞內游離Ca2+排出至細胞外，間接地保護神經細胞。
圖12是測量因K+去極化而產生的存在於大腦皮質神經元(神經細胞)內的粒線體內Ca2+濃度上升與藉由樣本3對其進行抑制的效果的圖。
a是對自正常小鼠獲得的腦切片標本連續3次添加80mM KCl細胞外液(應用5分鐘後清洗5分鐘)時的對照反應。縱軸表示粒線體內Ca2+濃度增加的螢光測定結果。
b是對腹腔內(i.p.)注射10μg/kg的樣本3後22小時後自大鼠摘取並製作的腦切片標本賦予80K細胞外液時粒線體內Ca2+濃度的變化。與a相比，可觀察到對Ca2+濃度上升的抑制與因80K去極化而上升的Ca2+濃度更快的恢復。
c針對大腦皮質神經元的粒線體內Ca2+濃度而言的對照組與樣本3的比較。於10μg/kg時觀察到Ca2+濃度抑制的最大效力。(與1000倍量的10mg/kg的結果相同)(n=3平均值：由自同一個體
得到的3片切片獲得的資料)
圖13是對海馬迴神經元(神經細胞)的K+去極化所引起的粒線體內Ca2+濃度上升進行測量的圖。
a是連續3次添加80mM KCl細胞外液(應用5分鐘後清洗5分鐘)時的對照反應。
b是表示腹腔內注射10μg/kg的樣本3後22小時後製作腦切片標本，並對其賦予80K細胞外液時粒線體內Ca2+濃度變化的圖。
c是表示海馬迴神經元的粒線體內Ca2+濃度的對照組與由樣本3的10μg/kg及10mg/kg i.p.帶來的抑制效果的比較的圖。於10μg/kg時獲得最大效果。(n=3平均值：由自同一個體得到的3片切片獲得的資料)
根據實施例6的實驗結果，藉由樣本310μg/kg i.p.生物體內前處理，顯著地且最大程度上減少小鼠皮質與海馬迴神經細胞(神經元)的80K去極化所引起的各自的粒線體內Ca2+濃度的上升。本結果暗示出樣本3修復於腦缺血時等產生的神經細胞損傷。
即，對於由損傷成熟小鼠腦細胞(神經元)的粒線體內游離Ca2+增加所產生的Ca負荷，樣本3所引起的ATP增加會激活細胞膜上的Ca泵，並減少粒線體內游離Ca2+量，結果顯示出有助於防止神經細胞死亡(ATP增加的間接證明)。
[實施例7]
進行用於確認樣本添加對腦缺血模型成年大鼠運動的行動下
降帶來的效果的實驗。
於吸入麻醉下，於韋斯系成熟大鼠(體重200g~230g)的頭骨上開設小孔後，向對照組的右腦紋狀體中注入生理鹽水1.2μl，向出血組的右腦紋狀體中注入包含0.24U的膠原酶(類型IV(type IV))的生理鹽水1.2μl，從而製作腦內出血模型大鼠。
圖14是表示腦內出血模型大鼠的腦剖面的圖。
為了確認樣本4對腦內出血模型大鼠的腦細胞保護作用，於膠原酶施用後的1小時後，將100μg/kg的樣本4注入至腦內的點(圖中/白色菱形)，並對大鼠的運動足跡進行定量測定，其中A為對照組，B為出血組，關注出血後的變色(黑)。
運動量的測定是對大鼠拍攝5分鐘視頻。對所述拍攝時間的後半部分的3分鐘的自由行動(運動距離與運動速度)進行分析。
圖15是測定大鼠的運動足跡的圖，利用攝像機來測定箱內的大鼠運動足跡，圖16是測量運動距離與運動速度的經日變化的圖。
樣本4減緩大鼠因腦出血而引起的缺血性的運動距離與運動速度的下降(圖15與圖16)。所述效果於出血第1天與1週後均可見。
根據實驗結果顯示出，樣本4有助於防止成熟大鼠腦細胞的缺血損傷(ATP增加的間接證明)。
繼而，使用化合物編號II-12(樣本5)、化合物編號II-31(樣本6)、化合物編號III-2(樣本7)、化合物編號III-14(樣本
8)、化合物編號IV-10(樣本9)、化合物編號IV-15(樣本10)及化合物編號IV-23(樣本11)的化合物來檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)是否藉由該些樣本的添加而顯著地伸長。
自幼小(出生後第0天)的ICR小鼠腦中採集海馬迴培養細胞，並於培養皿中培養。
向發育初期的細胞(培養第1天)中添加1次各樣本，3天後(培養第4天)利用MAP2抗體進行免疫染色，對樹突的分支數量進行定量。
測定是以細胞體(細胞本體(soma))為中心，以10μm為間隔描繪20μm~100μm的同心圓(未圖示)，測量與所述圓交叉的樹突的根數。
關於檢定，是將按距細胞體的距離測量的交叉樹突的根數繪製成折線圖，針對折線圖下的面積(曲線下面積(Area Under the Curve：AUC))，利用司徒頓t檢定，配對(Student’s t-test,paired)(t-檢定、兩側分佈)來進行。
對於有足夠例子數量的樣本，去掉最大值與最小值來進行檢定。所添加的樣本濃度均為0.3μM。
對於樹突是否顯著伸長的判定，根據t-值算出p-值，若p值為p<0.05，則樹突顯著地伸長(效果++)，若0.05<p<0.2，則於遠位或近位伸長(效果+)，若p>0.2，則設為無明顯差異(效果±)。
圖22~圖28是分別表示添加樣本5~樣本11，並定量
檢定海馬迴神經細胞樹突(Dendrite)分支數量的結果的圖。
a(底線)是表示相對於距細胞體(soma)的距離而言的交叉樹突的根數的圖，b(底線)是表示對AUC進行比較所得的檢定結果的圖。
另外，實線表示添加了樣本的情況，虛線表示未添加樣本的情況(對照組(Control))。再者，n為標本數量。
由圖表明，於統計學上發現顯著差異(p<0.05)的僅為樣本7(III-2)與樣本11(IV-23)，但其他樣本5(II-12)、樣本6(II-31)、樣本8(III-14)、樣本9(IV-10)、樣本10(IV-15)亦可見突起伸長的效果。
繼而，選擇樣本1(TND1128)並進行與β-NMN的作用比較實驗。於該實驗中，比較、評價了對將小鼠腦切片標本暴露於強烈的去極化刺激時所引起的明顯的細胞質內及粒線體內Ca2+濃度變動進行抑制的效果。其原因在於：於發明者等人的預備實驗中獲得了於利用樣本1(TND1128)進行了24小時處理的線蟲中SIRT1顯著上升的見解，因此，對施用24小時後是否亦可利用β-NMN獲得同樣的效果進行比較。
[實驗方法]
腦切片標本製作與鈣濃度測量：使用將24小時前皮下施用了樣本1的小鼠(C57B/6NL)的全腦切片(300μm)於正中線處切成一半所得的全腦半切標本。將該標本於室溫下保存於通入有O2 95%、CO2 5%的人工腦脊髓液(ACSF)內，並利用選擇性地取入
至粒線體中的Xrhod-1/AM(Kd=700μM)、以及停留於細胞質中的fura-4F/AM(Kd=770μM)進行雙重染色。將該標本放置在安裝於倒置型螢光顯微鏡(奧林帕斯(Olympus)IX71)的操作台(stage)上的腔室(chamber)內，利用黑色木棉片覆蓋，進而利用鉑環加以固定，利用通入有O2 95%、CO2 5%的ACSF(70ml/hr)進行灌流。利用4倍的物鏡獲取標本的螢光圖像，並促使海馬迴腹側部與大腦皮質側頭部的圖像處於一個畫面中。粒線體內鈣濃度的測量中，將藉由激發光580nm產生的紅色螢光(>600nm)的強度變化以於細胞質的鈣測量中藉由360nm激發與380nm激發所得的螢光(>500nm)之比而求出。測量部位(ROI)放置於海馬迴CA1部位與大腦皮質兩處。
[藥物調整法與施用方法]
將β-NMN溶解於水中並將10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg於製作標本24小時前皮下施用於小鼠(0.1ml/10g)，將樣本1溶解於醇中而製成1mg/ml，並利用水將其稀釋，將0.01mg/kg、0.1mg/kg或1.0mg/kg於製作標本24小時前皮下施用於小鼠(0.1ml/10g)。
[效力評價法]：於本試驗中，將自施用了兩種藥物的各濃度的小鼠製作的腦標本暴露於等張80mM KCl-ACSF(人工腦脊髓液)中5分鐘，然後恢復為正常ACSF 5分鐘，連續三次進行所述操作，藉此對標本賦予嚴酷的鈣負荷，測量此時細胞質內與粒線體內鈣濃度的變動。
[實驗結果]
引起粒線體內鈣濃度變動的β-NMN與樣本1(TND1128)的作用
圖29表示使自皮下施用了β-NMN(A：0(對照組(control))(n=6)、B：10(n=5)、C：30(n=5)以及D：100mg/kg(n=5))的小鼠中於24小時後製作的標本三次暴露於80K ACSF中時粒線體內的Ca2+濃度變動。圖30同樣地表示80K ACSF暴露時的施用了樣本1(TND1128)(A：0(對照組(control))(n=6)、B：0.01(n=5)、C：0.1(n=5)以及D：1.0mg/kg(n=5)皮下地(s.c.))的小鼠的腦標本中粒線體的鈣濃度變動。關於自以兩種藥物的各劑量進行了處理的個體獲得的標本的反應，以第一次80K施用時間點的螢光強度為基準進行標準化(normalize)，示出細胞質或粒線體內Ca2+濃度的時間平均值及其標準誤差。根據該圖29與圖30明確到，兩種藥物於所使用的劑量範圍內以劑量依賴性的方式抑制粒線體內Ca2+增加。
圖31及圖32是分別對β-NMN與樣本1(TND1128)的各濃度的作用進行定量化的結果。圖31及圖32的A為將自施用時實驗開始5分鐘後至三次暴露於80K-ACSF、5分鐘清洗後的時間點35分鐘為止的粒線體內鈣濃度的大小以AUC(Area under the curve)來計算的結果(參照圖37)。B與C分別表示大腦皮質(CTX)與海馬迴(CA1)中的針對80K施用5分鐘與其後的清洗5分鐘(第1次(1st)：5分鐘至15分鐘，第2次(2nd)：15分鐘至25
分鐘，第3次(3rd)：25分鐘至35分鐘)各者而言的藥物作用(參照圖37)。顯著差異的檢定是使用Tukey法。於所研究的劑量範圍內發現了β-NMN與TND1128的劑量反應關係。
[引起細胞質內鈣濃度變動的β-NMN與樣本1(TND1128)的作用]
圖33及圖34表示引起80KACSF連續三次施用時的細胞質內鈣變動的β-NMN及樣本1(TND1128)的作用。圖33與圖34所示的對照反應中，每次80K-ACSF施用的反應恢復小，初看上去，鈣指示劑的反應達到了極限，但用於該試驗的細胞內鈣濃度指示劑fura-4F的Ca2+螯合能力(Kd)為770nM，認為亦可充分應對所預想的細胞內鈣濃度的急劇上升，因此可認為，對照組的細胞內Ca2+的運動顯示出已達到細胞質膜的Ca2+泵的功能極限。自經β-NMN的30mg/kg及100mg/kg處理的小鼠獲得的標本、以及經樣本1(TND1128)的0.01mg/kg至1.0mg/kg處理的小鼠的標本中，於每次施用的細胞質內鈣濃度的變動中發現了同樣的恢復。但是，如圖35及圖36所示，於利用與粒線體相同的方法對所述值進行定量的情況下，於β-NMN的10mg/kg施用組以外的濃度下未發現顯著的差異。
[根據有效濃度發現的兩種藥物的作用方式]
兩種藥物顯示出大致相同程度的粒線體內Ca2+濃度控制作用，但就有效濃度而言，樣本1(TND1128)的所述作用強100倍。非專利文獻6中報告了施用β-NMN後，NAD+於30分鐘後達到峰
值，所施用的NMN的血中濃度相應減少，顯示出所施用的NMN成為NAD+生物合成的基質的可能性。但是，本實驗中所使用的樣本1(TND1128)有效量為1.0mg/kg以下的微量，無法將其與β-NMN同樣地考慮作為生物合成的原料。即便最終粒線體的氧化能量獲取過程中的NAD+的生物合成量增加，亦應該認為施用後24小時後發現的顯著的粒線體功能穩定作用是由於藉由去乙醯化酶基因組的表達促進引起的NAD+增加所致。本研究中，於24小時前施用的β-NMN中發現了顯著的粒線體保護功能，因此，應該認為β-NMN的作用亦並非單純地作為NAD+的基質而供給的結果，而是經由對去乙醯化酶基因組的作用而實現。
另一方面，關於對細胞質內Ca2+濃度的由80K-ACSF引起的劇烈上升的作用，β-NMN及樣本1(TND1128)均未顯示出顯著的作用。根據圖29與圖30所示的β-NMN 100mg/kg與樣本1(TND1128)1mg/kg對粒線體內Ca2+濃度變動的作用、以及圖33與圖34所示的β-NMN及樣本1(TND1128)對細胞質內Ca2+濃度變動的作用顯示出，於該樣本中為儘管有80K-ACSF的劇烈刺激，但仍可維持極其穩定的生理學反應的狀態。若其可於人腦中再現，則可期待強大的腦保護作用。
雖然已經報告了紅葡萄酒的成分白藜蘆醇(resveratrol)或其衍生物SRT1720等合成去乙醯化酶活化藥物的藥理作用(非專利文獻8)，但實際上並無報告提及對於如本實驗般皮下施用的小鼠腦的粒線體功能而言的有效性。
根據以上而明確到，樣本1(TND1128)為疏水性高、且極其穩定的化合物，此為超越β-NMN的更大的優點。
認為可利用該優點來調整外用藥，使衰老的毛根活化，並用於白髮或禿頂的治療，另外亦可用於已鬆弛的皮膚細胞的復活。進而認為，藉由經皮吸收，亦可期待對腦的作用。
根據所述實驗結果，可以說式(I)~式(IV)所示的5-去氮黃素化合物激活了細胞中ATP產生。
Claims (3)
- 一種ATP產生激活劑，其為由下述式(II)所表示的吡啶并二嘧啶化合物作為有效成分，
- 如請求項1所述的ATP產生激活劑，其中R1表示氫原子、甲基、溴癸基或苯基；R2表示C1-C19烷基、未經取代的苯基、經一個或兩個甲基、氯原子或溴原子取代的苯基；R3表示氫原子、 甲基或苯基。
- 如請求項1所述的ATP產生激活劑，其中R1及R3表示甲基或苯基；R2表示乙基或經氯原子取代的苯基。
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