JP6717989B2 - 細胞内でのａｔｐ産生を賦活するための補酵素因子の使用 - Google Patents

Description

本発明は、細胞内でＡＴＰ産生を賦活するための補酵素因子の使用に係り、詳しくは、ＡＴＰ産生に関与する酸化還元酵素を補助する補酵素因子の使用に関する。

アルツハイマー病、パーキンソン病、脳出血・梗塞に伴う神経変性疾患やうつ病は、近年の老齢化社会の到来とともに急激に増加しており、これらの神経変性疾患の予防・治療薬に対する需要が高まっている。
上記疾患の発症要因の一つとして、細胞内でのエネルギー産生（ＡＴＰ産生）の機能低下が挙げられる。ＡＴＰ産生は細胞質基質でも行なわれるが、有酸素下では主としてミトコンドリア複合体において行なわれる。ミトコンドリアは全ての動物細胞内に存在し、電子伝達システムを介して細胞の治動に必要なエネルギー産生を担っている。ミトコンドリアおよびミトコンドリア遺伝子は、電子伝達異常による酸化的ストレスに対して脆弱なため、その結果、エネルギー代謝の低下、細胞の変性に至る。特に脳細胞においては、エネルギー要求量が高いため、ミトコンドリアはより変性を受け易く、老化に伴うミトコンドリア電子伝達異常による、いわゆる脳ミトコンドリア障害が惹起される。

一方、最近の研究によりサーチュイン（Sirtuin）遺伝子の活性化により老化の遅延、生物の寿命の延長が可能となると考えられている（非特許文献１）。
サーチュイン遺伝子とミトコンドリアとの関係についても研究が進んでおり、サーチュイン遺伝子が活性化されると細胞内の小器官であるミトコンドリアの量が増え、さらに賦活され認知症予防、動脈硬化予防、難聴予防、脂肪の燃焼、細胞修復、活性酸素の除去を促進し、老化要因の発現を抑制するだけでなく、ミトコンドリア障害を治癒する効果も得られると考えられている（非特許文献２）。

例えばマサチューセッツ大学の研究チームは、サーチュイン遺伝子の一つであるSIRT１遺伝子を欠損させたマウスでは記憶障害が見られることから、本遺伝子が記憶に関与する可能性を提唱した。さらにアルツハイマー病と筋委縮性側索硬化症の疾患モデル動物を用いてSIRT１遺伝子活性化の神経変性疾患治療への応用を示唆した。一方２００８年、ワシントン大学医学部今井眞一郎教授は人間の老化をコントロールする物質としてＮＭＮ（Nicotinamide mononucleotide）を同定し、ＮＭＮにより老化し不活性化したランゲルハンス島を再活性化することにも成功した。このＮＭＮはすべての遺伝子を賦活し、ミトコンドリアを活性化することが明らかにされている（非特許文献３）。

また、今井教授等が発見した長寿命タンパク質サーチュイン遺伝子の１つであるSIRT２はテロメアおよびリボソームＤＮＡで転写を停止させるヘテロクロマチン成分であり、ＮＡＤ依存性ヒストン脱アセチル化酵素であることが明らかとなった。この酵素はアセチル化によって弱められたヒストンへのＤＮＡの結合を脱アセチル化によって元に戻し、ＤＮＡのヒストンへの巻き付けを高め、転写を抑制する働きを持っており、これが長寿に関連すると考えられている（非特許文献４）。

今井教授等は、この酵素の活性化因子であるＮＡＤ^＋（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）の生合成促進剤が抗老化効果を持つ可能性を示唆し、ＮＡＤ^＋合成の中間物質である、ＮＭＮがＮＡＤ^＋の生合成を促進し、これが抗老化作用に関与する可能性を報告している（非特許文献５）。

さらに、Ｍills等は、マウスにＮＭＮを加えた食餌を長期間摂取させると、組織中でＮＡＤ^＋の産生が高められ、加齢による個体の生理学的機能低下の抑制ができることを報告している（非特許文献６）。
これはＮＡＤ^＋がミトコンドリアにおける酸化的リン酸化の第一段階およびＴＣＡサイクルにおける酸化反応に係わるエネルギー産生の最も重要な分子の一つであることからも理解できる。

一方、長寿命タンパク質サーチュイン遺伝子の１つであるSIRT１は主に、核に発現しながらも障害を受けたミトコンドリアの修復・再生にも関わることが知られている。さらに、これまで発見されている哺乳動物の７個のサーチュイン遺伝子の内、SIRT３，SIRT４およびSIRT５が主にミトコンドリアに発現していることが明らかにされている（非特許文献７，８）。
これらの結果を総合すると、多様なサーチュイン遺伝子がミトコンドリア機能の活性化を介して寿命延長作用に関与していると考えられている（非特許文献９）。

正常時のミトコンドリアでは、ＮＭＮ（ＮＡＤ^＋（ニコチン・アミド・アデニン・ジヌクレオチド）の前駆化合物）は常時継続的に産生されるが、老化や病態時にはその産生量は低下してＮＡＤ^＋は減少する。その結果、ミトコンドリアでの電子伝達系による酸化的リン酸化や細胞質基質で解糖系により産生される生命維持のエネルギー源であるＡＴＰ（adenosine triphosphate）が減少する（非特許文献１０）。ＮＡＤ^＋の還元型であるＮＡＤＨ(Dihydro-nicotinamide adeninedinucleotide）やＦＡＤＨ_２(Dihydro-flavin adenine dinucleotide）はミトコンドリア内のマトリックスのＴＣＡ（クエン酸）回路や細胞質の解糖系で補酵素として機能している。

ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで、還元型はＮＡＤＨで体内に最も多量に存在する補酵素である。
ＮＡＤの構造は、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）とアデニル酸がホスホジエステル結合している。酸化型ＮＡＤにおけるピリジン環の窒素原子はピリジウムイオンとして存在するので、これをＮＡＤ^＋と表現する。ＮＡＤ^＋の重要な機能はＡＴＰ産生機構（酸化反応）にＮＡＤ^＋の還元が共役している点にある。
また、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）も酸化還元酵素に関与する補酵素の一つで、還元型はＦＡＤＨ_２で、ミトコンドリアの電子伝達系でのＡＴＰ産生に使用される。

真核生物の代謝におけるＦＡＤの一次供給先はミトコンドリア内のクエン酸回路とβ酸化が行なわれる細胞質基質である。クエン酸回路では、ＦＡＤがコハク酸をフマル酸に酸化するコハク酸デヒドロゲナーゼの補酵素として機能し、β酸化ではアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼの酵素反応の補酵素として機能している。しかし、redox（酸化還元）系に属するＮＭＮやＮＡＤ^＋は代謝系で分解されやすく化学的にも不安定で将来医薬品として開発するのは困難と考えられる。さらに合成するにしても高価となる。
従って、優れたＡＴＰ産生機能賦活作用を有し、かつ優れた体内動態（体内吸収性、脳内移行性等）を示す点において医薬品として十分満足できる化学物の開発が切望されている。

ところで、本発明者等は永年に渡ってフラビン骨格を有する化合物の合成及びその薬理作用について鋭意研究を重ねてきた。リボフラビンの５位のＮをＣＨに置換した特有の化学構造を有する５−デアザフラビン（ピリミド［４,５−ｂ］キノリン−２,４（３Ｈ,１０Ｈ）−ジオン）誘導体は、１９７０年にリボフラビンの類似体として始めて合成された化合物である。５−デアザフラビンの誘導体中には優れた制癌活性を示すものや、抗ヘルペスウィルス活性を有するものも知られており、制癌剤や抗ヘルペスウィルス剤として使用されるものもある（特許文献１〜５）。

その構造の変化に伴っておこるアルコールのケトンやアルデヒドへの変換反応に対する触媒的機能、アミンのイミン（ケトン）への変換反応、カルボニル化合物のアルコールへの還元やイミンのアミンへの還元および不斉還元などやＮＡＤ^＋（ニコチンアミドヌクレオチド）との類似性も研究されている（非特許文献１１）。ミトコンドリア機能賦活剤についても種々の特許文献が公開されている（特許文献６〜８）。しかし、この５−デアザフラビン誘導体の酸化還元触媒活性に着眼し、ミトコンドリア機能賦活作用に適用した文献は見当らない。５−デアザフラビン誘導体は、酸化還元触媒活性を有するため、ミトコンドリアの酸化的リン酸化におけるＡＴＰ産生機能に影響することは明らかである。５−デアザフラビン骨格は、メタン発酵の酸化還元反応に関わる補酵素の補酵素Ｆ₄₂₀（Coenzyme Ｆ₄₂₀）に見出され、フラビンの類縁体でもある。その酸化還元挙動はフラビンよりむしろＮＡＤ(Ｐ)^＋に類似している。また共鳴極限式の１つはＮＡＤ(Ｐ)^＋構造を分子中に内蔵しており、電子密度（分子軌道計算化学で求めたもの）を見ても“ フラビン型のＮＡＤ(Ｐ)^＋”とみなし得る。

発明者等は５−デアザフラビンはＮＡＤ^＋やＦＡＤと同様のｒｅｄｏｘ（酸化還元）機能を有することから、細胞内でのＡＴＰ産生を賦活し、さらにサーチュイン遺伝子を直接又は間接的に賦活すると考え、鋭意研究を行った結果、特定の構造式を有する５−デアザフラビン化合物は化学的に非常に安定で、しかも安価に合成でき、ＡＴＰ産生を賦活し、さらにミトコンドリアの機能を制御するサーチュイン遺伝子を賦活することを見出し、本発明を完成するに至った。

特許第３０７３３０９号 特開平６−１９９８５７号 特開平１１−３２２７４６号 特開２０００−２１２０８７号 特開平６−７３０５８号 特開２００１−４８７８４号 特開２００２−３２２０５８号 特開２００８−２５５０５９号

１４０．ミトコンドリア制御による抗老化対策，上原記念生命科学財団研究報告集，２５（２０１１） SIRT１による代謝制御機構の解明，www.mishima-kaiun.or.jp/assist/docs/SNo4-hasegawa.pdf 身体機能を回復し、健康寿命を延ばす。‐‐老化・寿命の研究で解明された物質「ＮＭＮ」の驚きの効用，https://www.mugendai-web.jp/archives/6576 Imai S1,Armstrong CM, Kaeberlein M, Guarente L(2000) Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403(6771):795-800. Imai (2010) A possibility of nutriceuticals as an anti-aging intervention: activation of sirtuins by promoting mammalian NAD biosynthesis. Pharmacol Res. 62(1):42-7. Mills KF, Yoshida S, Stein LR, Grozio A, Kubota S, Sasaki Y, Redpath P, Migaud ME, Apte RS, Uchida K, Yoshino J, Imai SI (2016)Long-Term Administration of Nicotinamide Mononucleotide Mitigates Age-Associated Physiological Declinde in Mice. Cell Metab. 24(6):795-806. Michishita E1, Park JY, Burneskis JM, Barrett JC, Horikawa I.(2005) Evolutionarily conserved and nonconserved cellular localizations and functions of human SIRT proteins. Mol Biol Cell. Oct;16(10):4623-35 Pacholec M, Bleasdale JE, Chrunyk B, Cunningham D, Flynn D, Garofalo RS, Griffith D, Griffor M, Loulakis P, Pabst B, Qiu X, Stockman B, Thanabal V, Varghese A, Ward J, Withka J, Ahn K.(2010) SRT1720, SRT2183, SRT1460, and resveratrol are not direct activators of SIRT1. J Biol Chem. 285(11):8340-51. Tang BL(2016) Sirt1 and the Mitochondria Mol. Cells 39(2):87-95 老化関連疾患におけるＮＡＤ＋合成系の役割と創薬標的としての可能性，https://seikagaku.jbsoc.or.jp/10.14952/SEIKAGAKU.2015.870239/data/index.pdf 「酸化還元機能性を有する複素環化合物の合成」，www.waseda.jp/prj-prac-chem/product/research%20product/2002 nitta.pdf

本発明の課題は、各種の５−デアザフラビン誘導体の中から細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するのに有効な構造式を有する５−デアザフラビン化合物を提供することにある。

本発明者等は上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、各種の異なった構造式を有する５−デアザフラビン誘導体化合物を検体として作製し、それを使用してインビトロ（in vitro）で各種実験を重ねた結果、細胞内でのＡＴＰ産生を増加させる構造式を持った化合物を見出した。

まず本発明者等は、ＮＭＮ（図１７参照）の類縁化合物として、成長因子として知られ水溶性ビタミンであるリボフラビン（ビタミンＢ_２）のフラビン骨格の５位の窒素をメチレン基に置き換えた５−デアザフラビンに着目した。５−デアザリボフラビンはリボフラビンと代謝拮抗し、強力な抗コクシジウム活性を示した。最近メタン生成菌から５−デアザフラビン骨格をもった補酵素Ｆ_４２０（図１８参照）が見出され、炭酸ガスのメタンへの還元過程や、抗生物質の生合成過程で重要な働きをしていることがわかってきた。５−デアザフラビンの酸化還元挙動はフラビンよりむしろＮＡＤ（Ｐ）^＋（図１９参照）に類似している。また共鳴極限式の１つはＮＡＤ（Ｐ）^＋構造を分子中に内蔵しており、電子密度（分子軌道計算化学で求めたもの）を見ても“フラビン型のＮＡＤ（Ｐ）^＋”とみなし得る（図２０参照）。Huckel ＭＯ法計算で、５−デアザフラビン環の５位が非常にπ電子欠乏（正味荷電net charge:＋０.２４）になっており、ニコチンアミドヌクレオチドの４位も同様にπ電子欠乏（net charge:＋０.２１０）になっている。其れゆえ、５−デアザフラビン環はＮＡＤ（＋）とＦＡＤ（図２１参照）の両方の電子伝達系に属するものと考えられる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ，nicotinamide adenine dinucleotide)は、全ての真核生物と多くの古細菌、真正細菌で用いられる電子伝達体である。

事実、マイトトラッカー蛍光染色によりミトコンドリア膜電位を蛍光標識したところ、新規ＮＭＮ類縁体（５−デアザフラビン）の処理により顕著にミトコンドリア活性の促進がみられた。サーチュイン遺伝子が活性化されると細胞内の小器官「ミトコンドリア」が活性化され、認知症予防、動脈硬化予防、難聴予防、脂肪の燃焼、細胞修復や遺伝子に有害な活性酸素の除去を促進し、老化要因の発現を抑制する効果が得られると考えられており、この電子伝達系として働く５−デアザフラビンはβ−ＮＭＮに比較して、低容量で長寿遺伝子のサーチュイン遺伝子のスイッチオンにして活性化と同時にミトコンドリアの活性化によりＡＴＰ産生を促す。

一方、ＮＡＤ^＋やＦＡＤ同様のredox機能を持つこの５−デアザフラビン化合物は、現在ＮＭＮを補充する医薬品に用いたいと検討されているβ−ＮＭＮと比較すると、化学的に非常に安定でしかも安価に合成でき、ＮＡＤ^＋を活性化し、さらにミトコンドリアの長寿遺伝子（SIRT１およびSIRT３）も直接又は間接的に賦活すると発明者等は考えた。即ち、発明者等はＮＡＤ^＋依存的に活性化され、ミトコンドリア機能維持に重要な遺伝子として既に明らかになっている長寿遺伝子SIRT１の活性化を評価する目的で、SIRT１の標的転写因子であるFOXO1の発現を活性指標として、HCT116 細胞を用いｑ−ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡ増加のスクリーニング評価を行った。

その結果、β−ＮＭＮと比較し本発明に係る化合物がより低用量でSIRT１活性能を有することを明らかにした。よって本発明に係る化合物はＮＡＤ^＋を直接活性化し虚血などの病態的条件下でも連続してＡＴＰを産生させ、その効果は持続的で強力であると予想出来る。したがって本発明に係る化合物は医薬品として開発可能な必要条件を十分に備えていると考えられる。また、その化学構造が機能的及び電子論的にＮＡＤ^＋とＦＡＤの補酵素のコア部分の合体型構造、即ち、nicotinamideとflavinのハイブリッドで自然界に存在する構造に近いことから、副作用の発現は殆ど無いだろうと推測できる。さらに、本発明に係る化合物の構造は、酸化還元電位測定値より判断すると、補酵素としてのＮＡＤやＦＡＤよりもredoxポテンシャルが高く酸化還元能が優れている。

本発明は上記の知見を基にして完成したものである。
即ち、本発明により細胞内でＡＴＰ産生を賦活するために有効な補酵素因子として、下記の式（Ｉ）〜式（IV）で示される化合物を特定した。

（式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ_３及びＲ_４は、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。）

（式中、Ｒ_１及びＲ_３は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）

（式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）

（式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）

本発明により提供されたＡＴＰ産生を賦活する補酵素因子を使用することにより、細胞内でのエネルギー産生の機能低下を改善することができる。
従って、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳出血・梗塞に伴う神経変性疾患やうつ病などの予防・治療薬として極めて有用である。

図１は、ヒト由来神経芽細胞（ニューロブラスト−マ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ株の培養細胞に検体１を添加し、添加後の細胞内・外のＡＴＰ濃度を蛍光測定した結果を示す図である。 図２Ａは、中枢神経系のグリア細胞の一種、培養アストロサイト細胞に検体１を添加し、蛍光測定した結果を示す図である。 図２Ｂは、図２Ａでの測定結果を定量化した図である。 図３は、ヒトグリオーマＵ２５１の培養細胞（Sig1-R transfected cells）に検体１，２を添加し、添加後の細胞内のＡＴＰ濃度を添加しない場合（Cont.）と相対比較して示した図である。 図４は、幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養し、検体１を添加した後の海馬神経細胞（ニューロン）の神経軸索（Axon）の伸展・発達・分岐を示す免疫染色画像である。 図５は、図４の場合と同様にして検体１を添加し、海馬神経細胞軸索（Axon）の分岐数を計測した結果を示す図である。 図６は、図４の場合と同様に検体１を添加した後の、海馬神経細胞樹状突起（Dentrite）の伸展・発達・分岐を示す免疫染色画像である。 図７は、図６の場合と同様に検体１を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を計測した結果を示す図である。 図８は、図４の場合と同様に培養し、１４日目における興奮性シナプスを免疫染色したオータプス標本におけるシナプスの免疫染色画像である。 図９は、図４の場合と同様に培養し、１４日目における興奮性シナプスの数を定量した図である。 図１０は、成熟培養海馬細胞（培養１１日目）に検体１を１回投与して３日後（培養１４日目）に定量した海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の免疫染色画像である。 図１１は、図１０の場合と同様に、培養１４日目の発達期に、ＭＡＰ２抗体により免疫染色し、樹状突起（Dendrite）の分岐数を計測した図である。 図１２は、成熟Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１０〜１７週齢、体重２８〜３１ｇ）に生理食塩水（コントロール）と検体３（１０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、２２時間後に皮質（Cortex）と海馬（Hippocampus）領域を含む脳薄切片（スライス）標本を作製し、外液に８０ｍＭＫＣｌ（８０Ｋ）を添加して細胞膜の脱分極を起こし、Ｋ^＋脱分極によって生じる大脳皮質ニューロン（神経細胞）内に存在するミトコンドリア内のＣａ^２＋濃度上昇と検体３によるその抑制効果を計測した図である。 図１３は、図１２の場合と同様に、海馬ニューロン（神経細胞）のＫ^＋脱分極によるミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度上昇と検体３によるその抑制効果を計測した図である。 図１４は、吸入麻酔下のウイスター系成熟ラット（体重２００〜２３０ｇ）の頭蓋骨に小穴をあけた後、右脳線条体にコントロール群には生理食塩水、出血群には０．２４Ｕのコラゲナーゼ（typeＮ）を含む生理食塩水１．２μｌを注入した脳内出血モデルラットの脳断面を示す図。 図１５は、脳内出血モデルラットに対する検体４の脳細胞保護作用を検証するためにコラゲナーゼ投与の１時間後に検体４を１００μｇ／ｋｇを脳内のスポットへ注入し、ラットの運動足跡を定量的に測定した図である。 図１６は、図１５の場合と同様にして、検体４投与有無ラットの運動距離と運動スピードの経日変化を計測した図である。 図１７は、β−ＮＭＮの化学構造式を示す図である。 図１８は、補酵素Ｆ_４２０の化学構造式を示す図である。 図１９は、ＮＡＤ（Ｐ）^＋の化学構造式とその酸化還元反応（Redox）を説明する図である。 図２０は、５−デアザフラビンとＮＡＤ（Ｐ）^＋のフラビン環の分子軌道計算化学で求めた電子密度を示す図である。 図２１は、ＮＡＤ^＋との比較としてＦＡＤとの構造の類似性を説明した図である。 図２２は、検体５を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２３は、検体６を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２４は、検体７を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２５は、検体８を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２６は、検体９を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２７は、検体１０を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２８は、検体１０を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。 図２９は、２４時間前にβ−ＮＭＮを皮下投与したマウスの脳標本のミトコンドリア内Ｃａ^２＋の解析結果を示す図である。ミトコンドリア選択的Ｃａ^２＋指示薬Ｘrhod-1で染色された標本を５分間８０Ｋ ＡＣＦＳ暴露−５分間洗浄操作を三回繰返した。この時のミトコンドリア内Ｃａ^２＋の変動に及ぼすβ−ＮＭＮの用量反応関係 Ａ：Control, Ｂ：β-ＮＭＮ １０ｍｇ／ｋｇ; Ｃ：β-ＮＭＮ ３０ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：β-ＮＭＮ １００ｍｇ／ｋｇそれぞれの用量のβ−ＮＭＮを皮下投与し、２４時間後に全脳スライス標本を作成し、ミトコンドリア特異的Ｃａ^２＋指示薬Ｘrhod-1で染色した。５８０ｎｍ励起時の赤色（＞６００ｎｍ）の蛍光画像から、三回の８０Ｋ ＡＣＳＦ刺激で得られたミトコンドリア内Ｃａ^２＋上昇を経時計測した。実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ）；点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５〜６例の平均値と標準誤差を示す。 図３０は、２４時間前に検体１(TND1128）を皮下投与したマウスの脳標本のミトコンドリア内Ｃａ^２＋ の解析結果を示す図である。ミトコンドリア選択的Ｃａ^２＋指示薬Xrhod-１で染色された標本を図２２と同様に、５分間８０Ｋ ＡＣＦＳ暴露−５分間洗浄操作を三回繰り返した。このミトコンドリアＣａ^２＋の変動に及ぼす検体１（TND1128）の用量反応関係Ａ：Control, Ｂ：TND1128 0.０１ｍｇ／ｋｇ；Ｃ：TND1128 0.１ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：TND1128 1.０ｍｇ／ｋｇ（皮下投与）。図２２と同様にXrhod-1の５８０ｎｍ励起時の赤色（＞６００ｎｍ）蛍光画像から、三回の８０Ｋ ＡＣＳＦ刺激で得られたミトコンドリア内Ｃａ^２＋上昇を経時計測した。実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ），点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５〜６例の平均値と標準誤差を示す。 図３１は、β−ＮＭＮの８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時のミトコンドリア内 Ｃａ^２＋濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。 図２９のデータを定量的にまとめた（図３７参照） Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）におけるミトコンドリアのＣａ^２＋取り込み量に対するβ−ＮＭＮの作用 Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ^２＋取り込みの用量反応関係 Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ^２＋取り込みの用量反応関係 ＊：Ｔｕｋｅｙ法による多重解析で有意差（P＜0.05） 図３２は、検体１（TND1128）の８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時のミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。 図２９のデータを定量的にまとめた（図３７参照） Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）におけるミトコンドリアのＣａ^２＋取り込み量に対するTND1128の作用 Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ^２＋取り込みの用量反応関係 Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回におけるミトコンドリアのＣａ^２＋取り込みの用量反応関係 ＊：Ｔｕｋｅｙ法による多重解析で有意差（P＜0.05） 図３３は、２４時間前にβ−ＮＭＮを皮下投与したマウスの脳標本の細胞質内Ｃａ^２＋ の解析結果を示す図である。それぞれの用量のβ−ＮＭＮを皮下投与し、２４時間後に全脳スライス標本を作成し、脳スライス標本を細胞質に留まるＣａ^２＋ 指示薬Ｆｕｒａ−４Ｆで染色した。この脳標本から３６０ｎｍと３８０ｎｍの励起光を与えた時の青緑色（＞５００ｎｍ）の蛍光強度（Ｆ３６０とＦ３８０）の比を１０秒毎、経時的に得、三回の８０Ｋ−ＡＣＳＦ刺激で得られた細胞質内Ｃａ^２＋ 上昇の時間経過。Ａ：Control, Ｂ：β−ＮＭＮ １０ｍｇ／ｋｇ；Ｃ：β−ＮＭＮ ３０ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：β−ＮＭＮ １００ｍｇ／ｋｇ、実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ）、点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５〜６例の平均値と標準誤差を示す。 図３４は、２４時間前に検体１(TND1128）を皮下投与したマウスの脳標本の細胞質内Ｃａ^２＋ の解析結果を示す図である。細胞質選択的Ｃａ^２＋ 指示薬Ｆｕｒａ−４Ｆで染色された標本を図２９と同様に、５分間８０Ｋ ＡＣＦＳ暴露−５分間洗浄操作を三回繰り返した。この細胞質のＣａ^２＋ の変動に及ぼす TND1128の用量反応関係Ａ：Control, Ｂ：TND1128 0.０１ｍｇ／ｋｇ；Ｃ：TND1128 0.１ｍｇ／ｋｇ；Ｄ：TND1128 1.０ｍｇ／ｋｇ（皮下投与）。図３３と同様に３６０ｎｍと３８０ｎｍの励起光を与えた時のＦｕｒａ−４Ｆの青緑色（＞５００ｎｍ）蛍光の強度（Ｆ３６０とＦ３８０）の比を１０秒毎、経時的に得た。実線：大脳皮質部位（ＣＴＸ），点線：海馬ＣＡ１部位（ＣＡ１）の反応。５〜６例の平均値と標準誤差を示す。 図３５は、β−ＮＭＮの８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時の細胞質内Ｃａ^２＋ 濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。図３３のデータを定量的にまとめた（図３７参照） Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）における細胞質のＣａ^２＋ 取り込み量に対するβ−ＮＭＮの作用 Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ^２＋ 取り込みの用量反応関係 Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ^２＋ 取り込みの用量反応関係 図３６は、検体１(TND1128）の８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時の細胞質内Ｃａ^２＋ 濃度に対する保護作用の量反応関係を示す図である。 図３４のデータを定量的にまとめた（図３７参照） Ａ：８０Ｋ ＡＣＳＦ三連続暴露全体での大脳皮質（ＣＴＸ）（白）と海馬（ＣＡ１）（黒）における細胞質のＣａ^２＋ 取り込み量に対するβ−ＮＭＮの作用 Ｂ：大脳皮質における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ^２＋ 取り込みの用量反応関係 Ｃ：海馬における８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露、各回における細胞質のＣａ^２＋取り込みの用量反応関係 ＊Ｔｕｋｅｙ法による多重解析で有意差（P＜0.05） 図３７は、８０Ｋ 連続三回暴露時のミトコンドリアまたは細胞質におけるＣａ^２＋ 上昇量の定量法を説明する図である。

（化合物の構造）
本発明では、式（Ｉ），（II），(III）及び（IV）で示される構造式を有する化合物の使用が細胞内でのＡＴＰ産生を賦活するのに有効である。
以下、それらの化合物の具体例とその製法を示す文献を第１表〜第４表に示す。

（化合物の製造方法）
一般式Ｉで表される５−デアザフラビン化合物（Ｉ−１〜Ｉ−１１８）（３）は既知文献（１〜１４）記載の製造方法により合成できる。特に、（製法Ａ）に記した文献（１）の一般製造方法により大半の誘導体が合成できる。即ち、６−Ｎ−置換−アミノウラシル類（１）と適当なｏ−ハロゲノベンズアルデヒド（２）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で、加熱還流する。加熱時間は３〜７時間が適当である。反応液を減圧下濃縮し、残留物を適当な溶媒（アルコール、ジオキサンやＤＭＦなど）で再結晶し、対応する５−デアザフラビン（３）を得る。

一般式IIで表されるピリドジピリミジン化合物（II）（II−１〜II−３２）（５）は既知文献（１５〜１９）記載の製造方法により合成できる。特に、（製法Ｂ）に記した文献（１５）の一般製造方法により大半の誘導体が合成できる。即ち、６−Ｎ−置換−アミノウラシル類（１）と適当な３−置換−６−クロロウラシ−５−カルブアルデヒド（４）をジメチルホルムアミド又は酢酸中で、加熱還流する。加熱時間は２〜５時間が適当である。反応液を減圧下濃縮し、残留物を適当な溶媒（アルコール、酢酸やＤＭＦなど）で再結晶し、対応するピリドジピリミジン（５）を得る。

一般式IIIで表されるデアザフラビノテストステロン化合物（III）（III−１〜III−２）（７）は既知文献（２０，２１）記載の製造方法により合成できる。同様の方法で未知化合物（III−３〜III−２３）も合成できる。即ち、ジフェニルエーテルに、６−Ｎ−モノ置換−アミノウラシル類（１）と２−ヒドロキシメチレンテストステロン（６）を加え、更に、この混合物へｐ−トルエンスルホン酸を加えた後、１８０℃でアルゴン雰囲気下３０分〜６０分間加熱攪拌する。反応後この反応物をカラムクロマトグラフィーに付し精製する。尚、この反応はジオキサン中で数時間加圧下加熱しても合成できる。

［製造例１］
（８’−置換−５’−デアザ−１７β−ヒドロキシ−３’−メチルアンドロスト−２，４−ジエノ［２，３−ｇ］プテリジン−２’，４’（３’Ｈ，８’Ｈ）−ジオン誘導体（III−３〜III−１３）の一般合成）
ジオキサン（５０ｍｌ）にｐ−トルエンスルホン酸（６０ｍｇ，０.３２mmol）と６−モノ置換アミノ−３−メチルウラシル（１）（２.８４mmol）を加え、更に、２−ヒドロキシメチレンテストステロン（６）（１.０ｇ，３.１６mmol）を加えた後、アルゴン雰囲気下で封管中１２時間加熱する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー（Fuji Silysia ２３０〜４００mesh；溶出液：酢酸エチル：エタノール＝１２：１又は酢酸エチルのみ）で分離精製し、粉末結晶を得る。更に、再結晶は酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合溶液より行なえる。

化合物 III-３ (5'-Deaza-8'-ethyl-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione) ; 黄色の粉末結晶（0.77 g, 60%）, mp 260 ℃ (decomp.); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH₃), 1.00 (3H, s, 19-CH₃), 1.41 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH₂CH₃), 2.46-2.62 (2H, br dd, 6-H), 2.67 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.92 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.43 (3H, s, 3'-CH₃), 3.68 (1H, dd, J_16α,17α= 8.7 Hz, J_16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 4.46-4.73 (1H, m, 8'-CH_aH_b), 4.73-5.00 (1H, m, 8'-CH_aH_b), 6.39 (1H, s, 4-H), 8.25 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-４ (8'-n-Butyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione) ; 黄色の粉末結晶 (0.79 g, 58%), mp 246 ℃ (decomp.)； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH₃), 0.99 (3H, s, 19-CH₃), 1.50 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH₂CH₂CH₂CH₃), 2.46-2.61 (2H, br dd, 6-H), 2.66 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.91 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH₃), 3.69 (1H, dd, J_16α,17α= 7.8 Hz, J_16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 4.28-4.60 (1H, m, 8'-CH_aH_b), 4.60-4.92 (1H, m, 8'-CH_aH_b), 6.35 (1H, s, 4-H), 8.25 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-５ (8'-Benzyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine- 2',4'(3'H,8'H)-dione ); 黄色の粉末結晶 (0.63 g, 43%), mp 215 ℃； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH₃), 0.95 (3H, s, 19-CH₃), 2.37-2.45 (2H, br dd, 6-H), 2.64 (1H, d, J = 15.5 Hz, 1β-H), 2.90 (1H, d, J = 15.5 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH₃), 3.66 (1H, dd, J_16α,17α=8.4Hz, J_16β,17α=8.5 Hz, 17α-H), 5.59 (1H, br d, J = 15.3 Hz, 8'-CH_aH_b), 6.26 (1H, br d, J = 15.3 Hz, 8'-CH_aH_b), 6.28 (1H, s, 4-H), 7.07-7.19 (2H, m, Bn-mH), 7.25-7.35 (3H, m, Bn-o, pH), 8.33 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-６ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine- 2',4'(3'H,8'H)-dione)；燈色の粉末結晶 (0.54 g, 38%), mp 215 ℃ (decomp.)； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH₃), 1.01 (3H, s, 19-CH₃), 2.20-2.43 (2H, br dd, 6-H), 2.76 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J =15.9 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH₃), 3.67(1H, dd, J_16α,17α=8.7 Hz, J_16β,17α= 8.9 Hz, 17α-H), 5.60 (1H, s, 4-H), 6.90-7.22 (2H, m, Ph-mH), 7.22-7.49 (3H, m, Ph-o, pH), 8.39 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-７ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-(4-methylphenyl)androst-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.58 g, 40%), mp 205 ℃ (decomp.)；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ： 0.81 (3H, s, 18-CH₃), 1.02 (3H, s, 19-CH₃), 2.92 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 3.10 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1α-H), 2.46 (3H, s, 8'-CH₃), 3.40 (3H, s, 3'-CH₃), 3.67 (1H, dd, J_16α,17α= 8.4 Hz, J_16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 5.56 (1H, s, 4-H), 6.88-7.20 (2H, m, Ar-mH), 7.20-7.47 (2H, m, Ar-oH), 8.37 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-８ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methoxyphenyl)-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.69 g, 47%), mp 220 ℃ (decomp.)；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH₃), 1.02 (3H, s, 19-CH₃), 2.18-2.41 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH₃), 3.67(1H, dd, J_16α,17α= 8.7Hz, J_16β,17α = 8.4 Hz, 17α-H), 3.89 (3H, s, OCH₃), 5.61 (1H, s, 4-H), 7.02-7.24 (4H, m, Ar-m, oH), 8.36 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-９ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3'-methyl-8'-(3,4-methylenedioxyphenyl)-androst-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.72 g, 47%), mp 214 ℃; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH₃), 1.01 (3H, s, 19-CH₃), 2.22-2.46 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.96 (1H, d, J =15.6 Hz, 1α-H), 3.40 (3H, s, 3'-CH₃), 3.67 (1H, dd, J_16α,17α= 9.9 Hz, J_16β,17α= 8.4 Hz, 17β-H), 5.67 (1H, s, 4-H), 6.08 (2H, s, OCH₂O), 6.51-7.17 (1H, m, Ar-mH), 6.86-6.98 (2H, m, Ar-oH), 8.36 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-１０ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-hydroxyphenyl)-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.47 g, 32%), mp 280 ℃ (decomp.); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH₃), 1.00 (3H, s, 19-CH₃), 2.61-2.78 (2H, br dd, 6-H), 2.71 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.98 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.45 (3H, s, 3'-CH₃), 3.67 (1H, dd, J_16α,17α= 7.6 Hz, J_16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.68 (1H, s, 4-H), 6.73-6.98 (4H, m, Ar-m, oH), 8.40 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-１１ (5'-Deaza-8'-(4-fluorophenyl)-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)；燈色の粉末結晶 (0.69 g, 47%), mp 270 ℃ (decomp.)；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH₃), 1.00 (3H, s, 19-CH₃), 2.68 (2H, dd, J = 15.0, 6-H), 2.93 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H), 3.11 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.70 (3H, s, 3'-CH₃), 3.56-3.80 (1H,br dd, 17α-H), 6.54 (1H, s, 4-H), 7.12-7.66 (4H, m, Ar-m, oH), 8.50 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-１２ (8'-(4-Chlorophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 黄色の粉末結晶 (0.74 g, 49%), mp 270 ℃ (decomp.); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH₃), 1.03 (3H, s, 19-CH₃), 2.19-2.42 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 3.96 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.40(3H, s, 3'-CH₃), 3.67 (1H, dd, J_16α,17α= 8.4 Hz, J_16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.53 (1H, s, 4-H), 7.06-7.21 (2H, m, Ar-mH), 7.50-7.60 (2H, m, Ar-oH), 8.37 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-１３ (8'-(4-Bromophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-methylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶 (0.72 g, 44%), mp 250 ℃ (decomp.); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.80 (3H, s, 18-CH₃), 1.03 (3H, s, 19-CH₃), 2.25-2.42 (2H, br dd, 6-H), 2.70 (1H, d, J = 15.3 Hz, 1β-H), 3.96 (1H, d, J = 15.3 Hz, 1α-H), 3.39(3H, s, 3'-CH₃), 3.67(1H, dd, J_16α,17α= 8.7 Hz, J_16β,17α= 8.1 Hz, 17α-H), 5.53 (1H, s, 4-H), 6.99-7.15 (2H, m, Ar-mH), 7.65-7.75 (2H, m, Ar-oH), 8.38 (1H, s, 5'-H)

［製造例２］
（８’−置換−５’−デアザ−１７β−ヒドロキシ−３’−フェニルアンドロスト−２，４−ジエノ［２，３−ｇ］プテリジン−２’，４’（３’Ｈ，８’Ｈ）−ジオン誘導体（III−１４〜III−２３）の一般合成）
ジフェニルエーテル（１ｍｌ）にｐ−トルエンスルホン酸（６０ｍｇ，０.３２mmol），６−モノ置換アミノ−３−フェニルウラシル（１）（０.６６ｇ，２.８４mmol）及び２−ヒドロキシメチレンテストステロン（６）(１.０g, ３.１６mmol)を加え、窒素雰囲気下１５５℃で４５分撹拌する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー（Fuji Silysia２３０〜４００mesh；溶出液：酢酸エチル：エタノール＝１０:１又は酢酸エチルのみ）で分離精製し、粉末結晶を得る。更に、再結晶は酢酸エチルとｎ−ヘキサンの混合溶液より行なえる。

化合物 III-１４ (5'-Deaza-8'-ethyl-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H, 8'H)-dione)； 黄色の粉末結晶 (0.79g, 54%), mp 240℃ (decomp.)；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH₃), 1.01(3H, s, 19-CH₃), 1.45 (3H, t, J = 7.5 Hz, 8'-CH₂CH₃), 2.52-2.61 (2H, br dd, 6-H), 2.67(1H, d, J =15.6 Hz, 1β-H), 2.93(1H, d, J =15.6 Hz, 1α-H), 3.68 (1H, dd, J_16α,17α=7.5 Hz, J_16β,17α=8.1 Hz, 17α-H), 4.46-4.76(1H, m, 8'-CH_aH_b), 4.76-5.05(1H, m, 8'-CH_aH_b), 6.41(1H, s, 4-H), 7.21-7.45 (2H, m, Ph-mH), 7.45-7.52 (3H, m, Ph-o, pH), 8.27 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-１５ (8'-n-Butyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno [2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 黄色の粉末結晶 (0.77g, 50%), mp 200℃；¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH₃), 0.99 (3H, s, 19-CH₃), 1.18 (3H, t, J = 7.2 Hz, 8'-CH₂CH₂CH₂CH₃), 2.45-2.62 (2H, br dd, 6-H), 2.65 (1H, d, J =15.6 Hz, 1β-H), 2.91(1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.63 (1H, dd, J_16α,17α= 7.1 Hz, J_16β,17α=7.1 Hz, 17α-H), 4.35-4.64 (1H, m, 8'-CH_aH_b), 4.64-4.94 (1H, m, 8'-CH_aH_b), 6.39 (1H, s, 4-H), 7.21-7.52 (5H, m, Ph-o, m, pH), 8.27 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-１６ (8'-Benzyl-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 黄色の粉末結晶 (0.72 g, 44%), mp 224 ℃； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH₃), 0.92 (3H, s, 19-CH₃), 2.30 (2H, dd, J = 10.5 Hz, 6-H), 2.63 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.87 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J_16α,17α= 8.4 Hz, J_16β,17α= 7.8 Hz, 17α-H), 5.37-5.61 (1H, br, 8'-CH_aH_b), 6.41-6.64 (1H, br, 8'-CH_aH_b), 7.02 (1H, s, 4-H), 7.24-7.56 (10H, m, Bn-o, m, pH and Ph-o, m, pH), 8.33 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-１７ (5'-Deaza-17β-hydroxy-3',8'-diphenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione )； 燈色の粉末結晶 (0.57 g, 36%), mp 257 ℃； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH₃), 1.04 (3H, s, 19-CH₃), 2.71 (1H, d, J= 15.6 Hz, 1β-H), 2.98 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.65 (1H, dd, J_16α,17α= 8.4Hz, J_16β,17α= 8.7Hz, 17α-H), 5.57(1H, s, 4-H), 7.16-7.66(10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.40 (1H, s, 5'-H)

化合物III-１８ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methylphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.90 g, 55%), mp 246 ℃ (decomp.)； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH₃), 0.88 (3H, s, 19-CH₃), 2.47 (3H, s, 8'-CH₃), 2.58-2.74 (2H, br dd, 6-H), 2.92 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H), 3.16 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.68 (1H, dd, J_16α,17α= 8.7 Hz, J_16β,17α= 7.8 Hz, 17α-H), 6.61 (1H, s, 4-H), 6.89-7.49 (7H, m, 3'-Ph-m, pH and 8'-Ar-o, mH), 8.40-8.56 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.49 (1H, s, 5'-H)

化合物III-１９ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(3,4-dimethylphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.90 g, 54%), mp 260 ℃ (decomp.); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.77 (3H, s, 18-CH₃), 0.80 (3H, s, 19-CH₃), 2.33 (3H, s, 8'-Ar-CH₃), 2.35 (3H, s, 8'-Ar-CH₃) 2.71(1H, d, J=15.0 Hz, 1β-H), 2.97(1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J_16α,17α= 7.5 Hz, J_16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 5.60 (1H, s, 4-H), 6.88-7.50 (8H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ar-o, mH), 8.38 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-２０ (5'-Deaza-17β-hydroxy-8'-(4-methoxyphenyl)-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione); 燈色の粉末結晶(0.96 g, 57%), mp 250 ℃ (decomp.)； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.78 (3H, s, 18-CH₃), 0.81 (3H, s, 19-CH₃), 2.23-2.38 (2H, br dd, 6-H), 2.71 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1β-H), 2.93 (1H, d, J = 15.6 Hz, 1α-H), 3.62 (1H, dd, J_16α,17α= 6.9 Hz, J_16β,17α= 6.6 Hz, 17α-H), 3.87(3H, s, OCH₃), 6.19 (1H, s, 4-H), 7.00-7.13 (7H, m, 3'-Ph- m, pH and 8'-Ar-o, mH), 7.17-7.50 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.38 (1H, s, 5'-H)

化合物III-２１ (5'-Deaza-8'-(4-fluorophenyl)-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶(0.61 g, 37%), mp 260 ℃ (decomp.)； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.79 (3H, s, 18-CH₃), 1.04 (3H, s, 19-CH₃), 2.70 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1β-H), 2.97 (1H, d, J = 15.9 Hz, 1α-H), 3.66(1H, dd, J_16α,17α= 8.1 Hz, J_16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 5.54(1H, s, 4-H),7.18-7.54 (10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.39 (1H, s, 5'-H)

化合物III-２２ (8'-(4-Chlorophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione)； 燈色の粉末結晶 (0.56 g, 33%), mp 241 ℃ (decomp.)； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.77 (3H, s, 18-CH₃), 0.85 (3H, s, 19-CH₃), 2.29-2.44 (2H, br dd, 6-H), 2.79 (1H, d, J = 16.2 Hz, 1β-H), 3.07 (1H, d, J = 16.2 Hz, 1α-H), 3.67 (1H, dd, J_16α,17α= 7.8 Hz, J_16β,17α= 8.4 Hz, 17α-H), 6.46 (1H, s, 4-H), 7.17-7.59 (10H, m, 3'-Ph-o, m, pH and 8'-Ph-o, m, pH), 8.47 (1H, s, 5'-H)

化合物 III-２３ (8'-(4-Bromophenyl)-5'-deaza-17β-hydroxy-3'-phenylandrost-2,4-dieno[2,3-g]pteridine-2',4'(3'H,8'H)-dione )； 燈色の粉末結晶 (0.93, 51, mp 300 ℃ (decomp.)； ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃)δ: 0.81 (3H, s, 18-CH₃), 0.83(3H, s, 19-CH₃), 2.69 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1β-H), 3.12 (1H, d, J = 15.0 Hz, 1α-H), 3.07(1H, dd, J_16α,17α= 7.9 Hz, J_16β,17α= 8.7 Hz, 17α-H), 6.56 (1H, s, 4-H), 6.69-7.52 (7H, m, 3'-Ph-m, pH and 8'-Ar-o, mH), 7.67-7.79 (2H, m, 3'-Ph-oH), 8.48 (1H, s, 5'-H)

上記新規化合物（III−３〜III−２３）の機器分析値を第５表と第６表に示す。

一般式IVで表されるピリドジピリミジン化合物（IV）（IV−１〜IV−２６）（９）は既知文献（２２）記載の製造方法により合成できる（製法Ｄ）。即ち、ジフェニルエーテルにｐ−トルエンスルホン酸，３−置換−６−モノ置換アミノウラシル（１）及び２−ヒドロキシメチレンコレスト−４−エン−３−オン（８）を加え、窒素雰囲気下１８０℃で４５分間加熱撹拌する。反応後、これをカラムクロマトグラフィー（Fuji Silysia ２３０〜４００mesh；溶出液：酢酸エチル）で分離精製し、粉末結晶を得る。

次に、化合物番号Ｉ−５０（検体１）、Ｉ−５４（検体２）、III−４（検体３）及びＩ−７５（検体４）の化合物を用いて、それらの検体の添加が細胞内でＡＴＰ産生に直接又は間接に貢献していることを実験により検証したので、以下実施例として説明する。

［実施例１］
ヒト由来神経芽細胞（ニューロブラスト−マ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ株の培養細胞に検体１を添加後、細胞内・外のＡＴＰ濃度を蛍光測定した。その結果を図１に示す。細胞内においては、検体１（１μＭ）添加直後から５時間後までＡＴＰ産生の増加（蛍光の強さの増加）がみられ、１２時間後には作用消失する。なお、検体処置による培養細胞の形態変化はない。
細胞外においても、検体１（１μＭ）添加直後から５時間後までＡＴＰ産生の増加がみられＡＴＰ濃度が増加した。これは細胞内で増加したＡＴＰが細胞外に流出したものと思われる。

［実施例２］
中枢神経系のグリア細胞の一種、培養アストロサイト細胞に検体１を添加し、蛍光測定した結果を図２Ａと図２Ｂとに示す。
グリア細胞内のＡＴＰ量は検体１を１μＭ投与したとき、１２時間と２４時間後に有意に増加しており、細胞外についても同様な動向を示している。

［実施例３］
ヒトグリオーマＵ２５１の培養細胞（Sig1-R transfected cells）に検体１，２をそれぞれ添加し、添加後の細胞内のＡＴＰ濃度を添加しない場合（Cont.）と相対比較した。その結果、図３に示すように検体１と検体２とはヒトグリオーマＵ２５１細胞のＡＴＰ産生量を有意に増加させていることが検証された。脂溶性の高い検体２は検体１に比較して効果が大である。なお蛍光測定は検体の投与後６時間で行った。

なお、実施例１〜３は脳神経細胞（ニューロン）に関して実験したものであるが、脳神経細胞（ニューロン）は酸素（Ｏ_２）とグルコースとを必要とする。これらの２物質は血中よりグリア（アストロサイト）にまず取り込まれ、その後グリアからニューロンへと伝達される。検体も同様である。よって検体によるグリア内ＡＴＰ量増加は、グリアの働きを直接的に促進していることを示すと共に、間接的にニューロンを賦活することを示唆する。

［実施例４］
幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養した。
発達初期の細胞（培養１日目）に検体１を１回添加し、３日後（培養４日目）に海馬神経細胞（ニューロン）の神経軸索（Axon）、樹状突起（Dendrite）や発達するシナプス数を定量した。検体１（０.１μＭ，０.３μＭ，１.０μＭ）は培養１日目に１回のみ添加した。添加３日後（培養４日目）において、AxonとDendriteをｔａｕ抗体とＭＡＰ２抗体とを用いてそれぞれ免疫染色し、形態観察を行った。

図４は海馬神経細胞軸索（Axon）の免疫染色画像を示したもので、培養４日目にｔａｕ抗体にて軸索を免疫染色した。左はControl（対照群）、右は培養１日目に検体１（１μＭ）を１回のみ添加した検体処置神経細胞を示す。

図５は海馬神経細胞軸索（Axon）の分岐数を示したもので、培養４日目にｔａｕ抗体にて軸索の分岐数を定量した。実験は細胞体を中心に１０μｍ間隔で同心円（図示せず）を描き、その円を交差する軸索の本数を計測した。
図４と図５から、検体１は濃度依存的に神経軸索（Axon）の伸展・発達と、その分岐数を増加させることを示した。なお、検体濃度０．３μＭと１．０μＭではほぼ同程度の最大薬効を示した。

図６は海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の免疫染色画像を示したもので、培養４日目にＭＡＰ２抗体にて樹状突起を免疫染色した。左はControl（対照群）、右は培養１日目に検体１（１μＭ）を１回のみ添加した神経細胞を示す。

図７は海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の分岐数を示したもので、培養４日目にＭＡＰ２抗体にて免疫染色し、樹状突起の分岐数を定量した。実験は、細胞体を中心に１０μｍ間隔で同心円（図示せず）を描き、その円を交差する樹状突起の本数を計測した。
図６と図７から、検体１は濃度依存的に樹状突起の伸展と、その分岐数を増加させることを示した。なお検体濃度０．３μＭと１．０μＭではほぼ同程度の最大薬効を示した。
次いで、培養１４日目における興奮性シナプスをＶＧＬＵＴ１抗体を用いて免疫染色し、シナプス数を定量した。

図８は、オータプス標本におけるシナプスの免疫染色画像を示したもので、左はControl（対照群）、右は培養１日目に検体１（１μＭ）を１回のみ添加し、培養１４日目に、ＶＧＬＵＴ１抗体にて興奮性シナプスを免疫染色した神経細胞を示す。

図９は、海馬神経細胞に投射する興奮性シナプスの増加を計測した図である。脳には神経の興奮と抑制とを速やかに伝達するグルタミン酸作動性とＧＡＢＡ作動性の２シナプスがあるが、図９は培養１４日目に、ＶＧＬＵＴ１抗体にて免疫染色し、興奮性シナプス数を定量したものである。
図８と図９から、検体１は０．３μＭの添加により興奮性シナプス数を有意に最大値まで増加させることを示した。

［実施例５］
実施例４と同様に、幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて神経細胞を培養した。
成熟培養海馬細胞（培養１１日目）に検体１を１回投与して３日後（培養１４日目）に海馬神経細胞（ニューロン）の神経軸索（Axon）、樹状突起（Dendrite）の様子を観察した。培養１４日目の軸索は伸展および軸索同士の交差が著しく、軸索本数の定量が不可能であったので、樹状突起の形態のみを観察した。

図１０は、海馬神経細胞樹状突起（Dendrite）の免疫染色画像を示したもので、左はControl（対照群）、右は培養１４日目の画像で、検体１を投与し、培養１４日目にＭＡＰ２抗体にて免疫染色したものである。

図１１は、培養１４日目の発達後期に、ＭＡＰ２抗体にて免疫染色し、樹状突起（Dendrite）の分岐数を検体濃度０．１〜１μＭで定量したもので、細胞体を中心に１０μｍの間隔で同心円を描き、その円と交差する樹状突起の本数を計測した。
樹状突起は幼若培養細胞４日目（図７）と比較して、細胞体から生える樹状突起の本数は、培養日数に依存して増加している（図１１）。添加される検体濃度（０．３μＭと１μＭ）によって樹状突起は成熟培養細胞でも増加する傾向は認められるものの、培養４日目の細胞でみられた薬効ほどの顕著な分岐数の増加は認められなかった。

実施例４及び５の実験結果を踏まえると、検体添加によりラットの幼若・成熟培養神経細胞の発達・分岐・シナプス数の増加や促進が神経細胞内のＡＴＰ産生増加で促進されていることを間接的に証明しているといえる。

［実施例６］
成熟Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１０〜１７週齢、体重２８〜３１ｇ）に、一方には生理食塩水（Control）を他方には検体３（１０μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、２２時間後にそれぞれのマウスの皮質（Cortex）と海馬（Hippocampus）領域を含む脳薄切片（スライス）標本を作製した。外液に８０ｍＭ ＫＣｌ（８０Ｋ）を添加して細胞膜の脱分極を起こし、その結果生じるミトコンドリア内のＣａ^２＋濃度の増加をＲｈｏｄ−２（注１）を用いて蛍光的方法にて計測した。脳スライスにおいて、８０Ｋによる増加するＣａ^２＋濃度（注２）が検体３により、いかに抑制されるのかを指標とし、ミトコンドリアでのＡＴＰ活性に検体３が積極的に関与していることを間接的に検証した（注３）。

（注１）Ｒｈｏｄ−２：ミトコンドリアに選択的に取り込まれるＣａ^２＋蛍光色素
（注２）８０Ｋによる神経細胞膜の脱分極は細胞外から細胞内へのＣａ^２＋の流入と細胞内のＣａストアーからのＣａ^２＋の遊離の両者によって起こる。細胞内に増加した遊離Ｃａ^２＋は細胞内の独立器官であるミトコンドリア内へと容易に流れ込む。その結果ミトコンドリア内のＣａ^２＋濃度が上昇する。
（注３）８０Ｋ刺激による脱分極で神経細胞質内に増加した遊離Ｃａ^２＋は直ちに細胞質内からミトコンドリア内に速やかに移行する。検体によるミトコンドリア内遊離Ｃａ^２＋濃度の減少は神経細胞質膜に存在する外向きＣａポンプによって遊離Ｃａ^２＋が細胞外へ汲み出されるか、ミトコンドリア内部の一部に吸着、固定される。そのためのエネルギーはミトコンドリアで産生されるＡＴＰから供給される。よって得られた結果から、腹腔内注射された検体３は血液中からグリア（アストロサイト）細胞を経て大脳皮質や海馬ニューロン内のミトコンドリア内に取り込まれ、このことによりミトコンドリアでのＡＴＰ産生が活性化して神経細胞が活性化され、神経細胞膜上のＣａポンプがエネルギー源のＡＴＰをミトコンドリアから得て、余分な細胞内遊離Ｃａ^２＋を細胞外へと排出し、神経細胞を間接的に保護する。

図１２は、Ｋ^＋脱分極によって生じる大脳皮質ニューロン（神経細胞）内に存在するミトコンドリア内のＣａ^２＋濃度上昇と検体３によるその抑制効果を計測した図である。
ａは、正常マウスから得た脳スライス標本に８０ｍＭ ＫＣｌ外液（５分間適用後５分間洗浄）を３回連続した時のコントロール反応。縦軸はミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度の増加の蛍光測定の結果を示す。
ｂは、検体３を１０μｇ／ｋｇ腹腔内（i.p.）注射後２２時間後にラットより摘出作製した脳スライス標本に８０Ｋ外液を与えた時のミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度の変化。ａと比較してＣａ^２＋濃度上昇の抑制と８０Ｋ脱分極によって上昇したＣａ^２＋濃度のより速い回復がみられる。
ｃは、大脳皮質ニューロンのミトコンドリア内におけるＣａ^２＋濃度に対するコントロールと検体３の比較。１０μｇ／ｋｇでＣａ^２＋濃度抑制の最大効力がみられる。（1000倍量の１０ｍｇ／ｋｇの結果と変わらない。）（ｎ＝３平均値：同一固体から得た３枚のスライスから得たデータ）

図１３は、海馬ニューロン（神経細胞）のＫ^＋脱分極によるミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度上昇を計測した図である。
ａは、８０ｍＭ ＫＣｌ外液（５分間適用後５分間洗浄）を３回連続した時のコントロール反応。
ｂは、検体３を１０μｇ／ｋｇ腹腔内注射後２２時間後に脳スライス標本を作製し、これに８０Ｋ外液を与えた時のミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度の変化を示す図。
ｃは、海馬ニューロンのミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度のコントロールと検体３の１０μｇと１０ｍｇ／ｋｇ i.p.による抑制効果の比較を示す図。１０μｇ／ｋｇで最大効果が得られる。（ｎ＝３平均値：同一個体から得た３枚のスライスから得たデータ）

実施例６の実験結果を踏まえると、検体３は１０μｇ／ｋｇ i.p.生体内前処置により、マウス皮質と海馬神経細胞（ニューロン）の８０Ｋ脱分極によるそれぞれのミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度の上昇を顕著にしかも最大限に減少する。本結果は検体３が脳虚血時などに生じる神経細胞の損傷を救済することを示唆する。
即ち、成熟マウス脳細胞（ニューロン）を損傷するミトコンドリア内遊離Ｃａ^２＋増加によるＣａ負荷に対して、検体３によるＡＴＰ増加が細胞膜上のＣａポンプを賦活してミトコンドリア内遊離Ｃａ^２＋量を減少させ、その結果として神経細胞死の防止に貢献することを示す（ＡＴＰ増加の間接的証明）。

［実施例７］
脳虚血モデル成体ラットによる運動の行動の低下に対して検体添加が及ぼす効果を確認するための実験を行った。
ウイスター系成熟ラット（体重２００〜２３０ｇ）の頭蓋骨に吸入麻酔科で小穴をあけた後、右脳線条体にコントロール群には生理食塩水、出血群には０．２４Ｕのコラゲナーゼ（type IV）を含む生理食塩水１．２μｌを注入して脳内出血モデルラットを作製した。

図１４は、脳内出血モデルラットの脳断面を示す図である。
脳内出血モデルラットに対する検体４の脳細胞保護作用を確認するために、コラゲナーゼ投与の１時間後に検体４を１００μｇ／ｋｇを脳内のスポット（図中／白色菱形）へ注入し、ラットの運動足跡を定量的に量測定した。
運動量の測定はラットを５分間動画撮影。その撮影時間の後半の３分間の自由行動（運動距離と運動スピード）を解析した。

図１５はラットの運動足跡を測定した図であり、図１６は運動距離と運動スピードの経日変化を計測した図である。
検体４はラットの脳出血によって起こる虚血性の運動距離と運動スピードの低下を緩和する（図１５と１６）。その効果は出血１日目と１週間後にもみられる。
実験結果を踏まえると、成熟ラット脳細胞の虚血損傷の防止に検体４が貢献することが示された（ＡＴＰ増加の間接的証明）。

次いで、化合物番号II−１３（検体５）、II−３１（検体６）、III−２(検体７）、III−１４(検体１４）、IV−１０（検体９）、IN−１５（検体１０）及びIV−２３（検体１１）の化合物を用いて、それらの検体の添加により海馬神経細胞樹状突起（Dendride）の分岐数が有意に伸長しているかを検定した。
幼若（生後０日目）のＩＣＲマウス脳から海馬培養細胞を採取して培養皿にて培養した。
発達初期の細胞（培養１日目）に各検体を１回添加し、３日後（培養４日目）にＭＡＰ２抗体にて免疫染色し、樹状突起の分岐数を定量した。
測定は細胞体（ｓｏｍａ）を中心に１０μｍ間隔で２０μｍ〜１００μｍの同心円（図示せず）を描き、その円を交差する樹状突起の本数を計測した。

検定は、細胞体からの距離毎に計測した交差する樹状突起の本数を折線グラフ化し、折線グラフ下の面積（Area Under the Curve：ＡＵＣ）に対し、Student’s t-test, paired（ｔ−検定、両側分布）で行った。
例数が十分にある検体に対しては最大値と最小値を外して検定をした。添加する検体濃度はいずれも０．３μＭであった。
樹状突起が有意に伸長しているか否かの判定は、ｔ−値よりｐ−値を算出し、ｐ値がｐ＜０．０５では有意に伸長（効果＋＋）、０．０５＜ｐ＜０．２では遠位又は近位において伸長（効果＋）、ｐ＞０．２では有意差なし（効果±）とした。

図２２〜図２８はそれぞれ検体５〜１０を添加し、海馬神経細胞樹状突起（Dendride）の分岐数を定量検定した結果を示す図である。
ａは細胞体（ｓｏｍａ）からの距離に対する交差樹状突起の本数を、ｂは、ＡＵＣを比較した検定結果を示した図である。
また、実線は検体を添加した場合を、点線は検体の添加がなかった場合（control）を示している。なおｎは標本数である。
図から明らかなように、統計的に有意差が認められる（ｐ＜０．０５）のは検体７（III−２）と検体II（IV−２３）だけであるが、他の検体５(II−１３)、６（II−３１）、８（III−２）、９（IV−１０）、１０（IV−１５）、１１（IV−２３）についても突起伸長の効果が認められる。

次に、検体１（TND1128）を選び、β−ＮＭＮとの作用比較実験を行った。この実験では、マウス脳スライス標本を激しい脱分極刺激に暴露した場合の引き起こされる著しい細胞質内およびミトコンドリア内Ｃａ^２＋ 濃度の変動に対する抑制効果を比較、評価した。これは発明者等の予備実験において、検体１（TND1128）で２４時間処置した線虫においてSIRT１が有意に上昇する知見が得られたので、投与２４時間後においてβ−ＮＭＮでも同様な効果が得られるか比較するためである。

［実験方法］
脳スライス標本作成とカルシウム濃度計測：２４時間前に検体１を皮下投与したマウス（C57B/6NL）の全脳スライス（３００μｍ）を正中線で半切した全脳半切標本を用いた。この標本をＯ_２ ９５％、ＣＯ_２ ５％通気した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）内に室温で保存し、ミトコンドリアに選択的に取り込まれるXrhod-１／ＡＭ（Ｋｄ＝７００μＭ）、および細胞質に留まるｆｕｒａ−４Ｆ／ＡＭ（Ｋｄ＝７７０μＭ）で二重染色した。この標本を倒立型蛍光顕微鏡（Olympus IX71）のステージに装着したチェンバーに置き、黒色木綿片でカバーしさらに白金リングで固定して、Ｏ_２ ９５％、ＣＯ_２ ５％通気ＡＣＳＦで潅流した（７０ｍｌ／ｈｒ）。標本の蛍光画像を４倍の対物レンズで取得し、海馬腹側部と大脳皮質側頭部の画像を一画面に促えた。ミトコンドリア内カルシム濃度の計測には励起光５８０ｎｍにより生ずる赤色蛍光（＞６００ｎｍ）の強度変化を、細胞質のカルシウム計測には３６０ｎｍ励起と３８０ｎｍ励起による蛍光（＞５００ｎｍ）の比として求めた。計測部位（ＲＯＩ）は海馬ＣＡ１部位と大脳皮質の二カ所に置いた。

［薬物調整法と投与法］：
β−ＮＭＮは水に溶解して、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇを、検体１はアルコールに溶解し、１ｍｇ／ｍｌとし、これを水で希釈し、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇを標本作成２４時間前にマウスに皮下投与した（０．１ｍｌ／１０ｇ）。

［効力評価法］：
本試験では、二種の薬物の各濃度を投与したマウスから作成した脳標本を等張８０ｍＭ ＫＣｌ−ＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）に５分間暴露し、その後５分間正常ＡＣＳＦに戻す操作を三回連続で行うことで、標本に厳しいカルシウム負荷を与え、その際の、細胞質内とミトコンドリア内のカルシウム濃度の変動を計測した。

［実験結果］
ミトコンドリア内カルシウム濃度の変動に及ぼすβ−ＮＭＮと検体１(TND1128)の作用
図２９は、β−ＮＭＮ（Ａ：０(control)（ｎ＝６）、Ｂ：１０（ｎ＝５）、Ｃ：３０（ｎ＝５）およびＤ：１００ｍｇ／ｋｇ(ｎ＝５)）を皮下投与されたマウスから２４時間後に作成した標本を８０Ｋ ＡＣＳＦに三回暴露した時のミトコンドリアにおけるＣａ^２＋濃度変動を示している。図３０は同様に８０Ｋ ＡＣＳＦ暴露時の検体１(TND1128）（Ａ：０(control）（ｎ＝６）、Ｂ：0.０１（ｎ＝５）、Ｃ：０．１（ｎ＝５）およびＤ：１．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）s.c.）投与マウスの脳標本におけるミトコンドリアのカルシウム濃度の変動を示す。両薬物のそれぞれの用量で処置された個体から得た標本の反応は第一回目の８０Ｋ投与時点の蛍光強度を基準として標準化(normalize）し、細胞質またはミトコンドリア内Ｃａ^２＋ 濃度の時間平均値とその標準誤差を示している。この図２９と図３０から両薬物は用いた用量範囲でミトコンドリア内Ｃａ^２＋ 上昇を用量依存性に抑制していることは明らかである。

図３１および図３２はそれぞれ、β−ＮＭＮと検体１(TND1128）の各濃度の作用を定量化した結果である。図３１および図３２のＡは投与時実験開始５分後から８０Ｋ−ＡＣＳＦに三回暴露し、５分洗浄した時点３５分までのミトコンドリア内カルシウム濃度の大きさを、ＡＵＣ（Area under the curve）として計算した結果である（図３７参照）。ＢとＣはそれぞれ、大脳皮質（ＣＴＸ）と海馬（ＣＡ１）における８０Ｋ投与５分間とその後の洗浄５分間（１st：５分から１５分、２nd：１５分から２５分、３rd：２５分から３５分）それぞれに対する薬物作用を示している（図３７参照）。有意差検定はＴｕｋｅｙ法を用いた。検討した用量範囲でβ−ＮＭＮとTND1128 の用量反応関係が見られた。

［細胞質内カルシウム濃度の変動に及ぼすβ−ＮＭＮと検体１(TND1128）の作用］
図３３および図３４は８０ＫＡＣＳＦ三連続投与時の細胞質内カルシウム変動に及ぼすβ−ＮＭＮおよび検体１(TND1128）の作用を示す。図３３と図３４に示したコントロール反応は８０Ｋ−ＡＣＳＦ投与毎の反応の回復が小さく、一見、カルシウム指示薬の反応が頭打ちになっている様に見えるが、この試験に用いた細胞内カルシウム濃度指示薬ｆｕｒａ−４ＦはＣａ^２＋キレート能（Ｋｄ）は７７０ｎＭであり、予想される細胞内カルシウム濃度の激しい上昇にも十分対応できると考えられるので、対照群の細胞内Ｃａ^２＋ の動きは細胞質膜のＣａ^２＋ ポンプの機能限界に達していることを示すものと考えることができる。β−ＮＭＮの３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ処置されたマウスから得られた標本、また、検体１(TND1128）の０．０１ｍｇ／ｋｇから１．０ｍｇ／ｋｇ処置マウスの標本では投与毎の細胞質内カルシウム濃度の変動に同様な回復が見られている。しかし、図３５および図３６に見られる様に、この値をミトコンドリアと同様な方法で定量化した場合、β−ＮＭＮの１０ｍｇ／ｋｇ投与群以外の濃度で有意な差はみられなかった。

［有効濃度から見た両薬物の作用様式］
両薬物はほぼ同程度のミトコンドリア内 Ｃａ^２＋ 濃度制御作用を示すが、有効濃度からその作用は検体１(TND1128）の方が１００倍強力であった。非特許文献６ではβ−ＮＭＮ投与後、ＮＡＤ^＋ が３０分後にはピークに達し、投与されたＮＭＮの血中濃度はそれに対応して減少すると報告しており、投与されたＮＭＮがＮＡＤ^＋ 生合成の基質になっている可能性を示している。しかし、本実験で用いた検体１（TND1128）有効量は１．０ｍｇ／ｋｇ以下の微量であり、これをβ−ＮＭＮと同じように生合成の原料と考えることはできない。最終的にミトコンドリアの酸化的エネルギー獲得過程でのＮＡＤ^＋ の生合成量が増えているとしても、投与後２４時間後に見られた有意なミトコンドリア機能安定作用はサーチュイン遺伝子群の発現促進によるＮＡＤ^＋ 増加によるものと考えるべきであろう。本研究では２４時間前に投与したβ−ＮＭＮで有意なミトコンドリア保護機能が見られたことから、β−ＮＭＮの作用も単純にＮＡＤ^＋ の基質として供給された結果ではなく、サーチュイン遺伝子群への作用を介したものと考えるべきであろう。

一方、細胞質内Ｃａ^２＋ 濃度の８０Ｋ−ＡＣＳＦによる激しい上昇に対する作用についてはβ−ＮＭＮおよび検体１(TND1128）共に有意な作用を示さなかった。図２９と図３０に示すβ−ＮＭＮ１００ｍｇ／ｋｇと検体１（TND1128）１ｍｇ／ｋｇのミトコンドリア内Ｃａ^２＋濃度変動に対する作用と、図３３と図３４に示すβ−ＮＭＮおよび検体１（TND1128）の細胞質内Ｃａ^２＋ 濃度変動に対する作用から、この標本では８０Ｋ−ＡＣＳＦの激しい刺激にもかかわらず、極めて安定した生理学的反応を維持ができる状態であることを示している。これがヒトの脳で再現できれば、強力な脳保護作用を期待することができる。
すでに赤ワインの成分であるresveratrolやその誘導体としてSRT1720などの合成サーチュイン活性化薬物の薬理作用が報告されているが（非特許文献８）、実際に本実験のように皮下投与されたマウス脳のミトコンドリア機能に対する有効性を言及した報告はない。

以上から明らかなように、検体１（TND1128）は疎水性が高く、極めて安定な化合物であることが、β−ＮＭＮを凌ぐさらに大きな利点である。
この利点を利用して、外用薬を調整し、衰えた毛根を活性化して、白髪や禿げの治療に、また、たるんだ皮膚細胞の若返りにも使用可能と思われる。さらに、経皮吸収によって脳への作用も期待できるのではないかと思われる。

上述の実験結果を踏まえると、式（Ｉ）〜（IV）で表わされる５−デアザフラビン化合物は細胞内でのＡＴＰ産生を賦活しているといえる。

Claims (4)

1. 式（Ｉ）で表わされる５−デアザフラビン化合物を有効成分とするＡＴＰ産生賦活剤
   

   

   （式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ_３及びＲ_４は、水素原子、低級アルキル基、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、低級アルコキシ基、フェニル置換低級アルコキシ、低級アルキルアミノ基、フェニル置換低級アルキルアミノ基、又は低級アルキルスルホニル基を表す。）
2. 式（II）で表わされるピリドジピリミジン化合物を有効成分とするＡＴＰ産生賦活剤
   

   

   （式中、Ｒ_１及びＲ３は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
3. 式(III）で表わされるデアザフラビノテストステロン化合物を有効成分とするＡＴＰ産生賦活剤
   

   

   （式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）
4. 式（IV）で表わされるデアザフラビノコレステロール化合物を有効成分とするＡＴＰ産生賦活剤
   

   

   （式中、Ｒ_１は、水素原子、アルキル基、ハロゲン置換アルキル基、カルボキシ置換アルキル基、又はフェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基を表し、Ｒ_２は、アルキル基、シクロアルキル基、フェニル置換低級アルキル基、フェニル基、ハロゲン原子若しくは低級アルキル基若しくは低級アルコキシ基のうちの一つで置換されたフェニル基、低級アルキルジ置換フェニル基を表す。）

Images