CN109528697B

CN109528697B - (1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用

Info

Publication number: CN109528697B
Application number: CN201811563224.8A
Authority: CN
Inventors: 刘健康; 崔玉婷; 冯智辉; 曹瑞军; 黄娜
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN109528697A

Abstract

(1,2,3‑三甲氧基苯)‑丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用，通过提高线粒体膜电势和线粒体有氧代谢能力，增强线粒体功能，激活二相酶系统，上调二相酶基因表达，清除线粒体活性氧，(1,2,3‑三甲氧基苯)‑丙烯酮作为一种靶向线粒体的抗氧化剂，可通过调控PI3K/Akt信号通路，恢复谷氨酸所造成的线粒体功能损伤和氧化应激，发挥抗氧化和保护线粒体功能，恢复谷氨酸所引起的氧化应激和线粒体损伤，从而预防由谷氨酸引起的神经毒性所造成的急慢性脑损伤的发生和发展。

Description

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物学及医药学领域，特别涉及(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用。

背景技术

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中丰富且重要的兴奋性神经递质。在正常生理条件下，谷氨酸可以调控神经元和神经胶质细胞的多种重要的生理功能，包括突触传递，突触可塑性，突触之间的相互作用，非突触神经传递，神经元存活，以及胶质细胞的递质释放。虽然，谷氨酸引起的神经兴奋对大脑的结构和功能起着至关重要的作用，但突触间隙内过量的谷氨酸可以引起兴奋性神经毒性，导致神经元死亡，进而引发多种中枢神经系统疾病和精神疾病，例如中风，创伤性脑损伤，癫痫，神经退行性疾病，糖尿病，神经源性疼痛，以及精神分裂症，抑郁，强迫症，焦虑症等等。

过去20年来，调节谷氨酸受体通路已迅速成为中枢神经系统疾病和精神疾病药物开发的关键靶点。目前，已经有许多种类的谷氨酸受体拮抗剂已经投入临床使用。但是，虽然NMDA受体拮抗剂或AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂可以通过抑制谷氨酸诱导的Ca²⁺内流保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性的侵害，但这种保护作用的持续时间在体内受到严格限制，这大大降低了谷氨酸受体拮抗剂的临床效果。此外，由于高氧耗率和有限的抗氧化能力，人类大脑相比于身体其他器官更容易受到氧化损伤的侵害。因此，我们应将今后的研究重点从Ca²⁺过载引起的神经兴奋性毒性转移到谷氨酸引起的氧化应激神经毒性。

在突触后膜上，除了谷氨酸离子型受体和代谢性受体之外，还有一类特殊的逆转运体，它是谷氨酸/胱氨酸逆转运体。生理状态下，释放1分子谷氨酸，摄取1分子胱氨酸，二者偶联运转。而细胞内摄入的胱氨酸可还原成半胱氨酸，参与谷胱甘肽的合成。突触间隙内过量的谷氨酸会抑制胱氨酸摄入，从而降低谷胱甘肽的生物合成。作为细胞内重要的抗氧化物酶，谷胱甘肽的含量的减少极大地削弱细胞内抗氧化系统，促进细胞内活性氧的积累，引起氧化应激。细胞内活性氧的增加会激活12-脂氧合酶，其代谢产物会进一步激活s-鸟苷酸环化酶。活化的s-鸟苷酸环化酶通过将更多GTP催化成c-GMP并通过激活c-GMP依赖性Ca²⁺通道而增加Ca²⁺内流。细胞内过量的活性氧和Ca²⁺会促进tBid易位至线粒体，导致线粒体功能损伤和线粒体膜通透化，引起ATP的快速损失和细胞色素c的释放，使AIF入核并诱导DNA片段化，最终导致细胞死亡。

发明内容

本发明解决的问题在于提供(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善兴奋性神经毒性的药物中的应用，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮能有效提高线粒体功能，通过上调二相酶基因的表达，清除线粒体活性氧，发挥抗氧化活性；(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮作为一种靶向线粒体的抗氧化剂，可通过调控PI3K/Akt信号通路，恢复谷氨酸引起的线粒体损伤和氧化应激，明显改善谷氨酸造成的神经毒性，保护神经功能，通过抗氧化和保护线粒体功能来预防及干预急慢性脑损伤的发生和发展。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用，其结构式为：

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮通过提高线粒体膜电势和线粒体有氧代谢能力，增强线粒体功能的药物。

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是激活二相酶系统，上调二相酶基因表达，清除线粒体活性氧，具有抗氧化功能的药物。

1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是抑制谷氨酸造成的神经毒性，具有神经保护功能的药物。

1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是通过调控PI3K/Akt信号通路，恢复谷氨酸所造成的线粒体功能损伤和氧化应激，从而抑制神经毒性的药物。

1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是在制备预防及干预由神经毒性所引起的急慢性脑损伤的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞和人神经母细胞瘤细胞无毒副作用，本发明首次发现一种新合成的靶向线粒体的抗氧化剂，揭示了(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可明显地抑制谷氨酸造成的神经毒性，具有显著的神经保护功能，阐述了(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮通过抗氧化和提高线粒体功能来预防由神经毒性引起的急慢性脑损伤的发生和发展，该药物具有很好的应用前景。

本发明围绕查尔酮进行大量的结构修饰工作，新合成的查尔酮类似物相比于其他合成化合物，具有最强的生物活性和较低的毒副作用。它就是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮(Tak，(1,2,3-trimethylbenzene)-acrylketone)，研究表明，增加查尔酮类化合物苯环上的带电基团、甲氧基团或羟基团，可以大大提高细胞内合成谷胱甘肽的能力。而组成型和诱导型谷胱甘肽的生物合成与Nrf2的转录活性密切相关，这说明苯环上的带电基团还可增加Nrf2转录活性。(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮的每个苯环上修饰着三个甲氧基团，由此推测(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮应该具有较强的促进Nrf2转录和谷胱甘肽合成的抗氧化活性。

附图说明

图1是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮的结构式。

图2是用来表示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞和人神经母细胞瘤细胞无毒副作用。其中，图2A是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞活性的影响；图2B是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对人神经母细胞瘤细胞活性的影响；图2C和2D是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞细胞周期影响，图2C是流式细胞仪检测细胞周期的结果图，图2D是流式细胞仪检测细胞周期的统计图。图2A，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理小鼠海马神经元细胞12或24h。图2B，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理人神经母细胞瘤细胞12或24h。图2C～图2D，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理小鼠海马神经元细胞12h。

图3是用来表示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可提高线粒体功能。其中，图3A是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞线粒体膜电势的影响；图3B是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对人神经母细胞瘤细胞线粒体膜电势的影响；图3C是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞线粒体呼吸耗氧的影响。图3A，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理小鼠海马神经元细胞12或24h。图3B，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理人神经母细胞瘤细胞12或24h。图3C，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理小鼠海马神经元细胞12h。

图4是用来表示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是一种靶向线粒体的抗氧化剂。其中，图4A是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞中活性氧影响的柱状统计图；图4B是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞中线粒体活性氧影响的荧光示意图。图4A～图4B，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理小鼠海马神经元细胞12h。

图5是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可以提高二相酶基因的表达。其中，图5A～图5G是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞中catalase、NQO-1、GCLc、GCLm、SOD1、SOD2和HO-1的mRNA水平影响的柱状示意图。图5A～图5G，用0.1、1、5、10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理小鼠海马神经元细胞12h。

图6是用来表示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸诱导小鼠海马神经元细胞神经毒性的抑制作用。其中，图6A是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸引起的小鼠海马神经元细胞形态改变的保护作用；图6B是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸引起的小鼠海马神经元细胞活力降低的保护作用的柱状统计图；图6C是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮恢复谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞线粒体膜电位降低的柱状统计图；图6D是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮抑制谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞凋亡的流式图。图6A、6B、6C、6D，用5μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮预处理小鼠海马神经元细胞12h，再用8mM的谷氨酸处理小鼠海马神经元细胞12h。

图7是用来表示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮通过激活PI3K/Akt信号通路抑制谷氨酸诱导小鼠海马神经元细胞神经毒性。图7A和7B是(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸作用下的小鼠海马神经元细胞中p-Akt、Akt、p-Erk1/2、Erk1/2、p-p38、p38蛋白表达的影响，图7A是蛋白免疫印迹示意图，图7B是蛋白免疫印迹统计图；图7C是PI3K/Akt的抑制剂LY294002抑制(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞神经毒性的保护作用(流式细胞仪检测凋亡的散点图)；图7D是LY294002削弱(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞线粒体膜通透化和线粒体活性氧过量产生的抑制作用，图7D是线粒体膜电势的柱状统计图，图7E是线粒体活性氧的柱状统计图。图7A～图7B，用5μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮预处理小鼠海马神经元细胞12h，再用8mM的谷氨酸处理小鼠海马神经元细胞12h。图7C～图7E，先用10μM的LY294002预处理小鼠海马神经元细胞30min，再用5μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮预处理小鼠海马神经元细胞12h，最后用8mM的谷氨酸处理小鼠海马神经元细胞12h。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

1.实验材料

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮((1,2,3-trimethylbenzene)-acrylketone)是，；谷氨酸、MTT、JC-1、LY294002、DCFH-DA购买于sigma公司；TRIzol试剂购买于Invitrogen公司；RNA逆转录试剂盒和SYBR荧光染料从大连宝生物公司购买。RNA引物序列从西安擎科泽西生物有限公司订购合成；Hoechst试剂盒和IP裂解液购买于碧云天；凋亡试剂盒购买于BD生物公司；针对catalase、NQO-1、SOD1、SOD2、HO-1的一抗购买于Santa Cruz公司；针对p-Akt、Akt、p-p38、p38、p-Erk1/2、Erk1/2的一抗购买于Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶偶联的针对鼠、兔、山羊的二抗购买于杰克逊免疫实验室(JacksonImmunoResearch Laboratories)。

2.实验细胞培养及模型建立

小鼠海马神经元细胞(Mouse Hippocampal Neuron Cells,HT22)来源于第二军医大学，人神经母细胞瘤细胞(Human Neuroblastoma Cell，SH-SY5Y)来源于中国科学研究院。细胞培养于含有95％空气和5％CO₂的37℃恒温、湿润、无菌培养箱中。细胞培养在含有10％牛血清的高糖DMEM培养基中。所有实验使用第四代到第八代的细胞。

3.实验方法

(1)MTT检测

经药物处理的细胞，在细胞培养箱培养到相应的时间后，吸出原有的培养基，加入含有0.5mg/ml MTT的无血清培养基，在培养箱中孵育4h后，用PBS清洗一遍，再加入DMSO溶解，在490nm的波长下检测其吸光值。

(2)线粒体膜电势检测

经药物处理的细胞，在细胞培养箱培养到相应的时间后，吸出原有的培养基，加入含有5μg/ml JC-1的无血清培养基，在培养基中孵育1h后，用PBS清洗一遍，在485/535nm和485/590nm的波长下检测其荧光强度。

(3)活性氧的检测

经药物处理的细胞，在细胞培养箱培养到相应的时间后，吸出原有的培养基，加入含有5DCFH-DA探针的无血清培养基，在培养基中孵育30min后，用PBS清洗两遍，加入200μL的细胞裂解液，用细胞刮刮取细胞，振荡15s，冰浴10min，如此反复三次，4℃，13000g离心10min，取上清，在485/590nm的波长下检测其荧光强度。

(4)线粒体活性氧的检测

经药物处理的细胞，在细胞培养箱培养到相应的时间后，吸出原有的培养基，加入含有MitoSOX探针的无血清培养基，在培养基中孵育30min后，用无血清培养基清洗两遍，再加入含有TitoTracker Green探针的无血清培养基，在培养基中孵育30min后，用无血清培养基清洗两遍，在荧光共聚焦显微镜下观察细胞并照相。

(5)细胞凋亡的检测

用PE/Annexin V细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡

12孔板培养细胞，经药物处理的细胞，在细胞培养箱培养到相应的时间后，吸出原有的培养基，收集到15mL离心管，PBS洗细胞一次，收集PBS到相同的离心管，再收集细胞悬液收集到相同离心管中。4℃2000rpm离心5min，用1mL PBS清洗细胞一次，4℃2000rpm离心5min，吸弃PBS，加入100μL 1X binding buffer重悬细胞，加入5μL Annexin-FITC，轻缓吹打细胞以混匀，再加入5μL PE，轻缓吹打细胞以混匀。在室温下避光孵育15min，再加入400μL 1X Binding buffer，轻缓吹打细胞以混匀，然后用流式细胞仪检测。

(6)细胞周期的检测

12孔板培养细胞，经药物处理的细胞，在细胞培养箱培养到相应的时间后，吸出原有的培养基，收集到15mL离心管，PBS洗细胞一次，收集PBS到相同的离心管，再收集细胞悬液收集到相同离心管中。4℃2000rpm离心5min，用1mL PBS清洗细胞一次，4℃2000rpm离心5min，吸弃PBS，加入500μL PBS重悬细胞，将细胞悬液滴加到正在涡旋中的-20℃的4.5mL的70％乙醇中，置于-20℃固定至少2h。之后，4000rpm离心8min，用1mL PBS清洗细胞一次，加入500μL PI染液，在室温下染30min，然后用流式细胞仪检测。

(7)mRNA含量检测

采用逆转录RNA-实时荧光定量PCR的方法进行检测。具体方法如下：

1)RNA提取

12孔细胞培养板，每孔加入500μL的TRIzol试剂，室温，摇床5min，加入100μl氯仿(1/5总体积)抽提蛋白，剧烈混匀15s，室温放置15min后，13,000g,4℃,离心20分钟。将上层水相转移至另一RNase-Free EP管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置15min后，13,000g,4℃,离心20min，弃上清。加入500μL预冷的75％乙醇，颠倒混匀，13,000g,4℃，离心10min。弃上清，使乙醇挥发完全挥发掉，溶于10-20μl DEPC水中。用紫外分光光度计检测测定其浓度，用于反转录。

2)RNA反转录

转录体积为20μl，取出500ng RNA，加入4μl的5X Master Mix，用DEPC水补充至20μl体积，37℃孵育60min，80℃作用15s。置于-20℃备用。

3)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

用SYBR Green法进行，反应体系包括1μl cDNA，5μl

Premix Ex Taq^TMII，0.5μl上下游引物混合液(10μM)，加灭菌水至10μl。反应条件依照说明书，95℃解链10min，进行40个循环PCR(每个循环包括95℃30s，55℃30s，72℃20s)，最后观测融解曲线(95℃15s，60℃15s，95℃15s)。β-actin作为内参，实验所用的引物序列为：

catalase:

forward：5’-AGCGACCAGATGAAGCAGTG-3’

reverse：5’-TCCGCTCTCTGTCAAAGTGTG-3’

NQO-1:

forward：5’-AGGATGGGAGGTACTCGAATC-3’

reverse：5’-AGGCGTCCTTCCTTATATGCTA-3’

GCLc:

forward：5’-CTACCACGCAGTCAAGGACC-3’

reverse：5’-CCTCCATTCAGTAACAACTGGAC-3’

GCLm:

forward：5’-AGGAGCTTCGGGACTGTATCC-3’

reverse：5’-GGGACATGGTGCATTCCAAAA-3’

SOD1:

forward：5’-AACCAGTTGTGTTGTCAGGAC-3’

reverse：5’-CCACCATGTTTCTTAGAGTGAGG-3’

SOD2:

forward：5’-CAGACCTGCCTTACGACTATGG-3’

reverse：5’-CTCGGTGGCGTTGAGATTGTT-3’

HO-1:

forward：5’-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3’

reverse：5’-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3’

β-actin:

forward:5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3'

reverse:5'-AGATGGGCACAGTGTGGGT-3’

(8)蛋白检测

1)蛋白提取

6孔细胞培养板，每孔加入100μL的IP裂解液，用细胞刮刮取细胞，振荡15s，冰浴10min，如此反复三次，保证冰浴时间至少在30min以上，4℃，13000g离心10min，取上清，用BCA方法进行蛋白定量，调平，加入5X loading buffer和巯基乙醇，煮沸10min，使蛋白变性，-80℃保存，待用。

2)Western blot

利用10％的丙烯酰胺凝胶进行跑胶，蛋白上样量为20μg，利用PVDF膜转印，后封闭，孵育一抗，4℃过夜，清洗一抗，孵育二抗，室温1h，清洗二抗，进行化学发光。

(9)统计分析

结果以Mean±S.E.M形式表示，数据分析使用One Way-ANOVA分析方法，显著统计学意义为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

实施例一

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞和人神经母细胞瘤细胞无毒副作用

用(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮作用于小鼠海马神经元细胞和人神经母细胞瘤细胞12h或24h，检测细胞活力。图2A和图2B显示浓度低于5μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对小鼠海马神经元细胞活力没有影响，浓度超过5μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可轻微降低小鼠海马神经元细胞活力，但(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮不影响人神经母细胞瘤细胞活力。从细胞周期的结果图2C和图2D可看出，高浓度的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可使小鼠海马神经元细胞周期阻滞在S期，从而抑制细胞增殖，导致细胞活力降低。

实施例二

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可提高线粒体功能

用(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮作用于小鼠海马神经元细胞和人神经母细胞瘤细胞12h或24h，检测线粒体膜电势。图3A和3B表明，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可显著提高小鼠海马神经元细胞和人神经母细胞瘤细胞的线粒体膜电势。图3C是经过(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理的小鼠海马神经元细胞中线粒体呼吸耗氧率的结果图，线粒体呼吸耗氧率代表线粒体进行有氧代谢的能力。如图3C所示，相比于对照，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮处理组的基础氧耗、用于ATP合成的氧化磷酸化耗氧、最大的呼吸耗氧和非线粒体呼吸耗氧都发生显著上升，提示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可提高线粒体有氧代谢能力。

实施例三

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可是一种靶向线粒体的抗氧化剂

细胞内的活性氧主要是由线粒体呼吸链以及NADPH氧化酶和过氧化物酶产生。作为活性氧产生的主要位点，有氧代谢能力高的线粒体会产生更多的活性氧。因此利用活性氧探针DCFH-DA和线粒体活性氧探针MitoSOX，检测(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮清除活性氧的能力。图4A表明，相比于对照，5μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可显著降低细胞内的活性氧水平，提示其具有抗氧化功效。同时，图4B表明，相比于对照，红色荧光强度的减弱证明(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可明显清除细胞内的线粒体活性氧水平，提示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是一种靶向清除线粒体活性氧的的抗氧化剂。

实施例四

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可以提高二相酶基因表达

二相酶系统参与调节细胞内的抗氧化反应，上游的Nrf2入核与启动子结合后，激活二相酶基因的表达。用(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮作用于小鼠海马神经元细胞12h，检测二相酶mRNA表达水平。图5A～图5G表明，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可显著提高过氧化氢酶(catalase)、NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO-1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLc)、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基(GCLm)、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、锰超氧化物歧化酶(SOD2)和血红素氧化酶(HO-1)的mRNA表达水平，激活二相酶系统。值得一提的是，相比于对照，10μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可使血红素氧化酶的mRNA表达水平提高大约40倍，提示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮通过激活二相酶系统发挥抗氧化功效。

实施例五

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可抑制谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞神经毒性

突触间隙内过量的谷氨酸可通过阻滞胱氨酸的摄入，降低谷胱甘肽的生物合成，从而削弱细胞内抗氧化系统，导致氧化应激和线粒体功能损伤，引起神经细胞死亡。图6A显示5μM的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可显著恢复谷氨酸引起的小鼠海马神经元细胞形态上的改变。图6B显示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可显著恢复谷氨酸引起的小鼠海马神经元细胞活力上的降低。图6C显示(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可显著恢复谷氨酸引起的小鼠海马神经元细胞线粒体膜电位的降低。如图6D所示谷氨酸可显著增加小鼠海马神经元细胞的早期和晚期凋亡细胞数，而(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮的预处理会显著抑制谷氨酸引起的早期和晚期凋亡细胞数的增加，从而抑制谷氨酸造成的细胞凋亡。

实施例六

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮通过激活PI3K/Akt信号通路抑制谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞神经毒性

PI3K/Akt信号通路是由磷脂酰肌醇-3羟基激酶(PI3K)始动的生物信号传导通路，PKA和PKC相关的蛋白激酶(Rac)Akt处于这一通路的中心环节，其功能涉及细胞增殖、周期调控、凋亡的启动、血管生成和细胞侵袭等诸多方面。更为重要的是，PI3K/Akt信号通路是经典的细胞存活通路，它可保护神经元细胞存活。从图7A和图7B可看出，相比于对照，谷氨酸可显著抑制Akt和Erk的磷酸化，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮的预处理会明显恢复Akt的磷酸化水平，而ERK的磷酸化水平只有轻微的上调。因此，推测PI3K/Akt可能参与(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸诱导的神经毒性的保护作用。接着，PI3K/Akt的抑制剂LY294002被利用去验证PI3K/Akt信号通路在其中的作用。图7C显示，LY294002可显著削弱(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元细胞活力的降低与早晚期凋亡细胞数增加的抑制作用，表明(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可通过激活PI3K/Akt信号通路抑制谷氨酸引起的小鼠海马神经元细胞神经毒性。而从图7D和图7E可看出，LY294002可显著削弱(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮对谷氨酸引起的活性氧含量增加和线粒体膜电势崩溃的抑制作用。

通过以上实验结果证明(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮可通过激活PI3K/Akt信号通路，提高抗氧化和线粒体有氧代谢能力，抑制谷氨酸引起的小鼠海马神经元细胞神经毒性，从而发挥神经保护功能。可进行以下应用：

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用。

进一步的，所述的药物是提高线粒体呼吸功能的药物。

所述的药物是可提高线粒体膜电势和线粒体有氧代谢能力。

进一步的，所述的药物是一种靶向清除线粒体活性氧的抗氧化药物。

所述的药物不仅可以清除细胞内的活性氧，还可以靶向清除由线粒体呼吸链的电子漏所产生的活性氧。

进一步的，所述的药物是激活二相酶系统，提高二相酶基因表达的药物。

所述的药物可提高二相酶基因的表达，从而发挥抗氧化功效。

进一步的，所述的药物是对谷氨酸造成的神经细胞毒性反应有保护作用的药物。

所述的药物可抑制谷氨酸所造成的细胞活力降低和细胞凋亡数增加。

进一步的，所述的药物是对谷氨酸造成的神经细胞毒性反应所引起的氧化应激和线粒体损伤有保护作用的药物。

所述的药物可通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制谷氨酸引起的活性氧产生和线粒体膜电势崩溃，从而保护细胞免受神经毒性的侵害。

虽然谷氨酸作为一种重要的兴奋性神经递质在突触内发挥着重要生理功能，但过量的谷氨酸会损伤突触后膜上的谷氨酸/胱氨酸逆转运体，导致谷胱甘肽合成降低，引发氧化应激，进而损伤线粒体功能，导致细胞凋亡。而(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在以上神经细胞损伤实验中表现出很好的保护神经细胞以及抑制氧化应激和线粒体损伤的特性。由此，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在预防由谷氨酸引起神经毒性所造成的急慢性脑损伤等疾病有很好的应用前景，以及为预防急慢性脑损伤开辟新的医药途径。

可进行以下应用：

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备防治急慢性脑损伤的药物中的应用。

所述的药物是治疗谷氨酸引起的神经毒性的药物。

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备预防谷氨酸引起的神经毒性而引起的急慢性脑损伤发生和发展的药物或保健品中的应用。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用，其特征在于，其结构式为：

(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是抑制谷氨酸造成的神经毒性，具有神经保护功能的药物。

2.根据权利要求1所述的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用，其特征在于，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是通过提高线粒体膜电势和线粒体有氧代谢能力，增强线粒体功能的药物。

3.根据权利要求1所述的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用，其特征在于，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是激活二相酶系统，上调二相酶基因表达，清除线粒体活性氧，具有抗氧化功能的药物。

4.根据权利要求1所述的(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮在制备改善谷氨酸引起的神经毒性的药物中的应用，其特征在于，(1,2,3-三甲氧基苯)-丙烯酮是通过调控PI3K/Akt信号通路，恢复谷氨酸所造成的线粒体功能损伤和氧化应激，从而抑制神经毒性的药物。