WO2019088666A2 - 안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도 - Google Patents

안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for quantitative analysis of nucleic acids (DNA and RNA) with high accuracy and reliability, and more specifically, to a method for quantitatively analyzing stable isotope labeled nucleic acids (DNA or RNA) SILD ') as an internal standard for nucleic acid quantitative analysis.
  • Genetic analysis involves amplifying a specific gene by PCR and sequencing techniques and analyzing the base sequence. Genetic analysis is used in medical fields such as disease diagnosis, mutation detection, detection of pathogenic bacteria and viruses; Food and hygiene sectors such as the detection of genetically modified agricultural products, the determination of the origin of foodstuffs, and the detection of microorganisms contaminated with foodstuffs; Analysis of microbial communities, analysis of toxicity to organisms, environmental conservation such as biodiversity conservation; It has been widely used in the forensic field such as paternity discrimination, individual identification, and identification of criminal suspects.
  • NGS next generation sequencing
  • the amount of circulating nucleic acid in the blood is 20-100 ng / ml in the normal state, and 200-500 ng / ml in the cases of cancer such as breast cancer and blood cancer. It has been reported that the amount of circulating nucleic acid varies not only in cancer, but also in myocardial infarction, infection, acute inflammation, excessive exercise and stress. In other words, simply measuring the amount of blood circulating nucleic acid opens up the possibility of early diagnosis of major diseases. For this, accurate and reliable quantitative analysis of circulating nucleic acids is needed.
  • nucleic acid quantification method UV spectrometry, quantitative nucleic acid amplification (qPCR), digital nucleic acid amplification (digital PCR) and fluorescence quantification are widely used. Because these assays are interrupted by other components present in the sample or medium, accurate quantitation of nucleic acids can not be analyzed without purification. However, quantitative methods with high accuracy and reliability for nucleic acids in complex media have not been proposed yet.
  • Patent Document 1 relates to a method for quantifying a nucleic acid, comprising the steps of adding to the sample a different amount of various nucleic acid constructs which can be distinguished from nucleic acid as an analyte in a sample and which can be simultaneously amplified with the nucleic acid; Treating the sample with a nucleic acid amplification procedure using an amplification reagent capable of reacting with the nucleic acid and nucleic acid constructs of the analyte; And calculating the amount of nucleic acid as an analyte from the relative amounts.
  • Each nucleic acid construct is different; Nucleic acid constructs can be distinguished from one another and nucleic acids, which are the analyte.
  • the nucleic acid construct is similar to the nucleic acid construct in that it can be reacted with the same amplification reagent and the nucleic acid as the analyte.
  • the above-mentioned method can not be used because the various nucleic acid constructs used for preparing the calibration curves can be continuously varied depending on the nucleic acid to be analyzed, and there is a premise that the nucleic acid construct must be amplified at the same rate as the analyte It is not a quantitative analysis method.
  • Patent Document 2 relates to the use of a universal reference nucleic acid to generate a calibration curve capable of calculating the characteristic level of a target nucleic acid in a sample.
  • Patent Document 2 relates to a method of introducing and quantifying a universal reference nucleic acid labeled with a known amount of fluorescent end.
  • the error is basically inherent in that there is a premise that the nucleic acid used in the calibration curve should also be amplified at the same rate.
  • the present invention provides a method for quantitatively analyzing a nucleic acid present in a sample or a complex medium without amplification of the target nucleic acid.
  • the present invention relates to a nucleic acid quantitative analysis method using SILD as an internal standard as a method for increasing the accuracy and reliability of quantitative analysis of nucleic acids (DNA and RNA) in a sample.
  • nucleic acid extraction or purification processes are required to accurately quantitate nucleic acids present in samples or complex media.
  • the yield of nucleic acid extraction and purification is highly variable due to the purification principle, the kit used and the characteristics of the sample. Therefore, efficient normalization of nucleic acid extraction and purification yields is a prerequisite for accurate nucleic acid quantitation based on raw samples.
  • the present invention relates to a method of using SILD as an internal standard material to correct the yield in nucleic acid purification and pretreatment.
  • nucleic acid extraction and purification In order to indirectly correct the yield of nucleic acid extraction and purification, a method of extracting and purifying a gene by adding a known amount of a specific gene to a sample as an internal standard and then measuring the amount of the gene after extraction and purification A method of calculating the yield is also used.
  • the nucleic acid which is inserted into the internal standard material at a variable size of the nucleic acid to be purified has a single size, and since the efficiency of nucleic acid extraction is greatly influenced by the size of the nucleic acid, There are disadvantages.
  • a nucleic acid having an identical size and a known amount is used as an external reference material, and a separate extraction, purification reaction and quantitative analysis are performed to estimate the yield according to the kit and the experimenter There is also a way.
  • this method can not be regarded as a perfect efficiency correction method because fundamentally, the yield of nucleic acid purification may vary from one individual vessel to another, and depending on the medium type of the sample. Therefore, in order to overcome such disadvantages of the conventional methods, a method of correcting the purification efficiency of the whole nucleic acid while using it as an internal standard material has been invented and reached to the present invention.
  • the present invention utilizes SILD as an internal standard substance as a method of correcting the yield of nucleic acid extraction and purification.
  • SILD has the same chemical and biological properties as the normal nucleic acid to be analyzed, but the molecular weights are differentiated by stable isotopes ( 13 C, 15 N). These molecular weight differences can be detected and quantified as different charge-to-mass ratios (m / z) in a mass spectrometer as a final analysis instrument. That is, the amount of the normal nucleic acid calculated from each sample and the amount of the internal standard nucleic acid can be simultaneously and separately quantified.
  • the signal value of the internal standard substance is the same as that of the reaction efficiency of the analyte Scale.
  • isotope dilution mass spectrometry which is the method used in the quantitative analysis of the material.
  • isotope dilution mass spectrometry requires the preparation of an internal reference material that is isotopically substituted for the analyte. Analytical chemistry is relatively easy to prepare internal standard materials substituted with isotopes because of the small molecular weight and simple structure, and commercial reagent companies can purchase them.
  • the molecular weight is very large (usually 10 kb in length for a dielectric nucleic acid, 7 MDa in a molecular weight, 150 bp in a circulating nucleic acid in blood, and 100 kDa in molecular weight) It is not easy.
  • a method of labeling whole nucleic acid with stable isotope was developed by culturing E. coli in a medium supplemented with minimal medium consisting of inorganic elements only and isotope-substituted ammonium sulfate and glycerol have.
  • E. coli genomic nucleic acid labeled with stable isotope was produced in consideration of such a technique, and this nucleic acid was used as an internal standard for nucleic acid analysis in the medium.
  • SILD used as an internal reference material is added at the beginning of the analysis to the sample to be analyzed and the sample to be compared (control or reference material). Since SILD substituted with stable isotopes such as 13 C and 15 N has chemically the same characteristics as the nucleic acid to be analyzed originally, it can be used not only for extraction and purification of nucleic acid but also for subsequent enzyme reaction and mass spectrometry. The same efficiency is obtained. In addition, since the charge-to-mass (m / z) value is detected differently by stable isotope substitution in the final analysis step, the signal value of the internal standard nucleic acid added can be separated.
  • the mass spectrometry process uses liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
  • the instrument signal value peak area in the mass spectrometer Is an objective measure of purification, enzyme reaction and mass spectrometry efficiency.
  • the present invention relates to a process for preparing 1) 13 C and / or 15 N SILDs; 2) adding the same amount of the substituted nucleic acid (SILD) as an internal standard substance to the sample to be analyzed and the control sample; 3) obtaining a nucleic acid from the sample to be analyzed and the control sample; 4) hydrolyzing the nucleic acid obtained in the step 3) to a single nucleoside level; 5) obtaining a nucleoside-derived nucleoside-substituted nucleotide (SILD) -induced nucleoside detection value from the nucleoside obtained in the step 4) in mass spectrometry; And 6) correcting the amount of the sample nucleic acid to be analyzed using the property that the nucleoside detection value derived from the substituted nucleic acid (SILD) should be the same in the sample to be analyzed and the control sample.
  • the nucleic acid is DNA or RNA and the sample is at least one of whole blood, plasma, serum, urine, saliva, sweat, milk, animal extract, plant extract, cell extract, cell culture liquid, drinking water, .
  • the SILD of 13 C and / or 15 N is derived from one of E. coli, a human, a mouse, a yeast, a plant, a fruit fly, or a small nematode, preferably from Escherichia coli.
  • the step of obtaining the nucleic acid from the sample may be extraction and purification.
  • Methods for hydrolyzing the nucleic acid to a single nucleoside level include at least one of an enzymatic reaction, an acid treatment, a heat treatment, a radiation treatment, and an ultrasonic treatment.
  • hydrolysis is hydrolyzed to a single nucleoside by 99.5% (by weight) of the total nucleic acid.
  • the step of correcting is calculated by the following equation.
  • the amount of nucleic acid is the amount of nucleic acid of the sample to be analyzed
  • the detection value of the nucleic acid is the detection value of the nucleic acid of the sample to be analyzed
  • the amount of the nucleic acid of the control sample SILD detection value (control) was determined by mass spectrometry of the substituted nucleic acid (SILD) of the control sample
  • SILD detection value (analysis target) was analyzed by the mass spectrometry Refers to the detection value in the mass analysis of the substituted nucleic acid (SILD) of the target sample.
  • the advantage of the present invention is that SILD can be used as an internal reference material to compensate for differences in the yields that arise during the extraction and purification of the nucleic acid in the medium.
  • the added internal standard also corrects the efficiency of the enzyme reaction and mass spectrometry after purification. For example, if some impurities remain, the ionization efficiency of the enzyme reaction or mass spectrometry may be different. Since the internal standard material is also affected by this effect, the signal value ratio of the internal standard material is used to determine the interference effect Can be corrected.
  • SILD as an internal standard allows to improve the accuracy of medium nucleic acid quantitation by correcting the efficiency of all procedures and reactions performed to quantitate the nucleic acid of the medium sample.
  • 1 is a schematic diagram of a process for quantifying nucleic acids in a medium using SILD as an internal standard material.
  • SILD as an internal standard material.
  • '*' Means stable isotope labeled substance.
  • FIG. 2 shows the results of mass spectrometry of Escherichia coli genomic DNA produced to utilize SILD as an internal standard material.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of correcting DNA extraction and purification efficiency using SILD as an internal standard material.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of the amount of free nucleic acid (cell-free DNA) in human serum using SILD as an internal standard material.
  • the present invention relates to a method for producing a purified nucleic acid, which comprises the steps of 1) adding SILD as an internal standard substance to the sample to be analyzed and a comparative sample (control or reference material), 2) extracting or purifying the nucleic acid from each sample, To a single nucleoside level through an enzymatic reaction; and 4) by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to obtain each nucleoside and stable isotope substituted Detecting and quantifying the nucleoside, 5) correcting the difference in efficiency of the whole step by using the signal value of the internal standard material, and quantitatively calculating the amount of the nucleic acid in the sample to be analyzed In the medium.
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a process for quantifying nucleic acids in a medium using SILD as an internal standard material.
  • SILD as an internal standard material.
  • the same amount of SILD is added to the sample to be analyzed and the sample to be compared (or the standard sample), and then the two samples are extracted and purified, followed by hydrolysis and mass analysis by enzymatic reaction.
  • the signal value of the SILD that gave the same amount in the mass analysis results is a measure of the overall reaction efficiency and yield of the two samples, and the absolute value or the relative amount of nucleic acid in the medium by the formula described in the figure, Can be calculated.
  • the amount of nucleic acid is the amount of nucleic acid of the sample to be analyzed
  • the detection value of the nucleic acid is the detection value of the nucleic acid of the sample to be analyzed
  • the amount of the nucleic acid of the control sample SILD detection value (control) was determined by mass spectrometry of the substituted nucleic acid (SILD) of the control sample
  • SILD detection value (analysis target) was analyzed by the mass spectrometry Refers to the detection value in the mass analysis of the substituted nucleic acid (SILD) of the target sample.
  • Genomic DNA extraction from Escherichia coli cultured in stable isotope medium was carried out using Genute Bacterial genomic DNA kit (Sigma-Aldrich). Approximately 500 ng of DNA was hydrolyzed to the nucleoside (dNMP) level using DNase I (Takara) and Phosphodiesterase I (Affymetrics) to confirm that the extracted genomic DNA was well labeled with stable isotope, and LC-Quadrupole-TOF SCIEX 5600) mass spectrometer to detect each nucleoside (see FIG. 2).
  • the E. coli DNA cultured in the general medium and the E. coli DNA cultured in the stable isotope medium have a molecular weight difference of 12 in dCMP and TMP, and a difference of 15 in dAMP and dGMP.
  • This difference corresponds to the difference that comes from assuming that both the carbon and nitrogen in each nucleoside are substituted.
  • the normal nucleosides with small molecular weights can not be detected. Therefore, according to the method of the present invention, it was confirmed that E. coli DNA was labeled with stable isotope at a level close to 100%.
  • HGH buffer 2.25% Mannitol, 0.5% Glycine, 0.15%
  • a representative medium was used as a representative medium to confirm the correctness of the extraction and purification efficiency of the medium when the stable isotope labeled E. coli DNA was added as an internal standard.
  • Sodium phosphate, 5 mg / mL Bovine serum albumin were selected.
  • 100ng of known amount of DNA was added to the hGH buffer as a sample to be analyzed, and about 100 ng of SILD was added as an internal standard.
  • the same amount of SILD was also added to human placental DNA and dNMP samples of known value as a standard of quantification.
  • SILD-added samples were purified by PCR purification kit (QPK, Qiagen), QiaAmp DNA Blood mini kit (QBD, Qiagen), serum / plasma cell free DNA midi kit (Sigma, Sigma-Aldrich) and QiaAmp circulating nucleic acid kit Qiagen) (Fig. 3).
  • DNA was hydrolyzed to the nucleotide (dNMP) level using DNase I (Takara) and Phosphodiesterase I (Affymetrics) and hydrolyzed to the nucleoside (dN) again using Shrimp alkaline phosphatase (Takara).
  • nucleosides were quantitatively analyzed by LC-Quadrupole-TOF (AB SCIEX 5600) mass spectrometer. Based on the peak area of the normal nucleoside from each purified sample and the peak area of the SILD-derived nucleoside, the amount of DNA in the medium was calculated by applying the following formula. The following formula can be used only when the same 100 ng of analytical sample and internal standard are applied.
  • the nucleic acid quantification results before and after kit-specific correction are compared in FIG.
  • the result of quantification without calibration with SILD shows a quantitative value of 20 - 70% according to the kit based on the initial reference value.
  • a quantitative value of 90 to 105% of the reference value was obtained. This result implies that the accuracy of quantification can be dramatically improved by using the internal standard of SILD in the quantitative analysis of nucleic acids in the medium.
  • the use of internal standard SILDs has made it possible to obtain highly accurate nucleic acid quantification even when nucleic acid purification procedures are omitted.
  • the peak area of the nucleoside in the case of no correction is about 50% of the reference value, and the efficiency of hydrolysis by enzymes and the ionization efficiency of mass spectrometry are lower than that of the purified nucleic acid.
  • This lowered efficiency is interpreted as the disturbance factors contained in the hGH buffer were not removed by the purification.
  • SILD also compensates for such low hydrolysis efficiency and ionization efficiency, the final result of nucleic acid quantitation is 101.5% of the reference value, which enables highly accurate quantification.
  • Free DNA in human serum was quantitatively analyzed to confirm that the stable isotope labeled E. coli DNA was properly corrected for medium DNA extraction and purification efficiency when added as an internal standard.
  • About 50 ng of SILD was added to 0.5 ml each of 16 human serum samples prior to purification of the free DNA in the serum.
  • the same amount of SILD was also added as an internal standard in the dNMP standard mixture (quantities of 20 ng / ml each of 4 kinds of individual nucleotides), the quantity of which was previously known as a standard of quantitation.
  • DNA was extracted using a circulating cell-free DNA purification kit (Qiagen).
  • the extracted DNA was quantitatively analyzed by LC-MS after hydrolysis as described above.
  • the results are shown in FIG.
  • the range of the measurement value shown in FIG. 4 is 50-500 ng / ml, which is generally higher than that of 20-100 ng / ml calculated from experiments in which DNA extraction and purification efficiency are not corrected.
  • the purification efficiency of the kit used for DNA purification is about 40%, it is judged that the measurement method used in the present invention obtained about twice the high measurement value because the purification efficiency was completely corrected.
  • the 'DNA measurement method using a stable isotope labeled DNA as an internal standard substance' proposed in the present invention is a method of measuring the DNA purification efficiency, the hydrolysis efficiency by enzymes, It can be confirmed that this method is capable of accurate quantification.
  • the present invention allows the use of SILD as an internal reference material to compensate for differences in the yields that arise during the extraction and purification of nucleic acids in the medium.
  • the added internal standard also corrects the efficiency of the enzyme reaction and mass spectrometry after purification. For example, if some impurities remain, the ionization efficiency of the enzyme reaction or mass spectrometry may be different. Since the internal standard material is also affected by this effect, the signal value ratio of the internal standard material is used to determine the interference effect Can be corrected.
  • the use of SILD as an internal standard allows to improve the accuracy of medium nucleic acid quantitation by correcting the efficiency of all procedures and reactions performed to quantitate the nucleic acid of the medium sample.

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Abstract

시료 또는 복잡한 매질 내에 존재하는 핵산을 정량 분석하기 위해서는 핵산 추출 또는 정제 과정이 필요하다. 그러나 핵산 추출 및 정제의 수율(yield)은 정제 원리, 사용되는 키트 및 시료의 특성에 의해 변동성이 매우 크다. 따라서 핵산 추출 및 정제 수율의 효율적인 보정(normalization)은 원 시료를 기준으로 하는 정확한 핵산 정량 분석의 필수 조건이 된다. 본 발명은 표적 핵산의 증폭없이 시료 또는 복잡한 매질 내에 존재하는 핵산을 정량 분석하는 방법에 관한 것이다.

Description

안정동위원소 표지 핵산을 내부표준물질로 활용하는 핵산 정량 방법 및 이의 용도
본원 발명은 정확도와 신뢰성을 높인 핵산(Nucleic acids; DNA 및 RNA)의 정량 분석방법으로서, 구체적으로 안정동위원소(stable isotope)로 표지된 핵산(stable isotope labelled nucleic acids(DNA or RNA); 이하 'SILD')를 내부표준물질(internal standard)로 활용하는 핵산 정량 분석방법에 관한 것이다.
유전자 분석은 PCR과 시퀀싱(sequencing) 기술에 의해 특정 유전자를 증폭하고 그 염기서열을 분석하는 과정을 포함한다. 유전자 분석은 질병 진단, 돌연변이 검출, 병원성 박테리아와 바이러스의 검출과 같은 의학 분야; 유전자 변형 농산물의 검출, 식재료의 원산지 판별, 식재료에 오염된 미생물 검출과 같은 식품 및 위생 분야; 미생물 군집 분석, 생물체에 가해지는 독성 분석, 생물 다양성 보존과 같은 환경 분야; 친자 판별, 개인 식별, 범죄 용의자 식별과 같은 법의학적 분야에서 다양하게 활용되고 있다.
차세대 염기서열 분석(next generation sequencing; NGS) 기술의 개발로 수십, 수백 개의 다른 시료를 동시에 분석하거나 수천, 수만 유전자를 동시에 분석하는 고효율 유전체(genome) 분석까지 가능하다. NGS 기술은 전사체 분석에 의한 모든 유전자의 발현 양상 분석 및 대규모, 고정밀도의 미생물 군집 분석; 코호트 분석에 의한 집단 유전적 특성 및 질병 마커 발굴; 개인 유전체 분석에 의한 질병 예측 및 맞춤의학 등 여러 분야에서 매우 유용하게 활용되고 있다.
최근 혈액 내 '순환 핵산 또는 자유 핵산(circulating cell free nucleic acid)'이 발견되었다. 후속 연구를 통해서 순환 핵산이 의학적으로 매우 중요하다는 것이 밝혀졌고, 이를 활용하기 위한 정밀 분석법의 필요성이 크게 대두되고 있다.
정상 상태일 때 혈액 중 순환 핵산의 양은 20-100ng/이나, 유방암, 혈액암 등 암이 발병되는 경우에는 200-500ng/㎖로 크게 증가되어 있는 현상이 발견되었다. 암 뿐만 아니라 심근 경색, 감염, 급성 염증, 과도한 운동 및 스트레스에서도 혈중 순환 핵산의 양이 변한다는 것이 보고되었다. 즉, 단순히 혈중 순환 핵산의 양을 측정하는 것만으로도 주요 질병을 조기에 진단할 수 있는 가능성이 열렸다. 이를 위해서는 무엇보다도, 혈중 순환 핵산에 대한 정확하고 신뢰성 있는 정량 분석이 필요하다.
핵산 정량법으로는 UV 흡광법(UV spectrometry), 정량적 핵산 증폭법(qPCR), 디지털 핵산 증폭법(digital PCR) 및 형광 정량법 등이 많이 사용된다. 이들 정량법은 시료 또는 매질에 존재하는 다른 성분들에 의해 방해를 받기 때문에 정제 과정이 없이는 정확한 핵산의 정량을 분석할 수 없다. 그러나, 복잡한 매질 중의 핵산에 대해서 정확도와 신뢰성이 높은 정량 분석법은 아직까지 제시되지 않았다.
특허문헌 1은 핵산의 정량 방법에 관한 것으로서, 샘플 중의 피분석물인 핵산과 구별될 수 있고 이 핵산과 동시 증폭될 수 있는 여러 핵산 작제물들의 상이한 각각의 양을 샘플에 첨가하는 단계; 상기 피분석물인 핵산 및 핵산 작제물과 반응할 수 있는 증폭 시약을 사용하여 상기 샘플을 핵산 증폭 절차로 처리하는 단계; 상기 상대적인 양들로부터 피분석물인 핵산의 양을 계산하는 단계로 구성된다. 각각의 핵산 작제물은 상이하며; 핵산 작제물들은 서로 구별될 수 있고 피분석물인 핵산과도 구별될 수 있다. 핵산 작제물은 동일한 증폭 시약으로 반응 할 수 있다는 점에서 핵산 작제물, 및 피분석물인 핵산과 유사하다.
그러나 상기와 같은 방법은 검량곡선의 작성에 사용되는 여러 핵산 작제물이 분석하는 핵산에 따라서 계속 달라질 수 있고, 핵산 작제물이 피분석물과 동일한 속도로 증폭이 되어야 하는 전제가 있다는 점에서 신뢰성 있는 정량 분석방법이라고 볼 수 없다.
특허문헌 2는 샘플 내의 표적 핵산의 특성 수준을 계산할 수 있는 캘리브레이션 곡선을 생성하기 위한 보편적 기준 핵산의 사용에 관한 것이다. 특허문헌 2는 공지된 양의 형광단으로 표지된 보편적 기준 핵산을 도입하여 정량하는 방법에 관한 것이다. 이 또한 특허문헌 1과 같이 검량곡선에 사용되는 핵산 또한 동일한 속도로 증폭이 되어야하는 전제가 있다는 점에서 오류가 기본적으로 내재되었다.
이와 같이 표적 핵산의 증폭 없이 핵산을 정밀하게 정량할 수 있는 방법은 현재까지 제시되지 않았다.
(선행기술문헌)
대한민국 등록특허공보 제10-0312800호
대한민국 공개특허공보 제10-2017-0083053호
시료 또는 복잡한 매질 내에 존재하는 핵산을 정량 분석하기 위해서는 핵산 추출 또는 정제 과정이 필요하다. 그러나 핵산 추출 및 정제의 수율(yield)은 정제 원리, 사용되는 키트 및 시료의 특성에 의해 변동성이 매우 크다. 따라서 핵산 추출 및 정제 수율의 효율적인 보정(normalization)은 원 시료를 기준으로 하는 정확한 핵산 정량 분석의 필수 조건이 된다. 본 발명은 표적 핵산의 증폭없이 시료 또는 복잡한 매질 내에 존재하는 핵산을 정량 분석하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 시료 중의 핵산(Nucleic acids; DNA 및 RNA) 정량 분석의 정확도와 신뢰성을 높이기 위한 방법으로서 SILD를 내부표준물질 (internal standard)로 활용하는 핵산 정량 분석방법에 관한 것이다.
시료 또는 복잡한 매질 내에 존재하는 핵산을 정확히 정량 분석하기 위해서는 핵산 추출 또는 정제 과정이 필요하다. 그러나 핵산 추출 및 정제의 수율(yield)은 정제 원리, 사용되는 키트 및 시료의 특성에 의해 변동성이 매우 크다. 따라서 핵산 추출 및 정제 수율의 효율적인 보정(normalization)은 원 시료를 기준으로 하는 정확한 핵산 정량 분석의 필수 조건이 된다.
본 발명은 핵산 정제 및 전처리 과정에서의 수율을 보정하기 위해 SILD를 내부표준물질로 이용하는 방법에 관한 것이다.
핵산 추출 및 정제의 수율을 간접적으로 보정하기 위해 많이 활용되는 방법은 미리 알고 있는 양의 특정 유전자를 시료에 내부표준물질로 첨가한 후 추출 및 정제 후 이 유전자의 양을 다시 측정함으로써 추출 및 정제의 수율을 계산하는 방법이 쓰이기도 한다. 그러나 이 방법은 정제 대상 핵산의 크기가 다양한 상태에서 내부표준물질로 넣어주는 핵산은 단일 크기를 가지게 되는데 핵산 추출 효율은 핵산의 크기에 따라서도 큰 영향을 받기 때문에 전체적인 추출 효율의 보정에 활용하기 어렵다는 단점이 있다. 또한 이러한 크기 문제를 해결하기 위해 크기 분포 등이 동일하고 미리 양을 알고 있는 핵산을 외부표준물질로 활용하여 이에 대한 별도의 추출 및 정제 반응 그리고 정량분석을 함으로써 사용된 키트, 실험자 등에 따른 수율을 예측하는 방법도 있다. 그러나 이 방법은 근본적으로 핵산 정제의 수율이 개별 반응 용기마다 다를 수 있다는 점, 시료의 매질 형태에 따라서도 달라진다는 점 때문에 완벽한 효율 보정 방법이라고 하기는 힘들다. 따라서 기존 방법들의 이러한 단점을 극복하기 위해 내부표준물질로 사용되면서도 핵산 전체의 정제 효율을 보정하는 방법을 발명하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 핵산 추출 및 정제의 수율을 보정하는 방법으로서 SILD를 내부표준물질로 활용한다. SILD는 분석대상인 보통의 핵산과 화학적, 생물학적 특성은 동일하지만 안정동위원소(13C, 15N)에 의해 분자량은 차이가 나게 된다. 그리고 이러한 분자량 차이는 최종 분석 기기인 질량분석기에서 서로 다른 전하-대-질량비(m/z)로서 검출 및 정량이 가능하다. 즉, 각 시료에서 산출된 정상 핵산의 양과 내부표준물질 핵산의 양을 동시에 그리고 구분해서 정량할 수 있다. 그리고 시료에서 산출된 내부표준물질의 특성은 분석대상 핵산의 추출, 정제, 효소 반응, 질량분석의 효율과 동일하기 대문에 내부표준물질의 신호값은 동일 반응에 대해 분석대상 물질이 갖는 반응 효율의 척도가 된다.
만약 내부표준물질로 첨가한 핵산의 양을 미리 알고 있거나 핵산 정량의 표준물질에 동일한 양의 내부표준물질을 첨가했다면 이러한 분석법은 통칭 동위원소희석 질량분석법(isotope dilution mass spectrometry)라고 하는데 이는 분석화학 분야에서 물질 정량분석법으로 사용되는 방법이다. 그러나 동위원소희석 질량분석법은 분석대상물질에 대해 동위원소로 치환된 내부표준물질의 준비가 반드시 필요하다. 분석화학 분야에서 주로 대상으로 하는 물질들은 분자량이 작고 구조가 단순하기 때문에 동위원소로 치환된 내부표준물질의 준비가 비교적 쉽고 상업용 시약 회사에서도 구입을 할 수가 있다. 그러나 핵산의 경우에는 분자량이 매우 크고(유전체 핵산의 경우 보통 10kb의 길이, 분자량 7MDa 이상, 혈액 내 순환 핵산의 경우 길이 150bp, 분자량 100 kDa 정도) 구조가 복잡하기 때문에 동위원소 희석 내부표준물질의 준비가 쉽지 않다. 이러한 어려움에도 불구하고 대장균을 무기 원소만으로 구성된 최소 배지와 동위원소로 치환된 질소원(ammonium sulfate) 및 탄소원(glycerol)을 추가한 배지에서 배양함으로써 핵산 전체를 안정동위원소로 표지하는 방법이 개발된 바 있다. 본 발명에서는 이러한 기술에 착안하여 안정동위원소로 표지된 대장균 유전체 핵산을 생산하였고 이 핵산을 매질 내 핵산 분석의 내부표준물질로 활용하였다.
내부표준물질로 사용되는 SILD는 분석 시작 시점에서 분석대상 시료와 비교대상 시료(대조군 또는 표준물질)에 동일량을 첨가해 준다. 13C, 15N 등 안정동위원소로 치환된 SILD는 원래 시료에 들어있는 분석대상 핵산과 화학적으로 동일한 특성을 갖기 때문에 핵산의 추출 및 정제 과정 뿐만 아니라 그 후의 효소 반응, 질량분석 과정 등에서도 원칙적으로 동일한 효율을 갖게 된다. 그리고 최종 분석 단계인 질량분석 결과에서는 안정동위원소 치환에 의해 전하-대-질량(m/z) 값이 다르게 검출이 되므로 첨가해준 내부표준물질 핵산의 신호값은 따로 분리를 할 수 있다.
상기 질량분석 과정은 액체 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)를 사용한다.
한편 분석 시작 시점에서 SILD를 분석대상 시료와 비교대상 시료(대조군 또는 표준물질) 시료에 동일량을 첨가했기 때문에 각각 시료에서 나오는 내부표준물질의 기기 신호값(질량분석기에서의 피크 면적)은 각 시료에서의 정제, 효소 반응, 질량분석 효율의 객관적인 척도가 된다.
본 발명은 1) 13C 및/또는 15N의 SILD를 준비하는 단계; 2) 상기 치환된 핵산(SILD)을 분석대상 시료 및 대조군 시료에 내부표준물질로서 각각 동일량 첨가하는 단계; 3) 상기 분석대상 시료 및 상기 대조군 시료로부터 핵산을 얻는 단계; 4) 상기 3) 단계에서 얻은 핵산을 단일 뉴클레오시드 수준으로 가수분해 하는 단계; 5) 질량분석에서 상기 4) 단계에서 얻은 뉴클레오시드로부터 정상 뉴클레오시드와 치환된 핵산(SILD) 유래 뉴클레오시드 검출값을 얻는 단계; 6) 상기 치환된 핵산(SILD) 유래 뉴클레오시드 검출값이 분석대상 시료와 대조군 시료에서 같아야 하는 특성을 이용해 분석대상 시료 핵산의 양을 보정하는 단계;를 포함하는 핵산의 정량 분석방법이다.
여기서 핵산은 DNA 또는 RNA이며, 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 땀, 우유, 동물 추출액, 식물 추출액, 세포 추출액, 세포 배양액, 식수, 상수, 하수, 강물, 바닷물 중 적어도 하나 이상이다.
13C 및/또는 15N의 SILD는 대장균, 사람, 생쥐, 효모, 식물, 초파리, 예쁜꼬마선충 중에서 하나로부터 유래한 것이며, 바람직하게는 대장균으로부터 유래된 것이다.
시료로부터 핵산을 얻는 단계는 추출 및 정제일 수 있다.
핵산을 단일 뉴클레오시드 수준으로 가수분해하는 방법은 효소 반응, 산(acid) 처리, 열(heat) 처리, 방사선 처리, 초음파 처리 중 적어도 하나 이상이다. 특히 가수분해는 전체 핵산의 99.5% 이상(중량 기준)이 단일 뉴클레오시드로 가수분해된다.
상기 보정하는 단계는 하기 식에 의해서 계산된다.
Figure PCTKR2018013028-appb-I000001
여기서 핵산(분석대상)은 분석대상 시료의 핵산의 양, 핵산검출값(분석대상)은 분석대상 시료의 핵산의 질량분석에서의 검출값, 핵산(대조군)은 대조군 시료의 핵산의 양, 핵산검출값(대조군)은 대조군 시료의 핵산의 질량분석에서의 검출값, SILD검출값(대조군)은 대조군 시료의 치환된 핵산(SILD)의 질량분석에서의 검출값, SILD검출값(분석대상)은 분석대상 시료의 치환된 핵산(SILD)의 질량분석에서의 검출값을 말한다.
본 발명의 효과는 SILD를 내부표준물질로 활용함으로써 매질 내에 있는 핵산의 추출 및 정제 과정에서 발생하는 수율의 차이를 보정할 수 있게 해 주는 것이다. 또한 첨가된 내부표준물질은 정제 후의 효소 반응 및 질량분석의 효율도 보정한다. 예를 들어서, 일부 불순물이 남아 있을 경우 효소 반응이나 질량분석의 이온화 효율이 달라질 수 있는데 이런 효과를 내부표준물질 또한 동일하게 받기 때문에 내부표준물질의 신호값 비를 이용해서 분석대상물질이 받은 방해 효과를 보정할 수 있게 된다. 종합적으로 SILD를 내부표준물질로의 사용은 매질 시료의 핵산을 정량분석하기 위해 수행되는 모든 절차 및 반응의 효율을 보정함으로써 매질 핵산 정량분석의 정확도를 개선할 수 있게 한다.
도 1은 SILD를 내부표준물질로 활용하여 매질 내 핵산을 정량하는 과정에 대한 모식도이다. '*'는 안정동위원소 표지된 물질을 의미한다.
도 2는 SILD를 내부표준물질로 활용하기 위해 생산된 대장균 유전체 DNA의 질량분석 결과이다.
도 3은 SILD를 내부표준물질로 활용해서 DNA 추출 및 정제 효율을 보정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 SILD를 내부표준물질로 활용하여 인간 혈청 중의 자유 핵산(cell free DNA)의 양을 측정한 결과이다.
본 발명은 1) SILD를 내부표준물질로서 분석대상 시료 및 비교대상 시료(대조군 또는 표준물질) 시료에 동일량 첨가하는 단계, 2) 각 시료로부터 핵산을 추출하거나 정제하는 단계, 3) 정제된 핵산을 효소반응을 통해 단일 뉴클레오시드(nucleoside) 수준으로 가수분해하는 단계, 4) 액체 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-mass spectrometry; LC-MS)을 통해 각 뉴클레오시드 및 안정동위원소 치환된 뉴클레오시드를 분리, 검출, 정량하는 단계, 5) 내부표준물질의 신호값을 이용해 전체 단계의 효율 차이를 보정하고 분석대상 시료 내에 있던 핵산의 양을 정량적으로 산출하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 매질 내 핵산 정량법이다.
도 1은 SILD를 내부표준물질로 활용하여 매질 내 핵산을 정량하는 과정에 대한 모식도이다. SILD를 분석대상 시료와 비교대상 시료(또는 표준물질 시료)에 동일량을 첨가한 후 두 시료를 추출 및 정제, 효소반응에 의한 가수분해, 질량분석을 차례대로 수행한다. 최종적으로 질량분석 결과에서 동일량을 넣어준 SILD의 신호값은 두 시료에 대한 전체 반응 효율 및 수율의 척도가 되고 그림에 기술한 공식, 정확히는 아래에 기재된 식에 의해 매질 내 핵산의 절대량 또는 상대량을 계산할 수 있다.
Figure PCTKR2018013028-appb-I000002
여기서 핵산(분석대상)은 분석대상 시료의 핵산의 양, 핵산검출값(분석대상)은 분석대상 시료의 핵산의 질량분석에서의 검출값, 핵산(대조군)은 대조군 시료의 핵산의 양, 핵산검출값(대조군)은 대조군 시료의 핵산의 질량분석에서의 검출값, SILD검출값(대조군)은 대조군 시료의 치환된 핵산(SILD)의 질량분석에서의 검출값, SILD검출값(분석대상)은 분석대상 시료의 치환된 핵산(SILD)의 질량분석에서의 검출값을 말한다.
본 발명을 실시하기 위해서는 SILD를 생산하는 것이 우선적으로 필요하다.
1. SILD의 생산 및 확인
SILD의 생산은 참고문헌(Appl Microbiol Biotechnol (2010) 88:771-779)에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 간략하게 설명하면 필수 무기원소만으로 구성된 LMR 배지(176mM KH2PO4, 25mM NaOH, 10㎕ H2SO4, 12.6mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 10 microMole FeSO4, 0.2 % Trace metal solution) 조성에서 15N으로 치환된 (NH4)2SO4 를 사용하였고(Cambridge Isotope Laboratory) 탄소원으로서 0.2%의 13C로 치환된 글리세롤(glycerol)을 첨가한 배지를 사용하였다. 대장균은 표준 균주인 KCTC11을 사용하였다. 안정동위원소 배지에서 배양된 대장균으로부터의 유전체 DNA 추출은 Genelute Bacterial genomic DNA kit(Sigma-Aldrich)를 이용해서 수행하였다. 추출된 유전체 DNA가 안정동위원소로 잘 표지됐는지 확인하기 위해 DNA 약 500ng을 DNase I (Takara)과 Phosphodiesterase I (Affymetrics)을 이용해 뉴클레오시드(dNMP) 수준으로 가수분해 하고 LC-Quadrupole-TOF(AB SCIEX 5600) 질량분석기를 통해 각 뉴클레오시드를 검출하였다(도 2 참조).
도 2에서 볼 수 있듯이 일반 배지에서 배양한 대장균 DNA와 안정동위원소 배지에서 배양한 대장균 DNA는 dCMP와 TMP의 경우 분자량이 12가 차이가 나고 dAMP와 dGMP는 15가 차이가 난다. 이러한 차이는 각 뉴클레오시드에 있는 탄소 및 질소가 모두 치환됐다고 가정했을 때 나오는 차이에 해당한다. 그리고 안정동위원소 배지에서 배양된 DNA에서는 분자량이 작은 정상 뉴클레오시드는 검출이 되지 않는다. 따라서 본 발명에서 실시한 방법에 의하면 대장균 DNA가 100%에 가까운 수준으로 안정동위원소로 표지되었다는 사실을 확인할 수 있었다.
2. 매질 DNA의 추출 및 정제 효율 보정 및 DNA 정량 분석
안정동위원소 표지된 대장균 DNA를 내부표준물질로 첨가했을 때 매질 DNA 추출 및 정제 효율을 제대로 보정하는지 확인하기 위해 대표적인 매질로서 단백질 의약품 보관 용 버퍼(hGH buffer: 2.25 % Mannitol, 0.5 % Glycine, 0.15 % Sodium phosphate, 5 mg/mL Bovine serum albumin)를 선정하였다. hGH 버퍼에 분석대상 시료로서 100ng의 아는 양의 DNA를 첨가했고 내부표준물질로서 약 100ng에 해당하는 SILD를 첨가하였다. 동일량의 SILD를 정량의 표준물질로서 값을 미리 알고 있는 human placental DNA 및 dNMP 시료에도 첨가하였다. SILD가 첨가된 시료는 PCR purification kit (QPK, Qiagen), QiaAmp DNA Blood mini kit (QBD, Qiagen), Serum/plasma cell free DNA midi kit (Sigma, Sigma-Aldrich) 및 QiaAmp circulating nucleic acid kit (QC, Qiagen) 등 4종류의 서로 다른 키트를 이용해 추출 및 정제하였다(도 3). DNA는 DNase I (Takara)과 Phosphodiesterase I (Affymetrics)을 이용해 뉴클레오티드(dNMP) 수준으로 가수분해 하고 다시 Shrimp alkaline phosphatase(Takara)를 이용해서 뉴클레오시드(dN)으로 가수분해하였다. 가수분해 된 4종의 뉴클레오시드는 LC-Quadrupole-TOF (AB SCIEX 5600) 질량분석기를 통해 정량 분석하였다. 각 정제된 시료에서 산출된 정상 뉴클레오시드의 피크 면적과 SILD 유래 뉴클레오시드의 피크 면적을 기반으로 다음과 같은 공식에 적용하여 매질 내 DNA 양을 산출하였다. 하기 식은 분석대상 시료와 내부표준물질이 동일한 100ng이 적용되었을 경우에만 사용될 수 있다.
Figure PCTKR2018013028-appb-I000003
키트 별 보정 전 및 보정 후의 핵산 정량 결과는 도 3에 비교돼 있다. SILD로 보정하지 않고 정량한 결과는 최초 기준값 대비 키트에 따라 20 - 70 % 수준의 정량값을 보여준다. 반면에 본 발명에서 제시하는 SILD로 정제 및 가수분해 반응을 보정한 결과에서는 기준값 대비 90 - 105 % 수준의 정량값을 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 매질 내 핵산 정량분석에 있어서 SILD 내부표준물질을 사용함으로써 정량의 정확도를 획기적으로 높일 수 있다는 사실을 의미한다. 이에 더해서SILD 내부표준물질을 사용하면 심지어는 핵산 정제 과정을 생략한 경우에도 매우 정확한 핵산 정량이 가능하다는 사실을 확인할 수 있었다.
도 3에서 보듯이 보정하지 않은 경우의 뉴클레오시드 피크 면적은 기준값의 약 50 % 수준으로서 효소에 의한 가수분해의 효율 및 질량분석의 이온화 효율이 정제된 핵산 대비 낮다는 것을 알 수 있다. 이렇게 낮아진 효율은 hGH버퍼에 포함돼 있는 방해 요인들이 정제에 의해 제거되지 않았기 때문으로 해석이 된다. 그러나 SILD를 이용하면 이처럼 낮은 가수분해 효율 및 이온화 효율까지도 보정을 해주기 때문에 최종 결과의 핵산 정량값은 기준값 대비 101.5%로서 매우 정확한 정량이 가능하였다. 이와 같은 관찰 결과를 바탕으로 SILD를 내부표준물질로 사용하면 매질 내 핵산 양을 추출 및 정제 키트 종류에 무관하게 그리고 더 나가서는 정제를 하지 않은 경우에도 매우 정확하게 핵산 양을 측정할 수 있다는 결론을 얻을 수 있다.
3. 인간 혈청 중의 자유 DNA 정량 분석
안정동위원소 표지된 대장균 DNA를 내부표준물질로 첨가했을 때 매질 DNA 추출 및 정제 효율을 제대로 보정하는지 확인하기 위해 인간 혈청 중의 자유 DNA를 정량 분석하였다. 혈청 중의 자유 DNA를 정제하기 전에 16개의 인간 혈청 시료 각 0.5㎖에 약 50ng의 SILD를 첨가하였다. 또한 정량의 기준으로서 양을 미리 알고 있는 dNMP 표준물질 혼합물(4종 개별 뉴클레오티드 각 20ng/㎖ 농도)에도 동일한 양의 SILD를 내부표준물질로 첨가하였다.
SILD가 첨가된 시료는 Circulating cell free DNA purification kit(Qiagen)을 이용해 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 앞에서 서술한 바와 동일하게 가수분해를 거쳐 LC-MS에서 정량 분석하였다. 그 결과는 도 4에 나타나 있다. 도 4에 나타난 측정값의 범위는 50 - 500ng/㎖로서 일반적으로 DNA 추출 및 정제 효율을 보정하지 않은 실험에서 산출된 20 - 100ng/㎖보다 상당히 높은 값의 분포를 보이고 있다. 이는 DNA 정제에 사용된 키트의 정제 효율이 약 40%라는 점을 고려하면 본 발명에서 사용한 측정법은 이 정제 효율을 완전하게 보정했기 때문에 약 두 배 정도의 높은 측정값을 얻은 것으로 판단된다. 이상의 결과를 통해 본 발명에서 제시하는 ‘안정동위원소 표지 DNA를 내부표준물질로 활용하는 매질 내 DNA 측정법’은 DNA의 정제 효율, 효소에 의한 가수분해 효율, LC-MS에서의 변동성을 한꺼번에 보정함으로써 정확한 정량을 가능하게 하는 방법임을 확인할 수 있다.
본 발명은 SILD를 내부표준물질로 활용함으로써 매질 내에 있는 핵산의 추출 및 정제 과정에서 발생하는 수율의 차이를 보정할 수 있게 해 주는 것이다. 또한 첨가된 내부표준물질은 정제 후의 효소 반응 및 질량분석의 효율도 보정한다. 예를 들어서, 일부 불순물이 남아 있을 경우 효소 반응이나 질량분석의 이온화 효율이 달라질 수 있는데 이런 효과를 내부표준물질 또한 동일하게 받기 때문에 내부표준물질의 신호값 비를 이용해서 분석대상물질이 받은 방해 효과를 보정할 수 있게 된다. 종합적으로 SILD를 내부표준물질로의 사용은 매질 시료의 핵산을 정량분석하기 위해 수행되는 모든 절차 및 반응의 효율을 보정함으로써 매질 핵산 정량분석의 정확도를 개선할 수 있게 한다.

Claims (9)

1) 13C 및/또는 15N의 안정동위원소로 치환된 핵산(SILD)을 준비하는 단계;
2) 상기 치환된 핵산(SILD)을 분석대상 시료 및 대조군 시료에 내부표준물질로서 각각 동일량 첨가하는 단계;
3) 상기 분석대상 시료 및 상기 대조군 시료로부터 핵산을 얻는 단계;
4) 상기 3) 단계에서 얻은 핵산을 단일 뉴클레오시드 수준으로 가수분해 하는 단계;
5) 질량분석에서 상기 4) 단계에서 얻은 뉴클레오시드로부터 정상 뉴클레오시드와 치환된 핵산(SILD) 유래 뉴클레오시드 검출값을 얻는 단계;
6) 상기 치환된 핵산(SILD) 유래 뉴클레오시드 검출값이 분석대상 시료와 대조군 시료에서 같아야 하는 특성을 이용해 분석대상 시료 핵산의 양을 보정하는 단계;
를 포함하는 핵산의 정량 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 핵산은 DNA 또는 RNA이며,
상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 땀, 우유, 동물 추출액, 식물 추출액, 세포 추출액, 세포 배양액, 식수, 상수, 하수, 강물, 바닷물 중 적어도 하나 이상인 핵산의 정량 분석방법.
제2항에 있어서,
상기 핵산은 DNA이며, 상기 시료는 혈청인 핵산의 정량 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 치환된 핵산(SILD)이 대장균, 사람, 생쥐, 효모, 식물, 초파리, 예쁜꼬마선충 중에서 하나로부터 유래한 것인 핵산의 정량 분석방법.
제4항에 있어서,
상기 치환된 핵산(SILD)이 대장균으로부터 유래한 것인 핵산의 정량 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 얻는 단계는 추출 및 정제인 핵산의 정량 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 가수분해는 효소 반응, 산(acid) 처리, 열(heat) 처리, 방사선 처리, 초음파 처리 중 적어도 하나 이상인 핵산의 정량 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 단일 뉴클레오시드 수준은 전체 핵산의 99.5% 이상(중량 기준)이 단일 뉴클레오시드로 가수분해되는 것인 핵산의 정량 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 보정하는 단계는 하기 식에 의해서 계산되는 것인 핵산의 정량 분석방법;
여기서 핵산(분석대상)은 분석대상 시료의 핵산의 양, 핵산검출값(분석대상)은 분석대상 시료의 핵산의 질량분석에서의 검출값, 핵산(대조군)은 대조군 시료의 핵산의 양, 핵산검출값(대조군)은 대조군 시료의 핵산의 질량분석에서의 검출값, SILD검출값(대조군)은 대조군 시료의 치환된 핵산(SILD)의 질량분석에서의 검출값, SILD검출값(분석대상)은 분석대상 시료의 치환된 핵산(SILD)의 질량분석에서의 검출값을 말한다.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102379144B1 (ko) * 2020-09-29 2022-03-28 한국표준과학연구원 SARS-CoV-2의 RNA 표준물질 및 이를 이용한 코로나19바이러스(SARS-CoV-2) 감염 진단 정보의 제공방법
CN114657235B (zh) * 2022-04-11 2023-09-01 中国计量科学研究院 一种用于评估逆转录效率的方法及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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ATE178946T1 (de) 1993-07-09 1999-04-15 Akzo Nobel Nv Verbessertes verfahren für die quantifizierung von nukleinsäuren
US20020123055A1 (en) * 2000-08-25 2002-09-05 Estell David A. Mass spectrometric analysis of biopolymers
EP2208992A1 (en) * 2003-11-21 2010-07-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Quantitation method using isotope labeled internal standard substance, analysis system for executing the quantitation method, and program for the analysis
US20050202406A1 (en) * 2003-11-25 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Method for high-throughput screening of compounds and combinations of compounds for discovery and quantification of actions, particularly unanticipated therapeutic or toxic actions, in biological systems
EP1850132A1 (en) * 2006-04-26 2007-10-31 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Method for determining the ratio of two distinct peptides or polynucleic acids
WO2009070233A1 (en) * 2007-11-26 2009-06-04 Waters Technologies Corporation Internal standards and methods for use in quantitatively measuring analytes in a sample
CA2829549A1 (en) * 2010-03-10 2011-09-15 Perfinity Biosciences, Inc. Method for recognition and quantification of multiple analytes in a single analysis
TWI484037B (zh) * 2012-05-07 2015-05-11 Nat Univ Chung Cheng 乙基化胸腺嘧啶dna加成產物之偵測方法
CN104995311A (zh) * 2012-08-30 2015-10-21 外来体诊断公司 用于核酸测定的对照
KR101493236B1 (ko) * 2012-09-28 2015-02-25 한국표준과학연구원 안정동위원소 표식 펩타이드의 정량 분석용 키트 및 이를 이용한 정량방법
CN105143872B (zh) * 2013-06-07 2019-03-01 皮尔斯生物科技有限公司 通过质谱分析用复用内标物对蛋白质和蛋白质修饰的绝对定量
CN107002152A (zh) 2014-10-17 2017-08-01 阿库根股份有限公司 改进的核酸定量方法
KR101719285B1 (ko) * 2014-11-04 2017-03-23 한국과학기술원 표적 물질에 의해 조절되는 핵산 중합효소 활성을 이용한 생체물질의 검출 및 정량 방법
US20180340208A1 (en) * 2015-10-15 2018-11-29 Woods Hole Oceanographic Institution Compositions and methods for absolute quantification of proteins

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