WO2019083309A2 - 아스로박터 속 미생물을 이용하여 과당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법 - Google Patents

아스로박터 속 미생물을 이용하여 과당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법

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WO2019083309A2
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    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase

Definitions

  • the present application relates to a method for preparing a fructose-transferred steviol glycosides by using microorganisms of the genus Aspergillus.
  • Stevia A natural high-sweetener that has received considerable attention in recent years is Stevia, which is extracted from the leaves of the plant Stevia rebaudiana Bertoni. Stevia is a natural material and has 200-300 times the sweetness of sugar. Stevioside, Rebaudioside A, B, C, D, E, M, Dulcoside A, And Lubuso side. Stevia is also known to have no effect on the human body and has potential as a substitute sweetener, but it has a disadvantage that the bitter taste is particularly strongly expressed, thus limiting its use.
  • the present inventors have completed the present application by confirming the activity of converting fructose into ⁇ -linked sugar into steviolglycoside using an asbesto-4 microorganism.
  • One object of the present application is to provide a method of treating Arthrobacter globiformis , Arthrobacter crystallopoietes , Arthrobacter ureafaciens,
  • the present invention provides a method for producing a fructose-transferred steviol glycosides by using at least one microorganism belonging to the genus Arthrobacter selected from the group consisting of Arthrobacter aurescens , a culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, and a lysate of the strain .
  • Another object of the present application is to provide a fructose-transferred steviol glycoside prepared by the above-mentioned production method.
  • a composition for producing a fructose-transferred steviol glycoside which comprises at least one microorganism of the genus Asperformant selected from the group consisting of Arthrobacter aurescens , a culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, and a lysate of the strain .
  • the method for preparing a fructose-transferring steviol glycoside according to the present application is a method for producing a fructose-transferred steviol glycosides according to the present invention, which comprises selecting from the group consisting of Asobacter globopemis, Asobacter crystal lofoetes, Asrobacter urea pessis, and Asobacter aurecens
  • the fructose-transferred steviol glycoside can be specifically produced using at least one microorganism in the genus Asperformant, a culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, and a disruption of the strain.
  • the fructose transfer steviol glycoside according to the present application is a high sweetener material having improved bitter taste of steviol glycosides and can be used in various fields because it has a higher calorie than known glucose transfer steviol glycosides.
  • 1 to 9 show HPLC chromatographic results of a fructose-transferred steviol glycoside prepared by using a microorganism of the genus Asperformant, a culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, and a lysate of the strain.
  • Fig. 10 shows HPLC / MS results of fructose-transferred steviol glycoside prepared by using the microorganism of the genus Asperformant, the culture thereof, the supernatant of the culture, the culture extract, and the lysate of the strain.
  • FIG. 11 is a graph showing the conversion of fructose-linked steviol glycoside (stevioside, riboidoside A) according to temperature.
  • FIG. 12 is a graph showing the synthesis conversion rate of fructose-transferred steviol glycosides (stevioside, ribauidoside A) according to pH.
  • FIG. 13 is a graph showing the conversion conversion of steviol glycosides according to the concentration of steviol glycosides (stevioside, ribauidoside A).
  • one aspect of the present invention relates to a method for producing a fructose-containing sugar, which comprises reacting sugar with a steviolglycoside in the presence of four kinds of microorganisms of Aspermator, a culture thereof, a culture supernatant, And a step of producing a fructose-transferred steviol glycoside.
  • steviol glycosides in this application is a natural sweetener having the formula (1).
  • the steviol glycoside has a low calorie content as compared with sugar and has a sweetness of about 200-300 times that of sugar.
  • it has a disadvantage of accompanied by unique pungent taste and bitter taste, and there has been an effort to improve the sweetness.
  • R 1 may be bonded with hydrogen (H), or glucose may be bonded with 1 to 3 ⁇ bonds, and R 2 may include glucose, xylose, Rhamnose may be bound to a single ⁇ bond, and glucose (glucose) may be bonded to 0 or 2 ⁇ bonds.
  • H hydrogen
  • R 2 may include glucose, xylose, Rhamnose may be bound to a single ⁇ bond
  • glucose (glucose) may be bonded to 0 or 2 ⁇ bonds.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the ⁇ - / ⁇ -glycoside bond is distinguished by the anomeric position and the relative stereochemistry of the stereocenter (S-type or S-type) farthest from the carbon number 1 of the monosaccharide.
  • S-type or S-type stereocenter
  • ⁇ -glycosidic bonds are formed when two carbons have the same stereochemistry, whereas ⁇ -glycosidic bonds occur when two carbons have different stereochemistry.
  • the present inventors have found that Arthrobacter globiformis , Arthrobacter crystallopoietes , Arthrobacter ureafaciens , and Arthrobacter aurescens, ), A culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, and a lysate of the strain are obtained by digesting sugar into fructose using sugar as a substrate and selectively adding one (1) to the steviolglycoside Linking the three fructose with ⁇ -linkage, and the microorganism derived from the four species of Asbesta of the present application, the culture thereof, the supernatant of the culture, the extract of the culture, and the lysate of the strain were used as the fructose transfer steviol glycosides It has an excellent conversion rate and has a merit that the sweetness is greatly improved compared to the conventional steviol glycosides I first identified the sound.
  • fructose-transferred steviol glycoside in the present application means a fructose-transferring steviol glycoside, which is obtained by using sugar and steviol glycosides as substrates and inhibiting the expression of Aspergillus globopneumis, OH site of the steviolglycoside by at least one microorganism of the genus Asperformant selected from the group consisting of bacterium aureus, its culture, the supernatant of the culture, the broth of the culture and the lysate of the strain.
  • One to three fructose may be added to the glucose through a [beta] -link, and more specifically, one to three fructose may be added to the glucose directly or at a position in the 19-OH position of the steviolglycoside but not limited to, a form added via? - (2,6) linkage.
  • each step of the above fructose-transferred steviol glycosides production method will be described in detail.
  • asbestos gluing agent asbestos crystal lophoblast, Sense, at least one microorganism selected from the group consisting of Aspergillus, a culture thereof, an extract of the culture, and a lysate of the strain.
  • the next step of the fructose-transferring steviol glycoside production method is to react sugar with steviol glycosides in the presence of a microorganism of the genus Asperformer, a culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, and a lysate of the strain.
  • steviol glycosides are selected from the group consisting of stevioside, rubusoide, dulcoside A, ribeuroside A, ribeuroside C, ribeuroside D, ribeuroside E, ribaudioside F, Side M, and the like.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the step of reacting the sugar with the steviol glycoside may be carried out at a pH of 1 to 10 and at a temperature of 1 to 80 ° C, more specifically at a pH of 2 to 9 and at a temperature of 5 to 70 ° C, May be performed at a pH of 3 to 8 and at a temperature of 10 to 60 ⁇ ⁇ , but the present invention is not limited thereto.
  • the fructose-transferred steviol glycoside may be a form in which 1 to 3 fructose is added in a ⁇ -bond through glucose directly or through a bond at the 19-OH position of the steviolglycoside, more specifically, But are not limited to, a form in which 1 to 3 fructose is added to the 19-OH position of glucose directly or via glucose attached thereto via a ⁇ - (2,6) bond.
  • the conversion rate from steviol glycosides to fructose-transferred steviol glycosides may be 30 to 70%, but is not limited thereto.
  • the above-mentioned microorganisms of the genus Asperformer, the culture thereof, the supernatant of the culture, the extract of the culture, Specifically, the conversion rate of the present application to fructose-transferred steviosides is higher than that of known enzymes derived from other microorganisms. More specifically, the conversion to fugitive-transferred stevioside may be 10-80%, and more specifically, the conversion may be 10-80%, 20-75%, 30-70%, but is not limited thereto .
  • the microorganism of the genus Asperformer, the culture supernatant thereof, the supernatant of the culture, the extract of the culture and the lysate of the strain may be 0.01 to 16% (w / w), more specifically 0.05 to 8% w / w), 0.1 to 6% (w / w), 0.2 to 4% (w / w), 0.4 to 3% (w / w), 0.6 to 2% w / w), or 1% (w / w).
  • the fructose-transferred steviol glycoside produced by the above method is a fructose-transferred stevioside, a fructose-transferring lucoside, a fructose-transferring ducoside A, a fructose transferring riboidase A, a fructose transferring riboidase C, but are not limited to, at least one selected from the group consisting of ribavidoside D, fructose transfer ribavidoside E, fructose transfer ribavidoside F, and fructose transfer ribavidoside M.
  • Another aspect of the present application is a method of treating or preventing a disease or condition selected from the group consisting of Arthrobacter globiformis , Arthrobacter crystallopoietes , Arthrobacter ureafaciens, A composition for producing fructose-transferred steviol glycosides, which comprises at least one microorganism belonging to the genus Arthrobacter selected from the group consisting of Arthrobacter aurescens , a culture thereof, a supernatant of the culture, an extract of the culture, and a lysate of the strain do.
  • the microorganisms of A. globiformis KCCM 40830, A. globiformis KCCM 40829, A. globiformis KCCM 40800, A. ureafaciens KCCM 40801, A. ureafaciens KCCM 40828 and A. aurescens KCCM 41109 were cultured at 30 ° C for 24-48 hours, respectively. The culture was centrifuged to separate the cells and the supernatant, and the supernatant was removed to prepare the enzyme solution. The sugar hydrolytic activity of the 10 species of ascorbic acid was confirmed by the DNS method.
  • Table 1 shows the results of analysis of the crude enzyme solution Sugar hydrolysis
  • the activity and fructose transfer shows the activity of producing steviol glycosides
  • FIGS. 1A and 1B show HPLC chromatographic results of fructose-transferred steviol glycosides prepared using crude enzyme-derived from microorganisms of the genus Asperformus.
  • FIG. 1-9 shows the reaction solution obtained by reacting crude enzyme solution with 10 kinds of ascorbates and steviol glycosides by HPLC to confirm the formation of fructose-transferred steviol glycosides.
  • the steviol glycoside is selected from the group consisting of stevioside, rubusoide, dulcoside A, ribavidoside A / C / D / E / F / M, fugitive transfer stevioside, fructose transfer rubusoid, dulcoside A, Side A / C / D / E / F / M.
  • fructose transfer steviol glycosides were produced in only 7 out of 10 asbestos. This result implies that even a microorganism belonging to the genus Asperformer has a microorganism having an activity capable of specifically transferring fructose to a steviol glycoside in only specific microorganism species.
  • Fructose transesterification To confirm the fructose polymerization degree of steviol glycoside, HPLC / MS analysis was carried out to confirm the molecular weight of the fructose transfer steviol glycoside.
  • FIGS. 10A to 10E show HPLC / MS results of fructose-transferred steviol glycosides prepared using a microorganism derived from asrobacter globomex.
  • fructose transfer steviol glycoside prepared by using the enzyme derived from asrobacter globomes was randomly transferred to steviol glycoside up to 1-3 fructose.
  • fructose transfer steviol glycosides by crude enzyme solution derived from asrobacter glutamate was evaluated.
  • the sugar and steviol glycosides were dissolved in acetic acid buffer solution (pH 5.0), and the crude enzyme solution was added thereto, followed by reaction at 10 to 60 ° C for 24 hours. After the reaction was completed, the formation of fructose transister steviol glycosides in solution was analyzed by HPLC.
  • FIG. 11 is a graph showing the conversion of fructose-linked steviol glycosides (stevioside, riboidoside A) according to temperature.
  • fructose transfer steviol glycosides by aspartame glutamate free enzyme solution was evaluated.
  • Sugar and steviol glycosides were dissolved in acetic acid buffer solution (pH 3.0-5.0), phosphate buffer solution (pH 6.0) and tris buffer solution (pH 7.0-8.0), and then the crude enzyme solution was added to the solution at pH 3 to pH 8 And reacted for 24 hours. After the reaction was completed, the formation of fructose transfer steviol glycosides was analyzed by HPLC.
  • FIG. 12 is a graph showing the synthesis conversion rate of fructose-transferred steviol glycoside (stevioside, rebaudioside A) according to pH.
  • fructose transister steviol glycosides by the concentration of steviol glycosides by the enzyme - linked immunosorbent assay was evaluated.
  • the sugar and steviol glycosides (steviside, ribavidoside A) were dissolved in acetic acid buffer solution (pH 5.0) and reacted at 40 ° C for 24 hours. Sugar concentration was 0.75M and enzyme concentration was 50U / ml. After the reaction was completed, the formation of fructose transfer steviol glycosides was analyzed by HPLC.
  • FIG. 13 is a graph showing the synthesis conversion rate of fructose-transferred steviol glycoside according to stevioside concentration.
  • bakteo glow fructose transition steviol glycosides conversion by the before-miss crude enzyme solution to Ars is (w / w) showed a high level of 0.4% (w / w) to 4% (w / w), especially 1% , Respectively.
  • FIG. 13 is a graph showing the conversion rate of fructose transition ribulose synthase A according to the concentration of ribavudio A.
  • the sugar and steviol glycosides are dissolved in an acetic acid buffer solution (pH 5.0), and the crude enzyme solution is added, followed by reaction at 40 ° C for 24 hours.
  • the reaction solution was deactivated at 100 ⁇ , and impurities were removed using a 0.45 ⁇ filter.
  • the steviol glycoside (stevioside, ribauidoside A), which was excessively transferred, was separated pure using HP20 resin.
  • fructose-transferred stevioside As a result of confirming the structure of fructose-transferred stevioside and the fructose-transferred riboidoside A, the fructose-transferred stevioside was found to be 13 - [(2-0- ⁇ -D-Glucopyranosyl- ⁇ -D-glucopyranosyl) oxy] kaur- D-glucopyranosyl-3-O- ⁇ -D-glucopyranosyl ester, fructose transfer ribavudioside A is 13 - [(2-O- ⁇ -D-glucopyranosyl- ⁇ -D-glucopyranosyl) oxy] ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O- ⁇ -D-fructofuranose- ⁇ -D-glucopyranosyl ester.

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Abstract

본 출원은 아스로박터 유래 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물을 이용하여, 과당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

아스로박터 속 미생물을 이용하여 과당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법
본 출원은 아스로박터 속 미생물을 이용하여, 과당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)의 당 섭취에 따른 질병(비만) 우려에 의해 일일 당 섭취량을 낮출 것을 권고함에 따라, 선진국을 중심으로 정부 주도하에 다양한 당류 섭취량을 줄이기 위한 정책이 활발히 논의 중이다. 이에 시장에서는 다양한 대체감미료 소재에 대한 니즈가 증가하고 있어, 대체감미료 소재가 지속적으로 개발, 상용화 되고있다. 대체감미료로는 합성고감미료(Saccharin, Aspartame, Sucralose 등), 합성당알콜류(Maltitol, Xylitol), 고감미료(Rebaudioside A, Liquorice)으로 지속적으로 변화되고 있다. 그러나 지속적인 합성감미료의 안전성에 대한 우려로 천연감미료에 대한 고객의 니즈가 지속적으로 커지고 있으나, 천연감미료 특유의 이미·이취의 맛 속성 한계로 기존의 합성감미료 중심의 저칼로리·제로칼로리제품을 본격적으로 대체하지 못하고 있는 실정이다.
최근 상당한 주목을 받고 있는 천연의 고감미료는 식물인 스테비아 레바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎에서 추출한 스테비아(Stevia)이다. 스테비아는 천연소재이면서 설탕의 200-300배의 감미도를 가지고 있으며, 스테비오사이드(Stevioside), 리바우디오사이드 (Rebaudioside) A, B, C, D, E, M, 둘코사이드 A(Dulcoside A), 루부소사이드 등으로 이뤄져 있다. 또한 스테비아는 열량을 내지 않고 혈중 포도당과 인슐린 수준에 긍정적이며, 인체에 부작용이 없는 것으로 보고되어 대체감미료로서의 잠재력을 띄고 있지만, 쓴맛이 특히 강하게 발현되는 단점이 있어 사용에 제한을 가지고 있다.
현재까지 스테비아의 감미질 개선 방법으로는 크게 3가지가 있는데, (1)당질 감미료나 아미노산 혹은 아미노산 염과 배합하는 방법과 (2)싸이클로덱스트린과 같이 물질로 포접시키는 물리적 방법과 (3)효소를 이용한 당전이 방법이 알려져 있다. 효소를 이용한 당전이 방법은 CGTase를 이용하여 스테비올 배당체에 포도당(1-12개)을 전이시키는 방법이 현재 널리 사용된다(한국특허출원 제10-1991-0020769호). 하지만, 스테비올 배당체에 전이된 글루코스가 장내 미생물에 의해 모두 분해되어, 칼로리를 상승시키는 결과를 초래한다는 단점이 있다. 따라서, 글루코스가 아닌 당으로 전이시킨 당전이 스테비올 배당체를 제조할 수 있는 새로운 방법의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명자들은 아스로박터 4종 미생물을 이용하여 과당을 스테비올 배당체에 beta 결합으로 당전이 시키는 활성이 있음을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스로박터 크리스탈로포이에테스 (Arthrobacter crystallopoietes), 아스로박터 우레아페시언스 (Arthrobacter ureafaciens,), 및 아스로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물을 이용하여, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된, 과당전이 스테비올 배당체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스로박터 크리스탈로포이에테스 (Arthrobacter crystallopoietes), 아스로박터 우레아페시언스 (Arthrobacter ureafaciens,), 및 아스로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물을 포함하는, 과당전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원에 따른 과당전이 스테비올 배당체 제조방법은, 아스로박터 글로비포미스, 아스로박터 크리스탈로포이에테스, 아스로박터 우레아페시언스, 및 아스로박터 아우레센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물을 이용한 것으로서, 과당전이 스테비올 배당체를 특이적으로 생산할 수 있다. 본 출원에 따른 과당전이 스테비올 배당체는, 스테비올 배당체의 쓴맛이 개선된 고감미료 소재이며, 공지된 글루코스전이 스테비올 배당체에 비하여 칼로리가 높지 않으므로, 다양한 분야에 활용될 수 있다.
도 1 내지 9는 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물이 추출물 및 균주의 파쇄물를 이용하여 제조된 과당전이 스테비올 배당체의 HPLC 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물이 추출물 및 균주의 파쇄물를 이용하여 제조된 과당전이 스테비올 배당체의 HPLC/MS 결과를 나타낸 것이다.
도 11는 온도에 따른 과당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 12은 pH에 따른 과당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 13은 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A)의 농도에 따른 과당전이 스테비올 배당체 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 아스로박터 4종의 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물의 존재하에, 설탕과 스테비올 배당체를 반응시켜 과당전이 스테비올 배당체를 제조하는 단계를 포함하는, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원에서의 용어 "스테비올 배당체"는 천연 감미료의 하나로서, 화학식 1을 갖는다. 상기 스테비올 배당체는 설탕에 비하여 저칼로리이며, 감미도는 설탕의 약 200-300배를 갖는 장점이 있으나, 독특한 떫은맛이나 쓴맛을 수반하는 단점이 있어, 감미질을 개선하는 노력이 있어 왔다.
Figure PCTKR2018012766-appb-C000001
상기 화학식 1에서 R1에는 수소(H)가 결합되어 있거나, 포도당(Glucose)이 β결합으로 1개 내지 3개 결합되어 있을 수 있으며, R2에는 포도당(Glucose) 내지 자일로스(Xylose) 내지 람노스(Rhamnose)가 β결합으로 1개 결합하고 여기에 포도당(Glucose)가 β결합으로 0개 내지 2개 결합되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
α-/β- 글리코시드 결합은 아노머릭 위치(Anomeric position)와 단당의 1번탄소에서 가장 멀리 떨어져 있는 입체중심(Stereocenter)의 상대적 입체화학(Steriochemistry, R형 또는 S형)에 의해 구분된다. 일반적으로 두 개의 탄소가 동일한 입체 화학을 가지고 있을 때 α- 글리코 시드 결합이 형성되는 반면, 두 개의 탄소가 다른 입체 화학을 가질 때 β- 글리코 시드 결합이 발생한다. 본 발명자들은 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스로박터 크리스탈로포이에테스 (Arthrobacter crystallopoietes), 아스로박터 우레아페시언스 (Arthrobacter ureafaciens,), 및 아스로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물이 설탕을 기질로 하여 설탕을 과당으로 분해 및 스테비올 배당체에 선택적으로 1개 내지 3개의 과당을 β-결합으로 연결시킨다는 것을 최초로 규명하였으며, 본 출원의 아스로박터 4종 유래 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물이 과당전이 스테비올 배당체로의 우수한 전환율을 가지며 기존의 스테비올 배당체에 비하여 감미질이 크게 향상되는 장점이 있음을 최초로 규명하였다.
본 출원에서의 용어 "과당전이 스테비올 배당체"는 설탕과 스테비올 배당체를 기질로 하여, 아스로박터 글로비포미스, 아스로박터 크리스탈로포이에테스, 아스로박터 우레아페시언스, 및 아스로박터 아우레센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추추룰 및 균주의 파쇄물에 의해 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 직접 또는 이에 결합된 포도당에 과당이 1개 내지 3개가 β-결합을 통해 부가된 형태일 수 있고, 보다 구체적으로는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 위치에 직접 또는 이에 결합된 포도당에 과당이 1개 내지 3개가 β-(2,6) 결합을 통해 부가된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 과당전이 스테비올 배당체 제조방법의 각 단계에 대하여 구체적으로 설명하면, 우선, 아스로박터 글로비포미스, 아스로박터 크리스탈로포이에테스, 아스로박터 우레아페시언스, 및 아스로박터 아우레센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물을 준비하는 것일 수 있다.
상기 과당전이 스테비올 배당체 제조방법의 다음 단계는 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물 존재하에, 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 것이다.
상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F, 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 상기 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는, pH 1 내지 10 및 1 내지 80 ℃에서 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 pH 2 내지 9 및 5 내지 70 ℃에서 수행될 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 pH 3 내지 8 및 10 내지 60 ℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 제조방법으로 제조된, 과당전이 스테비올 배당체를 제공하는 것이다. 상기 과당전이 스테비올 배당체는, 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 직접 또는 이에 결합된 포도당을 통해 과당이 1개 내지 3개가 β-결합으로 부가된 형태일 수 있고, 보다 구체적으로는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 직접 또는 이에 결합된 포도당을 통해 과당이 1개 내지 3개가 β-(2,6) 결합으로 부가된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물은, 스테비올 배당체로부터 과당전이 스테비올 배당체로의 전환율이 30 내지 70 %일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 출원의 과당전이 스테비오사이드로의 전환율은 공지된 다른 미생물 유래의 효소에 비하여 높은 것을 특징으로 한다. 더욱 구체적으로 상기 과당전이 스테비오사이드로의 전환율은 10 내지 80 %일 수 있으며, 보다 구체적으로는, 상기 전환율은 10 내지 80 %, 20 내지 75 %, 30 내지 70 % 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물은 반응액 내에서 0.01 내지 16 %(w/w)일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.05 내지 8%(w/w), 0.1 내지 6 %(w/w), 0.2 내지 4 %(w/w), 0.4 내지 3 %(w/w), 0.6 내지 2 %(w/w), 0.8 내지 1.5 %(w/w), 또는 1 %(w/w)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로, 상기 방법으로 제조된 과당전이 스테비올 배당체는 과당전이 스테비오사이드, 과당전이 루부소사이드, 과당전이 둘코사이드 A, 과당전이 리바우디오사이드 A, 과당전이 리바우디오사이드 C, 과당전이 리바우디오사이드 D, 과당전이 리바우디오사이드 E, 과당전이 리바우디오사이드 F, 및 과당전이 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스로박터 크리스탈로포이에테스 (Arthrobacter crystallopoietes), 아스로박터 우레아페시언스 (Arthrobacter ureafaciens,), 및 아스로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물이 추출물 및 균주의 파쇄물을 포함하는, 과당전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공한다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 아스로박터 속 조효소액 제조 방법
설탕을 탄소원으로, 이스트 추출물 및 옥수수 침지액을 질소원으로 하는 영양 배지에서 아스로박터 속 10종(A. atorocyaneus KCCM 41106, A. crystallopoietes KCCM 41107, A. sulfureus KCCM 12457, A. oxydans KCCM 11369, A. globiformis KCCM 40830, A. globiformis KCCM 40829, A. globiformis KCCM 40800, A. ureafaciens KCCM 40801, A. ureafaciens KCCM 40828, A. aurescens KCCM 41109)의 미생물을 각각 30℃, 24-48시간 동안 배양하였다. 배양물을 원심분리하여 균체와 상등액을 분리한 후 상등액만 취하여 효소 용액을 준비하였다. 상기 아스로박터 속 10종에 대하여 설탕 가수분해 활성을 DNS 방법으로 확인하였다.
실시예 2: 스테비올 배당체로부터 과당전이 스테비올 배당체의 전환 평가
스테비올 배당체, 설탕을 0.05M 아세테트 완충용액에 용해한 후 실시예 1에서 준비한 아스로박터 속 9종 조효소액를 첨가하여 40℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃에서 실활시킨 후 과당전이 스테비올 배당체의 생산 여부를 HPLC로 확인하였다.
하기의 표 1은, 아스로박터 속 10종 유래 조효소액의 설탕가수분해 활성 및 과당전이 스테비올 배당체 제조 활성을 나타낸 것이고, 도 1a 및 1b는 아스로박터 속 미생물 유래 조효소액를 이용하여 제조된 과당전이 스테비올 배당체의 HPLC 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
균주명 설탕 가수분해 당전이 스테비올 배당체
Arthrobacter atorocyaneus KCCM 41106 ○ Ⅹ
Arthrobacter crystallopoietes KCCM 41107 ○ ○
Arthrobacter sulfureus KCCM 12457 ○ Ⅹ
Arthrobacter oxydans KCCM 11369 ○ Ⅹ
Arthrobacter globiformis KCCM 40830 ○ ○
Arthrobacter globiformis KCCM 40829 ○ ○
Arthrobacter globiformis KCCM 40800 ○ ○
Arthrobacter ureafaciens KCCM 40801 ○ ○
Arthrobacter ureafaciens KCCM 40828 ○ ○
Arthrobacter aurescens KCCM 41109 ○ ○
표 1을 토대로 스테비올 배당체로의 과당전이 활성을 가진 아스로박터 4종(A. crystallopoietes, A. globiformis, A. ureafaciens, A. aurescens)을 선택하였다. 도 1-9는, 아스로박터 10종의 조효소액과 스테비올 배당체를 반응시킨 반응액을 HPLC로 분석하여 과당전이 스테비올 배당체 생성을 확인한 것이다. 여기서 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A/C/D/E/F/M로 과당전이 스테비오사이드, 과당전이 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A/C/D/E/F/M을 생성하는지 HPLC로 확인하였다.
그 결과, 아스로박터 10종 중 7종에서만 과당전이 스테비올 배당체을 생성하였다. 이와 같은 결과는 아스로박터 속에 속하는 미생물이라고 하더라도, 구체적인 일부 미생물 종만 특이적으로 과당을 스테비올 배당체로 전이시킬 수 있는 활성을 갖는 미생물을 가진다는 것을 의미한다. 과당전이 스테비올 배당체의 과당 중합도를 확인하기 위하여 HPLC/MS 분석을 시행하여 과당전이 스테비올 배당체의 분자량을 확인하였다.
도 10a 내지 도 10e는, 아스로박터 글로비포미스 유래 미생물을 이용하여 제조된 과당전이 스테비올 배당체의 HPLC/MS 결과를 나타낸 것이다.
그 결과, 아스로박터 글로비포미스 유래 효소를 이용하여 제조된 과당전이 스테비올 배당체는 과당이 1-3개까지 랜덤하게 스테비올 배당체에 전이된 것임을 확인하였다.
실시예 3: 과당전이 스테비올 배당체 합성에 대한 온도의 영향성
아스로박터 글로비포미스 유래 조효소액에 의한 과당전이 스테비올 배당체생산에 있어서, 온도의 영향성을 평가하였다. 설탕과 스테비올 배당체를 아세트산 완충용액(pH5.0)에 용해한 후, 상기 조효소액를 첨가하여 10 내지 60℃에서 24시간 반응하였다. 반응이 완료된 후, 용액 내 과당전이 스테비올 배당체 생성을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 11은, 온도에 따른 과당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 전환율을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 아스로박터 글로비포미스 조효소액에 의한 과당전이 스테비올 배당체 전환율은 20 내지 40 ℃에서 50 내지 70%의 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: 과당전이 스테비올 배당체 합성에 대한 pH의 영향성
아스로박터 글로비포미스 조효소액에 의한 과당전이 스테비올 배당체 생산에 있어서, pH의 영향성을 평가하였다. 설탕과 스테비올 배당체를 아세트산 완충용액(pH 3.0-5.0), 인산염 완충 용액(pH 6.0), 트리스 완충용액(pH 7.0-8.0)에 용해한 후, 조효소액을 첨가하여 pH 3에서 pH 8의 범위에서 24시간 반응하였다. 반응이 완료된 후, 과당전이 스테비올 배당체의 생성을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 12는, pH에 따른 과당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 아스로박터 글로비포미스 조효소액에 의한 과당전이 스테비올 배당체 전환율은 pH 4 내지 7에서 높은 수준을 나타내었으며, 특히 pH 5.0에서 가장 높게 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: 스테비올 배당체 농도에 따른 과당전이 스테비올 배당체 분석
아스로박터 글로비포미스 조효소액에 의한 스테비올 배당체 농도에 따른 과당전이 스테비올 배당체 생산을 평가하였다. 설탕과 스테비올 배당체(스테비사이드, 리바우디오사이드 A)를 아세트산 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 40℃에서 24시간 반응하였다. 설탕농도는 0.75M, 효소농도는 최종 50U/ml 로 하여 사용하였다. 반응이 완료된 후, 과당전이 스테비올 배당체의 생성을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 13은, 스테비오사이드 농도에 따른 과당전이 스테비올 배당체 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 아스로박터 글로비포미스 조효소액에 의한 과당전이 스테비올 배당체 전환율은 0.4%(w/w) 내지 4%(w/w)에서 높은 수준을 나타내었으며, 특히 1%(w/w) 에서 가장 높게 나타냄을 확인하였다.
도 13은, 리바우디오 A 농도에 따른 과당전이 리바우디오사이드 A 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 아스로박터 글로비포미스 조효소액에 의한 과당전이 리바우디오사이드 A 전환율은 0.5%(w/w) 내지 2%(w/w)에서 높은 수준을 나타내었으며, 특히 1%(w/w) 에서 가장 높게 나타냄을 확인하였다.
실시예 6: 과당전이 스테비올 배당체 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 분석
설탕과 스테비올 배당체를 아세트산 완충용액(pH 5.0)에 용해한 후, 상기 조효소액를 첨가하여 40℃에서 24시간 반응시킨다. 반응용액을 100℃에서 실활시킨후, 0.45㎛ 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다. HP20레진을 이용하여 과당 한 개가 전이된 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A)를 각각 순수 분리하였다. 분리된 과당전이 스테비오사이드와 과당전이 리바우디오사이드 A 의 결합 구조를 분석하고자 1H/13C NMR, Homonuclear correlation spectroscopy(COSY), Total correlation spectroscopy (TOCSY), Heteronuclear single-quantum coherence (HSQC), 및 heteronuclear multiple-bond correlation (HMBC)로 확인하고, 그 결과(1H/13C NMR, COSY 그리고 HMBC)를 하기 표 2-3 및 표 4-5에 나타내었다.
또한, 과당전이 스테비오사이드와 과당전이 리바우디오사이드 A 구조를 확인한 결과, 과당전이 스테비오사이드는 13-[(2-O-β-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranosyl)oxy]kaur-16-en-18-oic acid 6-O-β-D-fructofuranose-β-D-glucopyranosyl ester 으로, 과당전이 리바우디오사이드 A는 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O-β-D-fructofuranose-β-D-glucopyranosyl ester으로 신규 화합물임을 확인하였다.
< 과당전이 스테비오사이드 모식도 >
Figure PCTKR2018012766-appb-I000001
< 과당전이 리바우디오사이드 A 모식도 >
Figure PCTKR2018012766-appb-I000002
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2018012766-appb-T000001
Figure PCTKR2018012766-appb-T000002
Figure PCTKR2018012766-appb-T000003
Figure PCTKR2018012766-appb-T000004

Claims (9)

  1. 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스로박터 크리스탈로포이에테스 (Arthrobacter crystallopoietes), 아스로박터 우레아페시언스 (Arthrobacter ureafaciens,), 및 아스로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물을 이용하여, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물에서, 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 단계를 포함하는, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F, 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는, pH 3 내지 8 및 10 내지 60 ℃에서 수행되는, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 과당전이 스테비올 배당체는, 과당을 1 내지 3개 포함하는, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 과당전이 스테비올 배당체는, 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 직접 또는 이에 결합된 포도당을 통해 과당이 β-(2,6) 결합으로 연결되어 부가된 스테비올 배당체인, 과당전이 스테비올 배당체 제조방법.
  7. 제1항의 방법으로 제조된, 과당전이 스테비올 배당체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 과당전이 스테비올 배당체는, 과당전이 스테비오사이드, 과당전이 루부소사이드, 과당전이 둘코사이드 A, 과당전이 리바우디오사이드 A, 과당전이 리바우디오사이드 C, 과당전이 리바우디오사이드D, 과당전이 리바우디오사이드 E, 과당전이 리바우디오사이드 F, 및 과당전이 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 과당전이 스테비올 배당체.
  9. 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아스로박터 크리스탈로포이에테스 (Arthrobacter crystallopoietes), 아스로박터 우레아페시언스 (Arthrobacter ureafaciens,), 및 아스로박터 아우레센스 (Arthrobacter aurescens)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아스로박터 속 미생물, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 균주의 파쇄물을 포함하는, 과당전이 스테비올 배당체 생산용 조성물.
PCT/KR2018/012766 2017-10-27 2018-10-25 아스로박터 속 미생물을 이용하여 과당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법 WO2019083309A2 (ko)

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