TW201923085A - 使用節桿菌屬之微生物製備轉果糖基化之甜菊醣苷之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明內容為有關使用衍生自節桿菌之微生物、其培養物、該培養物之上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物製備轉果糖基化之甜菊醣苷之方法。
Description
本揭示內容為有關使用節桿菌屬之微生物製備轉果糖基化之甜菊醣苷之方法。
由於世界衛生組織(WHO)建議降低因糖消耗導致的疾病(肥胖症)問題導致的每日糖攝入量,因此已開發國家的政府正在積極討論旨在減少糖攝入量的各種政策。因此,隨著市場上對開發各種替代甜味劑的需求的增加,替代甜味劑不斷被開發和商業化。作為替代甜味劑,這些是合成高強度甜味劑(例如,糖精、阿斯巴甜、三氯蔗糖等),合成糖醇(例如,麥芽糖醇和木糖醇)及高強度甜味劑(例如,甜葉菊苷A和甘草)的形式連續變化的目標。然而,由於擔心合成甜味劑的安全性,消費者對天然甜味劑的需求一直在穩步增長;然而,由於天然甜味劑的獨特風味特性的限制(即,異味和變味),天然甜味劑不能完全取代現有基於合成甜味劑的低卡路里和零卡路里產品。
近年來受到廣泛關注的天然高強度甜味劑是從菊科甜菊屬甜葉菊種(Stevia rebaudiana Bertoni)的葉子中提取的甜菊萃。甜菊萃是一種天然材料,其甜度是糖的200至300倍。此外,甜菊萃係由甜菊苷、甜葉菊苷A、B、C、D、E和M、衛矛醇苷A、甜茶苷等所組成。此外,甜菊萃具有作為替代甜味劑的潛在用途,因為據報導它不產生卡路里,對血糖和胰島素水平是正向的,對人體無副作用;然而,甜菊萃具有苦味,這表示在使用中存在限制。
到目前為止,已經有三種方法來改善甜菊萃的甜味:(1)與醣類甜味劑、胺基酸或胺基酸鹽混合的方法,(2)包含諸如環糊精的材料的物理方法;以及(3)使用酶轉移葡萄糖的方法。至於使用酶轉移葡萄糖的方法,使用CGT酶將1至12個葡萄糖分子轉移至甜菊醣苷的方法係在發明所屬技術領域中被廣泛使用(韓國專利申請案第10-1991-0020769號)。然而,此方法的缺點在於轉移到甜菊醣苷的所有葡萄糖都被腸道微生物降解,從而增加了卡路里。因此,需要一種製備其中轉移除葡萄糖之外的醣類的甜菊醣苷的新穎方法。
在這種情況下,本案發明者已藉由發現使用節桿菌屬(Arthrobacter)的四種微生物以β-鍵對甜菊醣苷具有轉果糖基化活性,而完成了本揭示內容。
本揭示內容的一個目的是提供一種製備轉 果糖基化之甜菊醣苷的方法,其係使用一種或多種選自由球形節桿菌(Arthrobacter gluobiformis)、成晶節桿菌(Arthrobacter crystallopoietes)、產腺節桿菌(Arthrobacter ureafaciens)和金黃色節桿菌(Arthrobacter aurescens)所組成群組之節桿菌屬之微生物;其培養物;該培養物之上清液;該培養物之提取物;以及該微生物的裂解物。
本發明內容的另一個目的是提供根據上述製備方法製備的轉果糖基化之甜菊醣苷。
本發明內容的另一個目的是提供一種用於產生轉果糖基化之甜菊醣苷的組合物,其包含一種或多種選自由球形節桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌和金黃色節桿菌所組成群組之節桿菌屬之微生物;其培養物;該培養物之上清液;該培養物之提取物;以及該微生物的裂解物。
在後文中,將詳細描述本揭示內容。同時,本文中揭示的每個說明和例示性具體實施例可以應用於其他說明和例示性具體實施例。也就是說,本文揭示的各種因素的所有組合皆屬於本揭示內容的範疇。此外,本揭示內容的範疇不應受限於後文提供的具體揭示內容。
為了達成本揭示內容的目的,本揭示內容的一個態樣提供了一種用於製備轉果糖基化之甜菊醣苷的方法,包括藉由使甜菊醣苷與糖在節桿菌屬的四種微生物、其培養物、該培養物之上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物的存在下反應而製備轉果糖基化之甜菊醣 苷。
如本文所用,術語“甜菊醣苷”是指具有化學式1的天然甜味劑。甜菊醣苷的優點在於其與糖相比具有更少的卡路里,並且其甜度是糖的甜度的約200至300倍;但缺點在於它伴有獨特的澀味或苦味。因此,已經努力改善甜菊醣苷的甜度。
在化學式1中,在R1處,可以結合氫(H),或者可以經由β-鍵結合1至3個葡萄糖分子;在R2處,可以結合葡萄糖、木糖以及鼠李糖中的任一者,並且可以經由β-鍵將0至2個葡萄糖分子與其結合,但是這些不限於此。
α-/β-糖苷鍵的區別在於離單醣的1-碳最遠的立體中心的變旋異構異位置和相對立體化學(R-型或S-型)。通常,當兩個碳具有相同的立體化學時形成α-糖苷鍵,而當兩個碳具有不同的立體化學時產生β-糖苷鍵。本 案發明人首次發現選自由球形節桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌和金黃色節桿菌所組成群組之節桿菌屬的一種或多種微生物、其培養物、該培養物的上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物係使用糖作為基質,將糖分解成果糖,並藉由β-鍵將1至3個果糖分子選擇性地鏈接至甜菊醣苷。此外,本案發明人首先發現本揭示內容的衍生自四種節桿菌之微生物、其培養物、該培養物的上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物是有利的,因為它們具有轉成轉果糖基化之甜菊醣苷的優異轉化率,並且與現有的甜菊醣苷相比,其甜度顯著提高。
如本文所用,術語“轉果糖基化之甜菊醣苷”可以指具有如下形式的甜菊醣苷:藉由選自由球形節桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌和金黃色節桿菌所組成群組之節桿菌屬的一種或多種微生物、其培養物、該培養物的上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物及藉由使用糖和甜菊醣苷作為基質,而將1至3個果糖分子直接添加至甜菊醣苷之19-OH位點,或直接添加至經由β-鍵與該甜菊醣苷接合之葡萄糖。更具體地,轉果糖基化之甜菊醣苷可為以其中1至3個果糖分子直接添加至甜菊醣苷的19-OH位點或直接添加至藉由β-(2,6)鍵與該甜菊醣苷接合之葡萄糖的形式,但不限於此。
將詳細描述用於製備轉果糖基化之甜菊醣苷的方法的每個步驟。首先,在該方法中,可製備選自由球形節桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌和金黃色節桿菌所 組成群組之節桿菌屬的一種或多種微生物、其培養物、該培養物的上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物。
在用於製備轉果糖基化之甜菊醣苷的方法的下一步驟中,糖可以在節桿菌屬的微生物、其培養物、該培養物的上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物的存在下,與甜菊醣苷反應。
本文中,甜菊醣苷可以是選自由甜菊苷、甜茶苷、衛矛醇苷A、甜葉菊苷A、甜葉菊苷C、甜葉菊苷D、甜葉菊苷E、甜葉菊苷F以及甜葉菊苷M所組成群組之一種或多種,但不限於此。
使糖與甜菊醣苷反應的步驟可以在1至80℃的溫度且於1至10的pH進行,更具體地,在5至70℃的溫度且於2至9的pH,以及最具體地,在10℃至60℃的溫度且於pH為3至8,但pH和溫度不限於此。
為了實現本揭示內容的目的,本揭示內容的另一態樣提供了一種藉由上述製備方法製備的轉果糖基化之甜菊醣苷。轉果糖基化之甜菊醣苷可為以其中1至3個果糖分子直接添加至甜菊醣苷的19-OH位點或直接添加至經由β-鍵與該甜菊醣苷接合的葡萄糖的形式,以及更具體地,可為以其中1至3個果糖分子直接添加至甜菊醣苷的19-OH位點或直接添加至經由β-(2,6)鍵與該甜菊醣苷接合的葡萄糖的形式,但是不限於此。
節桿菌屬的微生物、其培養物、該培養物 的上清液、該培養物的提取物和該微生物的裂解物可具有從甜菊醣苷到轉果糖基化之甜菊醣苷的轉化率為30%至70%。但該轉化率不限於此。具體而言,本揭示內容的轉果糖基化之甜菊苷的轉化率高於其他已知的衍生自微生物之酶。更具體地,轉化為轉果糖基化之甜菊苷的轉化率可以為10%至80%,並且具體地可以為10%至80%、20%至75%或30%至70%,但該轉化率不限於此。
另外,節桿菌屬的微生物、其培養物,該培養物的上清液、該培養物的提取物以及該微生物的裂解物在反應溶液中可以是0.01%(重量/重量)至16%(重量/重量),更具體地,可以是0.05%(重量/重量)至8%(重量/重量)、0.1%(重量/重量)至6%(重量/重量)、0.2%(重量/重量)至4%(重量/重量)、0.4%(重量/重量)至3%(重量/重量)、0.6%(重量/重量)至2%(重量/重量)、0.8%(重量/重量)至1.5%(重量/重量)或1%(重量/重量),但不限於此。
更具體地,根據上述方法之轉果糖基化之甜菊醣苷可以是選自由轉果糖基化之甜菊苷、轉果糖基化之甜茶苷、轉果糖基化之衛矛醇苷A、轉果糖基化之甜葉菊苷A、轉果糖基化之甜葉菊苷C、轉果糖基化之甜葉菊苷D、轉果糖基化之甜葉菊苷E、轉果糖基化之甜葉菊苷F以及轉果糖基化之甜葉菊苷M所組成群組之一種或多種,但不限於此。
本揭示內容的另一態樣提供了一種用於產生轉果糖基化之甜菊醣苷的組成物,其包含選自由球形節 桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌和金黃色節桿菌所組成群組之節桿菌屬的一種或多種微生物;其培養物;該培養物之上清液;該培養物之提取物;以及該微生物的裂解物。
用於製備轉果糖基化之甜菊醣苷的本揭示內容的方法可以藉由使用選自由球形節桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌和金黃色節桿菌所組成群組之節桿菌屬的一種或多種微生物;其培養物;該培養物之上清液;該培養物之提取物;以及該微生物的裂解物而製備。根據本揭示內容的轉果糖基化之甜菊醣苷是一種用於高強度甜味劑的材料,其具有改善的苦味,並且與已知的轉葡糖基化之甜菊醣苷相比,其熱量含量不高,因此可用於各個領域。
第1圖至第9圖顯示使用節桿菌屬之微生物、其培養物、該培養物之上清液、該培養物之提取物以及該微生物之裂解物,而製備的轉果糖基化之甜菊醣苷的HPLC結果。
第10圖顯示使用節桿菌屬之微生物、其培養物,該培養物之上清液,該培養物之提取物以及該微生物之裂解物製備的轉果糖基化之甜菊醣苷的HPLC/MS結果。
第11圖顯示轉果糖基化之甜菊醣苷(甜菊苷和甜葉菊苷A)根據溫度之轉化率之圖形。
第12圖顯示轉果糖基化之甜菊醣苷(甜菊苷和甜葉菊 苷A)根據pH之轉化率之圖形。
第13圖顯示轉果糖基化之甜菊醣苷根據甜菊醣苷(甜菊苷和甜葉菊苷A)之濃度之轉化率之圖形。
在後文中,將結合所附例示性具體實施例詳細描述本揭示內容。然而,本文公開的例示性實施例僅用於說明目的,不應被解釋為限制本揭示內容的範疇。
實施例1:節桿菌屬的微生物粗酶液的製備方法
在含有酵母提取物和作為氮源之玉米漿以及作為碳源之糖的營養培養基中,節桿菌屬的10種微生物(即黑藍節桿菌KCCM 41106(Arthrobacter atrocyaneus)、成晶節桿菌KCCM 41107、硫磺節桿菌(Arthrobacter sulfureus)KCCM 12457、氧化節桿菌(Arthrobacter oxydans)KCCM 11369、球形節桿菌KCCM 40830、球形節桿菌KCCM 40829、球形節桿菌KCCM 40800、產腺節桿菌KCCM 40801、產腺節桿菌KCCM 40828以及金黃色節桿菌KCCM 41109)在30℃培養24小時到48小時。將培養物離心以分離細胞和上清液,然後將上清液僅用於製備粗酶液。節桿菌屬的10種微生物的糖水解活性係藉由DNS方法確認。
實施例2:評估從甜菊醣苷轉化為轉果糖基化之甜菊醣苷
將甜菊醣苷和糖溶解在0.05M之乙酸鹽緩衝溶液中,及在其中加入已在實施例1中製備的節桿菌屬的9種微生 物的粗酶液,然後在40℃反應24小時。反應後,將產物在100℃滅活,然後藉由HPLC確認轉果糖基化之甜菊醣苷的產生。
下表1顯示衍生自節桿菌屬的10種微生物的粗酶液的糖水解活性和對甜菊醣苷的轉果糖基化活性;第1圖顯示使用衍生自節桿菌屬的微生物的粗酶液製備之果轉糖基化之甜菊醣苷的HPLC色譜結果。
基於上表1,選擇對甜菊醣苷具有轉果葡糖基化活性的節桿菌屬的四種微生物(即,成晶節桿菌、球形節桿菌、 產腺節桿菌以及金黃色節桿菌)。第1圖至第9圖顯示藉由HPLC分析藉由使節桿菌屬的10種微生物的粗酶液與甜菊醣苷反應而獲得的反應溶液來產生轉果糖基化之甜菊醣苷。本文中,甜菊醣苷是甜菊苷、甜茶苷、衛矛醇苷A以及甜葉菊苷A/C/D/E/F/M,以及藉由HPLC確認它們是否產生轉果糖基化之甜菊醣苷、經過果糖基化之甜茶苷,轉葡萄糖基化之衛矛醇苷A以及轉果糖基化之甜葉菊苷A/C/D/E/F/M。
結果,在節桿菌屬的10種微生物中,只有7種微生物產生轉果糖基化之甜菊醣苷。此結果意味著只有節桿菌屬的一些特定微生物具有將果糖特異性地轉移至甜菊醣苷的活性。轉果糖基化之甜菊醣苷的分子量係藉由HPLC/MS分析,來確定轉果糖基化之甜菊醣苷的果糖聚合度來確定。
第10圖顯示使用衍生自球形節桿菌的微生物製備的轉果糖基化之甜菊醣苷的HPLC/MS分析結果。
結果證實,在使用衍生自球形節桿菌的酶製備的轉果糖基化之甜菊糖苷中,將1至3個果糖分子隨機轉移至甜菊醣苷。
實施例3:溫度對轉果糖基化之甜菊醣苷合成的影響
在藉由衍生自球形節桿菌的粗酶液而產生之轉果糖基化之甜菊醣苷中,評估溫度的影響。將甜菊醣苷和糖溶解在乙酸緩衝液(pH5.0)中,並在其中加入粗酶液,然後在 10℃至60℃反應24小時。反應後,藉由HPLC分析反應溶液中轉果糖基化之甜菊醣苷的產生。
第11圖是顯示轉果糖基化之甜菊醣苷(甜菊苷和甜葉菊苷A)根據溫度的轉化率的圖。
結果證實,球形節桿菌的粗酶液對轉果糖基化之甜菊醣苷的轉化率在20℃至40℃時高達50%至70%。
實施例4:pH對轉果糖基化之甜菊醣苷合成的影響
在藉由源自球形節桿菌的粗酶液而產生轉果糖基化之甜菊醣苷中,評估了pH的影響。將甜菊醣苷和糖溶解在乙酸緩衝液(pH 3.0至pH 5.0)、磷酸鹽緩衝液(pH 6.0)以及Tris緩衝液(pH7.0至pH 8.0)中。此後,在其中加入粗酶液,並在pH 3至pH 8進行反應24小時。反應後,藉由HPLC分析轉果糖基化之甜菊醣苷的產生。
第12圖是顯示轉果糖基化之甜菊醣苷(甜菊苷和甜葉菊苷A)根據pH之轉化率之圖。
結果證實,球形節桿菌的粗酶液對轉果糖基化之甜菊醣苷的轉化率在pH 4.0至pH 7.0時高,特別是在pH 5.0時最高。
實施例5:根據甜菊醣苷的濃度分析轉果糖基化之甜菊醣苷
評估了根據不同濃度之甜菊醣苷濃度,藉由球形節桿菌之粗酶液產生之轉果糖基化之甜菊醣苷。將糖和甜菊醣苷(甜菊苷和甜葉菊苷A)溶解在乙酸緩衝液(pH5.0)中,且 在40℃進行反應24小時。反應在糖濃度為0.75M,最終酶濃度為50U/mL的條件下進行。反應後,藉由HPLC分析轉果糖基化之甜菊醣苷的產生。
第13圖是顯示轉果糖基化之甜菊醣苷根據甜菊苷之濃度之轉化率之圖。
結果證實,球形節桿菌的粗酶液對轉果糖基化之甜菊醣苷的轉化率高達0.4%(重量/重量)至4%(重量/重量),特別地,最高為1%(重量/重量)。
第13圖是顯示根據甜菊葉苷A的濃度的轉果糖基化的甜菊葉苷A的合成轉化率的圖。結果,證實了球形節桿菌的粗酶液對轉果糖基化之甜葉菊苷A的轉化率高達0.5%(重量/重量)至2%(重量/重量),特別地,1%(重量/重量)時最高。
實施例6:轉果糖基化之甜菊醣苷之核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)分析
將糖和甜菊醣苷溶解在乙酸緩衝液(pH5.0)中,然後在其中加入粗酶液,然後在40℃反應24小時。將反應溶液在100℃滅活,然後使用0.45μm過濾器除去雜質。將HP20樹脂用以純粹分離其中一個果糖經轉移之各甜菊醣苷(甜菊苷和甜葉菊苷A)。藉由1H/13C NMR、同核關聯性頻譜(homoclear correlation spectroscopy,COZY)、全關聯性頻譜光譜(total correlation spectroscopy,TOCSY)、異核單量子相關譜(heteronuclear single-quantum coherence,HSQC)以及異核多鍵關聯性(heteronulcear multiple-bond correlation),分析經分離之轉果糖基化之甜菊醣苷和轉果糖基化之甜葉菊苷A之鍵結結構。另外,其結果(1H/13C NMR、COSY和HMBC)係示於表2和3中。
此外,鑑定了轉果糖基化之甜菊醣苷和轉果糖基化之甜葉菊苷A之結構的結果,證實這些是新穎化合物,因為轉果糖基化之甜菊苷具有13-[(2-O-β-D-葡萄哌喃糖基-α-D-葡萄哌喃糖基)氧基]貝殼衫-16-烯-18-酸6-O-β-D-呋喃果糖-β-D-葡萄哌喃糖基酯的結構和轉果糖基化之甜葉菊苷A具有13-[(2-O-β-D-葡萄哌喃糖基-3-O-β-D-葡萄呱喃糖基-β-D-葡萄哌喃糖基)氧基]映-貝殼衫-16-烯-19-酸6-O-β-D-呋喃果糖-β-D-葡萄哌喃糖基酯之結構。
<轉果糖基化之甜菊醣苷的圖解>
<轉果糖基化之甜葉菊苷A的圖解>
雖然已經參考特定的闡釋性具體實施例描述了本揭示內容,發明所述技術人員將理解,本顯示內容可以以其他特定形式體現而不脫離本揭示內容的技術精神或者必要特點。因此,上述具體實施例在所有方面都被認為是闡釋性,而非限制性。此外,本揭示內容的範疇由所附申請專利範圍界定,而不是由實施方式所限定,並且應當理解,從本揭示內容的含義和範疇及其等效物衍生之所有修改或變化都包括在本揭示內容的範疇內。
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<400> 1
<210> 2
<211> 414
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 產腺節桿菌之β呋喃果糖苷酶蛋白
<400> 2
Claims (9)
- 一種製備轉果糖基化之甜菊醣苷之方法,該方法係使用選自由球形節桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌以及金黃色節桿菌所組成群組之節桿菌屬之一種或多種微生物;其培養物;該培養物之上清液;該培養物之提取物;以及該微生物的裂解物。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中,該方法包括使甜菊醣苷與該節桿菌屬之微生物、該其培養物、該培養物之該上清液、該培養物之該提取物以及該微生物之該裂解物反應。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中該甜菊醣苷係選自由甜菊苷、甜茶苷、衛矛醇苷A、甜葉菊苷A、甜葉菊苷C、甜葉菊苷D、甜葉菊苷E、甜葉菊苷F以及甜葉菊苷M所組成群組之一種或多種。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法,其中使該甜菊醣苷與該糖反應在pH為3至8,溫度為10℃至60℃進行反應。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該轉果糖基化之甜菊醣苷包含1至3個果糖分子。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該轉果糖基化之甜菊醣苷是甜菊醣苷中之果糖藉由直接鏈接至該甜菊醣苷之19-OH位點或經由藉由β-(2,6)鍵而與該甜菊醣苷接合之葡萄糖而添加。
- 一種轉果糖基化之甜菊醣苷,其係藉由如申請專利範圍 第1項所述之方法製備。
- 如申請專利範圍第7項所述之轉果糖基化之甜菊醣苷,其中該轉果糖基化之甜菊醣苷係選自由轉果糖基化之甜菊苷、轉果糖基化之甜茶苷、轉果糖基化之衛矛醇苷A、轉果糖基化之甜葉菊苷A、轉果糖基化之甜葉菊苷C、轉果糖基化之甜葉菊苷D、轉果糖基化之甜葉菊苷E、轉果糖基化之甜葉菊苷F以及轉果糖基化之甜葉菊苷M所組成群組之一種或多種。
- 一種用於產生轉果糖基化之甜菊醣苷之組合物,包括選自由球形節桿菌、成晶節桿菌、產腺節桿菌以及金黃色節桿菌所組成群組之節桿菌屬之一種或多種微生物;其培養物;該培養物之上清液;該培養物之提取物;以及該微生物的裂解物。
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