WO2019044937A1 - 核酸搭載ユニット型ポリイオンコンプレックス - Google Patents

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WO2019044937A1
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nucleic acid
block copolymer
polyion complex
upic
segment
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片岡　一則
完二郎 宮田
重人 福島
光太朗 林
秀美代 渡邉
ヒョンジン キム
藤　加珠子
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国立大学法人 東京大学
公益財団法人川崎市産業振興財団
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Definitions

  • the present invention relates to a unitary polyion complex carrying a nucleic acid and a composition comprising the unitary polyion complex.
  • nucleic acid drugs can control various genes in cells, their application to various diseases such as cancer and hereditary diseases which have been considered difficult to treat so far is strongly expected.
  • nucleic acid drugs require appropriate delivery techniques to target cells due to the low in vivo stability of the nucleic acid molecule itself.
  • a nucleic acid delivery technology conventionally, a block copolymer having a hydrophilic polymer segment and a cationic polymer segment is used, and a complex (polyion complex) is generated through electrostatic interaction between the nucleic acid and the block copolymer. There is technology to form.
  • the polyion complex obtained by the above prior art is, for example, a polyion complex consisting of an indefinite number of nucleic acids and a block copolymer, wherein the block copolymer directs the hydrophilic polymer segments outward and the cationic polymer segments inside.
  • a polyion complex (hereinafter sometimes referred to as “micellar type polyion complex”) arranged radially in a state of containing a nucleic acid (hereinafter referred to as “micellar type polyion complex”) and a polyion complex consisting of a specific number of nucleic acids and a block copolymer.
  • polyion complexes hereinafter sometimes referred to as “unit-type polyion complexes” or “uPIC”) present as a stable structural unit in vivo, for example, in blood (eg, Patent Document 1).
  • the unit-type polyion complex described in Patent Document 1 has a clear structure consisting of a specific number of nucleic acids and a block copolymer, and can improve the retention of nucleic acids in blood.
  • the nucleic acid and / or the nucleic acid and / or the negative charge from the nucleic acid and the positive charge from the block copolymer are offset so that the unitary polyion complex becomes electrically neutral. Careful design of block copolymers is required.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and its main object is to provide a unit type polyion complex which can be designed more easily.
  • a unitary polyion complex composed of a specific number of block copolymers having polyethylene glycol segments and cationic polyamino acid segments and a specific number of nucleic acids.
  • the sum of the positive charges derived from the side chain of the cationic polyamino acid segment of the block copolymer is not offset by the sum of the negative charges derived from the nucleic acid;
  • the chain length of the nucleic acid is The molecular weight of the polyethylene glycol segment is 40 ⁇ 10 3 or more; and the binding constant (Ka) of the block copolymer to the nucleic acid is 3.0 ⁇ 10 5 or more.
  • the unitary polyion complex is composed of two molecules of the block copolymer and one molecule of the nucleic acid.
  • the nucleic acid is a double stranded nucleic acid.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol segment is 60 ⁇ 10 3 or more.
  • the polyethylene glycol segment is bifurcated and the molecular weight of each polyethylene glycol chain is at least 20 ⁇ 10 3 .
  • the cationic polyamino acid comprises ornithine as a constituent amino acid.
  • a composition for nucleic acid delivery comprising the unit type polyion complex and a block copolymer which can constitute the unit type polyion complex, wherein the block copolymer is free.
  • the ratio (N / P ratio) of the molar concentration of the amino group derived from the block copolymer to the molar concentration of the phosphate group derived from the nucleic acid in the composition is 1 to 20.
  • block copolymers having a predetermined affinity for nucleic acids are used.
  • a unit-type polyion complex capable of improving the retention of the nucleic acid in the blood even in the state where the charge is not offset.
  • Such unit-type polyion complexes are more easily designed than conventional unit-type polyion complexes because it is not necessary to strictly control the negative charge derived from nucleic acid and the positive charge derived from block copolymer during preparation. obtain.
  • a unit type polyion complex composed of a specific number of block copolymers having a polyethylene glycol segment and a cationic polyamino acid segment and a specific number of nucleic acids, wherein the block in the unitary polyion complex
  • a unit-type polyion complex in which the sum of positive charges derived from the side chain of the cationic polyamino acid segment of the copolymer is not offset by the sum of negative charges derived from the nucleic acid (as a result, it is not neutralized electrically Unit type polyion complex) is provided.
  • the block copolymer and the nucleic acid used in the present invention can each exhibit a certain degree of polydispersity when obtained as a polymerization reaction product. Therefore, in the present specification, when referring to the properties of the block copolymer (molecular weight, polymerization degree, charge etc.) and the properties of the nucleic acid (base length, charge etc.), polymerization showing polydispersity unless otherwise stated. We shall refer to the average of all reactions. Therefore, for example, the charge amount of the block copolymer is calculated based on the average degree of polymerization, with the degree of polymerization of the cationic amino acid residue actually measured and obtained being the average degree of polymerization.
  • FIGS. 1 (a) to (d) are schematic diagrams illustrating an example of uPIC in the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 (a) is a schematic view of a block copolymer that can be used in the present invention
  • FIG. 1 (b) is a schematic view of a nucleic acid that can be used in the present invention
  • FIG. 1 (d) is the space of the PEG segment in uPIC of FIG. 1 (c). It is the schematic which showed the typical spread.
  • Each of the block copolymers 10a and 10b shown in FIG. 1 (a) has bi-branched PEG segments 13a, 14a, 13b and 14b and cationic polyamino acid segments 12a and 12b.
  • the nucleic acid 20a shown in FIG. 1 (b) is a double stranded nucleic acid having an overhang of 2 bases each.
  • the block copolymer 10a, 10b and the nucleic acid 20a are associated by electrostatic interaction between the positive charge from the cationic polyamino acid segment 12a, 12b and the negative charge from the nucleic acid 20a, thereby forming the uPIC 100 ( Figure 1 (c)).
  • the block copolymers 10a, 10b can typically be arranged in opposite directions to each other in the main chain direction of the nucleic acid 20a. Thereby, steric hindrance caused by mutual overlapping of the PEG segments 13a, 13b, 14a, 14b can be suppressed. As a result, even a block copolymer having a branched long chain PEG segment can be suitably electrostatically coupled to a nucleic acid to form uPIC. Further, by arranging in this manner, as shown in FIG. 1D, four PEG segments 13a, 13b, 14a, 14b can be spread so as to cover the entire nucleic acid 20a. It can contribute to a high degree of protection. In one embodiment, four PEG segments may be positioned such that each end is at the apex of a substantially tetrahedron, and nucleic acids may be located within the tetrahedron.
  • the uPIC of the present embodiment may be configured of a specific number of block copolymers and a specific number of nucleic acids, and is not limited to the configuration of the illustrated example.
  • the amount of positive charge from the side chain of the cationic polyamino acid segment of the block copolymer is not offset by the amount of negative charge from nucleic acid , As a result, not electrically neutralized.
  • the sum of the positive charges derived from the side chain of the cationic polyamino acid segment of the block copolymer in the unitary polyion complex is not offset by the sum of the negative charges derived from the nucleic acid” or “uPIC”
  • the sum (absolute value) of the amount of charge derived from the side chain of the cationic polyamino acid segment of all block copolymers contained in uPIC is contained in uPIC It means less than 90% or more than 110% of the sum (absolute value) of the amount of charge derived from all nucleic acids.
  • uPIC which is charged by selecting a block copolymer having a predetermined affinity for nucleic acid and adopting a long PEG segment.
  • the structure can be stably maintained, and excellent blood retention can be obtained.
  • the total positive charge from the side chain of the cationic polyamino acid segment of the whole block copolymer in uPIC in physiological pH environment is 45% of the total negative charge from all nucleic acids in uPIC It may be more than 90% (eg, 50% to 85%, or 50% to 80%).
  • the total positive charge from the side chain of the cationic polyamino acid segment of the block copolymer in uPIC in a physiological pH environment is greater than 110% of the total negative charge from the nucleic acid 150 % Or less (eg, 115% to 140%).
  • the uPIC of this embodiment is typically smaller than the micelle-type PIC.
  • the particle size (hydrodynamic diameter) of the uPIC of this embodiment is preferably 10 nm to 30 nm, and may be, for example, 10 nm to 25 nm, and also, for example, 10 nm to 20 nm. Such compactness can contribute to delivering the loaded nucleic acid deep into the tissue.
  • the block copolymer that can be used in the present embodiment has a PEG segment and a cationic polyamino acid segment, and is 3.0 ⁇ 10 5 or more, preferably 5.0 ⁇ 10 5 or more, with respect to the nucleic acid to be delivered. It has a coupling constant (Ka) of (for example, 8.0 ⁇ 10 5 or more, 1.0 ⁇ 10 6 or more, 1.5 ⁇ 10 6 or more, or 2.0 ⁇ 10 6 or more).
  • Ka coupling constant
  • block copolymers By using a block copolymer having the above-described predetermined affinity for nucleic acid, it becomes difficult for the block copolymer to dissociate from uPIC in blood, or it can be reassociated immediately if dissociated, as a result, nucleic acid It is speculated that the nucleic acid can be well protected and high blood retention can be obtained even when the negative charge from the block copolymer and the negative charge from the block copolymer are not offset.
  • the upper limit value of the coupling constant (Ka) is not particularly limited, but may be, for example, 4.0 ⁇ 10 6 or less from the viewpoint of realization ease.
  • block copolymers also include pharmaceutically acceptable salts of the block copolymers.
  • the binding constant (Ka) is measured by the method described in the examples below.
  • the binding constant (Ka) tends to increase as the electrostatic bond between the cationic polyamino acid segment and the nucleic acid increases or as the individual electrostatic bond becomes stronger. Therefore, the binding constant (Ka) can be controlled within a desired range by adjusting the positive charge number of the cationic polyamino acid segment, selecting the kind of constituent amino acid of the cationic polyamino acid segment, etc.
  • the binding constant (Ka) mainly depends on the negative charge amount of the nucleic acid, and it is considered that if the base length is the same, it does not substantially change due to the difference in the base sequence.
  • the PEG segment is preferably branched, more preferably di-chain branched. It goes without saying that the PEG segment may be in a single chain form containing only one PEG chain.
  • the molecular weight of the PEG segment (in the case of a branched type, the sum of the molecular weights of the respective PEG chains) is 40 ⁇ 10 3 or more, preferably 50 ⁇ 10 3 or more, more preferably 60 ⁇ 10 3 or more.
  • the molecular weight of each PEG chain is not limited as long as the sum of the molecular weight of each chain satisfies the above range, and may be the same as or different from each other.
  • the molecular weight of each branched PEG chain may be preferably 10 ⁇ 10 3 or more, for example 20 ⁇ 10 3 or more, 25 ⁇ 10 3 or more, 30 ⁇ 10 3 or more, or 35 ⁇ 10 3 or more.
  • all of the branched PEG chains have a molecular weight of 20 ⁇ 10 3 or more, 25 ⁇ 10 3 or more, 30 ⁇ 10 3 or more, or 35 ⁇ 10 3 or more.
  • the molecular weight of each PEG chain may be independently, for example, 80 ⁇ 10 3 or less, 60 ⁇ 10 3 or less, or 50 ⁇ 10 3 or less.
  • the molecular weight of the PEG segment can be determined by gel filtration chromatography (GFC) or the like.
  • GFC gel filtration chromatography
  • a commercially available PEG whose molecular weight is known for example, PEG as a molecular weight standard substance for GFC
  • PEG as a molecular weight standard substance for GFC
  • the above-mentioned cationic polyamino acid segment has any desired positive charge in physiological pH environment, and any appropriate as long as the binding constant (Ka) of block copolymer to nucleic acid is 3.0 ⁇ 10 5 or more.
  • Basic amino acids can be included as a constituent unit.
  • As the basic amino acid at least one basic amino acid selected from lysine, ornithine, 2,3-diaminopropionic acid and 2,4-diaminobutyric acid is preferable because a desired binding constant can be easily realized. Among these, ornithine is more preferable.
  • the ratio of the number of the at least one basic amino acid (the total number of two or more basic amino acids, if any) to the total number of amino acid residues constituting the cationic polyamino acid segment is preferably 50 % To 100%, for example 80% to 100%, 90% to 100% or 100%.
  • the cationic polyamino acid segment may further contain other basic amino acids as a constitutional unit as long as a desired binding constant is obtained.
  • Other basic amino acids include, for example, natural basic amino acids such as arginine and histidine, and amino acid derivatives in which cationic residues are introduced into the side chain of acidic amino acid (for example, Asp (in which ethylenediamine structure is introduced into the side chain of DET)).
  • the amount of positive charge (per block copolymer molecule) derived from the side chain of the cationic polyamino acid segment is the binding constant (Ka) to the desired nucleic acid, the composition of uPIC, the amount of negative charge of nucleic acid, basic amino acid residue It may be set appropriately according to the type of The amount of positive charge (per molecule of block copolymer) is not limited because the preferable range may vary depending on the amount of negative charge of nucleic acid, type of basic amino acid residue, etc. It may be an integer of 10 or more or 11 or more.
  • the amount of positive charge may be 22.5% or more, 25% or more or 27% or more of the amount of negative charge of nucleic acid, although not limited thereto. .
  • a positive charge amount using the above-mentioned basic amino acid residue (eg, lysine, ornithine, 2,3-diaminopropionic acid or 2,4-diaminobutyric acid), a predetermined value or more with respect to the nucleic acid can be obtained.
  • a block copolymer having a binding constant (Ka) can be suitably obtained.
  • the positive charge amount may be preferably 50 or less, for example 40 or less, 30 or less or 25 or less.
  • the cationic polyamino acid segment may contain nonbasic amino acid residues (eg, hydrophobic amino acid residues) as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the number of nonbasic amino acid residues can be, for example, 10% or less, more preferably 5% or less, and still more preferably 2% or less of the total number of amino acid residues constituting the cationic polyamino acid segment.
  • the PEG segment and the cationic polyamino acid segment are linked via any suitable linking group.
  • a linking group containing an ester bond, an amide bond, an imino group, a carbon-carbon bond, an ether bond and the like can be mentioned.
  • these segments may be linked via an in vivo cleavable linking group (eg, a disulfide bond, a hydrazone bond, a maleate bond, an acetal group).
  • any appropriate modification can be made to the PEG segment side end and / or the cationic polyamino acid segment side end of the block copolymer as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • Examples of the modification include introduction of a protective group, introduction of a target binding site, and the like.
  • the target binding site may be any appropriate site depending on the target tissue, purpose and the like.
  • the target binding site may be formed, for example, by attaching a compound having the target binding site to the free end of the PEG segment of the block copolymer.
  • the target binding site has a biological recognition function that can specifically bind to a substance derived from a living organism and a virus to form a biological binding pair with the substance. It says a part.
  • R 1a to R 1d independently represent a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms
  • R 2 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, or an unsubstituted or substituted linear or branched alkyl carbonyl having 1 to 24 carbon atoms
  • R 3 represents a hydroxyl group, an unsubstituted or substituted linear or branched alkyloxy group having 1 to 12 carbon atoms, an unsubstituted or substituted linear or branched alkenyl having 2 to 12 carbon atoms
  • L is a divalent linking group or a valence bond. Any appropriate linking group may be employed as the divalent linking group.
  • L may be -L 1 -L 2 -L 3-
  • L may be -L 4 -L 5 -L 6- .
  • L 1 and L 4 are each independently-(O- (CH 2 ) a ) b -L 1a- , where a is an integer of 1 to 5 and b is an integer of 0 to 300 And when b is 2 or more, all a do not necessarily have to be the same, and L 1a is a valence bond, —S—S—, —NH—, —O—, —O—CH (CH 3 ) —O -, -OCO-, -OCONH-, -NHCO-, -NHCOO-, -NHCONH-, -CONH- or -COO; L 2 and L 5 independently of each other are a valence bond or -L 2a -L 2b -L 2c- , wherein L 2a and L 2c are structures serving as spacers, and are not particularly limited.
  • L 2b Is any of the structures shown in the following formulas (III) to (V);
  • L 3 is-((CH 2 ) c -O) d- (CH 2 ) e -L 3a- , wherein c is an integer of 1 to 5, d is an integer of 0 to 500, and e is an integer of 0 to 5; And when d is 2 or more, c does not necessarily all have to be the same, and L 3a is -NH- or -O-;
  • L 6 is-((CH 2 ) f -O) g- (CH 2 H- L 6a- (CH 2 ) i -CO-, where f is 1 to 5, g is 0 to 300, h is 0 to 5, i is an integer of 0 to 5, and g is 2 In the above cases, it is not always necessary that f be the same, and L 6a is —OC
  • the alkyl moiety of the linear or branched alkyloxy group having 1 to 12 carbon atoms, the alkyl-substituted imino group, and the alkyl group defined by the groups of R 1a to R 1d , R 2 or R 3 above includes For example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-hexyl group, decyl group, undecyl group and the like can be mentioned.
  • alkenyl or alkynyl moiety in the linear or branched alkenyloxy group having 2 to 12 carbon atoms or the linear or branched alkynyloxy group having 2 to 12 carbon atoms is exemplified by those having 2 or more carbon atoms. And alkyl groups having double bonds or triple bonds in the alkyl groups.
  • substituents when “substituted” include, but are not limited to, C 1-6 alkoxy, aryloxy, aryl C 1-3 oxy, cyano, carboxyl group, amino group, C 1-6 alkoxycarbonyl group, C 2-7 acylamide group, a tri -C 1-6 alkyl siloxy group, a siloxy group, or shows a silylamino group, or acetalized formyl group, a formyl group, chlorine or Mention may be made of halogen atoms such as fluorine.
  • C 1-6 means carbon number 1 to 6, and hereinafter, the same meaning is used.
  • the C 1-12 unsubstituted or substituted straight or branched alkyl moiety of the C 1 to C 24 straight or branched alkyl carbonyl group is Examples thereof can be referred to, and examples of the alkyl moiety having 13 or more carbon atoms include tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, nonadecyl group, docosanyl group and tetracosyl group.
  • the substituent may be a group containing a target binding site.
  • z is such that the sum of positive charges from the side chains of the cationic polyamino acid segment of the block copolymer when forming uPIC is less than 90% or more than 110% of the sum of negative charges from nucleic acids
  • z can be set such that the binding constant (Ka) with the nucleic acid is greater than or equal to a predetermined value.
  • Ka binding constant
  • a block copolymer having a binding constant (Ka) greater than or equal to the value may be suitably obtained.
  • z is an integer of 9 or more, for example, an integer of 10 or more or an integer of 11 or more, binding to a predetermined value or more to nucleic acid A block copolymer having a constant (Ka) can be suitably obtained.
  • the upper limit of z may be, for example, an integer of 40 or less or an integer of 30 or less.
  • W is preferably an integer of 1 to 3 from the viewpoint of enhancing the binding constant with nucleic acid, and further preferably 3 from the viewpoint of easiness of production.
  • w is preferably an integer of 1 to 3, for example, 3.
  • the same group may be selected for all of the repeating units to which it belongs, and different groups may be selected for each of the repeating units.
  • the bonding order of each repeating unit is arbitrary, and may be a random structure or a block structure.
  • the lower limit is, for example, 600, for example, 700, for example, 800, and the upper limit is, for example, 1,400, for example, 1,200, or for example 1100 independently of each other.
  • nucleic acid refers to a poly or oligonucleotide having as a basic unit a nucleotide consisting of a purine or pyrimidine base, pentose, or phosphate.
  • double stranded nucleic acids such as oligo or poly double stranded RNA, oligo or poly double stranded DNA, or oligo or poly double stranded nucleic acid in which RNA and DNA are mixed in the same strand can be preferably used.
  • the nucleotide contained in the nucleic acid may be naturally occurring or chemically modified non-naturally occurring, or may be one to which a molecule such as an amino group, a thiol group or a fluorescent compound has been added. Also good.
  • the length of the nucleic acid (length of the portion constituting the double strand in double-stranded nucleic acid) may be typically 10 to 50 bases long, for example 10 to 30 bases long.
  • nucleic acid As said nucleic acid, functional nucleic acids, such as siRNA, miRNA mimic, shRNA, a decoy nucleic acid, can be mentioned preferably.
  • siRNA for example, all those designed in any appropriate method can be used for the target gene or polynucleotide.
  • the length of the portion constituting the duplex may be preferably 15 to 50 bases, more preferably 18 to 30 bases, and the length of the portion of the siRNA may be a compound known in the art, or similar to them. Includes all nucleotides having various functions or functions. Without limitation, specific examples of siRNA can be designed with reference to genes that may be targets for gene therapy.
  • a unitary polyion complex comprising a specific number of block copolymers having polyethylene glycol segments and cationic polyamino acid segments, and a specific number of nucleic acids,
  • the sum of the positive charges from the side chains of the cationic polyamino acid segment of the block copolymer is not offset by the sum of the negative charges from the nucleic acid,
  • the length of the nucleic acid is 10 to 50 bases,
  • the molecular weight of the polyethylene glycol segment is 40 ⁇ 10 3 or more
  • the block copolymer comprises a double-stranded nucleic acid consisting of the sense strand shown in SEQ ID NO: 1 and the antisense strand shown in SEQ ID NO: 2 (with no phosphate group added at the 5 'end of each strand)
  • a unitary polyion complex having a predetermined binding constant (Ka) is provided.
  • the sum of the positive charges derived from the side chains of the cationic polyamino acid segment of the block copolymer in the physiological pH environment is not offset by the sum of the negative charges derived from the nucleic acids. It has not been neutralized electrically.
  • the total amount of positive charges from the side chains of the cationic polyamino acid segment of all block copolymers in uPIC in physiological pH environment is 45% or more and less than 90% of the total amount of negative charges from all nucleic acids in uPIC (e.g. It may be 50% to 85%, or 50% to 80%, or more than 110% to 150% or less (eg, 115% to 140%).
  • the block copolymer is, for example, a double stranded nucleic acid consisting of the sense strand shown in SEQ ID NO: 1 and the antisense strand shown in SEQ ID NO: 2 (however, no phosphate group is added to the 5 'end of each strand) Or 3.0 ⁇ 10 5 or more, preferably 5.0 ⁇ 10 5 or more (eg, 8.0 ⁇ 10 5 or more, 1.0 ⁇ 10 6 or more, 1.5 ⁇ 10 6 or more, or 2.). It may have an association constant (Ka) of 0 ⁇ 10 6 or more.
  • the binding constant (Ka) for the double stranded nucleic acid can be, for example, 4.0 ⁇ 10 6 or less.
  • block copolymers exhibit high affinity to all kinds of short-chain nucleic acids of about 10 to 50 bases in length, and can be suitably associated to form uPIC.
  • block copolymer for example, the block copolymer described in the section A-1-2 can be used.
  • nucleic acid for example, the nucleic acid described in the section A-1-3 can be used.
  • single-stranded nucleic acid for example, oligo or poly single-stranded RNA, oligo or poly single-stranded DNA, or oligo or poly-one in which RNA and DNA are mixed
  • double-stranded nucleic acid A single stranded nucleic acid can also be preferably used.
  • Specific examples of the single-stranded nucleic acid having a chain length of 10 to 50 bases preferably include functional nucleic acids such as microRNA, antisense nucleic acid, aptamers and ribozymes.
  • the uPIC of the second embodiment is uPIC composed of one nucleic acid and one block copolymer, or uPIC composed of one nucleic acid and two molecules block copolymer It can be.
  • the uPIC of the present invention can be prepared, for example, by mixing any suitable block copolymer and nucleic acid in an optionally buffered aqueous solution (eg, phosphate buffered saline, HEPES buffer) it can.
  • an optionally buffered aqueous solution eg, phosphate buffered saline, HEPES buffer
  • composition for nucleic acid delivery of the present invention comprises the uPIC described in the section A and a block copolymer which can constitute the uPIC, which is in the free state.
  • a block copolymer which can constitute the uPIC which is in the free state.
  • the reason why such an effect is obtained can be estimated, for example, as follows. That is, in the solution containing uPIC, dissociation and association between the nucleic acid-block copolymer occur as a reversible reaction, and as a result, uPIC is reversibly decomposed and reformed. Therefore, it is considered that the equilibrium can be shifted to the association side by blending the free block copolymer in addition to uPIC, and as a result, the nucleic acid can be protected better than the case of uPIC alone.
  • any block copolymer capable of replacing uPIC to form uPIC can be used.
  • a specific example is the block copolymer described in the section A-1-2, preferably the same block copolymer as the block copolymer constituting the uPIC.
  • the block copolymer can suitably reassociate with the nucleic acid even in blood because of its high affinity to the nucleic acid.
  • the composition for nucleic acid delivery of the present invention can be obtained by mixing the above block copolymer and nucleic acid in an optionally buffered aqueous solution so as to obtain a desired N / P ratio.
  • the N / P ratio means the ratio of the molar concentration of the amino group derived from the block copolymer to the molar concentration of the phosphate group derived from the nucleic acid in the composition.
  • the N / P ratio is, for example, 1 or more, preferably 1.5 or more, more preferably 2 or more.
  • the upper limit of the N / P ratio can be typically 20 or less, for example 10 or less, 5 or less, or 4 or less.
  • double-stranded nucleic acid is selected as the nucleic acid to be delivered, and binding to the nucleic acid is, for example, 8.0 ⁇ 10 5 or more, preferably 1.0 ⁇ 10 6 or more.
  • the present invention will be more specifically described by way of examples, but the present invention is not limited by these examples.
  • the polymer structure is described in the order of the molecular weight (kDa) of PEG and the degree of polymerization of the polyamino acid.
  • the molecular weight of each of the two branched branched PEG chains is 37 kDa and the cationic polyamino acid segment consists of 10 ornithine residues, it is abbreviated as "PEG-pOrn (37 ⁇ 2-10)" .
  • Example 1 PEG-pOrn (37 ⁇ 2-11) and siRNA were separately dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.3), and the final concentration of siRNA was 10 ⁇ M, and the N / P ratio was 0.
  • the PIC solution was prepared by mixing so as to be 25, 0.5, 1, 2, 3, 5, or 10.
  • siLuc siRNA against luciferase in which no phosphate group was added to the 5 'end of each strand was used, and the 5' end was labeled with Alexa 647 or the like, if necessary.
  • Nucleotide sequence of siLuc Sense 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Example 2 A PIC solution was prepared in the same manner as in Example 1, except that PEG-pOrn (37 ⁇ 2-14) was used instead of PEG-pOrn (37 ⁇ 2-11).
  • Example 3 A PIC solution was prepared in the same manner as in Example 1, except that PEG-pLys (37 ⁇ 2-14) was used instead of PEG-pOrn (37 ⁇ 2-11).
  • Comparative Example 1 A PIC solution was prepared in the same manner as Example 1 except that PEG-pLys (37 ⁇ 2-9) was used instead of PEG-pOrn (37 ⁇ 2-11).
  • Reference Example 1 A uPIC solution was prepared in the same manner as Example 1 except that PEG-pLys (37 ⁇ 2-20) was used instead of PEG-pOrn (37 ⁇ 2-11).
  • ⁇ Structural analysis 1 of uPIC> Nucleic acid association per PIC by performing ultracentrifugation analysis (SE-AUC analysis) and fluorescence correlation spectroscopy analysis (FCS analysis) by the sedimentation equilibrium method on the PIC solutions prepared in the above Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 The number and the number of block copolymer associations were determined. The specific method is as follows.
  • SE-AUC analysis was performed using an analytical ultracentrifuge system Beckman Optima XL-A (manufactured by Beckman Coulter) equipped with absorption optics.
  • the absorption at a wavelength of 260 nm was measured as a function of r.
  • the measurement results of each sample were analyzed using ORIGIN software to determine the molecular weight (Da) of PIC.
  • FCS analysis The FCS analysis was performed using a confocal laser scanning microscope (manufactured by Carl Zeiss, product name “LSM510”) equipped with a 40 ⁇ objective (C-Apochromat, manufactured by Carl Zeiss) and a ConfoCor 3 module.
  • the PIC solution prepared at N / P ratio 1 in the above Examples and Comparative Examples was diluted with 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) containing 150 mM NaCl so that the siRNA concentration would be 100 nM, and used as a measurement sample.
  • the measurement sample was transferred to an 8-well chamber, and FCS measurement was performed at a sampling time of 15 seconds and 5 repetitions.
  • AN siRNA N siRNA / N PIC (a) Where AN siRNA is the number of nucleic acid associations per PIC , and N siRNA and N PIC are the average number of fluorescent particles of the control sample containing only the fluorescently labeled siRNA and the average fluorescence of the measurement sample from the PIC solution, respectively Is the number of particles)
  • AN copolymer [MW PIC- (MW siRNA x AN siRNA )] / MW copolymer (b) (Wherein, AN copolymer is the number of block copolymer associations per PIC , MW PIC is the molecular weight (Da) of PIC obtained by the above SE-AUC analysis, and MW siRNA and MW copolymer are siRNA and respectively Molecular weight (Da) calculated based on the structural formula of the block copolymer.)
  • the number of association of siRNA and block copolymer determined by actually performing FCS analysis and ultracentrifugation analysis is about 1 and about 2, respectively.
  • the standard deviation of the number of meetings is 0.1 or less
  • the PICs obtained in Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 have very high structural homogeneity, and a specific uniform structure Indicates that the From the above, it is reasonably understood that the PICs prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 are uPICs composed of one molecule of siRNA and two molecules of block copolymer.
  • ⁇ Structural analysis 2 of uPIC> The number of nucleic acid associations per PIC and the average particle size of PIC (hydrodynamic diameter: D H ) by performing FCS analysis on the uPIC solution obtained in Reference Example 1 in the same manner as the structural analysis 1 of uPIC above. I asked for.
  • the average particle diameter (D H ) of PIC converts the autocorrelation curve obtained by the above FCS measurement into diffusion time using ConfoCor 3 and then the diffusion time using the Cy5 dye as a control and the diffusion coefficient was converted to (D C), it was calculated by substituting the diffusion coefficient in the Einstein relation (Stokes-Einstein equation). The results are shown in FIG.
  • Binding constants were determined by quantifying the intensity of fluorescence that enhanced binding of EtBr to nucleic acids when binding competition for ethidium bromide (EtBr) and block copolymer siRNAs. The quantification of the fluorescence intensity was performed using a fluorescence spectrophotometer (FP-6600, manufactured by JASCO Corporation).
  • the block copolymer to be measured and the above siRNA are added to 10 mM HEPES buffer (pH 7.3) containing 150 mM NaCl.
  • the PIC solution was prepared by dissolving separately and mixing so that the final concentration of siRNA is 1 ⁇ M, and the N / P ratio is 0.25, 0.5, or 1.
  • 10 ⁇ L of about 0.5 mM aqueous solution of EtBr was dropped 10 times to 1 mL of PIC solution of each N / P ratio, and the fluorescence intensity (ex 525 nm, em 600 nm) was measured each time it was dropped.
  • the obtained fluorescence intensity was analyzed based on a previously reported method (J. Chem. Edu. 71, 77 (1994)) to calculate a binding constant.
  • the uPIC of the present invention can be suitably applied in drug delivery systems such as nucleic acid drugs.

Abstract

本発明は、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスであって、　該ユニット型ポリイオンコンプレックスにおける該ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、該核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されず、　該核酸の鎖長が、１０～５０塩基長であり、　該ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、４０×１０３以上であり、　該ブロックコポリマーの該核酸に対する結合定数（Ｋａ）が、３．０×１０５以上である、ユニット型ポリイオンコンプレックスを提供する。

Description

核酸搭載ユニット型ポリイオンコンプレックス
　本発明は、核酸を搭載したユニット型ポリイオンコンプレックスおよび該ユニット型ポリイオンコンプレックスを含む組成物に関する。
　核酸医薬は、細胞内の様々な遺伝子を制御し得ることから、これまで治療困難とされてきた癌、遺伝性疾患等の種々の疾患への適用が強く期待されている。その一方で、核酸医薬は、核酸分子自体の生体内での安定性が低いことから、標的細胞への適切な送達技術を必要とする。例えば、核酸の送達技術として、従来、親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーを利用し、核酸と該ブロックコポリマーとに静電的相互作用を介した複合体（ポリイオンコンプレックス）を形成させる技術がある。
　上記従来技術で得られるポリイオンコンプレックスとしては、例えば、それぞれ不特定数の核酸とブロックコポリマーとからなるポリイオンコンプレックスであって、該ブロックコポリマーが親水性ポリマーセグメントを外側に向けるとともにカチオン性ポリマーセグメントを内側に向け、核酸を内包した状態で放射状に配列しているポリイオンコンプレックス（以下、「ミセル型ポリイオンコンプレックス」と称する場合がある）、および、それぞれ特定数の核酸とブロックコポリマーとからなるポリイオンコンプレックスであって、生体内、例えば、血中で安定な構成単位体として存在するポリイオンコンプレックス（以下、「ユニット型ポリイオンコンプレックス」または「ｕＰＩＣ」と称する場合がある）が挙げられる（例えば、特許文献１）。
　特許文献１に記載のユニット型ポリイオンコンプレックスは、それぞれ特定数の核酸とブロックコポリマーとからなる明確な構造を有し、核酸の血中滞留性を向上することができる。
国際公開第２０１３／１６２０４１号パンフレット
　特許文献１に記載のユニット型ポリイオンコンプレックスの調製においては、核酸由来の負電荷とブロックコポリマー由来の正電荷とが相殺されてユニット型ポリイオンコンプレックスが電気的に中性となるように核酸および／またはブロックコポリマーの設計を慎重に行う必要がある。
　本願発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、より簡便に設計可能なユニット型ポリイオンコンプレックスを提供することにある。
　本発明によれば、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスが提供される。該ユニット型ポリイオンコンプレックスにおいては、該ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が該核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されず；該核酸の鎖長が、１０～５０塩基長であり；該ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、４０×１０３以上であり；該ブロックコポリマーの該核酸に対する結合定数（Ｋａ）が、３．０×１０５以上である。
　１つの実施形態において、上記ユニット型ポリイオンコンプレックスは、２分子の上記ブロックコポリマーと１分子の上記核酸とから構成される。
　１つの実施形態において、上記核酸が二本鎖核酸である。
　１つの実施形態において、上記ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、６０×１０３以上である。
　１つの実施形態において、上記ポリエチレングリコールセグメントが二鎖分枝型であり、各ポリエチレングリコール鎖の分子量が、２０×１０３以上である。
　１つの実施形態において、上記カチオン性ポリアミノ酸が、構成アミノ酸としてオルニチンを含む。
　本発明の別の局面によれば、上記ユニット型ポリイオンコンプレックスと、該ユニット型ポリイオンコンプレックスを構成し得るブロックコポリマーであって、遊離のブロックコポリマーと、を含む、核酸送達用組成物が提供される。
　１つの実施形態において、上記組成物中における上記ブロックコポリマー由来のアミノ基のモル濃度と上記核酸由来のリン酸基のモル濃度との比（Ｎ／Ｐ比）が、１～２０である。
　本発明においては、核酸に対して所定の親和性を有するブロックコポリマーを用いる。これにより、驚くことに、電荷が相殺されていない状態においても核酸の血中滞留性を向上可能なユニット型ポリイオンコンプレックスが得られる。このようなユニット型ポリイオンコンプレックスは、調製の際に、核酸由来の負電荷とブロックコポリマー由来の正電荷とを厳密に制御する必要がないことから、従来のユニット型ポリイオンコンプレックスよりも簡便に設計され得る。
本発明の１つの実施形態におけるユニット型ポリイオンコンプレックスの構成を説明する概略図である。 ユニット型ポリイオンコンプレックスの平均粒子径およびユニット型ポリイオンコンプレックス中の核酸会合数を示すグラフである。 核酸の血中滞留性を示すグラフである。
［Ａ．ユニット型ポリイオンコンプレックス］
　本発明によれば、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスであって、該ユニット型ポリイオンコンプレックスにおけるブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されていないユニット型ポリイオンコンプレックス（結果として、電気的に中和されていないユニット型ポリイオンコンプレックス）が提供される。以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。なお、本発明に用いられるブロックコポリマーおよび核酸はそれぞれ、重合反応物として得られる場合に、ある程度の多分散性を示し得る。よって、本明細書において、ブロックコポリマーの特性（分子量、重合度、電荷等）および核酸の特性（塩基長、電荷等）について言及する際は、特段の記載がない限り、多分散性を示す重合反応物全体の平均について言及するものとする。したがって、例えば、ブロックコポリマーの電荷量は、実際に測定して得られるカチオン性アミノ酸残基の重合度を平均重合度とし、該平均重合度に基づいて算出される。また例えば、ポリエチレングリコールセグメントの分子量としては、実際に測定して得られる平均分子量（例えば、数平均分子量）が適用され得る。
［Ａ－１．第１の実施形態］
［Ａ－１－１．ユニット型ポリイオンコンプレックスの全体構成］
　図１（ａ）～（ｄ）は、本発明の第１の実施形態におけるｕＰＩＣの一例を説明する概略図である。具体的には、図１（ａ）は、本発明で使用され得るブロックコポリマーの概略図であり、図１（ｂ）は、本発明で使用され得る核酸の概略図であり、図１（ｃ）は、図１（ａ）のブロックコポリマーと図１（ｂ）の核酸とから構成されるｕＰＩＣの概略図であり、図１（ｄ）は、図１（ｃ）のｕＰＩＣにおけるＰＥＧセグメントの空間的な広がりを示した概略図である。
　図１（ａ）に示されるブロックコポリマー１０ａ、１０ｂはそれぞれ、二鎖分枝型のＰＥＧセグメント１３ａ、１４ａ、１３ｂ、１４ｂとカチオン性ポリアミノ酸セグメント１２ａ、１２ｂとを有する。また、図１（ｂ）に示される核酸２０ａは、各々２塩基のオーバーハングを有する二本鎖核酸である。ブロックコポリマー１０ａ、１０ｂと核酸２０ａとは、カチオン性ポリアミノ酸セグメント１２ａ、１２ｂ由来の正電荷と核酸２０ａ由来の負電荷との間の静電的相互作用によって会合し、これにより、ｕＰＩＣ１００を形成している（図１（ｃ））。ｕＰＩＣ１００において、ブロックコポリマー１０ａ、１０ｂは、代表的には、核酸２０ａの主鎖方向において互いに逆向きに配列し得る。これにより、ＰＥＧセグメント１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ相互の重なりに起因する立体障害を抑制することができる。その結果、分枝型かつ長鎖のＰＥＧセグメントを有するブロックコポリマーであっても核酸と好適に静電結合してｕＰＩＣを形成することができる。また、このように配列することにより、図１（ｄ）に示されるとおり、４本のＰＥＧセグメント１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂが、核酸２０ａの全体を覆うように広がることができ、核酸２０ａの高度な保護に寄与し得る。１つの実施形態において、４本のＰＥＧセグメントは、各々の端部が略正四面体の頂点となるように位置し得、核酸は、該正四面体内に位置し得る。
　本実施形態のｕＰＩＣは、特定数のブロックコポリマーと特定数の核酸とから構成されるものであればよく、上記図示例の構成に限定されるものではない。
　本実施形態のｕＰＩＣは、生理的ｐＨ環境（ｐＨ＝約７．４）において、ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量が核酸由来の負の電荷量によって相殺されず、結果として、電気的に中和されていない。なお、本明細書において、「ユニット型ポリイオンコンプレックスにおけるブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されない」または「ｕＰＩＣが電気的に中和されていない」との記載は、ｕＰＩＣ中に含まれる全てのブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の電荷量の合計（絶対値）が、ｕＰＩＣ中に含まれる全ての核酸由来の電荷量の合計（絶対値）の９０％未満または１１０％超であることを意味する。ｕＰＩＣの開発においては、従来、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷と核酸由来の負電荷とが相殺されない場合、ｕＰＩＣが全体として電荷を帯びた状態となり、血液中のタンパクや酵素を静電的に誘引して血中滞留性が低下することや、電荷を帯びたｕＰＩＣが相互に、または、ブロックコポリマーおよび／または核酸とさらに会合して均一性が低下することが懸念されていた。これに対し、本発明者らの検討によれば、核酸に対して所定の親和性を有するブロックコポリマーを選択し、かつ、長鎖のＰＥＧセグメントを採用することにより、電荷を帯びたｕＰＩＣであっても、その構造を安定に維持して、優れた血中滞留性を有し得ることがわかった。１つの実施形態において、生理的ｐＨ環境におけるｕＰＩＣ中の全ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷量の合計は、ｕＰＩＣ中の全核酸由来の負電荷量の合計の４５％以上９０％未満（例えば５０％～８５％、または、５０％～８０％）であり得る。別の実施形態において、生理的ｐＨ環境におけるｕＰＩＣ中のブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計は、核酸由来の負の電荷量の合計の１１０％を超え１５０％以下（例えば１１５％～１４０％）であり得る。
　本実施形態のｕＰＩＣは、代表的には、ミセル型ＰＩＣよりも小型である。本実施形態のｕＰＩＣの粒子径（流体力学的直径）は、好ましくは１０ｎｍ～３０ｎｍであり、例えば１０ｎｍ～２５ｎｍ、また例えば１０ｎｍ～２０ｎｍであり得る。このように小型であることは、搭載した核酸を組織の深部まで送達することに寄与し得る。
［Ａ－１－２．ブロックコポリマー］
　本実施形態で使用され得るブロックコポリマーは、ＰＥＧセグメントと、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと、を有し、送達対象の核酸に対して３．０×１０５以上、好ましくは５．０×１０５以上（例えば、８．０×１０５以上、１．０×１０６以上、１．５×１０６以上、または２．０×１０６以上）の結合定数（Ｋａ）を有する。核酸に対して上記所定の親和性を有するブロックコポリマーを用いることにより、血中においてｕＰＩＣからブロックコポリマーが解離し難くなる、あるいは、解離したとしてもすぐに再会合することができ、結果として、核酸由来の負電荷とブロックコポリマー由来の正電荷とが相殺されていない状態においても、核酸を良好に保護して高い血中滞留性を得ることができると推測される。一方、結合定数（Ｋａ）の上限値は、特に限定されないが、実現容易性の観点から、例えば、４．０×１０６以下であり得る。なお、本明細書において、ブロックコポリマーは、該ブロックコポリマーの薬学的に許容可能な塩も包含する。
　上記結合定数（Ｋａ）は、後述の実施例に記載の方法で測定される。結合定数（Ｋａ）は、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと核酸との間の静電結合が多くなるにつれて、または、個々の静電結合が強くなるにつれて増大する傾向にある。よって、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの正電荷数を調整すること、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの構成アミノ酸の種類を適切に選択すること等によって、結合定数（Ｋａ）を所望の範囲に制御可能である。なお、ブロックコポリマーの構成を固定した場合、結合定数（Ｋａ）は、主として核酸の負電荷量に依存し、塩基長が同じであれば塩基配列の違いによって実質的に変化しないと考えられる。
　上記ＰＥＧセグメントは、好ましくは分枝型であり、より好ましくは二鎖分枝型である。言うまでもないが、上記ＰＥＧセグメントは、ＰＥＧ鎖を１本のみ含む単鎖型であってもよい。
　上記ＰＥＧセグメントの分子量（分枝型の場合は各ＰＥＧ鎖の分子量の合計）は、４０×１０３以上であり、好ましくは５０×１０３以上、より好ましくは６０×１０３以上である。分枝型の場合、各ＰＥＧ鎖の分子量は、各鎖の分子量の合計が上記範囲を満たす限りにおいて制限されず、互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。分枝型の各ＰＥＧ鎖の分子量は、好ましくは１０×１０３以上、例えば２０×１０３以上、２５×１０３以上、３０×１０３以上、または、３５×１０３以上であり得る。好ましくは、分枝型のＰＥＧ鎖のすべてが、２０×１０３以上、２５×１０３以上、３０×１０３以上、または、３５×１０３以上の分子量を有する。一方、各ＰＥＧ鎖の分子量はそれぞれ独立して、例えば８０×１０３以下、６０×１０３以下、または、５０×１０３以下であり得る。ＰＥＧセグメントの分子量がこのような範囲内にあることにより、ｕＰＩＣが電荷を帯びた状態であっても核酸を酵素分解等から好適に保護することができる。また、ｕＰＩＣの生体適合性を高め、異物として分解または排出されることを防止し得る。なお、ＰＥＧセグメントの分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）等によって求めることができ、その際には、分子量が既知の市販のＰＥＧ（例えば、ＧＦＣ用分子量標準物質としてのＰＥＧ）を分子量マーカーとして用いることができる。
　上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、生理的ｐＨ環境で所望の正電荷を有し、かつ、ブロックコポリマーの核酸への結合定数（Ｋａ）が３．０×１０５以上となる限りにおいて、任意の適切な塩基性アミノ酸を構成単位として含み得る。該塩基性アミノ酸としては、所望の結合定数を容易に実現できることから、リシン、オルニチン、２，３－ジアミノプロピオン酸および２，４－ジアミノ酪酸から選択される少なくとも１種の塩基性アミノ酸が好ましく、なかでも、オルニチンがより好ましい。
　上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成する全アミノ酸残基数に対する、上記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の数（２種以上の上記塩基性アミノ酸を含む場合はその合計数）の割合は、好ましくは５０％～１００％であり得、例えば８０％～１００％、９０％～１００％または１００％であり得る。
　上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、所望の結合定数が得られる限りにおいて、構成単位として他の塩基性アミノ酸をさらに含み得る。他の塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン等の天然塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸側鎖にカチオン性残基を導入したアミノ酸誘導体（例えば、アスパラギン酸の側鎖にエチレンジアミン構造を導入したＡｓｐ（ＤＥＴ））が挙げられる。
　上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷量（ブロックコポリマー１分子あたり）は、所望される核酸との結合定数（Ｋａ）、ｕＰＩＣの構成、核酸の負電荷量、塩基性アミノ酸残基の種類等に応じて適切に設定され得る。該正電荷量（ブロックコポリマー１分子あたり）は、核酸の負電荷量、塩基性アミノ酸残基の種類等によってその好適範囲が変動し得ることから、限定されるものではないが、例えば９以上、１０以上または１１以上の整数であり得る。別の観点から、該正電荷量（ブロックコポリマー１分子あたり）は、同様に限定されるものではないが、核酸の負電荷量の２２．５％以上、２５％以上または２７％以上であり得る。上記塩基性アミノ酸残基（例えば、リシン、オルニチン、２，３－ジアミノプロピオン酸または２，４－ジアミノ酪酸）を用いてこのような正電荷量とすることにより、核酸に対して所定値以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーが好適に得られ得る。一方、該正電荷量が多すぎると、ポリマー自身の血中滞留性が低下するおそれがある。よって、該正電荷量は、好ましくは５０以下、例えば４０以下、３０以下または２５以下であり得る。
　上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、本発明の効果が得られる限りにおいて、非塩基性アミノ酸残基（例えば、疎水性アミノ酸残基）を含んでいてもよい。非塩基性アミノ酸残基の数は、カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成する全アミノ酸残基数の、例えば１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下とすることができる。
　上記ＰＥＧセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとは任意の適切な連結基を介して結合される。例えば、エステル結合、アミド結合、イミノ基、炭素－炭素結合、エーテル結合等を含む連結基が挙げられる。また、これらのセグメントは、生体内で開裂可能な連結基（例えば、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、マレアメート結合、アセタール基）を介して連結されていてもよい。
　上記ブロックコポリマーのＰＥＧセグメント側末端および／またはカチオン性ポリアミノ酸セグメント側末端には、本発明の効果が得られる範囲において、任意の適切な修飾がなされ得る。該修飾としては、例えば、保護基の導入、標的結合部位の導入等が挙げられる。
　上記標的結合部位は、標的となる組織や目的等に応じて任意の適切な部位であり得る。標的結合部位は、例えば、標的結合部位を有する化合物を上記ブロックコポリマーのＰＥＧセグメントの自由末端に結合させることにより形成され得る。なお、本明細書において、標的結合部位とは、生体およびウイルスに由来する物質に対し特異的に結合して当該物質と生物学的な結合対を形成し得る、生物学的な認識機能を有する部位をいう。標的結合部位を導入することにより、標的となる所望の部位への核酸の到達性を向上できる。
　上記ブロックコポリマーの好ましい具体例は、以下の一般式（１）または（２）で表され得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （上記各式において、
　Ｒ１ａ～Ｒ１ｄは、相互に独立して、水素原子あるいは未置換もしくは置換された炭素数１～１２の直鎖または分枝状のアルキル基を表し、
　Ｒ２は、水素原子、炭素数１～１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル基あるいは炭素数１～２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基を表し、
　Ｒ３は、ヒドロキシル基、炭素数１～１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２～１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数２～１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基あるいは炭素数１～１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル置換イミノ基を表し、
　Ｌは、二価の連結基または原子価結合を表し、
　ｘ１～ｘ４は、相互に独立して、４５５～１，８００の整数を表し、
　ｚは、９～５０の整数を表し、
　ｗは、１～４の整数を表し、
　ｌおよびｍは、相互に独立して、０～５の整数を表す。）
　上記式（１）または（２）において、Ｌは、二価の連結基または原子価結合である。二価の連結基としては、任意の適切な連結基が採用され得る。例えば、式（１）において、Ｌは、－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－であり得、式（２）において、Ｌは、－Ｌ４－Ｌ５－Ｌ６－であり得る。ここで、Ｌ１およびＬ４は、相互に独立して、－（Ｏ－（ＣＨ２）ａ）ｂ－Ｌ１ａ－であり、ここでａは１～５、ｂは０～３００の整数であり、ｂが２以上の時ａはすべて同一である必要は必ずしもなく、Ｌ１ａは原子価結合、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－、－ＯＣＯ－、－ＯＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＮＨＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ－またはＣＯＯであり；Ｌ２およびＬ５は、相互に独立して、原子価結合または－Ｌ２ａ－Ｌ２ｂ－Ｌ２ｃ－であり、ここでＬ２ａおよびＬ２ｃはスペーサーとなる構造であり、特に限定はされないが、例えば置換または未置換の炭素数１～１２のアルキル基であり、Ｌ２ｂは下記式（ＩＩＩ）～（Ｖ）に示す構造のいずれかであり；Ｌ３は、－（（ＣＨ２）ｃ－Ｏ）ｄ－（ＣＨ２）ｅ－Ｌ３ａ－であり、ここでｃは１～５、ｄは０～５００、ｅは０～５の整数であり、ｄが２以上の時ｃはすべて同一である必要は必ずしもなく、Ｌ３ａは－ＮＨ－または－Ｏ－であり；Ｌ６は、－（（ＣＨ２）ｆ－Ｏ）ｇ－（ＣＨ２）ｈ－Ｌ６ａ－（ＣＨ２）ｉ－ＣＯ－であり、ここでｆは１～５、ｇは０～３００、ｈは０～５、ｉは０～５の整数であり、ｇが２以上の時ｆはすべて同一である必要は必ずしもなく、Ｌ６ａは－ＯＣＯ－、－ＮＨＣＯ－、－ＯＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＮＨＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ－または－ＣＯＯ－である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記Ｒ１ａ～Ｒ１ｄ、Ｒ２、またはＲ３の基で定義する、炭素数１～１２の直鎖または分枝状のアルキルオキシ基、アルキル置換イミノ基、およびアルキル基のアルキル部分としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。炭素数２～１２の直鎖または分枝状のアルケニルオキシ基または炭素数２～１２の直鎖または分枝状のアルキニルオキシ基における、アルケニルまたはアルキニル部分は、炭素数が２以上の上記に例示したアルキル基中に二重結合または三重結合を含むものを挙げることができる。
　このような基または部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ１－６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１－３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１－６アルコキシカルボニル基、Ｃ２－７アシルアミド基、トリ－Ｃ１－６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、またはアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素またはフッ素等のハロゲン原子を挙げることができる。ここで、例えば、「Ｃ１－６」の表示は、炭素数１～６を意味し、以下同様な意味を表すものとして使用する。さらに、炭素数１～２４の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１～１２の未置換もしくは置換された直鎖または分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。また、該置換基は、標的結合部位を含む基であってもよい。
　ｚは、ｕＰＩＣを形成した際にブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、核酸由来の負の電荷量の合計の９０％未満または１１０％超となるように設定される。また、ｚは、核酸との結合定数（Ｋａ）が所定の値以上となるように設定され得る。ｗの値、核酸の負電荷数等によって変動し得るが、ｚが、例えば核酸の負電荷量の２２．５％以上、２５％以上または２７％以上の整数である場合、核酸に対して所定値以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーが好適に得られ得る。同様に、ｗの値、核酸の負電荷数等によって変動し得るが、ｚが、９以上の整数、例えば１０以上の整数または１１以上の整数である場合、核酸に対して所定値以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーが好適に得られ得る。ｚの上限は、例えば４０以下の整数または３０以下の整数であってもよい。
　ｗは、核酸との結合定数を高める観点から、好ましくは１～３の整数であり、さらに製造容易性の観点から、より好ましくは３である。例えば、ｚが１４以下、特に１３以下の場合、ｗは、１～３の整数、例えば、３であることが好ましい。ｗは、属する繰り返し単位全てについて同一の基が選択されてもよく、各々の繰り返し単位について異なる基が選択されてもよい。異なる基が選択される場合、各繰り返し単位の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。
　エチレングリコールの繰り返し数を表すｘ１～ｘ４は、相互に独立して、下限が例えば６００、また例えば７００、また例えば８００であり、上限が例えば１４００、また例えば１２００、また例えば１１００である。
［Ａ－１－３．核酸］
　本明細書において、核酸とは、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味する。例えば、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、または、同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ二本鎖核酸等の二本鎖核酸が好ましく用いられ得る。当該核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物などの分子が付加されたものであっても良い。
　上記核酸の鎖長（二本鎖核酸においては二重鎖を構成する部分の長さ）は、代表的には１０～５０塩基長、例えば１０～３０塩基長であり得る。
　上記核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ　ｍｉｍｉｃ、ｓｈＲＮＡ、デコイ核酸等の機能性核酸を好ましく挙げることができる。
　上記ｓｉＲＮＡとしては、例えば、標的とする遺伝子またはポリヌクレオチドに対し、任意の適切な方法で設計されたすべてのものを用いることができる。ｓｉＲＮＡの鎖長は、二重鎖を構成する部分の長さが好ましくは１５～５０塩基、より好ましくは１８～３０塩基であることができ、当該技術分野で公知の化合物、また、それらと同様な作用または機能を有するすべてのヌクレオチドを包含する。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡの具体例は、遺伝子療法の対象となりうる遺伝子を参照して設計することができる。
［Ａ－２．第２の実施形態］
　本発明の第２の実施形態によれば、ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスであって、
　該ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、該核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されず、
　該核酸の鎖長が、１０～５０塩基長であり、
　該ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、４０×１０３以上であり、
　該ブロックコポリマーが、配列番号１で示されるセンス鎖および配列番号２で示されるアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸（ただし、各鎖の５’末端にリン酸基が付加されていない）に対して所定の結合定数（Ｋａ）を有する、ユニット型ポリイオンコンプレックスが提供される。
　本実施形態のｕＰＩＣにおいては、生理的ｐＨ環境におけるブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が核酸由来の負の電荷量の合計によって相殺されず、結果として、電気的に中和されていない。生理的ｐＨ環境におけるｕＰＩＣ中の全ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正電荷量の合計は、ｕＰＩＣ中の全核酸由来の負電荷量の合計の４５％以上９０％未満（例えば５０％～８５％、または、５０％～８０％）、あるいは、１１０％を超え１５０％以下（例えば１１５％～１４０％）であり得る。
　上記ブロックコポリマーは、例えば、配列番号１で示されるセンス鎖および配列番号２で示されるアンチセンス鎖からなる二本鎖核酸（ただし、各鎖の５’末端にリン酸基が付加されていない）に対して３．０×１０５以上、好ましくは５．０×１０５以上（例えば、８．０×１０５以上、１．０×１０６以上、１．５×１０６以上、または２．０×１０６以上）の結合定数（Ｋａ）を有し得る。該二本鎖核酸に対する結合定数（Ｋａ）は、例えば４．０×１０６以下とすることができる。このようなブロックコポリマーは、１０～５０塩基長程度の短鎖核酸全般に対して高い親和性を示し、好適に会合してｕＰＩＣを形成することができる。上記ブロックコポリマーとしては、例えばＡ－１－２項に記載のブロックコポリマーが用いられ得る。
　上記核酸としては、例えばＡ－１－３項に記載の核酸が用いられ得る。本実施形態のｕＰＩＣにおいては、二本鎖核酸と同様に一本鎖核酸（例えば、オリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡ、または、ＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ一本鎖核酸）も好ましく用いられ得る。鎖長が１０～５０塩基長である一本鎖核酸の具体例としては、ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム等の機能性核酸を好ましく挙げることができる。一本鎖核酸を用いる場合、第２の実施形態のｕＰＩＣは、１分子の核酸と１分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣまたは１分子の核酸と２分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣであり得る。
［Ｂ．ユニット型ポリイオンコンプレックスの調製方法］
　本発明のｕＰＩＣは、例えば、任意の適切なブロックコポリマーと核酸とを、必要により緩衝化された水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝液）中で混合することにより調製することができる。
［Ｃ．核酸送達用組成物］
　本発明の核酸送達用組成物は、Ａ項に記載のｕＰＩＣと、該ｕＰＩＣを構成し得るブロックコポリマーであって、遊離状態のブロックコポリマーと、を含む。本発明の核酸送達用組成物によれば、ｕＰＩＣを単独で用いる場合よりも優れた核酸の血中滞留性が得られ得る。このような効果が得られる理由は、例えば以下のように推測できる。すなわち、ｕＰＩＣを含む溶液においては、核酸－ブロックコポリマー間の解離および会合が可逆反応として生じており、その結果、ｕＰＩＣが可逆的に分解および再形成されている。よって、ｕＰＩＣに加えて遊離状態のブロックコポリマーを配合することにより、平衡を会合側にシフトさせることができ、結果として、ｕＰＩＣ単独の場合よりも核酸を好適に保護できると考えられる。
　上記遊離状態のブロックコポリマーとしては、ｕＰＩＣを構成しているブロックコポリマーと置き換わってｕＰＩＣを形成し得るものであればよい。具体例としては、Ａ－１－２項に記載のブロックコポリマーが挙げられ、好ましくはｕＰＩＣを構成しているブロックコポリマーと同一のブロックコポリマーが挙げられる。該ブロックコポリマーは、核酸との親和性が高いことから、血中においても核酸と好適に再会合し得る。
　本発明の核酸送達用組成物は、必要により緩衝化された水溶液中で上記ブロックコポリマーと核酸とを、所望のＮ／Ｐ比となるように混合することによって得られ得る。ここで、Ｎ／Ｐ比とは、組成物中における上記ブロックコポリマー由来のアミノ基のモル濃度と上記核酸由来のリン酸基のモル濃度との比を意味する。
　本発明の核酸送達用組成物において、Ｎ／Ｐ比は、例えば１以上であり、好ましくは１．５以上、より好ましくは２以上である。また、Ｎ／Ｐ比の上限は、代表的には２０以下、例えば１０以下、５以下、または４以下とすることができる。本発明の核酸送達用組成物においては、送達対象の核酸として二本鎖核酸を選択し、該核酸に対して、例えば８．０×１０５以上、好ましくは１．０×１０６以上の結合定数（Ｋａ）を有するブロックコポリマーを用いることにより、Ｎ／Ｐ比が５以下（例えば、３程度）であっても投与から３時間後に１０％以上の核酸の血中滞留性を実現することができる。
　以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、以下の実施例においては、ＰＥＧの分子量（ｋＤａ）およびポリアミノ酸の重合度の順序でポリマー構造を記す。例えば、二鎖分枝型ＰＥＧ鎖の各々の分子量が３７ｋＤａであり、カチオン性ポリアミノ酸セグメントが１０個のオルニチン残基からなる場合は、「ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１０）」と略記する。
＜ブロックコポリマーの調製＞
　種々の分子量を有する二鎖分枝型のポリ（エチレングリコール）誘導体（ＮＯＦ社製）を用い、特許文献１の実施例に記載のブロックコポリマーの調製方法と同様の方法で、以下のブロックコポリマー（塩酸塩）：ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１１）、ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１４）、ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－２０）、ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－４０）、ＰＥＧ－ｐＬｙｓ（３７×２－９）、ＰＥＧ－ｐＬｙｓ（３７×２－１４）、ＰＥＧ－ｐＬｙｓ（３７×２－２０）、ＰＥＧ－ｐＬｙｓ（３７×２－４０）の白色粉末を得た。ポリアミノ酸セグメントの重合度は、１Ｈ-ＮＭＲによって決定した。
［実施例１］
　ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１１）とｓｉＲＮＡとを、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解し、ｓｉＲＮＡの終濃度が１０μＭとなるように、かつ、Ｎ／Ｐ比が０．２５、０．５、１、２、３、５または１０となるように混合してＰＩＣ溶液を調製した。ｓｉＲＮＡとしては、各鎖の５’末端にリン酸基が付加されていないｓｉＬｕｃ（ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ）を用い、必要に応じて、５’末端にＡｌｅｘａ６４７等の標識を付して用いた。
　ｓｉＬｕｃの塩基配列： 
　センス　５’－ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ－３’（配列番号１）
　アンチセンス　５’－ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｄＴｄＴ－３’（配列番号２）
［実施例２］
　ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１１）の代わりにＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１４）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＩＣ溶液を調製した。
［実施例３］
　ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１１）の代わりにＰＥＧ－ｐＬｙｓ（３７×２－１４）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＩＣ溶液を調製した。
［比較例１］
　ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１１）の代わりにＰＥＧ－ｐＬｙｓ（３７×２－９）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＰＩＣ溶液を調製した。
［参考例１］
　ＰＥＧ－ｐＯｒｎ（３７×２－１１）の代わりにＰＥＧ－ｐＬｙｓ（３７×２－２０）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ｕＰＩＣ溶液を調製した。参考例１で得られたｕＰＩＣ溶液（Ｎ／Ｐ比＝１０）は、特許文献１の表２において医薬製剤Ｂとして開示されたｕＰＩＣ溶液に略相当し、１分子のｓｉＲＮＡと２分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣを含むものである。
＜ｕＰＩＣの構造解析１＞
　上記実施例１～３および比較例１で調製したＰＩＣ溶液について、沈降平衡法による超遠心分析（ＳＥ－ＡＵＣ分析）および蛍光相関分光解析（ＦＣＳ解析）を行うことによって、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数およびブロックコポリマー会合数を求めた。具体的な方法は以下のとおりである。
［ＳＥ－ＡＵＣ分析］
　ＳＥ－ＡＵＣ分析は、吸収光学系を備えた分析用超遠心システムＢｅｃｋｍａｎ　Ｏｐｔｉｍａ　ＸＬ－Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて行った。上記実施例および比較例においてＮ／Ｐ比＝１で調製したＰＩＣ溶液をｓｉＲＮＡ濃度が０．６μＭになるように１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して測定試料とした。２０℃で７２時間遠心後、波長２６０ｎｍにおける吸収をｒの関数として測定した。各試料の測定結果を、ＯＲＩＧＩＮソフトウェアを用いて解析してＰＩＣの分子量（Ｄａ）を求めた。
［ＦＣＳ解析］
　ＦＣＳ解析は、４０×対物レンズ（Ｃ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ、Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社製）およびＣｏｎｆｏＣｏｒ３モジュールを搭載した共焦点レーザスキャン顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社製、製品名「ＬＳＭ５１０」）を用いて行った。上記実施例および比較例においてＮ／Ｐ比＝１で調製したＰＩＣ溶液をｓｉＲＮＡ濃度が１００ｎＭになるように１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して測定試料とした。測定試料を８ウェルチャンバーに移してサンプリング時間１５秒、繰り返し回数５回にてＦＣＳ測定を行った。測定結果をＣｏｎｆｏＣｏｒ３ソフトウェアで解析することにより測定領域内における平均蛍光粒子数を求めた。次いで、以下の式（ａ）を用いて計算することによって、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数を求めた。
ＡＮｓｉＲＮＡ＝ＮｓｉＲＮＡ／ＮＰＩＣ　　　　　　　（ａ）
（式中、ＡＮｓｉＲＮＡは、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数であり、ＮｓｉＲＮＡおよびＮＰＩＣはそれぞれ、蛍光標識したｓｉＲＮＡのみを含む対照試料の平均蛍光粒子数およびＰＩＣ溶液由来の測定試料の平均蛍光粒子数である。）
　上記ＰＩＣの分子量（Ｄａ）およびＰＩＣ１個あたりの核酸会合数を以下の式（ｂ）に代入することにより、ＰＩＣ１個あたりのブロックコポリマー会合数を算出した。
ＡＮｃｏｐｏｌｙｍｅｒ＝［ＭＷＰＩＣ－（ＭＷｓｉＲＮＡ×ＡＮｓｉＲＮＡ）］／ＭＷｃｏｐｏｌｙｍｅｒ　（ｂ）
（式中、ＡＮｃｏｐｏｌｙｍｅｒは、ＰＩＣ１個あたりのブロックコポリマー会合数であり、ＭＷＰＩＣは、上記ＳＥ－ＡＵＣ分析で得たＰＩＣの分子量（Ｄａ）であり、ＭＷｓｉＲＮＡおよびＭＷｃｏｐｏｌｙｍｅｒはそれぞれ、ｓｉＲＮＡおよびブロックコポリマーの構造式に基づいて算出される分子量（Ｄａ）である。）
　上記構造解析の結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１に示されるとおり、実際にＦＣＳ解析および超遠心分析を行って決定されたｓｉＲＮＡおよびブロックコポリマーの会合数はそれぞれ、約１および約２である。ここで、各会合数の標準偏差が０．１以下であることは、実施例１～３および比較例１で得られたＰＩＣは、構成上の均質性が非常に高く、特定の均一な構成を有することを示す。以上より、実施例１～３および比較例１で調製されたＰＩＣが、１分子のｓｉＲＮＡと２分子のブロックコポリマーとから構成されるｕＰＩＣであることが合理的に理解される。
＜ｕＰＩＣの構造解析２＞
　上記参考例１で得られたｕＰＩＣ溶液について、上記ｕＰＩＣの構造解析１と同様にＦＣＳ解析を行うことによって、ＰＩＣ１個あたりの核酸会合数およびＰＩＣの平均粒子径（流体力学的直径：ＤＨ）を求めた。なお、ＰＩＣの平均粒子径（ＤＨ）は、ＣｏｎｆｏＣｏｒ３を用いて、上記ＦＣＳ測定で得られた自己相関曲線を拡散時間に変換し、次いで、該拡散時間をＣｙ５色素を対照として用いて拡散係数（ＤＣ）に変換し、該拡散係数をアインシュタインの関係式（Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ）に代入することによって算出した。結果を図２に示す。
　図２に示されるとおり、参考例１のｕＰＩＣ溶液においては、Ｎ／Ｐ比＝１～１０の範囲にわたって、ｕＰＩＣの平均粒子径が約１８ｎｍであり、また、核酸会合数が約１であり、両者ともほぼ一定であった。このことから、参考例１のｕＰＩＣは、ｕＰＩＣ相互または遊離のブロックコポリマーと二次会合をすることなく、安定な構成単位体として存在することがわかる。
＜結合定数の測定＞
　上記で得られた各ブロックコポリマーのｓｉＲＮＡに対する結合定数（Ｋａ）を以下の方法により決定した。結果を表２に示す。
　結合定数は、エチジウムブロマイド(ＥｔＢｒ)とブロックコポリマーのｓｉＲＮＡに対する結合の競合を、ＥｔＢｒが核酸に結合すると増強する蛍光の強度を定量することにより決定した。上記蛍光強度の定量は、蛍光分光光度計(日本分光社製、ＦＰ‐６６００)を用いて行った。具体的には、測定対象のブロックコポリマーと上記ｓｉＲＮＡ（実施例および比較例で用いたｓｉＬｕｃ、ただし、Ａｌｅｘａ６４７で標識されていない）とを、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解し、ｓｉＲＮＡの終濃度が１μＭとなるように、かつ、Ｎ／Ｐ比が０．２５、０．５または１となるように混合してＰＩＣ溶液を調製した。各Ｎ／Ｐ比のＰＩＣ溶液　１ｍＬに対して、約０．５ｍＭのＥｔＢｒ水溶液を１０μＬずつ１０回滴下し、滴下する度に蛍光強度（ｅｘ　５２５ｎｍ，ｅｍ　６００ｎｍ）の測定を行った。得られた蛍光強度を、既報の方法（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕ．７１，７７（１９９４））に基づいて解析して結合定数を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜ｓｉＲＮＡの血中滞留性評価１＞
　実施例、比較例および参考例で得られたｕＰＩＣ溶液（Ｎ／Ｐ比＝１）を６週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスに尾静脈投与した。このとき、ｓｉＬｕｃの投与量が２ｎｍｏｌ／マウスとなるように投与した。その後、Ｉｎ　ｖｉｖｏ共焦点イメージングシステム(Ｎｉｋｏｎ　Ａ１Ｒ、ニコン社製)を用いて、マウスの耳血管内でのｓｉＬｕｃ由来の蛍光強度を経時的に測定し、次式によって相対蛍光強度を求めた（Ｎ＝１）。投与直後、５分後、１０分後、３０分後および６０分後の相対蛍光強度を表３に示す。
　　　相対蛍光強度（％）=（測定時の強度－バックグラウンド強度）／（最大強度－バックグラウンド強度）×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表３に示されるように、実施例１～３のｕＰＩＣ溶液によれば、参考例１のｕＰＩＣ溶液と同等以上の優れた核酸の血中滞留性が得られた。特に、核酸との結合定数（Ｋａ）が１．０×１０６を超えるブロックコポリマーを用いた実施例１および２では、参考例１よりも優れた核酸の血中滞留性が得られた。一方、比較例１のｕＰＩＣ溶液は、投与直後に蛍光強度が大きく低下し、その後は安定な測定ができなかった。
＜ｓｉＲＮＡの血中滞留性評価２＞
　Ｎ／Ｐ比＝１０のｕＰＩＣ溶液を用いたこと以外は、ｓｉＲＮＡの血中滞留性評価１と同様にして、６週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスにｕＰＩＣ溶液を尾静脈投与し、マウスの耳血管内でのｓｉＬｕｃ由来の蛍光強度を経時的に測定して相対蛍光強度を求めた（Ｎ＝１）。相対蛍光強度の経時的変化を図３に示す。
　図３に示されるように、実施例１～３のｕＰＩＣ溶液（核酸送達用組成物）によれば、参考例１のｕＰＩＣ溶液と同等の優れた核酸の血中滞留性が得られた。一方、比較例１のｕＰＩＣ溶液は、実施例および参考例１のｕＰＩＣ溶液よりも核酸の血中滞留性が劣っていた。
　本発明のｕＰＩＣは、核酸医薬等のドラッグデリバリーシステムにおいて好適に適用され得る。
１００　　　　ユニット型ポリイオンコンプレックス
１０　　　　　ブロックコポリマー
１２　　　　　カチオン性ポリアミノ酸セグメント
１３、１４　　ポリエチレングリコールセグメント
２０　　　　　核酸

Claims (8)

  1. 　ポリエチレングリコールセグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントとを有する特定数のブロックコポリマーと、特定数の核酸と、から構成されるユニット型ポリイオンコンプレックスであって、
    　該ユニット型ポリイオンコンプレックスにおける該ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸セグメントの側鎖由来の正の電荷量の合計が、該核酸由来の負の電荷量の合計で相殺されず、
    　該核酸の鎖長が、１０～５０塩基長であり、
    　該ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、４０×１０３以上であり、
    　該ブロックコポリマーの該核酸に対する結合定数（Ｋａ）が、３．０×１０５以上である、ユニット型ポリイオンコンプレックス。
  2. 　２分子の前記ブロックコポリマーと１分子の前記核酸とから構成される、請求項１に記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。
  3. 　前記核酸が二本鎖核酸である、請求項１または２に記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。
  4. 　前記ポリエチレングリコールセグメントの分子量が、６０×１０３以上である、請求項１から３のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。
  5. 　前記ポリエチレングリコールセグメントが二鎖分枝型であり、
    　各ポリエチレングリコール鎖の分子量が、２０×１０３以上である、請求項１から４のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。
  6. 　前記カチオン性ポリアミノ酸が、構成アミノ酸としてオルニチンを含む、請求項１から５のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックス。
  7. 　請求項１から６のいずれかに記載のユニット型ポリイオンコンプレックスと、
    　該ユニット型ポリイオンコンプレックスを構成し得るブロックコポリマーであって、遊離のブロックコポリマーと、を含む、核酸送達用組成物。
  8. 　組成物中における前記ブロックコポリマー由来のアミノ基のモル濃度と前記核酸由来のリン酸基のモル濃度との比（Ｎ／Ｐ比）が、１～２０である、請求項７に記載の核酸送達用組成物。
     
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