WO2018223876A1 - 一种荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Definitions

  • the invention relates to a fluorescent probe, a preparation method thereof and use thereof.
  • Fluorescence-specific labeling is an important means of studying protein function and quantification. Fluorescent labels are an irreplaceable advantage over other research methods in terms of sensitivity, in situ, instant, and visual. Although the molecular structure of organic small molecule fluorescent dyes is abundant, small molecule fluorescent probes still have many defects in protein-specific labeling. The same fluorescent emission exists regardless of whether the free probe or the labeled probe, that is, whether the probe on the label or not is emitting fluorescence in the system. This non-characteristic fluorescence emission is clearly a serious drawback of current ligand labeling techniques. Removing the probe without the label by washing is the only effective way to solve the above problems. Obviously, the application of this technology will be severely limited in situations where it is needed quickly or cannot be washed.
  • a method for fluorescently activated protein-specific labeling for ligand labeling techniques is designed, it is dark or emits very weak fluorescence before labeling, and once it is labeled on the protein, the fluorescence of the dye sharply increases.
  • probes of this type will have the same specificity as fluorescent proteins, which will not only eliminate free probe washing, but also greatly reduce the background interference of free probes, and will widen the application of such techniques.
  • a method for designing a fluorescently activated protein-specific label suitable for this technique must consider a suitable fluorescence loss/activation mechanism. The FRET mechanism is first applied to the design of this aspect by adding an additional fluorescence quenching group to the ligand.
  • the small molecule fluorescence is quenched by the group to which it is attached; once the ligand is combined with the chemical tag, the quenching group is quenched. Leaving, fluorescence activation is achieved (ZX Chen et. al. J. Am. Chem. Soc. 2012, 124, 12692-12699.).
  • the introduction of the quenching group greatly increases the molecular volume of the probe, greatly reduces the labeling speed, severely limits the real-time tracking and detection of the probe protein in cells and tissues, and the fluorescent probe and quenching group. There must be a good energy level match between the clusters, which makes the long wavelength, for example, the FRET design of the red light emitting dye very difficult.
  • fluorescence-sensitive dyes have also been used to design activated probes (TKLiu.et.al.ACS Chem.Biol. 2014, 9, 2359-2365.), the dye is in a large polarity such as cell fluid In the solvent, the probe has no fluorescence or has weak fluorescence. When the ligand binds to the protein, the probe is in the protein non-polar pocket, and the probe emits stronger fluorescence.
  • the fluorescence enhancement of the probe is limited; on the other hand, the cell or tissue itself is a very complex system, and the polarity of each organelle changes very much. Large, these can lead to polar-sensitive probes with a high background in cell or tissue imaging.
  • the present inventors have found that by attaching an addition-activated fluorescent dye to a ligand moiety, it is possible to specifically label a target protein and achieve fluorescence-specific illumination, and the probe fluorescence is not affected by other nucleophiles, thereby obtaining A new structure of fluorescent probes, which can be used for specific labeling of proteins, with fast labeling and wide application range, and can be effectively used for labeling, tracking, localization and quantification of target proteins.
  • the present invention provides a fluorescent probe characterized in that the fluorescent probe comprises a ligand moiety A, an optional linker moiety B, a fluorescent dye moiety C, and the fluorescent dye moiety C is an addition-activated fluorescent dye.
  • a group comprising a fluorophore D, an optional unsaturated moiety E, a double bond moiety F, said ligand moiety A comprising a group capable of being specifically recognized by a target protein.
  • the fluorescent probe described above has a structure as shown in formula (I),
  • the ligand moiety A includes a ligand group capable of specifically recognizing a target protein, a drug group, a small molecule inhibitor group, or a short peptide group composed of 2-100 amino acids;
  • Linker moiety B is an optionally present group selected from the group consisting of alkylene, modified alkylene, aryl, Wherein R is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, modified alkyl or aryl.
  • the fluorescent dye moiety C is a structural moiety represented by the formula (I-a) in the formula (I).
  • the double bond portion F is a structural portion represented by the formula (I-a-1) in the formula (I-a),
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, a halogen atom, a nitro group, a cyano group, a carboxyl group, a ketone group, an ester group, an amide group, a phosphonate group, a phosphonite group, a sulfonic acid group, a sulfonate group, a sulfone group, a sulfoxide group, an aryl group, a heteroaryl group, an alkyl group or a modified alkyl group; alternatively, R 2 and R 3 are bonded to each other to form an alicyclic or heterocyclic ring together with a carbon atom. ;
  • the unsaturated structural moiety E is an optionally present group which is a structure represented by the following formula (Ib) and is selected from a vinylidene group or a conjugated alkenylene group, an ethynylene group or a conjugated alkynylene group, and an aromatic group.
  • the fluorophore D is selected from the group consisting of a coumarin group, a quinone group, a borodiazole-based (BODIPY) group, a xanthene-based group, a quinone group, and a porphyrin group.
  • the fluorescent probe described above has a structure as shown in the formula (I-I),
  • R 2 and the linker moiety B are linked to each other to form an alicyclic or heteroalicyclic ring; alternatively, R 2 and the ligand moiety A are linked to each other to form an alicyclic or heteroalicyclic ring;
  • the fluorescent probe described above has a structure as shown in the formula (I-II),
  • the fluorescent probe described above is characterized in that:
  • the target protein is a purified product, an unpurified product or an in situ state present in a cell, a tissue or a living body, the target protein having a nucleophilic group;
  • the target protein is dihydrofolate reductase or a mutant thereof, His-tag (Shohei Uchinomiya. et al. Chem. Commun., 2013, 49, 5022-5024.) or a mutant thereof, a kinase or a mutant thereof, cathepsin (Cysteine cathepsins) or a mutant thereof, carbonic anhydrase or a mutant thereof, FKBP12 or a mutant thereof;
  • the target protein is a mutated dihydrofolate reductase L28C or W22C, or a growth factor T790M;
  • the nucleophilic group is selected from the group consisting of: a thiol group, a hydroxyl group, an amino group, an imidazole, and a pyrrole;
  • the ligand moiety A is selected from the group consisting of a methylaminosteroid group, a nickel ligand group, a zinc ligand group, a fenil group, a short peptide group, a benzenesulfonamide. a group-like group, a rapamycin group;
  • the nickel ligand-based group refers to a group forming a complex with nickel, for example, a group represented by the following formulas 3 and 4;
  • the zinc ligand-based group refers to a group forming a complex with zinc, for example, a group represented by the following formula 5;
  • the ligand moiety A is selected from the group consisting of:
  • the ligand moiety A is selected from the group consisting of:
  • the connector portion B is selected from the group consisting of: Wherein R is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, modified alkyl or aryl;
  • the connector portion B does not exist
  • the unsaturated structural moiety E is selected from the structures in the following formulas (I-1) to (I-9):
  • R 6 - is X 0 O- or N(X 1 )(X 2 )-, and X 0 , X 1 , X 2 are each independently selected from hydrogen, alkyl and modified alkyl, optionally, X 1 , X 2 is linked to each other as a saturated or unsaturated heterocyclic ring;
  • each of the hydrogen atoms contained in the parent core structure represented by the following formula (II-Ii) is optionally independently selected from a halogen atom, a nitro group, and a hydrophilic group. Substituted with a substituent of a group, an alkyl group and a modified alkyl group, which are optionally linked to each other to form a saturated or unsaturated alicyclic or heteroalicyclic ring;
  • a substituent on the formula (II-Ii) is bonded to X 0 , X 1 or X 2 to form a saturated or unsaturated heteroalicyclic ring;
  • the oxime group has a structure as shown in the formula (II-II), wherein each hydrogen atom contained therein is optionally independently selected from a halogen atom, a nitro group, a hydrophilic group, an alkyl group and a modified alkane. Substituted by a substituent which is optionally linked to each other to form a saturated or unsaturated alicyclic or heteroalicyclic ring;
  • the structure of the borodipyrromethene group is as shown in formula (II-III), wherein R 7 and R 8 are each independently selected from a halogen atom, an alkyl group, a modified alkyl group;
  • each of the hydrogen atoms contained is optionally independently selected from a halogen atom.
  • a substituent of an alkyl group and a modified alkyl group which are optionally linked to each other to form a saturated or unsaturated alicyclic or heterocyclic ring, an aromatic ring or an aromatic heterocyclic ring;
  • the formula (II- The substituent on III-i) is bonded to R 7 and/or R 8 to form a saturated or unsaturated alicyclic or heterocyclic ring, an aromatic ring or an aromatic heterocyclic ring;
  • the structure of the xanthene group is as shown in formula (II-IV-a), (II-IV-b), (II-IV-c) or (II-IV-d), wherein :X 3 , X 4 , X 5 , X 6 , X 7 are each independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, and modified alkyl; X 4 , X 5 , X 6 , and X 7 are optionally bonded to each other to be saturated or unsaturated.
  • An aliphatic heterocyclic ring L is an anion;
  • X is selected from the group consisting of O, CR a R b , SiR a R b , GeR a R b , SnR a R b , Se, wherein R a and R b are each independently selected from hydrogen and an alkane And a modified alkyl group, optionally, R a , R b are linked to each other as an alicyclic or heteroalicyclic ring;
  • each hydrogen atom contained is optionally independently selected from a halogen atom, an alkyl group and a modified alkyl group. Substituted by a substituent which is optionally linked to each other to form a saturated or unsaturated alicyclic or heterocyclic ring, an aromatic ring or an aromatic heterocyclic ring; alternatively, a substituent on the formula (II-IV-i) And X 4 , X 5 , X 6 , and X 7 are bonded to each other to form a saturated or unsaturated alicyclic or heterocyclic ring, an aromatic ring or an aromatic heterocyclic ring;
  • the structure of the flavonoid group is as defined in formula (II-Va), (II-Vb), (II-Vc), (II-Vd), (II-Ve) or (II-Vf)
  • X, Y are each independently selected from the group consisting of S, O, CR c R d , wherein R c , R d are each independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, and modified alkyl
  • X 8 and X 9 are each independently Selected from hydrogen, alkyl, modified alkyl
  • L is an anion
  • one hydrogen atom is optionally selected Independently substituted by a substituent selected from a hydrophilic group, an alkyl group, a modified alkyl group, which are optionally bonded to each other to form a saturated or unsaturated alicyclic or heterocyclic ring, aromatic ring or aromatic ring;
  • the structure of the porphyrin group is as shown in formula (II-VI-a) or (II-VI-b), wherein each hydrogen atom contained therein is optionally independently selected from an alkyl group, Substituting a substituent of a modified alkyl group, which are optionally interconnected to form a saturated or unsaturated alicyclic or heterocyclic ring, an aromatic ring or an aromatic heterocyclic ring; wherein M is a metal ion;
  • the wavy line connection means that hydrogen at a position connected to the linker portion B or the ligand portion A is replaced by the linker portion B or the ligand portion A;
  • the fluorescent probe described above is characterized in that:
  • the alkyl group is a saturated aliphatic straight or branched alkyl group having 1 to 30 carbon atoms; alternatively, a C 1 -C 10 linear or branched alkyl group; alternatively, C 1 a -C 7 straight or branched alkyl group; optionally, a C 1 -C 5 straight or branched alkyl group; optionally, selected from the group consisting of methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and Butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, isopentyl, 1-ethylpropyl , neopentyl, n-hexyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, isohexyl, 1,1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbuty
  • the alkylene group is a saturated aliphatic straight or branched alkylene group having 1 to 30 carbon atoms; alternatively, it is a C 1 -C 7 linear or branched alkylene group; alternatively, Is a C 1 -C 5 linear or branched alkylene group;
  • substitution of a carbon atom as used herein means that a carbon atom or a carbon atom is replaced by a corresponding group together with a hydrogen atom thereon.
  • the alicyclic ring is a saturated or unsaturated 3 to 10 membered monocyclic or polycyclic alicyclic ring;
  • the heteroalicyclic ring is a saturated or unsaturated 3 to 10 membered monocyclic or polycyclic heterocyclic ring containing at least one hetero atom selected from N, O, S or Si, on the heteroalicyclic ring.
  • S atom When it contains an S atom, it is optionally -S-, -SO- or -SO 2 -; the heterocyclic heterocyclic ring is optionally modified by a halogen atom, a nitro group, an alkyl group, an aryl group, a hydrophilic group, and Alkyl substitution
  • the aryl, arylene or aromatic ring is a 5- to 10-membered aromatic monocyclic or aromatic fused bicyclic ring;
  • the heteroaryl, heteroarylene or aromatic heterocyclic ring is a 5- to 10-membered aromatic monocyclic or aromatic fused bicyclic ring containing at least one hetero atom selected from N, O, S or Si;
  • the halogen atoms are each independently selected from the group consisting of F, Cl, Br, and I;
  • the hydrophilic group is a hydroxyl group, a sulfonic acid group, a sulfuric acid group, a phosphoric acid group, a primary amino group, a secondary amino group or a tertiary amino group, or a salt thereof;
  • the monocyclic cyclocyclic hydrocarbon group is a 3 to 7 membered cycloalkylene group
  • the bicyclic subcyclic hydrocarbon group is a 5- to 7-membered bicyclic ring-opened hydrocarbon group
  • the bridged heterocyclic ring is a 5- to 20-membered bridged heterocyclic ring containing at least one hetero atom selected from N, O, or S on the ring;
  • the anion is selected from the group consisting of: Cl - , I - , Br - , SO 4 2- , ClO 4 - , PF 6 - ;
  • the metal ion is selected from the group consisting of Fe 3+ , Fe 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , Co 2+ , Zn 2+ , Ru 2+ , Sn 2+ ;
  • the amide group is a RCONR' group
  • the sulfonic acid group is an RSO 3 H group
  • the sulfonate group is an RSO 2 OR'group
  • the sulfone group is an RSO 2 R'group
  • the primary amino group is an RNH 2 group
  • the secondary amino group is a RNHR' group
  • the tertiary amino group is an RNR 'R" group
  • the monosaccharide unit is a saccharide unit that can no longer be simply hydrolyzed into smaller sugar molecules
  • the disaccharide unit is a saccharide unit obtained by dehydration of two monosaccharides
  • the polysaccharide unit is a saccharide unit obtained by dehydration of more than ten monosaccharides
  • the C 1 -C 8 alkyl group is a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group
  • the C 1 -C 8 alkoxy group is a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, Isopropoxy group
  • the C 1 -C 8 acyloxy group is acetoxy group, ethyl group, propyl group, isopropyl group
  • the C 1 -C 8 haloalkyl group is trifluoromethyl group, chloromethyl group, bromine group methyl;
  • R 7 and R 8 are each independently selected from the group consisting of a halogen atom, a C 1 -C 30 alkyl group, a C 1 -C 30 alkoxy group, a modified alkyl group capable of containing a water-soluble group;
  • R 7, R 8 is F, or together form - (CH 2 CH 2 O) n -, wherein, n is 1 to 10;
  • R 7 and R 8 are a methoxy group or a methoxyethynyl group
  • each hydrogen atom contained in the formula (II-III-i) is independently substituted with the following structure:
  • each hydrogen atom contained in the formula (II-III-i) is independently substituted with the following structure:
  • the fluorescent probe described above is characterized in that:
  • the formula (II-I) is selected from the structures of the following formulas (II-I-1) to (II-I-6):
  • formula (II-I) is selected from the structures of the following formulas (II-I-7) to (II-I-18):
  • the formula (I) contains a structure of the following formula (I-c) selected from the structures of the formulae (II-I-19) to (II-I-30):
  • the formula (I-c) is selected from the structures of the formulae (II-I-31) to (II-I-32):
  • the formula (II-III) is selected from the structures of the following formulas (II-III-1) to (II-III-25):
  • formula (II-III) is selected from the structures of the following formulas (II-III-26) to (II-III-30):
  • formula (II-IV-a), (II-IV-b), (II-IV-c) or (II-IV-d) is selected from the following formula (II-IV-1) ⁇ Structure in (II-IV-41):
  • formula (II-IV-a), (II-IV-b), (II-IV-c) or (II-IV-d) is selected from the following formula (II-IV-42) ⁇ Structure in (II-IV-52):
  • the (II-Va), (II-Vb), (II-Vc), (II-Vd), (II-Ve) or (II-Vf) is selected from the following formula (II-V- 1) ⁇ (II-V-14) structure:
  • the fluorescent probe described above is characterized in that the fluorescent probe is selected from the following structure:
  • the present invention also provides a method of preparing the above-described fluorescent probe, comprising the steps of reacting a fluorescent dye represented by the formula (III) with a ligand and an optional linker:
  • Y reaction can be bonded to a linker group or a ligand; optionally, Y is selected from the group consisting of a carboxylic acid group, an acid chloride group, an active ester, a sulfonic acid group, a sulfonyl chloride, an isocyanate, an isothiocyanate, a phosphine. Acid base.
  • the present invention also provides a fluorescence-activated protein-specific labeling method, comprising the steps of: contacting the fluorescent probe with a target protein, and the ligand portion of the fluorescent probe is labeled with a target protein, Marking a fluorescent probe onto a target protein; optionally, labeling the fluorescent probe onto the target protein is a covalent label;
  • the reaction medium of the labeling reaction is selected from a pure protein solution, a cell lysate or an in situ medium in which the target protein is present; optionally, the in situ medium is an intracellular medium, an intracellular medium, a living body. Tissue medium, blood or body fluids.
  • the invention also provides the above fluorescent probe in protein fluorescent labeling, protein quantification, detection, kinetics, activity research, and use in cells, tissues, and living images.
  • the protein includes eDHFR-I50C, eDHFR-N18C, eDHFR-N23C, eDHFR-L28C, 6his-cys, cys-6his-, 6his-aa-cys-, cys-1aa-6his-, 6his-2aa -cys-, cys-2aa-6his-, 6his-3aa-cys-, cys-3a-6his-, 6his-4aa-cys-, cys-4aa-6his-, 6his-5aa-cys-.
  • the present invention also provides a probe kit comprising the above fluorescent probe.
  • the probe kit further comprises a biocompatible medium; optionally, the biocompatible medium is selected from at least one of dimethyl sulfoxide, a buffer, and physiological saline;
  • the buffer comprises a phosphate buffer.
  • the target protein of the present invention can be prepared by existing genetic engineering techniques or can be derived from a natural protein.
  • the additive-activated fluorescent dye according to the present invention means that the fluorescent group having fluorescence is linked to ethylene or a derivative thereof to form a dye, and the fluorescence is quenched. When the ethylene double bond of ethylene or its derivative is added, the fluorescence is obtained. Increased strength.
  • the additive having an addition-activated fluorescent dye has a ratio of maximum fluorescence emission intensity of the dye after addition to fluorescence intensity before addition at 25 ° C under the same concentration and excitation wavelength. Preferably, more than 5, more preferably more than 10, organic dye molecules.
  • the concentration of the addition-activated dye ranges from 1 ⁇ 10 -7 M to 1 ⁇ 10 -5 M.
  • the staff in the field can select the corresponding protein and ligand
  • the instruments used may include equipment and facilities capable of testing or displaying fluorescence, such as fluorescence spectrometer, fluorescence microscope, confocal microscope, enzyme.
  • Equipment such as standard instruments, flow cytometers, and live imagers.
  • the operator can select dyes of different kinds or emission/excitation wavelengths as needed.
  • the fluorescent probe has a wide range of fluorescence emission wavelengths.
  • a fluorescent probe can be used for specific labeling of a target protein, fluorescence can be activated after binding of a fluorescent probe to a target protein, has good fluorescent molecular switching properties, and has high fluorescence activation multiple and fluorescence activation. High Brightness.
  • the fluorescent probe can specifically label the intracellular target protein and achieve fluorescence-specific illumination, and at the same time, the probe fluorescence is not affected by the intracellular environment such as other nucleophiles in the cell. .
  • the binding of the fluorescent probe to the target protein is covalently bound.
  • the fluorescence intensity of the fluorescent probe has a good linear relationship with the target protein concentration, and can be used for quantitative detection of the target protein, and the content of the active protein can be determined.
  • the fluorescent probe can serve as a powerful tool for cell subcellular organelle markers, such as markers for the nucleus, mitochondria, Golgi apparatus, endoplasmic reticulum, cytoskeleton, intracellular membrane, lysosomes, and the like.
  • the fluorescence of the fluorescent probe is not affected by the environment of the animal, and can be applied to a specific marker of a target protein in a living animal.
  • the fluorescent probe can be rapidly labeled onto the native protein, can be used for rapid detection of tumors, and guides tumor resection during surgery.
  • a fluorescent probe can perform rapid contrast imaging of a tissue that is not suitable for washing, such as tissue, living body, and the like.
  • the fluorescent probe is used to label the target protein with almost no detection signal, does not interfere with the detection of the sample, can realize rapid quantitative detection of complex samples, and can also track the dynamic process of the labeling reaction process.
  • probe 1 is a fluorescence spectrum of different probe-labeled cells, wherein (1) to (12) are probe 2, probe 11, probe 58, probe 85, probe 93, probe 115, probe 135, The results of cell labeling of probe 142, probe 159, probe 176, probe 189, and probe 200 are shown as dark field fluorescence on the left and bright field on the right.
  • Group A is Hela cells overexpressing the corresponding protein tag
  • group B is Hela-WT cells (Hela primordial cells, which do not express the corresponding target protein);
  • FIG. 2 is an SDS-PAGE diagram of different probes reacted with corresponding protein tags, wherein (1) to (12) are probe 2, probe 11, probe 58, probe 85, probe 93, and probe, respectively. 115, probe 135, probe 142, probe 159, probe 176, probe 189, probe 200 and corresponding combined SDS-PAGE map; Coomassie blue staining on the left and fluorescence imaging on the right.
  • Figure 12 is a probe standard curve of the fluorescence intensity and probe concentration of the probe 197;
  • Figure 13 is a fluorescence spectrum of different organelles with different probe labels, wherein group A to group C are probe 2, probe 11, probe 48, respectively, (1) to (7) are nucleus, lysosome, Mitochondria, Golgi, cytoskeleton, endoplasmic reticulum and intracellular membrane;
  • Figure 14 is a fluorescence spectrum of the results of labeling experiments using probe 143 for intracellular endogenous proteins, wherein A is a blank group and B is a group overexpressing BTK protein (endogenous protein);
  • Figure 15 is a fluorescence spectrum of the experimental results of the probe 27 for labeling in a living mouse, wherein A is a blank group liver, B is a sample group liver, and C is a control group liver;
  • Figure 16 is a fluorescence spectrum of the experimental results of probe 2 for labeling live zebrafish, in which 16 (1) group is the probe fluorescence channel, 16 (2) group is the mKate fluorescence channel, 16A is the injection probe group, and 16B is the 16B The probe set was not injected;
  • Fig. 17 is a fluorescence spectrum of the experimental results of the labeling of the endogenous protein of the probe 140 for the living mouse, Fig. 17A shows the result of the injection before the injection of the probe, and Fig. 17B shows the result of the imaging after the injection of the probe for 3 hours;
  • Figure 18 is a graph showing the fluorescence intensity versus time for the reaction kinetics of probe 2 and eDHFR different mutants, wherein I50C, N18C, N23C, L28C are mutants of eDHFR, and WT is a wild type eDHFR containing no thiol group, buffer a phosphate buffer solution for probe 2;
  • Figure 19 is a graph showing the fluorescence intensity versus time for the reaction kinetics of probe 90 and his-tag different mutants.
  • the "probe” in the present invention is a shorthand for "fluorescent probe”.
  • Resorcinol (11.0 g, 0.1 mol) was placed in a 100 ml round bottom flask, maleic anhydride (4.9 g, 0.05 mol) was added, 50 ml of concentrated sulfuric acid was carefully added, and heated in an oil bath at 150 ° C for 6 h under argon atmosphere. After completion of the reaction, it was cooled to room temperature, added to 200 g of crushed ice, filtered, and the filter cake was washed twice with iced ethanol, dried, and ethanol was resected to give the product 16.07 g, yield 57%.
  • N,N-Dimethylm-aminophenol (13.7 g, 0.1 mol) in a 100 ml round bottom flask, maleic anhydride (4.9 g, 0.05 mol) was added, and 50 ml of concentrated sulfuric acid was carefully added under argon atmosphere. °C oil bath heating for 6h, the reaction is completed, cooled to room temperature, added to 200g of crushed ice, filtered, filter cake washed twice with iced ethanol, dried, ethanol recrystallized, recrystallized product ion exchange by chloride ion exchange chromatography, concentrated product 3.78 g, yield 20%.
  • N', N'-dimethylm-aminophenol (1.37 g, 10.0 mmol) and 250 ml in-situ flask were dissolved in 130 ml of anhydrous dichloromethane, and then added with maleic anhydride (0.98 g, 10.0 mmol). 0°C, anhydrous aluminum trichloride (1.33g, 10.0mmol) was added to slowly return to room temperature. After the reaction was completed, the reaction was quenched by carefully adding 5 ml of water, filtered, and the organic phase was washed with saturated brine, and the organic The sodium was dried, and the solvent was evaporated to dryness, and the product was purified by column chromatography.

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Abstract

一种荧光探针及其制备方法和用途，所述荧光探针为加成激活型探针，可用于蛋白的特异性荧光标记，还可用于蛋白的定量、检测、动力学、活性研究以及细胞、组织和活体影像。

Description

一种荧光探针及其制备方法和用途 技术领域
本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
荧光特异性标记，是研究蛋白功能并定量的一种重要手段。和其它研究方法相比，荧光标记具有灵敏、原位、即时、可视等不可替代的优势。有机小分子荧光染料的分子结构虽然丰富，但是小分子荧光探针在蛋白特异性标记方面仍存在很多缺陷。无论游离的探针还是已标记的探针都存在同样的荧光发射，也就是说，不管标记上的还是没标记上的探针都在该体系内发射荧光。这种非特征性的荧光发射，显然是当前配体标记技术的严重缺陷。将没有标记上的探针通过洗涤的方法加以去除，是当前解决以上问题的唯一有效方法。显然，在一些需要快速，或者无法洗涤的场合，该技术的应用将受到严重限制。
假若设计一种适用于配体标记技术的荧光激活型蛋白特异标记的方法，它在未标记之前是暗的或发射非常弱的荧光，一旦它标记在蛋白上后，染料的荧光急剧增强。毫无疑问，这类设计的探针将有可能实现与荧光蛋白具有等同的特异性，不仅可以免除游离探针洗涤，大幅降低游离探针的背景干扰，而且势必拓宽此类技术的应用。设计适用于该技术的荧光激活型蛋白特异标记的方法，必须考虑一个合适的荧光失/激活机制。FRET机制首先应用于这方面的设计，在配体上额外加入荧光淬灭基团，正常情况下小分子荧光被与之相连的基团淬灭；一旦配体与化学标签结合后淬灭基团离去，实现荧光激活(Z.X.Chen et.al.J.Am.Chem.Soc.2012，124，12692—12699.)。但是，淬灭基团的引入，大大增加了探针的分子体积，使标记速度大大下降，严重限制了探针在细胞、组织中蛋白的实时跟踪与检测，并且，荧光探针与淬灭基团之间必须具有较好的能级匹配，这样使得长波长，例如，红光发射染料的FRET设计非常困难。另外，一些荧光对极性敏感的染料也被用来设计激活型探针(T.K.Liu.et.al.ACS Chem.Biol.2014，9，2359—2365.)，染料处于细胞液等大极性溶剂中，探针没有荧光或者具有较弱荧光，当配体与蛋白结合，探针处于蛋白非极性口袋中，探针发射较强荧光。然而，一方面由于蛋白表面本身就存在一个极性较大的水化层，使探针的荧光增强幅度有限；另一方面，细胞或组织本身是个非常复杂的体系，各个细胞器的极性变化很大，这些都会导致极性敏感的探针在细胞或组织造影中具有很高的背景。
发明内容
本发明人发现，通过将加成激活型荧光染料与配体部分相连，可以实现特异性标记靶蛋白，并实现荧光特异性点亮，探针荧光不受其他亲核试剂的影响，从而获得了一种全新结构的荧光探针，可用于蛋白的特异性标记，标记速度快、适用范围广，能够有效用于靶蛋白的标记、跟踪、定位和定量。
本发明是通过以下技术方案来实施的：
本发明提供一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括配体部分A、任选的连接体部分B、荧光染料部分C，所述荧光染料部分C为加成激活型荧光染料基团，包括荧光团D、任选的不饱和结构部分E、双键部分F，所述配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的基团。
可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I)所示的结构，
A-B-C
(I)
其中：
配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的配体基团、药物基团、小分子抑制剂基团或2-100个氨基酸组成的短肽类基团；
连接体部分B为任选存在的基团，选自亚烷基、改性亚烷基、芳基、
Figure PCTCN2018088987-appb-000001
Figure PCTCN2018088987-appb-000002
其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基。
荧光染料部分C为式(I)中的式(I-a)所示结构部分，
Figure PCTCN2018088987-appb-000003
其中：
双键部分F为式(I-a)中的式(I-a-1)所示结构部分，
Figure PCTCN2018088987-appb-000004
R 1、R 2、R 3各自独立地选自氢、卤原子、硝基、氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸酯基、亚膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基或改性烷基；可选地，R 2和R 3相互连接，与碳原子一起形成脂环或脂杂环；
不饱和结构部分E为任选存在的基团，其为如下式(I-b)所示的结构，为选自亚乙烯基或共轭亚烯基、亚乙炔基或共轭亚炔基、亚芳基、亚杂芳基中的至少一种，且其与D环共轭连接，并且与式(I-a-1)共轭连接，其中不饱和结构部分E所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；
Figure PCTCN2018088987-appb-000005
荧光团D选自香豆素类基团、芘类基团、硼二吡咯甲川类(BODIPY)基团、呫吨类基团、花箐类基团、卟啉类基团。
可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I-I)所示的结构，
Figure PCTCN2018088987-appb-000006
可选地，R 2与连接体部分B相互连接形成脂环或脂杂环；可选地，R 2与配体部分A相互连接形成脂环或脂杂环；
可选地，式(I-a-1)结构为如下所示：
Figure PCTCN2018088987-appb-000007
可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I-II)所示的结构，
Figure PCTCN2018088987-appb-000008
可选地，上述的荧光探针，其特征在于：
所述靶蛋白为提纯品、未提纯品或存在于细胞、组织或活体的原位状态，所述靶蛋白具有亲核基团；
可选地，所述靶蛋白为二氢叶酸还原酶或其突变体、His-tag(Shohei Uchinomiya.et al.Chem.Commun.,2013,49,5022—5024.)或其突变体、激酶或其突变体、组织蛋白酶(Cysteine cathepsins)或其突变体、碳酸酐酶或其突变体、FKBP12或其突变体；
可选地，所述靶蛋白为突变的二氢叶酸还原酶L28C或W22C，或生长因子T790M；
可选地，所述亲核基团选自：巯基、羟基、氨基、咪唑、吡咯；
可选地，所述配体部分A选自甲氨基碟呤类基团、镍配体类基团、锌配体类基团、替尼类药物基团、短肽类基团、苯磺酰胺类基团、雷帕霉素类基团；
所述镍配体类基团是指与镍形成配合物的基团，例如下式3、4所示基团；
所述锌配体类基团是指与锌形成配合物的基团，例如下式5所示基团；
可选地，所述配体部分A选自下式结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000009
Figure PCTCN2018088987-appb-000010
可选地，所述配体部分A选自下式结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000011
可选地，所述连接体部分B选自：
Figure PCTCN2018088987-appb-000012
其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基；
可选地，所述连接体部分B不存在；
可选地，所述不饱和结构部分E选自下式(I-1)～(I-9)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000013
可选地，所述香豆素类基团的结构如式(II-I)所示：
Figure PCTCN2018088987-appb-000014
其中，R 6-为X 0O-或N(X 1)(X 2)-，X 0、X 1、X 2各自独立地选自氢、烷基和改性烷基，可选地，X 1，X 2相互连接为饱和或不饱和的脂杂环；
可选地，所述香豆素类基团中下式(II-I-i)所示的母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；
Figure PCTCN2018088987-appb-000015
可选地，式(II-I-i)上的取代基与X 0、X 1或X 2相互连接形成饱和或不饱和脂杂环；
所述芘类基团的结构如式(II-II)所示，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；
Figure PCTCN2018088987-appb-000016
可选地，所述硼二吡咯甲川类基团的结构如式(II-III)所示，其中，R 7、R 8各自独立地选自卤原子、烷基、改性烷基；
Figure PCTCN2018088987-appb-000017
其中，式(II-III)所示硼二吡咯甲川类基团中的下式(II-III-i)所示母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；可选地，式(II-III-i)上的取代基与R 7和/或R 8相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；
Figure PCTCN2018088987-appb-000018
可选地，所述呫吨类基团的结构如式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)所示，其中：X 3、X 4、X 5、X 6、X 7各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；X 4、X 5、X 6、X 7任选相互连接为饱和或不饱和的脂杂环；L为阴离子；X选自O、CR aR b、SiR aR b、GeR aR b、SnR aR b、Se，其中R a、R b各自独立地选自氢、烷基和改性烷基，可选地，R a、R b相互连接为脂环或脂杂环；
Figure PCTCN2018088987-appb-000019
其中，所述呫吨类基团中的下式(II-IV-i)所示母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；可选地，式(II-IV-i)上的取代基与X 4、X 5、X 6、X 7相互连接构成饱和或不饱和 的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；
Figure PCTCN2018088987-appb-000020
可选地，所述花箐类基团的结构如式(II-V-a)、(II-V-b)、(II-V-c)、(II-V-d)、(II-V-e)或(II-V-f)所示，其中：X、Y各自独立地选自S、O、CR cR d，其中R c、R d各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；X 8、X 9各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；L为阴离子；
Figure PCTCN2018088987-appb-000021
其中，所述花箐类基团中的如下式(II-V-i)、(II-V-ii)或(II-V-iii)所示的母核结构中，所含的个氢原子任选独立地被选自亲水性基团、烷基、改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；
Figure PCTCN2018088987-appb-000022
可选地，所述卟啉类基团的结构如式(II-VI-a)或(II-VI-b)所示，其中所含的各个氢原子任选独立地被选自烷基、改性烷基的取代基取代，所述取代基任选的相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；其中，M为金属离子；
Figure PCTCN2018088987-appb-000023
上述式(I-a)中，波浪线连接方式是指与连接体部分B或配体部分A相连位置的氢被连接体部分B或配体部分A替代；
可选地，上述的荧光探针，其特征在于：
所述烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的烷基；可选地，为C 1-C 10直链或支链烷基；可选地，为C 1-C 7直链或支链烷基；可选地，为C 1-C 5直链或支链烷基；可选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2,2,3-三甲基丁基；
所述亚烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的亚烷基；可选地，为C 1-C 7直链或支链亚烷基；可选地，为C 1-C 5直链或支链亚烷基；
所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-NO 2、-CN、-S-、-SO 2-、-(S＝O)-、
Figure PCTCN2018088987-appb-000024
芳基(优选苯基)、亚芳基(优选亚苯基)、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～33个碳原子，可选地，所述改性烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
所述改性亚烷基为亚烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-NO 2、-CN、-S-、-SO 2-、-(S＝O)-、
Figure PCTCN2018088987-appb-000025
芳基(优选苯基)、亚芳基(优选亚苯基)、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性亚烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
这里所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基团置换。
所述脂环为饱和或不饱和的3～10元单环或多环脂环；
所述脂杂环为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的3～10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有S原子时，其任选为-S-、-SO-或-SO 2-；所述脂杂环任选被卤原子、硝基、烷基、芳基、亲水性基团和改性烷基取代；
所述芳基、亚芳基或芳香环为5～10元芳香单环或芳香稠合双环；
所述杂芳基、亚杂芳基或芳香杂环为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的5～10元芳香单环或芳香稠合双环；
所述卤原子各自独立地选自F、Cl、Br、I；
所述亲水性基团为羟基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、伯氨基、仲氨基或叔氨基，或它们的盐；
所述单环亚环烃基为3～7元亚环烃基；
所述双环亚环烃基为5～7元双环亚环烃基；
所述桥联脂杂环为环上含有选自N、O、或S中的至少一种杂原子的5～20元桥联脂杂环；
所述阴离子选自：Cl -、I -、Br -、SO 4 2-、ClO 4 -、PF 6 -；
所述金属离子选自：Fe 3+、Fe 2+、Cu 2+、Mg 2+、Co 2+、Zn 2+、Ru 2+、Sn 2+；
所述酮基为R-(C＝O)R'基团；
所述酯基为R(C＝O)OR'基团；
所述酰胺基为RCONR'基团；
所述亚膦酸酯基RP(＝O)(OH) 2基团；
所述膦酸酯基为ROP(＝O)(OH) 2基团；
所述磺酸基为RSO 3H基团；
所述磺酸酯基为RSO 2OR'基团；
所述砜基为RSO 2R'基团；
所述亚砜基RSOR'基团；
所述伯氨基为RNH 2基团；
所述仲氨基为RNHR'基团；
所述叔氨基为RNR'R”基团；
所述季铵盐基R R'R”R”'N +基团；
各个R、R'、R”、R”'各自独立地为单键、烷基、亚烷基、改性烷基或改性亚烷基，所述改性烷基或改性亚烷基为C 1-C 10(优选为C 1-C 6)烷基或亚烷基的任意一个碳原子被选自-O-、-OH、-CO-、-CS-、-(S＝O)-中一种基团置换所得的基团；
可选地，所述改性烷基或改性亚烷基各自独立地为含有选自-OH、-O-、-NH-、乙二醇单元(-(CH 2CH 2O) n-)、C 1～C 8烷基、C 1～C 8烷氧基、C 1～C 8酰基氧基、C 1～C 8卤代烷基、单糖基团、二糖基团、多糖基团、-O-CO-、-NH-CO-、-(-NH-CHR””-CO-) n-、-SO 2-O-、-SO-、-SO 2-NH-、-S-S-、-CH＝CH-、-C≡C-、卤原子、氰基、硝基、邻硝基苯基、苯甲酰甲基、磷酸酯基中至少一种基团的基团，其中，n为1～100，优选为1～50，更优选为1～30，更优选为1～15，更优选为1～7；R””为H或α氨基酸的残基；所述“磷酸酯基”具有如上所述定义；
所述单糖单元为不能再被简单地水解为更小的糖分子的糖类单元；
所述二糖单元为两个单糖失水而成的糖类单元；
所述多糖单元为十个以上单糖失水而成的糖类单元；
可选地，所述C 1～C 8烷基为甲基、乙基、丙基、异丙基，所述C 1～C 8烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基，所述C 1～C 8酰基氧基为乙酰氧基、乙基、丙基、异丙基，所述C 1～C 8卤代烷基为三氟甲基、氯甲基、溴甲基；
可选地，R 7、R 8各自独立地选自：卤原子、C 1～C 30烷基、C 1～C 30烷氧基、能包含水溶性基团的改性烷基；
可选地，R 7、R 8为F，或一起构成-(CH 2CH 2O) n-，其中，n为1～10；
可选地，R 7、R 8为甲氧基、甲氧乙炔基；
可选地，式(II-III-i)中所含的各氢原子独立地被下式结构取代：
Figure PCTCN2018088987-appb-000026
可选地，式(II-III-i)中所含的各氢原子独立地被下式结构取代：
甲基、甲氧基、甲硫基、乙硫基
Figure PCTCN2018088987-appb-000027
Figure PCTCN2018088987-appb-000028
可选地，上述的荧光探针，其特征在于：
所述式(II-I)选自下式(II-I-1)～(II-I-6)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000029
可选地，所述式(II-I)选自下式(II-I-7)～(II-I-18)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000030
可选地，式(I)中含下式(I-c)结构，其选自式(II-I-19)～(II-I-30)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000031
Figure PCTCN2018088987-appb-000032
可选地，所述式(I-c)选自式(II-I-31)～(II-I-32)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000033
所述式(II-III)选自下式(II-III-1)～(II-III-25)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000034
Figure PCTCN2018088987-appb-000035
可选地，所述式(II-III)选自下式(II-III-26)～(II-III-30)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000036
可选地，所述式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)选自下式(II-IV-1)～(II-IV-41)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000037
Figure PCTCN2018088987-appb-000038
可选地，所述式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)选自下式(II-IV-42)～(II-IV-52)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000039
可选地，所述(II-V-a)、(II-V-b)、(II-V-c)、(II-V-d)、(II-V-e)或(II-V-f)选自下式(II-V-1)～(II-V-14)中的结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000040
Figure PCTCN2018088987-appb-000041
可选地，上述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针选自下式结构：
Figure PCTCN2018088987-appb-000042
Figure PCTCN2018088987-appb-000043
Figure PCTCN2018088987-appb-000044
Figure PCTCN2018088987-appb-000045
Figure PCTCN2018088987-appb-000046
Figure PCTCN2018088987-appb-000047
Figure PCTCN2018088987-appb-000048
Figure PCTCN2018088987-appb-000049
Figure PCTCN2018088987-appb-000050
Figure PCTCN2018088987-appb-000051
Figure PCTCN2018088987-appb-000052
本发明还提供制备上述的荧光探针的方法，其特征在于，包括式(III)所示荧光染料与配体以及任选的连接体发生反应的步骤：
Figure PCTCN2018088987-appb-000053
其中，Y反应后能够与连接体基团或配体键合；可选地，Y选自羧酸基、酰氯基、活性酯、磺酸基、磺酰氯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、膦酸基。
本发明还提供一种荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述的荧光探针与靶蛋白接触，所述荧光探针的配体部分与靶蛋白发生标记反应，将荧光探针标记到靶蛋白上；可选地，所述将荧光探针标记到靶蛋白上为共价标记；
可选地，所述标记反应的反应介质选自纯蛋白溶液、细胞裂解液或靶蛋白所处在的原位介质；可选地，所述原位介质为细胞内介质、细胞器内介质、活体组织介质、血液或体液。
本发明还提供上述的荧光探针在蛋白荧光标记，蛋白的定量、检测、动力学、活性研究，以及细胞、组织、活体影像中的用途。可选地，所述蛋白包括eDHFR-I50C、eDHFR-N18C、eDHFR-N23C、eDHFR-L28C、6his-cys、cys-6his-、6his-aa-cys-、cys-1aa-6his-、6his-2aa-cys-、cys-2aa-6his-、6his-3aa-cys-、cys-3aa-6his-、6his-4aa-cys-、cys-4aa-6his-、6his-5aa-cys-。
本发明还提供一种探针试剂盒，其特征在于，包括上述的荧光探针。
可选地，所述探针试剂盒还包含生物相容性介质；可选地，所述生物相容性介质选自二甲基亚砜、缓冲剂、生理盐水中的至少一种；可选地，所述缓冲剂包括磷酸盐缓冲液。
本发明所述靶蛋白可通过现有基因工程技术制备而来，也可为来自天然蛋白。
本发明所述的具有加成激活型荧光染料是指具有荧光的荧光团与乙烯或其衍生物连接构成染料后荧光被淬灭，当乙烯或其衍生物的乙烯双键被加成后，荧光强度增强。可选地，所述的具有加成激活型荧光染料为：在25℃下，同等浓度和激发波长的条件下，染料最大荧光发射强度在加成后与加成前的荧光强度之比大于2，优选大于5，更优选大于10的有机染料分子。所述加成激活型染料的浓度的范围在1×10 -7M～1×10 -5M。
根据具体情况，本领域工作人员可根据需要选择对应的蛋白与配体、
本领域技术人员可利用具有相应配置的仪器设备对靶蛋白进行跟踪监测，根据需要，所用的仪器设备可包括能测试或显示荧光的设备与设施，如荧光光谱仪、荧光显微镜、共聚焦显微镜、酶标仪、 流式细胞仪和活体成像仪等设备。
根据需要，操作者可以选择不同种类或发射/激发波长的染料。
根据发明一方面的实施方式，荧光探针荧光发射波长范围广。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针可用于靶蛋白的特异性标记，荧光探针结合靶蛋白后荧光可以被激活，具有良好的荧光分子开关性质，而且荧光激活倍数高，荧光激活亮度高。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针可以实现特异性标记细胞内靶蛋白，并且实现荧光特异性点亮，同时，探针荧光不受细胞内环境如细胞内其他亲核试剂的影响。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针与靶蛋白的结合为共价结合。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针的荧光强度和靶蛋白浓度具有很好的线性关系，可用于目的蛋白的定量检测，可以测定活性蛋白的含量。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针可作为细胞亚细胞器标记的有力工具，例如对细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、细胞骨架、细胞内膜、溶酶体等的标记。
根据本发明另一方面的实施方式，荧光探针的荧光不受动物内环境的影响，可以应用于活体动物体内靶蛋白的特异性标记。
根据本发明的另一方面，荧光探针可以快速标记到天然蛋白上，可以用于肿瘤的快速检测，指导手术中的肿瘤切除。
根据本发明的另一方面，荧光探针可以对组织、活体等不适宜清洗的样本进行快速造影成像。
根据本发明的另一方面，荧光探针为标记靶蛋白时几乎不产生检测信号，不干扰对样本的检测，可以实现复杂样本的快速定量检测，还可以跟踪标记反应过程的动力学过程。
附图说明
图1为不同探针标记细胞荧光图谱，其中，(1)～(12)分别为探针2、探针11、探针58、探针85、探针93、探针115、探针135、探针142、探针159、探针176、探针189、探针200的细胞标记结果图，左边为暗场荧光图，右边为明场图。A组是过表达相应蛋白标签的Hela细胞，B组是Hela-WT细胞(Hela原始细胞，未表达相应靶蛋白)；
图2为不同探针与相应蛋白标签反应后的SDS-PAGE图，其中(1)～(12)分别为探针2、探针11、探针58、探针85、探针93、探针115、探针135、探针142、探针159、探针176、探针189、探针200与相应结合后的SDS-PAGE图；左边为考马斯亮蓝染色图，右边为荧光成像图。
图3～图11分别为探针2、探针4、探针53、探针55、探针84、探针90、探针115、探针129、探针141的荧光强度对相应蛋白标签浓度做的标准曲线；
图12为探针197的荧光强度与探针浓度的探针标准曲线；
图13为不同探针标记不同的细胞器的荧光图谱，其中，A组～C组分别为探针2、探针11、探针48，(1)～(7)分别为细胞核、溶酶体、线粒体、高尔基体、细胞骨架、内质网和细胞内膜；
图14为探针143用于细胞内内源性蛋白的标记实验结果荧光图谱，其中，A为空白组，B为过表达BTK蛋白(内源性蛋白)组；
图15为探针27用于活体小鼠的标记的实验结果荧光图谱，其中A为空白组肝脏，B为样品组肝脏，C为对照组肝脏；
图16为探针2用于活体斑马鱼的标记的实验结果荧光图谱，其中16(1)组为探针荧光通道，16(2)组为mKate荧光通道，16A为注射探针组，16B为未注射探针组；
图17为探针140用于活体小鼠的内源性蛋白的标记的实验结果荧光图谱，图17A为注射探针前成 像结果，图17B为注射探针3小时后成像结果；
图18为反映探针2与eDHFR不同突变体的反应动力学的荧光强度随时间的变化曲线，其中I50C、N18C、N23C、L28C为eDHFR的突变体，WT为不含巯基的野生型eDHFR，buffer为探针2的磷酸盐缓冲溶液；
图19为反映探针90与his-tag不同突变体的反应动力学的荧光强度随时间的变化曲线。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于对本发明进行示例性说明，并不用于限制本发明。
本发明中“探针”为“荧光探针”的简写。
实施例1
Figure PCTCN2018088987-appb-000054
化合物2：
化合物1(0.39g，2mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入无水甲醇60ml溶解，加入丙二酸(0.25g，2.4mmol)，催化量氯化锌，Ar保护条件下油浴加热回流过夜，次日过滤，旋转蒸发除去部分溶剂，体系放入冰箱中冷却结晶，过滤，冷乙醇冲洗三次得黄色晶体0.28g，产率61％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.96(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)7.49(d，1H，J＝7.2Hz)，6.69(d，1H，J＝7.2Hz)，6.52(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.44(s，1H)。
探针1：
化合物2(0.23g，1mmol)于25ml梨形瓶中，加入化合物3(参照公开文献C.R.Jing,V.C.Cornish.ACS Chem.Biol.,2013,8,1704—1712.)(0.40g，1.2mmol)，六氟磷酸苯丙三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.63g，1.2mmol)，三乙胺(0.15g，1.5mmol)，加入10ml无水二甲基甲酰胺，Ar保护条件下室温搅拌1h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离，得淡黄色晶体0.47g，产率86％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.96(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)7.49(d，1H，J＝7.2Hz)，7.28(s，1H)，6.69(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(s，2H)，6.52(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.44(s，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例2：
Figure PCTCN2018088987-appb-000055
化合物5：
化合物4(参照文献公开方法：X.P.Zhang.et al.ACS Macro Lett.2016,5,229—233.)(0.49g，2mmol)按照化合物2的方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.96(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s， 1H)，6.44(s，1H)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
探针2：
参照探针1的合成方法，产率92％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.96(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.28(s，1H)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(s，2H)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例3：
Figure PCTCN2018088987-appb-000056
化合物7：
化合物6(参照文献公开的方法：WO 2006023821(A2))(0.53g，2mmol)按照化合物2的合成方法，产率66％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.10(s，1H)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，1.96(m，4H)。
探针3：
按照探针1的合成方法，产率88％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，7.28(s，1H)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，6.64(s，2H)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，2.08(m，2H)，1.96(m，4H)。
实施例4：
Figure PCTCN2018088987-appb-000057
化合物9：
化合物8(X.J Pei.et al.Analyst.2014，139，5290—5296.)(2.46g，10mmol)于250ml圆底烧瓶中，加乙醇125ml溶解，加入乙酰丙酮锰(4.23g，12mmol)，加入30％双氧水50ml，油浴加热回流，反应完毕，过滤，体系倒入1000ml冷水中，过滤，滤饼真空烘干，柱色谱分离得红褐色晶体0.71g，产率31％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.46(s，1H)，9.99(s，1H)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，6.30(s，1H)。
化合物10：
参照化合物2的合成方法，产率59％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.96(s，1H)，11.81(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)， 6.30(s，1H)。
探针4：
参照探针1的合成方法，产率93％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.96(s，1H)，11.81(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(s，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例5：
Figure PCTCN2018088987-appb-000058
化合物12：
化合物11(参照文献公开方法：WO 200623821(A2))(0.73g，2.0mmol)和5-醛基苯硼酸(0.37g，2.4mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入10ml甲苯，10ml乙醇，2M K 2CO 3溶液2ml，反复换气三次，加入四三苯基膦钯(0.12g，0.1mmol)油浴回流6h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物溶于100ml二氯甲烷中，分别用水、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得红褐色产物0.51g，产率79％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝9.96(s，1H)，7.51(d，2H，J＝8.0Hz)，7.43(d，2H，J＝8.0Hz)，7.22(d，1H，J＝9.0Hz)，6.56(d，1H，J＝2.5Hz)，6.51(dd，1H，J＝2.5 9.0Hz)，5.98(s，1H)，3.41(q，4H，J＝7.0Hz)，1.20(t，6H，J＝7.0Hz)。
化合物13：
参照化合物2的合成方法，产率71％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.10(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.52(d，2H，J＝8.0Hz)，7.45(d，2H，J＝8.0Hz)，7.29(d，1H，J＝9.0Hz)，6.59(d，1H，J＝2.5Hz)，6.54(dd，1H，J＝2.5 9.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(s，1H)，3.43(q，4H，J＝7.0Hz)，1.20(t，6H，J＝7.0Hz)。
探针5：
参照探针1的合成方法，产率91％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.10(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.52(d，2H，J＝8.0Hz)，7.45(d，2H，J＝8.0Hz)，7.29(d，1H，J＝9.0Hz)，7.26(s，1H)，6.64(s，2H)，6.59(d，1H，J＝2.5Hz)，6.54(dd，1H，J＝2.5 9.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(s，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.43(q，4H，J＝7.0Hz)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.20(t，6H，J＝7.0Hz)。
实施例6：
Figure PCTCN2018088987-appb-000059
化合物15：
化合物14(参照文献公开方法：W.H.Wu.et al.Chemistry-A European Journal,2012,18,4953—4964.) 按照化合物2的合成方法，产率75％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝12.03(s，1H)，7.92(m，4H)，7.85(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(s，1H)，7.36(d，1H，J＝9.0Hz)，6.63(d，1H，J＝8.5Hz)，6.54(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，3.47(m，4H)，1.24(t，6H，J＝7.0Hz)。
探针6：
参照探针1的合成方法，产率96％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.92(m，4H)，7.85(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(s，1H)，7.36(d，1H，J＝9.0Hz)，7.28(s，1H)，6.67(s，2H)，6.63(d，1H，J＝8.5Hz)，6.54(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.47(m，4H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.24(t，6H，J＝7.0Hz)。
实施例7：
Figure PCTCN2018088987-appb-000060
化合物17：
化合物16(L.Han.et al.Youji Huaxue,2013,33,1000-1004.)按照15的合成方法，产率67％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝11.83(s，1H)，8.67(d，1H，J＝16.0Hz)，8.43(s，1H)，7.98(d，1H，J＝4.4Hz)，7.86(d，1H，J＝4.4Hz)，7.57(d，1H，J＝9.0Hz)，6.83(dd，1H，J＝2.4 9.0Hz)，6.78(d，1H，16.0Hz)，6.65(d，1H，J＝2.4Hz)，3.50(q，4H，J＝7.2Hz)，1.16(t，6H，J＝7.2Hz)。
探针7：
按照探针1的合成方法，产率91％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.67(d，1H，J＝16.0Hz)，8.43(s，1H)，7.98(d，1H，J＝4.4Hz)，7.86(d，1H，J＝4.4Hz)，7.57(d，1H，J＝9.0Hz)，7.29(s，1H)，6.83(dd，1H，J＝2.4 9.0Hz)，6.78(d，1H，16.0Hz)，6.65(d，1H，J＝2.4Hz)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.50(q，4H，J＝7.2Hz)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.16(t，6H，J＝7.2Hz)。
实施例8：
Figure PCTCN2018088987-appb-000061
化合物19：
化合物18(按照文献公开的合成方法：M.Y.Wu.et al.Analyst,2013,138,3018—3025.)按照化合物2的合成方法，产率45％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝11.83(s，1H)，8.41(s，1H)，8.39(d，1H，J＝11.6Hz)，7.69—7.62(m，2H)，7.52(d，1H，J＝14.4Hz)，6.88(dd，1H，J＝2.4 9.2Hz)，6.69(d，1H，J＝2.4Hz)，3.58(q，4H，J＝7.2Hz)，1.22(t，6H，J＝7.2Hz)。
探针8：
参照探针1的合成，产率88％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.41(s，1H)，8.39(d，1H， J＝11.6Hz)，7.69—7.62(m，2H)，7.52(d，1H，J＝14.4Hz)，7.28(s，1H)，6.88(dd，1H，J＝2.4 9.2Hz)，6.69(d，1H，J＝2.4Hz)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.58(q，4H，J＝7.2Hz)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.22(t，6H，J＝7.2Hz)。
实施例9：
Figure PCTCN2018088987-appb-000062
化合物21：
化合物20(Poronik,Ye.M.et al.Dyes and Pigments,2006,72,199—207.)(0.42g，2.0mmol)和丙二酸环(亚)异丙酯(0.35g，2.4mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入65ml无水乙醇溶解，加催化量的无水氯化锌，Ar保护条件下油浴加热回流过夜，反应完毕，缓慢降温，冷却结晶，过滤，冰乙醇洗三次得黄色针状晶体0.46g，产率83％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.54(d，1H，J＝2.2Hz)，6.65(d，1H，J＝9.2Hz)，6.51(d，1H，J＝2.6Hz)，3.44(q，4H，J＝7.2H)，2.55(s，3H)，1.23(t，6H，J＝7.2Hz)。
化合物22：
化合物21(0.55g，2.0mmol)和多聚甲醛(0.60g，20.0mmol)与100ml圆底烧瓶中，加入65ml无水乙醇，加入催化量无水氯化锌，Ar保护条件下油浴加热回流，反应完毕，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离，橘黄色产物0.18g，产率32％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.54(d，1H，J＝2.2Hz)，6.65(d，1H，J＝9.2Hz)，6.59(m，1H)，6.51(d，1H，J＝2.6Hz)，5.61(m，1H)，5.18(m，1H)，3.44(q，4H，J＝7.2H)，1.23(t，6H，J＝7.2Hz)。
探针9：
按照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.54(d，1H，J＝2.2Hz)，7.28(s，1H)，6.69(s，2H)，6.65(d，1H，J＝9.2Hz)，6.59(m，1H)，6.51(d，1H，J＝2.6Hz)，5.61(m，1H)，5.18(m，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.44(q，4H，J＝7.2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.23(t，6H，J＝7.2Hz)。
实施例10：
Figure PCTCN2018088987-appb-000063
化合物24：
化合物23(按照文献公开方法：Cuerten,Beate.et al.Photochemistry and Photobiology,2005,81,641—648.)(0.57g，3.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入70ml无水丙酮，加入催化量碘，Ar保护条件下油浴加热回流，反应完毕，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得红褐色产物0.37g，产率45％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.54(d，1H，J＝2.2Hz)，6.84(s，1H)，6.56(s，1H)，3.98(s，2H)，1.97(d，3H，J＝1.6Hz)，1.25(s，6H)。
化合物25：
化合物24(0.27g，1mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷65ml溶解，加入过量二氧化锰，Ar保护条件下室温搅拌过夜，反应完毕，过量，旋干滤液得固体，固体溶解于50ml无水乙醇中，加入丙二酸(0.13g，12mmol)，催化量氯化锌，Ar保护条件下油浴加热回流过夜，次日过滤，旋转蒸去部分溶剂，体系放入冰箱中冷却结晶，过滤，冷乙醇冲洗三次得黄色晶体0.20g，产率65％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.37(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.54(d，1H，J＝2.2Hz)，6.84(s，1H)，6.56(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，3.98(s，2H)，1.97(d，3H，J＝1.6Hz)，1.25(s，6H)。
探针10：
按照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.37(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.54(d，1H，J＝2.2Hz)，δ＝7.28(s，1H)，6.84(s，1H)，6.64(s，2H)，6.56(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.98(s，2H)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.97(d，3H，J＝1.6Hz)，1.25(s，6H)。
实施例11：
Figure PCTCN2018088987-appb-000064
化合物27：
化合物27(按照文献公开方法：WO 2014025435(A2))按照化合物2的合成方法，得红褐色针状晶体，产率33％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，2.65(s，6H)。
探针11：
按照探针1的合成方法，产率78％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.65(s，6H)，2.08(m，2H)。
实施例12：
Figure PCTCN2018088987-appb-000065
化合物29：
化合物28(按照文献公开的方法合成：WO 2014025435(A2))(0.58g，2.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加无水甲苯70ml溶解，加入苯甲醛(0.21g，2.0mmol)和催化量的无水氯化锌，Ar保护条件下油浴加热回流过夜，次日体系冷却至室温，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物溶于100ml二氯甲烷 中，分别用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得产物0.22g，产率31％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.06(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，3.40(s，2H)，2.23(s，3H)，1.9(s，3H)。
化合物30：
化合物29(0.19g，0.5mmol)于50ml茄型瓶中，加入30ml甲醇溶解，加入氢氧化锂(24mg，1mmol)，水6ml，Ar保护条件下室温搅拌，TLC板检测反应，反应完毕，体系倒入100ml二氯甲烷中，稀盐酸调pH至中性，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得产物0.14g，产率83％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.06(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，3.49(s，2H)，2.23(s，3H)。
化合物31：
参照化合物25的合成方法，产物经柱色谱分离得纯品，产率69％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.06(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，2.23(s，3H)。
探针12：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.28(s，1H)，7.06(s，1H)，6.64(s，2H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.23(s，3H)，2.08(m，2H)。
实施例13：
Figure PCTCN2018088987-appb-000066
化合物32：
化合物28(0.58g，2.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加无水甲苯70ml溶解，加入苯甲醛(0.63g，6.0mmol)和催化量的无水氯化锌，Ar保护条件下油浴加热回流过夜，次日体系冷却至室温，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物溶于100ml二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得产物0.82g，产率83％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.17(d，2H，J＝7.8Hz)，7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，3.40(s，2H)，2.23(s，3H)，1.9(s，3H)。
化合物33：
参照化合物30的合成方法，产率67％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.19(d，2H，J＝7.8Hz)，7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，3.70(s，2H)，2.23(s，3H)。
化合物34：
参照化合物31的合成方法，产率70％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.19(d，2H，J＝7.8Hz)， 7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，6.51(d，1H，J＝16.0Hz)，3.70(s，2H)，2.23(s，3H)。
探针13：
参照探针1的合成方法，产率88％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.19(d，2H，J＝7.8Hz)，7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.28(s，1H)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(s，2H)，6.51(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.77(s，2H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.23(s，3H)2.08(m，2H)。
实施例14：
Figure PCTCN2018088987-appb-000067
化合物35：
参照化合物29的合成方法，产率45％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.32(d，1H，J＝16.4Hz)，7.54(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.65(s，2H)，2.65(s，3H)，2.01(s，3H)。
化合物36：
参照化合物30的合成方法，产率83％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.75(s，2H)，2.60(s，3H)。
化合物37：
参照化合物25的合成方法，产率56％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.75(s，2H)，2.60(s，3H)。
探针14：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.35(s，1H)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.64(s，2H)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.75(s，2H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.60(s，3H)2.08(m，2H)。
实施例15：
Figure PCTCN2018088987-appb-000068
化合物38：
参照化合物32的合成，产率78％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.32(d，2H，J＝16.4Hz)，7.56(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，2H，J＝16.4Hz)，7.40(d，2H，J＝4.8)，7.29(d，2H，J＝4.8Hz)，7.09(d，2H，J＝4.4Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.63(s，2H)，2.01(s，3H)。
化合物39：
参照化合物33的合成，产率88％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.32(d，2H，J＝16.4Hz)，7.56(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，2H，J＝16.4Hz)，7.40(d，2H，J＝4.8)，7.29(d，2H，J＝4.8Hz)，7.09(d，2H，J＝4.4Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.73(s，2H)。
化合物40：
参照化合物25的合成，产率65％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.32(d，2H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，2H，J＝16.4Hz)，7.40(d，2H，J＝4.8)，7.29(d，2H，J＝4.8Hz)，7.09(d，2H，J＝4.4Hz)，6.49(s，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.73(s，2H)。
探针15：
参照探针1的合成，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.32(d，2H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，2H，J＝16.4Hz)，7.40(d，2H，J＝4.8)，7.29(d，2H，J＝4.8Hz)，7.25(s，1H)，7.09(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(s，2H)，6.49(s，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.73(s，2H)3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例16：
Figure PCTCN2018088987-appb-000069
化合物41：
参照化合物32的合成，产率78％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，4.06(s，3H)，3.40(s，2H)，2.23(s，3H)，1.9(s，3H)。
化合物42：
参照化合物33的合成，产率88％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，4.06(s，3H)，3.60(s，2H)，2.23(s，3H)。
化合物43：
参照化合物25的合成，产率65％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，4.06(s，3H)，2.23(s，3H)。
探针16：
参照探针1的合成，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.28(s，1H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.64(s，2H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，4.06(s，3H)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.23(s，3H)，2.08(m，2H)。
实施例17:
Figure PCTCN2018088987-appb-000070
化合物44：
参照化合物32的合成，产率78％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，3.40(s，2H)，2.96(s，6H)，2.23(s，3H)，1.9(s，3H)。
化合物45：
参照化合物33的合成，产率88％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，3.71(s，2H)，2.96(s，6H)，2.23(s，3H)，1.9(s，3H)。
化合物46：
参照化合物25的合成，产率65％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.52(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，2.96(s，6H)，2.23(s，3H)。
探针17：
参照探针1的合成，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.28(s，1H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.64(s，2H)，6.52(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.96(s，6H)，2.23(s，3H)，2.08(m，2H)。
实施例18：
Figure PCTCN2018088987-appb-000071
化合物47：
参照化合物32的合成方法，产率83％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，3.40(s，2H)，2.91(s，6H)，2.23(s，3H)，1.9(s，3H)。
化合物48：
参照化合物30的合成方法，产率67％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，3.90(s，2H)，2.91(s，6H)，2.23(s，3H)。
化合物49：
参照化合物31的合成方法，产率70％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，3.90(s，2H)，2.91(s，6H)，2.23(s，3H)。
探针18：
参照探针1的合成方法，产率88％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.28(s，1H)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.90(s，2H)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.91(s，6H)，2.23(s，3H)，2.08(m，2H)。
实施例19：
Figure PCTCN2018088987-appb-000072
化合物50：
参照化合物32的合成，产率71％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.32(d，1H，J＝16.4Hz)，7.54(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，1H，J＝16.4Hz)，7.45(d，1H，J＝4.8)，7.20(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.65(s，2H)，2.65(s，3H)，2.01(s，3H)。
化合物51：
参照化合物33的合成，产率84％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.32(d，1H，J＝16.4Hz)，7.54(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，1H，J＝16.4Hz)，7.45(d，1H，J＝4.8)，7.20(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.95(s，2H)，2.65(s，3H)。
化合物52：
参照化合物25的合成，产率69％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.32(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.54(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，1H，J＝16.4Hz)，7.45(d，1H，J＝4.8)，7.20(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.53(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，2.65(s，3H)。
探针19：
参照探针1的合成，产率79％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.32(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.54(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，1H，J＝16.4Hz)，7.45(d，1H，J＝4.8)，7.28(s，1H)，7.20(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.64(s，2H)，6.53(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.65(s，3H)，2.08(m，2H)。
实施例20：
Figure PCTCN2018088987-appb-000073
化合物53：
2-苯基吡咯(0.3g，2.1mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入35ml干燥二氯甲烷溶解，加入乙酰氧基乙酰氯(0.14ml，1.3mmol)，Ar保护条件下40℃油浴加热，2h后冷却至室温，加入DIEA(0.73ml，4.2mmol)搅拌15分钟，加入三氟化硼乙醚溶液(0.53ml，4.2mmol)，体系室温条件下搅拌30分钟，倒入10ml水淬灭反应，饱和食盐水洗涤有机相，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离，得红褐色晶体0.44g，产率49％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，5.22(s，2H)，2.09(s，3H)。
化合物54：
参照化合物33的合成，产率84％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，5.52(s，2H)。
化合物55：
参照化合物25的合成，产率69％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)。
探针20：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.28(s，1H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(s，2H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例21：
Figure PCTCN2018088987-appb-000074
化合物56：
参照化合物53的合成方法，产率49％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，5.31(s，2H)，3.86(s，6H)，2.01(s，3H)。
化合物57：
参照化合物33的合成，产率84％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，5.46(s，2H)，3.86(s，6H)。
化合物58：
参照化合物25的合成，产率69％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，3.86(s，6H)。
探针21：
参照探针1的合成，产率87％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.64(s，2H)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.81(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例22：
Figure PCTCN2018088987-appb-000075
化合物59：
参照化合物54的合成方法，产率49％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，5.20(s，2H)，2.01(s，3H)。
化合物60：
参照化合物33的合成，产率84％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，5.37(s，2H)。
化合物61：
参照化合物25的合成，产率69％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)， 7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)。
探针22：
参照探针1的合成方法，产率91％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.28(s，1H)，7.15(dd，2H，J＝3.65.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.54(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例23：
Figure PCTCN2018088987-appb-000076
化合物62：
参照化合物54的合成方法，产率49％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，2H，J＝7.8Hz)，7.44(m，4H)，7.03(d，2H，J＝7.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.21(s，2H)，2.03(s，3H)。
化合物63：
参照化合物33的合成，产率84％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，2H，J＝7.8Hz)，7.44(m，4H)，7.03(d，2H，J＝7.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.25(s，2H)。
化合物64：
参照化合物25的合成，产率69％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，2H，J＝7.8Hz)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.44(m，4H)，7.03(d，2H，J＝7.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)。
探针23：
参照探针1的合成方法，产率87％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，2H，J＝7.8Hz)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.44(m，4H)，7.03(d，2H，J＝7.2Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例24：
Figure PCTCN2018088987-appb-000077
化合物65：
参照化合物54的合成方法，产率49％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝6.83(d，2H，J＝5.6Hz)，6.71(d，2H，J＝5.6H)，6.40(s，2H)，5.20(s，2H)，2.02(s，3H)。
化合物66：
参照化合物33的合成，产率84％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝6.83(d，2H，J＝5.6Hz)， 6.71(d，2H，J＝5.6H)，6.40(s，2H)，5.31(s，2H)。
化合物67：
参照化合物25的合成，产率69％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，6.83(d，2H，J＝5.6Hz)，6.71(d，2H，J＝5.6H)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(s，2H)。
探针24：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，6.83(d，2H，J＝5.6Hz)，6.71(d，2H，J＝5.6H)，6.64(s，2H)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例25：
Figure PCTCN2018088987-appb-000078
化合物68：
化合物28(0.292g，1.0mmol)于50ml圆底烧瓶，加入无水二氯甲烷30ml溶解，Ar保护条件下加入三氟甲基磺酸三甲基硅脂(0.266g，1.2mmol)室温搅拌5分钟，加入甲醇1ml，室温搅拌2小时，反应完毕，加水1ml淬灭反应，分出有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得产物0.17g，产率65％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.22(s，2H)，3.69(s，3H)，2.62(s，6H)，2.09(s，3H)。
化合物69：
参照化合物33的合成方法，产率65％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.42(s，2H)，3.69(s，3H)，2.62(s，6H)。
化合物70：
参照化合物25的合成方法，产率55％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.83(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，3.69(s，3H)，2.62(s，6H)。
探针25：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.83(d，1H，J＝16.0Hz)，6.64(s，2H)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.69(s，3H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.62(s，6H)，2.08(m，2H)。
实施例26：
Figure PCTCN2018088987-appb-000079
化合物71：
参照化合物54的合成方法，产率45％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.22(s，2H)，2.09(s，3H)。
化合物72：
化合物70(0.332g，1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入三乙胺(0.244g，2.4mmol)，巯基乙醇(0.248g，4.0mmol)，加入50ml无水二氯甲烷溶解，Ar保护条件下室温搅拌，反应完毕，体系倒入100ml水中，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得产物0.31g，产率81％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.22(s，2H)，2.90(q，4H，J＝5.6Hz)，2.09(s，3H)，1.21(t，6H，J＝5.6Hz)。
化合物73：
参照化合物33的合成方法，产率79％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.42(s，2H)，2.90(q，4H，J＝5.6Hz)，1.21(t，6H，J＝5.6Hz)。
化合物74：
参照化合物25的合成方法，产率64％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.71(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，2.90(q，4H，J＝5.6Hz)，1.21(t，6H，J＝5.6Hz)。
探针26：
参照探针1的合成方法，产率92％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.71(d，1H，J＝16.0Hz)，6.64(s，2H)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.90(q，4H，J＝5.6Hz)，2.08(m，2H)，1.21(t，6H，J＝5.6Hz)。
实施例27：
Figure PCTCN2018088987-appb-000080
化合物75：
化合物70(0.332g，1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入三乙胺(0.244g，2.4mmol)，甲醇1ml，加入50ml无水二氯甲烷溶解，Ar保护条件下室温搅拌，反应完毕，体系倒入100ml水中，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离得产物0.31g，产率81％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.22(s，2H)，3.90(s，6H)，2.09(s，3H)。
化合物76：
参照化合物33的合成方法，产率78％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.42(s，2H)，3.90(s，6H)。
化合物77：
参照化合物25的合成方法，产率56％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.83(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.42(s，2H)，3.90(s，6H)。
探针27：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.83(d，1H，J＝16.0Hz)，6.64(s，2H)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.42(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.90(s，6H)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例28：
Figure PCTCN2018088987-appb-000081
化合物78：
化合物71(0.464g，1.4mmol)于100ml圆底烧瓶，加入苯乙炔(0.8ml，7.1mmol)，1.6M正丁基锂(4.5ml，7.1mmol)，溴化锌(1.6g，7.1mmol)，二氯二四三苯基膦钯(0.1g，0.14mmol)，加无水甲苯75ml，Ar保护条件下，室温搅拌，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离的产物0.42g，产率65％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，5.22(s，2H)，2.09(s，3H)。
化合物79：
参照化合物33的合成，产率78％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，5.52(s，2H)。
化合物80：
参照化合物25的合成，产率56％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)。
探针28：
参照探针1的合成，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.28(s，1H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(s，2H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例29：
Figure PCTCN2018088987-appb-000082
化合物81：
4’-甲氧基-2-苯基吡咯(0.35g，2.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入干燥二氯甲烷60ml溶解，冷却至-30℃，加入乙酰氧基乙酰氯(0.22ml，2mmol)，Ar保护条件下缓慢升至室温，反应完毕，加入1ml水淬灭反应，体系倒入50ml水中，分出有机相，30ml二氯甲烷萃取水相，合并有机相，无水 硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离地产物0.355g，产率65％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，5.22(s，2H)，2.02(s，3H)。
化合物82：
化合物81(0.273g，1.0mmol)于100ml三口瓶中，加入50ml二氯甲烷，Ar保护条件下加入2-甲基吡咯，然后注入0.2ml三氯氧磷，室温搅拌6小时，冰浴条件下注入1ml二异丙基乙胺，搅拌30分钟，加入2ml三氟化硼乙醚溶液，室温搅拌30分钟，加水5ml淬灭反应，体系倒入50ml水中，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得产物0.15g，产率39％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，5.22(s，2H)，2.65(s，3H)，2.02(s，3H)。
化合物83：
参照化合物33的合成方法，产率79％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，5.52(s，2H)，2.65(s，3H)。
化合物84：
参照化合物25的合成方法，产率56％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，5.52(s，2H)，2.65(s，3H)。
探针29：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.65(s，3H)，2.08(m，2H)。
实施例30：
Figure PCTCN2018088987-appb-000083
化合物85：
参照化合物29的合成方法，产率78％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.21(m，2H)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.99(d，1H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.81(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.41(d，1H，J＝7.2Hz)，5.22(s，2H)，2.65(s，3H)，2.02(s，3H)。
化合物86：
参照化合物33的合成方法，产率78％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.21(m，2H)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.99(d，1H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79 (d，1H，J＝7.2Hz)，6.81(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.41(d，1H，J＝7.2Hz)，5.42(s，2H)。
化合物87：
参照探针35的合成方法，产率56％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.21(m，2H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.99(d，1H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.81(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.59(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(d，1H，J＝7.2Hz)，5.42(s，2H)。
探针30：
参照探针1的合成方法，产率61％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.21(m，2H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.28(s，1H)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.99(d，1H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.81(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.69(s，2H)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.59(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(d，1H，J＝7.2Hz)，5.42(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例31：
Figure PCTCN2018088987-appb-000084
化合物89：
化合物88(Qing Miao et al.,Chem Commun.2009,2541—2543.)按照化合物2的合成方法，产率61％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.95(d，2H，J＝8.2Hz)，7.68(d，2H，J＝8.2Hz)，6.70(d，2H，J＝4.0Hz)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.33(d，2H，J＝4.0Hz)，2.64(s，6H)。
探针31：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.95(d，2H，J＝8.2Hz)，7.68(d，2H，J＝8.2Hz)，6.70(d，2H，J＝4.0Hz)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.33(d，2H，J＝4.0Hz)，2.64(s，6H)。
实施例32:
Figure PCTCN2018088987-appb-000085
化合物90：
参照化合物80的方法，产率16％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.31(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.53(d，2H，J＝16.4Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，3.69(s，3H)。
化合物91：
参照化合物82的合成方法，产率35％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.31(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.53(d，2H，J＝16.4Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.75(d，1H，J＝4.8Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.51(d，1H，J＝4.8Hz)，3.69(s，3H)，2.62(t，2H，J＝1.8Hz)，2.0(t，2H，J＝1.8Hz)。
探针32：
参照探针1的合成方法，产率91％。 1H-NMR(400MHz，CDCl 3)：δ＝8.31(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.53(d，2H，J＝16.4Hz)，7.28(s，1H)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.75(d，1H，J＝4.8Hz)，6.69(s，2H)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.51(d，1H，J＝4.8Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.69(s，3H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.62(t，2H，J＝1.8Hz)，2.18(m，2H)，2.0(t，2H，J＝1.8Hz)。
实施例33：
Figure PCTCN2018088987-appb-000086
化合物92：
间苯二酚(11.0g，0.1mol)于100ml圆底烧瓶中，加入顺丁烯二酸酐(4.9g，0.05mol)，小心加入50ml浓硫酸，氩气保护条件下150℃油浴加热6h，反应完毕，冷却至室温，加入200g碎冰中，过滤，滤饼用冰乙醇洗涤两次，干燥，乙醇重结:得产物16.07g，产率57％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)。
探针33：
参照探针1的合成方法，产率88％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.2(s,1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例34：
Figure PCTCN2018088987-appb-000087
化合物94：
化合物93(按照文献公开方法：M.P.Angela et al.Chem.Eur.J.2014,20,447—455.)(0.467g，1mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃30ml，Ar保护条件下加入1M乙烯基氯化镁(1.5ml，1.5mmol)，室温搅拌3h，反应完毕，加水1ml淬灭反应，用6M盐酸调为pH＝3.0，室温搅拌3h，旋转蒸干溶剂，残余物过柱的产物0.23g，产率98％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.28(d，2H，J＝9.4Hz)，7.56(d，1H，J＝9.4Hz)，7.39(dd，2H，J＝9.2 2.2Hz)，7.37(d，2H，J＝2.2Hz)，6.0(s，1H)，5.38(s，1H)。
化合物95：
化合物94(0.24g，1.0mmol)溶于50ml水中，加入氢氧化钠(0.08g，2.0mmol)溶解，加入溴乙酸(0.21g，1.5mmol)，Ar保护条件下室温搅拌2h，反应完毕用3M的稀盐酸调为酸性，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离的产物0.23g，产率78％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.28(d，2H，J＝9.4Hz)，7.56(d，1H，J＝9.4Hz)，7.39(dd，2H，J＝9.2 2.2Hz)，7.37(d，2H，J＝2.2Hz)，6.0(s，1H)，5.38(s，1H)4.81(s，2H)。
探针34：
参照探针1的合成方法，产率93％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.28(d，2H，J＝9.4Hz)，7.56(d，1H，J＝9.4Hz)，7.39(dd，2H，J＝9.2 2.2Hz)，7.31(d，2H，J＝2.2Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，6.0(s，1H)，5.38(s，1H)4.81(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例35：
Figure PCTCN2018088987-appb-000088
化合物97：
化合物96(参照文献公开方法：Pant Umesh C et al.Indian Journal of Chemistry,Section B.1987,26,947—950.)(2.08g，10.0mmol)于250ml圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基间氨基酚(2.74g，20.0mmol)小心加入50ml 85％硫酸，氩气保护条件下120℃油浴加热2h，反应完毕，冷却至室温，加入200g碎冰中，过滤，滤饼用冰乙醇洗涤两次，干燥，固体经柱色谱分离得产物3.71g，产率12％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.61(d，2H，J＝9.6Hz)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，6.51(s，1H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，6.38(s，1H)，3.45(s，6H)。
探针35：
参照探针1的合成方法，产率89％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.61(d，2H，J＝9.6Hz)，7.28(s，1H)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，6.64(s，2H)，6.51(s，1H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，6.38(s，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.45(s，6H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例36：
Figure PCTCN2018088987-appb-000089
化合物98：
参照化合物95的合成方法，产率9％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.61(d，2H，J＝9.6Hz)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，6.51(s，1H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，6.38(s，1H)，3.32(bs，4H)，2.35(bs，4H)，1.73(bs，4H)。
探针36：
参照探针1的合成方法，产率94％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.61(d，2H，J＝9.6Hz)，7.28(s，1H)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，6.64(s，2H)，6.51(s，1H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，6.38(s，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.32(bs，4H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.35(bs，4H)，2.08(m，2H)，1.73(bs，4H)。
实施例37：
Figure PCTCN2018088987-appb-000090
化合物99：
参照化合物98的合成方法，产率7％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.61(d，2H，J＝9.6Hz)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，6.51(s，1H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，6.38(s，1H)，3.45(s，3H)，1.12(s，6H)。
探针37：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.61(d，2H，J＝9.6Hz)，7.28(s，1H)，6.69(d，2H，J＝9.6Hz)，6.64(s，2H)，6.51(s，1H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，6.38(s，1H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.45(s，3H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.12(s，6H)。
实施例38：
Figure PCTCN2018088987-appb-000091
化合物100：
N，N-二甲基间氨基酚(13.7g，0.1mol)于100ml圆底烧瓶中，加入顺丁烯二酸酐(4.9g，0.05mol)，小心加入50ml浓硫酸，氩气保护条件下150℃油浴加热6h，反应完毕，冷却至室温，加入200g碎冰中，过滤，滤饼用冰乙醇洗涤两次，干燥，乙醇重结晶，重结晶产品经氯离子交换色谱离子交换，浓缩得产物3.78g，产率20％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.2(s,1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，3.61(s，12H)。
探针38：
参照探针1的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.2(s,1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.61(s，12H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例39：
Figure PCTCN2018088987-appb-000092
化合物102：
参照化合物100的合成方法，残了21％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.10(s，2H)，6.56(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)。
探针39：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，7.10(s，2H)，6.56(s，2H)，6.64(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例40:
Figure PCTCN2018088987-appb-000093
化合物103：
参照化合物100的合成方法，产率17％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.10(s，2H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，3.32(bs，8H)，2.35(bs，8H)，1.73(bs，8H)。
探针40：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，7.10(s，2H)，6.64(s，2H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.32(bs，8H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.35(bs，8H)，2.08(m，2H)，1.73(bs，8H)。
实施例41：
Figure PCTCN2018088987-appb-000094
化合物104：
参照化合物99的合成方法，产率15％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)。
探针41：
参照探针1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.2(s,1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例42:
Figure PCTCN2018088987-appb-000095
化合物105：
参照化合物100的合成方法，产率17％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.10(s，2H)，6.56(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，3.19(s，6H)，3.19(s，6H)，2.65(s，6H)，1.23(s，16H)。
探针42：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.10(s，2H)，6.56(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，3.19(s，6H)，3.19(s，6H)，2.65(s，6H)，1.23(s，16H)。
实施例43：
Figure PCTCN2018088987-appb-000096
化合物106：
N’,N’-二甲基间氨基酚(1.37g，10.0mmol)与250ml原地烧瓶中，加入无水二氯甲烷130ml溶解，加入顺丁烯二酸酐(0.98g，10.0mmol)冷却至0℃，加入无水三氯化铝(1.33g，10.0mmol)缓慢恢复至室温，反应完毕，小心加入5ml水淬灭反应，过滤，有机相用饱和食盐水洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离的产品1.32g，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝13.25(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.63(d，1H，J＝9.3Hz)，6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，6.24(dd，1H，J＝2.4Hz)，6.11(d，1H，J＝2.4Hz)，2.9(s，6H)。
化合物107：
化合物106(2.35g，10.0mmol)加入N,N-二甲基间氨基酚(2.74g，20.0mmol)小心加入50ml 85％硫酸，氩气保护条件下120℃油浴加热2h，反应完毕，冷却至室温，加入200g碎冰中，过滤，滤饼用冰乙醇洗涤两次，干燥，固体经柱色谱分离得，旋转蒸干，经氯离子交换树脂交换，产物4.22g，产率11％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.95(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.33(d，2H，J＝9.3Hz)，7.03(d，2H，J＝9.3Hz)，6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，6.63(d，1H，J＝9.3Hz)，3.77(t，2H，J＝8.0Hz)，3.19(s，9H)，2.90(t，2H，J＝8.0Hz)。
探针43：
按照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.95(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.33(d，2H，J＝9.3Hz)，7.28(s，1H)，7.03(d，2H，J＝9.3Hz)，6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，6.64(s，2H)，6.63(d，1H，J＝9.3Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.77(t，2H，J＝8.0Hz)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，3.19(s，9H)，2.90(t，2H，J＝8.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例44：
Figure PCTCN2018088987-appb-000097
化合物108：
参照化合物107的合成方法，15％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.95(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.33(d，2H，J＝9.3Hz)，7.03(d，2H，J＝9.3Hz)6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，，6.63(d，1H，J＝9.3Hz)，3.32(bs，4H)，3.12(s，6H)，2.35(bs，4H)，1.73(bs，4H)。
探针44：
参照探针1的合成方法，产率91％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.95(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.33(d，2H，J＝9.3Hz)，7.28(s，1H)，7.03(d，2H，J＝9.3Hz)，6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，6.64(s，2H)，6.63(d，1H，J＝9.3Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.32(bs，4H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，3.12(s，6H)，2.35(bs，4H)，2.08(m，2H)，1.73(bs，4H)。
实施例45：
Figure PCTCN2018088987-appb-000098
化合物109：
按照化合物107的合成方法，产率19％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.95(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.33(d，2H，J＝9.3Hz)，7.03(d，2H，J＝9.3Hz)6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，，6.63(d，1H，J＝9.3Hz)，3.12(s，9H)，2.71(s，3H)，1.26(s，6H)。
探针45：
参照探针1的合成方法，产率95％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝12.95(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.33(d，2H，J＝9.3Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，7.03(d，2H，J＝9.3Hz)6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，，6.63(d，1H，J＝9.3Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，3.12(s，9H)，2.71(s，3H)，2.08(m，2H)，1.26(s，6H)。
实施例46：
Figure PCTCN2018088987-appb-000099
化合物111：
化合物110(0.324g，1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃呋喃50ml溶解，加入1M甲基溴化镁四氢呋喃溶液(1.5ml，1.5mmol)，Ar保护条件下室温搅拌3小时，反应完毕，6M的盐酸调至酸性，室温搅拌30分钟，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得产品0.35g，产率98％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，3.37(s，12H)，2.91(s，3H)，0.54(s，6H)。
化合物112：
化合物111(0.359g，1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入25ml乙酸酐溶解，加入乙醛酸(0.10g，1.35mmol)Ar保护条件下80℃油浴加热，反应完毕，体系冷却至室温，倒入100ml水中，过滤，滤饼经柱色谱分离得产品0.104g，产率35％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，3.37(s，12H)，0.54(s，6H)。
探针46：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.28(s，1H)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.60(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.37(s，12H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，0.54(s，6H)。
实施例47：
Figure PCTCN2018088987-appb-000100
化合物114：
参照化合物111的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.10(s，2H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.72(s，3H)，0.54(s，6H)。
化合物115：
参照化合物112的合成方法，产率36％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.31(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.10(s，2H)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，0.54(s，6H)。
探针47：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.28(s，1H)，7.10(s，2H)，6.64(s，2H)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)， 4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.08(m，2H)，0.54(s，6H)。
实施例48：
Figure PCTCN2018088987-appb-000101
化合物117：
参照化合物116的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.72(d，2H，J＝9.2Hz)，7.19(d，2H，J＝2.4Hz)，7.00(dd，2H，J＝2.4 9.2Hz)，3.37(s，12H)，2.75(s，3H)，1.72(s，6H)。
化合物118：
参照化合物112的合成方法，产率31％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.95(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.4Hz)，7.72(d，2H，J＝9.2Hz)，7.19(d，2H，J＝2.4Hz)，7.00(dd，2H，J＝2.49.2Hz)，6.71(d，1H，J＝16.4Hz)，3.37(s，12H)，1.72(s，6H)。
探针48：
参照探针1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.95(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.4Hz)，7.72(d，2H，J＝9.2Hz)，7.28(s，1H)，7.19(d，2H，J＝2.4Hz)，7.00(dd，2H，J＝2.4 9.2Hz)，6.71(d，1H，J＝16.4Hz)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.37(s，12H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.72(s，6H)。
实施例49：
Figure PCTCN2018088987-appb-000102
化合物120：
参照化合物111合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.10(s，2H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.72(s，3H)，1.72(s，6H)。
化合物121：
参照化合物112的合成方法，产率36％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(d，1H，J＝15.6Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.10(s，2H)，6.71(d，1H，J＝15.6Hz)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，1.72(s，6H)。
探针49：
参照探针1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(d，1H，J＝15.6Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.28(s，1H)，7.10(s，2H)，6.71(d，1H，J＝15.6Hz)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.08(m，2H)，1.72(s，6H)。
实施例50：
Figure PCTCN2018088987-appb-000103
化合物123：
化合物122(参照文献公开方法：Jonathan B Grimm.et al.Nature Methods.，2015,12,244--250.)参照化合物109的合成方法，产率97％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝6.90(d，2H，J＝2.5Hz)，6.86(d，2H，J＝2.5Hz)，6.33(dd，2H，J＝2.5Hz)，4.27(t，8H，J＝7.2Hz)，2.76(s，3H)，2.57(q，4H，J＝7.2Hz)。
化合物124：
参照化合物112的合成方法，产率21％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.13(s，1H)，7.92(d，1H，J＝16.0Hz)，6.90(d，2H，J＝2.5Hz)，6.86(d，2H，J＝2.5Hz)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.33(dd，2H，J＝2.5Hz)，4.27(t，8H，J＝7.2Hz)，2.76(s，3H)，2.57(q，4H，J＝7.2Hz)。
探针50:
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.13(s，1H)，7.92(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(s，1H)，6.90(d，2H，J＝2.5Hz)，6.86(d，2H，J＝2.5Hz)，6.64(s，2H)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.33(dd，2H，J＝2.5Hz)，4.27(t，8H，J＝7.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.76(s，3H)，2.57(q，4H，J＝7.2Hz)，2.08(m，2H)。
实施例51：
Figure PCTCN2018088987-appb-000104
化合物126：
化合物125(参照文献公开方法：Young-Hoon Ahn et al.J.Am.Chem.Soc.2007,129,4501—4511.)参照化合物93的合成方法，产率93％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.28(d，2H，J＝9.4Hz)，7.56(d，1H，J＝9.4Hz)，7.39(dd，2H，J＝9.2 2.2Hz)，7.37(d，2H，J＝2.2Hz)，6.0(s，1H)，5.38(s，1H)，3.34(q，2H，J＝3.2Hz)，1.21(t，3H，J＝3.2Hz)。
化合物127：
化合物126(0.30g，1.0mmol)与100ml圆底烧瓶中，加入35ml无水二甲基甲酰胺，加入碳酸钾(0.138g，1.0mmol)、溴乙酸(0.21g，1.5mmol)，Ar保护条件下50℃油浴加热，反应完毕，旋转蒸干溶解，残余物柱色谱分离得产品0.10g，产率27％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.28(d，2H，J＝9.4Hz)，7.56(d，1H，J＝9.4Hz)，7.39(dd，2H，J＝9.2 2.2Hz)，7.37(d，2H，J＝2.2Hz)，6.0(s，1H)，5.38(s，1H)，4.21(s，2H)，3.34(q，2H，J＝3.2Hz)，1.21(t，3H，J＝3.2Hz)。
探针51：
按照探针1的合成方法，产率93％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.28(d，2H，J＝9.4Hz)，7.56(d，1H，J＝9.4Hz)，7.39(dd，2H，J＝9.2 2.2Hz)，7.37(d，2H，J＝2.2Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，6.0(s，1H)，5.38(s，1H)，4.21(s，2H)，3.34(q，2H，J＝3.2Hz)，1.21(t，3H，J＝3.2Hz)。
实施例52：
Figure PCTCN2018088987-appb-000105
化合物129：
化合物128(按照文献公开方法合成：L.X.Wu，K.Burgess，J.Org.Chem.2008,73,8711—8718.)(0.585g，1.0mmol)于100ml的圆底烧瓶中，加入醋酸钯(4.4mg，0.02mmol)、三乙醇胺(0.30g，2.0mmol)，加干燥二甲基甲酰胺25ml，加入丙烯酸价值(0.172g，2.0mmol)，85℃油浴加热，反应完毕，冷却至室温，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得产物0.461g，产率85％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.11(d，1H，J＝16.0Hz)，7.95(d，2H，J＝8.4Hz)，7.27(d，2H，J＝9.6Hz)，7.12(d，2H，J＝8.4Hz)，7.07(dd，2H，J＝2.4 9.6Hz)，6.99(d，2H，J＝2.4Hz)，6.71(d，1H，J＝16.0Hz)，3.96(s，3H)，3.73(br，8H)，1.76(br，12H)。
化合物130：
化合物129(0.271g，0.5mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入50ml甲醇、10ml水，加入碳酸钾(0.138g，1.0mmol)，Ar保护条件下室温搅拌，反应完毕，体系调至酸性，倒入100ml二氯甲烷中，分出有机相，饱和食盐水洗涤两次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得产物0.227g，产率86％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝11.96(s，1H)，8.11(d，1H，J＝16.0Hz)，7.95(d，2H，J＝8.4Hz)，7.27(d，2H，J＝9.6Hz)，7.12(d，2H，J＝8.4Hz)，7.07(dd，2H，J＝2.4 9.6Hz)，6.99(d，2H，J＝2.4Hz)，6.71(d，1H，J＝16.0Hz)，3.73(br，8H)，1.76(br，12H)。
探针52：
参照探针1的合成方法，产率93％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.11(d，1H，J＝16.0Hz)，7.95(d，2H，J＝8.4Hz)，7.34(s，1H)，7.27(d，2H，J＝9.6Hz)，7.12(d，2H，J＝8.4Hz)，7.07(dd，2H，J＝2.4 9.6Hz)，6.99(d，2H，J＝2.4Hz)，6.71(d，1H，J＝16.0Hz)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.73(br，8H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.76(br，12H)。
实施例53：
Figure PCTCN2018088987-appb-000106
化合物132：
化合物131(参照X.J.Peng et.al.PCT Int.Appl.2012103678公开的方法)(0.283g，0.5mmol)溶于25ml无水乙醇中，丙二酸(0.062g，0.6mmol)，加入催化量三乙胺，油浴加热回流2h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物柱色谱分离得0.170g，产率56％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.26(d，2H，J＝14.4H)8.01(d，1H，J＝9.2H)，7.68(d，1H，J＝9.2H)，7.49(t，2H，J＝8.0H)，7.46(d，2H，J＝7.6Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.22(bp，2H)，4.51(q，4H，J＝7.2Hz)，3.92(s，3H)，1.86(s，6H)，1.56(t，6H，J＝7.2H)。
探针53：
参照探针1的合成方法，产率88％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝8.26(d，2H，J＝14.4H)8.01(d，1H，J＝9.2H)，7.68(d，1H，J＝9.2H)，7.49(t，2H，J＝8.0H)，7.46(d，2H，J＝7.6Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.28(s，1H)，7.22(bp，2H)，6.64(s，2H)，4.51(q，4H，J＝7.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.92(s，3H)，1.86(s，6H)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.56(t，6H，J＝7.2H)。
实施例54：
Figure PCTCN2018088987-appb-000107
化合物133：
参照化合物131的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.26(d，2H，J＝14.4H)8.01(d，1H，J＝9.2H)，7.68(d，1H，J＝9.2H)，7.46(d，2H，J＝7.6Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.22(bp，2H)，4.51(q，4H，J＝7.2Hz)，3.92(s，3H)，1.86(s，6H)，1.56(t，6H，J＝7.2H。
探针54：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.26(d，2H，J＝14.4H)8.01(d，1H，J＝9.2H)，7.68(d，1H，J＝9.2H)，7.46(d，2H，J＝7.6Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.28(s，1H)，7.22(bp，2H)，6.64(s，2H)，4.51(q，4H，J＝7.2Hz)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.92(s，3H)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，1.86(s，6H)，1.56(t，6H，J＝7.2H)。
实施例55：
Figure PCTCN2018088987-appb-000108
化合物136：
化合物135(参照文献公开方法合成：Mathisa O et.al.J.Am.Soc.Soc.2004，126，13634—13635.)(0.169g，0.5mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入25ml无水乙醇溶解，加入丙二酸(62.4mg，0.6mmol)，加入催化量的无水氯化锌，氩气保护条件下油浴加热回流2h，反应完毕，旋转蒸去部分溶剂，冷却析 出晶体，过滤，滤饼用冷的无水乙醇洗涤两次，得纯品0.164g，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.1(s，1H)，10.28(s，2H)，10.25(s，1H)，10.17(d，2H，J＝4.4Hz)，9.46(d，2H，J＝4.4Hz)，9.39(d，2H，J＝4.4Hz)，9.36(d，2H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝8.8Hz)，7.8(d，1H，J＝8.8Hz)，-3.05(s，2H)。
探针55：
参照探针1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.28(s，2H)，10.25(s，1H)，10.17(d，2H，J＝4.4Hz)，9.46(d，2H，J＝4.4Hz)，9.39(d，2H，J＝4.4Hz)，9.36(d，2H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝8.8Hz)，7.8(d，1H，J＝8.8Hz)，7.28(s，1H)，6.64(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)，-3.05(s，2H)。
实施例56：
Figure PCTCN2018088987-appb-000109
化合物137:
参照化合物2的合成方法，产率78％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.99-8.39(m，10H)，6.75(d，1H，J＝16.4Hz)，5.41(s，2H)。
探针56：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.99-8.39(m，10H)，7.28(s，1H)，6.75(d，1H，J＝16.4Hz)，6.64(s，2H)，5.41(s，2H)，4.12(t，2H，J＝5.4Hz)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，2H，J＝6.0Hz)，2.08(m，2H)。
实施例57：
Figure PCTCN2018088987-appb-000110
探针57：
化合物5(0.287g，1.0mmol)与50ml圆底烧瓶中，加入化合物138(0.223g，1.2mmol)、六氟磷酸苯丙三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(0.63g，1.2mmol)，三乙胺(0.15g，1.5mmol)，加入10ml无水二甲基甲酰胺，Ar保护条件下室温搅拌1h，反应完毕，旋转蒸干溶剂，柱色谱分离，得淡黄色晶体0.391g，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.96(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例58：
Figure PCTCN2018088987-appb-000111
探针58：
参照探针57的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.10(s，1H)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，3.9(s，2H)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，1.96(m，4H)。
实施例59：
Figure PCTCN2018088987-appb-000112
探针59：
参照探针57的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.96(s，1H)，11.81(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，6.30(s，1H)，3.9(s，2H)。
实施例60：
Figure PCTCN2018088987-appb-000113
探针60：
参照探针57的合成方法，产率94％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，6.35(d，2H，J＝4.2Hz)，3.9(s，2H)，2.65(s，6H)。
实施例61：
Figure PCTCN2018088987-appb-000114
探针61：
参照探针57的合成方法，产率95％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.20(d，2H，J＝7.2Hz)，7.06(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，6.35(d，2H，J＝4.2Hz)，3.9(s，2H)，2.23(s，3H)。
实施例62：
Figure PCTCN2018088987-appb-000115
探针62：
参照探针57的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.19(d，2H，J＝7.8Hz)，7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，6.51(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)，3.70(s，2H)，2.23(s，3H)。
实施例63：
Figure PCTCN2018088987-appb-000116
探针63：
参照探针57的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.45(br，2H)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.9(s，2H)，3.75(s，2H)，2.60(s，3H)。
实施例64：
Figure PCTCN2018088987-appb-000117
探针64：
参照探针57的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H， J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，4.06(s，3H)，3.9(s，2H)，2.23(s，3H)。
实施例65：
Figure PCTCN2018088987-appb-000118
探针65：
参照探针57的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)。
实施例66：
Figure PCTCN2018088987-appb-000119
探针66：
参照探针57的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)，3.86(s，6H)。
实施例67：
Figure PCTCN2018088987-appb-000120
探针67：
参照探针57的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.32(d，2H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.56(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，2H，J＝16.4Hz)，7.40(d，2H，J＝4.8)，7.29(d，2H，J＝4.8Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.09(d，2H，J＝4.4Hz)，6.49(s，1H，J＝16.0Hz)，6.44(br，2H)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.9(s，2H)，3.73(s，2H)。
实施例68：
Figure PCTCN2018088987-appb-000121
探针68：
参照探针57的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.22(d，2H，J＝7.2Hz)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.52(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，3.9(s，2H)，2.96(s，6H)，2.23(s，3H)。
实施例69：
Figure PCTCN2018088987-appb-000122
探针69：
参照探针57的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.32(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.54(d，2H，J＝4.2Hz)，7.50(d，1H，J＝16.4Hz)，7.45(d，1H，J＝4.8)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.20(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.53(d，1H，J＝16.0Hz)，6.45(br，2H)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.9(s，2H)，2.65(s，3H)。
实施例70：
Figure PCTCN2018088987-appb-000123
探针70：
参照探针57的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.73(d，2H，J＝7.2Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)。
实施例71：
Figure PCTCN2018088987-appb-000124
探针71：
参照探针57的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.45(br，2H)，，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，5.52(s，2H)，3.9(s，2H)2.65(s，3H)。
探针72：
Figure PCTCN2018088987-appb-000125
探针72：
参照探针57的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)。
实施例73：
Figure PCTCN2018088987-appb-000126
探针73：
参照探针57的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.2(s,1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，3.61(s，12H)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)。
实施例74：
Figure PCTCN2018088987-appb-000127
探针74：
参照探针57的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.10(s，2H)，6.56(s，2H)，6.44(br，2H)，，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，3.9(s，2H)3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t， 4H，J＝8.0Hz)。
实施例75：
Figure PCTCN2018088987-appb-000128
探针75：
参照探针57的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.10(s，2H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，3.32(bs，8H)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)，2.35(bs，8H)，1.73(bs，8H)。
实施例76：
Figure PCTCN2018088987-appb-000129
探针76：
参照探针57的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)。
实施例77：
Figure PCTCN2018088987-appb-000130
探针77：
参照探针57的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，3.37(s，12H)，3.9(s，2H)，0.54(s，6H)。
实施例78：
Figure PCTCN2018088987-appb-000131
探针78：
参照探针57的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.31(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.10(s，2H)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，0.54(s，6H)。
实施例79：
Figure PCTCN2018088987-appb-000132
探针79：
参照探针57的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.95(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.4Hz)，7.72(d，2H，J＝9.2Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.19(d，2H，J＝2.4Hz)，7.00(dd，2H，J＝2.4 9.2Hz)，6.71(d，1H，J＝16.4Hz)，6.41(br，2H)，3.9(s，2H)，3.37(s，12H)，1.72(s，6H)。
实施例80：
Figure PCTCN2018088987-appb-000133
探针80：
参照探针57的合成方法，产率79％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.13(s，1H)，7.92(d，1H，J＝16.0Hz)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，6.90(d，2H，J＝2.5Hz)，6.86(d，2H，J＝2.5Hz)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.41(br，2H)，6.33(dd，2H，J＝2.5Hz)，4.27(t，8H，J＝7.2Hz)，3.9(s，2H)，2.76(s，3H)，2.57(q，4H，J＝7.2Hz)。
实施例81：
Figure PCTCN2018088987-appb-000134
探针81：
参照探针57的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.26(d，2H，J＝14.4H)8.01(d，1H，J＝9.2H)，7.70(d，2H，J＝7.2Hz)，7.68(d，1H，J＝9.2H)，7.49(t，2H，J＝8.0H)，7.46(d，2H，J＝7.6Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.26(d，2H，J＝7.2Hz)，7.22(bp，2H)，6.41(br，2H)，4.51(q，4H，J＝7.2Hz)，3.92(s，3H)，3.9(s，2H)，1.86(s，6H)，1.56(t，6H，J＝7.2H)。
实施例82：
Figure PCTCN2018088987-appb-000135
探针82：
参照探针57的合成方法，产率81％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.1(s，1H)，10.28(s，2H)，10.25(s，1H)，10.17(d，2H，J＝4.4Hz)，9.58(s，1H)，9.46(d，2H，J＝4.4Hz)，9.39(d，2H，J＝4.4Hz)，9.36(d，2H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝8.8Hz)，7.85(m，3H)，7.42(d，2H，J＝7.8Hz)，7.30(s，2H)，4.32(d，2H，J＝6.0Hz)，-3.05(s，2H)。
实施例83：
Figure PCTCN2018088987-appb-000136
探针83：
化合物5(0.287g，1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.138g，1.2mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(0.287g，1.5mmol)和4-N,N-二甲基吡啶(0.146g，1.2mmol)，加入干燥二氯甲烷25ml溶解，Ar保护条件加室温搅拌，反应完毕，体系倒入100ml水中，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，无需纯化，直接加入化合物139(按照文献公开的方法：Suman Lata.et al.J.AM.CHEM.SOC.2005,127,10205—10215.)(0.262g，1.0mmol)，加入干燥二甲基甲酰胺15ml溶解，加三乙胺(0.100g，1.3mmol)，Ar保护条件下室温搅拌，反应完毕，旋转蒸干溶剂，残余物经反相色谱分离得纯品0.297g，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.96(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，3.47(d，4H，J＝5.6Hz)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，3.31(t，1H，J＝5.6Hz)，2.69(t，2H，J＝5.6Hz)，1.62(m，2H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例84：
Figure PCTCN2018088987-appb-000137
探针84：
参照探针83的合成方法，产率68％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.10(s，1H)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，3.47(d，4H，J＝5.6Hz)，3.31(t，1H，J＝5.6Hz)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，2.69(t，2H，J＝5.6Hz)，1.62(m，2H)，1.96(m，4H)。
实施例85：
Figure PCTCN2018088987-appb-000138
探针85：
参照探针83的合成方法，产61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.96(s，1H)，11.81(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(s，1H)3.47(d，4H，J＝5.6Hz)，3.31(t，1H，J＝5.6Hz)，2.69(t，2H，J＝5.6Hz)，1.62(m，2H)。
实施例86：
Figure PCTCN2018088987-appb-000139
探针86：
参照探针83的合成方法，产率57％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.47(d，4H，J＝5.6Hz)，3.31(t，1H，J＝5.6Hz)，2.69(t，2H，J＝5.6Hz)，2.65(s，6H)，1.62(m，2H)。
实施例87：
Figure PCTCN2018088987-appb-000140
探针87：
参照探针83的合成方法，56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.06(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.47(d，4H，J＝5.6Hz)，3.31(t，1H，J＝5.6Hz)，2.69(t，2H，J＝5.6Hz)，2.23(s，3H)，1.62(m，2H)。
实施例88：
Figure PCTCN2018088987-appb-000141
探针88：
参照探针83的合成方法，59％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.75(s，2H)，3.47(d，4H，J＝5.6Hz)，3.31(t，1H，J＝5.6Hz)，2.69(t，2H，J＝5.6Hz)，2.60(s，3H)，1.62(m，2H)。
实施例89：
Figure PCTCN2018088987-appb-000142
探针89：
参照探针83的合成方法，61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，3.47(d，4H，J＝5.6Hz)，3.31(t，1H，J＝5.6Hz)，2.69(t，2H，J＝5.6Hz)，1.62(m，2H)。
实施例90：
Figure PCTCN2018088987-appb-000143
探针90：
化合物140(按照文献公开的方法：Suman Lata.et al.J.AM.CHEM.SOC.2005,127,10205—10215.)参照探针83的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.96(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，，6.88(br，1H)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，12H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例91：
Figure PCTCN2018088987-appb-000144
探针91：
参照探针83的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.10(s，1H)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，6.88(br，1H)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，10H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.96(m，4H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例92：
Figure PCTCN2018088987-appb-000145
探针92：
参照探针83的合成方法，产率57％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.96(s，1H)，11.81(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，6.88(br，1H)，，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(s，1H)5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例93：
Figure PCTCN2018088987-appb-000146
探针93：
参照探针83的合成方法，产率67％。 1H-NMR(400MHz，DMSO-d 6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，6.88(br，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.65(s，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例94：
Figure PCTCN2018088987-appb-000147
探针94：
参照探针83的合成方法，产率62％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，6.88(br，1H)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.06(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.23(s，3H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例95：
Figure PCTCN2018088987-appb-000148
探针95：
参照探针83的合成方法，产率56％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.88(br，1H)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，5.03(s，2H)，4.06(s，3H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.23(s，3H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例96：
Figure PCTCN2018088987-appb-000149
探针96：
参照探针83的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.88(br，1H)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，5.03(s，2H)，3.75(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.60(s，3H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例97：
Figure PCTCN2018088987-appb-000150
探针97：
参照实施例83的合成方法，产率62％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.68(br，1H)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.88(br，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例98：
Figure PCTCN2018088987-appb-000151
探针98：
参照探针83的方法，产率63％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.81(br，1H)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，5.03(s，2H)，3.86(s，6H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例99：
Figure PCTCN2018088987-appb-000152
探针99；
参照探针83的合成方法，产率62％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.68(br，1H)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.15(dd，2 H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.83(br，1H)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例100：
Figure PCTCN2018088987-appb-000153
探针100：
参照探针83的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.68(br，1H)，6.88(br，1H)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，5.52(s，2H)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.65(s，3H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例101：
Figure PCTCN2018088987-appb-000154
探针101：
参照探针83的合成方法，产率55％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.68(br，1H)，6.88(br，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例102：
Figure PCTCN2018088987-appb-000155
探针102：
参照探针83的合成方法，产率58％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.2(s,1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.68(br，1H)，，7.59(d，2H，J＝8.8H)，6.88(br，1H)，6.56(d，2H， J＝8.8H)，6.48(s，2H)，5.03(s，2H)，3.61(s，12H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例103：
Figure PCTCN2018088987-appb-000156
探针103：
参照探针83的合成方法，产率63％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，7.10(s，2H)，6.88(br，1H)，6.56(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，5.03(s，2H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例104：
Figure PCTCN2018088987-appb-000157
探针104：
参照探针83的合成方法，产率63％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，6.88(br，1H)，7.10(s，2H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，3.12(bs，8H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，2.35(bs，8H)，1.73(bs，8H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例105：
Figure PCTCN2018088987-appb-000158
探针105：
参照探针83的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.68(br，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，6.88(br，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例106：
Figure PCTCN2018088987-appb-000159
探针106：
参照探针83的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.68(br，1H)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.88(br，1H)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.40-3.50(m，8H)，3.37(s，12H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)，0.54(s，6H)。
实施例107：
Figure PCTCN2018088987-appb-000160
探针107：
参照探针83的合成方法，产率61％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.31(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.68(br，1H)，7.10(s，2H)，6.88(br，1H)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)，0.54(s，6H)。
实施例108:
Figure PCTCN2018088987-appb-000161
探针108：
参照探针83的合成方法，产率63％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.13(s，1H)，7.92(d，1H，J＝16.0Hz)，7.68(br，1H)，6.88(br，1H)，6.90(d，2H，J＝2.5Hz)，6.86(d，2H，J＝2.5Hz)，6.61(d，1H，J＝16.0Hz)，6.33(dd，2H，J＝2.5Hz)，5.03(s，2H)，4.27(t，8H，J＝7.2 Hz)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，2.76(s，3H)，2.57(q，4H，J＝7.2Hz)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例109：
Figure PCTCN2018088987-appb-000162
探针109：
参照探针83的合成方法，产率57％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.95(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.4Hz)，7.72(d，2H，J＝9.2Hz)，7.68(br，1H)，7.19(d，2H，J＝2.4Hz)，7.00(dd，2H，J＝2.4 9.2Hz)，6.88(br，1H)，6.71(d，1H，J＝16.4Hz)，5.03(s，2H)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.37(s，12H)，3.20-3.33(m，6H)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.72(s，6H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例110：
Figure PCTCN2018088987-appb-000163
探针110：
参照探针83的合成方法，产率63％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.03(d，1H，J＝15.6Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.68(br，1H)，7.10(s，2H)，6.88(br，1H)，6.71(d，1H，J＝15.6Hz)，5.03(s，2H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.56(t，1H，J＝1.2Hz)，3.36-3.50(m，8H)，3.20-3.33(m，6H)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.37(m，2H)，2.05(m，2H)，1.72(s，6H)，1.46-1.65(m，12H)，1.45(s，18H)。
实施例111：
Figure PCTCN2018088987-appb-000164
探针111：
化合物141(按照文献公开方法合成：Tae-Hyuk Kwon.et al.Chem.Eur.J.2008,14,9613—9619.)参照探针1的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)， 6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H)，3.41(m，6H)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例112：
Figure PCTCN2018088987-appb-000165
探针112：
参照探针1的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.82(t，2H，J＝7.2Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，1.96(m，4H)。
实施例113：
Figure PCTCN2018088987-appb-000166
探针113：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.96(s，1H)，8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(s，1H)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H)，3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例114：
Figure PCTCN2018088987-appb-000167
探针114：
参照探针1的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)，2.65(s，6H)。
实施例115：
Figure PCTCN2018088987-appb-000168
探针115：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，3.86(s，8H)，7.06(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)，2.23(s，3H)。
实施例116：
Figure PCTCN2018088987-appb-000169
探针116：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.26-7.32(m，2H)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.20(d，1H，J＝4.2Hz)，4.06(s，3H)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)，2.23(s，3H)。
实施例117：
Figure PCTCN2018088987-appb-000170
探针117：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0 Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H)，3.75(s，2H)，3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)，2.60(s，3H)。
实施例118：
Figure PCTCN2018088987-appb-000171
探针118：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例119：
Figure PCTCN2018088987-appb-000172
探针119：
参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，3.86(m，14H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例120：
Figure PCTCN2018088987-appb-000173
探针120：
参照探针1的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)， 7.12(s，2H)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例121：
Figure PCTCN2018088987-appb-000174
探针121：
参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.56(d，4H，J＝7.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H),3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例122：
Figure PCTCN2018088987-appb-000175
探针122：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H)，3.61(s，12H)，3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例123：
Figure PCTCN2018088987-appb-000176
探针123：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，7.10(s，2H)，6.56(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，3.86(s，8H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.76(s，4H)，3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例124：
Figure PCTCN2018088987-appb-000177
探针124：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.56(d，4H，J＝7.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H)，3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)。
实施例125：
Figure PCTCN2018088987-appb-000178
探针125：
参照探针1的合成方法，产率82％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，3.37(s，12H)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H)，3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)，0.54(s，6H)。
实施例126：
Figure PCTCN2018088987-appb-000179
探针126：
参照探针1的合成方法，产率85％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.52(d，4H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.71(t，4H，J＝7.6Hz)，7.58(d，4H，J＝7.8Hz)，7.22(t，4H，J＝6.0Hz)，7.12(s，2H)，7.10(s，2H)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，3.86(s，8H)，3.76(s，4H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.41(t，2H，J＝7.4Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.76(t，2H，J＝7.2Hz)，0.54(s，6H)。
实施例127：
Figure PCTCN2018088987-appb-000180
探针127：
参照探针1的合成方法，产率85％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，7.88(m，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例128:
Figure PCTCN2018088987-appb-000181
探针128：
参照探针1的合成方法，产率85％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，7.88(m，1H)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3,77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)，1.96(m，4H)。
实施例129:
Figure PCTCN2018088987-appb-000182
探针129：
参照探针1的合成方法，产率85％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.62(s，1H)，9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，7.88(m，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.47(d，1H，J＝16.0 Hz)，6.30(s，1H)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3,77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例130:
Figure PCTCN2018088987-appb-000183
探针130：
参照探针1的合成方法，产率81％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，7.88(m，1H)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3,77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.65(s，6H)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例131:
Figure PCTCN2018088987-appb-000184
探针131：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.88(m，1H)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3,77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例132:
Figure PCTCN2018088987-appb-000185
探针132：
参照探针1的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，7.88(m，1H)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.217.2Hz)，7.05(s，1H)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4 Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.86(s，6H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例133:
Figure PCTCN2018088987-appb-000186
探针133：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，7.88(m，1H)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.03.6Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.05(s，1H)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例134:
Figure PCTCN2018088987-appb-000187
探针134：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.88(m，1H)，7.81(d，2H，J＝7.2Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.16(d，2H，J＝7.2Hz)，7.05(s，1H)，6.86(d，1H，J＝5.4Hz)，6.79(d，1H，J＝7.2Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝5.4Hz)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，5.52(s，2H)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.65(s，3H)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例135:
Figure PCTCN2018088987-appb-000188
探针135：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.88(m，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例136:
Figure PCTCN2018088987-appb-000189
探针136：
参照探针1的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.88(m，1H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，3.61(s，12H)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例137:
Figure PCTCN2018088987-appb-000190
探针137：
参照探针1的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，7.88(m，1H)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.10(s，2H)，7.05(s，1H)，6.56(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例138:
Figure PCTCN2018088987-appb-000191
探针138：
参照探针1的合成方法，产率96％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.88(m，1H)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.05(s，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)。
实施例139:
Figure PCTCN2018088987-appb-000192
探针139：
参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.88(m，1H)，7.72(dd，2H，J＝2.79.2Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.05(s，1H)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，3.37(s，12H)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)，0.54(s，6H)。
实施例140:
Figure PCTCN2018088987-appb-000193
探针140：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝9.41(s，1H)，8.38(s，1H)，8.17(t，1H，J＝12.6Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.88(m，1H)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.38(dd，2H，J＝8.2 17.2Hz)，7.10(s，2H)，7.05(s，1H)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，5.41(s，2H)，5.20(s，1H)，4.00-3.87(m，3H)，3.82(dd，1H，J＝7.8 12.6Hz)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.29(m，1H)，2.15(m，1H)，0.54(s，6H)。
实施例141:
Figure PCTCN2018088987-appb-000194
探针141：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例142:
Figure PCTCN2018088987-appb-000195
探针142：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.84(s，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.90(m，4H)，1.70(m，1H)。
实施例143:
Figure PCTCN2018088987-appb-000196
探针143：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.85(s，1H)，8.31(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(s，1H)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例144:
Figure PCTCN2018088987-appb-000197
探针144：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.31(s，1H)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.65(s，6H)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例145:
Figure PCTCN2018088987-appb-000198
探针145：
参照探针1的合成方法，产率84％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.31(s，1H)，8.19(d，2H，J＝7.8Hz)，7.87(d，2H，J＝16.4Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝16.4Hz)，7.73(d，4H，J＝7.6Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.52(d，4H，J＝7.6Hz)，7.39(d，2H，J＝4.4Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，7.04(d，2H，J＝4.4Hz)，6.51(d，1H，J＝16.0Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.70(s，2H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，2.23(s，3H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例146:
Figure PCTCN2018088987-appb-000199
探针146：
参照探针1的合成方法，产率84％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.31(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.83(d，2H，J＝4.4 Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例147:
Figure PCTCN2018088987-appb-000200
探针147：
参照探针1的合成方法，产率84％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.31(s，1H)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.86(s，6H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例148:
Figure PCTCN2018088987-appb-000201
探针148：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.31(s，1H)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.21(m，3H)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例149:
Figure PCTCN2018088987-appb-000202
探针149：
参照探针1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例150:
Figure PCTCN2018088987-appb-000203
探针150：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，，3.61(s，12H)3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例151:
Figure PCTCN2018088987-appb-000204
探针151：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.10(s，2H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.56(s，2H)，6.40(d，1H，J＝16.0Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.44(m，1H)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例152:
Figure PCTCN2018088987-appb-000205
探针152：
参照探针1的合成方法，产率87％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，
8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)。
实施例153:
Figure PCTCN2018088987-appb-000206
探针153：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.44(m，1H)，3.37(s，12H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)，0.54(s，6H)。
实施例154:
Figure PCTCN2018088987-appb-000207
探针154：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.15(m，3H)，7.10(s，2H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，4.90(m，1H)，4.25(m，1H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.44(m，1H)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.70(m，1H)，0.54(s，6H)。
实施例155:
Figure PCTCN2018088987-appb-000208
探针155：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.31(s，1H)，8.26(d，2H，J＝14.4H)8.01(d，1H，J＝9.2H)，7.68(d，1H，J＝9.2H)，7.65(d，2H，J＝8.4Hz)，7.49(t，2H，J＝8.0H)，7.46(d，2H，J＝7.6Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6H)，7.35(t，2H，J＝8.0Hz)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.22(bp，2H)，7.15(m，3H)，7.06(d，2H，J＝8.0Hz)，4.90(m，1H)，4.51(q，4H，J＝7.2Hz)，4.25(m，1H)，3.92(s，3H)，3.44(m，1H)，2.86(t，1H，J＝10.8Hz)，2.32(m，2H)，1.98(m，1H)，1.86(s，6H)，1.70(m，1H)，1.56(t，6H，J＝7.2H)。
实施例156:
Figure PCTCN2018088987-appb-000209
探针156：
化合物144(按照文献公开方法合成：T.H.Zhang.et al.Chemmistry and Biology.2012,19,140—154..)参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.49(m，2H)，6.76(m，1H)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.52(s，1H)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，6.44(s，1H)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，2.79(s，6H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例157:
Figure PCTCN2018088987-appb-000210
探针157：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.49(m，2H)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，6.84(s，1H)，6.76(m，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.79(s，6H)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，1.96(m，4H)。
实施例158:
Figure PCTCN2018088987-appb-000211
探针158：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.81(s，1H)，10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.49(m，2H)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，6.76(m，1H)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(s，1H)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，2.79(s，6H)。
实施例159:
Figure PCTCN2018088987-appb-000212
探针159：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.49(m，2H)，6.76(m，1H)，6.52(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，2.79(s，6H)，2.65(s，6H)。
实施例160:
Figure PCTCN2018088987-appb-000213
探针160：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.56(d，2H，J＝2.4Hz)， 7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.49(m，2H)，7.26-7.32(m，4H，J＝16.4Hz)，7.06(s，1H)，6.76(m，1H)，6.52(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，2.79(s，6H)，2.23(s，3H)。
实施例161:
Figure PCTCN2018088987-appb-000214
探针161：
参照探针1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.49(m，2H)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.76(m，1H)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，3.75(s，2H)，2.79(s，6H)，2.60(s，3H)。
实施例162:
Figure PCTCN2018088987-appb-000215
探针162：
参照探针1的合成方法，产率93％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.49(m，2H)，7.44-7.47(m，6H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.76(m，1H)，6.58(d，1H，J＝16.0Hz)6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，2.79(s，6H)。
实施例163:
Figure PCTCN2018088987-appb-000216
探针163：
参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.49(m，2H)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.76(m，1H)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，3.86(s，6H)，2.79(s，6H)。
实施例164:
Figure PCTCN2018088987-appb-000217
探针164：
参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.49(m，2H)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.76(m，1H)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，2.79(s，6H)。
实施例165:
Figure PCTCN2018088987-appb-000218
探针165：
参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.49(m，2H)，6.76(m，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，6.40(s，2H)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，2.79(s，6H)。
实施例166:
Figure PCTCN2018088987-appb-000219
探针166：
参照探针1的合成方法，产率86％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.49(m，2H)，6.76(m，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.51(s，2H)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，，3.61(s，12H)2.79(s，6H)。
实施例167:
Figure PCTCN2018088987-appb-000220
探针167：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.49(m，2H)，6.76(m，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.52(d，1H，J＝15.6Hz)，6.48(s，2H)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，2.79(s，6H)。
实施例168:
Figure PCTCN2018088987-appb-000221
探针168：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，7.94(d，1H，J＝15.3Hz)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.49(m，2H)，7.33(d，2H，J＝9.3Hz)，7.03(d，2H，J＝9.3Hz)，6.90(d，1H，J＝15.2Hz)，6.76(m，1H)，6.63(d，1H，J＝9.3Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，3.77(t，2H，J＝8.0Hz)，3.19(s，9H)，2.90(t，2H，J＝8.0Hz)，2.79(s，6H)。
实施例169:
Figure PCTCN2018088987-appb-000222
探针169：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H，J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.49(m，2H)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.76(m，1H)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，3.37(s，12H)，2.79(s，6H)，0.54(s，6H)。
实施例170:
Figure PCTCN2018088987-appb-000223
探针170：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.53(s，1H)，10.20(s，1H)，9.94(b，1H)，9.75(s，1H)，9.35(s，1H)，8.75(d，1H，J＝4.8Hz)，8.59(d，1H， J＝4.8Hz)，8.56(dt，1H，J＝4.8 7.8Hz)，8.17(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.89(d，1H，J＝9.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.77(d，2H，J＝9.0Hz)，7.69(d，2H，J＝9.0Hz)，7.65(m，2H)，7.49(m，2H)，7.10(s，2H)，6.76(m，1H)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，6.48(d，1H，J＝15.6Hz)，3.96(d，2H，J＝6.0Hz)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.79(s，6H)，0.54(s，6H)。
实施例171:
Figure PCTCN2018088987-appb-000224
探针171：
化合物145(按照文献公开方法合成：T.H.Zhang.et al.Chemmistry and Biology.2012,19,140—154..)参照探针1的合成方法，产率90％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，6.74(m，1H)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，2.84(s，6H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例172:
Figure PCTCN2018088987-appb-000225
探针172：
参照探针1的合成方法，产率88％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，7.35(m，2H)，6.84(s，1H)，6.74(m，1H)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.84(s，6H)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，1.96(m，4H)。
实施例173:
Figure PCTCN2018088987-appb-000226
探针173：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.81(s，1H)，10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.43(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.35(m，2H)，6.74(m，1H)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，6.30(s，1H)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，2.84(s，6H)。
实施例174:
Figure PCTCN2018088987-appb-000227
探针174：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，6.74(m，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.45(d，1H，J＝15.6Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，2.84(s，6H)，2.65(s，6H)。
实施例175:
Figure PCTCN2018088987-appb-000228
探针175：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d， 1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.87.8Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.35(m，2H)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，6.74(m，1H)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.45(d，1H，J＝15.6Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，3.75(s，2H)，2.84(s，6H)，2.60(s，3H)。
实施例176:
Figure PCTCN2018088987-appb-000229
探针176：
参照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.50(d，1H，J＝8.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.35(m，2H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.74(m，1H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，2.84(s，6H)。
实施例177:
Figure PCTCN2018088987-appb-000230
探针177：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，6.74(m，1H)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，3.86(s，6H)，2.84(s，6H)。
实施例178:
Figure PCTCN2018088987-appb-000231
探针178：
参照探针1的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.74(m，1H)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，2.84(s，6H)。
实施例179:
Figure PCTCN2018088987-appb-000232
探针179：
参照探针1的合成方法，产率92％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.10(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.92(s，1H)，7.69(m，1H)，7.63(d，1H，J＝5.4Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，6.74(m，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，2.84(s，6H)。
实施例180:
Figure PCTCN2018088987-appb-000233
探针180：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)， 8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.10(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.92(s，1H)，7.69(m，1H)，7.63(d，1H，J＝5.4Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，6.74(m，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，3.61(s，12H)，2.84(s，6H)。
实施例181:
Figure PCTCN2018088987-appb-000234
探针181：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，7.10(s，2H)，6.74(m，1H)，6.45(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，3.32(bs，8H)，2.84(s，6H)，2.35(bs，8H)，1.73(bs，8H)。
实施例182:
Figure PCTCN2018088987-appb-000235
探针182：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.10(s，1H)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.92(s，1H)，7.69(m，1H)，7.63(d，1H，J＝5.4Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，6.74(m，1H)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，2.84(s，6H)。
实施例183:
Figure PCTCN2018088987-appb-000236
探针183：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝10.27(s，1H)，9.87(s，1H)，9.48(br，1H)，8.95(t，1H，J＝6.0Hz)，8.83(br，1H)，8.76(d，1H，J＝7.8Hz)，8.68(d，1H，J＝5.4Hz)，8.52(s，1H)，8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，8.03(d，2H，J＝7.8Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.69(m，1H)，7.59(d，1H，J＝5.4Hz)，7.53(dt，1H，J＝1.8 7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝8.4Hz)，7.35(m，2H)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.74(m，1H)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝15.6Hz)，4.52(d，2H，J＝6.0Hz)，3.94(d，2H，J＝6.0Hz)，3.37(s，12H)，2.84(s，6H)，0.54(s，6H)。
实施例184:
Figure PCTCN2018088987-appb-000237
探针184：
化合物5(0.575g，2.0mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入2,4-二甲氧基苯胺(0.306g，2.0mmol)、2-醛基噻吩(0.246g，2.2mmol)、乙异腈(0.091g，2.2ml)，加入20ml甲醇，Ar保护条件下室温搅拌48h，反应完毕，体系过滤，旋转蒸干溶剂，残余物溶于50ml二氯甲烷，分别用饱和食盐水和水洗涤两次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干有机相，残余物经柱色谱分离得产物0.357g，产率31％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.52(s，1H)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.44(s，1H)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，2.75(s，3H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例185:
Figure PCTCN2018088987-appb-000238
探针185：
参照探针184的合成方法，产率34％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.76(d，1H，J＝16.0Hz)，7.46(d，1H，J＝9.2Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.84(s，1H)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.70(d，1H，J＝16.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，5.99(d，1H，J＝9.2Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，3.26(m，4H)，2.88(t，2H，J＝6.5Hz)，2.75(t，2H，J＝6.5Hz)，2.65(s，3H)，1.96(m，4H)。
实施例186:
Figure PCTCN2018088987-appb-000239
探针186：
参照探针184的合成方法，产率34％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.81(s，1H)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.30(s，1H)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.75(s，3H)。
实施例187:
Figure PCTCN2018088987-appb-000240
探针187：
参照探针184的合成方法，产率29％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，6.35(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.65(s，6H)，2.75(s，3H)。
实施例188:
Figure PCTCN2018088987-appb-000241
探针188：
参照探针184的合成方法，产率32％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.30(d，1H，J＝16.4Hz)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.55(d，2H，J＝4.2Hz)，7.51(d，1H，J＝16.4Hz)，7.40(d，1H，J＝4.8)，7.29(d，1H，J＝4.8Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.09(d，1H，J＝4.4Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，6.35(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，2H)，3.70(s，3H)，2.75(s，3H)，2.60(s，3H)。
实施例189:
Figure PCTCN2018088987-appb-000242
探针189：
参照探针184的合成方法，产率30％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.90(d，2H，J＝4.4Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.48.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.75(s，3H)。
实施例190:
Figure PCTCN2018088987-appb-000243
探针190：
参照探针184的合成方法，产率30％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.95(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.60(d，2H，J＝4.4Hz)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.90(s，6H)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.75(s，3H)。
实施例191:
Figure PCTCN2018088987-appb-000244
探针191：
参照探针184的合成方法，产率32％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.75(s，3H)。
实施例192:
Figure PCTCN2018088987-appb-000245
探针192：
参照探针184的合成方法，产率32％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.75(s，3H)。
实施例193:
Figure PCTCN2018088987-appb-000246
探针193：
参照探针184的合成方法，产率31％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48(s，2H)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，3.61(s，12H)，2.75(s，3H)。
实施例194:
Figure PCTCN2018088987-appb-000247
探针194：
参照探针184的合成方法，产率30％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.10(s，1H)，7.92(s，1H)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.59(d，2H，J＝8.8H)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.56(d，2H，J＝8.8H)，6.48 (s，2H)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.75(s，3H)，2.75(s，3H)。
实施例195:
Figure PCTCN2018088987-appb-000248
探针195：
参照探针184的合成方法，产率29％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.72(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.98(dd，2H，J＝2.7 9.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.72(d，2H，J＝7.2Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.48.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.37(s，12H)，3.75(s，3H)，2.75(s，3H)，0.54(s，6H)。
实施例196:
Figure PCTCN2018088987-appb-000249
探针196：
参照探针184的合成方法，产率29％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.85(t，1H，J＝5.0Hz)，7.78(d，2H，J＝1.2Hz)，7.18(d，1H，J＝5.0Hz)，7.10(s，2H)，7.04(d，1H，J＝3.2Hz)，6.83(d，1H，J＝5.0Hz)，6.67(d，1H，J＝8.8Hz)，6.54(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，1H，J＝2.8Hz)，6.25(dd，1H，J＝2.4 8.8Hz)，4.15(s，3H)，4.00(d，1H，J＝5.0Hz)，3.84(s，3H)，3.77(t，4H，J＝8.0Hz)，3.75(s，3H)，3.19(s，6H)，2.90(t，4H，J＝8.0Hz)，2.75(s，3H)，0.54(s，6H)。
实施例197:
Figure PCTCN2018088987-appb-000250
探针197：
锌粉(0.130g，2.0mmol)于100ml三口烧瓶中，加入50ml无水四氢呋喃，加入少量碘单质，Ar保护条件下室温搅拌30分钟，加入化合物146(参照文献公开方法合成，Anne-Marie.R.Dechert et al.Bioorg.Med.Chem.2010.18.6230-6237.)(0.504g，1.0mmol)40℃油浴加热2小时，体系冷却至室温，注入化合物4(0.245g，1.0mmol)的5ml的无水四氢呋喃溶液，室温搅拌过夜，次日，加入3N的盐酸，室温搅拌30分钟，反应完毕，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物经反相柱分离得产物0.449g，产率 69％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.78(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，1H，J＝7.2Hz)，7.28(m，10H)，6.71(d，1H，J＝7.2Hz)，6.49(d，1H，J＝16.0Hz)，6.52(s，1H)，6.44(s，1H)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，3.9(s，2H)，3.41(t，4H，J＝8.2Hz)，3.07(dd，1H，J＝6.8 13.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)，1.21(d，6H，J＝8.2Hz)。
实施例198:
Figure PCTCN2018088987-appb-000251
探针198：
按照探针197的合成方法，产率71％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.81(s，1H)，7.82(d，1H，J＝16.0Hz)，7.47(dd，1H，J＝2.0，11.4Hz)，7.28(m，10H)，6.47(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(s，1H)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，3.9(s，2H)，3.07(dd，1H，J＝6.8 13.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)。
实施例199:
Figure PCTCN2018088987-appb-000252
探针199：
按照探针197的合成方法，产率71％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.51(d，2H，J＝4.2Hz)，7.28(m，10H)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，6.40(d，2H，J＝4.2Hz)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，3.9(s，2H)，3.07(dd，1H，J＝6.8 13.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，2.65(s，6H)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)。
实施例200:
Figure PCTCN2018088987-appb-000253
探针200：
化合物54(0.374g，1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入35ml无水二氯甲烷溶解，加入活性二氧化锰(0.348g，4.0mmol)，Ar保护条件下室温搅拌，反应完毕，过滤，滤液直接旋干溶剂，无需分离，直接用于下一步。
锌粉(0.130g，2.0mmol)于100ml三口烧瓶中，加入50ml无水四氢呋喃，加入少量碘单质，Ar保护条件下室温搅拌30分钟，加入化合物146(参照文献公开方法合成，Anne-Marie.R.Dechert et al.Bioorg.Med.Chem.2010.18.6230-6237.)(0.504g，1.0mmol)40℃油浴加热2小时，体系冷却至室温，注入上步的化合物的5ml的无水四氢呋喃溶液，室温搅拌过夜，次日，加入3N的盐酸，室温搅拌30分钟，反应完毕，过滤，旋转蒸干溶剂，残余物经反相柱分离得产物0.475g，产率61％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.01(d，1H，J＝16.0Hz)，7.79-7.82(m，4H)，7.72(d，2H，J＝4.4Hz)，7.44-7.47(m，6H)，7.28(m，10H)，6.83(d，2H，J＝4.4Hz)，6.48(d，1H，J＝16.0Hz)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，3.9(s，2H)，3.07(dd，1H，J＝6.8 13.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)。
实施例201:
Figure PCTCN2018088987-appb-000254
探针201：
参照探针200的合成方法，产率59％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(m，10H)，6.99(d，2H，J＝8.8Hz)，6.97(d，4H，J＝8.8Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.72(d，1H，J＝16.0Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，3.9(s，2H)，3.86(s，6H)，3.07(dd，1H，J＝6.8 13.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)。
实施例202:
Figure PCTCN2018088987-appb-000255
探针202：
参照探针200的合成方法，产率57％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.81(d，1H，J＝16.0Hz)，7.76(dd，2H，J＝1.0 3.6Hz)，7.51(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，7.28(m，10H)，7.15(dd，2H，J＝3.6 5.4Hz)，6.89(d，2H，J＝4.4Hz)，6.62(d，2H，J＝4.4Hz)，6.64(d，1H，J＝16.0Hz)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，3.9(s，2H)，3.07(dd，1H，J＝6.8 13.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.413.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)。
实施例203:
Figure PCTCN2018088987-appb-000256
探针203：
参照探针200的合成方法，产率57％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.83(d，1H，J＝16.0Hz)，7.28(m，10H)，7.18(d，2H，J＝4.2Hz)，6.83(d，1H，J＝16.0Hz)，6.30(d，2H，J＝4.2Hz)，5.42(s，2H)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，4.01(s，2H)，3.90(s，6H)，3.07(dd，1H，J＝6.813.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)。
实施例204:
Figure PCTCN2018088987-appb-000257
探针204：
参照探针200的合成方法，产率60％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.26(d，2H，J＝14.4H)8.01(d，1H，J＝9.2H)，7.68(d，1H，J＝9.2H)，7.49(t，2H，J＝8.0H)，7.46(d，2H，J＝7.6Hz)，7.38(t，2H，J＝7.6H)，7.33(d，2H，J＝8.4Hz)，7.28(m，10H)，7.22(bp，2H)，4.59(m，1H)，4.51(q，4H，J＝7.2Hz)，4.38(m，1H)，3.92(s，3H)，3.85(s，2H)，3.07(dd，1H，J＝6.813.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.81(s，6H)，1.60(m，3H)，1.56(t，6H，J＝7.2H)，1.36(m，2H)。
实施例205:
Figure PCTCN2018088987-appb-000258
探针205：
参照探针200的合成方法，产率60％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.1(s，1H)，10.28(s，2H)，10.25(s，1H)，10.17(d，2H，J＝4.4Hz)，9.46(d，2H，J＝4.4Hz)，9.39(d，2H，J＝4.4Hz)，9.36(d，2H，J＝4.4Hz)，8.01(d，1H，J＝8.8Hz)，7.8(d，1H，J＝8.8Hz)，7.28(m，10H)，4.53(m，1H)，4.38(m，1H)，3.9(s，2H)，3.07(dd，1H，J＝6.8 13.8Hz)，2.94(dd，1H，J＝8.4 13.8Hz)，2.86(t，2H，J＝7.2Hz)，1.87(m，1H)，1.60(m，3H)，1.36(m，2H)，-3.05(s，2H)。
实施例206：
Figure PCTCN2018088987-appb-000259
化合物147：
参照文献公开方法(L,Zhao et al.Adv.Funct.Mater.2014,24,363—371.)1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.34(d，J＝8.8Hz，1H)，6.55(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，6.46(d，J＝2.0Hz，1H)，5.93(s，1H)，3.20(t，J＝8.0Hz，4H)，2.33(s，3H)，1.56(m，4H)，1.28(m，20H)，0.88(m，6H)。
化合物148：
参照化合物4的合成方法，产率33％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝10.01(s，1H)，7.34(d，J＝8.8Hz，1H)，6.55(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，6.46(d，J＝2.0Hz，1H)，5.93(s，1H)，3.20(t，J＝8.0Hz，4H)，1.56(m，4H)，1.28(m，20H)，0.88(m，6H)。
化合物149：
参照化合物2的合成方法，产率79％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.81(d，J＝16.0Hz，1H)，7.36(d，J＝8.8Hz，1H)，7.01(d，J＝16.0Hz，1H)，6.59(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，6.42(d，J＝2.0Hz，1H)，5.91(s，1H)，3.23(t，J＝8.0Hz，4H)，1.55(m，4H)，1.28(m，20H)，0.88(m，6H)。
探针206：
参照探针1的合成方法，产率89％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.81(d，J＝16.0Hz，1H)，7.36(d，J＝8.8Hz，1H)，7.28(s，1H)，7.01(d，J＝16.0Hz，1H)，6.59(dd，J＝8.8，2.8Hz，1H)，6.64(s，2H)，6.42(d，J＝2.0Hz，1H)，5.91(s，1H)，4.12(t，J＝5.4Hz，2H)，3.87(s，6H)，3.70(s，2H)，3.30(t，J＝6.0Hz，2H)，3.23(t，J＝8.0Hz，4H)，2.08(m，2H)，1.55(m，4H)，1.28(m，20H)，0.88(m，6H)。
实施例207：
Figure PCTCN2018088987-appb-000260
化合物150：
参照文献公开方法(L，Y,Zhu.et al.J.AM.CHEM.SOC.2010,132,10645—10647.)，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.44(d，J＝8.8Hz,1H)，6.60(dd，J＝8.8，2Hz，1H)，6.47(s，1H)，6.10(s，1H)，5.64(s，1H)，4.67(s，2H)，4.16(s，2H)，3.47(q，J＝6.8Hz，2H)，1.12(t，J＝6.8Hz，3H)。
化合物151：
参照探针1的合成方法，产率77％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.45(d，J＝8.8Hz,1H)，6.61(dd，J＝8.8，2Hz，1H)，6.49(s，1H)，6.10(s，1H)，5.64(s，1H)，4.69(s，2H)，4.18(s， 2H)，3.68-3.55(m，56H)，3.50(t，J＝4.8Hz，2H)，3.49(q，J＝6.8Hz，2H)，3.24(s，3H)，2.87(t，J＝4.8Hz，2H)，1.12(t，J＝6.8Hz，3H)。
化合物152：
参照化合物25的合成方法，产率45％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.98(d，J＝16.0Hz，1H)，7.45(d，J＝8.8Hz,1H)，6.98(d，J＝16.0Hz，1H)，6.61(dd，J＝8.8，2Hz，1H)，6.49(s，1H)，6.10(s，1H)，5.64(s，1H)，4.18(s，2H)，3.68-3.55(m，56H)，3.50(t，J＝4.8Hz，2H)，3.49(q，J＝6.8Hz，2H)，3.24(s，3H)，2.87(t，J＝4.8Hz，2H)，1.12(t，J＝6.8Hz，3H)。
探针207：
参照探针1的合成方法，产率78％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.98(d，J＝16.0Hz，1H)，7.66(s，1H)，7.28(s，1H)，7.45(d，J＝8.8Hz,1H)，6.98(d，J＝16.0Hz，1H)，6.64(s，2H)，6.61(dd，J＝8.8，2Hz，1H)，6.49(s，1H)，6.10(s，1H)，5.64(s，1H)，4.18(s，2H)，4.12(t，J＝5.4Hz，2H)，3.86(s，6H)，3.70(s，2H)，3.68-3.55(m，56H)，3.50(t，J＝4.8Hz，2H)，3.49(q，J＝6.8Hz，2H)，3.30(t，J＝6.0Hz，2H)，3.24(s，3H)，2.87(t，J＝4.8Hz，2H)，2.08(m，2H),1.12(t，J＝6.8Hz，3H)。
实施例208：
Figure PCTCN2018088987-appb-000261
化合物153：
参照文献公开的方法(H,Volker.et al.Angew.Chem,Int,Ed,2005,44,7887—7891.)1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.47(d，J＝8.9Hz，1H)，6.56(dd，J＝9.0，2.4Hz，1H)，6.45(d，J＝2.4Hz，1H)，6.14(s，1H)，5.53(s，1H)，4.68(s，2H)，4.21(s，4H)。
化合物154：
参照探针1的合成方法，产率67％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝7.47(d，J＝8.9Hz，1H)，6.56(dd，J＝9.0，2.4Hz，1H)，6.45(d，J＝2.4Hz，1H)，6.14(s，1H)，5.53(s，1H)，4.68(s，2H)，4.21(s，4H)，3.56—3.61(m，48H)，3.51(t，J＝5.2Hz，4H)，3.21(s，6H)，2.87(t，J＝5.2Hz，4H)。
化合物155：
参照化合物25的合成方法，产率76％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.11(d，J＝16.0Hz，1H)，7.49(d，J＝8.9Hz，1H)，7.89(d，J＝16.0Hz，1H)，6.61(dd，J＝9.0，2.4Hz，1H)，6.49(d，J＝2.4Hz，1H)，6.14(s，1H)，5.53(s，1H)，4.21(s，4H)，3.56—3.61(m，48H)，3.51(t，J＝5.2Hz，4H)，3.21(s，6H)，2.87(t，J＝5.2Hz，4H)。
探针208：
按照探针1的合成方法，产率91％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.11(d，J＝16.0Hz，1H)，7.49(d，J＝8.9Hz，1H)，7.28(s，1H)，6.89(d，J＝16.0Hz，1H)，6.64(s，2H)，6.61(dd，J＝9.0，2.4Hz，1H)，6.49(d，J＝2.4Hz，1H)，6.14(s，1H)，5.53(s，1H)，4.21(s，4H)，4.12(t，J＝5.4Hz，2H)，3.86(s，6H)，3.70(s，2H)，3.56—3.61(m，48H)，3.51(t，J＝5.2Hz，4H)，3.30(t，J＝6.0Hz，2H)，3.21(s，6H)，2.87(t，J＝5.2Hz，4H)，2.08(m，2H)。
实施例209：
将探针加入含有巯基乙醇的PBS溶液中，配置为探针终浓度为2uM，巯基乙醇为10mM的混合溶液，将混合溶液至于37℃孵育72小时，相同条件下，未加巯基乙醇的探针溶液作为对比，同样置于37℃孵育72小时，使用荧光分光光度计检测样品荧光强度变化，结果如表1所示。
由表1中游离探针量子产率可知，通过乙烯基或乙烯基衍生物的引入，有效的淬灭了荧光团的荧光，使其自身本底荧光接近PBS缓冲液本底荧光水平，当与巯基乙醇加成后，由探针的量子产率可知，探针的荧光强度急剧增强，荧光激活倍数达几百倍到几千倍以上，并且亮度较高，说明本发明探针为加成激活型探针，具有很好的荧光开关的性质，而未加巯基乙醇的样品荧光没有变化，说明探针性质稳定。
综上可知：本发明探针性质稳定，具有良好的荧光分子开关的性质，并且结构灵活可控，波长方便可调。
实施例210：
将探针与对应的靶蛋白混合得混合样品，混合样品中的探针终浓度为2uM(其中，探针83-89加入2uM的氯化镍，探针90-110加入4uM的氯化镍，探针111-126加入2uM的氯化锌)，靶蛋白终浓度为5Um，其中，探针1-56对应于eDHFR(L28C)(C.R.Jing,V.W.Cornish.ACS Chem.Biol.2013,8,17104—1712.)，探针57-82对应于人的碳酸酐酶(hCAⅡ)(Yousuke Takaoka.et al.J.AM.CHEM.SOC.2006,128,3272—3280.)，探针83-110对应于改性HIS-tag(Shohei Uchinomiya.et al.Chem.Commun.,2013,49,5022—5024.)，探针111-126对应于D4-tag(Hiroshi Nonaka.et al.J.AM.CHEM.SOC.2007,129,15777—15779.)，探针127-140对应于生长因子(Caterina.Carmi.et al.J.Med.Chem.2012,55,2251—2264.)，探针141-155对应于蛋白BTK(Nora Liu.et al.Org.Biomol.Chem.,2015,13,5147—5157.)，探针156-183对应于蛋白JNK(T.H.Zhang.et al.Chemistry and Biology.2012,19,140—154.)探针184-196对应于蛋白PDI(Shili.Xu.et al.PNAS.2012,109,16348—16353.)，探针197-205对应于组蛋白酶(Leslie O.et al.ACS Chem.Biol.2015,10,1977—1988.)，将混合样品至于37℃孵育2小时，使用荧光分光光度计检测样品荧光强度变化，结果如表1所示。
由表1中的游离探针量子产率可知：本发明的探针以及探针未与靶蛋白结合时荧光极低，自身本底荧光接近PBS缓冲液本底荧光水平，当探针与靶蛋白结合后，由结合靶蛋白量子产率可知，探针的荧光强度急剧增强，荧光激活倍数达几百倍到几千倍以上，并且亮度较高，说明本发明的探针可与靶蛋白结合，并且荧光激活倍数高，具有很好的荧光开关的性质。
表1探针发射强度检测结果
Figure PCTCN2018088987-appb-000262
Figure PCTCN2018088987-appb-000263
Figure PCTCN2018088987-appb-000264
Figure PCTCN2018088987-appb-000265
Figure PCTCN2018088987-appb-000266
Figure PCTCN2018088987-appb-000267
Figure PCTCN2018088987-appb-000268
Figure PCTCN2018088987-appb-000269
下述实施例中，探针83—探针89使用时首先加入一倍当量的氯化镍，探针90—探针110使用时首先加入2倍当量氯化镍，探针111—探针126使用时首先加入一倍当量的氯化锌。
实施例211：
Hela细胞为例检测探针在哺乳动物细胞中的标记效果。将表达了蛋白标签的Hela细胞、未表达蛋白标签的Hela-WT细胞(Hela原始细胞)种植于14mm玻璃底96孔细胞培养板中。细胞铺板10小时后，将探针2、探针11、探针58、探针85、探针93、探针115、探针135、探针142、探针159、探针176、探针189、探针200分别加入至表达了蛋白标签的Hela细胞和未表达蛋白标签的Hela-WT细胞的培养基中并稀释至5μM。细胞置于37℃二氧化碳培养箱孵育2小时，使用Leica TPS-8共聚焦显微镜成像检测标记细胞荧光变化，结果如图1中(1)～(12)所示。图1B组结果显示加入上述探针后2h内在Hela-WT细胞中未能检测到相应的荧光信号，说明探针荧光不受细胞内亲核试剂的影响；而图1A组中表达了蛋白标签的Hela细胞可以检测到强烈的荧光信号，荧光信号增强200～610倍不等。
以上实验说明探针可以实现特异性标记细胞内蛋白标签，并且实现荧光特异性点亮，同时，探针荧光不受细胞内亲核试剂影响。
实施例212：
通过SDS-PAGE确定探针与蛋白形成共价结合，并通过活体成像仪确认探针标记于蛋白上并激活荧光。将探针2、探针11、探针58、探针85、探针93、探针115、探针135、探针142、探针159、探针176、探针189、探针200分别加入对应的蛋白中配制为探针最终浓度为2uM，对应蛋白最终浓度5uM，样品置于37℃孵育2小时，酶标仪检测样品荧光被激活，收集个样品，加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12000rpm离心10min，取上层清液，检测的样品进行SDS-PAGE鉴定，结果如图2中(1)～(12)所示。
从图2可以看到，以上探针荧光被激活，并且，与相应靶蛋白结合为共价结合。
实施例213：
将不同蛋白标签分别加入探针2、探针4、探针53、探针55、探针84、探针90、探针115、探针129、探针135的溶液中，各探针的浓度均为30uM，制得靶蛋白终浓度为0.1uM、0.5uM、0.7uM、1.2uM、4.5uM、8.1uM、13.1uM、14.8uM的混合样品溶液，将混合样品溶液置于37℃反应1小时，使用荧光分光光度计检测样品激发发射光谱变化，根据发射光谱强度绘制靶蛋白浓度与荧光强度关系图，结果分别如图3～图11所示。
从图3～～图11中可以看出，靶蛋白浓度在0.1uM～14.8uM的范围内与探针的荧光强度都具有较好的线性关系，因此，可以根据标准曲线对蛋白标签进行定量检测。
实施例214：
组织蛋白酶活性受多种因素的调节，因此，测定信使RNA和蛋白总量不能很好地反应蛋白的活性，为验证探针具有检测蛋白活性的功能，将0.1uM、0.5uM、0.75uM、1.5uM、4.5uM、7.5uM、10.0uM、12.5uM、15.0uM的探针197分别加入到50uM组织蛋白酶中，样品至于37℃孵育3小时，酶标仪检测样品荧光强度，根据样品荧光强度绘制荧光强度随探针浓度的关系图，结果如图12所示，荧光强度随探针的浓度增加呈线性变化，说明探针被蛋白全部激活，并在荧光强度范围内与荧光强度具有较好的线性关系。
将待测组织蛋白酶加入探针197，配置为探针197终浓度为30uM的样品溶液，将样品溶液至于37℃孵育3小时，酶标仪检测样品荧光强度，根据样品荧光强度和标准曲线得出活性蛋白浓度为3.75uM，经考马斯亮蓝法测定蛋白总浓度为5.0uM，从而得出该组蛋白酶中活性蛋白占蛋白总量的75％。
由以上实验可知，本发明探针可用于定量检测活性蛋白。
实施例215：
为验证探针2、探针27、探针48可以应用于标记不同细胞器定位的目标蛋白，以Hela细胞为例检测了探针标记不同亚细胞蛋白标签的效果。Hela细胞5000细胞每孔种植于96孔玻璃底细胞培养板中，14小时后使用lipo2000试剂盒转染eDHFR-L28C不同细胞器定位质粒；转染后24小时去除原有培养基，使用无酚红DMEM培养基清洗2次，使用含有0.2μM探针的无酚红培养基孵育细胞2小时，使用leica TCS-8共聚焦显微镜成像检测细胞标记效果。结果如图13显示，探针可以在免洗的情况下清晰展示多种亚细胞器结构，其中包括但不限于细胞核、溶酶体、线粒体、高尔基体、细胞骨架、内质网和细胞内膜。
以上结果说明的探针具有很好的特异性，可以作为细胞亚细胞器标记的有力工具。
实施例216：
人的B淋巴细胞为例检测探针在哺乳动物细胞中内源性蛋白的标记效果。人的B淋巴细胞内源性的表达Bruton酪氨酸激酶(BTK)，将人的B淋巴细胞种植于于14mm玻璃底96孔细胞培养板中，细胞密度3000/孔，培养12小时。将细胞分为A、B两组，A组细胞加入探针143加入细胞的培养基中并分别稀释至1Μm，细胞置于37℃二氧化碳培养箱孵育30分钟，B组细胞在加入探针143前首先加 入2uM依鲁替尼37℃二氧化碳培养箱孵育2小时，依鲁替尼是BTK的强效抑制剂，能够与BTK特异性结合，从而使BTK失去与探针143结合的能力，使用Leica TPS-8共聚焦显微镜成像检测标记细胞荧光变化。图14A组结果显示加入上述探针14B组细胞中荧光信号微弱，说明探针荧光不受细胞内亲核试剂的影响；而图14A组中人的B淋巴细胞可以检测到强烈的荧光信号，荧光信号增强85倍。
以上实验说明探针可以实现特异性标记细胞内非过量表达的内源性蛋白，并且实现荧光特异性点亮，同时，探针荧光不受细胞内亲核试剂影响。
实施例217：
首先，将表达eDHFR蛋白标签的质粒pcdna3.1-eDHFR-L28C(样品组)和对照质粒pcdna3.1-CAT导入小鼠体内。此方法是将质粒溶解在很大体积的溶液中通过尾静脉注射迅速注射入小鼠体内，小鼠肝脏和肾脏吸收DNA，进而表达目的蛋白。质粒注射后20小时，将溶于200ul PBS中的0.4μM探针27通过尾静脉注射方法注射到小鼠体内标记eDHFR靶蛋白；6小时后解剖小鼠，通过柯达多光谱活体成像系统检测不同小鼠样品肝脏部位荧光差异，结果如图15。图15A显示，注射探针27的对照质粒pcdna3.1-CAT的小鼠肝脏荧光很低，接近为未注射探针的空白肝脏的本底荧光水平，如图15C，而注射探针27的eDHFR质粒pcdna3.1-eDHFR-L28C的小鼠肝脏具有较强的荧光，如图15B，信号强度是对照组荧光的25倍。
以上实验说明探针的荧光不受动物内环境影响，可以应用于活体动物体内，且可以特异性标记表达在肝脏部位的eDHFR靶蛋白，并产生较强荧光信号。
实施例218：
为验证探针可以用于活体中蛋白标签的标记，以eDHFR-L28C为例，检测探针对斑马鱼表达蛋白的标记。将50ng/Ul eDHFR-L28C-mKate融合蛋白的表达质粒1nL注入斑马鱼的受精卵中(AB鱼动物极)，28℃培养48小时，出鱼后直接由尾静脉注射5nL 0.5mM的探针21，30分钟后，使用leica TCS-8共聚焦显微镜成像检测标记效果。结果如图16显示：16(2)为mKate荧光通道，说明蛋白成功表达；16(1)组为探针荧光通道，16B为未注射探针，并且没有荧光信号，16A为注射探针，荧光信号明显，荧光强度是未注射探针的55倍，并且与mKate荧光信号具有较好的重叠。
以上实验说明探针的荧光不受动物环境的影响，可以应用于活体动物体内，且可以特异性标记表达在体内的靶蛋白，并产生较强的荧光信号。
实施例219：
为验证实施例探针可以用于活体中天然蛋白的标记，以Hela细胞为例，检测探针对其生长因子的标记。将Hela(Hela原始细胞)种于裸鼠腋下，生长3周，至肿瘤直径0.5cm左右，将20uM探针140溶于350ul 20％DMSO的PBS溶液中，通过尾静脉注射入小鼠体内标记肿瘤中生长因子(EGFR)，通过柯达多光谱活体成像系统检测不同时间的小鼠肿瘤部位的荧光强度变化，结果如图17所示，未注射探针140前，小鼠肿瘤部位没有荧光，如图17A所示，注射0.3小时后，小鼠肿瘤部位荧光达到最大值，其他部位没有明显荧光信号，如图17B所示。
以上实验说明，探针不受动物体内环境的影响，可以用于活体动物体内快速标记，并且，无需对蛋白进行改造，可以直接用于标记活体内的天然蛋白。
实施例220：
通过定点突变技术，构建具有不同位点半胱氨酸eDHFR的突变体，验证结合口袋周围是否具有活性巯基，可以对探针进行加成并激活荧光性质，将探针共价结合于蛋白上，同时激活荧光。通过定点突变技术并结合蛋白晶体数据，分别获得eDHFR结合口袋周围的不同氨基酸突变类型：eDHFR-I50C、eDHFR-N18C、eDHFR-N23C、eDHFR-L28C(Z,X Chen.et al.J.Am.Chem.Soc.2012,134,13692-13699.)。 未含巯基的野生型蛋白(WT)、纯化后的eDHFR各个突变体蛋白(eDHFR-I50C、eDHFR-N18C、eDHFR-N23C、eDHFR-L28C)分别同相同浓度的探针2混匀孵育后，利用酶标仪检测样品的荧光变化，如图18所示。
实验结果显示，未含巯基的野生型蛋白荧光很低，接近于探针的缓冲溶液(buffer)的荧光，含有巯基的突变体蛋白都能够激活探针的荧光，说明探针与蛋白结合并发生了加成反应，而未含巯基的蛋白样品不能激活探针的荧光。
实施例221：
6his-cys-MBP作为载体蛋白，将his-tag与半胱氨酸(cys)之间加入不同个数的氨基酸作为连接体，并将其融合表达在MBP的N端，得到带有不同连接体的重组蛋白，6his-cys-MBP命名为F 0、cys-6his-MBP命名为F 1、6his-aa-cys-MBP命名为F 2、cys-1aa-6his-MBP命名为F 3、6his-2aa-cys-MBP命名为F 4、cys-2aa-6his-MBP命名为F 5、6his-3aa-cys-MBP命名为R 0、cys-3aa-6his-MBP命名为R 2、6his-4aa-cys-MBP命名为R 3、cys-4aa-6his-MBP命名为R 4、6his-5aa-cys-MBP命名为R 5、6his-MBP命名为6his，其中“Naa”表示将his-tag与半胱氨酸之间加入N个氨基酸。将探针90加入上述蛋白溶液中，制得最终探针浓度为2uM，蛋白浓度为5uM，37℃酶标仪进行荧光检测，结果如图19所示，具有巯基亲核试剂的突变体都可以和探针发生亲核加成反应而激活荧光，而不具有巯基的多肽(6his)不能够激活探针荧光。
实验结果显示，具有亲核基团的蛋白可以与探针发生特异性的结合，并且发生加成反应，从而激活探针荧光。

Claims (10)

  1. 一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括配体部分A、任选的连接体部分B、荧光染料部分C，所述荧光染料部分C为加成激活型荧光染料基团，包括荧光团D、任选的不饱和结构部分E、双键部分F，所述配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的基团。
  2. 根据权利要求1所述的荧光探针，其具有如式(I)所示的结构，
    Figure PCTCN2018088987-appb-100001
    其中：
    配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的配体基团、药物基团、小分子抑制剂基团或2-100个氨基酸组成的短肽类基团；
    连接体部分B为任选存在的基团，选自亚烷基、改性亚烷基、芳基、
    Figure PCTCN2018088987-appb-100002
    Figure PCTCN2018088987-appb-100003
    其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基；
    荧光染料部分C为式(I)中的式(I-a)所示结构部分，
    Figure PCTCN2018088987-appb-100004
    其中：
    双键部分F为式(I-a)中的式(I-a-1)所示结构部分，
    Figure PCTCN2018088987-appb-100005
    R 1、R 2、R 3各自独立地选自氢、卤原子、硝基、氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、亚磷酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、改性烷基、亚烷基或改性亚烷基；可选地，R 2和R 3相互连接，与碳原子一起形成脂环或脂杂环；
    不饱和结构部分E为任选存在的基团，其为如下式(I-b)所示的结构，为选自亚乙烯基或共轭亚烯基、亚乙炔基或共轭亚炔基、亚芳基、亚杂芳基中的至少一种，且其与D环共轭连接，并且与式(I-a-1)共轭连接，其中不饱和结构部分E所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100006
    荧光团D选自香豆素类基团、芘类基团、硼二吡咯甲川类基团、呫吨类基 团、花箐类基团、卟啉类基团；
    可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I-I)所示的结构，
    Figure PCTCN2018088987-appb-100007
    可选地，R 2与连接体部分B相互连接形成脂环或脂杂环；可选地，R 2与配体部分A相互连接形成脂环或脂杂环；
    可选地，式(I-a-1)结构为如下所示：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100008
    可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I-II)所示的结构
    Figure PCTCN2018088987-appb-100009
  3. 根据权利要求1或2所述的荧光探针，其特征在于：
    所述靶蛋白为提纯品、未提纯品或存在于细胞、组织或活体的原位状态，所述靶蛋白具有亲核基团；
    可选地，所述靶蛋白为二氢叶酸还原酶或其突变体、His-tag或其突变体、激酶或其突变体、组织蛋白酶(Cysteine cathepsins)或其突变体、碳酸酐酶或其突变体、FKBP12或其突变体；
    可选地，所述靶蛋白为突变的二氢叶酸还原酶L28C或W22C，或生长因子T790M；
    可选地，所述亲核基团选自：巯基、羟基、氨基、咪唑基、吡咯基；
    可选地，所述配体部分A选自甲氨基碟呤类基团、镍配体类基团、锌配体类基团、替尼类药物基团、短肽类基团、苯磺酰胺类基团、雷帕霉素类基团；
    可选地，所述配体部分A选自下式结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100010
    Figure PCTCN2018088987-appb-100011
    可选地，所述配体部分A选自下式结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100012
    可选地，所述连接体部分B选自：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100013
    其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基；
    可选地，所述连接体部分B不存在；
    可选地，所述不饱和结构部分E选自下式(I-1)～(I-9)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100014
    可选地，所述香豆素类基团的结构如式(II-I)所示：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100015
    其中，R 6-为X 0O-或N(X 1)(X 2)-，X 0、X 1、X 2各自独立地选自氢、烷基和改性烷基，可选地，X 1，X 2相互连接为饱和或不饱和的脂杂环；
    可选地，所述香豆素类基团中下式(II-I-i)所示的母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100016
    可选地，式(II-I-i)上的取代基与X 0、X 1或X 2相互连接形成饱和或不饱和脂杂环；
    所述芘类基团的结构如式(II-II)所示，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100017
    可选地，所述硼二吡咯甲川类基团的结构如式(II-III)所示，其中，R 7、R 8各自独立地选自卤原子、烷基、改性烷基；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100018
    其中，式(II-III)所示硼二吡咯甲川类基团中的下式(II-III-i)所示母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；
    可选地，式(II-III-i)上的取代基与R 7和/或R 8相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100019
    可选地，所述呫吨类基团的结构如式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)所示，其中：X 3、X 4、X 5、X 6、X 7各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；X 4、X 5、X 6、X 7任选相互连接为饱和或不饱和的脂杂环；L为阴离子；X选自O、CRaRb、SiRaRb、GeRaRb、SnRaRb、Se，其中Ra、Rb各自独立地选自氢、烷基和改性烷基，可选地，Ra、Rb相互连接为脂环或脂杂环；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100020
    Figure PCTCN2018088987-appb-100021
    其中，所述呫吨类基团中的下式(II-IV-i)所示母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；可选地，式(II-IV-i)上的取代基与X 4、X 5、X 6、X 7相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100022
    可选地，所述花箐类基团的结构如式(II-V-a)、(II-V-b)、(II-V-c)、(II-V-d)、(II-V-e)或(II-V-f)所示，其中：X、Y各自独立地选自S、O、CR cR d，其中R c、R d各自独立地选自氢、烷基、改性烷基X；1X 8、X 9各自独立地选自氢、X3烷基、改性烷基；L为阴离子；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100023
    其中，所述花箐类基团中的如下式(II-V-i)、(II-V-ii)或(II-V-iii)所示的母核结构中，所含的个氢原子任选独立地被选自亲水性基团、烷基、改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100024
    可选地，所述卟啉类基团的结构如式(II-VI-a)或(II-VI-b)所示，其中所含的各个氢原子任选独立地被选自烷基、改性烷基的取代基取代，所述取代基任选的相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；其中，M为金属离子；
    Figure PCTCN2018088987-appb-100025
  4. 根据权利要求2～3中任一项所述的荧光探针，其特征在于：
    所述烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的烷基；可选地，为C 1-C 10直链或支链烷基；可选地，为C 1-C 7直链或支链烷基；可选地，为C 1-C 5直链或支链烷基；可选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、3-乙基戊基或2,2,3-三甲基丁基；
    所述亚烷基为具有1～30个碳原子的饱和脂肪族直链或支链的亚烷基；可选地，为C 1-C 7直链或支链亚烷基；可选地，为C 1-C 5直链或支链亚烷基；
    所述改性烷基为烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-NO 2、-CN、-S-、-SO 2-、-(S＝O)-、
    Figure PCTCN2018088987-appb-100026
    芳基(优选苯基)、亚芳基(优选亚苯基)、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性烷基具有1～33个碳原子，可选地，所述改性烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
    所述改性亚烷基为亚烷基的任意碳原子被选自卤原子、-O-、-OH、-CO-、-NO 2、-CN、-S-、-SO 2-、-(S＝O)-、
    Figure PCTCN2018088987-appb-100027
    芳基(优选苯基)、亚芳基(优选亚苯基)、伯氨基、仲氨基、叔氨基、季铵盐基、饱和或不饱和的单环或双环亚环烃基、桥联脂杂环中的至少一种基团置换所得的基团，所述改性亚烷基具有1～30个碳原子，其碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳叁键置换；
    所述脂环为饱和或不饱和的3～10元单环或多环脂环；
    所述脂杂环为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的饱和或不饱和的3～10元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有S原子时，其任选为-S-、-SO-或-SO 2-；所述脂杂环任选被卤原子、硝基、烷基、芳基、亲水性基团和改性烷基取代；
    所述芳基、亚芳基或芳香环为5～10元芳香单环或芳香稠合双环；
    所述杂芳基、亚杂芳基或芳香杂环为环上含有选自N、O、S或Si中的至少一种杂原子的5～10元芳香单环或芳香稠合双环；
    所述卤原子各自独立地选自F、Cl、Br、I；
    所述亲水性基团为羟基、磺酸基、硫酸基、磷酸基、伯氨基、仲氨基或叔氨基，或它们的盐；
    所述单环亚环烃基为3～7元亚环烃基；
    所述双环亚环烃基为5～7元双环亚环烃基；
    所述桥联脂杂环为环上含有选自N、O、或S中的至少一种杂原子的5～20元桥联脂杂环；
    所述阴离子选自：Cl -、I -、Br -、SO 4 2-、ClO 4 -、PF 6 -；
    所述金属离子选自：Fe 3+、Fe 2+、Cu 2+、Mg 2+、Co 2+、Zn 2+、Ru 2+、Sn 2+；
    可选地，R 7、R 8各自独立地选自：卤原子、C 1～C 30烷基、C 1～C 30烷氧基、能包含水溶性基团的改性烷基；
    可选地，R 7、R 8为F，或一起构成-(CH 2CH 2O) n-，其中，n为1～10；
    可选地，R 7、R 8为甲氧基、甲氧乙炔基；
    可选地，式(II-III-i)中所含的各氢原子独立地被下式结构取代：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100028
    可选地，式(II-III-i)中所含的各氢原子独立地被下式结构取代：
    甲基、甲氧基、甲硫基、乙硫基
    Figure PCTCN2018088987-appb-100029
    Figure PCTCN2018088987-appb-100030
  5. 根据权利要求1～4中任一项所述的荧光探针，其特征在于：
    所述式(II-I)选自下式(II-I-1)～(II-I-6)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100031
    可选地，所述式(II-I)选自下式(II-I-7)～(II-I-18)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100032
    Figure PCTCN2018088987-appb-100033
    可选地，式(I)中含下式(I-c)结构，其选自式(II-I-19)～(II-I-30)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100034
    可选地，所述式(I-c)选自式(II-I-31)～(II-I-32)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100035
    所述式(II-III)选自下式(II-III-1)～(II-III-25)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100036
    可选地，所述式(II-III)选自下式(II-III-26)～(II-III-30)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100037
    可选地，所述式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)选自下式(II-IV-1)～(II-IV-41)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100038
    Figure PCTCN2018088987-appb-100039
    可选地，所述式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)选自下式(II-IV-42)～(II-IV-52)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100040
    可选地，所述(II-V-a)、(II-V-b)、(II-V-c)、(II-V-d)、(II-V-e)或(II-V-f)选自下式(II-V-1)～(II-V-14)中的结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100041
    Figure PCTCN2018088987-appb-100042
  6. 根据权利要求1～5中任一项所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针选自下式结构：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100043
    Figure PCTCN2018088987-appb-100044
    Figure PCTCN2018088987-appb-100045
    Figure PCTCN2018088987-appb-100046
    Figure PCTCN2018088987-appb-100047
    Figure PCTCN2018088987-appb-100048
    Figure PCTCN2018088987-appb-100049
    Figure PCTCN2018088987-appb-100050
    Figure PCTCN2018088987-appb-100051
    Figure PCTCN2018088987-appb-100052
  7. 制备权利要求1～6中任一项所述的荧光探针的方法，其特征在于，包括式(III)所示荧光染料与配体以及任选的连接体发生反应的步骤：
    Figure PCTCN2018088987-appb-100053
    其中，Y反应后能够与连接体基团或配体键合；可选地，Y选自羧酸基、酰氯基、活性酯、磺酸基、磺酰氯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、膦酸基。
  8. 一种荧光激活型蛋白特异性标记方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-6任一项所述的荧光探针与靶蛋白接触，所述荧光探针的配体部分与靶蛋白发生标记反应，将荧光探针标记到靶蛋白上；可选地，所述将荧光探针标记到靶蛋白上为共价标记；
    可选地，所述标记反应的反应介质选自纯蛋白溶液、细胞裂解液或靶蛋白所处在的原位介质；可选地，所述原位介质为细胞内介质、细胞器内介质、活体组织介质、血液或体液。
  9. 权利要求1-6任一项所述的荧光探针在蛋白荧光标记，蛋白的定量、检测、动力学、活性研究，以及细胞、组织、活体影像中的用途；可选地，所述蛋白包括eDHFR-I50C、eDHFR-N18C、eDHFR-N23C、eDHFR-L28C、6his-cys、cys-6his、6his-aa-cys、cys-1aa-6his、6his-2aa-cys、cys-2aa-6hi、6his-3aa-cys、cys-3aa-6his、6his-4aa-cys、cys-4aa-6his、6his-5aa-cys。
  10. 一种探针试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-6任一项所述的荧光探针；
    可选地，所述探针试剂盒还包含生物相容性介质；可选地，所述生物相容性介质选自二甲基亚砜、缓冲剂、生理盐水中的至少一种；可选地，所述缓冲剂包括磷酸盐缓冲液。
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