CN112876392B - 一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针及其制备方法和应用，涉及荧光探针技术领域。该近红外荧光探针的结构为：
其制备方法包括将第一原料与第二原料反应制得。本申请的近红外荧光探针的异硫氰酸酯基团可以与Cys发生特异性反应的，释放出胺类产物和H2S，其中，胺类产物具有较强的荧光强度，可以显示近红外荧光探针与Cys发生特异性反应。该近红外荧光探针具有Cys传感特性、灵敏度高、细胞毒性低等优点，TMN‑NCS在检测生命系统中的半胱氨酸方面具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，具体而言，涉及一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
半胱氨酸(Cys)作为含有硫醇结构的氨基酸，是一种还原剂或抗氧化剂，对自由基有着较好的清除作用。Cys在许多病理事件和生物过程中起着重要作用，如参与蛋白质合成，通过调节活性氧(ROS)稳态发挥细胞保护作用。此外，Cys浓度异常也是人类某些疾病的表现，Cys浓度已被用作多种疾病的诊断指标。因此，研究一种简单有效的选择性检测生命系统中Cys的策略具有重要的生理意义。
在过去的二十年中，许多检测半胱氨酸方法已经被建立起来。在众多的方法中，小分子探针荧光成像技术的应用已被证明是一种不可或缺或理想的方法。这是因为荧光探针具有操作简单、生物相容性好、灵敏度高、成本低等明显的实用优势。目前，构建具有Cys特异性识别位点的荧光探针已被用于设计合成选择性检测Cys。例如，基于Michael加成的丙烯酸酯结构的环化反应、与醛的环化反应、二硫键交换反应和亲核取代反应等。但是同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在反应性和结构上与Cys具有相似的特征，用这些探针对Hcy和GSH中的Cys进行选择性分析存在一些缺陷。为了避免Hcy和GSH的干扰，需要建立新的选择性鉴别Cys方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针，其Cys传感特性佳、灵敏度高、细胞毒性低。
本发明的第二目的在于提供一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法，该制备方法简单，容易实施。
本发明的第三目的在于提供一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针在半胱氨酸检测中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针，所述近红外荧光探针的结构为：
其中，R1、R2、R3和R4独立地选自OCH3、CH3、H、OH或N(CH3)2。
第二方面，本发明提供一种如前述实施方式所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法，其是由第一原料与第二原料反应制得，所述第一原料的结构式为
所述第二原料的结构式为：
其中，R1、R2、R3和R4独立地选自OCH3、CH3、H、OH或N(CH3)2。
在可选的实施方式中，所述第一原料与所述第二原料的摩尔比为1:1-2。
在可选的实施方式中，所述第一原料与所述第二原料在含有催化剂的无水DMF中进行反应。
在可选的实施方式中，先将所述第一原料溶解于所述含有三乙胺的无水DMF中，逐滴添加所述第二原料，反应2-3h得反应混合物；将反应混合物倒入水中，并调节pH至7-8，过滤并收集固体产物，对所述固体产物进行纯化；
优选地，所述催化剂包括三乙胺、二异丙基乙胺、哌啶和吡啶中的一种或多种；
优选地，采用稀盐酸、稀硝酸、稀硫酸、氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种或多种来调节pH。
在本申请的其他实施方式中，所述第二原料在保护气氛下加入；
优选地，所述保护气氛包括氮气、二氧化碳、氢气、氦气和氩气中的至少一种。
第三方面，本发明提供前述实施方式所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针在半胱氨酸检测中的应用。
在可选的实施方式中，所述近红外荧光探针中的异硫氰酸酯基团作为半胱氨酸的反应位点。
在可选的实施方式中，检测时所需的激发波长范围在400-500nm，荧光发射波长范围为575-780nm。
在可选的实施方式中，所述近红外荧光探针应用于细胞内半胱氨酸的荧光成像或浓度检测，非疾病诊断和治疗目的。
本发明具有以下有益效果：
本申请通过提供一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针，该近红外荧光探针的异硫氰酸酯基团可以与Cys发生特异性反应，释放出胺类产物和H2S，其中，胺类产物具有较强的荧光强度，可以显示近红外荧光探针与Cys发生特异性反应。经实验表明，本申请提供的近红外荧光探针具有Cys传感特性、灵敏度高、细胞毒性低等优点，TMN-NCS在检测生命系统中的半胱氨酸方面具有潜在的应用前景。此外，本申请提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法简单，操作条件容易实施，适合推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例1提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的1HNMR图；
图2为本申请实施例1提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的13CNMR图；
图3为本申请实施例1提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针与Cys反应前后的吸收光谱和荧光光谱变化图；
图4为本申请实施例1提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针与不同浓度的Cys反应后的荧光信号增强图谱；
图5为本申请实施例1提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的选择性图；
图6为本申请实施例1提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的抗干扰图；
图7为本申请实施例1提供的不同浓度的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针在HepG2细胞中孵育24h后HepG2细胞存活率的示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请提供了一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针，其结构为：
其中，R1、R2、R3和R4独立地选自OCH3、CH3、H、OH或N(CH3)2。
本申请提供的近红外荧光探针的结构中具有异硫氰酸酯基团，异硫氰酸酯是一类重要的抗真菌和抗癌化合物，广泛分布于十字花科蔬菜中。经发明人研究发现，异硫氰酸酯基团能与Cys发生特异性反应，具体响应机理(以R1、R2、R3和R4取代基均为H时的化合物为例)如下：
从上述机理可以看出，异硫氰酸酯基团能与Cys发生特异性反应，释放出胺类产物和H2S。该胺类产物具有较强的荧光强度，可以显示近红外荧光探针与Cys发生特异性反应。
本申请提供的近红外荧光探针是一种具有红光发射波长的新型荧光探针。其对Cys具有优异的选择性，且与Cys反应后荧光强度明显，抗干扰性能佳，且具有传感特性、灵敏度高、细胞毒性低等优点，TMN-NCS在检测生命系统中的半胱氨酸方面具有潜在的应用前景。
本申请提供的具有上述结构的近红外荧光探针，其相较于其他NCS结构的化合物而言，其合成简单，产率高等优点，更适合工业生产和应用。
进一步地，本申请还提供了上述近红外荧光探针的制备方法，其合成路线为：
其中，R1、R2、R3和R4独立地选自OCH3、CH3、H、OH或N(CH3)2。
具体操作步骤如下：
(1)制备第一原料
以第一原料的R1、R2、R3和R4取代基均为H时的化合物为例，其结构式为：
本文中定义其名称为TMN-NH2，其中文名：(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈(按照文献制备：Tetrahedron Letters,2020,61,151963)。
(2)制备近红外荧光探针(TMN-NCS)
将TMN-NH2与第二原料(1,1’-硫代羰基二咪唑)反应制得近红外荧光探针(TMN-NCS)。TMN-NH2与1,1’-硫代羰基二咪唑在含有催化剂的无水DMF中进行反应。具体来说，先将TMN-NH2溶解于含有催化剂的无水DMF中，在保护气氛下逐滴添加1,1’-硫代羰基二咪唑，反应2-3h得反应混合物；将反应混合物倒入水中淬灭反应，并调节pH至7-8，过滤并收集固体产物，对固体产物采用柱层析进行纯化。
本申请中，TMN-NH2与1,1’-硫代羰基二咪唑的摩尔比为1:1-2。通过逐滴添加1,1’-硫代羰基二咪唑，可以使得TMN-NH2充分与1,1’-硫代羰基二咪唑进行反应，反应完全后，通过加水可以使得多余的1,1’-硫代羰基二咪唑溶于水并分解，避免1,1’-硫代羰基二咪唑影响终产物。
优选地，催化剂包括但不限于三乙胺、二异丙基乙胺、哌啶和吡啶中的一种或多种，采用稀盐酸、稀硝酸、稀硫酸、氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种或多种来调节pH。保护气氛包括但不限于氮气、二氧化碳、氢气、氦气和氩气中的至少一种。本申请中，采用保护气氛有利于避免反应过程发生氧化。本申请提供的制备方法简单，容易实施。
进一步地，上述基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针可以广泛应用于半胱氨酸检测中。
具体来说，本申请中，可以将近红外荧光探针应用于细胞内半胱氨酸的荧光成像或浓度检测，非疾病诊断和治疗目的。
其中，近红外荧光探针中的异硫氰酸酯基团作为半胱氨酸的反应位点，对Cys进行特应性检测，检测时所需的激发波长范围在400-500nm，荧光发射波长范围为575-780nm。
此外，申请人推测具有如下以下结构的化合物1-5也可作为近红外荧光探针：
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针，其结构式为：
其制备方法包括如下步骤：
在圆底烧瓶中，将0.29g的TMN-NH2溶解于15mL含三乙胺的无水DMF中。通过搅拌溶解固体后，在氮气气氛下，逐滴添加1,1’-硫代羰基二咪唑0.22g的溶解于干燥DMF中的溶液。2小时后，将反应混合物倒入去离子水中，并用稀HCl将pH调节至7–8。过滤并收集固体产物，通过柱层析进一步纯化，得到黄色粉末状TMN-NCS0.28 g(收率为87％)。
请参阅图1和图2，结构表征：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.24(d,J＝8.6Hz,2H),6.99(d，J＝16Hz,1H),6.98(d，J＝16Hz,1H),6.86(s,1H),2.61(s,2H),2.46(s,2H),1.09(s,6H)。
13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ169.01,153.10,135.10,134.65,132.08,130.19,128.57,126.40,124.25,113.32,112.56,79.38,42.94,39.15,32.04,28.01。
实验例1
实施方法：室温下，取3mL含有30％DMSO的PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4；v/v)溶液置于比色皿中，加入探针TMN-NCS和Cys，使其终浓度分别为10μM和100μM)。分别测出与Cys反应前后的光谱数据。在荧光光谱测量中，激发波长为450nm，收集575-780nm的发射波长(请参阅图3)。
从图3可以看出，近红外荧光探针在与Cys反应前后，其产生吸光度的波长发生了变化，同时，在近红外荧光探针与Cys反应前，并无明显荧光强度，而在近红外荧光探针与Cys反应后出现了明显的荧光强度，充分说明，本申请提供的近红外荧光探针可以与Cys反应并显示出荧光。
进一步的，本实验例还考察了探针TMN-NCS(10μM)与不同浓度的Cys(0、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200μM)作用后的光谱数据。
从图4可以看出，探针TMN-NCS与Cys的荧光信号增强强度随着Cys浓度的增加而增强。
实验例2
选择性高低是决定荧光探针性能的重要条件，本申请还针对近红外荧光探针TMN-NCS对Cys以及其他常见物质的选择性实验。
实验方法：室温下，取3mL含有30％DMSO的PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4；v/v)溶液置于比色皿中，加入探针TMN-NCS，使其终浓度为10μM分别，然后加入各种终浓度为500μM的分析物质(1.Ala；2.Arg；3.Asn；4.Asp；5.Gln；6.Gly；7.Glu；8.Ile；9.His；10.Leu；11.Met；12.Lys；13.Phe；14.Pro；15.Ser；16.Thr；17.Trp；18.Tyr；19.Val；20.KI；21.MgSO4；22.NaBr；23.NaCl；24.NaF；25.CaCl2；26.GSH；27.Hcy；28.NaHS；29.Cys)。其中，在检测抗干扰时，在添加分析物质1-28时，同时添加Cys。以激发波长为450nm，收集575-780nm的发射波长。
从图5的选择性图可以看出，本申请提供的近红外荧光探针TMN-NCS对Cys的选择性明显高于其他分析物质。从图6的抗干扰图可以看出，本申请的提供的近红外荧光探针TMN-NCS可以有效避免其他分析物质的干扰，具有较强的选择性。
实验例3
细胞毒性实验
将不同浓度的TMN-NCS分别在HepG2细胞中孵育24小时后，MTT法测HepG2细胞存活率。
从图7可以看出，孵育24h后，HepG2细胞的存活率高，说明本申请提供的近红外荧光探针TMN-NCS细胞毒性低，在检测生命系统中的半胱氨酸方面具有潜在的应用前景。
综上所述，本申请通过提供一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针，该近红外荧光探针的异硫氰酸酯基团可以与Cys发生特异性反应，释放出胺类产物和H2S，其中，胺类产物具有较强的荧光强度，可以显示近红外荧光探针与Cys发生特异性反应。经实验表明，本申请提供的近红外荧光探针具有Cys传感特性、灵敏度高、细胞毒性低等优点，TMN-NCS在检测生命系统中的半胱氨酸方面具有潜在的应用前景。此外，本申请提供的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法简单，操作条件容易实施，适合推广。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针的结构为：
其中，R1、R2、R3和R4独立地选自OCH3、CH3、H、OH或N(CH3)2。
2.一种如权利要求1所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，其是由第一原料和第二原料反应制得，所述第一原料的结构式为
所述第二原料的结构式为：
其中，R1、R2、R3和R4独立地选自OCH3、CH3、H、OH或N(CH3)2。
3.根据权利要求2所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第一原料与所述第二原料的摩尔比为1:1-2。
4.根据权利要求2所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第一原料与所述第二原料在含有催化剂的无水DMF中进行反应。
5.根据权利要求4所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，先将所述第一原料溶解于所述含有催化剂的无水DMF中，逐滴添加所述第二原料，反应2-3h得反应混合物；将所述反应混合物倒入水中，并调节pH至7-8，过滤并收集固体产物，对所述固体产物进行纯化；
所述催化剂包括三乙胺、二异丙基乙胺、哌啶和吡啶中的一种或多种；
采用稀盐酸、稀硝酸、稀硫酸、氢氧化钠和碳酸氢钠中的一种或多种来调节pH。
6.根据权利要求5所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第二原料在保护气氛下加入；
所述保护气氛包括氮气、二氧化碳、氢气、氦气和氩气中的至少一种。
7.权利要求1所述的基于异硫氰酸酯结构特异性检测半胱氨酸的近红外荧光探针在半胱氨酸检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述近红外荧光探针中的异硫氰酸酯基团作为半胱氨酸的反应位点。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测时所需的激发波长范围在400-500nm，荧光发射波长范围为575-780nm。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述近红外荧光探针应用于细胞内半胱氨酸的荧光成像或浓度检测，非疾病诊断和治疗目的。
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