CN116143719B - 一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物及其制备方法和应用，其化学结构式如通式(I)所示：其中，R1、R2、R3分别独立选自H、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的基团。本发明以对甲氧基苯硫酚和试卤灵为原料，使用一步合成的方法来制备用于检测ONOO‑的荧光探针，合成方法简单。本发明的荧光探针能够实现对ONOO‑高灵敏的专一检测，不受其他物质干扰，能够应用于RAW264.7细胞内源性ONOO‑成像。
Description
技术领域
本发明涉及化学传感器技术领域，具体涉及一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
帕金森病(PD)作为一种常见的神经退行性疾病，主要是由黑质(SN)区域中多巴胺能(DA)神经元的明显缺乏引起。尽管PD中多巴胺能神经元退行性变的机制尚不完全清楚，但已有证据表明，过量产生的活性氧/氮(ROS/RNS)的神经毒性可能导致多巴胺能神经元缺陷。因此，研究氧化应激的神经毒性对了解PD的病理和早期诊断至关重要。
过氧亚硝酸根(ONOO-)作为活性氧/氮物种(ROS/RNS)的一种，具有较高的氧化和硝化能力。ONOO-由活细胞内一氧化氮(NO)与O2 ·-通过扩散控制反应产生，对入侵的病原体或微生物具有保护作用。但当其浓度异常会引起细胞内氧化应激、炎症和免疫反应，并通过各种信号途径触发细胞凋亡，这与许多病理后果相关。大量研究表明，ONOO-在PD发病机制中起着关键作用。过量产生的ONOO-被认为可能导致PD中的氧化应激和神经退行性变，这使其成为PD早期诊断的潜在生物标志物。因此，开发关于ONOO-的荧光探针并对其进行实时监测，不仅对了解PD中ONOO-的病理生理作用很重要，而且对PD的早期诊断和治疗也具有重大意义。
试卤灵作为一种性能优异的荧光团，其结构式如下所示：
试卤灵具有较长的吸收/发射波长、光稳定性好、荧光量子产率高、生物相容性好等优点，经常被用于开发荧光和比色分析的响应探针。人们通常通过对试卤灵的7-羟基进行取代或对中位N原子的取代来阻断荧光信号，被广泛用于开发具有低背景荧光信号的新型探针，但以此设计的荧光探针一般水溶性都较差，且容易受到其他活性氧、生物硫醇及金属离子的干扰，影响其对过氧亚硝酸根检测的灵敏度和选择性。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物及其制备方法和应用。本发明利用试卤灵在硫醇存在时不稳定的化学性质来构建以试卤灵为母体的荧光探针，该荧光探针具有较好的水溶性，不需要引入其他助溶剂，能够灵敏、快速检测活细胞中与PD相关的过氧亚硝酸根(ONOO-)。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其化学结构式如通式(I)所示：
其中，R1、R2、R3分别独立选自H、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的基团：
进一步，当R1、R2、R3中的任一个独立选自式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的基团时，另外两个均为H。
进一步，具体为如下化合物中的一种：
发明提供一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将硫光气溶于三氯甲烷中，在冰水浴(0～4℃)下加入对甲氧基苯硫酚的氢氧化钠水溶液，室温搅拌反应，然后加入试卤灵的DMF溶液，在室温下搅拌反应，反应完成后，得到化合物RSF-1和化合物RSF-2；或者，将试卤灵和碳酸钠加入DMF中，室温搅拌反应，然后在冰水浴(0～4℃)下加入对甲氧基苯硫酚，在室温下搅拌反应，反应完成后，得到化合物RSF-1。
本发明通过一步合成的方法得到以试卤灵为母体，对甲氧基苯硫酚为ONOO-识别基团的试卤灵类衍生物，且化合物RSF-2对ONOO-的检测具有高灵敏和专一选择，可通过荧光响应实现对巨噬细胞内ONOO-检测的可视化，并为活体成像的发展奠定了基础。
进一步，对甲氧基苯硫酚、试卤灵与硫光气的摩尔比为1.5：1～1.5：2.5～3.5。
进一步，对甲氧基苯硫酚、试卤灵与碳酸钠的摩尔比为1.5：1～1.5：8～10。
发明提供一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物在制备细胞中检测过氧亚硝酸根试剂中的应用。
本发明提供一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物作为荧光探针在对细胞内过氧亚硝酸根的荧光成像中的应用。
本发明提供一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物作为荧光探针在对细胞内过氧亚硝酸根的定量荧光检测中的应用。
本发明所提供的化合物RSF-2可应用于细胞荧光成像，同时也可应用于ONOO-的定量荧光检测。
本发明的有益效果：
1、本发明以对甲氧基苯硫酚和试卤灵为原料，使用一步合成的方法来制备用于检测ONOO-的荧光探针，合成方法简单。
2、本发明的荧光探针能够实现对ONOO-高灵敏的专一检测，不受其他物质干扰，能够应用于RAW264.7细胞内源性ONOO-成像。
3、本发明化合物RSF-2可实现对过氧亚硝酸根的高灵敏度与高选择性检测，有效避免其他活性氧、生物硫醇及金属离子的干扰。
4、本发明利用过氧亚硝酸根的高亲核性与高氧化性实现对对甲氧基苯硫酚的快速氧化，实现荧光的开启，能够应用于对巨噬细胞内过氧亚硝酸根的检测，为关于ONOO-探针的开发拓宽了新的道路。
附图说明
图1为化合物RSF-1与化合物RSF-2的反应方程式。
图2为化合物RSF-1的1H-NMR谱图。
图3为化合物RSF-2的1H-NMR谱图。
图4为化合物RSF-1与不同浓度ONOO-反应的荧光光谱图。
图5为化合物RSF-2与不同浓度ONOO-反应的荧光光谱图。
图6为化合物RSF-1在不同pH的缓冲溶液中对ONOO-检测的荧光光谱图。
图7为化合物RSF-2在不同pH的缓冲溶液中对ONOO-检测的荧光光谱图。
图8为化合物RSF-1在不同分析物中开启响应的荧光光谱图。
图9为化合物RSF-2在不同分析物中开启响应的荧光光谱图。
图10为化合物RSF-1和化合物RSF-2的性质对比图。
图11为化合物RSF-2的细胞毒性研究结果图。
图12为化合物RSF-2的细胞成像研究结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其结构式如下所示：
具体制备过程(见图1)为：将50mg(即0.24mmol)试卤灵和254mg(即2.39mmol)Na2CO3用5mL DMF溶解，室温搅拌15min；然后在冰浴(0～4℃)条件下，加入45μL(即0.36mmol)对甲氧基苯硫酚，再缓慢恢复至室温，搅拌1h后；将反应液调节pH至7，用DCM萃取，饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩后，粗产物经硅胶柱层析纯化，纯化采用的洗脱剂为DCM/EA＝30/1，得到红棕色固体粉末，记为RSF-1。
采用核磁共振光谱对RSF-1进行表征(见图2)：
1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ＝7.56(d,J＝8.8Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.15(d,J＝8.8Hz,2H),6.88(dd,J1＝8.8Hz,J2＝2.4Hz,1H),6.81(d,J＝2.4Hz,1H),6.37(s,1H),6.27(s,1H),3.86(s,3H)。
实施例2
用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其结构式如下所示：
具体制备过程(见图1)为：将0.3mmol试卤灵和2.16mmol Na2CO3用5mL DMF溶解，室温搅拌15min；然后在冰浴(0～4℃)条件下，加入45μL(即0.36mmol)对甲氧基苯硫酚，再缓慢恢复至室温，搅拌1h后；将反应液调节pH至7，用DCM萃取，饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩后，粗产物经硅胶柱层析纯化，纯化采用的洗脱剂为DCM/EA＝30/1，得到红棕色固体粉末，记为RSF-1。
实施例3
用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其结构式如下所示：
具体制备过程(见图1)为：将0.36mmol试卤灵和1.92mmol Na2CO3用5mL DMF溶解，室温搅拌15min；然后在冰浴(0～4℃)条件下，加入45μL(即0.36mmol)对甲氧基苯硫酚，再缓慢恢复至室温，搅拌1h后；将反应液调节pH至7，用DCM萃取，饱和食盐水洗涤有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩后，粗产物经硅胶柱层析纯化，纯化采用的洗脱剂为DCM/EA＝30/1，得到红棕色固体粉末，记为RSF-1。
实施例4
用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其结构式如下所示：
具体制备过程(见图1)为：将54μL(即0.72mmol)硫光气用2mL氯仿溶解，然后在冰浴(0～4℃)下缓慢加入44μL(即0.35mmol)对甲氧基苯硫酚的5％NaOH水溶液，恢复至室温后搅拌30min；无需后处理，直接向上述反应液中缓慢加入50mg(即0.24mmol)试卤灵的5mLDMF溶液，室温搅拌12h；反应液用EA(乙酸乙酯)萃取，无水Na2SO4干燥，浓缩后，粗产物经硅胶柱层析纯化，纯化采用的洗脱剂为DCM/EA＝30/1，得到红棕色固体粉末，记为RSF-1；洗脱剂为DCM/EA＝5/1，得到靛蓝色固体粉末，记为RSF-2。
采用核磁共振光谱对RSF-2进行表征(见图3)：
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.64(d,J＝9.2Hz,1H),7.53(d,J＝8.8Hz,2H),7.14(d,J＝8.8Hz,2H),6.84(dd,J1＝9.2Hz,J2＝2.4Hz,1H),6.62(bs,1H),6.17(bs,1H),5.69(bs,1H),3.84(s,3H)。
实施例5
用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其结构式如下所示：
具体制备过程(见图1)为：将即0.58mmol硫光气用2mL氯仿溶解，然后在冰浴(0～4℃)下缓慢加入44μL(即0.35mmol)对甲氧基苯硫酚的5％NaOH水溶液，恢复至室温后搅拌30min；无需后处理，直接向上述反应液中缓慢加入0.35mmol试卤灵的5mL DMF溶液，室温搅拌12h；反应液用EA(乙酸乙酯)萃取，无水Na2SO4干燥，浓缩后，粗产物经硅胶柱层析纯化，纯化采用的洗脱剂为DCM/EA＝30/1，得到红棕色固体粉末，记为RSF-1；洗脱剂为DCM/EA＝5/1，得到靛蓝色固体粉末，记为RSF-2。
实施例6
用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其结构式如下所示：
具体制备过程(见图1)为：将即0.82mmol硫光气用2mL氯仿溶解，然后在冰浴(0～4℃)下缓慢加入44μL(即0.35mmol)对甲氧基苯硫酚的5％NaOH水溶液，恢复至室温后搅拌30min；无需后处理，直接向上述反应液中缓慢加入0.3mmol试卤灵的5mL DMF溶液，室温搅拌12h；反应液用EA(乙酸乙酯)萃取，无水Na2SO4干燥，浓缩后，粗产物经硅胶柱层析纯化，纯化采用的洗脱剂为DCM/EA＝30/1，得到红棕色固体粉末，记为RSF-1；洗脱剂为DCM/EA＝5/1，得到靛蓝色固体粉末，记为RSF-2。
下面以本发明实施例4所提供的RSF-2为例，对其光谱性能进行具体验证。
在10mL比色管中加入12.5μLRSF-2储备液(2mM in DMSO)，0.5mLPBS(pH＝7.4)，用去离子水定容至5mL，向其中分别加入0-5μM的ONOO-，充分摇匀后测定其荧光光谱，见图5。
如图5所示，在测试条件下RSF-2的水溶液呈现微弱的荧光，当在体系中加入不同浓度的ONOO-后，随着ONOO-浓度的增加，在586nm处的荧光强度逐渐增强，荧光强度升高约17倍，溶液荧光强度与ONOO-浓度在0-3.6μM范围内成线性相关，检出限为2.6nM(DL＝3σ/k,S/N＝3)。
如图7所示，探究不同pH对RSF-2与ONOO-反应荧光强度的影响。由图7结果可以发现，RSF-2在不同pH条件下的荧光光谱几乎没有变化，当向体系加入ONOO-后，荧光信号在pH6.6-8.0的范围内得到了很好的开启。因此，在生理条件下(pH＝7.4)，RSF-2能够实现对ONOO-快速检测。
为进一步探究RSF-2对ONOO-检测的专一选择性，如图9所示，当向RSF-2探针溶液中加入ONOO-后，检测体系的荧光光谱发生了明显的变化，而其他相关的生物活性物质，如常见的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，包括·OH、O2 ·-、TBHP、NO、H2O2、TBO·、1O2和ClO-，以及金属阳离子(K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+)和一些氨基酸(Cys、Hcy、GSH、His)在相同反应条件下荧光光谱的变化几乎可以忽略不计，结果表明探针RSF-2对ONOO-具有很高的选择性。
RSF-1与RSF-2保持相同的测试条件。RSF-1对ONOO-具有较宽的线性范围(如图4所示)；与ONOO-在pH6.6–7.4的范围内有较好的光谱响应(如图6所示)；且RSF-1能够实现对ONOO-、ClO-以及1O2荧光的开启(如图8所示)。
经上述光谱性质探究发现RSF-2与RSF-1相比具有很好的选择性与灵敏度(如图10所示)，因此选择探针RSF-2应用于细胞成像研究。
在进行细胞成像之前，首先采用MTT实验对RSF-2的细胞毒性进行了研究。如图11所示，探针RSF-2在0-50μM的浓度范围内，RAW264.7细胞的存活率几乎都在84％以上，具有较低的细胞毒性。
为进一步确定RSF-2对活细胞中ONOO-的成像情况，如图12所示，将RAW264.7细胞分为三组进行实验。
第一组作为对照组，RAW264.7细胞与RSF-2(10μM)孵育30min进行成像，细胞产生微弱的红色荧光，可能是由内源性ONOO-造成的。
第二组用LPS和PMA刺激RAW264.7细胞产生ONOO-；RAW264.7细胞先与LPS(1μg/mL)孵育4h，PMA(1μg/mL)孵育30min，再与RSF-2(10μM)孵育30min后进行成像，可观察到细胞内红通道荧光强度显著增强。
第三组先将RAW264.7细胞与UA(100μM，ONOO-清除剂)孵育1h，然后与LPS(1μg/mL)孵育4h，PMA(1μg/mL)孵育30min，再与RSF-2(10μM)孵育30min后进行成像。显然，加入ONOO-的清除剂UA后，与第二组相比，第三组的细胞的红色荧光强度稍弱。
以上实验结果表明，RSF-2可用于细胞内ONOO-的成像分析。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物，其特征在于，具体为如下化合物中的一种：
2.一种权利要求1所述的用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将硫光气溶于三氯甲烷中，在冰水浴下加入对甲氧基苯硫酚的氢氧化钠水溶液，室温搅拌反应，然后加入试卤灵的DMF溶液，在室温下搅拌反应，反应完成后，得到化合物RSF-1和化合物RSF-2；或者，
将试卤灵和碳酸钠加入DMF中，室温搅拌反应，然后在冰水浴下加入对甲氧基苯硫酚，在室温下搅拌反应，反应完成后，得到化合物RSF-1。
3.根据权利要求2所述的用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物的制备方法，其特征在于，对甲氧基苯硫酚、试卤灵与硫光气的摩尔比为1.5：1～1.5：2.5～3.5。
4.根据权利要求2所述的用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物的制备方法，其特征在于，对甲氧基苯硫酚、试卤灵与碳酸钠的摩尔比为1.5：1～1.5：8～10。
5.一种权利要求1所述的用于检测过氧亚硝酸根的试卤灵类衍生物在制备细胞中检测过氧亚硝酸根试剂中的应用。
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