CN107286926A - 基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents

基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料，具有如下结构式I：R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；X为羧基、氢、甲醛基、甲酰胺基或甲酸酯基；还公开了该类染料的制备方法。这类染料具有荧光素量子产率高的特点，也具有香豆素Stokes位移大的性质；同时，该类染料生物相容性好，可用于生物体系中的细胞器或生物大分子如蛋白质等的共价荧光标记，对于研究生命科学有非常重要的作用。

Description

基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一类荧光染料。更具体地，涉及一类基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，荧光染料伴随着生命科学的发展发挥着越来越重要的作用，特别是随着荧光分析检测技术的发展，具有荧光特性的有机小分子在酶分析、生物分子标记、细胞染色、临床检验诊断及环境监测等领域被广泛的应用，以有机小分子为基础的荧光分子探针的报道也已屡见不鲜，这些探针分子具有操作简便、选择性高、膜透性好、可重复性强，能原位检测等众多优点。此外，分子荧光探针可参与监控活细胞及活体中的生物分子与其代谢过程，使活细胞与计算机之间搭起一座桥梁，通过光纤传递信号进而实现细胞内代谢过程的可视化。近年来关于各类小分子及离子的荧光探针的报道层出不穷，分子荧光探针己成为国内外学者们的研究热点。目前，常见的经典有机荧光团包括内源性的荧光分子(如荧光蛋白、还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)等)和化学荧光探针，如：香豆素类、氧杂蒽类及其类似物等，它们在探针领域有着各自的优势及局限性。
香豆素类化合物是自然界中广泛存在的一类重要天然杂环化合物。香豆素类化合物的母体结构为苯并吡喃，最早由Vogel于1820年从黄香草木犀中提取得到，但直到1868年，才由Perkin首次人工合成了香豆素衍生物。研究表明，香豆素类化合物具有多方面独特的生理学和生物学活性，例如：抗高血压、抗凝血、抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗癌等一系列的生物和药用活性。近年来发现香豆素类化合物还具有抗氧化、抗衰老以及抵抗当今危害人类健康的顽症AIDS和肿瘤方面有较好的药物活性，因此倍受国内外学者的关注。香豆素化合物除具有独特生物活性外，还具有优异的光学特性。香豆素类化合物的母核苯并吡喃是没有荧光的无色物质，但取代后的香豆素衍生物，特别是7位上引入给电子基团，3或4位上引入吸电子基团后，形成推拉电子体系，便得到荧光物质，同时最大吸收波长和发射波长会发生红移。由于香豆素类化合物有较大的斯托克斯位移、生物相容性好、合成简单结构易于修饰和易于通过改变分子内存在的推拉体系容易调控光学性能等优点，因此，香豆素类衍生物被广泛的用做激光染料、荧光增白剂等，也是分子荧光探针设计中最常用的荧光团之一。但香豆素荧光染料的量子产率并不是特别高，吸收发射一般位于蓝紫色区域。
氧杂蒽类荧光探针以荧光素为典型代表，其是目前世界上最受欢迎的荧光分子之一，由Adolph Baeyer在1871年首次合成并命名。荧光素以其优越的性能被化学家们一直研究并在大量的荧光团分子中占据重要的地位，如原料相对廉价、荧光量子效率较高、摩尔消光系数较大、水溶性较好、激发波长与488nm的氩离子激光器相匹配等、在水溶液中可以中性离子，阴离子，阳离子，双阳离子形式存在，因此对pH特别敏感，可设计为pH荧光探针等，在过去的几十年中，荧光素己被衍生合成为一系列的荧光探针作为细胞学和免疫化学中的检测试剂，包括5(6)-羧基荧光素，异硫氰酸荧光素以及5(6)-乙酰氨基荧光素等。在细胞研究领域，荧光素是最早被用作pH探针的染料之一，它的荧光强度与pH的变化密切相关，pH<5时荧光素以弱荧光的电中性形式存在，pH介于5和6.5之间时以单阴离子(羧基去质子化)形式存在，而当pH>6.5时平衡转化，荧光素以高量子效率的强荧光的双负离子结构形式存在。荧光素的光稳定性、吸收与发射波长范围以及pKa等都可以通过引入不同的取代基来修饰其结构来调整。尽管基于荧光素的许多染料已被广泛应用于生物分析，但它也存在不少已被公认的缺陷：(1)光稳定性较差，易被光猝灭；(2)Stokes位移小，激发光源干扰发射信号的收集；(3)用于细胞成像时容易被细胞代谢裂解或是易与蛋白质形成复合物而使荧光减弱，降低了荧光分析的灵敏度。
终上所述，香豆素类和荧光素类荧光染料都存在着各自缺陷，在应用到生物体系识别领域还有很多的局限性。香豆素荧光染料的量子产率并不是特别高，吸收发射一般位于蓝紫色区域。基于荧光素的许多染料，光稳定性较差，Stokes位移小，激发光源干扰发射信号的收集。因此，合成化学和光学性质更加稳定、量子产率更高、毒性小、Stokes位移大、易于修饰的新型荧光染料具有重大的理论意义和应用价值。本发明基于原料易得的荧光素衍生物，通过活泼的丙二酸二乙酯偶联到荧光素类似物形成一个香豆素结构，具有大的共轭体系，作为重要的中间体，由其可以生成一系列不对称、非直线型共轭结构的荧光染料。这类基于香豆素和荧光素的荧光染料具有荧光素量子产率高的特点，也具有香豆素Stokes位移大的性质，位移大可以有效避免激发光源对发射信号收集的干扰；同时，该类染料生物相容性好，低毒性，具有细胞膜通透性，可用于生物体系中的细胞器或生物大分子如蛋白质等的共价荧光标记，对于研究生命科学有非常重要的作用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料，该杂合荧光染料具有不对称、非直线型共轭结构，且具有荧光素量子产率高、荧光稳定性好、Stokes位移大、生物相容性好、低毒性以及细胞膜通透性等特点。
本发明的第二个目的在于提供一种基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的制备方法，该制备方法简单，基于原料易得的荧光素衍生物，通过活泼的丙二酸二乙酯偶联到荧光素类似物形成一个香豆素结构，具有大的共轭体系，作为重要的中间体，由其可以生成一系列不对称、非直线型共轭结构的荧光染料。
本发明的第三个目的在于提供一种基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的应用。
为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料，其特征在于，具有如下结构式I：
其中，R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；X为羧基、氢、甲醛基、甲酰胺基或甲酸酯基；
所述R1、R2、R3、R4中的烃基为直链、支链或环状；所述烃基包含1-8个碳原子；
所述R5、R6、R7、R8、R9、X中甲酸酯基为2-20个碳原子烃基甲酸酯基、2-20个碳原子取代烷基甲酸酯基、甲酸苄基酯基或甲酸N-琥珀酰亚胺酯基；
所述R5、R6、R7、R8、R9、X中甲酰胺基为2-20个碳原子烃基甲酰胺基、2-20个碳原子取代烷基取代甲酰胺基、苄基甲酰胺基或马来酰亚胺基；
所述R5、R6、R7、R8、R9中胺基为1-20个碳原子烃基胺基、1-20个碳原子取代烷基取代胺基或1-20个碳原子酰基胺基；
所述卤素为氟、氯、溴或碘。
优选地，所述R1、R2、R3、R4中的烃基，分别独立的为甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、2-甲基戊基、环己基、庚基、2-甲基己基、辛基或2-甲基庚基；
所述R5、R6、R7、R8、R9、X中的甲酸酯基，其中2-20个碳原子烃基甲酸酯基为COO(CH2)nCH3或COOCH2CH＝CH2，其中，n为0-18；
所述R5、R6、R7、R8、R9、X中甲酸酯基，其中2-20个碳原子取代烷基甲酸酯基为COO(CH2)nCH2COOH、COO(CH2)nCH2COOM、COO(CH2)nCH2SO3H或COO(CH2)nCH2SO3M，其中，n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R5、R6、R7、R8、R9、X中甲酰胺基，其中，2-20个碳原子烃基甲酰胺基为CONH(CH2)nCH3或CON[(CH2)nCH3]2，其中，n为0-9；
所述R5、R6、R7、R8、R9、X中甲酰胺基，其中2-20个碳原子取代烷基取代甲酰胺基为CONH(CH2)nCH2COOH、CON[(CH2)nCH2COOH]2、CONH(CH2)nCH2COOM、CON[(CH2)nCH2COOM]2、CONH(CH2)nCH2SO3H、CON[(CH2)nCH2SO3H]2、CONH(CH2)nCH2SO3M或CON[(CH2)nCH2SO3M]2，其中，n为0-8，M为平衡电荷的阳离子；
所述R5、R6、R7、R8、R9中胺基，其中，1-20个碳原子烃基胺基为NH(CH2)nCH3或N[(CH2)nCH3]2，其中，n为0-9；
所述R5、R6、R7、R8、R9中胺基，其中，1-20个碳原子取代烷基取代胺基为NH(CH2)nCH2COOH、N[(CH2)nCH2COOH]2、NH(CH2)nCH2COOM、N[(CH2)nCH2COOM、NH(CH2)nCH2SO3、N[(CH2)nCH2SO3H]2]2、NH(CH2)nCH2SO3M或N[(CH2)nCH2SO3M]2，其中，n为0-9，M为平衡电荷的阳离子；
所述R5、R6、R7、R8、R9中胺基，其中1-20个碳原子酰基胺基为乙酰基胺基、叔丁氧羰基胺基、苯甲酰基胺基、甲基取代苯甲酰基胺基、乙基取代苯甲酰基胺基、氯取代苯甲酰基胺基、溴取代苯甲酰基胺基或马来酰亚胺基。
为达到上述第二个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明还公开了上述基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的制备方法，具体的，
当所述杂合荧光染料的结构式I中X为羧基时，其制备方法包括如下步骤：
向2毫摩尔化合物II与1-5毫摩尔丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml无水乙醇，搅拌均匀后，加入0.2ml六氢吡啶，于70-80℃温度下回流反应1-24h；冷却至室温后，旋蒸除去无水乙醇，向残余物中加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗产品中间体，真空干燥，再柱层析纯化得中间体化合物III；
将1毫摩尔化合物III溶到5-10ml NaOH的MeOH溶液中，加热至100℃回流反应3-5h，冷却，过滤出残余物，真空干燥后得产物Ia；
所述化合物II的结构式如下：
所述化合物III的结构式如下：
所述产物化合物Ia的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
当所述杂合荧光染料的结构式I中X为氢时，其制备方法包括如下步骤：
向2毫摩尔化合物II与1-5毫摩尔丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml无水乙醇，搅拌均匀后，加入0.2ml六氢吡啶，于70-80℃温度下回流反应1-24h；冷却至室温后，旋蒸除去无水乙醇，向残余物中加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗产品中间体，真空干燥，再柱层析纯化得中间体化合物III；
向1毫摩尔化合物III中加入8毫升体积比为1：1的浓盐酸和冰醋酸，于70-80℃加热回流反应4-6h；将反应液冷却至室温，倒入20毫升冰水，用质量百分浓度为40％的NaOH溶液调节溶液的pH值到5，收集析出的固体；继续搅拌30min，将粗产品过滤、水洗3次，真空干燥后重结晶纯化，得到产物Ib；
所述化合物II的结构式如下：
所述化合物III的结构式如下：
所述产物Ib的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
当所述杂合荧光染料的结构式I中X为甲醛基时，其制备方法包括如下步骤：
向2毫摩尔化合物II与1-5毫摩尔丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml无水乙醇，搅拌均匀后，加入0.2ml六氢吡啶，于70-80℃温度下回流反应1-24h；冷却至室温后，旋蒸除去无水乙醇，向残余物中加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗产品中间体，真空干燥，再柱层析纯化得中间体化合物III；
向1毫摩尔化合物III中加入8毫升体积比为1：1的浓盐酸和冰醋酸，于70-80℃加热回流反应4-6h；将反应液冷却至室温，倒入20毫升冰水，用质量百分浓度为40％的NaOH溶液调节溶液的pH值到5，收集析出的固体；继续搅拌30min，将粗产品过滤、水洗3次，真空干燥后重结晶纯化，得到化合物Ib；
在氮气保护下，向0.5毫升三氯氧磷中滴加0.5毫升DMF，30min内滴加完毕，反应液温度控制在50℃；待反应液呈淡红色，再向其中滴加2毫升溶有1.4mmol化合物Ib的DMF溶液；反应液在60℃下继续反应8-12h后，将其倒入20毫升的冰水中，收集析出的红色固体；粗产品经过滤、水洗3次、真空干燥，再重结晶纯化得到相应化合物Ib的醛基产物Ic；
所述化合物II的结构式如下：
所述中间体III的结构式如下：
所述化合物Ib的结构式如下：
所述产物Ic的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
当所述杂合荧光染料的结构式I中X为甲酸酯基时，其制备方法包括如下步骤：
向2毫摩尔化合物II与1-5毫摩尔丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml无水乙醇，搅拌均匀后，加入0.2ml六氢吡啶，于70-80℃温度下回流反应1-24h；冷却至室温后，旋蒸除去无水乙醇，向残余物中加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗产品中间体，真空干燥，再柱层析纯化得中间体化合物III；
将1毫摩尔化合物III溶到5-10ml NaOH的MeOH溶液中，加热至100℃回流反应3-5h，冷却，过滤出残余物，真空干燥后得化合物Ia；
将0.5毫摩尔化合物Ia、0.5毫摩尔相应的卤代化合物R10Y溶于10毫升干燥的DMF，氮气保护下室温反应12h后，蒸干溶剂柱层析分离纯化得到产物Id；
所述化合物II的结构式如下：
所述化合物III的结构式如下：
所述化合物Ia的结构式如下：
所述产物Id的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；R10为1-19个碳原子的烃基、1-19个碳原子取代烷基、苄基或N-琥珀酰亚胺。
所述卤代化合物R10Y中Y为氯、溴或碘。
当所述杂合荧光染料的结构式I中X为甲酰胺基时，其制备方法包括如下步骤：
向2毫摩尔化合物II与1-5毫摩尔丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml无水乙醇，搅拌均匀后，加入0.2ml六氢吡啶，于70-80℃温度下回流反应1-24h；冷却至室温后，旋蒸除去无水乙醇，向残余物中加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗产品中间体，真空干燥，再柱层析纯化得中间体化合物III；
将1毫摩尔化合物III溶到5-10ml NaOH的MeOH溶液中，加热至100℃回流反应3-5h，冷却，过滤出残余物，真空干燥后得化合物Ia；
将0.5毫摩尔化合物Ia、0.5毫摩尔相应的胺基化合物NH R11R12溶于10毫升干燥的DMF，氮气保护下室温反应12h后，蒸干溶剂柱层析分离纯化得到产物Ie；
所述化合物II的结构式如下：
所述化合物III的结构式如下：
所述产物Ia的结构式如下：
所述产物Ie的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；R11、R12分别独立的为氢、1-19个碳原子烃基、1-19个碳原子取代烷基取代、苄基或马来酰亚胺基，R11、R12不能同时为氢。
本申请的制备方法中使用的原料II包括但不限于根据文献“J.Org.Chem.1995,60,2964-2965”或文献“J.Org.Chem.,Vol.72,No.7,2007”中公开的方法制备得到，其余原料可通过但不限于市售获得。
为达到上述第三个目的，本发明采用下述技术方案：
本发明还保护上述基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的应用。
具体的，所述基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料主要用于生物体系中的细胞器或生物大分子的共价荧光标记；
优选地，所述生物大分子为核酸或蛋白质。
本发明的有益效果如下：
本发明一类基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料I，具有不对称、非直线型共轭结构，该类染料具有荧光素量子产率高的特点，也具有香豆素Stokes位移大的性质，位移大可以有效避免激发光源对发射信号收集的干扰；同时，该类染料生物相容性好，低毒性，具有细胞膜通透性，可用于生物体系中的细胞器或生物大分子如蛋白质等的共价荧光标记，对于研究生命科学有非常重要的作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出制备化合物I的反应方程式。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
II-1根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由对二甲氨基苯基荧光酮制备，产率78％。
将782mg(2mmol)化合物II-1与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，在75℃回流反应6h；冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝7:1)纯化分离得到782mg化合物Id-1，产率80％。ESI MS：m/z，487.1。λab max/nm＝505nm,λem max/nm＝548nm,Фf＝41％。
将487mg(1mmol)化合物Id-1溶到NaOH的MeOH溶液，100℃下搅拌反应4h，冷却，过滤出残余物，得到357mg化合物Ia-1，产率77.8％。ESI MS：m/z，459.1。λab max/nm＝504nm,λem max/nm＝545nm,Фf＝41.4％。
实施例2
将487mg(1mmol)按实施例1的方法制备得到的化合物Id-1溶于4mL浓盐酸和4mL冰醋酸中。继续升温在70℃回流反应5h。反应液冷却至室温，倒入20mL冰水，用质量百分浓度为40％的NaOH溶液调节溶液的pH值到5，有大量的固体析出。继续搅拌30min，粗产品过滤、水洗3次，真空干燥后用甲苯重结晶得到340mg化合物Ib-1，产率82％。ESI MS：m/z，415.1。λab max/nm＝487nm,λem max/nm＝537nm,Фf＝43％。
向25mL的三口瓶中加入0.5mL三氯氧磷，氮气保护下缓慢滴加0.5mL新蒸的DMF，30min内滴加完毕，加热反应液，温度控制在50℃。待反应液呈淡红色，再向其中滴加2mL溶有581mg化合物Ib-1(1.4mmol)的DMF溶液。反应液在60℃下继续反应12h后，将其倒入20mL的冰水中，有大量的固体析出。粗产品经过滤、水洗3次、真空干燥，然后用无水乙醇重结晶得到452.8mg化合物Ic-1，产率为73％。ESI MS：m/z，443.1。λab max/nm＝491nm,λem max/nm＝539nm,Фf＝42.8％。
实施例3
将230mg(0.5mmol)化合物Ia-1、926mg(0.5mmol)十二烷基胺溶于10毫升干燥的DMF，氮气保护下室温反应12h后，蒸干溶剂柱层析分离纯化得到121mg化合物Ie-1,产率38.6％。ESI MS：m/z，626.3。
将230g(0.5mmol)化合物Ia-1、124mg(0.5mmol)溴代十二烷溶于10毫升干燥的DMF，氮气保护下于125℃反应15小时后，蒸干溶剂柱层析分离得到153mg化合物Id-2,产率48.8％。ESI MS：m/z，627.3。
实施例4
II-2根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由四氯荧光素制备，产率81％。
将992mg(2mmol)化合物II-2与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，在80℃回流反应4h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝8:1)纯化分离得到899mg化合物Id-3，产率76％。ESI MS：m/z，591.9。λab max/nm＝503nm,λem max/nm＝543nm,Фf＝42％。
将592mg(1mmol)化合物Id-3溶于4mL浓盐酸和4mL冰醋酸中。继续升温至80℃回流反应6h。反应液冷却至室温，倒入20mL冰水，有大量的固体析出。继续搅拌30min，粗产品过滤、水洗3次，真空干燥后用甲苯重结晶得到426.3mg化合物Ib-2，产率82％。ESI MS：m/z，519.9。λab max/nm＝483nm,λem max/nm＝531nm,Фf/nm＝43.7％。
实施例5
II-3根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯制备，产率76％。
将914mg(2mmol)化合物II-3与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，于73℃回流反应4h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝8:1)纯化分离得到840.7mg化合物Id-4，产率76％。ESI MS：m/z，553.1。λabmax/nm＝501nm,λem max/nm＝540nm,Фf＝40.8％。
实施例6
II-4根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由2-羟基苯基荧光酮制备，产率85％。
将728mg(2mmol)化合物II-4与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，于80℃回流反应4h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝9:1)纯化分离得到772mg化合物Id-5，产率84％。ESI MS：m/z，460.1。λab max/nm＝505nm,λem max/nm＝547nm,Фf＝43％。
将460mg(1mmol)化合物Id-5溶到NaOH的MeOH溶液，100℃下搅拌反应4h，冷却，过滤出残余物，得到348mg化合物Ia-2，产率80.6％。ESI MS：m/z，432.0。λab max/nm＝504nm,λem max/nm＝544nm,Фf＝42.7％。
实施例7
II-5根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由荧光素制备，产率89％。
II-6根据文献(J.Org.Chem.,Vol.72,No.7,2007)由化合物II-5制备，79.3％。
将804mg(2mmol)化合物II-6和二氮杂二环DBU(30ul)混合在丙二酸二乙酯(1ml,6mmol)，真空下搅拌，加热到160℃，反应8h后，冷却到室温，加入二氯和盐酸溶液，分液，水相用二氯萃取两次，收集有机相，用无水MgSO4干燥，过滤，旋蒸蒸去溶剂，得残余物，柱层析纯化粗产品(环乙烷：乙酸乙酯＝9:1-4:1)，得到化合物577.8mg Id-6，产率58％。ESI MS：m/z，498.1。λab max/nm＝499nm,λem max/nm＝538nm,Фf＝38.7％。
将249g(0.5mmol)化合物Id-6、124mg(0.5mmol)溴代十二烷溶于10毫升干燥的DMF，氮气保护下室温反应15小时后，蒸干溶剂柱层析分离得到171mg化合物Id-7,产率51.4％。ESI MS：m/z，666.3。
实施例8
II-7根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由5-羧基荧光素制备，产率86％。
将808mg(2mmol)化合物II-7与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，于80℃回流反应6h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝9:1)纯化分离得到846.4mg化合物Id-8，产率82％。ESI MS：m/z，516.1。λab max/nm＝503nm,λem max/nm＝544nm,Фf＝42.3％。
将279.3mg(0.33mmol)化合物Id-8、76mg(0.66mmol)N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺溶于7毫升干燥的DMF，氮气保护下80℃反应2小时，冷却、过滤，滤液蒸干溶剂柱层析纯化分离得到61.6mg化合物Id-9,产率26.3％。ESI MS：m/z,710.1。
实施例9
II-8根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由9-[1-(2-甲基-4-甲氧基苯基)]-6-羟基-3H-呫吨-3-酮(其中，9-[1-(2-甲基-4-甲氧基苯基)]-6-羟基-3H-呫吨-3-酮是根据文献“J.Am.Chem.Soc.2005,127,4888-4894”制备得到)制备，产率86.7％。
将3.2mg(1.4mmol)氧化银和氢氧化钠(57mg，1.4mmol)混合在5ml水中，加热到60℃，搅拌下加入化合物II-8(505mg，1.4mmol)。氧化银转化成蓬松的金属银，产生大量热。搅拌10分钟，过滤，残渣银用20ml的热水洗。滤液用盐酸酸化，冷却。析出沉淀，过滤，干燥。加入2ml乙酸酐和1滴硫酸，加热反应30分钟，然后将反应液倒入冰水中，搅拌混合物，随着冰的融化，析出固体，过滤出沉淀。使用苯和乙酸重结晶得251.7mg化合物II-9，产率43％。ESI MS：m/z，418.1。
209mg化合物II-9(0.5mmol)和0.4ml氯化亚砜(1.5mmol)混合到2ml乙醚和4ml苯，加热回流16h。冷却到室温，减压下旋蒸除去溶剂，残余油状物溶解在6ml乙二醇二甲醚，制得酰氯基化合物。一个50ml的3口烧瓶，配备2个50ml的滴液漏斗和1个搅拌器，冰浴下到0℃。1g再蒸馏处理的丙二酸二乙酯，3g冰，和3ml水加入烧瓶混合均匀。往反应液中加入1-2滴茜素黄R(酸碱指示剂，pH变色范围10.2(黄色)～12.0(红色))的5％(V/V)乙醇水溶液，然后开始搅拌。酰氯基化合物的乙二醇二甲醚溶液转移到滴液漏斗里，另一个滴液漏斗盛10ml 50％(w/w)的氢氧化钠水溶液。在搅拌下，缓慢滴加两个滴液漏斗，氢氧化钠水溶液的滴加速度以维持反应混合液呈红色为标准。加完酰氯基化合物后继续搅拌25分钟。加入20ml的水，过滤，滤液使用浓盐酸调pH到3，冷却到4℃。24h后，析出固体，过滤出沉淀，用苯和乙醇重结晶，得到54.3mg化合物Id-10，产率23％。ESI MS：m/z，472.1。λab max/nm＝505nm,λem max/nm＝545nm,Фf＝39.6％。
实施例10
将47.2mg(0.1mmol)由实施例9制备得到的化合物Id-10，1ml三氯氧磷和三乙胺(2ml)混合均匀，加热到60℃，搅拌3h，然后把反应混合物倒入冰水里，析出固体，室温下搅拌混合物24h。用浓氢氧化钠调混合物的pH到5-6，然后过滤，用水洗，干燥得38.2mg化合物Id-11，产率78％。ESI MS：m/z，490.1。λab max＝506nm,λem max＝547nm,Фf＝38.7％。
实施例11
II-10根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由2',7'-二氯荧光素制备，产率88.3％。
将856mg(2mmol)化合物II-10与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，于80℃回流反应6h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝9:1)纯化分离得到869.8mg化合物Id-12，产率83％。ESI MS：m/z，524.0。λab max/nm＝509nm,λem max/nm＝551nm,Фf＝40.5％。
实施例12
II-11根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由6-硝基荧光素制备，产率87.1％。
将810.1mg(2mmol)化合物II-11与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，于78℃回流反应6h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝9:1)纯化分离得到830.8mg化合物Id-13，产率82.9％。ESI MS：m/z，501.1。λab max/nm＝503nm,λem max/nm＝543nm,Фf＝41.7％。
将化合物Id-13在水溶液中用Na2S和NaSH还原，即可得到化合物Id-14，产率55％。ESI MS：m/z,471.1。
实施例13
II-12根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由磺酰荧光素制备，产率89.5％。
将792mg(2mmol)化合物II-12与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，于80℃回流反应6h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝9:1)纯化分离得到804.1mg化合物Id-15，产率81.7％。ESI MS：m/z，492.1。λab max/nm＝501nm,λem max/nm＝543nm,Фf＝41％。
将492mg(1mmol)化合物Id-15溶到NaOH的MeOH溶液，100℃下搅拌反应5h，冷却，过滤出残余物，得到375.8mg化合物Ia-3，产率81％。ESI MS：m/z，464.0。
实施例14
II-13根据文献(J.Org.Chem.1995,60,2964-2965)由5-马来酰亚胺荧光素制备，产率85.7％。
将914mg(2mmol)化合物II-13与640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升无水乙醇中，室温搅拌待完全溶解后，再加入0.2mL六氢吡啶，于80℃回流反应6h。冷却至室温，减压蒸干有机溶剂，得到残余物，加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，收集有机相，使用无水MgSO4干燥，减压旋蒸除去溶剂，得到粗产品，柱层析(环乙烷：乙酸乙酯＝9:1)纯化分离得到891.6mg化合物Id-16，产率80.6％。ESI MS：m/z，553.1。
实施例15
所得基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料在核酸的共价荧光标记中的应用：
化合物Id-4与核苷酸氨基烯丙基-dUTP偶联：
将277mg(0.5mmol)实施例5制备得到的化合物Id-4的DMF溶液加入到258mg(0.5mmol)烯丙基-dUTP的缓冲溶液中(pH＝8)，室温下搅拌20小时，浓缩后柱层析纯化分离得到189.9g化合物Id-17，产率39.8％。ESI MS：m/z,954.1。λabmax/nm＝500nm,λem max/nm＝538nm,Фf＝40.5％。
实施例16
按照实施例12的方法，由5-硝基荧光素和丙二酸二乙酯为原料，制得化合物Id-18。ESI MS：m/z,471.1。
根据文献(RSC Advances.2013,3,16940)将化合物Id-18与CS2反应即可得到化合物Id-19，产率29.7％。ESI MS：m/z,513.1。λabmax/nm＝489nm,λem max/nm＝544nm,Фf＝40.0％。
所得基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料在核酸的共价荧光标记中的共价荧光标记中的应用：
将126g(0.2mmol)化合物Id-19的DMF溶液加入到0.103g(0.2mmol)烯丙基-dUTP的缓冲溶液中(pH＝8)，室温下搅拌20小时，浓缩后柱层析纯化分离得到100.6m g化合物Id-20，产率48.9％。ESI MS：m/z,1029.1。λabmax/nm＝487nm,λem max/nm＝543nm,Фf＝39.7％。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料，其特征在于，具有如下结构式I：
其中，R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；X为羧基、氢、甲醛基、甲酰胺基或甲酸酯基；
所述烃基为直链、支链或环状；所述烃基包含1-8个碳原子；
所述甲酸酯基为2-20个碳原子烃基甲酸酯基、2-20个碳原子取代烷基甲酸酯基、甲酸苄基酯基或甲酸N-琥珀酰亚胺酯基；
所述甲酰胺基为2-20个碳原子烃基甲酰胺基、2-20个碳原子取代烷基取代甲酰胺基、苄基甲酰胺基或马来酰亚胺基；
所述胺基为1-20个碳原子烃基胺基、1-20个碳原子取代烷基取代胺基或1-20个碳原子酰基胺基；
所述卤素为氟、氯、溴或碘。
2.根据权利要求1所述的基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料，其特征在于，
所述烃基为甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、2-甲基戊基、环己基、庚基、2-甲基己基、辛基或2-甲基庚基；
所述2-20个碳原子烃基甲酸酯基为COO(CH2)nCH3或COOCH2CH＝CH2，其中，n为0-18；
所述2-20个碳原子取代烷基甲酸酯基为COO(CH2)nCH2COOH、COO(CH2)nCH2COOM、COO(CH2)nCH2SO3H或COO(CH2)nCH2SO3M，其中，n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述2-20个碳原子烃基甲酰胺基为CONH(CH2)nCH3或CON[(CH2)nCH3]2，其中，n为0-9；
所述2-20个碳原子取代烷基取代甲酰胺基为CONH(CH2)nCH2COOH、CON[(CH2)nCH2COOH]2、CONH(CH2)nCH2COOM、CON[(CH2)nCH2COOM]2、CONH(CH2)nCH2SO3H、CON[(CH2)nCH2SO3H]2、CONH(CH2)nCH2SO3M或CON[(CH2)nCH2SO3M]2，其中，n为0-8，M为平衡电荷的阳离子；
所述1-20个碳原子烃基胺基为NH(CH2)nCH3或N[(CH2)nCH3]2，其中，n为0-9；
所述1-20个碳原子取代烷基取代胺基为NH(CH2)nCH2COOH、N[(CH2)nCH2COOH]2、NH(CH2)nCH2COOM、N[(CH2)nCH2COOM、NH(CH2)nCH2SO3、N[(CH2)nCH2SO3H]2]2、NH(CH2)nCH2SO3M或N[(CH2)nCH2SO3M]2，其中，n为0-9，M为平衡电荷的阳离子；
所述1-20个碳原子酰基胺基为乙酰基胺基、叔丁氧羰基胺基、苯甲酰基胺基、甲基取代苯甲酰基胺基、乙基取代苯甲酰基胺基、氯取代苯甲酰基胺基、溴取代苯甲酰基胺基或马来酰亚胺基。
3.如权利要求1-2任一项所述的基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的制备方法，其特征在于，当所述杂合荧光染料的结构式I中X为羧基时，其制备方法包括如下步骤：
向2毫摩尔化合物II与1-5毫摩尔丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml无水乙醇，搅拌均匀后，加入0.2ml六氢吡啶，于70-80℃温度下回流反应1-24h；冷却至室温后，旋蒸除去无水乙醇，向残余物中加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗产品中间体，真空干燥，再柱层析纯化得中间体化合物III；
将1毫摩尔化合物III溶到5-10ml NaOH的MeOH溶液中，加热至100℃回流反应3-5h，冷却，过滤出残余物，真空干燥后得产物化合物Ia；
所述化合物II的结构式如下：
所述化合物III的结构式如下：
所述产物化合物Ia的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
4.如权利要求1-2任一项所述的基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的制备方法，其特征在于，当所述杂合荧光染料的结构式I中X为氢时，其制备方法包括如下步骤：
向2毫摩尔化合物II与1-5毫摩尔丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml无水乙醇，搅拌均匀后，加入0.2ml六氢吡啶，于70-80℃温度下回流反应1-24h；冷却至室温后，旋蒸除去无水乙醇，向残余物中加入蒸馏水，使用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗产品中间体，真空干燥，再柱层析纯化得中间体化合物III；
向1毫摩尔化合物III中加入8毫升体积比为1：1的浓盐酸和冰醋酸，于70-80℃加热回流反应4-6h；将反应液冷却至室温，倒入20毫升冰水，用质量百分浓度为40％的NaOH溶液调节溶液的pH值到5；继续搅拌30min，将粗产品过滤、水洗3次，真空干燥后重结晶纯化，得到产物化合物Ib；
所述化合物II的结构式如下：
所述化合物III的结构式如下：
所述产物化合物Ib的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
5.根据权利要求4所述的基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
在氮气保护下，向0.5毫升三氯氧磷中滴加0.5毫升DMF，30min内滴加完毕，反应液温度控制在50℃；待反应液呈淡红色，再向其中滴加2毫升溶有1.4mmol化合物Ib的DMF溶液；反应液在60℃下继续反应8-12h后，将其倒入20毫升的冰水中，收集析出的红色固体，粗产品经过滤、水洗3次、真空干燥，再重结晶纯化得到相应化合物Ib的醛基产物化合物Ic；
所述产物化合物Ic的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
6.根据权利要求3所述的基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
将0.5毫摩尔化合物Ia、0.5毫摩尔相应的卤代化合物R10Y溶于10毫升干燥的DMF，氮气保护下室温反应12h后，蒸干溶剂柱层析分离纯化得到产物化合物Id；
所述产物化合物Id的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；R10为1-19个碳原子的烃基、1-19个碳原子取代烷基、苄基或N-琥珀酰亚胺；Y为氯、溴或碘。
7.根据权利要求3所述的基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
将0.5毫摩尔化合物Ia、0.5毫摩尔相应的胺基化合物NHR11R12溶于10毫升干燥的DMF，氮气保护下室温反应12h后，蒸干溶剂柱层析分离纯化得到产物化合物Ie；
所述产物化合物Ie的结构式如下：
其中，上述R1、R2、R3、R4分别独立的为氢、羟基、烃基或卤素；R5、R6、R7、R8、R9分别独立的为氢、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羟基、氨基、硝基、卤素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；R11、R12分别独立的为氢、1-19个碳原子烃基、1-19个碳原子取代烷基取代、苄基或马来酰亚胺基，R11、R12不能同时为氢。
8.如权利要求1-2任一项所述的基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料的应用，其特征在于，所述基于香豆素和荧光素的杂合荧光染料在生物体系中的细胞器或生物大分子的共价荧光标记中的应用；所述生物大分子为核酸或蛋白质。
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