CN114890958A - 双光子染料化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双光子染料化合物技术领域，具体而言，涉及双光子染料化合物、其制备方法及其应用。双光子染料化合物，其选自式1或式2所示化合物中的任意一种：
Figure DDA0003624349390000011
其中，R1和R2分别独立地选自氢或取代或未取代烷基，R3选自氢或取代或未取代胺基，n为1‑6。该双光子染料化合物能示踪苯丙胺类毒品荧光模拟物探针在脑部的分布区域动态变化过程，以明确苯丙胺类毒品作用于脑部神经的具体靶标，继而有利于揭示苯丙胺类毒品的成瘾机制和重点作用靶位，继而有利于设计药物来干预苯丙胺类物质成瘾。

Description

双光子染料化合物、其制备方法及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年02月23日提交中国专利局的申请号为202210168242.6、名称为“双光子染料化合物、其制备方法及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及双光子染料化合物技术领域，具体而言，涉及双光子染料化合物、其制备方法及其应用。
背景技术
神经毒理学研究已经发现苯丙胺类相比于其它传统的毒品，具有极为复杂的成瘾机制。最重要的是，苯丙胺类兴奋剂能增强中脑多巴胺神经元的功能并促进多巴胺神经元末端多巴胺的释放；除多巴胺系统外，也能刺激其它神经递质(5-羟色胺，谷氨酸等)系统，调节这些神经递质的释放，形成所谓“奖赏效应”，引起滥用者对苯丙胺类兴奋剂产生精神依赖。然而，正因为苯丙胺类神经成瘾性广泛涉及到不同神经功能区域的不同神经递质系统，而且这些系统间存在复杂关联，因此很难充分揭示苯丙胺类小分子如何协调这些系统间的相互作用过程的具体细节，使得选用和设计药物来干预苯丙胺类物质成瘾成为突出的挑战。
功能影像技术是神经生物学领域的新兴、重要研究方法。目前对于苯丙胺类毒品成瘾性研究，脑功能核磁共振成像得到了相对广泛的应用。但是，核磁共振空间分辨率较低，仅适用于脑部结构、神经纤维形态学和环境因素(如血氧水平)等的观测，只能间接反映毒品对脑部神经组织的影响，无法在细胞和分子水平上直接实现药物与生物靶标作用过程的动态可视化。
众所周知，高灵敏荧光显微成像技术，能精确到亚细胞甚至单分子水平。然而在毒品的神经生物学研究中，光学成像应用则非常有限，仅有免疫荧光法等获得一定使用，而免疫成像只适合固定后的生物样本，因此不能充分发挥荧光成像在活体实时动态探测方面的优势。荧光成像技术之所以未能在毒品神经生物学研究中像在其它生命科学领域内那样获得广泛应用，根本原因在于缺乏适合于模拟毒品功能的荧光类似物作为分子探针。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供双光子染料化合物、其制备方法及其应用。本发明实施例提供一种双光子染料化合物，其能示踪苯丙胺类毒品荧光模拟物探针在脑部的分布区域动态变化过程，以明确苯丙胺类毒品作用于脑部神经的具体靶标，继而有利于揭示苯丙胺类毒品的成瘾机制和重点作用靶位，继而有利于设计药物来干预苯丙胺类物质成瘾。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种双光子染料化合物，其选自式1或式2所示化合物中的任意一种：
Figure RE-GDA0003742007940000021
Figure RE-GDA0003742007940000022
其中，R1和R2分别独立地选自氢或取代或未取代烷基，R3选自氢或取代或未取代胺基，n为1-6。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的双光子染料化合物的制备方法，参照下述合成路径中的任意一种合成所述双光子染料化合物：
Figure RE-GDA0003742007940000023
Figure RE-GDA0003742007940000031
其中，R 为含有R1和R2的胺基保护基。
第三方面，本发明提供一种前述实施方式所述的双光子染料化合物在制备示踪苯丙胺类毒品的示踪剂的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种双光子染料化合物能示踪苯丙胺类毒品荧光模拟物探针在脑部的分布区域动态变化过程，以明确苯丙胺类毒品作用于脑部神经的具体靶标，继而有利于揭示苯丙胺类毒品的成瘾机制和重点作用靶位，继而有利于设计药物来干预苯丙胺类物质成瘾。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的化合物11的质谱图；
图2为本发明实施例1提供的化合物28的质谱图；
图3为本发明实施例1提供的化合物28的核磁氢谱图；
图4为本发明实施例2提供的化合物30的质谱图；
图5为本发明实施例2提供的化合物30的核磁氢谱图；
图6为本发明实施例3提供的化合物32的核磁氢谱图；
图7为本发明实验例1提供的检测结果图；
图8为细胞毒性试验结果图；
图9为空白对照和10μM浓度的实施例1-4的双光子染料化合物线粒体的成像图；
图10为5μM浓度的实施例1的双光子染料化合物线粒体的成像图；
图11为5μM浓度的实施例2的双光子染料化合物线粒体的成像图；
图12为空白对照的内质网的成像图；
图13为10μM浓度的实施例1的双光子染料化合物内质网的成像图；
图14为10μM浓度的实施例2的双光子染料化合物内质网的成像图；
图15为5μM浓度的实施例1的双光子染料化合物内质网的成像图；；
图16为5μM浓度的实施例2的双光子染料化合物内质网的成像图；
图17为本发明实施例4提供的化合物19的核磁氢谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种双光子染料化合物其选自式1或式2所示化合物中的任意一种：
Figure RE-GDA0003742007940000041
Figure RE-GDA0003742007940000042
其中，R1和R2分别独立地选自氢或取代或未取代烷基，R3选自氢或取代或未取代胺基，n为1-6。本发明实施例以苯丙胺类毒品为基础，引入结构最简单，体积最小的二甲胺基乙酰基萘(ADAN)类脂溶性荧光染料，并选用结构较小的三唑苯丙胺结构和染料结构单元的连接基团，而且连接位点远离氨基活性位点，具有下述优点：(1)染料标记要尽可能小地影响苯丙胺类毒品的结构和理化特征，才能最大程度地模拟此类兴奋剂神经生物学活性；(2)尽管ADAN染料共轭体系小，但是其双光子荧光活性截面足够大，确保良好的双光子成像效果；而且 ADAN染料的荧光性质具有高度的环境敏感性，随周围介质的极性改变而发生荧光光谱的移动，因此可以动态指示探针在细胞内所处不同微环境特性。
具体地，R1和R2分别独立地选自氢、C1-C4未取代烷基和C1-C5取代烷基中的任意一种；例如，R1和R2分别独立地选自氢、甲基和乙基中的任意一种。还可以为异丙基等未取代烷基或者氯代甲基等卤素取代的烷基。
R3选自取代或未取代的叔胺基；例如，R3为
Figure RE-GDA0003742007940000051
其中，R4和R5分别独立地选自氢或取代或未取代烷基；具体地，R4和R5分别独立地选自氢、甲基和乙基中的任意一种。
n为1、2、3和4中的任意一个数值。
进一步地，双光子染料化合物，选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure RE-GDA0003742007940000052
Figure RE-GDA0003742007940000053
中的任意一种。
第二方面，本发明实施例提供一种上述双光子染料化合物的制备方法，参照下述合成路径中的任意一种合成所述双光子染料化合物：
Figure RE-GDA0003742007940000054
Figure RE-GDA0003742007940000055
其中，
R为含有R1和R2的胺基保护基。
例如，参照下述合成路径中的任意一种合成所述双光子染料化合物：
Figure RE-GDA0003742007940000061
其中，化合物8和化合物26的摩尔比为0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50 度，反应时间为0.5～2小时；化合物11和化合物26的摩尔比为0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50度，反应时间为0.5～2小时；化合物17和化合物26的摩尔比为 0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50度，反应时间为0.5～2小时；化合物20和化合物26的摩尔比为0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50度，反应时间为0.5～2小时。
第三方面，本发明提供一种前述实施方式所述的双光子染料化合物在制备示踪苯丙胺类毒品的示踪剂的应用。其中，示踪剂为示踪苯丙胺类毒品摄取、传输和释放中至少一种的试剂。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种双光子染料化合物，其结构式如下所示：
Figure RE-GDA0003742007940000062
本实施例提供一种双光子染料化合物的制备方法，包括：
S1、参照下述合成路径合成原料化合物8；
Figure RE-GDA0003742007940000071
Figure RE-GDA0003742007940000072
具体地：
氮气氛围中，0℃时向化合物1(20.0克，72毫摩尔)的二氯甲烷(100毫升)溶液分批加入三氯化铝(14.3克，107毫摩尔)和吡啶(27毫升，331.2毫摩尔)。反应液缓慢升温至40℃，并回流搅拌过夜。待反应完全后，冷却至室温，缓慢加水(100毫升)淬灭反应，用乙酸乙酯(400毫升×2)萃取。有机相用1N的盐酸水溶液(200毫升× 2)和饱和食盐水(200毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)，减压浓缩得到化合物2(15.5克，收率：82％)。
室温下，向化合物2(10.3克，5.9毫摩尔)DMF(50毫升)溶液中，加入碳酸铯(28.3克，86.9毫摩尔)和二碘甲烷(23.3克，86.9毫摩尔)。反应液升温至120℃，回流反应5小时。待反应完全后，反应液用加入水(300毫升)淬灭，用乙酸乙酯(400 毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(200毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚＝9:1)，减压浓缩得到化合物3 (8.9克，收率：56％)。
氮气氛围下，室温时向化合物3(8.7克，31.5毫摩尔)的硝基乙烷(50毫升)，加如乙酸铵(1.2克，15.8毫摩尔)，反应升温至120℃并回流反应5小时。待反应完全后，冷却至室温，反应液用水(200毫升)稀释，用乙酸乙酯(200毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(200毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品在乙酸乙酯中重结晶，过滤干燥得到化合物4(6.55克，收率：62％)。
氮气氛围下，0℃时向化合物4(6.0克，18.0毫摩尔)溶解于干燥四氢呋喃(50毫升)，缓慢加入硼烷四氢呋喃配合物的四氢呋喃溶液(1M，74毫升，74毫摩尔)。反应液升温至70℃，回流反应过夜。待反应完全后，反应液冷却至0℃，缓慢滴加1N盐酸水溶液(100毫升)淬灭反应，搅拌1小时后再缓慢加入1N氢氧化钠水溶液(100毫升)。得到的混合溶液用乙酸乙酯(200毫升×2)萃取，有机相用饱和食盐水(100毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品5(4.76克，收率：86％)。粗品直接用于下一步，没有进一步纯化。
室温下，将化合物5(4.76克，15.6毫摩尔)溶于二氯甲烷(40毫升)，并加入三乙胺(3.15克，31.2毫摩尔)和二碳酸二叔丁酯(6.8克，31.2毫摩尔)，搅拌反应过夜。待反应完全后，向反应液加水(100毫升)，并用乙酸乙酯(100毫升×2)萃取。有机相用1N盐酸(100毫升×2)洗涤，用饱和食盐水(100毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝9:1)，减压浓缩得到化合物6(2.98克，收率：47％)。
氮气氛围下，化合物6(1.0克，2.47毫摩尔)，双(三苯基膦)氯化钯(II)(173毫克，0.25毫摩尔)，碘化亚铜(94毫克，0.49毫摩尔)，三甲基硅基乙炔(727毫克，7.41 毫摩尔)和三乙胺(1.2克，12.0毫摩尔)的干燥四氢呋喃(10毫升)溶液在70℃回流反应4小时。待反应完全后，反应液冷却至室温后用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(50 毫升×2)洗涤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝ 5:1)，减压浓缩得到化合物7(934毫克，收率：90％)。LCMS:RT＝3.55min；m/z calculated for C20H29NO4Si:375.54；found:398.02[M+Na]+。
氮气氛围下，向化合物7(800毫克，2.13毫摩尔)的二氯甲烷和甲醇溶液(V:V＝1:1， 20毫升)加入碳酸钾(735毫克，5.33毫摩尔)。反应液在氮气保护下常温下反应1小时。待反应完全后，反应液用二氯甲烷(50毫升)稀释，用水(30毫升×2)洗涤。有机相再用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝8:1)，减压浓缩得到化合物8(420毫克，收率：65％)。
S2、参照下述合成路径合成原料化合物26；
Figure RE-GDA0003742007940000081
Figure RE-GDA0003742007940000082
具体地：
依次称取化合物21(3.0克，13.44毫摩尔)，焦亚硫酸钠(5.1克，26.8毫摩尔)，二甲胺盐酸盐(5.5克，67.4毫摩尔)，水(15毫升)和氢氧化钠(2.7克，67.5毫摩尔)置于耐压反应管中。将反应管密封并升温至140℃，搅拌反应3天。待反应完全后，反应液冷却至室温并加入水(50毫升)稀释，用乙酸乙酯(50毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(50毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，减压浓缩得到化合物22(2.64克，收率： 78％)。
氮气氛围下，化合物22(1.0克，4.0毫摩尔)，醋酸钯(89.8毫克，0.4毫摩尔)，双二苯基膦丙烷(329.8毫克，0.8毫摩尔)，乙烯基乙二醇醚(1.1克，12毫摩尔)和三乙胺(1.1克，10.0毫摩尔)的乙二醇(20毫升)溶液在145℃时回流反应6小时。反应液冷却至室温，用二氯甲烷(20毫升)稀释，在加入盐酸水溶液(5％，40毫升)后继续搅拌1小时。待反应完全后，用二氯甲烷(50毫升×2)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，减压浓缩得到化合物23(642毫克，收率：75％)。LCMS:m/z calculated for C12H12BrN: 213.28；found:214.71[M+H]+。
将化合物23(842毫克，3.95毫摩尔)溶于硫酸(13毫升)，室温搅拌10分钟后形成深红色溶液。然后将该溶液移至0℃冰浴中冷却搅拌10分钟后，缓慢滴加冷的溴素(820毫克，5.13毫摩尔)的四氢呋喃(5毫升)溶液，反应液升温至室温并反应4小时。待反应完全后，将反应液缓慢滴入持续搅拌的冰水(50毫升)中得到红褐色的固体。固体用布氏漏斗过滤，用水(20毫升×2)洗涤后得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝15:1)，减压浓缩得到化合物24(1.17克，收率：79％)。LCMS:RT＝4.10 min；m/z calculated forC14H13Br2NO:371.07；found:372.29[M+H]+。
室温时，将化合物24(1.17克，3.14毫摩尔)溶于四氢呋喃(10毫升)中，先后加入亚磷酸二乙酯(521毫克，3.77毫摩尔)和二异丙基乙基胺(486毫克，3.77毫摩尔)，反应液持续搅拌16小时。待反应完全后，反应液用乙酸乙酯(50毫升)稀释，用水(50毫升×2)洗涤。有机相用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)，减压浓缩得到化合物25(790毫克，收率：86％)。
氮气氛围下，0℃时向化合物25(500毫克，1.71毫摩尔)的N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜溶液(V:V＝1:2，6毫升)加入叠氮钠(134毫克，2.05毫摩尔)，然后反应升至室温并搅拌1小时。待反应完全后，用乙酸乙酯(30毫升)稀释反应液，用水(50 毫升×2)洗涤。有机相再用饱和食盐水(20毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到化合物26粗品(420毫克，收率：90％)，粗品直接用于下一步，没有进一步纯化。
S3、参照下述合成路径合成双光子染料化合物即化合物28；
Figure RE-GDA0003742007940000101
具体地：
氮气氛围下，室温时将化合物26(180毫克，0.71毫摩尔)和化合物8(225毫克，0.71毫摩尔)溶于DMF(10毫升)中，依次加入抗坏血酸的水溶液(1M，6.4毫升， 6.4毫摩尔)和硫酸铜的水溶液(1M，2.13毫升，2.13毫摩尔)，然后反应液搅拌1小时。待反应完全后，加水(50毫升)稀释反应液，用乙酸乙酯(50毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(50毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，减压浓缩得到化合物27(310毫克，收率：76％)。LCMS:RT＝2.97min；m/zcalculated for C31H35N5O5:557.65；found:580.85 [M+Na]+。
室温时，向化合物27(240毫克，0.42毫摩尔)的乙酸乙酯和甲醇溶液(V:V＝3:1， 4毫升)中缓慢滴加4N盐酸乙酸乙酯溶液(4毫升),反应液室温搅拌1小时。待反应完全后，反应液直接浓缩得到粗品，粗品通过反相色谱柱纯化(0.1％HCl的水/乙腈＝ 10:90-40:60)，目标组分冻干后得到化合物28(175毫克，收率：88％)。表征图参见图2和图3，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(s,1H),8.39(s,1H),7.95(d,J＝9.1Hz, 1H),7.85(d,J＝8.7Hz,1H),7.75(d,J＝8.9Hz,1H),7.47(s,1H),7.32(d,J＝9.1Hz,1H), 6.99(s,1H),6.86(s,1H),6.28(s,2H),6.16(s,2H),3.15(s,1H),3.09(s,6H),2.90(dd,J＝ 13.7,5.9Hz,1H),2.72(dd,J＝13.6,8.1Hz,1H),1.16(d,J＝6.2Hz,3H).LCMS:RT＝3.84 min；m/zcalculated for C26H27N5O3:457.53；found:458.80[M+H]+。
实施例2
本实施例提供一种双光子染料化合物，其结构式如下所示：
Figure RE-GDA0003742007940000111
本实施例提供一种双光子染料化合物的制备方法，包括：
S1、参照下述合成路径合成原料化合物11；
Figure RE-GDA0003742007940000112
具体地：
氮气氛围下，0℃时向化合物6(1.0克，2.47毫摩尔)的DMF(10毫升)溶液中分批加入NaH(296毫克，7.40毫摩尔)。得到的悬浊液在0℃搅拌0.5小时后加入碘甲烷(701毫克，4.94毫摩尔)，随后反应液常温搅拌过夜。待反应完全后，加入水(50 毫升)淬灭反应，用乙酸乙酯(50毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，减压浓缩得到化合物9(850毫克，收率：82％)。表征图参见图1，LCMS: RT＝4.59min；m/z calculated forC16H22INO4:419.26；found:289.56M-B℃-NMe]+。
氮气氛围下，化合物9(1.0克，2.39毫摩尔)，双(三苯基膦)氯化钯(II)(167毫克，0.24毫摩尔)，碘化亚铜(90毫克，0.48毫摩尔)，三甲基硅基乙炔(703毫克，7.17 毫摩尔)和三乙胺(1.2克，12.0毫摩尔)的干燥四氢呋喃(10毫升)溶液在70℃下回流反应4小时。待反应完全后，反应液冷却至室温后用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(50 毫升×2)洗涤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝ 15:1)，减压浓缩得到化合物10(910毫克，收率：90％)。LCMS:RT＝4.17min；m/z calculated for C21H31NO4Si:389.57；found:187.61[M-B℃-NMe-TMS]+。
氮气氛围下，向化合物10(800毫克，2.05毫摩尔)的二氯甲烷和甲醇溶液(V:V＝1:1， 20毫升)加入碳酸钾(709毫克，5.13毫摩尔)。反应液在氮气保护下常温下反应1小时。待反应完全后，反应液用二氯甲烷(50毫升)稀释，用水(30毫升×2)洗涤。有机相再用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚：乙酸乙酯＝12:1)，减压浓缩得到化合物11(510 毫克，收率：78％)。LCMS:RT＝3.01min,[M+H]+＝318.64,calculated for C8H8O2:317.39。
S2、参照实施例1的方法制备原料化合物26。
S3、参照下述合成路径合成双光子染料化合物，即化合物30；
Figure RE-GDA0003742007940000121
具体地：
氮气氛围下，室温时将化合物26(168毫克，0.66毫摩尔)和化合物11(200毫克，0.66毫摩尔)溶于DMF(10毫升)中，依次加入抗坏血酸的水溶液(1M，6.4毫升， 6.0毫摩尔)和硫酸铜的水溶液(1M，2.0毫升，2.0毫摩尔)，然后反应液搅拌1小时。待反应完全后，加水(50毫升)稀释反应液，用乙酸乙酯(50毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(50毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化，减压浓缩得到化合物29(257毫克，收率：69％)。LCMS:RT＝3.30 min；m/z calculated for C32H37N5O5:571.68；found:594.51[M+Na]+。
室温时，向化合物29(200毫克，0.36毫摩尔)的乙酸乙酯和甲醇溶液(V:V＝3:1， 4毫升)中缓慢滴加4N盐酸乙酸乙酯溶液(4毫升),反应液室温搅拌1小时。待反应完全后，反应液直接浓缩得到粗品，粗品通过反相色谱柱纯化(0.1％HCl的水/乙腈＝ 10:90-40:60)，目标组分冻干后得到化合物30(125毫克，收率：75％)。表征图参见图4和图5，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(s,1H),8.39(s,1H),7.95(d,J＝9.1Hz, 1H),7.85(d,J＝8.8Hz,1H),7.75(d,J＝8.9Hz,1H),7.49(s,1H),7.32(d,J＝9.2Hz,1H), 6.99(s,1H),6.88(s,1H),6.29(s,2H),6.16(s,2H),3.47–3.39(m,1H),3.09(s,7H),2.72– 2.64(m,1H),2.61(s,3H),1.14(d,J＝6.4Hz,3H).LCMS:RT＝1.35min；m/z calculated for C27H29N5O3:471.56；found:472.87[M+H]+。
实施例3
本实施例提供一种双光子染料化合物，其结构式如下所示：
Figure RE-GDA0003742007940000122
本实施例提供一种双光子染料化合物的制备方法，包括：
S1、参照下述合成路径合成原料化合物17；
Figure RE-GDA0003742007940000131
Figure RE-GDA0003742007940000132
具体地：
向化合物12(2.0克，9.38毫摩尔)的甲醇溶液(40毫升)中加入乙酸铵(3.6克，46.7毫摩尔)和氰基硼氢化钠(2.9克，46.1毫摩尔)，随后反应液在80℃回流反应16 小时。待反应完全后，反应液冷却至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液(100毫升)淬灭，减压浓缩除去甲醇溶剂。得到的水溶液用乙酸乙酯(100毫升×2)萃取，有机相用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到化合物13的粗品(2.0克)。粗品直接用于下一步，没有进一步纯化。
将化合物13的粗品(2.0克)溶解于二氯甲烷(20毫升)，并依次加入三乙胺(1.89克，18.7毫摩尔)和二碳酸二叔丁酯(3.07克，14.0毫摩尔)，反应液搅拌过夜。待反应完全后，向反应液加水(100毫升)，并用乙酸乙酯(100毫升×2)萃取。有机相用 1N盐酸(100毫升×2)洗涤，用饱和食盐水(100毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，减压浓缩得到化合物14(2.68克，2步收率：90％)。
在耐压反应瓶中，化合物14(2.8克，8.91毫摩尔)溶解于二氧六环(30毫升)，并依次加入碘化亚铜(1.69克，8.87毫摩尔)，碘化钠(6.68克，44.56毫摩尔)和N,N- 二甲基乙二胺(780毫克，8.84毫摩尔)，密封反应瓶，在140℃加热搅拌反应3天。待反应完全后，反应液倒入水(200毫升)中，并用乙酸乙酯(100毫升×2)萃取。有机相用饱和氯化铵水溶液(100毫升×2)洗涤，用饱和食盐水(100毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，减压浓缩得到化合物15(1.8克，收率：55％)。
氮气氛围下，化合物15(1.7克，4.70毫摩尔)，双(三苯基膦)氯化钯(II)(165 毫克，0.23毫摩尔)，碘化亚铜(90毫克，0.48毫摩尔)，三甲基硅基乙炔(920毫克， 9.36毫摩尔)和三乙胺(1.42克，14.0毫摩尔)的干燥四氢呋喃(20毫升)溶液在70℃下回流反应4小时。待反应完全后，反应液冷却至室温后用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(50毫升×2)洗涤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)，减压浓缩得到化合物16(1.48克，收率：95％)。
氮气氛围下，向化合物16(800毫克，2.41毫摩尔)的二氯甲烷和甲醇溶液(V:V＝1:1， 20毫升)加入碳酸钾(833毫克，6.03毫摩尔)。反应液在氮气保护下常温下反应1小时。待反应完全后，反应液用二氯甲烷(50毫升)稀释，用水(30毫升×2)洗涤。有机相再用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，减压浓缩得到化合物17(500 毫克，收率：79％)。
S2、参照实施例1的方法制备原料化合物26。
S3、参照下述合成路径合成双光子染料化合物，即化合物32；
Figure RE-GDA0003742007940000141
具体地：
氮气氛围下，室温时将化合物26(320毫克，1.25毫摩尔)和化合物17(330毫克，1.28毫摩尔)溶于DMF(10毫升)中，依次加入抗坏血酸的水溶液(1M，10.5毫升， 10.5毫摩尔)和硫酸铜的水溶液(1M，3.8毫升，3.8毫摩尔)，然后反应液搅拌1小时。待反应完全后，加水(50毫升)稀释反应液，用乙酸乙酯(50毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(50毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化，减压浓缩得到化合物31(580毫克，收率：90％)。
室温时，向化合物31(250毫克，0.48毫摩尔)的乙酸乙酯和甲醇溶液(V:V＝3:1， 4毫升)中缓慢滴加4N盐酸乙酸乙酯溶液(4毫升),反应液室温搅拌1小时。待反应完全后，反应液直接浓缩得到粗品，粗品通过反相色谱柱纯化后得到化合物32(110毫克，收率：55％)。表征图参见图6，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.68(s,1H),8.54 (s,1H),8.16(d,J＝17.8Hz,1H),8.01(d,J＝9.1Hz,1H),7.91(d,J＝8.8Hz,1H),7.83(dd, J＝14.7,8.2Hz,3H),7.43(d,J＝8.8Hz,1H),7.35(d,J＝7.7Hz,2H),6.28(s,2H),3.44(s, 1H),3.11(s,6H),3.09–3.01(m,1H),2.72(dd,J＝13.4,9.1Hz,1H),1.14(d,J＝6.4Hz, 3H).LCMS:m/z calculatedfor C25H27N5O:413.53；found:414.1.[M+H]+。
实施例4
本实施例提供一种双光子染料化合物，其结构式如下所示：
Figure RE-GDA0003742007940000151
本实施例提供一种双光子染料化合物的制备方法，包括：
S1、参照下述合成路径合成原料化合物20；
Figure RE-GDA0003742007940000152
具体地：
氮气氛围下，0℃时向化合物15(1.0克，2.76毫摩尔)的DMF(10毫升)溶液中分批加入NaH(220毫克，5.5毫摩尔)。得到的悬浊液在0℃搅拌0.5小时后加入碘甲烷(590毫克，4.15毫摩尔)，随后反应液常温搅拌过夜。待反应完全后，加入水(50 毫升)淬灭反应，用乙酸乙酯(50毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚: 乙酸乙酯＝30:1)，减压浓缩得到化合物18(1.02克，收率：98％)。
氮气氛围下，化合物18(820毫克，2.18毫摩尔)，双(三苯基膦)氯化钯(II)(76 毫克，0.10毫摩尔)，碘化亚铜(41毫克，0.21毫摩尔)，三甲基硅基乙炔(428毫克， 4.35毫摩尔)和三乙胺(1.32克，13.0毫摩尔)的干燥四氢呋喃(10毫升)溶液在70℃下回流反应4小时。待反应完全后，反应液冷却至室温后用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯(50毫升×2)洗涤，滤液减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)，减压浓缩得到化合物19(678毫克，收率：89％)。其表征核磁氢谱图参见图17。
氮气氛围下，向化合物19(550毫克，1.59毫摩尔)的二氯甲烷和甲醇溶液(V:V＝1:1， 12毫升)加入碳酸钾(550毫克，3.98毫摩尔)。反应液在氮气保护下常温下反应1小时。待反应完全后，反应液用二氯甲烷(50毫升)稀释，用水(30毫升×2)洗涤。有机相再用饱和食盐水(30毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)，减压浓缩得到化合物20(405 毫克，收率：93％)。
S2、参照实施例1的方法制备原料化合物26。
S3、参照下述合成路径合成双光子染料化合物，即化合物34；
Figure RE-GDA0003742007940000161
，具体地：
氮气氛围下，室温时将化合物26(220毫克，0.86毫摩尔)和化合物20(230毫克，0.84毫摩尔)溶于DMF(10毫升)中，依次加入抗坏血酸的水溶液(1M，7.5毫升， 7.5毫摩尔)和硫酸铜的水溶液(1M，2.5毫升，2.5毫摩尔)，然后反应液搅拌1小时。待反应完全后，加水(50毫升)稀释反应液，用乙酸乙酯(50毫升×2)萃取。有机相用饱和食盐水(50毫升×2)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到粗品。粗品通过柱层析法纯化，减压浓缩得到化合物33(250毫克，收率：70％)。
室温时，向化合物33(230毫克，0.43毫摩尔)的乙酸乙酯和甲醇溶液(V:V＝3:1， 4毫升)中缓慢滴加4N盐酸乙酸乙酯溶液(4毫升),反应液室温搅拌1小时。待反应完全后，反应液直接浓缩得到粗品，粗品通过反相色谱柱纯化后得到化合物34(105毫克，收率：56％)。LCMS:m/z calculated for C26H29N5O:427.55；found:428.2.[M+H]+。
实验例1
对本发明实施例1-4提供的双光子染料化合物的双光子活性吸收截面积测定，测定方法如下：配置1mL浓度为1μM的双光子染料化合物的二氯甲烷溶液，同时以1.0×10 -5μM罗丹明B的二氯甲烷溶液作为参比，在激发波长688-910nm范围内测定探针的双光子荧光光谱。
结果参见图7，根据图7可知，实施例1的双光子染料化合物的最大吸收波长位于838nm处，其最大双光子活性吸收截面积为714GM；实施例2的双光子染料化合物的最大吸收波长位于837nm处，其最大双光子活性吸收截面积为761GM；实施例3的双光子染料化合物的最大吸收波长位于840nm处，其最大双光子活性吸收截面积为715GM；实施例4的双光子染料化合物的最大吸收波长位于837nm处，其最大双光子活性吸收截面积为761GM。
实验例2
细胞毒性试验
使用CCK8试剂盒测试不同浓度的双光子染料化合物对细胞的毒性，结果如图8所示。从图8中可看出，随着浓度的增加，细胞存活率越低，15μM荧光染料对Pc12细胞的存活率低于50％，表明该染料具有一定的细胞毒性。因此，为保证清晰的细胞成像效果，使用5μM和10μM作为细胞成像的浓度。
细胞成像试验
对本发明实施例1-4的双光子染料化合物进行细胞成像实验，具体过程如下：神经细胞株PC12在37℃、CO2浓度5％孵箱中孵育24小时，吸弃培养基，加入双光子染料化合物(其中，实施例1的双光子染料化合物记为TP-MDA，实施例2的双光子染料化合物记为TP-MDMA，实施例3的双光子染料化合物记为TP-APA，实施例4的双光子染料化合物记为TP-MAP)孵育24小时，PBS清洗三次，再加入商品化细胞染料，孵育20分钟，PBS清洗三次；最后加入细胞核染料DAPI，孵育15分钟。
实验组为4组，分别为：
第一组：取4组培养基，分别向其中加入10μM的实施例1-4提供的双光子染料化合物，孵育结束后加入的商品化细胞染料为商品化线粒体(Mitochondria，简写Mito)染料；
第二组：取2组培养基，分别向其中加入5μM的实施例1和2提供的双光子染料化合物，孵育结束后加入的商品化细胞染料为商品化线粒体(Mitochondria，简写Mito)染料；
针对第一组和第二组实验，以不加双光子染料化合物作为空白对照。
第三组：取2组培养基，分别向其中加入10μM的实施例1和2提供的双光子染料化合物，孵育结束后加入的商品化细胞染料为商品化内质网(ER)染料；
第四组：取2组培养基，分别向其中加入5μM的实施例1和2提供的双光子染料化合物，孵育结束后加入的商品化细胞染料为商品化内质网(ER)染料；
针对第三组和第四组实验，以不加双光子染料化合物作为空白对照。
染色结束后用820nm的激光激发，在明场可以观察到细胞轮廓；用绿色通道(500～550nm)对细胞进行荧光成像，可观察到绿色荧光成像图，此为荧光的细胞成像图；用红色通道(570～620nm)对细胞进行荧光成像时，可观察到红色荧光成像图，此为线粒体或内质网细胞成像图；用蓝色通道(425nm～475nm)对细胞进行荧光成像时，可观察到蓝色荧光成像图，此为细胞核(DAPI)成像图。各实验组的实验结果如图9-16所示。
图9为第一组实验的结果图，图中展示了空白组以及经实施例1-4提供的双光子染料化合物处理后线粒体的成像图，为使结果显示得更明确，左侧为红绿蓝通道的叠加图，蓝色为细胞核，红色为线粒体，绿色为实施例的荧光染色位点。
图10和图11为第二组实验的结果图，图10和11分别为实施例1和2提供的双光子染料化合物处理后线粒体的成像图，为了让结果显示得更明确，每图的左上角图为为红绿蓝通道的叠加图，蓝色为细胞核，红色为线粒体，绿色为实施例的荧光染色位点。
图12-14为第三组实验的结果图，图12-14分别为空白组、实施例1和2提供的双光子染料化合物处理后内质网的成像图，每图的左上角图为红绿蓝通道的叠加图，蓝色为细胞核，红色为内质网，绿色为实施例的荧光染色位点。
图15、16为第四组实验的结果图，图15、16分别为实施例1和2提供的双光子染料化合物处理后内质网的成像图，每图的左上角图为红绿蓝通道的叠加图，蓝色为细胞核，红色为内质网，绿色为实施例的荧光染色位点。
通过图9-16可以清楚地观察到，双光子染料化合物能够附着于神经细胞株PC12，并进入细胞质，对其均匀着色，说明实施例提供的染料对这类神经细胞具有很强的定位能力。这种双光子染料对细胞显影材料的遴选和制备，对于生命科学和材料科学的研究都具有潜在的重要意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种双光子染料化合物，其特征在于，其选自式1或式2所示化合物中的任意一种：
Figure FDA0003624349360000011
Figure FDA0003624349360000012
其中，R1和R2分别独立地选自氢或取代或未取代烷基，R3选自氢或取代或未取代胺基，n为1-6。
2.根据权利要求1所述的双光子染料化合物，其特征在于，R1和R2分别独立地选自氢、C1-C4未取代烷基和C1-C5取代烷基中的任意一种；
优选地，R1和R2分别独立地选自氢、甲基和乙基中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的双光子染料化合物，其特征在于，R3选自取代或未取代的叔胺基；
优选地，R3为
Figure FDA0003624349360000013
其中，R4和R5分别独立地选自氢或取代或未取代烷基；
优选地，R4和R5分别独立地选自氢、甲基和乙基中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的双光子染料化合物，其特征在于，n为1、2、3和4中的任意一个数值。
5.根据权利要求1-4任一项所述的双光子染料化合物，其特征在于，其选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure FDA0003624349360000021
Figure FDA0003624349360000022
中的任意一种。
6.一种权利要求1所述的双光子染料化合物的制备方法，其特征在于，参照下述合成路径中的任意一种合成所述双光子染料化合物：
Figure FDA0003624349360000023
Figure FDA0003624349360000024
其中，R为含有R1和R2的胺基保护基。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，参照下述合成路径中的任意一种合成所述双光子染料化合物：
Figure FDA0003624349360000025
Figure FDA0003624349360000031
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，化合物8和化合物26的摩尔比为0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50度，反应时间为0.5～2小时；
化合物11和化合物26的摩尔比为0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50度，反应时间为0.5～2小时；
化合物17和化合物26的摩尔比为0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50度，反应时间为0.5～2小时；
化合物20和化合物26的摩尔比为0.8:1～1:0.8，反应温度为摄氏10～50度，反应时间为0.5～2小时。
9.一种权利要求1所述的双光子染料化合物在制备示踪苯丙胺类毒品的示踪剂的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述示踪剂为示踪苯丙胺类毒品摄取、传输和释放中至少一种的试剂。
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