CN113848197B

CN113848197B - 一种荧光探针的用途

Info

Publication number: CN113848197B
Application number: CN202111249302.9A
Authority: CN
Inventors: 杨锐; 蒋廷旺; 刘玉申; 况亚伟; 郝明辉; 魏蒙蒙
Original assignee: Changshu No2 People's Hospital; Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu No2 People's Hospital; Changshu Institute of Technology
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2021-10-26
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2041-10-26
Also published as: CN113848197A

Abstract

本发明提供一种荧光探针在观测细胞内线粒体自噬的用途，所述荧光探针的化学结构式如下式所示：该荧光探针具有使用简单和可以高保真成像线粒体自噬过程的优点。

Description

一种荧光探针的用途

技术领域

本发明属于荧光探针应用领域，具体涉及一种荧光探针在观测细胞内线粒体自噬的用途。

背景技术

自噬是降解细胞内多余成分或受损细胞器的重要生理活动，是控制细胞器质量和数量的重要手段，它可以在恶劣条件下维持细胞的存活。作为细胞自噬中重要的一类，线粒体自噬可以特异性清除功能失调的线粒体，调节细胞代谢活动，维持细胞正常生理功能。线粒体自噬异常可引起多种疾病，如神经退行性疾病、癌症、阿尔茨海默病和心血管疾病。监测异常的线粒体自噬有助于理解这些疾病的发病机理，然而，科学界对异常自噬的研究和认识尚处于起步阶段，自噬的机制尚不明确，这一领域的研究人员也一直在寻找有效工具，以期进一步可视化异常自噬。因此，亟需开发相关工具来有效地监测线粒体自噬，这将为进一步深入研究自噬机制，解开疾病发生发展的本质奠定基础。

荧光技术具有操作简单、选择性强、损伤小等独特优势，荧光显微镜可以用于可视化活细胞的动态自噬过程。基于这一手段，开发可以原位、实时可视化线粒体自噬的荧光探针已成为深入理解自噬及其相关领域的一项重要任务。

目前，线粒体追踪型探针和商业溶酶体探针的协同作用已经用于可视化研究线粒体自噬。人们已经开发出一系列线粒体追踪型探针来研究线粒体自噬，但适合观测线粒体自噬的溶酶体探针数量不多。很多溶酶体探针对pH值敏感，会引发其在自噬过程的荧光变化（波长或强度），更重要的是，线粒体自噬过程中溶酶体pH值的变化还可能产生错误荧光信号。由此可见，开发一种荧光性质不受pH值影响的溶酶体探针仍然是一项迫切的任务，也是一个巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种荧光探针在观测细胞内线粒体自噬的用途。

一种荧光探针在观测细胞内线粒体自噬的用途，其特征在于，所述荧光探针的化学结构式如式（I）所示：

（）

其中，R为羟乙基、乙烷基或丙烷基。

溶酶体因其较强的酸性(pH = 4-5)而被人们熟知，但是人们往往忽视了其高粘度(47-190 cP) 特性。溶酶体的高粘度环境为设计合适的粘度响应型溶酶体探针提供思路，本发明的荧光探针没有pH响应的位点，不受pH影响；荧光探针是由吲哚及吲哚碘盐这两部分组成，这两部分结构之间的单键易发生旋转，这可能是其对粘度敏感的原因，更加精确地观测溶酶体粘度变化。

上述的荧光探针的制备方法为2,3,3-三甲基-3H-吲哚与RI混合反应得到化合物Ⅱ，然后将化合物Ⅱ与1H-吲哚-2-甲醛通过Knoevenagel反应合成荧光探针；

（Ⅱ）

作为技术方案的进一步改进，其中，所述Knoevenagel反应中催化剂为有机碱，生成的化合物通过柱色谱法纯化，得到纯净的黄色固体产物即为本发明的荧光探针。其反应路线图如下：

作为技术方案的进一步改进，2,3,3-三甲基-3H-吲哚与RI混合反应得到化合物Ⅱ，其中，二者的物质的量之比为1：（1 .1-1 .2），温度为85-95℃，回流时间为6-10 h；然后将化合物Ⅱ与化合物1H-吲哚-2-甲醛通过Knoevenagel反应合成产物，其中，所述的催化剂为有机碱（哌啶等），反应物的物质的量之比为1：（1.1-1.2），温度为85-95℃，回流时间为6-10 h；最后通过柱色谱法纯化，得到荧光探针。

本发明中的荧光探针为粘度响应型探针，使用时荧光探针与细胞接触，荧光探针穿过细胞膜，细胞染色后，所述荧光探针能使溶酶体显示出绿色荧光，当细胞发生自噬过程时，用该探针与线粒体追踪探针MTDR共染细胞，二者的共定位系数随时间增加而增加，以此成像线粒体的自噬过程。

作为技术方案的进一步改进，所述荧光探针是利用FRET来机制观测细胞内线粒体自噬。

作为技术方案的进一步改进，上述用途中观测细胞内线粒体自噬的方法为：将所述荧光探针、商用的线粒体追踪红色荧光探针（MTR）与体外培养的活细胞接触；以及对接触后的细胞进行荧光信号检测；其中，两个探针产生FRET效应后的荧光强度比变化，是所述细胞内存在自噬线粒体的指示。

本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明的荧光探针不受pH影响，稳定性好，可以更加精确地观测溶酶体粘度变化。进一步说，该探针的毒性低，安全浓度范围为0–8 μM，生物相容性好，可以观测线粒体自噬过程。再一步说，该探针还可通过与MTR之间的FRET效应来更加精细地观测线粒体自噬，这使得其具有重要的实验应用价值。荧光探针在本用途中具有光稳定、毒性低和对粘度敏感的优点。

附图说明

图1为化合物Ⅱ的氢谱图。

图2为荧光探针的氢谱图。

图3为荧光探针的碳谱图。

图4为荧光探针的质谱图。

图5为用不同浓度IVDI孵育HeLa细胞18小时的细胞存活结果图。

图6为IVDI (10 μM)在不同溶剂中的吸收光谱和荧光光谱图。

图7为IVDI和LTR染色HeLa细胞的共聚焦荧光结果图。

图8为IVDI和MTDR分别染色HeLa细胞的共聚焦荧光图像及定位结果图。

图9为IVDI和MTR在FRET机制下细胞荧光图像。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

各实施例中的所用物质均来自于市售产品。其中， 2,3,3-三甲基-3H-吲哚，2-碘乙醇和哌啶来自麦克林；1H-吲哚-2-甲醛购买于百灵威科技公司。吸收光谱的测试仪器为Hitachi U-2910 分光光度计；荧光光谱测试仪器为Hitachi F-2700 分光光度计；pH的调节仪器为METTLER TOLEDO FE20-FiveEasyTM pH-meter；共聚焦显微镜型号为STELLARIS5。

实施例1

荧光探针简称为IVDI的合成

1）苯并吲哚碘乙醇盐（化合物Ⅱ）的合成

将化合物2,3,3-三甲基-3H-吲哚（1.98 mL, 10 mmol）和2-碘乙醇 (1.72 mL, 10mmol)溶于20 mL纯乙醇溶液中，在烧瓶中搅拌1h。然后回流8 h，冷却过滤后用无水EtOH洗涤3次。干燥后得到白色固体3.40 g, 产率：92%，即化合物Ⅱ。并对其进行氢谱表征，结果如下：

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆), δ (ppm): 8.45 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.32 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.81 (t, J = 7.65 Hz, 1H), 5.23(s, 1H), 4.87 (t, J = 4.80 Hz, 2H), 3.90 (t, J = 4.50 Hz, 2H), 3.23 (s, 3H)。如图1所示。

2）荧光探针的合成

将化合物2 (0.331g,1 mmol)和化合物3 (0.145 g,1 mmol)溶于20 mL甲醇中，在烧瓶中搅拌1 h，加入5滴哌啶。搅拌后在85℃下回流8 h，冷却至室温后用石油醚洗涤。以CH₂Cl₂和CH₃OH混合物(CH₂Cl₂和CH₃OH的体积比为10:1 ～6:1)为洗脱液，进行柱色谱分离提纯，得到0.29 g黄色固体即为荧光探针，化学命名为：(E)-2-(2-1H-吲哚-3-乙烯基)-1-(2-羟乙基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-碘盐，简称为IVDI。并对其进行氢谱、碳谱和质谱的表征，通过对化合物的氢谱、碳谱和质谱数据进行分析，确认上述化合物的结构无误。表征结果如下：

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆), δ (ppm): 12.74 (s, 1H), 8.69 (t, J = 15.0Hz, 2H), 8.21-8.25 (m, 1H), 7.82 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 7.6 Hz,1H), 7.61-7.63 (m, 1H), 7.48-7.57 (m, 2H), 7.37-7.41 (m, 3H), 5.28 (t, J =5.4 Hz, 1H), 4.63 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 1.84 (s,6H)。如图2所示。

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d ₆), δ (ppm): 182.01, 149.38, 143.04, 141.92,138.82, 129.12, 127.90, 125.06, 124.86, 123.61, 123.18, 121.77, 116.43,114.36, 113.94, 106.47, 59.11, 51.53, 48.93, 27.17。如图3所示。

HRMS: m/z calculated for [C₂₂H₂₃N₂O]+ 331.1805 ([M-I]+); found:331.2246，如图4所示。

实施例2

探针IVDI的毒性测试-标准MTT法

将对数期生长的HeLa细胞接种于96孔板(约1×104个细胞/孔)，用无细胞的培养基填充小孔作为空白组。将接种的细胞置于37℃，5% CO₂培养箱内孵育24 h，然后将1、2、4、8 μM浓度的IVDI加入到孔中作为实验组。此外，加入终浓度为含0.2 % DMSO的DMEM培养液作为对照组。细胞在37℃，5% CO₂下孵育18小时。然后每孔加入MTT (5 mg/mL)。37℃孵育4h后，加入100 μL 的DMSO。再孵育20分钟后，使用酶标仪测试每个孔在490 nm处的吸光度，细胞毒实验重复4次。

细胞存活率可通过下述公式计算得到：

其中，A_sample为实验组吸光度，A_c为对照组吸光度，A_b为空白组的吸光度。用不同浓度的探针IVDI孵育HeLa细胞18小时的细胞存活率结果见图5，图中显示用8 μM的IVDI孵育HeLa细胞18小时后，细胞存活率仍高达85 %，说明该探针的毒性很低。

实施例3

IVDI 的光物理性质测试实验

用不同比例H₂O和甘油的混合溶剂配制含10 μM IVDI 的测试溶液，将上述溶液用荧光光谱仪测试其荧光发射光谱。测试商用探针（MTR）的吸收光谱和荧光发射光谱。不同pH值（pH= 4.0–9.0）的含2%DMSO的BR缓冲液，分别测试其吸收光谱和荧光发射光谱，结果见图6。

在图（A）中，随着甘油比例的增加，探针的荧光强度逐渐增加，表明该探针对粘度的变化响应明显。从图（B）中可以看出，探针IVDI的荧光发射光谱与MTR的吸收光谱存在较大的重叠，这说明这两个探针可以发生荧光共振能量转移（FRET）过程。从图（C）和图（D）中可以看出，探针IVDI对pH值的变化几乎没有响应。实验说明IVDI是一个粘度敏感的探针，该探针不受pH值变化影响，探针IVDI可以潜在地高保真成像溶酶体及线粒体自噬过程。

实施例4

探针IVDI在活性HeLa细胞中的共定位实验

用DMSO配制浓度为1 mM的探针母液。待HeLa细胞爬片长满盖玻片后，将活性HeLa细胞在含2 μM IVDI的培养液中孵育15 min，PBS冲洗两次后，将2 nM LTR加入培养液中孵育10 min，用荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像，结果见图7。

其中图7是用探针IVDI（2 μM，15 min）和溶酶体红色荧光探针LTR（2 nM，15 min）共同染色活性HeLa细胞的共聚焦显微镜图像。其中IVDI在绿光通道的激发波长为473 nm，荧光收集波长为480-580 nm；LTR在红光通道的激发波长为543 nm，荧光收集波长为580-680 nm；标尺为10 μm。从图中可以看出探针IVDI与LTR有着较大的重叠，共定位系数为0.88（Merged图），充分证明本发明的探针IVDI能够成像活性HeLa细胞的溶酶体。

实施例5

用IVDI观测线粒体自噬过程

首先，用2 μM IVDI和0.2 nM 线粒体追踪深红探针MTDR分别染色HeLa细胞；然后用20 μM CCCP和10 μM 抑肽素 A诱导细胞自噬。用共聚焦显微镜获取不同时间点(0 h、0.25 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h) 的 HeLa细胞荧光图像，并获得相关共定位系数，结果见图8。

其中图(A)是先用2 μM IVDI和0.2 nM MTDR染色，再用含20 μM CCCP和10 μM 抑肽素 A的PBS溶液处理不同时间的HeLa细胞的共聚焦图像。图(B)是与图(A)对应的IVDI和MTDR的共定位系数。IVDI在绿光通道的激发波长为473 nm，荧光收集波长为480-580 nm；MTDR在红光通道的激发波长为635 nm，荧光收集波长为650-750 nm；结果显示IVDI荧光图像与MTDR图像逐渐重叠，IVDI与MTDR的共定位系数从0.25逐渐增加到0.8，成功证明该探针适用于观测线粒体自噬的过程。

实施例6

用IVDI与线粒体追踪红色荧光探针（LTR）的FRET机制观测线粒体自噬过程

首先，用2 μM IVDI和0.2 nM MTR分别染色HeLa细胞；然后用20 μM CCCP和10 μM抑肽素 A诱导细胞自噬。用共聚焦显微镜获取不同时间点(0 h、0.25 h、0.5 h、1.0 h、1.5h、2.0 h、2.5 h) 的HeLa细胞荧光图像，并获得与之相关的绿光通道和红光通道荧光强度比，结果见图9。

图 (A)先用2 μM IVDI和0.2 nM MTDR染色HeLa细胞，再用含20 μM CCCP和10 μM抑肽素 A的PBS溶液处理不同时间点的HeLa细胞的共聚焦图像。图(B)是与图(A)对应的绿光通道和红光通道的荧光强度比。这两个探针的激发波长为473 nm，绿光通道的荧光收集波长为510-560 nm；在红光通道的荧光收集波长为580-680 nm。结果显示，红光通道的荧光强度逐渐增强，绿光通道和红光通道的荧光强度比值逐渐降低，明确提示FRET过程的发生，说明本发明的探针能够利用FRET机制观测线粒体自噬。

最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims

1.一种荧光探针在观测细胞内线粒体自噬的应用，其特征在于，所述荧光探针的化学结构式如式(I)所示：

其中，R为羟乙基、乙烷基或丙烷基；

所述荧光探针能使溶酶体显示出绿色荧光；

将所述荧光探针、商用的线粒体追踪红色荧光探针MTR共染体外培养的活细胞；以及对染色后的细胞进行荧光信号检测；其中，两个探针产生FRET效应后的荧光强度比变化，是所述细胞内存在自噬线粒体的指示。