WO2018174186A1 - 神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法 - Google Patents

神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法 Download PDF

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porous membrane
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polymer porous
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善俊 粕谷
健人 吉岡
萩原　昌彦
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宇部興産株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing differentiation of neural stem cells, a method for preparing neural stem cells, and a method for inducing differentiation of neural stem cells.
  • Non-patent Document 1 a non-patent Document 1
  • Patent Document 1 It has been reported that undifferentiated neural stem cells in which aggregates are not formed (not spheroidized) can be prepared using a honeycomb-shaped porous body (Patent Document 1).
  • the honeycomb-like porous body used in Patent Document 1 is a thin-film structure in which minute holes (including dents) directed in the vertical direction of the film are provided in a honeycomb shape in the plane direction of the film. It is.
  • Polyimide Porous Membrane The polyimide porous membrane has been used for applications such as filters, low dielectric constant films, electrolyte membranes for fuel cells, etc., especially for battery-related applications before the present application.
  • Patent Documents 2 to 4 are particularly excellent in permeability of substances such as gas, high porosity, excellent smoothness of both surfaces, relatively high strength, and in the direction of film thickness despite high porosity.
  • a polyimide porous membrane having a large number of macrovoids having excellent proof stress against compressive stress is described. These are all polyimide porous membranes prepared via an amic acid.
  • a cell culturing method has been reported that includes culturing cells by applying them to a polyimide porous membrane (Patent Document 5).
  • JP 2008-054621 A International Publication No. 2010/038873 JP 2011-219585 A JP 2011-219586 A International Publication No. 2015/012415
  • An object of the present invention is to provide a method capable of suppressing the differentiation of neural stem cells using a completely different means from the conventional methods and supplying a large amount of the neural stem cells.
  • the inventors of the present invention have a three-layer polymer porous structure having two surface layers having a plurality of pores and a macrovoid layer sandwiched between the two surface layers. Surprisingly, it was found that by culturing neural stem cells on a membrane, neural stem cell differentiation can be suppressed, and the present invention has been achieved.
  • the polymer porous membrane has a completely different three-dimensional shape from the honeycomb-like porous body disclosed in Patent Document 1.
  • this invention has the following aspects.
  • a method of inhibiting neural stem cell differentiation (1) applying neural stem cells to the polymer porous membrane, and (2) culturing and proliferating neural stem cells,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • the method comprising: a partition wall; and a plurality of macrovoids surrounded by the partition wall and the surface layers A and B, wherein holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoid.
  • the neural stem cell is a wild type cell.
  • the step (2) is performed for at least 70 days.
  • the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 10,000 times or less than the total volume of the polyimide porous membrane including the cell survival area, any one of [1] to [6] The method according to any one of the above.
  • the polymer porous membrane has a thickness of 5 to 500 ⁇ m.
  • the polymer porous membrane is a polyimide porous membrane.
  • the polyimide porous film is a polyimide porous film containing polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane was colored by heat treatment at 250 ° C. or higher after molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine and a colored precursor.
  • the method according to [11] or [12] which is a polyimide porous membrane.
  • a method for preparing neural stem cells comprising: (1) applying neural stem cells to the polymer porous membrane, and (2) culturing and proliferating neural stem cells,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • a method for inducing differentiation of neural stem cells (1) applying neural stem cells to the polymer porous membrane; (2) culturing and proliferating neural stem cells, (3) comprising culturing the neural stem cells obtained in step (2) under differentiation-inducing conditions
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • a partition, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition and the surface layers A and B, and holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoid; The method, wherein differentiation of neural stem cells is suppressed in the step (2).
  • neural stem cell differentiation can be suppressed and a large amount of the cells can be supplied.
  • FIG. 1 shows a model diagram of cell culture using a polyimide porous membrane.
  • FIG. 2 shows an optical micrograph of spheroids of neural stem cells after 10 days from the start of cultivation on a polyimide porous membrane.
  • FIG. 3 is a photomicrograph when immunostaining spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane into the culture medium after 10 days from the start of culture. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (nuclear staining marker): blue, nestin (neural stem cell marker): green, SOX2 (neural stem cell marker): red.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 4 is a photomicrograph when immunostaining spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane into the culture medium after 70 days from the start of culture.
  • DAPI blue
  • nestin green
  • SOX2 red.
  • FIG. 5 shows that, after 30 days from the start of culture, EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was incorporated as an indicator of DNA synthesis into the cell mass of neural stem cells cultured in and on the polyimide porous membrane.
  • EdU 5-ethynyl-2′-deoxyuridine
  • FIG. 6 shows a photomicrograph when EdU is fluorescently labeled after incorporation of EdU as an indicator of DNA synthesis into the cell mass of neural stem cells cultured in and on the polyimide porous membrane after 30 days from the start of culture. (Center and right). Also shown are micrographs when immunostaining SOX2 (left and right).
  • FIG. 7 shows that the differentiation-inducing agent platelet-derived growth factor (Platelet-derived growth factor (PDGF)) is added to neural stem cell spheroids released from the polyimide porous membrane on the 10th day of culture and cultured for 5 days. It is a microscope picture when immunostaining after having carried out.
  • PDGF differentiation-inducing agent platelet-derived growth factor
  • FIG. 8 is a photomicrograph of immunostaining after culturing for 5 days by adding forskolin as a differentiation inducer to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 10th day of culture.
  • DAPI Blue, microtubule-associated protein 2 (MAP2) (neuronal dendritic marker): green, ⁇ -aminobutyric acid (GABA) (GABAergic neuron molecular marker): red.
  • MAP2 microtubule-associated protein 2
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • FIG. 9 is a photomicrograph of immunostaining after culturing for 5 days after adding forskolin, a differentiation inducer, to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 10th day of culture.
  • DAPI blue
  • MAP2 green
  • Glu glutamic acid
  • FIG. 10 is a photomicrograph of immunostaining after culturing for 5 days after adding PDGF as a differentiation inducer to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 70th day of culture.
  • DAPI Blue
  • Neuronal mark Green
  • GFAP Red.
  • FIG. 11 is a photomicrograph of immunostaining after culturing for 5 days by adding forskolin as a differentiation-inducing agent to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 70th day of culture.
  • DAPI Blue
  • MAP2 Green
  • GABA Red
  • FIG. 12 is a photomicrograph of immunostaining after culturing for 5 days by adding forskolin, a differentiation inducer, to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 70th day of culture.
  • DAPI Blue
  • MAP2 Green
  • Glu Red.
  • FIG. 13 shows the immunization after culturing for 5 days by adding bone-morphogenetic protein-protein-2 (BMP2), which is an astrocyte-dominated differentiation inducer, to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 70th day of culture. It is a microscope picture when dyeing
  • DAPI Blue
  • GFAP Red
  • FIG. 14 is a photomicrograph of immunostaining after adding BMP2 (100 ng / mL) to the spheroid of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 225th day of culture and culturing for 5 days.
  • DAPI Blue
  • GFAP Red.
  • FIG. 15 shows a microscope when immunostaining was performed after adding PDGF (10 ng / mL) as a differentiation inducer to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 225th day of culture and culturing for 5 days. It is a photograph.
  • GFAP red
  • MAP2 green
  • DAPI blue
  • FIG. 16 shows a microscope when immunostaining was performed after adding PDGF (10 ng / mL) as a differentiation inducer to spheroids of neural stem cells released from the polyimide porous membrane on the 225th day of culture and culturing for 5 days. It is a photograph.
  • NG2 molecular marker of juvenile oligodendrocyte
  • O4 molecular marker of mature oligodendrocyte
  • One aspect of the present invention is a method of inhibiting neural stem cell differentiation, (1) applying neural stem cells to the polymer porous membrane, and (2) culturing and proliferating neural stem cells
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • the method includes a partition wall and a plurality of macrovoids surrounded by the partition wall and the surface layers A and B, and holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoid.
  • the differentiation suppression method of the present invention it is also referred to as “the differentiation suppression method of the present invention”.
  • Another aspect of the present invention is a method for preparing neural stem cells, (1) applying neural stem cells to the polymer porous membrane, and (2) culturing and proliferating neural stem cells
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • Another aspect of the present invention is a method for inducing differentiation of neural stem cells, (1) applying neural stem cells to the polymer porous membrane; (2) culturing and proliferating neural stem cells, (3) comprising culturing the neural stem cells obtained in step (2) under differentiation-inducing conditions,
  • the polymer porous membrane has a three-layered polymer porous structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B
  • the average pore diameter of the pores present in the surface layer A is smaller than the average pore diameter of the pores present in the surface layer B
  • the macrovoid layer is bonded to the surface layers A and B.
  • differentiation induction method of the present invention it is also referred to as “differentiation induction method of the present invention”.
  • the differentiation-inhibiting method of the present invention “the preparation method of the present invention”, and “the differentiation-inducing method of the present invention” are hereinafter also referred to as “the method of the present invention”.
  • neural stem cells are cells having the ability to self-renew and to differentiate into neurons and glial cells.
  • the type of neural stem cell that can be used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a mammalian neural stem cell, more preferably a primate (human, monkey, etc.), rodent (mouse, rat, guinea pig, etc.). , Cats, dogs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats or ferret neural stem cells, particularly preferably human neural stem cells.
  • the method for obtaining neural stem cells used in the method of the present invention is not particularly limited. For example, it may be isolated from the central nervous tissue of an animal. As the central nervous tissue, hippocampus, lateral ventricle and the surrounding tissue are preferable. Further, the development / development stage of the animal is not particularly limited, and may be any of fetus (fetus), immature individual, adult and the like.
  • the neural stem cells used in the method of the present invention are embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryonic germ stem cells (EG cells), nuclear transplant ES cells, somatic cell-derived ES cells. (NtES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), MUSE cells (Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell) and the like may be obtained by inducing differentiation.
  • the neural stem cells used in the method of the present invention may be wild-type cells or mutant cells (for example, cells derived from p38 ⁇ heterozygous mice (Yoshioka, K. et al., FEBS Open Bio 5 (2015) 437-444))).
  • the step of applying the neural stem cell used in the present invention to the polymer porous membrane is not limited, but in the method of the present invention, the application of the neural stem cell to the polymer porous membrane is, for example, as follows. Including embodiments.
  • A an embodiment comprising the step of seeding neural stem cells on the surface of the porous polymer membrane; (B) placing a neural stem cell suspension on the dry surface of the polymer porous membrane; Leave or move the polymer porous membrane to promote fluid outflow, or stimulate a portion of the surface to suck a neural stem cell suspension into the membrane; and The neural stem cells in the neural stem cell suspension are retained in the membrane, and the water flows out.
  • An embodiment comprising steps; and (C) Wetting one or both sides of the polymer porous membrane with a cell culture solution or a sterilized liquid, Loading the wet polymer porous membrane with a neural stem cell suspension; and The neural stem cells in the neural stem cell suspension are retained in the membrane, and the water flows out.
  • a mode comprising the steps.
  • the embodiment includes directly seeding cells or cell clusters on the surface of the polymer porous membrane.
  • a mode in which a polymer porous membrane is placed in a neural stem cell suspension and a cell culture solution is infiltrated from the surface of the membrane is also included.
  • neural stem cells seeded on the surface of the polymer porous membrane adhere to the polymer porous membrane and enter the porous interior.
  • the neural stem cell spontaneously adheres to the porous polymer membrane without particularly applying physical or chemical force from the outside.
  • Neural stem cells seeded on the surface of the polymer porous membrane can stably grow and proliferate on the surface and / or inside of the membrane. Neural stem cells can take a variety of different forms depending on the position of the membrane where they grow and proliferate.
  • the neural stem cell suspension is placed on the dried surface of the polymer porous membrane.
  • the polymer porous membrane By leaving the polymer porous membrane, or moving the polymer porous membrane to promote the outflow of the liquid, or stimulating a part of the surface to suck the neural stem cell suspension into the membrane
  • the neural stem cell suspension penetrates into the membrane. Without being bound by theory, it is thought that this is due to the properties derived from the surface shape of the polymer porous membrane.
  • neural stem cells are sucked and seeded at a location where the membrane is loaded with the neural stem cell suspension.
  • a part or the whole of one or both sides of the polymer porous membrane is wetted with a cell culture medium or a sterilized liquid, and then the neural stem cell suspension is placed on the wet polymer porous membrane.
  • a turbid solution may be loaded. In this case, the passage speed of the neural stem cell suspension is greatly improved.
  • a method of wetting a part of the membrane electrode for the main purpose of preventing the scattering of the membrane (hereinafter referred to as “one-point wet method”) can be used.
  • the one-point wet method is substantially similar to the dry method (the embodiment (B)) that does not substantially wet the film.
  • a method in which a neural stem cell suspension is loaded onto a polymer porous membrane that is sufficiently wetted on one or both sides hereinafter, referred to as “wet membrane”).
  • This is referred to as “wet film method”.
  • the passage speed of the neural stem cell suspension is greatly improved in the entire polymer porous membrane.
  • the neural stem cells in the neural stem cell suspension are retained in the membrane, and the water is allowed to flow out.
  • processing such as concentrating the concentration of neural stem cells in the neural stem cell suspension and allowing unnecessary components other than neural stem cells to flow out together with moisture.
  • the mode of (A) may be referred to as “natural seeding”, and the modes of (B) and (C) may be referred to as “suction sowing”.
  • the living cells selectively remain in the polymer porous membrane.
  • live cells remain in the polymer porous membrane and dead cells preferentially flow out with moisture.
  • the sterilized liquid used in the embodiment (C) is not particularly limited, but is a sterilized buffer or sterilized water.
  • the buffer include (+) and ( ⁇ ) Dulbecco ’s PBS, (+) and ( ⁇ ) Hank's Balanced Salt Solution. Examples of buffer solutions are shown in Table 1 below.
  • neural stem cells can be applied to a polymer porous membrane in such a manner that neural stem cells adhere to the membrane by suspending neural stem cells in suspension with the polymer porous membrane (entanglement). Including).
  • a cell culture medium a cell culture medium, neural stem cells and one or more of the polymer porous membranes may be placed in a cell culture container.
  • the cell culture medium is liquid
  • the polymer porous membrane is in a suspended state in the cell culture medium. Due to the nature of the polymer porous membrane, neural stem cells can adhere to the polymer porous membrane. Therefore, the polymer porous membrane can be cultured in a suspended state in the cell culture medium.
  • neural stem cells spontaneously adhere to the polymeric porous membrane. “Spontaneously adheres” means that neural stem cells remain on or inside the polymer porous membrane without any physical or chemical force applied from the outside.
  • neural stem cells may be applied to the polymer porous membrane by combining two or more of the embodiments (A) to (C).
  • Steps for culturing and proliferating neural stem cells used in the present invention The culture of neural stem cells used in the present invention may be performed by adhesion culture in which cells adhere to a polymer porous membrane, or cells are cultured. You may carry out by the floating culture
  • the polymer porous membrane when used in a suspended state in the cell culture medium, two or more pieces of the polymer porous membrane may be used. Since the polymer porous membrane is a three-dimensional and flexible thin film, the polymer porous membrane has a large surface area that can be cultured in a certain volume of cell culture medium by using, for example, small pieces suspended in the culture medium. Can be brought in. In the case of normal culture, the container bottom area is the upper limit of the cell culture area, but in the cell culture using the polymer porous membrane in the method of the present invention, all of the large surface area of the previously introduced polymer porous membrane is used. Is the area where cells can be cultured.
  • the polymer porous membrane allows the cell culture medium to pass therethrough, for example, nutrition and oxygen can be supplied into the folded membrane.
  • the polymer porous membrane is completely different from the conventional flat culture and is a cell culture substrate having a three-dimensional and flexible structure. Culturing is possible even in a culture container of material and size (for example, petri dishes, flasks, tanks, bags, etc.).
  • the size and shape of the polymer porous membrane pieces are not particularly limited.
  • the shape can take any shape such as a circle, an ellipse, a square, a triangle, a polygon, and a string.
  • the porous polymer membrane used in the method of the present invention is flexible and can be used by changing its shape.
  • the polymer porous membrane may be processed into a three-dimensional shape instead of a flat shape.
  • a polymer porous membrane is i) folded, ii) rolled into a roll, iii) a sheet or piece is connected with a thread-like structure, or iv) tied in a rope, in a cell culture vessel May be suspended or fixed in the cell culture medium.
  • a polymer porous membrane is i) folded, ii) rolled into a roll, iii) a sheet or piece is connected with a thread-like structure, or iv) tied in a rope, in a cell culture vessel May be suspended or fixed in the cell culture medium.
  • two or more polymer porous membranes may be laminated in the cell culture medium vertically or horizontally.
  • Lamination also includes an embodiment in which polymer porous membranes partially overlap.
  • the laminated culture it becomes possible to culture neural stem cells at high density in a narrow space. It is also possible to form a multilayer system with different types of cells by further stacking the membranes on the membranes on which neural stem cells have already been grown.
  • the number of polymer porous membranes to be laminated is not particularly limited.
  • neural stem cells grow and proliferate on and inside the polymer porous membrane.
  • Neural stem cells can be cultured while inhibiting differentiation over a long period of at least 225 days, or at least 300 days. Further, according to the method of the present invention, it is possible to cultivate in a conventional plane culture or longer, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, 3 times or more, 3.5 times or more of the planar culture period. Neural stem cells can be cultured while suppressing differentiation for a period of at least 4 times, at least 4 times, and at least 4.5 times.
  • spheroids generated in long-term cell culture in a petri dish or the like are not deformed or lost their ability to differentiate, and are dynamic rather than in a resting state. It is possible to maintain the neural stem cells that have been maintained for a long time. Further, according to the present invention, even in the case of neural stem cells cultured for a long period of time, the cell viability or the properties of the neural stem cells (for example, the expression level of cell surface markers, etc.) are almost changed compared to the neural stem cells before long-term culture. do not do.
  • neural stem cells proliferate three-dimensionally in the polymer porous membrane, so that contact inhibition caused by the limitation of the culture area and the planar environment as seen in conventional planar culture hardly occurs. Therefore, the culture can be grown for a long time. Further, according to the present invention, it is possible to arbitrarily increase the space in which cell culture is possible by bringing another polymer porous membrane into contact with the polymer porous membrane to which neural stem cells are adhered. Without performing a subculture operation with trypsin treatment, it is possible to perform culture that grows for a long period of time while avoiding a confluent state in which contact inhibition is caused. In addition, according to the present invention, there is also provided a new storage method in which neural stem cells are stored for a long period of time without being frozen.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A (hereinafter also referred to as “A surface” or “mesh surface”) in the porous polymer membrane used in the present invention is for example, the lower limit is 0.01 ⁇ m or more, 0.1 ⁇ m or more, 1 ⁇ m or more, 2 ⁇ m or more, 3 ⁇ m or more, 4 ⁇ m or more, 5 ⁇ m or more, 6 ⁇ m or more, 7 ⁇ m or more, 8 ⁇ m or more, 9 ⁇ m or more, or 10 ⁇ m.
  • the upper limit is less than 200 ⁇ m, 150 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, 40 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less, 20 ⁇ m or less, or 15 ⁇ m or less.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A is preferably 0.01 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, and particularly preferably 5 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B (hereinafter also referred to as “B surface” or “large hole surface”) in the polymer porous membrane used in the present invention is the average pore diameter of the pores existing in the surface layer A.
  • the lower limit is, for example, more than 5 ⁇ m, 20 ⁇ m or more, 30 ⁇ m or more, 40 ⁇ m or more, 50 ⁇ m or more, or 60 ⁇ m or more
  • the upper limit is 200 ⁇ m or less, 150 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 90 ⁇ m or less, 80 ⁇ m or less or 70 ⁇ m or less.
  • the average pore diameter of the pores existing in the surface layer B is preferably 20 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the average pore diameter on the surface of the polymer porous membrane is determined by measuring the pore area for 200 or more apertures from the scanning electron micrograph on the surface of the porous membrane, and determining the pore size according to the following formula (1)
  • the average diameter when the shape is assumed to be a perfect circle can be obtained by calculation.
  • Sa means the average value of the pore area.
  • the thickness of the surface layers A and B is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 50 ⁇ m, preferably 0.01 to 20 ⁇ m.
  • the average pore diameter in the plane direction of the macrovoids in the macrovoid layer in the polymer porous membrane is not particularly limited, but is, for example, 10 to 500 ⁇ m, preferably 10 to 100 ⁇ m, and more preferably 10 to 80 ⁇ m.
  • the thickness of the partition wall in the macrovoid layer is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 50 ⁇ m, and preferably 0.01 to 20 ⁇ m.
  • at least one partition wall in the macrovoid layer has one or more average pore diameters of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, communicating adjacent macrovoids. Has holes.
  • the partition in the macrovoid layer has no pores.
  • the film thickness of the polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited, but may be 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, 20 ⁇ m or more, or 25 ⁇ m or more, 500 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 75 ⁇ m or less, or 50 ⁇ m. It may be the following.
  • the thickness is preferably 5 to 500 ⁇ m, more preferably 25 to 75 ⁇ m.
  • the measurement of the thickness of the polymer porous membrane used in the present invention can be performed with a contact-type thickness meter.
  • the porosity of the polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited, but is, for example, 40% or more and less than 95%.
  • the porosity of the polymer porous membrane used in the present invention can be determined according to the following formula (2) from the basis weight by measuring the thickness and mass of the porous film cut to a predetermined size.
  • S represents the area of the porous film
  • d represents the film thickness
  • w represents the measured mass
  • D represents the density of the polymer.
  • the density is 1.34 g / cm 3 . To do.
  • the polymer porous membrane used in the present invention is preferably a three-layer structure having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the macrovoid layer includes a partition bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition and the surface layers A and B.
  • the partition of the macrovoid layer and the surface The thicknesses of the layers A and B are 0.01 to 20 ⁇ m, the holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoids, the total film thickness is 5 to 500 ⁇ m, and the porosity is 40% or more. Less than 95% Is mer porous membrane.
  • the at least one partition wall in the macrovoid layer has one or more pores having an average pore diameter of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, communicating adjacent macrovoids. Have In another embodiment, the septum does not have such holes.
  • the polymer porous membrane used in the present invention is preferably sterilized.
  • the sterilization treatment is not particularly limited, and includes any sterilization treatment such as dry heat sterilization, steam sterilization, sterilization with a disinfectant such as ethanol, and electromagnetic wave sterilization such as ultraviolet rays and gamma rays.
  • the polymer porous membrane used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above structural characteristics, but is preferably a porous membrane of polyimide or polyethersulfone (PES).
  • PES polyethersulfone
  • Polyimide is a general term for polymers containing imide bonds in repeating units, and usually means an aromatic polyimide in which aromatic compounds are directly linked by imide bonds.
  • Aromatic polyimide has a conjugated structure through the imide bond between aromatic and aromatic, so it has a rigid and strong molecular structure, and the imide bond has a strong intermolecular force, so it has a very high level of heat. Has mechanical, mechanical and chemical properties.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous membrane containing (obtained as a main component) a polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine, more preferably tetracarboxylic dianhydride. It is a polyimide porous membrane which consists of a polyimide obtained from a thing and diamine. “Containing as a main component” means that a component other than polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine may be essentially not included or included as a component of the polyimide porous membrane. It means that it is an additional component that does not affect the properties of the polyimide obtained from tetracarboxylic dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is prepared by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component and a colored precursor, and then at 250 ° C.
  • the colored polyimide porous membrane obtained by heat treatment as described above is also included.
  • Polyamic acid is obtained by polymerizing a tetracarboxylic acid component and a diamine component.
  • Polyamic acid is a polyimide precursor that can be ring-closed to form polyimide by thermal imidization or chemical imidization.
  • the polyamic acid even if a part of the amic acid is imidized, it can be used as long as it does not affect the present invention. That is, the polyamic acid may be partially thermally imidized or chemically imidized.
  • fine particles such as an imidization catalyst, an organic phosphorus-containing compound, inorganic fine particles, and organic fine particles can be added to the polyamic acid solution as necessary.
  • fine particles such as a chemical imidating agent, a dehydrating agent, inorganic fine particles, and organic fine particles, etc. can be added to a polyamic acid solution as needed. Even when the above components are added to the polyamic acid solution, it is preferable that the coloring precursor is not precipitated.
  • colored precursor means a precursor that is partially or wholly carbonized by heat treatment at 250 ° C. or higher to produce a colored product.
  • the colored precursor that can be used in the production of the polyimide porous membrane is uniformly dissolved or dispersed in a polyamic acid solution or a polyimide solution, 250 ° C. or higher, preferably 260 ° C. or higher, more preferably 280 ° C. or higher, more preferably Is thermally decomposed and carbonized by heat treatment at 300 ° C. or higher, preferably 250 ° C. or higher in the presence of oxygen such as air, preferably 260 ° C. or higher, more preferably 280 ° C. or higher, more preferably 300 ° C. or higher.
  • Those that produce colored products are preferred, those that produce black colored products are more preferred, and carbon-based colored precursors are more preferred.
  • the carbon-based coloring precursor is not particularly limited.
  • polymers such as petroleum tar, petroleum pitch, coal tar, coal pitch, or polymers obtained from monomers including pitch, coke, and acrylonitrile, ferrocene compounds (ferrocene and ferrocene derivatives). Etc.
  • the polymer and / or ferrocene compound obtained from the monomer containing acrylonitrile are preferable, and polyacrylonitrile is preferable as a polymer obtained from the monomer containing acrylonitrile.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is obtained by molding a polyamic acid solution obtained from a tetracarboxylic acid component and a diamine component without using the above colored precursor, A polyimide porous membrane obtained by heat treatment is also included.
  • a polyimide porous membrane produced without using a colored precursor is composed of, for example, 3 to 60% by mass of a polyamic acid having an intrinsic viscosity of 1.0 to 3.0 and 40 to 97% by mass of an organic polar solvent.
  • the polyamic acid solution is cast into a film and immersed in or contacted with a coagulation solvent containing water as an essential component to produce a polyamic acid porous film, and then the polyamic acid porous film is heat-treated to form an imide. May be manufactured.
  • the coagulation solvent containing water as an essential component is water or a mixed solution of 5% by mass or more and less than 100% by mass of water and more than 0% by mass and 95% by mass or less of an organic polar solvent. May be.
  • plasma treatment may be performed on at least one surface of the obtained porous polyimide film.
  • any tetracarboxylic dianhydride can be used, and can be appropriately selected according to desired characteristics.
  • Specific examples of tetracarboxylic dianhydride include pyromellitic dianhydride, 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA), 2,3,3 ′, 4 ′.
  • -Biphenyltetracarboxylic dianhydride such as biphenyltetracarboxylic dianhydride (a-BPDA), oxydiphthalic dianhydride, diphenylsulfone-3,4,3 ', 4'-tetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) sulfide dianhydride, 2,2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) -1,1,1,3,3,3-hexafluoropropane dianhydride, 2, 3,3 ′, 4′-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, 3,3 ′, 4,4′-benzophenone tetracarboxylic dianhydride, bis (3,4-dicarboxyphenyl) methane dianhydride 2,2-bis (3,4-dicarboxyphenyl) propane dianhydride, p-phenylenebis (trimellitic acid monoester acid an
  • At least one aromatic tetracarboxylic dianhydride selected from the group consisting of biphenyltetracarboxylic dianhydride and pyromellitic dianhydride is particularly preferable.
  • the biphenyltetracarboxylic dianhydride 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride can be suitably used.
  • Arbitrary diamine can be used for the diamine which can be used in manufacture of the said polyimide porous membrane.
  • diamines include the following. 1) One benzene nucleus such as 1,4-diaminobenzene (paraphenylenediamine), 1,3-diaminobenzene, 2,4-diaminotoluene, 2,6-diaminotoluene, etc .; 2) 4,4'-diaminodiphenyl ether, diaminodiphenyl ether such as 3,4'-diaminodiphenyl ether, 4,4'-diaminodiphenylmethane, 3,3'-dimethyl-4,4'-diaminobiphenyl, 2,2'- Dimethyl-4,4′-diaminobiphenyl, 2,2′-bis (trifluoromethyl) -4,4′-diaminobiphenyl, 3,3′-dimethyl-4,4′-dia
  • diamine to be used can be appropriately selected according to desired characteristics.
  • aromatic diamine compounds are preferable, and 3,3′-diaminodiphenyl ether, 3,4′-diaminodiphenyl ether, 4,4′-diaminodiphenyl ether and paraphenylenediamine, 1,3-bis (3-aminophenyl) Benzene, 1,3-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (3-aminophenyl) benzene, 1,4-bis (4-aminophenyl) benzene, 1,3-bis (4-amino) Phenoxy) benzene and 1,4-bis (3-aminophenoxy) benzene can be preferably used.
  • at least one diamine selected from the group consisting of benzenediamine, diaminodiphenyl ether and bis (aminophenoxy) phenyl is preferred.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention has a glass transition temperature of 240 ° C. or higher or a clear transition point at 300 ° C. or higher from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperatures. It is preferably formed from a polyimide obtained by combining acid dianhydride and diamine.
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention is preferably a polyimide porous membrane made of the following aromatic polyimide from the viewpoints of heat resistance and dimensional stability at high temperatures.
  • an aromatic polyimide comprising at least one tetracarboxylic acid unit selected from the group consisting of a biphenyltetracarboxylic acid unit and a pyromellitic acid unit, and an aromatic diamine unit
  • an aromatic polyimide comprising a tetracarboxylic acid unit and at least one aromatic diamine unit selected from the group consisting of a benzenediamine unit, a diaminodiphenyl ether unit and a bis (aminophenoxy) phenyl unit;
  • the polyimide porous membrane that can be used in the present invention preferably includes a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the macrovoid layer has a partition wall bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition wall and the surface layers A and B, and the partition wall of the macrovoid layer, and the The thicknesses of the surface layers A and B are 0.01 to 20 ⁇ m, the holes in the surface layers A and B communicate with the macrovoids, the total film thickness is 5 to 500 ⁇ m, and the porosity is 40%. More than 95% Imide porous film.
  • at least one partition wall in the macrovoid layer has one or a plurality of holes having an average pore diameter of 0.01 to 100 ⁇ m, preferably 0.01 to 50 ⁇ m, which communicate adjacent macrovoids.
  • polyimide porous membrane described in International Publication WO2010 / 038873, JP2011-219585, or JP2011-219586 can also be used in the present invention.
  • the PES porous membrane that can be used in the present invention contains polyethersulfone, and is typically substantially composed of polyethersulfone.
  • Polyethersulfone may be synthesized by a method known to those skilled in the art, for example, a method of polycondensation reaction of a dihydric phenol, an alkali metal compound and a dihalogenodiphenyl compound in an organic polar solvent, An alkali metal disalt can be synthesized in advance and can be produced by a polycondensation reaction with a dihalogenodiphenyl compound in an organic polar solvent.
  • alkali metal compound examples include alkali metal carbonates, alkali metal hydroxides, alkali metal hydrides, alkali metal alkoxides, and the like.
  • sodium carbonate and potassium carbonate are preferable.
  • dihydric phenol compounds examples include hydroquinone, catechol, resorcin, 4,4′-biphenol, bis (hydroxyphenyl) alkanes (for example, 2,2-bis (hydroxyphenyl) propane, and 2,2-bis (hydroxyphenyl) Methane), dihydroxydiphenyl sulfones, dihydroxydiphenyl ethers, or at least one hydrogen of the benzene ring is a lower alkyl group such as a methyl group, an ethyl group or a propyl group, or a lower alkoxy group such as a methoxy group or an ethoxy group.
  • the substituted one is mentioned.
  • the dihydric phenol compound a mixture of two or more of the above compounds can be used.
  • the polyethersulfone may be a commercially available product.
  • a commercial item Sumika Excel 7600P, Sumika Excel 5900P (above, Sumitomo Chemical Co., Ltd. product) etc. are mentioned.
  • the logarithmic viscosity of the polyethersulfone is preferably 0.5 or more, more preferably 0.55 or more from the viewpoint of satisfactorily forming the macrovoids of the PES porous membrane, and the ease of production of the porous polyethersulfone membrane In view of the above, it is preferably 1.0 or less, more preferably 0.9 or less, still more preferably 0.8 or less, and particularly preferably 0.75 or less.
  • the PES porous membrane or polyethersulfone as a raw material thereof has a glass transition temperature of 200 ° C. or higher or a clear glass transition temperature from the viewpoint of heat resistance and dimensional stability at high temperatures. Preferably it is not observed.
  • the production method of the PES porous membrane that can be used in the present invention is not particularly limited.
  • a polyethersulfone solution containing 0.3% to 60% by weight of polyethersulfone having a logarithmic viscosity of 0.5 to 1.0 and 40% to 99.7% by weight of an organic polar solvent is cast into a film.
  • the PES porous membrane that can be used in the present invention preferably has a surface layer A, a surface layer B, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B. Because the macrovoid layer includes a partition bonded to the surface layers A and B, and a plurality of macrovoids surrounded by the partition and the surface layers A and B and having an average pore diameter of 10 ⁇ m to 500 ⁇ m in the film plane direction.
  • the partition wall of the macrovoid layer has a thickness of 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m
  • Each of the surface layers A and B has a thickness of 0.1 ⁇ m to 50 ⁇ m
  • one has a plurality of pores having an average pore diameter of more than 5 ⁇ m and not more than 200 ⁇ m, and the other has a plurality of pores having an average pore diameter of 0.01 ⁇ m or more and less than 200 ⁇ m
  • the surface opening ratio of one of the surface layer A and the surface layer B is 15% or more, and the surface opening ratio of the other surface layer is 10% or more
  • the pores of the surface layer A and the surface layer B communicate with the macrovoid;
  • the PES porous membrane has a total film thickness of 5 ⁇ m to 500 ⁇ m and a porosity of 50% to 95%. PES porous membrane.
  • FIG. 1 shows a model diagram of cell culture using a polymer porous membrane.
  • FIG. 1 is a diagram for assisting understanding, and each element is not an actual size.
  • neural stem cells are applied to the polymer porous membrane and cultured, a large amount of neural stem cells grow on the multifaceted connected porous portions and surfaces of the polymer porous membrane.
  • the neural stem cells can be cultured easily.
  • a large amount of neural stem cells can be cultured while the amount of medium used for cell culture is greatly reduced as compared with the conventional method.
  • the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture container can be significantly reduced with respect to the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area.
  • the volume occupied by the porous polymer membrane not containing cells in the space including the volume of the internal gap is referred to as “apparent polymer porous membrane volume” (see FIG. 1).
  • apparent polymer porous membrane volume the volume occupied by the porous polymer membrane not containing cells in the space including the volume of the internal gap.
  • the polymer porous membrane volume including the cell survival area is apparently about 50% larger than the polymer porous membrane volume at the maximum.
  • a plurality of polymer porous membranes can be accommodated and cultured in one cell culture vessel. In this case, cell survival for each of the plurality of polymer porous membranes supporting neural stem cells is performed.
  • the total polymer porous membrane volume including the region may be simply referred to as “total polymer porous membrane volume including the cell survival region”.
  • the neural stem cells can be improved well over a long period of time. It becomes possible to culture.
  • neural stem cells can be cultured well over a long period of time even under conditions where the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 1000 times or less than the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area. it can.
  • the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture vessel is 100 times or less than the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area
  • neural stem cells can be cultured well over a long period of time. it can.
  • the total volume of the cell culture medium contained in the cell culture container is 10 times or less than the total volume of the polymer porous membrane including the cell survival area
  • neural stem cells can be cultured well over a long period of time. it can.
  • the space (container) for cell culture can be miniaturized to the limit as compared with the conventional cell culture apparatus for performing two-dimensional culture. Further, when it is desired to increase the number of neural stem cells to be cultured, it is possible to increase the volume of cell culture flexibly by a simple operation such as increasing the number of polymer porous membranes to be laminated. If it is a cell culture apparatus provided with the polymer porous membrane used for this invention, it will become possible to isolate
  • the space (container) in which the cell culture medium is stored may be enlarged or reduced according to the purpose, or may be a replaceable container, and is not particularly limited.
  • mass culture of cells means, for example, cell culture in which the number of neural stem cells contained in a cell culture container after culture using a polymer porous membrane is the same as the number of neural stem cells contained in the cell culture container.
  • a method for measuring the number of cells during or after the culture various known methods can be used. For example, a method of measuring the number of neural stem cells contained in a cell culture vessel after culturing using a polymer porous membrane as if all the neural stem cells are uniformly dispersed in the cell culture medium contained in the cell culture vessel As such, a known method can be used as appropriate. For example, a cell count method using CCK8 can be suitably used. Specifically, Cell Counting Kit 8; a solution reagent manufactured by Dojindo Laboratories (hereinafter referred to as “CCK8”) was used to measure the number of cells in a normal culture without using a polymer porous membrane, and the absorbance was measured.
  • CCK8 Cell Counting Kit 8
  • CCK8 a solution reagent manufactured by Dojindo Laboratories
  • the correlation coefficient with the actual cell number is obtained. After that, the polymer porous membrane cultured after applying neural stem cells is transferred to a medium containing CCK8, stored in an incubator for 1 to 3 hours, the supernatant is taken out, and the absorbance is measured at a wavelength of 480 nm. The number of cells is calculated from the correlation coefficient obtained in (1).
  • the mass culture of cells means, for example, that the number of cells contained per square centimeter of the polymer porous membrane is 1.0 ⁇ 10 5 or more after the culture using the polymer porous membrane. 0 ⁇ 10 5 or more, 1.0 ⁇ 10 6 or more, 2.0 ⁇ 10 6 or more, 5.0 ⁇ 10 6 or more, 1.0 ⁇ 10 7 or more, 2.0 ⁇ 10 7 As mentioned above, it means culturing until it becomes 5.0 ⁇ 10 7 or more, 1.0 ⁇ 10 8 or more, 2.0 ⁇ 10 8 or more, or 5.0 ⁇ 10 8 or more.
  • the number of cells contained per square centimeter of the polymer porous membrane can be appropriately measured using a known method such as a cell counter.
  • the cell culture medium of neural stem cells is not particularly limited as long as the cells can be cultured.
  • a medium supplemented with bFGF and 25 ng / ml EGF can be used.
  • cell culture using a polymer porous membrane it can coexist with other floating culture carriers such as microcarriers and cellulose sponges.
  • the shape and scale of the system used for culturing are not particularly limited, and it can be appropriately used from petri dishes for cell culture, flasks, plastic bags, test tubes to large tanks.
  • a cell culture dish manufactured by BD Falcon, a Nunc cell factory manufactured by Thermo Scientific, and the like are included.
  • a suspension culture apparatus for example, a spinner flask manufactured by Corning, rotary culture, or the like can be used.
  • a hollow fiber culture system such as FiberCell (registered trademark) System manufactured by VERITAS can be used as an environment in which similar functions can be realized.
  • the method of the present invention comprises: A polymer porous membrane; A cell culture module comprising two or more medium outlets and a casing containing the porous polymer membrane, Here, (i) two or more independent polymer porous membranes are aggregated in the casing, (Ii) the polymer porous membrane is folded; (Iii) The polymer porous membrane is wound into a roll and / or (Iv) The polymer porous membrane is tied in a rope shape, It may be performed using a cell culture module that is housed.
  • the “cell culture module” means a cell culture substrate, a cell culture device and a cell culture system, particularly a cell culture substrate applicable to a cell culture vessel, a cell culture device and a cell culture system used for suspension culture.
  • the material By bringing a suspension containing neural stem cells into contact with the cell culture module, the neural stem cells adhere to the polymer porous membrane. After proliferating neural stem cells, a large amount of neural stem cells can be collected by collecting or reseeding those released as spheroids.
  • the casing included in the cell culture module has two or more medium outlets so that the cell medium is supplied to the inside of the casing and discharged to the outside.
  • the diameter of the culture medium outlet / outlet of the casing is preferably larger than the diameter of the cells so that the cells can flow into the casing.
  • the diameter of a culture medium outflow inlet is smaller than the diameter from which a polymer porous membrane flows out from this culture medium outflow inlet.
  • the diameter smaller than the diameter from which the polymer porous membrane flows can be appropriately selected depending on the shape and size of the polymer porous membrane accommodated in the casing.
  • the polymer porous membrane has a string shape
  • it is 5 or more, preferably 10 or more, preferably 20 or more, preferably 50 or more, preferably 100 or more.
  • a part or all of the casing may have a mesh-like structure in the culture medium outlet / inlet. Further, the casing itself may be mesh-shaped.
  • the “mesh-shaped structure” has, for example, a vertical, horizontal, and / or diagonal lattice structure, and each medium opening has a medium outlet / inlet so that fluid can pass therethrough.
  • the present invention is not limited to this.
  • the casing provided in the cell culture module preferably has a strength not to be deformed by the movement of the medium under normal culture conditions such as stirring culture and shaking culture conditions, and is formed of an inflexible material. Is preferred.
  • the casing is preferably formed of a material that does not affect cell growth in cell culture. Examples of such materials include, but are not limited to, polymers such as polyethylene, polypropylene, nylon, polyester, polystyrene, polycarbonate, polymethyl methacrylate, and polyethylene terephthalate, and metals such as stainless steel and titanium.
  • the strength of the casing to some extent prevents the shape of the polymer porous membrane inside the casing from being continuously changed.
  • the casing does not deform means that the casing does not deform under a load received in a normal culture environment, and does not mean that the casing does not deform absolutely.
  • two or more independent polymer porous membranes are aggregated and accommodated in the casing.
  • two or more independent polymer porous membranes are contained in a fixed space surrounded by the casing. Refers to the state of being housed in an aggregate.
  • two or more independent polymer porous membranes are fixed at least one location of the polymer porous membrane and at least one location in the casing by an arbitrary method, and the polymer porous membrane is placed in the casing. It may be fixed so as not to move.
  • the two or more independent polymer porous membranes may be small pieces.
  • the shape of the small piece can be any shape such as a circle, an ellipse, a square, a triangle, a polygon, and a string, but preferably a square.
  • the size of the small piece can be any size, but when it is a square, the length may be any length, for example, 80 mm or less, preferably 30 mm or less. More preferably, it is 10 mm or less.
  • the polymer porous membrane is folded, (iii) the polymer porous membrane is wound into a roll, and / or Or (iv)
  • the polymer porous membrane may be tied in a rope shape and accommodated in the casing.
  • the “folded polymer porous membrane” is folded in the casing, so that the frictional force between each surface of the polymer porous membrane and / or the surface in the casing is increased in the casing.
  • This is a porous polymer membrane that is in a state of not moving.
  • “folded” may be a state in which the polymer porous membrane is creased or a state in which no crease is present.
  • the “polymer porous film wound in a roll shape” means that the polymer porous film is wound in a roll shape, and friction between each surface of the polymer porous film and / or the surface in the casing.
  • the “polymer porous membrane knitted in a rope shape” means, for example, a plurality of polymer porous membranes in a strip shape, knitted in a rope shape by an arbitrary method, and the frictional force between the polymer porous membranes. Refers to a porous polymer membrane that does not move relative to each other.
  • a polymer porous membrane in which two or more independent polymer porous membranes are aggregated (ii) a folded polymer porous membrane, (iii) a polymer porous membrane wound into a roll, and (iv) Polymer porous membranes tied in a rope shape may be combined and accommodated in a casing.
  • the state in which the polymer porous membrane does not move in the casing means that the polymer porous membrane does not continuously change its shape when the cell culture module is cultured in the cell culture medium.
  • the state accommodated in the casing In other words, the polymer porous membrane itself is in a state of being suppressed by the fluid so as not to continuously move.
  • the cell culture module a commercially available one can be applied as long as it is a culture apparatus and system for culturing cells in a floating state.
  • the present invention can be applied to a culture apparatus in which the culture container is formed of a flexible bag, and can be used in a state of being suspended in the culture container.
  • the cell culture module can be applied to a stirring culture container such as a spinner flask and cultured.
  • a culture container it can apply also to an open container and can also be applied to a closed container.
  • cell culture dishes, flasks, plastic bags, test tubes to large tanks can be used as appropriate.
  • a cell culture dish manufactured by BD Falcon, a Nunc cell factory manufactured by Thermo Scientific, and the like are included.
  • neural stem cells cultured by the methods of the present invention are collected.
  • the collection method is not particularly limited, for example, spheroids may be formed and neural stem cells released from the polymer porous membrane into the culture medium may be collected. Or you may collect
  • neural stem cells can be efficiently recovered or replated by a method of treating a polymer porous membrane with an enzyme such as Accutase (trademark) (Nacalai Tesque).
  • differentiation-inducing method of the present invention differentiation is induced by culturing neural stem cells grown on a polymer porous membrane under differentiation-inducing conditions.
  • the specific process regarding the differentiation induction of a neural stem cell is not specifically limited. Any method suitable for bringing neural stem cells growing on a membrane-like carrier into contact with a differentiation-inducing environment such as a differentiation-inducing medium, including the steps described in the present specification, can be employed.
  • differentiation from neural stem cells to neurons and glial cells can be performed by methods well known to those skilled in the art.
  • PDGF forskolin, BMP2 or the like can be used.
  • the polyimide porous membrane used in the following examples is composed of 3,3 ′, 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride (s-BPDA) which is a tetracarboxylic acid component and 4,4 which is a diamine component. It was prepared by molding a polyamic acid solution composition containing a polyamic acid solution obtained from '-diaminodiphenyl ether (ODA) and a polyacrylamide as a coloring precursor, and then heat-treating it at 250 ° C. or higher.
  • s-BPDA 4,4′-biphenyltetracarboxylic dianhydride
  • the obtained polyimide porous film is a three-layer polyimide porous film having a surface layer A and a surface layer B having a plurality of pores, and a macrovoid layer sandwiched between the surface layer A and the surface layer B.
  • the average pore size of the pores existing in the surface layer A was 6 ⁇ m
  • the average pore size of the pores existing in the surface layer B was 46 ⁇ m
  • the film thickness was 25 ⁇ m
  • the porosity was 73%.
  • Example 1 Culture of neural stem cells on a polyimide porous membrane Neural stem cells were collected from the hippocampus containing the dentate gyrus of a wild type mouse (C57BL / 6J, obtained from Clea Japan). In a container containing 10 ml of cell culture medium (D-MEM / Ham's F-12, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) (tissue culture flask with vent cap (surface treatment for adherent cells), manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) The neural stem cells collected in (1) were cultured for 8 days.
  • D-MEM / Ham's F-12 cell culture medium
  • the neural stem cells collected in (1) were cultured for 8 days.
  • Neural stem cell spheroids were collected from the medium and treated with an enzyme (Acactase (trademark) (Nacalai Tesque)) to decompose the spheroids, and a cell culture medium suspension containing neural stem cells was prepared.
  • Container containing a sterilized 1.8 cm square square polyimide porous membrane and culture medium (D-MEM / Ham's F-12, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (tissue culture dish (surface-treated for adherent cells) ), Asahi Glass Co., Ltd.) was added with the above-mentioned neural stem cell suspension, and culture was started. Ten days after the start of culture, the polyimide porous membrane was transferred to a container containing a new cell culture medium.
  • FIG. 10 days after the start of culture is shown in FIG. Further, 10 days and 70 days after the start of culture, neural stem cell spheroids released in the culture medium were collected and immunostained. For immunostaining, cells were fixed with 4% PFA, treated with 0.1% triton X-100, blocked, and then reacted with the primary antibody at 4 ° C overnight. The reaction was carried out for 1 hour. Micrographs are shown in FIGS. Even after 70 days, neural stem cells remained undifferentiated (FIG. 4).
  • EdU which is a DNA synthesis indicator
  • spheroids growing on the polyimide porous membrane 30 days after the start of culture and fluorescently labeled S-phase cell nuclei in the spheroids (FIGS. 5 and 6). It was shown that the cells proliferated inside and outside the polyimide porous membrane.
  • Example 2 Differentiation induction of neural stem cells cultured on a polyimide porous membrane A differentiation inducer (PDGF, forskolin, or BMP2) is added to the spheroids of neural stem cells collected 10 days and 70 days after the start of culture in Example 1 above After 5 days of culture, immunostaining was performed. Micrographs are shown in FIGS. It was shown that differentiation ability was maintained even in neural stem cells after 70 days from the start of culture (FIGS. 10 to 13).
  • PDGF polyimide porous membrane A differentiation inducer
  • Example 3 Long-term culture of neural stem cells on polyimide porous membrane and induction of differentiation of neural stem cells after long-term culture
  • neural stem cells are cultured on a 1.8 cm square square polyimide porous membrane did. 30 days after the start of culture, a separately prepared 1.8 cm square square polyimide porous membrane is placed on the polyimide porous membrane in which neural stem cells are cultured so that the A surfaces of both polyimide porous membranes overlap each other. The culture was continued. The newly added polyimide porous membrane increased the space for cell culture.
  • a separately prepared 1.8 cm square square polyimide porous membrane is placed on the polyimide porous membrane in which neural stem cells are cultured so that the A surfaces of both polyimide porous membranes overlap each other. Then, the neural stem cells could be finally cultured for 225 days by continuing the culture while appropriately increasing the culture space.
  • a differentiation inducer (PDGF or BMP2) was added to neural stem cell spheroids collected 225 days after the start of the culture, and after 5 days of culture, immunostaining was performed. Micrographs are shown in FIGS. It was shown that differentiation ability was maintained even in neural stem cells after 225 days from the start of culture.
  • the method of the present invention can be used to suppress neural stem cell differentiation and supply a large amount of the cells.

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Abstract

本発明は、ポリマー多孔質膜上で神経幹細胞を培養することによって、神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法に関する。

Description

神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法
　本発明は、神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法に関する。
　神経幹細胞の培養について
　神経幹細胞は、自己複製能と、ニューロン及びグリア細胞への分化能を有するため、神経再生医療の分野で注目されている。しかし、分化能を維持したまま神経幹細胞を長期培養することは困難であることが知られている。例えば、成体海馬由来の野生型の神経幹細胞は、継代に伴い自己複製能及び多分化能を著しく低下させることが報告されている（非特許文献１）。
　ハニカム状多孔質体を用いて、凝集塊を形成していない（スフェロイド化していない）未分化の神経幹細胞を調製することができることが報告されている（特許文献１）。特許文献１で使用されているハニカム状多孔質体とは、膜の垂直方向に向けられた微少な孔（くぼみを含む）が膜の平面方向に蜂の巣状に設けられている薄膜構造体のことである。
　ポリイミド多孔質膜
　ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２～４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
　細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
特開２００８－０５４６２１号公報 国際公開第２０１０／０３８８７３号 特開２０１１－２１９５８５号公報 特開２０１１－２１９５８６号公報 国際公開第２０１５／０１２４１５号
Seaberg, M. et al., The Journal of Neuroscience, March 1, 2002, 22(5):1784-1793
　本発明は、従来とは全く異なる手段を用いて神経幹細胞の分化を抑制し、当該神経幹細胞を大量に供給可能な方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、複数の孔を有する２つの表面層と、当該２つの表面層との間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜上で神経幹細胞を培養することで、驚くべきことに、神経幹細胞の分化を抑制できることを見出し、本発明に至った。当該ポリマー多孔質膜は、特許文献１に開示されているようなハニカム状多孔質体とは全く異なる立体形状を有する。
　すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
　神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
［２］
　神経幹細胞が野生型細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記工程（２）が少なくとも７０日間実施される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
　前記工程（２）において、神経幹細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０×１０5個以上となるまで増殖させる、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
　２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
　前記ポリイミド多孔質膜を
　ｉ）折り畳んで、
　ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
　ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
　ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］
　工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］
　前記表面層Ａの平均孔径が、５μｍ～５０μｍである、［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
　前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］
　前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５～５００μｍである、［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］
　前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］
　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１１］に記載の方法。
［１３］
　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］
　前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１５］
　神経幹細胞を調製する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
［１６］
　前記工程（２）で得られる神経幹細胞を回収する工程をさらに含む、［１５］に記載の方法。
［１７］
　神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
（３）工程（２）で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
　本発明によれば、神経幹細胞の分化を抑制し、当該細胞を大量に供給することができる。
図１は、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。 図２は、ポリイミド多孔質膜上で培養を開始してから１０日経過後の神経幹細胞のスフェロイドの光学顕微鏡写真を示す。 図３は、培養開始１０日経過後にポリイミド多孔質膜から培養培地中に遊離した神経幹細胞のスフェロイドを免疫染色したときの顕微鏡写真である。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（核染色マーカー）：青、ネスチン（神経幹細胞のマーカー）：緑、ＳＯＸ２（神経幹細胞のマーカー）：赤。 図４は、培養開始７０日経過後にポリイミド多孔質膜から培養培地中に遊離した神経幹細胞のスフェロイドを免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ネスチン：緑、ＳＯＸ２：赤。 図５は、培養開始３０日経過後にポリイミド多孔質膜内及び上で培養されている神経幹細胞の細胞塊にＤＮＡ合成の指標としてＥｄＵ（５－エチニル－２’－デオキシウリジン）を取り込ませた後に、当該ＥｄＵを蛍光標識したときの顕微鏡写真である（中央及び右）。ＤＡＰＩによって細胞核を免疫染色したときの顕微鏡写真も示す（左及び右）。 図６は、培養開始３０日経過後にポリイミド多孔質膜内及び上で培養されている神経幹細胞の細胞塊にＤＮＡ合成の指標としてＥｄＵを取り込ませた後に、当該ＥｄＵを蛍光標識したときの顕微鏡写真である（中央及び右）。ＳＯＸ２を免疫染色したときの顕微鏡写真も示す（左及び右）。 図７は、培養１０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤である血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor（ＰＤＧＦ））を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、Milli-Mark Pan Neuronal Marker（商標）（Neuronal mark）（成熟ニューロンのマーカー）：緑、グリア線維酸性タンパク質（glial fibrillary acidic protein（ＧＦＡＰ））（アストロサイトの分子マーカー）：赤。 図８は、培養１０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、microtubule-associated protein ２（ＭＡＰ２）（ニューロンの樹状突起のマーカー）：緑、γ-aminobutyric acid（ＧＡＢＡ）（ＧＡＢＡ作動性ニューロンの分子マーカー）：赤。 図９は、培養１０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＭＡＰ２：緑、Ｇｌｕ（グルタミン酸）（グルタミン酸作動性ニューロンの分子マーカー）：赤。 図１０は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるＰＤＧＦを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、Neuronal mark：緑、ＧＦＡＰ：赤。 図１１は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＭＡＰ２：緑、ＧＡＢＡ：赤。 図１２は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるフォルスコリンを添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＭＡＰ２：緑、Ｇｌｕ：赤。 図１３は、培養７０日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、アストロサイト優位な分化誘導剤であるbone morphogenetic protein ２（ＢＭＰ２）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＧＦＡＰ：赤。 図１４は、培養２２５日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、ＢＭＰ２（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ：青、ＧＦＡＰ：赤。 図１５は、培養２２５日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＧＦＡＰ：赤、ＭＡＰ２：緑、ＤＡＰＩ：青。 図１６は、培養２２５日目にポリイミド多孔質膜から遊離した神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤であるＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加して５日間培養した後に免疫染色したときの顕微鏡写真である。ＮＧ２（幼若オリゴデンドロサイトの分子マーカー）：赤、Ｏ４：（成熟オリゴデンドロサイトの分子マーカー）：緑、ＤＡＰＩ：青。
　本発明の一態様は、神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。以下で「本発明の分化抑制方法」とも呼ぶ。
　また、本発明の別の態様は、神経幹細胞を調製する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の調製方法」とも呼ぶ。
　また、本発明の別の態様は、神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
（１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
（３）工程（２）で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の分化誘導方法」とも呼ぶ。
　「本発明の分化抑制方法」、「本発明の調製方法」及び「本発明の分化誘導方法」を、以下で「本発明の方法」とも呼ぶ。
　１．本発明の方法で使用される神経幹細胞について
　本明細書において「神経幹細胞」とは、自己複製能と、ニューロン及びグリア細胞への分化能を有する細胞のことである。
　本発明に利用し得る神経幹細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の神経幹細胞であり、より好ましくは霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの神経幹細胞であり、特に好ましくはヒトの神経幹細胞である。
　本発明の方法で使用される神経幹細胞の取得方法は特に限定されない。例えば、動物の中枢神経組織から単離されてもよい。中枢神経組織としては、海馬、側脳室及びその周辺の組織が好ましい。また、動物の発生・発達段階は特に限定されず、胎仔（胎児）、未成熟個体、成体などのいずれであってもよい。あるいは、本発明の方法で使用される神経幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、核移植ＥＳ細胞、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ＭＵＳＥ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）などの多能性幹細胞を分化誘導して取得されてもよい。
　本発明の方法で使用される神経幹細胞は、野生型細胞であってもよいし変異細胞（例えば、ｐ３８αヘテロ接合体マウス由来の細胞（Yoshioka, K. et al., FEBS Open Bio 5(2015)437-444を参照））であってもよい。
　２．本発明で使用される神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程について
　限定されるわけではないが、本発明の方法において、神経幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
　（Ａ）神経幹細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
　（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に神経幹細胞懸濁液を載せ、
　放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、神経幹細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
　神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
　（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
　前記湿潤したポリマー多孔質膜に神経幹細胞懸濁液を装填し、そして、
　神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
　（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞又は細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を神経幹細胞懸濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
　ポリマー多孔質膜の表面に播種された神経幹細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、神経幹細胞はポリマー多孔質膜に自発的に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された神経幹細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。神経幹細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
　（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に神経幹細胞懸濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、神経幹細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませることにより、神経幹細胞懸濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の神経幹細胞懸濁液が装填された箇所に神経幹細胞が吸い込まれて播種される。
　あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に神経幹細胞懸濁液を装填してもよい。この場合、神経幹細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
　例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に神経幹細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、神経幹細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
　（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞の濃度を濃縮する、神経幹細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
　（Ａ）の態様を「自然播種」、（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
　限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
　態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに、本発明の方法において、神経幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある神経幹細胞をポリマー多孔質膜と懸濁的に共存させることにより神経幹細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、神経幹細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、神経幹細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、神経幹細胞は、ポリマー多孔質膜に自発的に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、神経幹細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
　上述した神経幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）～（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に神経幹細胞を適用してもよい。
　３．本発明で使用される神経幹細胞を培養し、増殖させる工程について
　本発明で使用される神経幹細胞の培養は、細胞をポリマー多孔質膜に接着させる接着培養で行われても良いし、細胞を培養培地中に浮遊させる浮遊培養で行われても良い。大量培養が可能であるという観点から、浮遊培養が好ましい。
　本発明の方法において、ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中に浮遊した状態で用いる場合、２以上の前記ポリマー多孔質膜の小片を用いてもよい。ポリマー多孔質膜は立体的でフレキシブルな薄膜であるため、例えばその小片を培養液中に浮遊させて用いることにより、一定容量の細胞培養培地中に多くの培養可能な表面積を有するポリマー多孔質膜を持ち込むことが可能となる。通常培養の場合、容器底面積が細胞培養可能な面積の上限となるが、本発明の方法におけるポリマー多孔質膜を用いた細胞培養では、先の持ち込まれたポリマー多孔質膜の大表面積の全てが細胞培養可能な面積となる。ポリマー多孔質膜は細胞培養液を通過させるので、例えば折りたたまれた膜内にも栄養や酸素等の供給が可能となる。また、ポリマー多孔質膜は従来の平面培養とは全く異なり、立体的かつフレキシブルな構造を有する細胞培養基材であるため、接着性を有する細胞を培養容器の形状を選ばず、様々な形状、材質、大きさの培養容器内でも培養可能である（例えば、シャーレ、フラスコ、タンク、バッグ等）。
　ポリマー多孔質膜の小片の大きさ、形状は、特に限定されない。形状は、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など任意の形をとりうる。
　本発明の方法で使用されるポリマー多孔質膜は柔軟性があるため形状を変化させて用いることができる。ポリマー多孔質膜を平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリマー多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ)ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させてもよい。ｉ）～ｉｖ）のように形状を加工することにより、小片を用いる場合と同様に、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。さらに、各小片を集合体として取り扱うことができるため、細胞体を集合化して移動させることが可能となり、総合的な応用性が高い。
　小片集合体と同様の考え方として、２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いてもよい。積層とは、ポリマー多孔質膜が一部重なる態様も含む。積層培養により、狭いスペースで高密度に神経幹細胞を培養することが可能になる。既に神経幹細胞が育成している膜上にさらに膜を積層させて設置して別種細胞との多層系を形成することも可能である。積層するポリマー多孔質膜の数は特に限定されない。
　本発明の方法において、好ましくは、神経幹細胞はポリマー多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する。
　本発明の方法において、従来のようにトリプシン処理等を行う継代操作を行う事なく、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも５０日間、少なくとも７０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも２００日間、少なくとも２２５日間、または少なくとも３００日間の長期にわたって、分化を抑制しながら神経幹細胞を培養することができる。また、本発明の方法により、従来の平面培養で培養することができる期間以上、例えば、平面培養期間の１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上の期間、分化を抑制しながら神経幹細胞を培養することができる。本発明によれば、シャーレ等の平面培養での長期間の細胞培養で発生するスフェロイドの変形や細胞の分化能の消失等を生じる事なく、休止状態ではなく動的であり、かつ本来の特性を維持した神経幹細胞を長期間維持する事ができる。また、本発明によれば、長期培養した神経幹細胞であってもセルバイアビリティ又は神経幹細胞の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現量等）が、長期培養前の神経幹細胞と比較してほとんど変化しない。また、本発明によれば、神経幹細胞がポリマー多孔質膜内において三次元的に増殖するため、従来の平面培養で見られるような培養領域の制限及び平面環境によりおこるコンタクトインヒビションが起こりにくいため、長期間、生育させる培養が可能となる。また、本発明によれば、神経幹細胞が接着したポリマー多孔質膜に別のポリマー多孔質膜を接触させることによって、細胞培養可能な空間を任意に増加することが可能であり、従来のようなトリプシン処理を伴った継代操作を行うことなく、コンタクトインヒビションが引き起こされるコンフルエント状態を回避しながら長期間、増殖させる培養が可能となる。また、本発明によれば、神経幹細胞を凍結等行うことなく、生きたまま長期間保存するという新たな保存方法までも提供される。
　４．本発明で使用されるポリマー多孔質膜について
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、その下限は、０．０１μｍ以上、０．１μｍ以上、１μｍ以上、２μｍ以上、３μｍ以上、４μｍ以上、５μｍ以上、６μｍ以上、７μｍ以上、８μｍ以上、９μｍ以上又は１０μｍ以上であり、その上限は、２００μｍ未満、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下又は１５μｍ以下である。表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、好ましくは０．０１μｍ～５０μｍであり、より好ましくは１μｍ～５０μｍであり、特に好ましくは５μｍ～５０μｍである。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、その下限は５μｍ超、２０μｍ以上、３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上又は６０μｍ以上であり、その上限は、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、９０μｍ以下、８０μｍ以下又は７０μｍ以下である。表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は、好ましくは２０μｍ～１００μｍである。
　ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 （式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
　表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは０．０１～２０μｍである。
　ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０～５００μｍであり、好ましくは１０～１００μｍであり、より好ましくは１０～８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１～５０μｍであり、好ましくは、０．０１～２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５～５００μｍであり、より好ましくは２５～７５μｍである。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 （式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
　本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
　本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の多孔質膜である。
　ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
　一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
　ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
　ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
　ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
　本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
　着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
　炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
　また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
　着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０～３．０であるポリアミック酸３～６０質量％と有機極性溶媒４０～９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ－ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’－ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２－ビス（３，４－ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ－フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ－ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、ｐ－ターフェニル－３，４，３’，４’－テトラカルボン酸二無水物、１，３－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４－ビス（３，４－ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２－ビス〔（３，４－ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８－ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’－（２，２－ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’－ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
　これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
　上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
　１）１，４－ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３－ジアミノベンゼン、２，４－ジアミノトルエン、２，６－ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
　２）４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ジメチル－４，４’－ジアミノビフェニル、２，２’－ビス（トリフルオロメチル）－４，４’－ジアミノビフェニル、３，３’－ジメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’－ジカルボキシ－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’－テトラメチル－４，４’－ジアミノジフェニルメタン、ビス（４－アミノフェニル）スルフィド、４，４’－ジアミノベンズアニリド、３，３’－ジクロロベンジジン、３，３’－ジメチルベンジジン、２，２’－ジメチルベンジジン、３，３’－ジメトキシベンジジン、２，２’－ジメトキシベンジジン、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル、３，３’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’－ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’－ジアミノジフェニルスルホン、３，４’－ジアミノジフェニルスルホン、４，４’－ジアミノジフェニルスルホン、３，３’－ジアミノベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジクロロベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジメトキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノジフェニルメタン、３，４’－ジアミノジフェニルメタン、４，４’－ジアミノジフェニルメタン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）プロパン、２，２－ビス（３－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス（４－アミノフェニル）－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、３，３’－ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’－ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’－ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
　３）１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェノキシ）－４－トリフルオロメチルベンゼン、３，３’－ジアミノ－４－（４－フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’－ジアミノ－４，４’－ジ（４－フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３－ビス（３－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（３－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４－ビス〔２－（４－アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
　４）３，３’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（３－アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’－ビス（４－アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２－ビス〔３－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔３－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（３－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパン、２，２－ビス〔４－（４－アミノフェノキシ）フェニル〕－１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
　これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
　これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’－ジアミノジフェニルエーテル、３，４’－ジアミノジフェニルエーテル、４，４’－ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェニル）ベンゼン、１，４－ビス（４－アミノフェニル）ベンゼン、１，３－ビス（４－アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４－ビス（３－アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
　（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
　（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
　（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
　本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ～１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ～１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１～２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５～５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１～１００μｍの、好ましくは０．０１～５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
　例えば、国際公開ＷＯ２０１０／０３８８７３、特開２０１１－２１９５８５、又は特開２０１１－２１９５８６に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
　アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
　二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’－ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２－ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２－ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
　ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
　ポリエーテルスルホンの対数粘度は、ＰＥＳ多孔質膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
　また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
　対数粘度０．５～１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％～６０質量％と有機極性溶媒４０質量％～９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
　前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
　本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
　前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ～５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
　前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ～５０μｍであり、
　前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ～５０μｍであり、
　前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
　表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
　前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
　前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ～５００μｍであり、かつ空孔率が５０％～９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
　５．細胞培養と培養体積
　ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図１に示す。図１は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の方法では、ポリマー多孔質膜に神経幹細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の神経幹細胞が生育するため、大量の神経幹細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の神経幹細胞を培養することが可能となる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
　本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。そして、ポリマー多孔質膜に神経幹細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に神経幹細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、神経幹細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、神経幹細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
　本発明の方法において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、神経幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
　つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する神経幹細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、神経幹細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
　本発明の方法において、細胞の大量培養とは、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる神経幹細胞の数が、神経幹細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
　なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる神経幹細胞の数を、神経幹細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。たとえば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ　Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、神経幹細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１～３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
　また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、または５．０×１０8個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
　６．神経幹細胞の培養システム及び培養条件
　本発明の方法において、神経幹細胞の細胞培養培地は、当該細胞が培養できるのであれば特に限定されないが、例えば、DMEM/F-12HAMに対し、1×N2 supplement、0.5×B27 supplement、25ng/ml bFGF、及び25ng/ml EGFを添加した培地が使用され得る。
　ポリマー多孔質膜を用いる細胞の培養に関して、マイクロキャリアやセルローススポンジ等、他の浮遊型培養担体と共存させることもできる。
　本発明の方法において、培養に用いるシステムの形状、規模などは特に限定されず、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ　セルファクトリー等が含まれる。なお、浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、ＶＥＲＩＴＡＳ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの様な中空糸培養システムも使用することが可能である。
　本発明の方法は、
　ポリマー多孔質膜と、
　２以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、
　ここで、前記ケーシング内に
　（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
　（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
　（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
　（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている、細胞培養モジュールを用いて行われても良い。本明細書において、「細胞培養モジュール」とは、細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システム、特に浮遊培養に用いられる細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システムに適用可能な、細胞培養基材をいう。神経幹細胞を含む懸濁液を当該細胞培養モジュールと接触させることにより、神経幹細胞がポリマー多孔質膜に接着する。神経幹細胞を増殖させた後、スフェロイドとして放出されるものを回収もしくは再播種することで、大量の神経幹細胞の回収が実行可能となる。
　ポリマー多孔質膜がケーシングに収容されていることによって、膜状のポリマー多孔質膜がケーシング内で、継続的に形態が変形することが防止される。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される神経幹細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の神経幹細胞を培養することが可能となる。
　上記細胞培養モジュールが備えるケーシングは、２以上の培地流出入口を有することで、細胞培地がケーシングの内部へ供給及び外部へ排出される。該ケーシングの培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、培地流出入口の径が、該培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本明細書において、「メッシュ形状の構造」とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。
　上記細胞培養モジュールが備えるケーシングは、通常の培養条件、例えば、攪拌培養、振とう培養条件における培地の動きによって変形しない程度に強度を有することが好ましく、非可撓性素材から形成されていることが好ましい。また、ケーシングは、細胞培養において、細胞の生育に影響を与えない素材によって形成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等のポリマー、ステンレス、チタンなどの金属が挙げられるが、これに限定されない。ケーシングにある程度強度があることにより、ケーシング内部のポリマー多孔質膜の形状が継続的に変更することが防止される。本明細書において、「ケーシングが変形しない」とは、通常の培養環境下で受ける負荷において変形しないことを意味するものであり、絶対的に変形しないことを意味するものではない。
　上記細胞培養モジュールは、前記ケーシング内に
　（ｉ）２以上の独立したポリマー多孔質膜が、集約されて、
　（ｉｉ）ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
　（ｉｉｉ）ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
　（ｉｖ）ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている。
　本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立したポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。上記細胞培養モジュールにおいて、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、正方形が好ましい。上記細胞培養モジュールにおいて、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは３０ｍｍ以下がよく、より好ましくは１０ｍｍ以下がよい。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。なお、ひも状のポリマー多孔質膜の場合、後述するように、（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、該ケーシングに収容されてもよい。
　本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
　本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔性膜をいう。また本明細書において、「縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜」とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立したポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。
　本明細書において、「ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、細胞培養モジュールを細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等による細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
　上記細胞培養モジュールは、細胞を浮遊状態で培養する培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性のバッグからなる培養装置にも適用可能であり、当該培養容器内に浮遊させた状態で使用することが可能である。また、上記細胞培養モジュールは、例えば、スピナーフラスコ等の攪拌培養型容器に適用し、培養することが可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ　セルファクトリー等が含まれる。
　７．培養された細胞の回収
　一実施形態において、本発明の方法で培養された神経幹細胞は回収される。回収方法は特に限定されないが、例えば、スフェロイドを形成してポリマー多孔質膜上から培養培地中に遊離した神経幹細胞を回収してもよい。あるいは、ポリマー多孔質膜上に接着している神経幹細胞のスフェロイドをピペッティングなどによりポリマー多孔質膜から遊離させることによって回収しても良い。また、アキュターゼ（商標）（ナカライテスク社）等の酵素によりポリマー多孔質膜を処理する方法によっても、効率的に神経幹細胞を回収、もしくは再播種する事が可能となる。
　８．本発明の分化誘導方法について
　本発明の分化誘導方法において、ポリマー多孔質膜上で増殖した神経幹細胞は、分化誘導条件下で培養することで分化誘導がなされる。神経幹細胞の分化誘導に関する具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程を含め、膜状の担体に生育する神経幹細胞を分化誘導培地等の分化誘導環境に接触させるのに適した任意の手法を採用することが可能である。
　限定されるわけではないが、神経幹細胞からニューロン及びグリア細胞への分化は、当業者に周知の方法で行うことができる。特に限定されないが、例えばＰＤＧＦ、フォルスコリン、ＢＭＰ２などを用いて行うことが可能である。
　以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’－ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ－ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’－ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。
　実施例１
　ポリイミド多孔質膜上での神経幹細胞の培養
　野生型マウス（C57BL/6J、日本クレア社より入手）の歯状回を含む海馬から神経幹細胞を採取した。細胞培養培地（D-MEM/Ham’s F-12、和光純薬工業社製）１０ｍｌを含む容器（ベントキャップ付組織培養用フラスコ（付着性細胞用表面処理済)、旭硝子社製）中で、上記で採取した神経幹細胞を８日間培養した。神経幹細胞のスフェロイドを培地から回収し、それを酵素（アキュターゼ （商標）（ナカライテスク社））で処理することよってスフェロイドを分解し、神経幹細胞を含む細胞培養培地懸濁液を調製した。滅菌した１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜と培養培地（D-MEM/Ham’s F-12、和光純薬工業社製）とを含む容器（組織培養用ディッシュ(付着性細胞用表面処理済)、旭硝子社製）に上記の神経幹細胞の懸濁液を添加し、培養を開始した。培養を開始してから１０日後にポリイミド多孔質膜を新しい細胞培養培地を含む容器に移し替えた。その後は３日経過するごとに、ポリイミド多孔質膜を新しい細胞培養培地を含む容器に移し替えた。培養を開始してから１０日後の神経幹細胞の光学顕微鏡写真を図２に示す。また、培養開始１０日後及び７０日後に、培養培地中に遊離した神経幹細胞のスフェロイドを回収し、免疫染色を行った。免疫染色は４％ＰＦＡで細胞を固定の上、０．１％ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で処理し、ブロッキングを行った後、一次抗体を４℃にて一晩反応させ、二次抗体を室温にて一時間反応させた。顕微鏡写真を図３及び４に示す。７０日経過後であっても、神経幹細胞が未分化のままで維持された（図４）。また、培養開始３０日後にポリイミド多孔質膜上で成長しているスフィロイドにＤＮＡ合成指示薬であるＥｄＵを短時間取り込ませ、スフィロイド中の分裂Ｓ期細胞核を蛍光ラベルした（図５及び６）。ポリイミド多孔質膜内外で細胞が増殖していることが示された。
　実施例２
　ポリイミド多孔質膜上で培養した神経幹細胞の分化誘導
　上記実施例１で培養開始１０日後および７０日後に回収された神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤（ＰＤＧＦ、フォルスコリンまたはＢＭＰ２）を添加し、５日間培養した後に免疫染色を行った。顕微鏡写真を図７～１３に示す。培養を開始してから７０日経過後の神経幹細胞であっても、分化能を維持していることが示された（図１０～１３）。
　実施例３
　ポリイミド多孔質膜上での神経幹細胞の長期間培養、及び長期間培養後の神経幹細胞の分化誘導
　上記実験例１に準じて、１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜上で神経幹細胞を培養した。培養開始３０日後、別途用意した１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜を、神経幹細胞を培養させたポリイミド多孔質膜の上に、両方のポリイミド多孔質膜のＡ面同士が重なるように配置し、培養を継続した。新たに追加したポリイミド多孔質膜によって、細胞培養可能な空間が増大した。その後７日毎に、別途用意した１．８ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜を、神経幹細胞を培養させたポリイミド多孔質膜の上に、両方のポリイミド多孔質膜のＡ面同士が重なるように配置して培養空間を適宜増大させながら培養を継続することにより、最終的に神経幹細胞を２２５日間培養することができた。
　培養開始２２５日後に回収された神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤（ＰＤＧＦ、またはＢＭＰ２）を添加し、５日間培養した後に免疫染色を行った。顕微鏡写真を図１４～１６に示す。培養開始から２２５日経過後の神経幹細胞であっても、分化能を維持していることが示された。
　本発明の方法は、神経幹細胞の分化を抑制し、当該細胞を大量に供給するために利用することができる。

Claims (17)

  1. 　神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
    （１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
    （２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
  2. 　神経幹細胞が野生型細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（２）が少なくとも７０日間実施される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記工程（２）において、神経幹細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０×１０5個以上となるまで増殖させる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記ポリイミド多孔質膜を
    　ｉ）折り畳んで、
    　ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
    　ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
    　ｉｖ）縄状に結んで
    細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記表面層Ａの平均孔径が、５μｍ～５０μｍである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記表面層Ｂの平均孔径が、２０～１００μｍである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５～５００μｍである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 　前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　神経幹細胞を調製する方法であって、
    （１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
    （２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
  16. 　前記工程（２）で得られる神経幹細胞を回収する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 　神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
    （１）神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
    （２）神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
    （３）工程（２）で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
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