WO2018030193A1 - 実験動物の腫瘍組織の評価に関する方法 - Google Patents

実験動物の腫瘍組織の評価に関する方法 Download PDF

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WO2018030193A1
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cells
human
cell
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PCT/JP2017/027648
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義一 栗原
秀樹 郷田
武寿 磯田
武嗣 白石
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a method applied to experimental animals such as PDX (patient-derived tumor xenograft) model. More particularly, the present invention relates to a method that can be used to evaluate the tumor tissue of such laboratory animals.
  • PDX patient-derived tumor xenograft
  • tumor-bearing mice There are two main types of tumor-bearing mice. One is a cultured cell-introduced model mouse produced by planting cultured cells derived from tumor cells removed from a patient and growing them in the mouse, and the other is a tumor tissue or tumor cell removed from a patient. Is a tumor tissue transplantation model mouse produced by planting a mouse in a mouse and growing it in the mouse. By using such tumor-bearing mice, the drug efficacy or safety (toxicity) of the drug or its candidate substance is investigated at the stage of drug discovery research or non-clinical trials that are conducted prior to human testing. Can do. Moreover, since mice derived from cancer patients with various properties can be prepared, it is possible to find effective patient profiles by comparative evaluation.
  • mice Since the former tumor-bearing mouse is easy to produce, its position as an experimental animal has been established classically.
  • the cells used for the production of such mice are those cloned by culturing in test tubes, and mice transplanted with the cloned cells stably inherit clonal elements, so tumor-bearing tumors with little individual difference Suitable for tests where mice are desired.
  • mice Even when these tumor-bearing mice are used, it is often impossible to produce specimen slides with uniform properties. Therefore, in the commercialization of specimen slides produced using such mice, the internal standard Quality assurance is implemented through use and pre-shipment inspection.
  • tumor tissue transplantation model mouse requires an instability technique in which tumor tissue or tumor cells removed from the patient are directly planted in the mouse, and so far it has been limited to production in limited facilities. It was. In recent years, however, the complexity of tumor cells has been maintained, including the genesis that produces them (gene mutations, etc.), and the complexity has been repeated over generations. Has come to be recognized.
  • PDX model mice can be mentioned as tumor-bearing mice that may be able to achieve such a level above a certain level.
  • PDX is an abbreviation for Patient-derived tumor xenograft (patient-derived tumor xenograft), in which a tumor tissue or tumor cell derived from a patient (human) is implanted in a mouse or other experimental animal, and the body of a mouse or the like for a certain period It means to grow in.
  • the PDX model mouse was transplanted with an individual (primary: 0th generation) initially transplanted with a tumor tissue or tumor cell extracted from a patient, and a tumor tissue or tumor cell (tumor part) grown in the primary body. There are individuals (passage: first generation, second generation, etc.).
  • Non-Patent Document 1 for example, can be referred to.
  • Non-Patent Document 2 describes that a PDX model mouse for bladder cancer has been prepared.
  • mice depending on the patient and the type of protein, Various mice have been shown, such as mice that do not change and mice whose traits change gradually with passage (see FIG. 3, for example). That is, although the experimental animals of the PDX model inherit genetic information by passage, they are not cloned as much as the cultured cell introduction model, and it is difficult to say that the specimen slides prepared from these tumor-bearing mice are the same. Therefore, when using the experimental animal of the PDX model, examination for assuring the quality of the prepared specimen slide is more important than the case of using the cultured cell introduction model.
  • quality control of a test animal transplanted with a tumor tissue or tumor cell derived from a patient (human), such as a PDX model mouse, and analysis of test results using such a test animal are performed. Provides a means to do more accurately.
  • the present inventor has infiltrated a patient-derived tumor tissue or a site containing a tumor cell (tumor part) with fibroblasts, extracellular matrix, endothelial cells, lymphocytes, monocytes, and other leukocytes derived from laboratory animals. By doing so, we thought that one of the causes of the above problem was to deviate from the original nature of the tumor. Then, by measuring the amount of substances other than human-derived tumor cells, for example, stromal cells derived from experimental animals as described above, in a specimen derived from a tumor tissue collected from a tumor part of the experimental animal, It was found that quality changes of experimental animals and more quantitative analysis of tumors became possible by detecting the phenotypic changes in tumor tissues that would be problematic when used.
  • the present invention relates to a human-derived tumor cell contained in a specimen collected from a site containing the tumor tissue or tumor cell in a laboratory animal transplanted with a human-derived tumor tissue or tumor cell.
  • a method comprising the step of measuring the amount of a substance other than.
  • the amount of substances other than human tumor cells for example, the amount of stromal cells derived from experimental animals
  • the amount is relatively large (for example, more than a predetermined reference value).
  • the tumor tissue held by the laboratory animal from which the specimen was collected may have a relatively large change in traits compared to the tumor tissue of the patient or the first experimental animal. It may have a different efficacy against experimental animals and experimental animals passaged from the original experimental animals.
  • quality control of various experimental animals such as PDX model mice and analysis of test results using such experimental animals can be performed. It can be done accurately at an unprecedented high level. As a result, it can be expected that non-clinical tests using experimental animals can be actively used in various situations.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of the first embodiment.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram of the second embodiment.
  • the method according to an embodiment of the present invention is included in a specimen collected from a site (tumor part) containing the tumor tissue or tumor cell in a laboratory animal transplanted with a human-derived tumor tissue or tumor cell. Measuring the amount of a substance other than human tumor cells.
  • Tumor in the present invention usually refers to a malignant tumor, and “cancer” (cancer / carcinoma in English) which is a malignant tumor generated from epithelial cells such as skin, stomach, intestinal mucosa; muscle, fiber, bone, “Sarcoma” (sarcoma in English), a malignant tumor arising from non-epithelial cells such as fat, blood vessels, and nerves; leukemia and malignant lymphoma arising from hematopoietic organs.
  • tumor tissue or “tumor cell” is generally used. However, as a typical embodiment, the term “cancer tissue” or “cancer cell” may be used. is there.
  • an experimental animal transplanted with tumor tissue or tumor cells derived from humans that is, an experimental animal generally called a tumor-bearing animal is used.
  • an immunodeficient animal is usually used to suppress rejection of tumor tissue or tumor cells derived from transplanted humans.
  • animal species include mice, rats, rabbits, guinea pigs, gerbils, hamsters, ferrets, dogs, minipigs, monkeys, cows, horses, sheep, etc. Animals that have requirements are listed.
  • “Human-derived tumor tissue or tumor cells” to be transplanted into experimental animals refers to tumor tissues or tumor cells collected from humans (patients) or human origin established as cultured cell lines for the 0th generation experimental animals.
  • the body of the n-1th generation experimental animals originating from tumor tissue or tumor cells transplanted in such 0th generation refers to tumor tissue grown or tumor cells grown.
  • a tumor tissue or tumor cell collected from a human (patient) in the 0th generation in which a change in a trait of a tumor tissue or tumor cell contained in a tumor part is relatively large, is transplanted, It is preferable to apply to the passage of nth generation experimental animals (PDX model mice, etc.) for the improvement of quality, etc., but the change in such traits is relatively small. Apply to the nth generation experimental animals (such as cultured cell-introduced model mice) that have been transplanted and passaged with human-derived tumor cells established as cell lines for further quality improvement Is also possible.
  • nth generation experimental animals such as cultured cell-introduced model mice
  • the place where a human-derived tumor tissue or tumor cell is transplanted is not particularly limited, such as subcutaneous, intradermal, organ, intracranial, etc.
  • the experimental animal is a mouse, it is easy to operate. From the viewpoint of ease of sample collection and the like, it is preferable to transplant subcutaneously in the back or flank.
  • the technique for transplanting a human-derived tumor tissue or tumor cell into a laboratory animal and carrying the tumor is not particularly limited, and a known technique can be used.
  • a method for producing a tumor-bearing model mouse by PDX it is preferable to use a method for producing a tumor-bearing model mouse by PDX, and an environment in which a produced tumor-bearing model mouse can be purchased is also prepared.
  • tumor-bearing model mice transplanted with cultured cells derived from tumor cells removed from patients can also be prepared by known techniques, and can also be obtained from various institutions.
  • mice transplanted with cultured cancer cells taken out from patients include CDX (Cell-line-derived xenograft) model mice, and mice transplanted with tumor tissues or tumor cells derived from humans include PDX (Patient In addition to derived (xenograft) model mice, immuno-avatar model mice, hemato-lymphoid-humanized model mice, and Imune-PDX model mice (Sanmamedmaet al., Annals of Oncology 00: 1- 9, 2016).
  • the “tumor part” held by each generation of experimental animals is a part containing “human-derived tumor tissue or tumor cells” as described above, from which “specimen” is collected.
  • the tumor part includes “substances other than human-derived tumor cells” as well as human-derived tumor tissues or tumor cells.
  • the amount of “substance other than human-derived tumor cells” contained in a specimen collected from a tumor site is measured.
  • the substance other than human-derived tumor cells to be measured may be one type or two or more types.
  • “substance other than human-derived tumor cells” whose amount is necessarily measured in the present invention is “first target substance”, and in a preferred embodiment of the present invention, “quantity is further evaluated”.
  • the “substance that human-derived tumor cells have” may be referred to as “second target substance”.
  • the “specimen” is prepared from a tumor part held by a laboratory animal as described above.
  • the method for collecting the tumor part from the experimental animal is not particularly limited, but the whole tumor part may be removed using a scalpel, or a part of the tumor part may be collected using a biopsy needle. Since some of the tumors are collected and then experimental animals can be used for drug efficacy tests such as anticancer drugs, it is preferable to collect them using a biopsy needle.
  • sample collected from a tumor site is a specimen slide prepared according to a predetermined procedure, which is conventionally used in, for example, pathological diagnosis when evaluating the expression level of a target protein by immunostaining. Is preferable.
  • the method according to an embodiment of the present invention is performed in vitro in an experimental animal using such a specimen.
  • the “substance other than human-derived tumor cells” contained in a tumor site or a specimen collected therefrom is typically “stromal material derived from experimental animals” or “stromal material from human tissue”.
  • the stroma derived from the experimental animal is a tissue derived from the experimental animal mixed in the tumor part in the living body of the experimental animal.
  • the stroma of a human-derived tumor tissue is contained in a tumor tissue collected from a human (patient) transplanted to a 0th generation experimental animal in a mouse transplanted with a human-derived tumor tissue or tumor cells. It is the stroma that has been or is derived from the stroma. The greater the proportion of the tumor tissue or the interstitium derived from the experimental animal in the specimen, the smaller the proportion of the human tissue-derived stroma.
  • “Stromal” mainly consists of stromal cells such as fibroblasts, endothelial cells, leukocytes (lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils) and proteins such as collagen and proteoglycans. Composed of an extracellular matrix.
  • the amount of either such stromal cells or extracellular matrix may be measured, but the effect on the traits of human-derived tumor tissue carried by experimental animals is believed to be greater. It is preferable to measure the amount of stromal cells.
  • the fibroblast is a typical stromal cell, and the amount thereof is preferably measured.
  • the method for measuring the amount is not particularly limited, and various known methods can be used. For example, using a marker protein expressed on the surface (cell membrane) of a stromal cell that can distinguish the stromal cell from other cells, and using an antibody corresponding to that marker protein It is preferable to measure the amount of stromal cells by the conventional immunostaining method.
  • stromal cells can be distinguished from other cells, at least human-derived tumor cells, proteins other than marker proteins, nucleic acids (such as mRNA) and proteins related to marker proteins or other proteins Stromal cells may be stained using a modifying sugar or the like, and the amount thereof may be measured.
  • the stromal cell marker or the like as described above can itself be positioned as “a substance other than a human-derived tumor cell”.
  • Stromal cell markers are substances that reflect the amount of stromal cells, and the amount of stromal cell markers increases in proportion to the amount of stromal cell markers. May be measured as an alternative to the amount of stromal cells.
  • CD140a is a membrane protein expressed on the surface of cells such as fibroblasts, megakaryocytes, monocytes, erythrocytes, myeloid progenitor cells, endothelial cells, and the stromal cell marker in one embodiment of the present invention.
  • CD106 VCAM-1, INCAM-110; CD49d / CD29-L: Activated vascular endothelial cells, dendritic cells (DC) CD109 (Platelet activation factor, 8A3, E123) ...
  • Activated T cells platelets, vascular endothelium, megakaryocytes, CD34 + progenitor cell subset CD140a (PDGF-R, PDGFR2) ... fibroblasts, megakaryocytes, monocytes, erythrocytes, myeloid progenitor cells, endothelial cells CD140b (PDGF-R, PDGFR1) ...
  • endothelial cells stromal cells CD141 (Thrombomodulin): Vascular endothelium, myeloid cells, platelets, smooth muscle CD142 (Tissue Factor (TF), Thromboplastin): Epithelial cells, activated monocytes, activated vascular endothelium CD143 (ACE; angiotensin converting enzyme) ... vascular endothelium, epithelial cells, activated macrophages CD144 (VE-Cadherin, Cadherin-5: involved in permeability of vascular endothelium) ... vascular endothelium CD145 (7E9, P7A5) ... endothelial cells CD146 (MUC18, s-endo, Mel-CAM) ...
  • vascular endothelium activated T cells, melanoma CD147 (Basigin, M6, EMMRRIN) ... white blood cells, red blood cells, vascular endothelium, platelets CD201 (EPCR: protein C receptor) ... vascular endothelium CD202 (TIE2, TEK; Angiopoietin-1-R) ...
  • Vascular endothelium, hematopoietic stem cell subset CD280 (Endo180, TEM22, uPARAP (uPAR-associated protein); bone marrow progenitor cells, fibroblasts, endothelial cell subsets, macrophage subsets CD299 (DC-SIGN-related, L-SIGN (Liver / Lympho node specific ICAM3-grabbing nonintegrin)) ...
  • Endothelial cells CD309 VGFR2: Vascular endothelial growth factor receptor 2, KDR
  • endothelial cells megakaryocytes, platelets, stem cell subsets CD322 (JAM2: Junctional adhesion molecule 2) ...
  • endothelial cells monocytes, B cells, T cell subsets CD331 (FGFR1: Fibroblast growth factor receptor1) ... fibroblasts, epithelial cells CD332 (FGFR2, Keratinocyte growth factor receptor) ... epithelial cells CD333 (FGFR3, JTK4; Achondroplasia, Thanatophoric dwarfism) ... fibroblasts, epithelial cells CD334 (FGFR4, JTK2, TKF) ... fibroblasts, epithelial cells CD339 (Jagged-1, JAG1; Alagille syndrome) ... Stroma cells, epithelial cells.
  • FGFR1 Fibroblast growth factor receptor 1
  • fibroblasts epithelial cells CD332 (FGFR2, Keratinocyte growth factor receptor) ... epithelial cells CD333 (FGFR3, JTK4; Achondroplasia, Thanatophoric dwarfism) ... fibroblasts
  • epithelial cells CD334 FGFR4, JTK
  • the amount of substances other than human-derived tumor cells in a specimen is generally measured by observation and imaging in the dark field or bright field of a specimen slide, and is usually the amount contained in one field or multiple fields. It is calculated as an average value of the amount contained in.
  • the first target substance (and the second target substance) in addition to measuring the amount of the first target substance (and the second target substance), the first target substance (and the second target substance) can be used using the same specimen slide as necessary. Further information such as the type, number, form, and expression site (distribution in tumor tissue or specimen, exclusive area) of cells having the target substance may be obtained.
  • one or more new information is derived and used for the desired application. It can also be used.
  • Such new information includes, for example, (i) the amount of the first target substance and / or the second target substance per cell (average amount) in the specimen (specimen slide), (ii) the first The amount per unit area of the tissue of the target substance and / or the second target substance, (iii) a histogram represented by the amount per cell of the first target substance and / or the second target substance and the corresponding number of cells (Iv) Information on the expression level per cell of the first target substance and / or the second target substance and the curve represented by the number of cells corresponding thereto, and the like.
  • target protein a protein is selected as the first target substance or the second target substance (hereinafter referred to as “target protein”), and its expression level is measured by immunostaining using fluorescent nano
  • the number of bright spots representing the target protein expressed for individual cells contained in the entire image or in a specific region (for example, only tumor tissue) in the image. Can be measured.
  • the measured number of bright spots may be used as an index value for the expression level of the target protein.
  • the brightness (luminance, fluorescence intensity) of one bright spot is measured separately for each fluorescent nanoparticle.
  • the number of fluorescent nanoparticles contained in the bright spot can be calculated by dividing by the brightness of the light, and the number of particles may be used as an index value for the expression level of the target protein.
  • (Iii) When creating a histogram expressed by the expression level of the target protein per cell and the number of cells corresponding to it, first, as in (i), the entire image or a specific region in the image ( For example, the number of bright spots or particles representing the expressed target protein is measured for individual cells contained in only the tumor tissue. A horizontal axis is used to create a histogram by dividing the expression level of the target protein per cell by a predetermined number, measuring the number of cells (frequency) corresponding to each division, and taking the vertical axis. Can do.
  • the method for measuring the amount of a substance (first target substance) other than human-derived tumor cells is not particularly limited as long as the amount of the first target substance can be measured with desired accuracy.
  • the amount can be measured by an immunostaining method using a stromal cell marker as described above.
  • an embodiment using the following two representative measurement methods can be given.
  • fluorescent nanoparticles that is, quantum dots (not integrated), or fluorescent materials such as fluorescent dyes and quantum dots are integrated using a resin or the like as a base material.
  • the first target substance for example, the number of stromal cells or the number of stromal cell markers approximately proportional to the number of stromal cells
  • PID phosphors integrated particles
  • the amount of the first target substance and the number of bright spots generated by fluorescent nanoparticles, preferably PID Positive correlation with the number of particles bound to one target substance (the number of particles contained in a bright spot can be calculated by dividing the brightness of one bright spot by the brightness per particle) Therefore, as the amount of the first target substance increases, the number of bright spots or the number of particles tends to increase.
  • the second embodiment (second measurement method) of the measurement method is a staining method that uses a reaction between an enzyme and a substrate, which is conventionally used in a conventional IHC (Immunohistochemistry) method.
  • the DAB staining method using a reaction between peroxidase and diaminobenzidine (DAB) is particularly preferable because of excellent dyeability.
  • the first target substance is labeled with an enzyme (peroxidase) and then reacted with the substrate diaminobenzidine (DAB) to produce a dye, whereby the periphery of the first target substance is stained brown. Is done.
  • the amount of the first target substance and the amount of the dye produced from DAB that is, stained brown
  • the amount of the first target substance and the amount of the dye produced from DAB that is, stained brown
  • Index values obtained by the first measurement method and the second measurement method that is, the number of particles of phosphor-integrated particles (PID) in the case of the first measurement method, and the like.
  • the area ratio, etc., of the obtained region in the visual field of the specimen slide reflects the amount of substances other than human-derived tumor cells.
  • such an index value is set so as to be stratified (scored) by setting several numerical ranges (for example, 2 to 5), that is, a group of specimens whose index values are within a predetermined range. It may be handled as if
  • the amount of the first target substance may be measured by the first measurement method using fluorescent nanoparticles, preferably a fluorescent label such as PID, or a reaction between an enzyme and a substrate such as DAB staining is used.
  • the measurement may be performed by the second measurement method, but measurement is preferably performed by the former, which is more quantitative and has a high accuracy in evaluating the efficacy.
  • the method according to an embodiment of the present invention further includes a step of measuring the amount of a substance possessed by a human-derived tumor cell that is an object of drug efficacy evaluation.
  • “Substances possessed by human-derived tumor cells to be evaluated for drug efficacy”, that is, the second target substance in one embodiment of the present invention is not particularly limited, and may be selected from various known substances. it can.
  • the second target substance to be measured may be one type or two or more types.
  • a protein that is a target of a molecular target drug and expressed in a tumor cell specifically, EGFR (HER1), HER2, HER3, VEGFR, PD-L1, Bcr-Abr, Kit, ALK, JAK, Btk, PI3K, BRAF, mTOR, CDK4 / 6 and the like can be mentioned.
  • the second target substance includes nucleic acids related to the tumor cell membrane protein as described above, for example, mRNA of the membrane protein, a gene that may be amplified in the tumor cell such as the HER2 gene, and tumor cell Examples include sugars (sugar chains) that modify membrane proteins, such as sugars (sugar chains) that become different from normal cells by becoming tumors.
  • the amount of the second target substance can be measured by the same method as the first target substance described above.
  • the amount is measured by an immunostaining method using an antibody corresponding to (specifically binds to) the protein, as when a protein is selected as the first target substance. It is preferable to do.
  • the amount is measured using a nucleic acid probe corresponding to the nucleic acid (having a complementary base sequence) or a lectin that recognizes and binds to the sugar. It is preferable.
  • the amount of the second target substance may be measured by the first measurement method using fluorescent nanoparticles, preferably a fluorescent label such as PID, or a reaction between an enzyme and a substrate such as DAB staining is used.
  • the measurement may be performed by the second measurement method, but measurement is preferably performed by the former, which is more quantitative and has a high accuracy in evaluating the efficacy.
  • the DAB staining method is used in a standardized test method for evaluating the expression level of HER2 protein in cell membranes such as breast cancer cells and determining the effectiveness of treatment using an anti-HER2 monoclonal antibody (trastuzumab). (Refer to “HER2 Examination Guide Third Edition”, Trastuzumab Pathology Committee, September 2009).
  • the amount of a substance other than human-derived tumor cells or an index value reflecting the amount measured by the method according to an embodiment of the present invention is not particularly limited.
  • the method according to an embodiment of the present invention can be used for quality control of experimental animals as follows, for example. Two sections of the tumor tissue are prepared from the tumor part of one generation of experimental animals, one of which is a specimen slide prepared as a specimen, and the other is transplanted to a separate immunodeficient animal for the next generation experiment. Create animals. A measured value (or score when stratified) of the amount of the first target substance obtained using the method according to an embodiment of the present invention for the specimen slide, and a drug (anticancer agent) for the next-generation experimental animal Can be associated with information on the medicinal effects of the administration of. If the amount of the first target substance is different, the medicinal effect on the next-generation experimental animal is different.
  • the amount of the first target substance may affect the quality of the experimental animal, that is, the effectiveness of the drug.
  • the experimental animal to be commercialized is limited to an experimental animal in which the amount of the first target substance in the tumor site is within a predetermined range that does not affect the effectiveness of the drug, or an experimental animal passaged therefrom. It is possible.
  • Such an analysis is not the amount of the first target substance (the total amount in the specimen or the field of view at the time of microscopic observation) itself, but new information derived by combining with other information as described above, for example, the first target It is also possible to carry out based on the amount of substance per cell.
  • the use of the index value reflecting the amount of the substance or the amount of the human-derived tumor cells to be evaluated for efficacy is also particularly limited. Is not to be done.
  • the experimental animal to be commercialized is analyzed by analyzing the relationship between the amount of the first target substance and the medicinal effect on the next-generation experimental animal as well as the relationship between the amount of the second target substance and the medicinal effect on the experimental animal.
  • the mixed liquid after cooling was dispensed into a plurality of centrifuge tubes, and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes to precipitate Texas red-integrated melamine resin particles contained in the mixed liquid.
  • the supernatant was removed and the precipitated particles were washed with ethanol and water.
  • the average particle size was 152 nm.
  • the particles subjected to the above surface amination treatment are adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and the final concentration of this solution is 10 mM.
  • SM (PEG) 12 succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido) -dodecaethyleneglycol] ester was mixed and allowed to react for 1 hour. The mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added, the precipitate was dispersed, and centrifuged again. Maleimide-modified Texas Red integrated melamine resin particles were obtained by performing washing by the same procedure three times.
  • streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was subjected to a thiol group addition treatment using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA), followed by filtration through a gel filtration column, so that a maleimide-modified Texas red integrated melamine resin was obtained. A streptavidin solution capable of binding to the particles was obtained.
  • the maleimide-modified Texas Red-integrated melamine resin particles and streptavidin to which a thiol group was added by the above treatment were mixed in PBS containing 2 mM of EDTA and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction. The obtained mixed solution was concentrated with a centrifugal filter, and then unreacted streptavidin and the like were removed using a purification gel filtration column to produce streptavidin-modified Texas Red-integrated melamine resin particles.
  • Example 1 According to the following procedure, the expression level of CD140a, which is the first target substance (protein), in the tumor tissue of the first generation PDX mouse was measured, and the efficacy of the anticancer drug in the second generation PDX mouse was determined.
  • a conceptual diagram of the first embodiment is shown in FIG.
  • Example 1-1 Embodiment in which the expression level of CD140a is measured using PID
  • the same breast cancer tissue (about 3 mm square) collected from a breast cancer patient evaluated as 3+ in the HER2 test by DAB staining is used as an immunodeficient mouse.
  • the tumor volume was determined from the calculation formula of (major axis) ⁇ (minor axis) ⁇ (minor axis) ⁇ 0.5 (mm 3 ) by measuring the major axis and minor axis of the tumor part using calipers. Ten pieces of about 3 mm square were prepared from the excised tumor tissue using a heat sterilized scalpel and a cutter.
  • PDX mice Ten sections prepared from 10 PDX mice (P0), a total of 100 sections, were subcultured to another 100 immunodeficient mice (first generation: P1) to obtain PDX mice (P1).
  • PDX mice (P1) were bred in the same manner as described above, and tumors were measured every 3 to 4 days. When the tumor volume reached 500 mm 3 , the tumor tissue was extracted using a scalpel. Two slices of about 3 mm square were prepared from the excised tumor tissue using a heat sterilized scalpel and a cutter.
  • CD140a an antigen that is expressed on the cell surface of fibroblasts, megakaryocytes, monocytes, erythrocytes, myeloid progenitor cells, and endothelial cells. Used for preparation of specimen slides. The remaining one was used for passage to the second generation: P2 described below.
  • the specimen slide was deparaffinized and then washed to replace xylene in the tissue with water.
  • the washed specimen slide was autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes in a 10 mM citrate buffer (pH 6.0) to activate the antigen.
  • the specimen slide after the activation treatment was washed with PBS, and the washed specimen slide was subjected to blocking treatment at room temperature for 15 minutes using PBS containing 1 (w / v)% BSA.
  • Antibody-antibody reaction treatment (primary reaction treatment for immunostaining related to CD140a)
  • a primary reaction treatment solution containing a biotin-modified anti-mouse CD140a rat monoclonal antibody (clone: APA5, BioLegend) at a concentration of 5 ⁇ g / mL was prepared using PBS containing 1 (w / v) BSA.
  • the specimen slide after the activation treatment step was immersed in this primary reaction treatment solution and reacted at 4 ° C. overnight.
  • Fluorescent labeling (secondary reaction) A fluorescent labeling reaction treatment solution was prepared by diluting the streptavidin-modified Texas red dye-integrated melamine resin particles produced in Production Example 2 to 0.02 nM using a fluorescent nanoparticle diluent containing casein and BSA. The specimen slide after completion of the antigen-antibody reaction treatment step is washed with PBS for 5 minutes ⁇ 3 times, and then immersed in this fluorescent labeling reaction treatment solution, under a neutral pH environment (pH 6.9 to 7.4) at room temperature. The reaction was performed for 3 hours.
  • the specimen slide subjected to the fluorescence labeling treatment was stained with Mayer's hematoxylin solution for 5 minutes and stained with hematoxylin, and then washed with running water at room temperature for 10 minutes.
  • the sample was irradiated with excitation light corresponding to Texas Red used for the fluorescent labeling of CD140a, which is the first target protein, to emit fluorescence, and an immunostained image in that state was photographed.
  • the wavelength of the excitation light was set to 575 to 600 nm using the excitation light optical filter provided in the fluorescence microscope, and the wavelength of the fluorescence to be observed was set to 612 to 692 nm using the fluorescence optical filter.
  • the intensity of the excitation light at the time of observation and image photographing with a fluorescence microscope was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 .
  • the exposure time at the time of image shooting was adjusted within a range in which the luminance of the image was not saturated, and was set to, for example, 8000 ⁇ sec.
  • Image processing software “ImageJ” open source was used for image processing in this process. Measure the number of bright spots on the field of view (screen) whose brightness is greater than or equal to a predetermined value, and divide the brightness of the bright spots by the brightness per phosphor integrated particle (PID) to convert it to the number of particles. This was treated as the expression level of CD140a in the visual field. The expression level (number of particles) of CD140a in 5 fields of view was measured, and the average value thereof was calculated as the “PID score” of the sample slide.
  • PID brightness per phosphor integrated particle
  • the PID score of CD140a in the first generation PDX mouse (P1) is calculated for 100 specimen slides by the above-mentioned PID stained specimen slide evaluation step, and the PID score is 0 or more and 50000 or less (P1-1), 50000 It was divided into four groups of greater than 100,000 (P1-2), greater than 100,000 and less than 150,000 (P1-3), and greater than 150,000 (P1-4). Further, depending on which group of P1-1, P1-2, P1-3, and P1-4 the first-generation PDX mouse (P1) belongs to, the second-generation PDX mouse (P2) is changed to P2-1. , P2-2, P2-3 and P2-4.
  • the average value of the relative values of the tumor volume 3 weeks after the administration of the drug was calculated. And when this average value is 200 or less, the medicinal effect is excellent ( ⁇ ), when it is greater than 200 and less than or equal to 400, good ( ⁇ ), when it is greater than 400 and less than or equal to 600 ( ⁇ ), when it is greater than 600, ( ⁇ ) was evaluated.
  • the expression level of CD140a measured using the PID of each group of the first generation PDX mouse (P1), the relative value of the tumor volume of each group of the second generation PDX mouse (P2) and the determination result of the drug efficacy The results are shown in Table 1 (see ⁇ Analysis> below).
  • Example 1-2 Embodiment of measuring the expression level of CD140a using DAB
  • passage of 100 individuals to the first generation PDX mouse (P1) and Two sections of tumor tissue were prepared.
  • the procedure of Example 1-1 was changed as described below to prepare a CD140a / DAB-stained specimen slide, and the expression level of CD140a was measured.
  • passage to 100 second-generation PDX mice (P2) was carried out in the same manner as in Example 1-1, and the efficacy of the anticancer drug was further increased. Judgment was made.
  • the activation process and antigen-antibody reaction process included in the specimen slide preparation process and the immunostaining process are performed in the same manner as in Example 1-1.
  • the replacement and morphology observation staining steps were not performed, and the dehydration, penetration, and encapsulation steps were performed in the same manner as in Example 1-1 after the DAB staining treatment.
  • a solution containing streptavidin-labeled horseradish peroxidase (SA-HRP, Thermo Fisher) at a concentration of 0.1 ⁇ g / mL was prepared using PBS containing 1% (w / v) BSA.
  • the specimen slide that had undergone the antigen-antibody reaction treatment was immersed in this solution and reacted at room temperature for 1 hour. Subsequently, the specimen slide was washed with PBS for 5 minutes ⁇ 3 times, and reacted with a 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) solution (Takara Bio Inc.) for 10 minutes at room temperature. After completion of the reaction, the specimen slide was washed with running water at room temperature for 10 minutes.
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride
  • DAB stained specimen slide evaluation process Observation and photographing process The area of the DAB-stained region contained in the DAB-stained specimen slide was determined using Aperio ScanScope CS2 (Leica).
  • Aperio ScanScope Console software was started, a specimen slide was set, and then a pre-scan for photographing the entire sample at a low resolution was performed. After pre-scanning, the scan area, focus point, and white balance were set and image capture was executed. After capturing the image, the ImageScope software attached to Aperio was launched, the region to be analyzed was selected from Annotations, and Positive Pixel Count (v9) was selected from Analysiss of Analysis, and staining with DAB was performed.
  • the CD140a Positivity number of pixels stained with DAB / number of pixels of the entire visual field ⁇ 100 in 5 fields of view was measured, and the average value was calculated as the “DAB score” of the specimen slide.
  • a second generation PDX mouse (P2) was prepared, the anticancer drug trastuzumab was administered, the tumor volume before and after administration was compared, and the relative value of the tumor volume 3 weeks after drug administration was calculated.
  • the DAB score of CD140a in the first generation PDX mouse (P1) is calculated for 100 specimen slides by the DAB-stained specimen slide evaluation process, and the DAB score is 0-10% (P1-5), 10 More than 20% and less than 20% (P1-6), more than 20% and less than 30% (P1-7), and more than 30% (P1-8).
  • the second generation PDX mouse was changed to P2-5, respectively.
  • P2-6, P2-7 and P2-8 were evaluated.
  • the average value of the relative values of the tumor volume 3 weeks after the administration of the drug was calculated. And when this average value is 200 or less, the medicinal effect is excellent ( ⁇ ), when it is greater than 200 and less than or equal to 400, good ( ⁇ ), when it is greater than 400 and less than or equal to 600 ( ⁇ ), when it is greater than 600, ( ⁇ ) was evaluated.
  • the expression level of CD140a measured by DAB staining of each group of the first generation PDX mouse (P1), the relative value of the tumor volume of each group of the second generation PDX mouse (P2) and the determination result of the drug efficacy are shown. It is shown in 2.
  • Example 1-1 (Table 1) and Example 1-2 (Table 2)
  • the group with the highest PID score or DAB score of CD140a that is, the proportion of stromal cells derived from mice is high. It was found that the efficacy in mice subcultured from those groups showed a tendency different from those in other groups. Therefore, by stratifying the expression level of CD140a, it is possible to predict the drug efficacy in mice to some extent.
  • the group with the highest PID score or DAB score of CD140a is excluded from the medicinal effect test in advance, so that a more reproducible experiment becomes possible, and from the viewpoint of animal welfare, the experimental animal is wasted. It is thought that the merit of not doing is obtained.
  • the present invention is an effective means for detecting a change in character even if the generation is different.
  • Example 2 Using specimen slides (new specimen slides separate from PID stained specimen slides or DAB stained specimen slides) for 100 first generation PDX mice (P1) prepared in Examples 1-1 and 1-2, As a second target substance (protein), the expression level of HER2 expressed on the cell membrane of breast cancer cells and the like was measured. A conceptual diagram of the second embodiment is shown in FIG.
  • the concentration of the linker reagent “Maleimide-PEG2-Biotin” was adjusted to 0.4 mM using DMSO. 8.5 ⁇ L of this linker reagent solution was added to the antibody solution, mixed, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to bind biotin to the anti-rabbit IgG antibody via the PEG chain.
  • the reaction solution was purified through a desalting column. For the desalted reaction solution, the absorbance at a wavelength of 300 nm was measured using a spectrophotometer (F-7000; Hitachi High-Tech Science) to calculate the concentration of the protein (biotin-modified secondary antibody) in the reaction solution. .
  • a solution in which the concentration of the biotin-modified secondary antibody was adjusted to 250 ⁇ g / mL using a 50 mM Tris solution was used as the biotin-modified secondary antibody solution.
  • Example 2-1 Embodiment in which the expression level of HER2 is measured using DAB
  • a sample slide prepared by the same method as the sample slide preparation step of Example 1-1 is used as a Ventana I-VIEW pathway HER2 (4B5).
  • HER2 score was determined by DAB method, and tumor area and stromal cell area were morphologically identified.
  • the HER2 score was in accordance with the standard used (see, for example, “HER2 Examination Guide Third Edition” (prepared by Trastuzumab Pathology Committee, September 2009)).
  • Example 2-2 Embodiment in which the expression level of HER2 is measured using PID
  • HER2 contained therein is designated as PID. Staining was performed by the immunostaining method used. The specific procedure of the immunostaining process is as follows.
  • Antibody-antibody reaction treatment (primary reaction treatment for immunostaining related to HER2)
  • a primary reaction treatment solution containing anti-HER2 rabbit monoclonal antibody “4B5” (Ventana) at a concentration of 0.05 nM was prepared using PBS containing 1% (w / v) BSA. The specimen slide after the activation treatment was immersed in this primary reaction treatment solution and reacted at 4 ° C. overnight.
  • Secondary antibody reaction treatment (secondary reaction treatment) A secondary reaction treatment solution was prepared by diluting the biotin-modified anti-rabbit IgG antibody solution prepared in Preparation Example 3 to 6 ⁇ g / mL using PBS containing 1 (w / v)% BSA. The specimen slide after the primary reaction treatment was washed with PBS, then immersed in this secondary reaction treatment solution, and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • Fluorescent labeling treatment (tertiary reaction treatment) A fluorescent labeling reaction treatment solution was prepared by diluting the streptavidin-modified Texas red-integrated melamine resin particles produced in Production Example 1 to 0.02 nM with a fluorescent nanoparticle diluent containing casein and BSA. The specimen slide after the secondary reaction treatment was immersed in this fluorescent labeling reaction treatment solution and reacted at room temperature for 3 hours in a neutral pH environment (pH 6.9 to 7.4).
  • the specimen slide subjected to the fluorescent labeling treatment was stained with Mayer's hematoxylin solution for 5 minutes and stained with hematoxylin, and then washed with running water at 45 ° C. for 3 minutes.
  • the specimen slide was irradiated with excitation light corresponding to Texas Red used for fluorescent labeling of HER2, which is the second target protein, to emit fluorescence, and an immunostained image in that state was photographed.
  • the wavelength of the excitation light was set to 575 to 600 nm using the excitation light optical filter provided in the fluorescence microscope, and the wavelength of the fluorescence to be observed was set to 612 to 692 nm using the fluorescence optical filter.
  • the intensity of the excitation light at the time of observation and image photographing with a fluorescence microscope was such that the irradiation energy near the center of the visual field was 900 W / cm 2 .
  • the exposure time at the time of image shooting was adjusted within a range in which the luminance of the image was not saturated, and set to, for example, 4000 ⁇ sec.
  • Image processing software “ImageJ” (open source) was used for image processing in this process.
  • the bright spot representing was extracted. Since HER2 is not expressed in the stromal cell region, the bright spot located in the stromal cell was treated as a nonspecific signal, that is, noise.
  • the number of bright spots on the cell membrane whose brightness is equal to or higher than a predetermined value is measured, and the brightness of the bright spot is divided by the brightness per phosphor integrated particle (PID) to convert it to the number of particles. It was handled as the expression level of HER2 in the cells. Then, the expression level (number of particles) of HER2 was measured for 1000 cells per specimen slide (5 fields of view), and the average value was calculated as the “PID score” of the specimen slide.
  • Example 2-1 in addition to the stratification by DAB score of 100 first generation PDX mice (P1) performed in Example 1-2, the layer according to whether the DAB score of HER2 is 3+ or not Separated. Further, in the same manner as in Example 1-2, linking with the results of the antitumor test of the second generation PDX mice (P2) passaged from these individuals was performed. The results are shown in Table 3.
  • Example 2-2 in addition to the stratification by DAB score of 100 first generation PDX mice (P1) performed in Example 1-2, the PID score of HER2 is 500 or more and less than 500 The stratification was carried out. The results are shown in Table 4.

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Abstract

本発明は、実験動物の腫瘍組織の評価に関する方法に関し、該方法は、ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞が移植された実験動物における、前記腫瘍組織または腫瘍細胞を含む部位から採取された検体中の、ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質の量を測定する工程を含む。

Description

実験動物の腫瘍組織の評価に関する方法
　本発明は、ＰＤＸ（Patient-derived tumor xenograft：患者由来腫瘍異種移植）モデルなどの実験動物に対して適用される方法に関する。より詳しくは、本発明はそのような実験動物の腫瘍組織を評価するために用いることのできる方法に関する。
　癌（腫瘍）の研究では、ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞を免疫不全動物である実験動物に移植して作製されるモデル動物、例えばマウスを実験動物として用いて作製される担腫瘍マウスを、生体内の環境を再現した実験系として用いることがある。
　担腫瘍マウスとしては、大きく分けて二つのタイプが知られている。一つは、患者から取り出した腫瘍細胞に由来する培養細胞をマウスに植え付け、マウス内で成長させることによって作製された培養細胞導入モデルマウス、もう一つは、患者から取り出した腫瘍組織または腫瘍細胞をマウスに植え付け、マウス内で成長させることによって作製された腫瘍組織移植モデルマウスである。このような担腫瘍マウスを用いることにより、ヒトを対象とする試験の前に行われる、創薬研究または非臨床試験の段階において、薬剤またはその候補物質の薬効や安全性（毒性）を調べることができる。また、様々な性質の癌患者由来のマウスを作製することができるので、比較評価することにより効果のある患者のプロファイルを見出すことも可能である。
　前者の担腫瘍マウスは作製が容易であることから、古典的に実験動物としての地位が確立されている。このようなマウスの作製に用いる細胞は、試験管で培養することでクローン化したものであり、クローン化した細胞を移植したマウスは安定してクローン的要素を引き継ぐので、個体差の少ない担腫瘍マウスを使用したい試験には好適である。しかしながら、こうした担腫瘍マウスを使用した場合であっても、均一な性質の標本スライドを作製できない場合がしばしばあり、そのためこのようなマウスを用いて作製する標本スライドの製品化においては、内部標準の使用や出荷前検査によって、品質保証を実施している。
　一方後者の腫瘍組織移植モデルマウスは、患者から取り出した腫瘍組織または腫瘍細胞を直接マウスに植え付けるという不安定性を抱えた手技が必要であるため、これまでは限られた施設での作製に限られていた。しかしながら近年、腫瘍細胞の複雑さがそれを生み出す成因（遺伝子変異など）を含めて維持され、またその複雑さが世代を超えて繰り返し再現されるため、このような担腫瘍マウスによる試験の重要性が認識されるようになった。
　そのようなことがある程度の水準以上で実現できる可能性がある担腫瘍マウスとして、ＰＤＸモデルマウスが挙げられる。ＰＤＸとは、Patient-derived tumor xenograft（患者由来腫瘍異種移植）の略称であり、患者（ヒト）由来の腫瘍組織または腫瘍細胞をマウスまたはその他の実験動物に植え付けて、一定期間、マウス等の体内で成長させることをいう。ＰＤＸモデルマウスには、患者から摘出した腫瘍組織または腫瘍細胞を最初に移植した個体（初代：第０世代）と、初代の生体内で増殖させた腫瘍組織または腫瘍細胞（腫瘍部）を移植した個体（継代：第１世代、第２世代など）がある。
　このようにして作製されたＰＤＸモデルマウスには、試験管内で培養された細胞は用いられないため、ＰＤＸモデルマウスを用いることで、従来の担腫瘍マウスよりも実際のヒトの病態を高度に再現した形で、薬効や安全性を評価することができると考えられている。近年ではＰＤＸモデルマウスを用いた非臨床的な試験方法による、診断・治療方法（診断または治療のための指標を得る方法）の開発が盛んになってきている。なお、ＰＤＸモデルは、マウスに限らず様々な実験動物について作製することが可能である。ＰＤＸモデルマウスおよびその他の各種の担腫瘍マウスについては、例えば非特許文献１を参照することができる。
　ところで、ＰＤＸモデルの実験動物でも、継代することで、腫瘍部に含まれる腫瘍組織または腫瘍細胞の形質（発現遺伝子および発現タンパク質）が完全に保持されるとは限らず、変化が起きることが分かってきた。例えば、非特許文献２には、膀胱癌のＰＤＸモデルマウスを作製したことが記載されているが、患者の違いやタンパク質の種類によって、元の患者の検体から形質が大きく変化したマウス、形質が変化しないマウス、また継代によって形質が徐々に変化するマウスなど、様々なマウスが示されている（例えばＦｉｇｕｒｅ　３参照）。すなわち、ＰＤＸモデルの実験動物は継代によって遺伝情報を引き継ぐものの、培養細胞導入モデルほどクローン化されておらず、これらの担腫瘍マウスから作製された標本スライドは同一とは言い難い。したがって、ＰＤＸモデルの実験動物を用いる場合には、培養細胞導入モデルを用いる場合以上に、作製された標本スライドの品質を保証するための検査が重要視される。
Sanmamed et al., Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies, Annals of Oncology 00: 1-9, 2016 Jager et al., Patient-derived bladder cancer xenografts in the preclinical development of novel target therapies. Oncotarget, Vol.6, No. 25, 21522-21532
　上述したようにＰＤＸモデルマウスのような実験動物においても、初代ＰＤＸモデルマウスと継代ＰＤＸモデルマウスとの間で腫瘍細胞の形質が必ずしも完全に保持されているわけではなく、ＰＤＸモデルマウスの品質管理が十分とは言えない状況にある。そのようなＰＤＸモデルマウスを用いて薬効等に関する試験を行っても、実際に患者に投与した結果を再現できているか否かは曖昧であり、解析がうまく行えないこともある。これがＰＤＸモデルマウスが当初考えられていたほど浸透していない一因となっているのではないかと考えられる。
　本発明の一実施形態では、ＰＤＸモデルマウスのような、患者（ヒト）由来の腫瘍組織または腫瘍細胞が移植された実験動物の品質管理や、そのような実験動物を用いた試験結果の分析をより正確に行うための手段を提供する。
　本発明者は、実験動物由来の繊維芽細胞や細胞外マトリックス、内皮細胞、さらにリンパ球、単球、その他の白血球などが、患者由来の腫瘍組織または腫瘍細胞を含む部位（腫瘍部）に浸潤することによって、腫瘍本来の性質から乖離していくことが上記問題の原因の一つではないかと考えた。そして、実験動物の腫瘍部から採取された腫瘍組織由来の検体における、ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質、例えば上述したような実験動物由来の間質細胞の量を測定することにより、実験動物を使用する際に課題となる腫瘍組織の形質変化を検出し、実験動物の品質管理やより定量的な腫瘍の分析が可能となることを見出した。
　すなわち、本発明は一つの側面において、ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞が移植された実験動物において、前記腫瘍組織または腫瘍細胞を含む部位から採取された検体中に含まれる、ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質の量を測定する工程を含む方法を提供する。
　本発明の一実施形態に係る方法により、ヒトの腫瘍細胞以外の物質の量、例えば実験動物由来の間質細胞の量を測定した結果、その量が比較的多い（例えば所定の基準値よりも多い）場合は、検体を採取した実験動物が保持する腫瘍組織は、患者ないし初代の実験動物の腫瘍組織と比較して形質が比較的大きく変化しているおそれがあり、抗癌剤等の薬剤はその実験動物およびそれから継代された実験動物に対して初代の実験動物とは異なる有効性を示す可能性がある。このような分析を行うことを可能とする本発明の方法を利用することにより、ＰＤＸモデルマウス等の各種の実験動物の品質管理や、そのような実験動物を用いた試験結果の分析を、これまでにない高い水準で正確に行うことができる。それにより、実験動物を用いた非臨床試験を様々な場面で積極的に活用できることが期待できる。
図１は、実施例１の概念図である。 図２は、実施例２の概念図である。
　本発明の一実施形態に係る方法は、ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞が移植された実験動物における、前記腫瘍組織または腫瘍細胞を含む部位（腫瘍部）から採取された検体中に含まれる、ヒトの腫瘍細胞以外の物質の量を測定する工程を含む。
　本発明における「腫瘍」は、通常は悪性腫瘍を指し、皮膚や胃、腸の粘膜など上皮性細胞から発生した悪性腫瘍である「癌」（英語ではcancer・carcinoma）；筋肉、線維、骨、脂肪、血管、神経など非上皮性細胞から発生した悪性腫瘍である「肉腫」（英語ではsarcoma）；造血臓器から発生した白血病や悪性リンパ腫などを包含する。本明細書では、一般的に「腫瘍組織」または「腫瘍細胞」という用語を用いて説明するが、典型的な実施形態として「癌組織」または「癌細胞」という用語を用いて説明する場合もある。
　本発明では「実験動物」として、ヒトに由来する腫瘍組織または腫瘍細胞が移植された実験動物、すなわち一般的に担腫瘍動物と呼ばれている実験動物を使用する。ＰＤＸモデルを作製する際には通常、移植されたヒトに由来する腫瘍組織または腫瘍細胞に対する拒絶反応を抑制するため、免疫不全動物が用いられる。動物種の例としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、フェレット、イヌ、ミニブタ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジなど、ある程度の遺伝学的な制御がなされており、均質な遺伝的要件を備えている動物が挙げられる。
　実験動物に移植される「ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞」は、第０世代の実験動物については、ヒト（患者）から採取した腫瘍組織または腫瘍細胞、あるいは培養細胞株として確立されたヒト由来の腫瘍細胞を指し、第ｎ世代（ｎ≧１）の実験動物については、そのような第０世代に移植された腫瘍組織または腫瘍細胞を起源とする、第ｎ－１世代の実験動物の体内で生長した腫瘍組織または増殖した腫瘍細胞を指す。本発明の一実施形態に係る方法は、腫瘍部に含まれる腫瘍組織または腫瘍細胞の形質の変化が比較的大きい、第０世代においてヒト（患者）から採取した腫瘍組織または腫瘍細胞が移植され、継代された第ｎ世代の実験動物（ＰＤＸモデルマウス等）に対して、品質の向上等のために適用することが好ましいが、そのような形質の変化が比較的小さい、第０世代において培養細胞株として確立されたヒト由来の腫瘍細胞が移植され、継代された第ｎ世代の実験動物（である培養細胞導入モデルマウス等）に対して、さらなる品質の向上等のために適用することも可能である。
　実験動物において、ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞を移植する場所は、皮下、皮内、臓器、頭蓋内など、特に限定されるものではなく、例えば実験動物がマウスであれば、操作の簡易性や検体採取の容易さ等の観点から、背部もしくは側腹部の皮下に移植することが好ましい。
　ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞を実験動物に移植し、腫瘍を担持させるための手法は特に限定されるものではなく、公知の手法を用いることができる。例えばマウスであれば、ＰＤＸによる担腫瘍モデルマウスの作製手法を用いることが好適であり、作製済みの担腫瘍モデルマウスを購入できる環境も整っている。一方、患者から取り出した腫瘍細胞に由来する培養細胞を移植した担腫瘍モデルマウスも公知の手法で作製することができ、また様々な機関から入手することもできる。
　患者から取り出した培養がん細胞が移植されたマウスとしては、ＣＤＸ(Cell-line derived xenograft)モデルマウスが挙げられ、ヒトに由来する腫瘍組織または腫瘍細胞が移植されたマウスとしては、ＰＤＸ(Patient derived xenograft）モデルマウスのほか、Immuno-avatarモデルマウス、造血リンパ系ヒト化（Hemato-lymphoid humanized）モデルマウス、Immune-PDXモデルマウスなどが挙げられる（Sanmamed et al., Annals of Oncology 00: 1-9, 2016）。
　各世代の実験動物が保持する「腫瘍部」は、上述したような「ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞」を含む部位であり、そこから「検体」が採取される。腫瘍部には、ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞とともに、「ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質」も含まれている。本発明では、腫瘍部から採取された検体に含まれる「ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質」の量を測定する。測定の対象とするヒト由来の腫瘍細胞以外の物質は、１種類であっても、２種類以上であってもよい。
　本明細書において、本発明において必ず量を測定する「ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質」を「第１目的物質」、本発明の好ましい実施形態においてさらに量を測定する「薬効評価の対象となるヒト由来の腫瘍細胞が有する物質」を「第２目的物質」と呼ぶことがある。
　本明細書において「検体」は、上述したように実験動物が保持する腫瘍部から作製する。実験動物から腫瘍部を採取する方法は特に限定されないが、メスを用いて腫瘍部の全体を摘出してもよいし、生検針を用いて腫瘍部の一部を採取してもよい。採取する腫瘍が一部であり、その後実験動物を抗がん剤などの薬効試験に用いることが可能なため、生検針を用いて採取することが好ましい。
　腫瘍部から採取された「検体」は、例えば病理診断において、免疫染色法により目的とするタンパク質の発現量を評価する際などに従来慣用されているような、所定の手順に従って作製された標本スライドの形態が好ましい。本発明の一実施形態に係る方法は、そのような検体を用いて、実験動物の生体外において実施される。
　腫瘍部またはそこから採取された検体に含まれる「ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質」は、典型的には、「実験動物由来の間質」または「ヒト由来の腫瘍組織の間質」である。実験動物由来の間質は、実験動物の生体内の腫瘍部に混入した実験動物由来の組織である。一方、ヒト由来の腫瘍組織の間質は、ヒトに由来する腫瘍組織または腫瘍細胞が移植されたマウスにおいて、第０世代の実験動物に移植した、ヒト（患者）から採取した腫瘍組織に含まれていた間質または該間質に由来する組織である。腫瘍組織ないし検体中に占める実験動物由来の間質の割合が大きいほど、相対的にヒト由来の腫瘍組織の間質の割合は小さくなる。
　「間質」は主に、線維芽細胞、内皮細胞、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）などの間質細胞と、コラーゲン、プロテオグリカンなどのタンパク質からなる細胞外マトリックスとによって構成される。本発明の一実施形態では、そのような間質細胞および細胞外マトリックスのどちらの量を測定してもよいが、実験動物が担持するヒト由来の腫瘍組織の形質に対する影響がより大きいと考えられる、間質細胞の量を測定することが好ましい。また、線維芽細胞は代表的な間質細胞であり、その量を測定することが好ましい。
　ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質として間質細胞を選択する場合、その量を測定する方法は特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を利用することができる。例えば、間質細胞マーカー、つまり間質細胞をその他の細胞から区別することのできる、間質細胞の表面（細胞膜）に発現しているマーカータンパク質を利用し、そのマーカータンパク質に対応する抗体を用いた免疫染色法により間質細胞の量を測定することが好ましい。また、間質細胞をその他の細胞、少なくともヒト由来の腫瘍細胞から区別することができるのであれば、マーカータンパク質以外のタンパク質や、マーカータンパク質またはその他のタンパク質に関係する核酸（ｍＲＮＡ等）、タンパク質を修飾する糖などを利用して、間質細胞を染色し、その量を測定してもよい。
　本発明の一実施形態において、上述したような間質細胞マーカー等は、それ自体を「ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質」に位置づけることも可能である。間質細胞マーカー等は、間質細胞の量を反映する物質であり、間質細胞の量が多ければ間質細胞マーカーの量もそれにほぼ比例して多くなるため、間質細胞マーカー等の量を、間質細胞の量の代替とみなして測定してもよい。
　間質細胞マーカーとしては、例えば以下に示すような膜タンパク質の中から適切なものを選択して利用することができる。一例を挙げれば、ＣＤ１４０ａは、線維芽細胞、巨核球、単球、赤血球、骨髄系前駆細胞、内皮細胞などの細胞表面に発現する膜タンパク質であり、本発明の一実施形態における間質細胞マーカーとして好ましい。
CD106（VCAM-1, INCAM-110; CD49d/CD29-L）…活性化血管内皮細胞、樹状細胞（DC）
CD109（Platelet activation factor, 8A3, E123）…活性化Ｔ細胞、血小板、血管内皮、巨核球、CD34+前駆細胞サブセット
CD140a（PDGF-R, PDGFR2）…繊維芽細胞、巨核球、単球、赤血球、骨髄系前駆細胞、内皮細胞
CD140b（PDGF-R, PDGFR1）…内皮細胞、ストローマ細胞
CD141（Thrombomodulin）…血管内皮、骨髄系細胞、血小板、平滑筋
CD142（Tissue Factor(TF), Thromboplastin）…上皮細胞、活性化単球、活性化血管内皮
CD143（ACE; アンジオテンシン転換酵素）…血管内皮、上皮細胞、活性化マクロファージ
CD144（VE-Cadherin, Cadherin-5：血管内皮の透過性に関与）…血管内皮
CD145（7E9, P7A5）…内皮細胞
CD146（MUC18, s-endo, Mel-CAM）…血管内皮、活性化T細胞、黒色腫
CD147（Basigin, M6, EMMRRIN）…白血球、赤血球、血管内皮、血小板
CD201（EPCR：プロテインCレセプター）…血管内皮
CD202（TIE2, TEK; Angiopoietin-1-R）…血管内皮、造血幹細胞サブセット
CD280（Endo180,TEM22,uPARAP(uPAR-associated protein);骨髄前駆細胞,繊維芽細胞,内皮細胞サブセット,マクロファージサブセット
CD299（DC-SIGN-related, L-SIGN(Liver/Lympho node specific ICAM3-grabbing nonintegrin)）…内皮細胞
CD309（VEGFR2: Vascular endothelial growth factor receptor2, KDR）…内皮細胞、巨核球、血小板、幹細胞サブセット
CD322（JAM2: Junctional adhesion molecule 2）…内皮細胞、単球、B細胞、T細胞サブセット
CD331（FGFR1: Fibroblast growth factor receptor1）…繊維芽細胞、上皮細胞
CD332（FGFR2, Keratinocyte growth factor receptor）…上皮細胞
CD333（FGFR3, JTK4; Achondroplasia, Thanatophoric dwarfism）…繊維芽細胞、上皮細胞
CD334（FGFR4, JTK2, TKF）…繊維芽細胞、上皮細胞
CD339（Jagged-1, JAG1; Alagille syndrome）…ストローマ細胞、上皮細胞。
　検体中の、ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質の量は一般的に、標本スライドの暗視野または明視野における観察および撮像により測定し、通常は、一つの視野に含まれる量、または複数の視野に含まれる量の平均値として求められる。
　本発明の一実施形態に係る方法では、第１目的物質（および第２目的物質）の量を測定するほかに、必要に応じて、同じ標本スライドを用いて、第１目的物質（および第２目的物質）を有する細胞の種類、数、形態、発現部位（腫瘍組織中または検体中の分布、専有面積）等のさらなる情報を得るようにしてもよい。
　また、第１目的物質および／または第２目的物質の量の測定結果と、上記のようなさらなる情報と組み合わせることで、１つまたは２つ以上の新たな情報を導き出し、それを所望の用途に利用することも可能である。そのような新たな情報としては、例えば、検体（標本スライド）における、（ｉ）第１目的物質および／または第２目的物質の細胞１個あたりの量（平均の量）、（ｉｉ）第１目的物質および／または第２目的物質の組織の単位面積あたりの量、（ｉｉｉ）第１目的物質および／または第２目的物質の細胞１個あたりの量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラム、（ｉｖ）第１目的物質および／または第２目的物質の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表される曲線、などに関する情報が挙げられる。以下、各情報の求め方について、第１目的物質または第２目的物質としてタンパク質を選択し（以下「目的タンパク質」と呼ぶ。）、蛍光ナノ粒子を用いた免疫染色法によりその発現量を測定する実施形態に沿って記載する。
　（ｉ）目的タンパク質の細胞１個あたりの平均発現量を定量する場合、例えば、検体（標本スライド）を蛍光ナノ粒子により免疫染色すると共に、形態観察用染色剤（例えばエオジン）によって細胞の形状が特定できるように染色する。蛍光ナノ粒子に対応する所定の波長を有する励起光を照射しながら行われる、暗視野における観察および撮像により、目的タンパク質を標識した蛍光ナノ粒子が輝点として表れている画像を取得する。一方で、明視野における観察および撮像により、細胞の形状を表すように染色されている画像を取得する。これらの２枚の画像を、画像処理により重ねあわせると、画像全体、または画像中の特定の領域（例えば腫瘍組織のみ）に含まれる、個々の細胞について、発現している目的タンパク質を表す輝点数を計測することができる。計測した輝点数を目的タンパク質の発現量の指標値としてもよい。また、複数の蛍光ナノ粒子が１つの輝点を形成している場合もあるので、ある１つの輝点の明るさ（輝度、蛍光強度）を、別途測定しておいた蛍光ナノ粒子１つあたりの明るさで割ることにより、その輝点に含まれる蛍光ナノ粒子の数を算出することができ、その粒子数を目的タンパク質の発現量の指標値として用いてもよい。画像に含まれる全ての細胞について輝点数または粒子数を求めることにより、細胞当たりの平均発現量を定量することが可能である。
　（ｉｉ）目的タンパク質の組織の単位面積あたりの発現量を定量する場合、（ｉ）と同様にして画像中の特定の領域にある組織における輝点数または粒子数の総和を求めた後、その組織の面積で割るようにすればよい。
　（ｉｉｉ）目的タンパク質の細胞１個あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラムを作成する場合、まず、（ｉ）と同様にして、画像全体、または画像中の特定の領域（例えば腫瘍組織のみ）に含まれる、個々の細胞について、発現している目的タンパク質を表す輝点数または粒子数を計測する。そして、横軸に細胞あたりの目的タンパク質の発現量を所定の数ごとに区切ってとり、それぞれの区切りに対応する細胞数（頻度）を計測して縦軸にとることにより、ヒストグラムを作成することができる。
　（ｉｖ）目的タンパク質の細胞１個あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表される曲線を作成する場合、まず、（ｉ）と同様にして、画像全体、または画像中の特定の領域（例えば腫瘍組織のみ）に含まれる、個々の細胞について、発現している目的タンパク質を表す輝点数または粒子数を計測する。そして、細胞あたりの目的タンパク質の発現量を連続的に（ヒストグラムのように区切らずに）横軸にとり、それぞれの発現量に対応する細胞数（頻度）を計測して縦軸にとることにより、曲線を作成することができる。
　上記（ｉｉｉ）のヒストグラムおよび（ｉｖ）の曲線からは、分布（ヒストグラムまたは曲線の形状、ピークの数）がどのようになっているか、平均値または中央値、分散（ＣＶ）がどのような値か、また特にヒストグラムの場合、細胞１個あたりの輝点数または粒子数について最大の区切りがどの程度の細胞数（頻度）になっているか、などの情報を得ることができる。
　ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質（第１目的物質）の量の測定方法は、所望の精度で第１目的物質の量を測定することができる限り、特に限定されるものではない。例えば、第１目的物質として間質細胞を選択する場合、前述したように間質細胞マーカーを利用した免疫染色法によりその量を測定することができる。本発明の一実施形態における好ましい実施形態として、下記の２つの代表的な測定方法を用いる実施形態が挙げられる。
　測定方法の第１の実施形態（第１測定方法）は、蛍光ナノ粒子、すなわち、量子ドット（集積化していないもの）、または蛍光色素や量子ドットなどの蛍光体を樹脂等を母体として集積させた蛍光体集積粒子（Phosphor Integrated Dot：ＰＩＤ）のように、直径がナノサイズの粒子を用いて、第１目的物質（例えば間質細胞の数またはそれとほぼ比例する間質細胞マーカーの数）を標識し、定量する手法である。中でも、後述する実施例において開示されているような、ＰＩＤを用いる測定方法（本明細書において「ＰＩＤ法」と称する。）は、第１目的物質の検出感度に優れ、正確な定量が行えるため特に好ましい。例えば、間質細胞ないしその細胞膜に発現している間質細胞マーカーを第１目的物質とする場合、それらの第１目的物質の量と、蛍光ナノ粒子、好ましくはＰＩＤによって生じる輝点数、ないし第１目的物質に結合する粒子数（１つの輝点の輝度を１粒子あたりの輝度で割ることにより、その輝点に含まれる粒子数を算出することができる）との間には正の相関関係が成り立ち、第１目的物質の量が多いほど当該輝点数ないし粒子数は多くなる傾向にある。
　ＰＩＤ法を用いてタンパク質を定量するための基本的な実施形態は、国際公開第２０１２／０２９７５２号、国際公開第２０１３／０３５７０３号、またはその他の特許文献または非特許文献により公知である。本発明の一実施形態でも、例えば標本スライドを用いて病理診断を行う場合に準じた実施形態で、ＰＩＤ法を実施することができる。
　測定方法の第２の実施形態（第２測定方法）は、従来のＩＨＣ（Immunohistochemistry：免疫組織化学）法において慣用されている、酵素と基質の反応を利用する染色法である。中でも、ペルオキシダーゼとジアミノベンジジン（ＤＡＢ）との反応を利用するＤＡＢ染色法は、染色性に優れるため特に好ましい。ＤＡＢ染色法を用いる場合、第１目的物質を酵素（ペルオキシダーゼ）で標識した後、基質であるジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を反応させて色素を生じさせることにより、第１目的物質の周辺は褐色に染色される。例えば、間質細胞ないしその細胞膜に発現している間質細胞マーカーを第１目的物質とする場合、それらの第１目的物質の量と、ＤＡＢから生成した色素の量、すなわち褐色に染色された細胞数、ないし褐色に染色された領域が標本スライドの視野を占める面積比、あるいは褐色の濃さとの間には正の相関関係が成り立ち、第１目的物質の量が多いほど当該細胞数ないし面積比が高くなり、あるいは褐色は濃くなる傾向にある。
　第１測定方法および第２測定方法によって得られる指標値、すなわち第１測定方法であれば蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）の粒子数など、第２測定方法であれば酵素反応により生成した色素で染色された領域が標本スライドの視野に占める面積比などは、ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質の量を反映したものとなっている。また、そのような指標値は、数個（例えば２～５個）の数値範囲を設定して層別化（スコア化）するように、すなわち指標値が所定の範囲内にある検体同士をグループ化するようにして取り扱ってもよい。
　また、第１目的物質の量は、蛍光ナノ粒子、好ましくはＰＩＤのような蛍光標識体を用いる前記第１測定方法によって測定してもよいし、ＤＡＢ染色のような酵素と基質の反応を利用する前記第２測定方法によって測定してもよいが、より定量性に優れ、精度の高い薬効の評価を行うことのできる前者によって測定することが好ましい。
　本発明の一実施形態に係る方法は、好ましい実施形態においてはさらに、薬効評価の対象となるヒト由来の腫瘍細胞が有する物質の量を測定する工程を含む。
　「薬効評価の対象となるヒト由来の腫瘍細胞が有する物質」、すなわち本発明の一実施形態における第２目的物質は特に限定されるものではなく、公知の様々な物質の中から選択することができる。測定の対象とする第２目的物質は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
　第２目的物質としては、例えば、分子標的薬のターゲットとなる、腫瘍細胞に発現するタンパク質、具体的には、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦＲ、ＰＤ－Ｌ１、Ｂｃｒ－Ａｂｒ、Ｋｉｔ、ＡＬＫ、ＪＡＫ、Ｂｔｋ、ＰＩ３Ｋ、ＢＲＡＦ、ｍＴＯＲ、ＣＤＫ４／６などが挙げられる。
　また、第２目的物質としては、上記のような腫瘍細胞の膜タンパク質に関係する核酸、例えば当該膜タンパク質のｍＲＮＡや、ＨＥＲ２遺伝子のように腫瘍細胞において増幅することのある遺伝子、および腫瘍細胞の膜タンパク質を修飾する糖（糖鎖）、例えば腫瘍化することにより正常細胞とは異なるものとなる糖（糖鎖）も挙げられる。
　第２目的物質は、前述した第１目的物質と同様の方法により、その量を測定することができる。例えば、第２目的物質としてタンパク質を選択する場合は、第１目的物質としてタンパク質を選択した場合と同様、そのタンパク質に対応する（特異的に結合する）抗体を用いた免疫染色法により量を測定することが好ましい。一方、第２目的物質として核酸または糖を選択する場合も、その核酸に対応する（相補的な塩基配列を有する）核酸プローブや、その糖を認識して結合するレクチンを用いて量を測定することが好ましい。
　また、第２目的物質の量は、蛍光ナノ粒子、好ましくはＰＩＤのような蛍光標識体を用いる前記第１測定方法によって測定してもよいし、ＤＡＢ染色のような酵素と基質の反応を利用する前記第２測定方法によって測定してもよいが、より定量性に優れ、精度の高い薬効の評価を行うことのできる前者によって測定することが好ましい。
　なお、ＤＡＢ染色法は、乳癌細胞等の細胞膜におけるＨＥＲ２タンパク質の発現量を評価し、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ）を用いた治療の有効性を判定するための、標準化された検査方法において用いられている手法である（「ＨＥＲ２検査ガイド第三版」，トラスツズマブ病理部会作成，２００９年９月参照）。この検査方法では、乳癌細胞の細胞膜の染色性およびその染色強度（染色パターン）に基づいて、３＋（強く完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞＞３０％である場合：陽性）、２＋（弱～中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％、または強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞≧１０％～≦３０％である場合：equivocal）、１＋（ほとんど識別できないほどかすかな細胞膜の染色がある癌細胞≧１０％で、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている場合：陰性）および０（細胞膜に陽性染色がない、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞＞１０％である場合（細胞膜に限局する陽性染色は判定対象外）：陰性）の４段階のスコアでＨＥＲ２タンパク質の発現量を評価する。このようなＨＥＲ２の発現量の評価方法は、やや定量性が低いかもしれないが、本発明における第２目的物質の量の測定方法の一実施形態として、本発明において利用することができる。
　本発明の一実施形態に係る方法の用途、より具体的には本発明の一実施形態に係る方法により測定される、ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質の量ないしその量を反映した指標値の用途は、特に限定されるものではない。
　本発明の一実施形態に係る方法は、例えば次のようにして、実験動物の品質管理のために使用することができる。ある世代の実験動物の腫瘍部から腫瘍組織の切片を２つ作製し、そのうちの１つは検体として標本スライドを作製し、もう１つは別個体の免疫不全動物に移植して次世代の実験動物を作製する。上記標本スライドについて本発明一実施形態に係るの方法を用いて得られた第１目的物質の量の測定値（ないし階層化したときのスコア）と、上記次世代の実験動物に薬剤（抗癌剤）を投与したときの薬効に関する情報とを関連づけることができる。仮に、第１目的物質の量が異なる場合に、次世代の実験動物に対する薬効の異なる、例えば第１目的物質の量が少ないと薬効が大きく、第１目的物質の量が少ないと薬効が小さいといった傾向が見られるとすれば、その第１目的物質の量は実験動物の品質、すなわち薬剤の有効性に影響を与える可能性がある。その場合、製品化する実験動物は、腫瘍部における第１目的物質の量が、薬剤の有効性に影響を与えない所定の範囲に収まっている実験動物またはそれから継代された実験動物に限定することが考えられる。
　このような分析は、第１目的物質の量（検体中ないし顕微鏡観察時の視野中の全量）そのものではなく、前述したようなその他の情報と組み合わせることで導き出される新たな情報、例えば第１目的物質の細胞１個あたりの量に基づいて行うことも可能である。
　さらに、本発明の一実施形態に係る方法において必要に応じて測定される、薬効評価の対象となるヒト由来の腫瘍細胞が有する物質の量ないしその量を反映した指標値の用途も、特に限定されるものではない。
　例えば、上述したような第１目的物質の量と次世代の実験動物に対する薬効との関係とともに、第２目的物質の量と実験動物に対する薬効との関係も分析することにより、製品化する実験動物は、腫瘍部における第１目的物質および第２目的物質の量が、ともに薬剤の有効性に影響を与えない、それぞれ所定の範囲に収まっている実験動物またはそれから継代された実験動物に限定するといったように、より厳密な品質が行える可能性がある。
　以下、実施例に基づいて本発明の好適な態様をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
　［作製例１］テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製
　テキサスレッド（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１；シグマアルドリッチ社）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業株式会社）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の混合液にギ酸１００μＬを加え、混合液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、その混合液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の混合液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、混合液に含まれるテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄した。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒子径を測定したところ、平均粒子径１５２ｎｍであった。
　［作製例２］ストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製
　作製例１で得られた粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散させ、アミノプロピルトリメトキシシラン「ＬＳ－３１５０」（信越化学工業社）２μＬを加えて８時間反応させることで表面アミノ化処理を行なった。
　次いで、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて上記表面アミノ化処理を行なった粒子を３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社、succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-dodecaethyleneglycol]ester）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことでマレイミド修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を得た。
　一方、ストレプトアビジン（和光純薬社）について、N-succinimidyl　S-acetylthioacetate（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行なうことで、マレイミド修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。
　上記マレイミド修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子と上記処理によりチオール基を付加したストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。その後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた混合液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を作製した。
　［実施例１］
　以下の手順に従って、第１世代のＰＤＸマウスの腫瘍組織における第１目的物質（タンパク質）であるＣＤ１４０ａの発現量の測定と、第２世代のＰＤＸマウスにおける抗癌剤の薬効の判定を行った。実施例１の概念図を図１に示す。
　［実施例１－１］ＰＩＤを用いてＣＤ１４０ａの発現量を測定する実施形態
　ＤＡＢ染色によるＨＥＲ２検査で３＋と評価された乳癌患者から採取した同一の乳癌組織（約３ｍｍ角）を免疫不全マウスに移植したＰＤＸマウス（第０世代：Ｐ０）を１０個体購入した。このＰＤＸマウス（Ｐ０）を飼育していき、腫瘍を３日ないし４日おきに計測して腫瘍体積が５００ｍｍ3となったところでメスを用いて腫瘍組織を摘出した。腫瘍体積は、ノギスを用いて腫瘍部分の長径および短径を計測し、（長径）×（短径）×（短径）×０．５（ｍｍ3）の計算式から求めた。加熱滅菌処理したメス、カッターを用いて、摘出した腫瘍組織から約３ｍｍ角の切片を１０個作製した。
　ＰＤＸマウス（Ｐ０）１０個体から作製した各１０個の切片、計１００個の切片を別の免疫不全マウス（第１世代：Ｐ１）１００個体に継代し、ＰＤＸマウス（Ｐ１）とした。先程と同様にＰＤＸマウス（Ｐ１）を飼育していき、腫瘍を３日ないし４日おきに計測して腫瘍体積が５００ｍｍ3となったところでメスを用いて腫瘍組織を摘出した。加熱滅菌処理したメス、カッターを用いて、摘出した腫瘍組織から約３ｍｍ角の切片を２個作製した。
　２個の切片のうち１つは、繊維芽細胞や巨核球、単球、赤血球、骨髄系前駆細胞、内皮細胞の細胞表面に発現が見られるＣＤ１４０ａと呼ばれる抗原の発現量を測定するための、標本スライドの作製に使用した。残りの１つは後述する第２世代：Ｐ２への継代に使用した。
　＜ＣＤ１４０ａの発現量の測定＞
　（標本スライド作製工程）
　上記のように作製したＰＤＸマウス（Ｐ１）の腫瘍組織の約３ｍｍ角の切片２個のうちの１個を、１０％中性緩衝ホルマリン（武藤化学社）に２４時間浸漬し、ホルマリン固定処理を行った。その後、固定処理を行った腫瘍組織を１００％エタノール中で１晩、９９．５％エタノール中で３０分×５回、１００％エタノール中で３０分の順で処理することで脱水した。脱水後、キシレンに３０分×２回浸漬することで腫瘍組織中のエタノールをキシレンに置換した。該切片を６０℃に設定したパラフィン溶融器中で溶融したパラフィンに３０分、４回浸漬させることで、パラフィン包埋処理を行った。包埋処理を行ったパラフィンブロックをミクロトームにより薄切して標本スライドを作製した。
　（免疫染色工程）
　・賦活化処理
　標本スライドは脱パラフィン処理した後、組織中のキシレンを水に置換するための洗浄を行った。洗浄した標本スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の標本スライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した標本スライドに対してＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含有するＰＢＳを用いて、室温で１５分間ブロッキング処理を行った。
　・抗原抗体反応処理（ＣＤ１４０ａに係る免疫染色用の１次反応処理）
　ＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含有するＰＢＳを用いて、ビオチン修飾抗マウスＣＤ１４０ａラットモノクローナル抗体（クローン：ＡＰＡ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を５μｇ／ｍＬの濃度で含有する１次反応処理液を調製した。この１次反応処理液に賦活化処理工程を終えた標本スライドを浸漬し、４℃で１晩反応させた。
　・蛍光標識処理（２次反応処理）
　作製例２で作製したストレプトアビジン修飾テキサスレッド色素集積メラミン樹脂粒子を、カゼインおよびＢＳＡを含有する蛍光ナノ粒子用希釈液を用いて０．０２ｎＭに希釈した蛍光標識反応処理液を調製した。抗原抗体反応処理工程を終えた標本スライドをＰＢＳで５分間×３回洗浄後、この蛍光標識反応処理液に浸漬し、中性のｐＨ環境下（ｐＨ６．９～７.４）、室温にて３時間反応させた。
　（形態観察用染色工程）
　蛍光標識処理を行った標本スライドを、マイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った後、室温の流水で１０分間洗浄した。
　（脱水・透徹・封入工程）
　免疫染色工程および形態観察用染色工程を終えた標本スライドを、１００％エタノールに浸漬する操作を４回行う固定化・脱水処理を行った。続いて、その標本スライドをキシレンに浸漬する操作を４回行う透徹処理を行った。最後に、標本スライドに封入剤「エンテランニュー」（メルク社）を載せて、カバーガラスを被せる封入処理を行い、観察に用いる標本スライド（ＣＤ１４０ａ／ＰＩＤ染色標本スライド）とした。
　（ＰＩＤ染色標本スライド評価工程）
　・観察・撮影工程
　この工程における励起光の照射および蛍光の発光の観察には蛍光顕微鏡「ＢＸ－５３」（オリンパス株式会社）を用い、免疫染色像（４００倍）の撮影には、当該蛍光顕微鏡に取り付けた顕微鏡用デジタルカメラ「ＤＰ７３」（オリンパス株式会社）を用いた。
　まず、第１目的タンパク質であるＣＤ１４０ａの蛍光標識に用いたテキサスレッドに対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の免疫染色像を撮影した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて５７５～６００ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６１２～６９２ｎｍに設定した。蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度は、視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像撮影時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないような範囲で調節し、例えば８０００μ秒に設定した。
　次に、蛍光顕微鏡の明視野における観察および画像撮影により、細胞の形態観察用のヘマトキシリン染色による染色像を撮影した。このような免疫染色像および形態観察用染色像の撮影は、同一視野において行った後、視野を変えて同じ操作を繰り返し、１つの標本スライドにつき５視野ずつ行った。
　・画像処理・計測工程
　この工程における画像処理には、画像処理ソフトウェア「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）を用いた。視野（画面）上の輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測し、その輝点の輝度を蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）１粒子あたりの輝度で除して粒子数に換算し、これをその視野におけるＣＤ１４０ａの発現量として取り扱った。５視野におけるＣＤ１４０ａの発現量（粒子数）を測定し、その平均値を算出して、その標本スライドの「ＰＩＤスコア」とした。
　＜抗癌剤の薬効の判定＞
　前述したように作製した第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）の腫瘍組織の約３ｍｍ角の切片２個のうち、標本スライドの作製に使用しなかった切片を別の免疫不全マウス（第２世代：Ｐ２）１００個体に継代し、第２世代ＰＤＸマウス（Ｐ２）とした。継代時の腫瘍体積を計測したこれらのマウスに対して、抗癌剤トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン）１５ｍｇ／ｋｇを腫瘍移植後３日後、４日後、５日後に各１回静脈内投与し、投与から３週間後の腫瘍体積を計測し、薬剤投与時の腫瘍体積を１００としたときの相対値を算出した。この相対値が小さいほど、腫瘍体積が減少している、または腫瘍体積の増加が抑制されていることを意味し、薬効が表れていると評価することができる。
　上記のＰＩＤ染色標本スライド評価工程により、１００個体分の標本スライドについて、第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）におけるＣＤ１４０ａのＰＩＤスコアを算出し、ＰＩＤスコアが０以上５００００以下（Ｐ１－１）、５００００より大きく１０００００以下（Ｐ１－２）、１０００００より大きく１５００００以下（Ｐ１－３）、および１５００００より大きい（Ｐ１－４）の４つの群に分けた。また、Ｐ１－１、Ｐ１－２、Ｐ１－３およびＰ１－４のどの群に属する第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）から継代されたかによって、第２世代ＰＤＸマウス（Ｐ２）をそれぞれＰ２－１、Ｐ２－２、Ｐ２－３およびＰ２－４の４つの群に分けた（ひもづけ）。Ｐ２－１、Ｐ２－２、Ｐ２－３およびＰ２－４の各群について、上述した薬剤投与３週間後の腫瘍体積の相対値の平均値を算出した。そして、この平均値が２００以下の場合の薬効を優（◎）、２００より大きく４００以下の場合を良（○）、４００より大きく６００以下の場合を可（△）、６００より大きい場合を不可（×）と評価した。第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）の各群のＰＩＤを用いて測定したＣＤ１４０ａ発現量と、それぞれに対応する第２世代ＰＤＸマウス（Ｐ２）の各群の腫瘍体積の相対値および薬効の判定結果を表１に示す（後記＜分析＞参照）。
　［実施例１－２］ＤＡＢを用いてＣＤ１４０ａの発現量を測定する実施形態
　実施例１－１と同様にして、１００個体の第１世代のＰＤＸマウス（Ｐ１）への継代および各マウスの腫瘍組織の２個の切片の作製を行った。２個の切片のうちの１個を用いて、下記のように実施例１－１の手順を変更して、ＣＤ１４０ａ／ＤＡＢ染色標本スライドを作製し、ＣＤ１４０ａの発現量を測定した。また、前記２個の切片のうちのもう１個を用いて、実施例１－１と同様にして、１００個体の第２世代のＰＤＸマウス（Ｐ２）への継代を行ない、さらに抗癌剤の薬効の判定を行った。
　ＤＡＢ染色標本スライドの作製にあたって、標本スライド作製工程、ならびに免疫染色工程に含まれる賦活化処理および抗原抗体反応処理は実施例１－１と同様にして行い、蛍光標識処理は下記のＤＡＢ染色処理に置き換え、形態観察用染色工程は行わず、ＤＡＢ染色処理後に脱水・透徹・封入工程を実施例１－１と同様にして行った。
　（ＤＡＢ染色処理）
　ＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含有するＰＢＳを用いてストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ－ＨＲＰ、サーモフィッシャー社）を０．１μｇ／ｍＬの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液に抗原抗体反応処理を経た標本スライドを浸漬し、室温にて１時間反応させた。続いて、標本スライドをＰＢＳにて５分間×３回洗浄後、３、３’－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）溶液（タカラバイオ社）を用いて室温にて１０分間反応させた。反応を終えた標本スライドを室温の流水で１０分間洗浄した。
　（ＤＡＢ染色標本スライド評価工程）
　・観察・撮影工程
　Ａｐｅｒｉｏ　ＳｃａｎＳｃｏｐｅ　ＣＳ２（ライカ社）を用いて、ＤＡＢ染色した標本スライドに含まれる、ＤＡＢによって染色された領域の面積を求めた。具体的な方法としては、Ａｐｅｒｉｏ　ＳｃａｎＳｃｏｐｅ　Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアを立ち上げ、標本スライドをセット後、サンプル全体を低解像度で撮影するプレスキャンを行った。プレスキャン終了後、スキャンエリア、フォーカスポイント、ホワイトバランスの設定を行い、画像の取り込みを実行した。画像の取り込み後、Ａｐｅｒｉｏに付属のＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを立ち上げ、Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓから解析する領域を選択し、ＡｎａｌｙｓｉｓのＡｌｇｏｒｉｔｈｍｓからＰｏｓｉｔｉｖｅ　Ｐｉｘｅｌ　Ｃｏｕｎｔ　（ｖ９）を選択してＤＡＢによる染色の解析を行った。５視野におけるＣＤ１４０ａのＰｏｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＤＡＢで染色されたピクセル数／視野全体のピクセル数×１００）を測定し、その平均値を算出して、その標本スライドの「ＤＡＢスコア」とした。
　＜抗癌剤の薬効の判定＞
　実施例１－１と同様にして、第２世代のＰＤＸマウス（Ｐ２）を作製し、抗癌剤トラスツズマブを投与して、投与前後の腫瘍体積を比較し、薬剤投与３週間後の腫瘍体積の相対値を算出した。上記のＤＡＢ染色標本スライド評価工程により、１００個体分の標本スライドについて、第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）におけるＣＤ１４０ａのＤＡＢスコアを算出し、ＤＡＢスコアが０以上１０％以下（Ｐ１－５）、１０％より大きく２０％以下（Ｐ１－６）、２０％より大きく３０％以下（Ｐ１－７）、および３０％以上（Ｐ１－８）の４つの群に分けた。また、Ｐ１－５、Ｐ１－６、Ｐ１－７およびＰ１－８のどの群に属する第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）から継代されたかによって、第２世代ＰＤＸマウス（Ｐ２）をそれぞれＰ２－５、Ｐ２－６、Ｐ２－７およびＰ２－８の４つの群に分けた。Ｐ２－５、Ｐ２－６、Ｐ２－７およびＰ２－８の各群について、上述した薬剤投与３週間後の腫瘍体積の相対値の平均値を算出した。そして、この平均値が２００以下の場合の薬効を優（◎）、２００より大きく４００以下の場合を良（○）、４００より大きく６００以下の場合を可（△）、６００より大きい場合を不可（×）と評価した。第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）の各群のＤＡＢ染色により測定したＣＤ１４０ａ発現量と、それぞれに対応する第２世代ＰＤＸマウス（Ｐ２）の各群の腫瘍体積の相対値および薬効の判定結果を表２に示す。
　＜分析＞
　実施例１－１（表１）および実施例１－２（表２）の結果から、ＣＤ１４０ａのＰＩＤスコアまたはＤＡＢスコアが最も高値の群、すなわちマウス由来の間質細胞の割合が高い場合には、それらの群から継代されたマウスにおける薬効がその他の群と異なる傾向を示すことがわかった。従って、ＣＤ１４０ａの発現量を層別化することで、マウスにおける薬効をある程度予測することが可能となる。この場合、ＣＤ１４０ａのＰＩＤスコアまたはＤＡＢスコアが最も高値の群を薬効試験から予め除くことで、より再現性の高い実験が可能になること、また、動物愛護の観点からも、実験動物を無駄にしないというメリットが得られると考えられる。なお、この実施例では、ＣＤ１４０ａの発現量を層別化したマウスと、薬効の判定を行ったマウスは世代が１世代異なるため、本来はこの継代の間にも形質が変わるはずであるが、それにも関わらず、一定の薬効の予測に寄与出来る結果が得られたことから、本発明は世代が異なったとしても形質の変化を検出するのに有効な手段であると言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　［実施例２］
　実施例１－１および１－２で作製した第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）１００個体分の標本スライド（ＰＩＤ染色標本スライドまたはＤＡＢ染色標本スライドとは別の、新たな標本スライド）を用いて、第２目的物質（タンパク質）として乳癌細胞等の細胞膜に発現するＨＥＲ２の発現量の測定を行った。実施例２の概念図を図２に示す。
　［作製例３］ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の作製
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ溶液に、２次抗体として用いる抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを溶解した。この溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液を添加、混合し、３７℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を脱塩カラム「Zeba Desalt Spin Columns」（サーモサイエンティフィック社、Cat.#89882）に通して、ＤＴＴで還元化した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を調製した。その一方で、リンカー試薬「Maleimide-PEG2-Biotin」（サーモサイエンティフィック社、製品番号21901）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように濃度を調整した。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ウサギＩｇＧ抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。この反応溶液を脱塩カラムに通して精製した。脱塩した反応溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光光度計（Ｆ－７０００；日立ハイテクサイエンス社）を用いて測定することにより、反応溶液中のタンパク質（ビオチン修飾２次抗体）の濃度を算出した。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾２次抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した溶液を、ビオチン修飾２次抗体の溶液とした。
　［実施例２－１］ＤＡＢを用いてＨＥＲ２の発現量を測定する実施形態
　実施例１－１の標本スライド作製工程と同様の方法で作製した標本スライドを、ベンタナＩ－ＶＩＥＷパスウェーＨＥＲ２（４Ｂ５）キットを用い、ベンタナベンチマークＵＬＴＲＡで染色し、ＤＡＢ法によりＨＥＲ２のスコアを判定し、腫瘍領域と間質細胞領域を形態学的に同定した。ＨＥＲ２のスコアは標準的に使用されている基準に従った（例えば「ＨＥＲ２検査ガイド第三版」（トラスツズマブ病理部会作成、２００９年９月）参照）。
　［実施例２－２］ＰＩＤを用いてＨＥＲ２の発現量を測定する実施形態
　実施例１－１の標本スライド作製工程と同様の方法で作製した標本スライドについて、そこに含まれるＨＥＲ２を、ＰＩＤを用いた免疫染色法により染色した。免疫染色工程の具体的な手順は次の通りである。
　（免疫染色工程）
　・賦活化処理
　実施例１－１の標本スライド作製工程と同様の方法で作製した標本スライドを脱パラフィン処理した後、組織中のキシレンを水に置換するための洗浄を行った。洗浄した標本スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で１２１℃、１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の標本スライドをＰＢＳにより洗浄し、洗浄した標本スライドに対してＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて、室温で１時間ブロッキング処理を行った。
　・抗原抗体反応処理（ＨＥＲ２に係る免疫染色用の１次反応処理）
　ＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含有するＰＢＳを用いて、抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体「４Ｂ５」（ベンタナ社）を０．０５ｎＭの濃度で含有する１次反応処理液を調製した。この１次反応処理液に賦活化処理を終えた標本スライドを浸漬し、４℃で１晩反応させた。
　・２次抗体反応処理（２次反応処理）
　作製例３で作製したビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の溶液を、さらにＢＳＡを１（ｗ／ｖ）％含有するＰＢＳを用いて、６μｇ／ｍＬに希釈した２次反応処理液を調製した。１次反応処理を終えた標本スライドをＰＢＳで洗浄した後、この２次反応処理液に浸漬し、室温で３０分間反応させた。
　・蛍光標識処理（３次反応処理）
　作製例１で作製したストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を、カゼインおよびＢＳＡを含有する蛍光ナノ粒子用希釈液を用いて０．０２ｎＭに希釈した、蛍光標識反応処理液を調製した。２次反応処理を終えた標本スライドをこの蛍光標識反応処理液に浸漬し、中性のｐＨ環境下（ｐＨ６．９～７.４）、室温で３時間反応させた。
　（形態観察用染色工程）
　蛍光標識処理を行った標本スライドを、マイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った後、４５℃の流水で３分間洗浄した。
　（脱水・透徹・封入工程）
　免疫染色工程および形態観察用染色工程を終えた標本スライドを、１００％エタノールに浸漬する操作を４回行う固定化・脱水処理を行った。続いて、その標本スライドをキシレンに浸漬する操作を４回行う透徹処理を行った。最後に、標本スライドに封入剤「エンテランニュー」（メルク社製）を載せて、カバーガラスを被せる封入処理を行い、観察に用いる標本スライド（ＨＥＲ２／ＰＩＤ染色標本スライド）とした。
　（ＰＩＤ染色標本スライド評価工程）
　・観察・撮影工程
　この工程における励起光の照射および蛍光の発光の観察には蛍光顕微鏡「ＢＸ－５３」（オリンパス株式会社）を用い、免疫染色像（４００倍）の撮影には、当該蛍光顕微鏡に取り付けた顕微鏡用デジタルカメラ「ＤＰ７３」（オリンパス株式会社）を用いた。
　まず、第２目的タンパク質であるＨＥＲ２の蛍光標識に用いたテキサスレッドに対応する励起光を標本スライドに照射して蛍光を発光させ、その状態の免疫染色像を撮影した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて５７５～６００ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６１２～６９２ｎｍに設定した。蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度は、視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像撮影時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないような範囲で調節し、例えば４０００μ秒に設定した。
　次に、蛍光顕微鏡の明視野における観察および画像撮影により、細胞の形態観察用のヘマトキシリン染色による染色像を撮影した。このような免疫染色像および形態観察用染色像の撮影は、同一視野において行った後、視野を変えて同じ操作を繰り返し、１つの標本スライドにつき５視野ずつ行った。
　・画像処理・計測工程
　この工程における画像処理には、画像処理ソフトウェア「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）を用いた。形態観察用染色像を用いた画像処理により、細胞の形状（細胞膜の位置）を特定し、免疫染色像と重ねあわせて、細胞膜上に発現しているＨＥＲ２タンパク質を標識したテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を表す輝点を抽出した。なお、間質細胞領域にはＨＥＲ２は発現しないので、間質細胞内に位置する輝点は非特異的シグナルすなわちノイズとして処理した。細胞膜上の輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測し、その輝点の輝度を蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）１粒子あたりの輝度で除して粒子数に換算し、これをその細胞のＨＥＲ２の発現量として取り扱った。そして、１つの標本スライド（５視野）あたり１０００個の細胞についてＨＥＲ２の発現量（粒子数）を測定し、その平均値を算出して、その標本スライドの「ＰＩＤスコア」とした。
　＜分析＞
　実施例２－１では、実施例１－２において行った１００個体の第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）のＤＡＢスコアによる層別化に加えて、さらにＨＥＲ２のＤＡＢスコアが３＋かそうでないかによる層別化を行った。また、実施例１－２と同様にして、それらの個体から継代された第２世代ＰＤＸマウス（Ｐ２）の抗腫瘍試験の結果とのひもづけを行った。結果を表３に示す。
　一方、実施例２－２では、実施例１－２において行った１００個体の第１世代ＰＤＸマウス（Ｐ１）のＤＡＢスコアによる層別化に加えて、さらにＨＥＲ２のＰＩＤスコアが５００以上か５００未満かにより層別化を行った。結果を表４に示す。
　表３の結果から、例えば、Ｐ２－５－１、Ｐ２－６－１を選択するなど、ＣＤ１４０ａだけでなくＨＥＲ２を用いて層別化することで、トラスツズマブに対して薬効を示す形質を維持していると思われるＰＤＸマウスを選択することが出来ることが判る。さらに、表４の結果からは、Ｐ２－５－３、Ｐ２－５－４、Ｐ２－６－３、Ｐ２－７－３を選択することで薬効を示す形質を維持しているＰＤＸマウスを選択することが出来ることが判る。
　これはＨＥＲ２のＤＡＢスコアが同じ３＋と判定されるマウスであっても、ＰＩＤスコアを用いることで、よりＨＥＲ２を多く発現しているマウスをさらに層別することが可能になることから、より薬効を示す形質を維持していると思われるＰＤＸマウスを選択することができる可能性を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (7)

  1. 　ヒト由来の腫瘍組織または腫瘍細胞が移植された実験動物における、前記腫瘍組織または腫瘍細胞を含む部位から採取された検体中に含まれる、ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質の量を測定する工程を含む方法。
  2. 　前記ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質が実験動物由来の間質細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質がヒト由来の腫瘍組織の間質細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記間質細胞の量を、当該細胞の表面に発現しているマーカータンパク質に対応する抗体を用いた免疫染色法により測定する、請求項２または３に記載の方法。
  5. 　さらに、前記検体中に含まれるヒト由来の腫瘍細胞が有する物質の量を測定する工程を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記ヒト由来の腫瘍細胞が有する物質が、タンパク質、核酸または糖であり、当該タンパク質、核酸または糖に対応する抗体、核酸プローブまたはレクチンを用いた染色法により当該タンパク質、核酸または糖の量を測定する、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記ヒト由来の腫瘍細胞以外の物質および／または前記ヒト由来の腫瘍細胞が有する物質がタンパク質であり、その量を蛍光ナノ粒子を用いた定量法により測定する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018164262A1 (ja) * 2017-03-10 2018-09-13 コニカミノルタ株式会社 治療有効性の予測方法
JPWO2020122102A1 (ja) * 2018-12-14 2021-10-28 コニカミノルタ株式会社 病変組織内への薬剤到達を予測する方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007049620A1 (ja) * 2005-10-24 2007-05-03 Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬及び治療薬
JP2007526756A (ja) * 2003-08-01 2007-09-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
JP2008169132A (ja) * 2007-01-10 2008-07-24 Chiba Univ Ｌｉｎ７ｃの癌の転移診断への応用
WO2012029752A1 (ja) * 2010-08-31 2012-03-08 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法
WO2013035703A1 (ja) * 2011-09-09 2013-03-14 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013102118A2 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Anticancer, Inc. Imageable patient tumors in mice
US20140109246A1 (en) * 2012-09-24 2014-04-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods of generating xenochimaeric mice with tumor and hematopoietic system from the same heterologous species

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007526756A (ja) * 2003-08-01 2007-09-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
WO2007049620A1 (ja) * 2005-10-24 2007-05-03 Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬及び治療薬
JP2008169132A (ja) * 2007-01-10 2008-07-24 Chiba Univ Ｌｉｎ７ｃの癌の転移診断への応用
WO2012029752A1 (ja) * 2010-08-31 2012-03-08 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法
WO2013035703A1 (ja) * 2011-09-09 2013-03-14 コニカミノルタエムジー株式会社 生体物質検出方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3477304A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018164262A1 (ja) * 2017-03-10 2018-09-13 コニカミノルタ株式会社 治療有効性の予測方法
JPWO2020122102A1 (ja) * 2018-12-14 2021-10-28 コニカミノルタ株式会社 病変組織内への薬剤到達を予測する方法
EP3895733A4 (en) * 2018-12-14 2022-03-02 Konica Minolta, Inc. METHOD OF PREDICTING THE ARRIVAL OF A DRUG WITHIN DISEASED TISSUE
JP7396578B2 (ja) 2018-12-14 2023-12-12 コニカミノルタ株式会社 病変組織内への薬剤到達を予測する方法

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