WO2007049620A1 - 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬及び治療薬 - Google Patents

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WO2007049620A1
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Tsunehiko Nishimura
Akio Nagano
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Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a reagent for detecting various diseases involving the receptor for hepatocyte growth factor (HGF) (c Met) by imaging, and a therapeutic agent for these diseases.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • Hepatocyte growth factor is an approximately 85 kDa heterodimeric protein in which an ⁇ chain with a molecular weight of approximately 69 kDa and a 34 kDa ⁇ chain are linked by a single disulfide bond.
  • the a chain is composed of a hairpin loop structure (amino acid sequence Cys39—Cys65) and four consecutive kringle structures (amino acid sequence Cys97—Cys438). Further, it is known that a site containing an N-terminal hairpin loop structure binds to a henone (Non-patent Document 1).
  • the ⁇ chain has a structure similar to that of serine protease (amino acid sequence 495-728), and as a whole, there is no force protease activity showing about 40% homology with plasminogen. In humans, it is located in the chromosome 7q21 and was clawed by Miyazawa et al.
  • HGF was thought to be a growth factor that regulates the reorganization of liver tissue after hepatectomy (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • hepatocytes tissues
  • renal tubular epithelial cells Non-patent document 6
  • mammary epithelial cells Non-patent document 7
  • melanocytes non-patent document 8
  • epidermal cells non-patent document 9
  • vascular endothelial cells non-patent documents 10, 11
  • HGF is produced in nearby cells such as liver non-parenchymal cells, liver and lung endothelial cells, and certain fibroblasts, and has proliferative activity and morphogenesis on epithelial cells that express HGF receptors. It is known to have activity (Non-Patent Documents 13 to 19).
  • Non-patent Document 20 In the vascular system, it is a vascular endothelium-specific growth factor that does not affect the proliferation of vascular smooth muscle cells but proliferates only vascular endothelial cells (Non-patent Document 20), and has an angiogenic action.
  • tumor invasion and metastasis can be induced by a proliferative action, a cell motility enhancing action, a morphogenesis inducing action, and an angiogenesis action, and a combined action with stromal cells surrounding the cancer cell. It is known (Non-Patent Documents 21 and 22).
  • the growth of certain types of cancer cells may be suppressed and induce apoptosis (Non-patent Document 23).
  • c-Met an HGF receptor
  • c-Met was first identified as an oncogene in human osteosarcoma cell force transformed with a chemical carcinogen (Non-patent Documents 24 and 25).
  • c-Met is a 190 kDa heterodimer in which a 50 kDa a chain and a 145 kDa ⁇ chain are linked by a disulfide bond, and is a protein having a transmembrane tyrosine kinase (Non-patent Document 26).
  • c-Met activates tyrosine kinase activity present in the cytoplasmic region by binding to HGF.
  • the responding cells show various responses such as growth promotion, angiogenesis, migration promotion, and morphogenesis.
  • tissue repair is facilitated through these biological activities.
  • the activity that strongly promotes cell migration induces invasion and metastasis of cancer cells (Non-patent Documents 31 and 32).
  • HGF receptor (c Met) is expressed at high frequency in clinical practice.
  • Non-patent documents 33, 34 gastric cancer
  • colon cancer Non-patent documents 35, 36
  • oral squamous cell carcinoma Non-patent document 37
  • thyroid cancer Non-patent document 38
  • HGF receptor c Met
  • HGF heparan sulfate proteodaricans
  • Non-patent Document 27 the mutant lacking the N-terminal hairpin loop structure from the HGF molecule loses the hepatocyte proliferation-promoting activity that is the physiological activity of HGF, so the hairpin loop structure is an essential structure for physiological activity. This is reported (Non-patent Document 27).
  • Treatment of ischemic diseases such as ischemic heart disease and peripheral vascular disease at this stage includes various drug therapies including vasodilation, angioplasty using a catheter, and binosurgery performed surgically. is there. The effectiveness of these therapies has been well examined and treatment strategies are almost established.
  • Refractory ischemic disease groups such as
  • Regenerative medicine has attracted attention in recent years in response to such a current situation, and basic research and applied research have been attempted on a global scale.
  • Regenerative medicine includes vascular regeneration therapy that regenerates blood vessels in tissues, tissue regeneration therapy that regenerates tissues, etc., and by performing angiogenesis in them, blood flow to ischemic tissues is ensured.
  • Revascularization therapy aimed at reducing site damage and necrosis is attracting attention.
  • Ischemic cardiomyocytes and blood vessels of ischemic heart disease and blood vessels of peripheral vascular disease are compared to normal tissues.
  • endogenous HGF has been reduced, indicating that the amount of HGF is not sufficient to rescue damaged blood vessels (Non-patent Documents 45 and 46).
  • c-Met a specific receptor for HGF present in vascular endothelial cells (Non-patent Documents 47-53)
  • supplementation with HGF promotes angiogenesis.
  • Gene therapy using HGF protein, plasmids containing the HGF gene, and viral vectors has been developed.
  • Non-patent Document 44 In clinical research, gene therapy using plasmids containing the HGF gene is the most advanced, and it is administered to patients with obstructive arteriosclerosis and Buerger's disease at Osaka University, and its safety and efficacy are studied. It has been reported that a good level of improvement without any problems was confirmed (Non-patent Document 44).
  • Phase III clinical trials targeting patients with peripheral vascular disease are ongoing at multiple centers nationwide.
  • an ischemic site is determined by imaging blood vessels using a contrast medium for X-rays or MRI, and the surrounding muscles. A therapeutic agent is administered (Non-patent Document 64).
  • ischemic heart disease as a method for determining the ischemic site, an angiography using a X-ray or MRI imaging agent, a myocardial blood flow preparation using a radionuclide, an ultrasonic method
  • NOGA system measures the myocardial intima side potential and spatial position with a sensor at the end of the catheter and determines the ischemic site from the myocardial action potential and local wall motion.
  • ischemic sites can be confirmed by conventional methods such as angiography using contrast agents for X-rays and MRI, blood flow products using radionuclides, and NOGA system. However, it is not a method that directly images the administration site where c treatment is expected to have the most therapeutic effect.
  • Cancer is diagnosed by combining in vitro tests and diagnostic imaging methods.
  • diagnostic imaging methods include X-ray computed tomography (CT) and nuclear magnetic resonance.
  • CT computed tomography
  • MRI sound imaging diagnostics
  • ultrasound imaging ultrasound imaging
  • radionuclide scintigraphy When the contrast agent is administered to the patient, the images obtained by X-ray CT, MRI and ultrasound become clear. Administration of radiopharmaceuticals localized to the tumor is necessary for radionuclide scintigraphy.
  • HGF receptor is a target molecule that can be an important index for assessing malignancy, and by imaging the expression of HGF receptor in solid tumors, it is possible to determine not only the presence but also malignancy. It is desirable to develop diagnostic agents that can be used.
  • tumor dormancy therapy has been performed in which cancer cells are put into a dormant state using an angiogenesis inhibitor.
  • Angiogenesis inhibitors inhibit tumor angiogenesis, disrupt the supply of nutrients and oxygen necessary for cancer cell growth, induce cancer cell death, and put cancer cells into a dormant state .
  • Bevacizumab (trade name Avastin), a humanized monoclonal antibody preparation targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) as an angiogenesis inhibitor, has been approved in Europe and the US and is in clinical use (in clinical trials in Japan).
  • Angiogenesis inhibitors under development include angiostatin (Non-patent document 65), endostatin (Non-patent document 66), and NK4, an HGF antagonist targeting the HGF receptor (Patent document 2, non-patent document Patent Documents 67 to 70) are known.
  • this tumor dormancy therapy puts cancer cells in a dormant state and kills them completely. It is not a method to eliminate the cancer, so it is not a treatment aimed at the complete cure of cancer.
  • NK4 which is a therapeutic drug targeting the HGF receptor, is not intended to completely cure the cancer. Therefore, a therapeutic drug aimed at the complete cure targeting the highly malignant tumor that expresses the HGF receptor. Development is desired.
  • Non-patent Document 2 Research has been conducted on pharmaceuticals using the NK4 gene Z protein, which has an N-terminal hairpin domain of the at-chain of HGF and four kringle domains (Patent Document 2).
  • Patent Document 73 There are reports that investigated the pharmacokinetic parameters of HGF (Non-patent Document 73) and the affinity of HGF and dermatan sulfate (Non-patent Document 74) using HGF labeled with a radionuclide ( 125 1).
  • an anti-c-Met monoclonal antibody is labeled with a radionuclide ( 125 1), c-Met-expressing cancer cells are transplanted into mice, and the tumor is imaged (Non-patent Document 75).
  • Patent Document 1 WO94Z09969 pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-250549
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  • Non-patent document 43 Mizuno et al., J Biol Chem 269: 1131— 1136 (1994)
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  • the labeled body of HGF promotes the action of HGF, that is, the growth, invasion and metastasis of cancer.
  • the molecular weight is large, it is slowly removed from the blood, and as a result, a long blood background is generated in the image, so that there is a disadvantage that it takes a long time for the image.
  • the anti-cMet antibody label has a long blood background with a molecular weight larger than that of the HGF label, and thus has a problem of antigenicity, which requires a long time for imaging.
  • the present invention provides an administration site that is expected to have the most therapeutic effect in order to efficiently promote angiogenesis in the treatment with an ischemic disease HGF protein and a plasmid virus vector containing the HGF gene. That is, an object is to provide a diagnostic agent capable of imaging the expression site of HGF receptor. It is another object of the present invention to provide a diagnostic agent and a therapeutic agent for imaging a primary tumor or a metastatic tumor of a cancer that expresses the HGF receptor of the present invention. Furthermore, an object of the present invention is to provide an effective diagnostic agent and therapeutic agent for diseases caused by angiogenesis including cancer. A further object of the present invention is to provide a screening method for a therapeutic agent for a disease involving an HGF receptor. Means for solving the problem
  • a label of a polypeptide containing a heterogen binding region is specific for the HGF receptor. It accumulates specifically in HGF receptor-expressing sites of diseases caused by angiogenesis including ischemic diseases and malignant tumors, and the sites can be clearly imaged, and treatment of these diseases Found useful.
  • the present invention is a partial polypeptide of hepatocyte growth factor, in which a polypeptide containing a heparin binding region, or one or several amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide is substituted or missing.
  • the present invention provides a diagnostic agent for a disease involving a hepatocyte growth factor receptor, which contains a labeled product of a polypeptide having a heparin-binding activity and having a lost or added amino acid sequence.
  • the present invention also relates to a partial polypeptide of hepatocyte growth factor, a polypeptide comprising a heparin binding region, or one or several amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide.
  • Treatment of diseases related to hepatocyte growth factor receptor containing a polypeptide having substitution, deletion, or addition, and having a binding activity of a peptide, a labeled substance thereof, or a toxin conjugate thereof It is intended to provide medicine.
  • the present invention also relates to a partial polypeptide of hepatocyte growth factor, comprising a heparin-binding region, or one or several amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide substituted, deleted or deleted.
  • the present invention provides the use of a polypeptide label having an added amino acid sequence and having a binding activity to a diagnostic agent for a disease involving a hepatocyte growth factor receptor.
  • the present invention also relates to a partial polypeptide of hepatocyte growth factor, a polypeptide comprising a heparin binding region, or an amino acid in which one or several amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide are substituted, deleted or added
  • a polypeptide having a binding power and a binding activity of a polypeptide, a labeled product thereof, or a toxin conjugate thereof for the manufacture of a therapeutic agent for a disease involving a hepatocyte growth factor receptor. It is.
  • the present invention also relates to a partial polypeptide of hepatocyte growth factor, wherein the polypeptide includes a heparin binding region, or one or several amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide is substituted, deleted or deleted.
  • a method for diagnosing a disease associated with a hepatocyte growth factor receptor comprising administering a polypeptide label having an added amino acid sequence and having a binding activity to a polypeptide, and detecting the label Is to provide.
  • the present invention also relates to a partial polypeptide of hepatocyte growth factor, a polypeptide comprising a heparin binding region, or an amino acid in which one or several amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide are substituted, deleted or added
  • a therapeutic method for a disease involving a hepatocyte growth factor receptor characterized by administering a polypeptide having a binding power and a binding activity of a polypeptide, a label thereof, or a toxin conjugate thereof. Is.
  • the present invention also relates to a partial polypeptide of hepatocyte growth factor, a polypeptide comprising a heparin binding region, or an amino acid in which one or several amino acids of the amino acid sequence of the polypeptide are substituted, deleted or added
  • a hepatocyte growth factor receptor characterized by selecting a substance that inhibits the binding of a polypeptide having a binding power and a peptide having a binding activity to the liver or a label thereof and a hepatocyte growth factor receptor.
  • the present invention provides a leasing method and a medicine screened by the method.
  • the labeled polypeptide accumulates specifically on the HGF receptor, so that only the HGF receptor expression site can be specifically and clearly imaged, and the HGF receptor is involved. It is possible to image diseases caused by angiogenesis including ischemic diseases and malignant tumors. Treatment of these diseases is also possible.
  • FIG. 1 shows the results of confirming the expression of cMet in the tumor cells used in the experiment, performed using DL-21 (mouse monoclonal anti-cMet antibody).
  • C-Met (j8 chain) was detected at about 140 kDa (triangle mark) in the lane of HuCCT-1.
  • the reason that McA—RH 7777 was not detected is due to the specificity of the antibody (DL21 is specific to human-derived cMet).
  • FIG. 2 shows the result of confirming the expression of cMet in the tumor cells used in the experiment, performed using SP260 (rabbit polyclonal anti-c-Met antibody).
  • C-Met was detected at a position of about 140 kDa (triangle mark) in the lane of SP260.
  • 8 chains) is weakly detected because of the specificity of the antibody (SPF260 is highly specific for mouse and rat c-Met).
  • FIG. 3 shows c Met-specific immunohistochemical staining images with anti-c Met antibodies (SP-260 and DL-21) and counterstaining images with hematoxylin.
  • FIG. 4 shows the result of negative control in immunohistochemical staining and a counterstained image with hematoxylin.
  • FIG. 5 [I] HGF (11-83) shows an integrated image of NH (McA-RH7777).
  • FIG. 6 shows an HE-stained image (McA—RH7777). (The right is an enlarged image.)
  • FIG. 7 shows an immunohistochemically stained image (McA—RH7777) using an anti-c-Met antibody (SP-260) (the right is an enlarged image).
  • FIG. 8 shows the results of binding inhibition experiments with hrHGF.
  • FIG. 10 [ 125 I] HGF (11-83) — A cardiac imaging image using NH.
  • FIG. 11 shows an enlarged HE-stained image of the boxed portion in FIG.
  • FIG. 12 shows a SPECT image of a myocardial ischemia model rat using 99m Tc-MIBI.
  • FIG.13 SPECT image of myocardial ischemia model rat using [ 123 I] HGF (11- 83) —NH
  • FIG. 14 shows a SPECT image in which FIGS. 12 and 13 are superimposed.
  • the diagnostic and therapeutic agent of the present invention is a partial polypeptide of HGF, wherein one or several amino acids of the polypeptide containing the heparin binding region or the amino acid sequence of the polypeptide are substituted or deleted.
  • the polypeptide is characterized by containing a polypeptide having heparin-binding activity (hereinafter sometimes referred to as “HGF receptor-binding polypeptide”) or a label thereof, depending on the added amino acid sequence.
  • HGF receptor-binding polypeptide a polypeptide having heparin-binding activity
  • Cys39-Cys65 in the HGF amino acid sequence SEQ ID NO: 1
  • the polypeptide contains Cys39-Cys65.
  • the heparin-binding activity can be assayed by an experiment using a henoline column as described in Examples below. Since the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a mature HGF sequence in which the signal peptide portion is removed from the HGF precursor, Glnl of SEQ ID NO: 1 corresponds to Gln32 of the amino acid sequence containing the signal peptide portion.
  • the HGF receptor-binding polypeptide has an amino acid sequence ability in which one or several amino acids representing the HGF partial polypeptide are substituted, deleted or added.
  • a polypeptide having heparin binding activity (hereinafter referred to as a variant) May be included).
  • PCR polymerase chain reaction
  • modifications are based on polymerase chain reaction (PCR) -based techniques to introduce mutations in one or more amino acids, or to cleave protein coding sequences at predetermined amino acid residues.
  • PCR polymerase chain reaction
  • HGF receptor binding polypeptides further include HGF receptor binding polypeptides conjugated to other compounds such as polyethylene glycol (PEG) polymers.
  • PEG polyethylene glycol
  • Derivatives of the amino group on the surface of a polypeptide such as an HGF receptor-binding polypeptide with a compound containing PEG can extend the circulation life of such a polypeptide and sustain the HGF receptor binding effect.
  • the molecular weight of PEG used is not particularly limited, but is usually 300 to 30,000, preferably 1,000 to 15,000.
  • the method for modifying PEG may be any method known in the art (eg, Beauchamp et al., Anal Biochem 131: 25-33 (1983)).
  • modified HGF receptor binding polypeptides within the scope of the present invention can be “engineered” to include an amino acid sequence that allows the polypeptide to be captured on the affinity matrix.
  • tags such as cmyc, hemagglutinin, polyhistidine, Flag TM tag (Kodak) can be used to assist in polypeptide purification.
  • tags can be inserted at any site in the polypeptide including either the carboxyl terminus or the amino terminus.
  • HGF receptor binding polypeptides can also be generated as fusions with enzymes such as alkaline phosphatase that aid in polypeptide detection.
  • Preferable HGF receptor-binding polypeptide is Cys39-Cys65, a polypeptide having 4 to 40 amino acids on the N-terminal side and 4 to 110 amino acids on the C-terminal side, or a variant thereof Is mentioned. More preferred is a polypeptide having Cys39-Cys65 and having 4 to 40 amino acids on the N-terminal side and on the Z- or C-terminal side thereof or a variant thereof. Most preferably, it has Cys39-65Cys, on the N-terminal side and / or C-terminal side thereof A polypeptide having 4 to 30 amino acids, or a variant thereof.
  • polypeptides examples include Cys39—His83, His9—Glu80, Phel l—His83 (SEQ ID NO: 2), Glnl—His83, Phel l—Asn96, Glnl—Asn9 6, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Glnl—Cys 175 and the like.
  • polypeptide having the amino acid sequence ability shown in SEQ ID NO: 2 or a variant thereof is particularly preferred.
  • modified HGF receptor-binding polypeptides include those having amino acid substitutions, deletions, or additions as described above and having heparin-binding activity.
  • Such a variant usually has a homology with a partial polypeptide of HGF of 90% or more, preferably 95% or more.
  • the heparin binding activity is preferably 10% or more, more than 50%, more than 60%, more than 70%, particularly more than 80% of the heparin binding activity of the Cys39-65Cys polypeptide.
  • the label for the HGF receptor-binding polypeptide examples include any label that can be detected and is usually used for diagnostic purposes. That is, for diagnostic purposes, the HGF receptor binding polypeptide can be labeled with a detectable moiety. This detectable moiety can generate a detectable signal directly or indirectly.
  • the detectable moiety can be a radionuclide such as 3H, 14C, 32P, 35S, 1251; a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine, luciferin; or an enzyme such as alkaline phosphatase, j8 galactosidase, It ’s a horseradish peroxidase.
  • any method known in the art for attaching a polypeptide to a detectable moiety can be utilized. For example, Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain et al., J Imm unol Meth 40: 219 (1982); Nygren, Histochem and Cytochem 30:40 7 (1982) reference.
  • the HGF receptor binding polypeptide may also be conjugated with a detectable moiety useful for in vivo imaging to image the HGF receptor!
  • the HGF receptor-binding peptide is labeled with a detectable moiety such as a radionuclide, a radiopaque drug, a paramagnetic drug, or a surfactant, preferably in the bloodstream of a mammal. And the presence and position of the labeled HGF receptor-binding polypeptide are detected externally.
  • HGF receptor binding polypeptides can be used to identify any portion of a HGF receptor binding polypeptide that can be detected in mammals by nuclear magnetic resonance, radiochemistry, ultrasound, or other detection methods. May be used to label.
  • the polypeptide moiety that binds to the HGF receptor optionally a linking group, and a detectable partial force.
  • Detectable parts include radioactive diagnostic agents that emit gamma rays or positrons, nuclear magnetic resonance imaging contrast agents, X-ray contrast agents, or ultrasound contrast agents.
  • radionuclides such as 11C, 13N, 150, 18F, 34mCl, 38C1, 75Br, 76Br, in the amino acid residues and structures such as tyrosine residues and histidine residues at the polypeptide site, 77Br, 80mBr, 80Br, 82Br, 1211, 1231, 1241, 1261, 1311 etc.
  • Directly labeled radiodiagnostics or absorb X-rays, that is, one atom with atomic number 20 or more X-ray diagnostic agents as described above, or paramagnetic compounds, for example, contrast agents for nuclear magnetic resonance diagnosis containing -troxide.
  • contrast agents in which a bifunctional ligand, a carbo-louie compound or the like is introduced as a linking group into a polypeptide to form a metal complex.
  • polyamino polycarboxylic acid is preferable.
  • Polyaminocarboxylic acids include ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTP A), diethylenetriaminepentaacetic acid bismethylamide (DTPA-BMA), 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane 1, 4, , 7, 10-tetraacetic acid (DOTA) and their derivatives.
  • Examples of the bifunctional ligand other than polyaminopolycarboxylic acid are selected from the group consisting of 6-hydrazinonicotinamide (HYNIC) and derivatives thereof.
  • a metal complex of a polypeptide and a bifunctional ligand is a metal ion that exhibits paramagnetism due to an unpaired electron in the inner shell, for example, Co, Mn, Cu, Cr, Ni, V, Au, Fe And complexes useful for nuclear magnetic resonance diagnostics containing paramagnetic ions of metal elements selected from the group consisting of Eu, Gd, Dy, Tb, Ho and Er as metal components.
  • a metal complex of a polypeptide and a bifunctional ligand absorbs X-rays, that is, atomic number 20 or higher, for example, Re, Sm, Ho, Lu, Pm, Y, Bi, Pb, Os Gold, a metal element selected from the group consisting of Pd, Gd, La, Au, Yb, Dy, Cu, Rh, Ag, and Ir Also useful are complexes useful for X-ray diagnostics with metal ions as metal components.
  • the metal complex of the polypeptide and the bifunctional ligand is a radionuclide, for example,
  • Examples also include complexes useful for radiodiagnostic agents containing metal ions of radionuclides selected from the group consisting of 201T1, 211At and 212B.
  • the labeling site in the polypeptide of the present invention is preferably a portion other than Cys39-Cys65.
  • HGF receptor-binding polypeptides bound to radionuclides that emit j8 rays, alpha rays and Auger or Coster-Kronig electrons can be used as therapeutic agents targeting HGF receptors. .
  • radionuclides suitable for treatment include 47Sc, 67Cu, 89Sr, 90Y, 103Pd, 105Rh, 109Pd, ll lAg, 1251, 1311, 140La, 149Pm, 153Sm, 159Gd, 165 Dy, 166Dy, 166Ho, 169Yb, 175Yb, Select to form stable complexes with radionuclides having 177Lu, 186Re, 188Re, 192Ir, 198Au, 199Au, 211At, 212Bi, 212Pb, and 217Bi.
  • ultrasonic contrast agent examples include a surface active partial force bonded to a polypeptide moiety, and include an ultrafine bubble of a biocompatible gas, a liquid carrier, and a surfactant microsphere.
  • HGF receptor-binding polypeptide conjugated to a toxin can be used as a therapeutic agent for targeting the HGF receptor.
  • the HGF receptor binding polypeptide can be conjugated to any toxin polypeptide that mediates a cytotoxic effect in the cytoplasm of the cell by procedures well known in the art.
  • Preferred toxin polypeptides include ribosome-inactive proteins such as A chain toxins (eg, castor venom A chain), saporin, bryodin, gelonin, abrin.
  • Plant toxins such as pokeweed antiviral protein (PAP), fungal toxins such as ⁇ -sarrein, aspergillin, restrictocin, diphtheria toxin (DT), etc.
  • Other useful toxin polypeptides are apoptosis-promoting polypeptides such as Fas ligand, TRAIL, TNF-a, TNF- ⁇ , Apo-3 ligand, Bax, Bad, Bak, Bim, Bik, Bok, Hrk.
  • multiple functional fragments (eg 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15, or 20) of one or more (eg 2, 3, 4 or 6) toxins can be combined with HGF receptor binding peptides. Can be combined. If repeats are included, they may be immediately adjacent to each other, separated by one or more target fragments, or separated by a binding peptide as described above.
  • the HGF receptor-binding polypeptide used in the present invention can be obtained by, for example, degrading HGF protein with an enzyme or the like, or by using a tissue culture cell expressing a specific polypeptide of interest to perform affinity chromatography.
  • a substantially pure polypeptide can be obtained by polypeptide purification techniques such as HPLC and HPLC.
  • Polypeptide synthesis techniques can also be used to generate HGF receptor binding polypeptides.
  • Polypeptide synthesis techniques include solid-phase synthesis, liquid-phase synthesis, etc. ("5th edition Experimental Chemistry Course 16 Synthesis of Organic Compounds IV Carboxylic Acid 'Amino Acid'Peptide" edited by the Chemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin (200 5)) 0
  • HGF receptor binding polypeptides can also be produced by thread-replacement methods.
  • the cDNA sequence of human HGF is known (Miyazawa et al., Biochem Biophys Res Commun 163: 967-973 (1989); Nakamura et al., Nature 342: 440-443 (1989)).
  • Methods for expressing protein products from cDNA are well known. For example, Maniatis et al., 1989, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, New York State, 16. 1-17. See page 44.
  • Appropriate expression systems include microorganisms such as bacteria (eg, E. coli and B.
  • subtilis transformed with thread-replaceable butteriophage, plasmid DNA, cosmid DNA expression vectors; recombinant yeast expression vectors Yeast cells transformed with (eg, Saccharomyces or Pichia); insect cell systems infected with recombinant viral expression vectors (eg, baculovirus); recombinant viral expression vectors containing fusion protein nucleotide sequences (eg, Cauliflower mosaic virus (CaMV) or tobacco mosaic virus (TMV)) or fusion protein
  • plasmid vectors Obtained directly from mammals, transformed with plasmid vectors, or viral vectors (eg, herpes virus, herpes simplex virus, retrovirus, vaccinia virus, attenuated vaccinia virus, canarypox virus, among others) , Adenovirus, Adeno-associated virus, Lentivirus, Potass virus, Lentivirus (HIV), Sendai virus, Epstein Barr virus (EBV), Poliovirus, Synbis virus, Simian virus 40 (SV40)) Primary cells or secondary cells are also useful as host cells.
  • viral vectors eg, herpes virus, herpes simplex virus, retrovirus, vaccinia virus, attenuated vaccinia virus, canarypox virus, among others
  • Adenovirus eg, Adeno-associated virus, Lentivirus, Potass virus, Lentivirus (HIV), Sendai virus, Epstein Barr virus (EBV), Poliovirus, Synbis virus, Simi
  • the target diseases of the diagnostic and therapeutic agents of the present invention include diseases involving HGF receptors, such as ischemic diseases and malignant tumors.
  • ischemic diseases include the ischemic heart disease and peripheral vascular disease.
  • malignant tumors include ovarian cancer, spleen cancer, stomach cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, breast cancer, esophageal cancer, liver cancer, oral cancer, colon cancer, colon cancer, sarcoma, Darioma, melanoma, etc. It is done. Diagnose and treat diseases that express HGF receptors and are associated with angiogenesis, such as myocardial angiogenesis, diabetic retinopathy, diabetic angiogenesis, inappropriate wound healing, and inflammatory diseases. Can do.
  • the diagnostic and therapeutic agents of the present invention are optimally administered by intravenous injection, but other common means such as oral, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraarticular, intrasyural, etc. Can be administered.
  • the dosage of the diagnostic agent and therapeutic agent of the present invention is appropriately determined depending on the patient's weight, age, sex, and various conditions such as a measuring instrument represented by a SPECT apparatus.
  • a measuring instrument represented by a SPECT apparatus In general, in the case of diagnostic agents, l l lMBq to 222 MB q as radioactivity of 1231, and in the case of therapeutic agents, the radioactivity of 131I ranges from 37 MBq to 3700 MBq.
  • an imaging method using the diagnostic agent of the present invention for example, in the case of 1231, It is desirable to administer this drug intravenously within the above dose range, about 1 hour later, and then to perform planar and tomographic imaging (SPECT) using a gamma camera over the whole body or around the diseased site over time.
  • SPECT planar and tomographic imaging
  • the diagnostic and therapeutic agents of the present invention include a stabilizer such as propylene glycol; a pH adjuster such as an acid and a base; a buffer such as a phosphate buffer; Etc. isotonic agents, etc. can be added to make a preparation.
  • a stabilizer such as propylene glycol
  • a pH adjuster such as an acid and a base
  • a buffer such as a phosphate buffer
  • Etc. isotonic agents, etc. can be added to make a preparation.
  • the HGF receptor-binding polypeptide or a label thereof can be used for screening for preventive or therapeutic agents for diseases associated with HGF receptor. That is, if a substance that inhibits the binding of HGF receptor-binding polypeptide or a labeled substance thereof to HGF receptor is selected, the inhibitor is useful as a preventive or therapeutic drug for diseases involving HGF receptor. It is.
  • the method for selecting the binding inhibitor can be carried out by a normal binding inhibition test. For example, in the presence of the test substance, the HGF receptor-binding polypeptide label is reacted with the HGF receptor, and the amount of the HGF receptor-binding polypeptide label bound to or not bound to the HGF receptor is determined. Just measure.
  • binding inhibitors selected by force are useful as preventive or therapeutic agents for diseases involving HGF receptors.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 2 HGF (11 -83) -NH was synthesized.
  • Liquid B 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution
  • Z-acetonitrile 30Z70 mixed solution (0-50 min linear gradient, solution A: 100% ⁇ 0%) mobile phase separated and purified at a flow rate of 1. OmLZ min .
  • 100 L of 10% ushi serum albumin aqueous solution was added as a stabilizer.
  • the organic solvent is distilled off from the preparative solution at room temperature under reduced pressure, and an appropriate amount of 10% urine serum albumin aqueous solution and water are added so that the final composition is about 0.5 mCiZmL of 1% urine serum albumin aqueous solution.
  • the solution was filtered through a 0.20 m membrane filter to prepare a target solution.
  • Heparin binding activity measurement experiments, tumor cell transplantation model animal distribution experiments, and ischemic heart disease model animal distribution experiments were stored at 20 ° C for up to 8 weeks.
  • the free [ 12 3 ⁇ 4 radiochemical purity of the decomposition product was 10% or less.
  • hrHGF (Peptide Laboratories) having strong and binding activity was used.
  • Solution B 10 mM Na phosphate buffer (pH 7.5) + 2 M NaCl
  • the retention time of hrHGF was 23.4 minutes and was eluted with about 1.5M NaCl.
  • McA-RH7777 cells rat-derived liver cancer cells
  • HuCCT-1 cells human-derived cholangiocarcinoma cells
  • Homogenate from cultured HuCCT-1 and McA-RH7777 protein amount 1. Omg ZmL was prepared. These samples were separated by SDS-PAGE (7.5% gel) and transferred to a PVDF membrane.
  • the transfer membrane consists of DL21 (mouse monoclonal anti-c-Met antibody; upstate) as the primary antibody, SP260 (rabbit polyclonal anti-c Met antibody; Santa Cruz Biochemistry), and ECL Anti- mouse IgG (Amersham Bio) as the secondary antibody.
  • c-Met expression HuCCT1 cells human cholangiocarcinoma cells
  • NUNC LabTek chamber slides
  • the cultured cells were fixed with 10% formalin buffer, pretreated with 0.2% TritonX-100, and then negative for anti-c Met antibodies (SP-260, DL21) and SP-260 as primary antibodies.
  • SP-260, DL21 non-immune rabbit rabbit normal immunoglobulin fraction
  • DAKO non-immune rabbit rabbit normal immunoglobulin fraction
  • mouse IgGl DAKO
  • the sample treated with SP-260 and the non-immune normal rabbit immunoglobulin fraction was treated with Simple Stint Rat MAX-PO (R) (Nichirei), DL-21 and mouse IgGl.
  • the muscle ratio in the vicinity was 4.6 to 8.1 times. Furthermore, serial frozen sections were subjected to immunohistochemical staining using hematoxylin / eosin (HE) staining (Fig. 6) and anti-c-Met antibody (SP-260) (Fig. 7). C Met-specific staining was confirmed at the tumor site, which was consistent with the accumulated image of [ 12 3 ⁇ 4HGF (1 1 -83) -NH (73aa).
  • HE hematoxylin / eosin
  • SP-260 anti-c-Met antibody
  • the final concentration was 0.190 nM, and the ratio with hrHGF was 1: 2000.
  • the Eppendorf tube containing the cells was incubated at room temperature for 1 hour, centrifuged at 4 ° C (3000 rpm, 3 min) to precipitate the cells, and the supernatant was removed with an aspirator. Binding with ice-cold cells The washing operation of adding 500 / zL of buffer and stirring and then centrifuging (3000rpm, 3min) was repeated three times. The radioactivity of the Eppendorf tube containing the cells was measured with a gamma counter.
  • 9mTc-MIBI was administered 60MBq from the femoral vein. 99mTc-MIBI 15 minutes after administration of [ 125 l] HGF (ll -83) -NH (73aa) from the femoral vein 740 kBq, 15 minutes later
  • Wistar rats (8 weeks old) were anesthetized with isoflurane (Foren (R) Abbott), then the trachea was opened and a ventilator connected with an anesthesia machine was attached. The left chest was opened and an electrocardiogram was recorded with this state as the pre-coronary ligation state.
  • the coronary artery and surrounding tissues were ligated with sutures. When ligating, a nylon thread was sandwiched between the coronary artery and the suture to weaken the ligation strength so that the blood flow was not completely blocked. An ischemic state was confirmed and recorded by an increase in ST on the electrocardiogram. Thereafter, the chest was closed and the trachea and skin were sutured.
  • Pinhole-SPECT imaging was performed with a gamma camera (PRISM2000 Shimadzu Corporation) (imaging conditions Pinhole collimator, matrix size 256 X 256, Magi. 0, energy window 99 m Tc: 140keV 10%, 123 I: 159keV 10% 3 ° 60sec / step).
  • a gamma camera PRISM2000 Shimadzu Corporation
  • Pinhole collimator matrix size 256 X 256, Magi. 0, energy window 99 m Tc: 140keV 10%, 123 I: 159keV 10% 3 ° 60sec / step.
  • the heart was removed after imaging, and Pinhole-SPECT imaging was performed ex vivo (imaging conditions were the same).

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Abstract

　虚血性疾患のＨＧＦプラスミドによる治療において、効率よく血管新生を促進させるために、最も治療効果が期待できる投与部位すなわちＨＧＦ受容体の発現部位を画像化できる診断薬を提供する。 　肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、ヘパリン結合領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン結合活性を有するポリペプチドの標識体を含有する肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬。

Description

明 細 書
肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬及び治療薬
技術分野
[0001] 本発明は、肝細胞増殖因子 (HGF)の受容体 (c Met)が関与する種々の疾患を イメージングによって検出する試薬及びこれらの疾患の治療薬に関する。
背景技術
[0002] 肝細胞増殖因子（HGF)は、分子量約 69kDaの α鎖と 34kDaの β鎖が一本のジ スルフイド結合で結ばれた約 85kDaのへテロ二量体のタンパク質である。 a鎖には ヘアピンループ構造 (アミノ酸配列 Cys39— Cys65)と 4つの連続したクリングル構造 (アミノ酸配列 Cys97— Cys438)により構成されている。また、 N末端のヘアピンル ープ構造を含む部位がへノ^ンと結合することが知られて 、る (非特許文献 1)。 β鎖 にはセリンプロテアーゼに類似した構造 (アミノ酸配列 495— 728)があり、全体として 、プラスミノーゲンと約 40%の相同性を示す力 プロテアーゼ活性はない。ヒトでは染 色体 7q21に位置しており、 Miyazawaらによりクローユングされた（非特許文献 2、 3
) o
[0003] 当初、 HGFは、肝切除後の肝組織の再構成を調節する増殖因子と考えられたが（ 非特許文献 4、 5)、肝細胞 (組織)の他にも、腎臓細管上皮細胞 (非特許文献 6)や 乳腺の上皮細胞 (非特許文献 7)、メラニン細胞 (非特許文献 8)、表皮細胞 (非特許 文献 9)、血管内皮細胞 (非特許文献 10、 11)等、様々な上皮系細胞や内皮細胞、さ らに一部の間葉系細胞の増殖促進活性があることが明らかになった (非特許文献 12
) o
[0004] HGFは肝臓の非実質細胞、肝臓や肺の内皮細胞、ある種の線維芽細胞など近隣 の細胞で産生され、 HGF受容体を発現する上皮系細胞に対して増殖活性や形態形 成活性を有することが知られて 、る（非特許文献 13〜 19)。
[0005] 血管系においては、血管平滑筋細胞の増殖に影響を与えず、血管内皮細胞のみ を増殖させる血管内皮特異的な増殖因子であり（非特許文献 20)、血管新生作用を もつ。 [0006] 癌細胞においては、増殖作用、細胞運動性亢進作用、形態形成誘導作用、血管 新生作用により、癌細胞をとりまく間質細胞との総合作用により、腫瘍の浸潤、転移を 誘導することが知られている（非特許文献 21、 22)。また、ある種の癌細胞の増殖を 逆に抑制的に働きアポトーシスを誘導することもある（非特許文献 23)。
[0007] HGF受容体である c— Metは、最初に化学発癌物質により形質転換したヒト骨肉 腫細胞力も癌遺伝子として同定された (非特許文献 24、 25)。 c— Metは、 50kDaの a鎖と 145kDaの β鎖をジスルフイド結合で結合した 190kDaのへテロ二量体で、膜 貫通チロシンキナーゼをもつタンパク質である（非特許文献 26)。
[0008] c— Metは HGFの結合により細胞質領域に存在するチロシンキナーゼ活性が活性 化される。 c Metのチロシンがリン酸化されると、応答する細胞によって、増殖促進 、血管新生、遊走促進、形態形成といった様々な反応を示す。正常の組織では、こ れら生物活性を介して組織の修復が促される。また、腫瘍組織においてはとりわけ細 胞の遊走を強く促す活性が、癌細胞の浸潤、転移を誘発する（非特許文献 31、 32) 。さらに、臨床において HGF受容体 (c Met)が高頻度に発現している癌の報告が 知られている。中でも、胃癌 (非特許文献 33、 34)、大腸癌 (非特許文献 35、 36)、 口腔扁平上皮癌 (非特許文献 37)、甲状腺癌 (非特許文献 38)などで研究が進んで おり、報告も多い。これらの癌では、免疫組織染色の陽性率は 60〜100%とかなり高 い。さらに、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、子宮頸部癌などにおいても 比較的高い陽性率が報告されている。また、癌の進展とともに発現が増加する例や、 高発現の症例では予後が悪いことなどの現象が報告されており、 HGF受容体 (c Met)は悪性度を反映する指標となり得る。
[0009] HGFの c Metに対する結合活性は、 HGF分子の N末端のヘアピンループ構造 及びそれに続くクリングル構造であることが報告されて 、る（非特許文献 27〜30)。
[0010] c Metへの結合に加えて、 HGFは細胞表面又は細胞外マトリックスに存在するあ る種のへノリン及びへパラン硫酸プロテオダリカン (HSPG)と結合することが確認さ れて 、る（非特許文献 39、 40)。
[0011] HGF分子内のへノ^ン結合部位及び生理活性部位を探し当てることを試みるいく つかの実験が報告されている。 Mizunoらは様々な欠失変異体 HGFs (d— K1 (第一 のクリングルドメインの欠失）； d—K2 (第二のクリングルドメインの欠失）； d— K3 (第 三のクリングルドメインの欠失）； d—K4 (第四のクリングルドメインの欠失）； d— beta ( ベータ鎖の欠失）； d— H (N末端ヘアピンループの欠失）；そして HK1K2 (N末端へ ァピンループと第一及び第二のクリングルドメイン力 構成される） )を作製し、へパリ ンカラムに対する結合を調べた (非特許文献 43)。その結果、
Figure imgf000004_0001
はへパリンァフィユティーカラムへの結合能が低下した。一方天然の HGFとその他の HGF変異体（d— Kl、 d— K3、 d— K4、 d— beta、 HK1K2)はへパリンカラムに結 合することを報告している。さらに Aoyamaらは、より短い N末端側のヘアピンループ 構造 (アミノ酸配列 70— 96)を含む部位が、へノ^ンカラムに結合することを報告して いる (非特許文献 1)。
また、 Matsumotoらは、 HGF分子から N末端のヘアピンループ構造を欠失した変 異体は、 HGFの生理活性である肝細胞増殖促進活性を失うことから、ヘアピンルー プ構造は生理活性に必須の構造であることを報告して 、る（非特許文献 27)。
[0012] 現段階における虚血性心疾患や末梢血管疾患などの虚血性疾患の治療は、血管 拡張を含めた各種薬物療法、カテーテルなどを用いた血管形成術及び外科的に行 われるバイノ ス手術である。これらの治療法の有効性にっ 、ては十分に検討がなさ れ、治療戦略はほぼ確立されている。
し力しながら、これらの治療法を施行しても再手術が必要となる症例や、当初より適 応にならな 、症例、これらの治療法を施行しても改善の得られな 、症例などのような 不応性虚血性疾患群が問題になって 、る。
[0013] このような現状を受けて再生医療が近年注目されるようになり、世界規模で基礎研 究と応用研究が試みられている。再生医療には、組織内の血管を再生する血管再生 療法、組織を再生する組織再生療法等があるが、その中で血管新生を行うことにより 虚血組織への血流を確保し、虚血部位の障害や壊死を軽減させることを目的とする 血管再生療法が注目されて 、る。
血管再生療法には、血管新生関連因子やその遺伝子による方法と幹細胞を用い た方法、サイト力インによる細胞動員療法が臨床研究として行われている。
[0014] 虚血性心疾患の虚血心筋細胞や血管、末梢血管疾患の血管では、正常組織に比 ベて、内因性 HGFが低下しており、障害血管を救うのに HGF量が十分でないことを 示している（非特許文献 45、 46)。また、血管内皮細胞に存在する HGFの特異的受 容体である c— Metの発現が増加していること（非特許文献 47〜53)から、そこに H GFを補充することにより血管新生の促進を狙った治療法として、 HGF蛋白質、 HGF 遺伝子を含むプラスミドやウィルスベクターによる遺伝子治療が開発された。
[0015] 動物の虚血性心疾患モデル及び末梢動脈疾患モデルに対する HGF蛋白質、 HG F遺伝子を含むプラスミドやウィルスベクターによる遺伝子治療では、良好な治療効 果が報告されて 、る (非特許文献 54〜63)。
臨床研究では HGF遺伝子を含むプラスミドによる遺伝子治療が最も進んでおり、 大阪大学にて閉塞性動脈硬化症及び Buerger症患者に投与され、その安全性と有 効性の検討が行われ、安全性は概ね問題なぐ良好な改善度が確認できたと報告し ている（非特許文献 44)。
現在は、全国多施設において末梢性血管疾患患者を対象にした臨床試験 (Phase III)が実施中である。
[0016] 末梢性血管疾患患者を対象にした HGF遺伝子を含むプラスミドによる遺伝子治療 では、 X線や MRI用の造影剤等を用いて血管を造影することで虚血部位を判断し、 その周辺筋肉内に治療薬を投与する (非特許文献 64)。
[0017] 虚血性心疾患の場合は通常、虚血部位を判断する方法として、 X線や MRI用の造 影剤による血管造影や放射性核種を用 ヽた心筋血流製剤による方法、超音波による 方法等がある。また、一般的ではないが、 NOGAシステムという、カテーテルの先の センサーで心筋内膜側の電位及び空間的な位置を測定して心筋活動電位と局所壁 運動から虚血部位を判断する方法がある。
[0018] HGFプラスミドによる治療において、従来法である X線や MRI用の造影剤による血 管造影や放射性核種を用いた血流製剤、 NOGAシステム等の画像診断法は、虚血 部位は確認できるが、最も治療効果が期待できる投与部位すなわち c Metの発現 部位を直接画像化する方法ではな ヽ。
[0019] 癌の診断は、インビトロ試験及び画像診断法を組み合わせることによって診断され る。画像診断法としては、例えば、 X線コンピューター断層撮影法 (CT)、核磁気共 鳴画像診断法 (MRI)、超音波画像診断法及び放射性核種シンチグラフィー法があ る。造影剤が患者に投与されることで、 X線 CT、 MRI及び超音波によって得られる画 像が明瞭になる。腫瘍に局在化する放射性医薬品の投与は、放射性核種シンチグラ フィ一法に必要である。
[0020] これら癌の画像診断のほとんどが存在診断であり、現在では、条件によっては数 m mほどの癌も発見することができる。
一方、癌の機能 (性質)的な診断、特に浸潤性、転移性など悪性度を画像により診 断する方法はない。
[0021] HGF受容体（c Met)の過剰発現と悪性度についての研究は、数多くのグループ で、ヒト乳癌及び前立腺癌について検証されており、乳癌では進行度との関連性 (非 特許文献 76〜78)や前立腺癌での骨転移性との関連性 (非特許文献 79〜82)を報 告している。
HGF受容体は悪性度を評価する上で重要な指標となり得る標的分子であり、固形 腫瘍にお 1、て HGF受容体の発現を画像化することで、存在のみならず悪性度を判 断することができる診断薬の開発が望まれる。
[0022] 癌の治療には、外科的療法、化学療法、放射線療法、ある 、はこれらを組み合わ せた集学的療法等が行われて 、る。
最近、血管新生阻害剤を用いて、癌細胞を休眠状態にするという腫瘍休眠療法が 行われている。血管新生阻害剤により、腫瘍の血管新生を阻害し、癌細胞の成長に 必要な栄養、酸素の供給経路を絶ち、癌細胞の細胞死を誘導し、癌細胞を休眠状 態にするものである。
血管新生阻害剤として血管内皮細胞増殖因子 (VEGF)を標的にしたヒト化モノクロ ーナル抗体製剤の Bevacizumab (商品名 Avastin)が欧米で承認され臨床使用さ れている（国内は臨床治験中）。開発中の血管新生阻害剤としては、アンジォスタチ ン (非特許文献 65)、エンドスタチン (非特許文献 66)、 HGF受容体を標的にした、 HGFのアンタゴ-ストである NK4 (特許文献 2、非特許文献 67〜70)、等が知られて いる。
しかし、この腫瘍休眠療法は、癌細胞を休眠状態にするもので、癌細胞を完全に死 滅させる方法ではな 、ため、癌の完治を目指した治療ではな 、と 、える。
HGF受容体を標的にした治療薬である NK4も癌の完治を目指したものではな ヽ ため、 HGF受容体が発現している悪性度の高い腫瘍を標的とした、完治を目指した 治療薬の開発が望まれる。
HGFの at鎖の N末端ヘアピンドメインと 4つのクリングルドメインを有する、 NK4遺 伝子 Z蛋白質を用いた医薬の研究が行われて 、る (特許文献 2)。放射性核種 (1251) で標識した HGFを用いて、 HGFの体内動態パラメーター（非特許文献 73)及び、へ ノラン硫酸 ·デルマタン硫酸との親和性 (非特許文献 74)を調査した報告がある。抗 c -Met モノクローナル抗体を放射性核種 (1251)で標識し、マウスに c— Met発現癌 細胞を移植し腫瘍を画像ィ匕した報告がある (非特許文献 75)。
特許文献 1： WO94Z09969号パンフレット
特許文献 2：特開 2003 - 250549号公報
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発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0024] し力しながら、 HGFの標識体では、 HGFの作用、すなわち癌の増殖や浸潤、転移 を促進してしまう可能性がある。さらに、分子量が大きいため、血液中からゆっくり取り 除かれ、その結果、画像において長期間の血液バックグランドを生じるため、画像ィ匕 に長時間を要する等の欠点がある。また、抗 c Met抗体の標識体では、 HGF標識 体よりも分子量が大きぐ長期間の血液バックグランドを生じるため、画像化に長時間 を要する、抗原性の問題等がある。
[0025] 従って、本発明は、虚血性疾患の HGF蛋白質、 HGF遺伝子を含むプラスミドゃゥ ィルスべクタ一による治療において、効率よく血管新生を促進させるために、最も治 療効果が期待できる投与部位すなわち HGF受容体の発現部位を画像化できる診断 薬を提供することを目的とする。また、本発明の HGF受容体を発現する癌の原発腫 瘍、転移腫瘍を画像化する診断薬及び治療薬を提供することを目的とする。さらに、 本発明は、癌を含む血管新生により生じる疾患に対し有効な診断薬及び治療薬を提 供することを目的とする。さらに本発明は HGF受容体が関与する疾患の治療薬のス クリーニング方法を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0026] そこで本発明者らは、上記目的を解決するため種々検討した結果、 HGFの部分ポ リペプチドのうち、へノ^ン結合領域を含むポリペプチドの標識体が、 HGF受容体に 特異的に集積し、かつ虚血性疾患及び悪性腫瘍を含む血管新生により生じる疾患 の HGF受容体発現部位に特異的に集積し、その部位が明瞭に画像ィ匕できること、さ らにはこれらの疾患の治療に有用であることを見出した。
[0027] すなわち、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合 領域を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミ ノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へパリン結合活性を有するポリ ペプチドの標識体を含有する肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬を提 供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域 を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が 置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリぺプ チド、その標識体、あるいはその毒素結合体を含有する肝細胞増殖因子受容体が関 与する疾患の治療薬を提供するものである。
[0028] また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域 を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が 置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリぺプ チドの標識体の、肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬製造のための使 用を提供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域 を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が 置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリぺプ チド、その標識体、あるいはその毒素結合体の、肝細胞増殖因子受容体が関与する 疾患の治療薬製造のための使用を提供するものである。
[0029] また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域 を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が 置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリぺプ チドの標識体を投与し、当該標識体を検出することを特徴とする肝細胞増殖因子受 容体が関与する疾患の診断方法を提供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域 を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が 置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリぺプ チド、その標識体、あるいはその毒素結合体を投与することを特徴とする肝細胞増殖 因子受容体が関与する疾患の治療方法を提供するものである。
また、本発明は、肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域 を含むポリペプチド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が 置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリぺプ チド又はその標識体と、肝細胞増殖因子受容体との結合を阻害する物質を選択する ことを特徴とする、肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の予防又は治療薬のスク リー-ング方法、及び当該方法によりスクリーニングされた医薬を提供するものである
発明の効果
[0030] 本発明の診断薬を用いれば、標識ポリペプチドが HGF受容体に特異的に集積す るため、 HGF受容体発現部位だけを特異的に明瞭に画像ィ匕でき、 HGF受容体が 関与する虚血性疾患及び悪性腫瘍を含む血管新生により生じる疾患が画像ィ匕でき る。また、これらの疾患の治療も可能である。
図面の簡単な説明
[0031] [図 1]DL— 21 (マウスモノクローナル抗 c Met抗体）を用いて行った、実験に使用し た腫瘍細胞の c Metの発現の確認結果を示す。
1 :A431 Cell Lysate (巿販ポジティブコントロール）。
2 : McA-RH 7777 ホモジネート。
3 :HuCCT—lホモジネート。 M :分子量マーカー。
HuCCT- 1のレーンの約 140kDaの位置（三角マーク）に、 c- Met ( j8鎖）が検出 された。 McA— RH 7777が検出されな力つた理由には、抗体の特異性 (DL21は 、ヒト由来 c Metに特異的）のためである。
[図 2]SP260 (ラビットポリクローナル抗 c— Met抗体）を用いて行った、実験に使用し た腫瘍細胞の c Metの発現の確認結果を示す。
1 :A431 Cell Lysate (巿販ポジティブコントロール）。
2 : McA-RH 7777 ホモジネート。
3： HuCCT— 1ホモジネート。 M :分子量マーカー。
SP260のレーンの約 140kDaの位置（三角マーク）に、 c- Metが検出された。 Hu じ01—1の。ー1^^1; ( |8鎖）の検出が弱ぃ理由には、抗体の特異性（SPF260は、マ ウス、ラット由来 c-Metに特異性が高い）のためである。
[図 3]抗 c Met抗体（SP— 260及び DL - 21)による c Met特異的免疫組織染色 像及びへマトキシリンによる対比染色像を示す。
[図 4]免疫組織染色における陰性コントロールの結果及びへマトキシリンによる対比 染色像を示す。 [図 5] [ I]HGF (11— 83) NHの集積像（McA— RH7777)を示す。
2
[図 6]HE染色像 (McA— RH7777)を示す。（右は拡大像である。 )
[図 7]抗 c - Met抗体 (SP— 260)を用 、た免疫組織染色像 (McA— RH7777)を示 す (右は拡大像である）。
[図 8]hrHGFによる結合阻害実験結果を示す。
[図 9]99mTc— MIBIを用いた心イメージング像を示す。
[図 10] [125I]HGF (11— 83)— NHを用いた心イメージング像を示す。
2
[図 11]図 9の囲み部分の拡大 HE染色像を示す。
[図 12]99mTc— MIBIを用いた心筋虚血モデルラット SPECT像を示す。
[図 13] [123I]HGF (11— 83)— NHを用いた心筋虚血モデルラット SPECT像を示
2
す。
[図 14]図 12と図 13を重ね合せた SPECT画像を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0032] 本発明の診断薬及び治療薬は、 HGFの部分ポリペプチドであって、へパリン結合 領域を含むポリペプチド又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のァミノ 酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列力 なり、へパリン結合活性を有するポリ ペプチド (以下、「HGF受容体結合性ポリペプチド」ということがある。）あるいはその 標識体を含有することを特徴とする。 HGFのへパリン結合領域としては ヽくつか存在 するが、このうち HGFアミノ酸配列（配列番号 1)中の Cys39— Cys65であることが好 ましぐ本発明で用いる HGF受容体結合性ポリペプチドとしては、当該 Cys39— Cys 65を含むポリペプチドであることが好ましい。ここでへパリン結合活性は、後記実施 例のようにへノ リンカラムを用いた実験で検定することができる。なお、配列番号 1の アミノ酸配列は、 HGF前駆体から、シグナルペプチド部分が除かれている成熟 HGF の配列なので、配列番号 1の Glnlは、シグナルペプチド部分を含むアミノ酸配列の Gln32に相当する。
[0033] HGF受容体結合性ポリペプチドには、 HGFの部分ポリペプチドの他に、 HGFの 部分ポリペプチドを示すアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加 したアミノ酸配列力 なり、へパリン結合活性を有するポリペプチドが（以下、改変体と いうことがある）が含まれる。これらの改変は、 1つ又は複数のアミノ酸の変異を導入 するため、あるいは事前に決定されたアミノ酸残基の個所で蛋白質コード配列を切断 するために、ポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR)に基づく技法や、 in vitroの部位特異 的突然変異誘発を含めた当分野で周知の方法を用いて引き起こすことができる。例 えば、 Kunkelらの方法を参照（Kunkelら、 Pro Natl Acad Sci USA 82 :488 —492 (1985) )。
[0034] HGF受容体結合性ポリペプチドの改変にはさらに、他の化合物たとえばポリエチレ ングリコール (PEG)重合体に結合した HGF受容体結合性ポリペプチドが含まれる。 PEGを含む化合物を用いて、ポリペプチドたとえば HGF受容体結合性ポリペプチド 表面のアミノ基を誘導体化させると、このようなポリペプチドの循環寿命を延ばし、 H GF受容体結合効果を持続することができる（Beauchampら、 Anal Biochem 13 1 : 25— 33 (1983) )。用いる PEGの分子量に特に限定はないが、通常は 300〜30 , 000、好ましくは 1, 000〜15, 000である。 PEGを改変する方法は、当分野で周 知の任意の方法でよい（例えば、 Beauchampら、 Anal Biochem 131 : 25〜33 ( 1983) )。
[0035] さらに、本発明の範囲に含まれる改変 HGF受容体結合性ポリペプチドは、了フィニ ティーマトリクス上でポリペプチドが捕捉可能にさせるアミノ酸配列を含むように「操作 」することができる。たとえば、ポリペプチド精製を支援するためにタグたとえば c my c、赤血球凝集素、ポリヒスチジン、 Flag (商標）タグ (Kodak)を使用することができる 。このようなタグは、カルボキシル末端及びアミノ末端のいずれかを含めたポリべプチ ド内の任意の部位に挿入することができる。 HGF受容体結合性ポリペプチドはまた、 ポリペプチドの検出を支援する、アルカリホスファターゼなど酵素との融合体として生 成させることができる。
[0036] HGF受容体結合性ポリペプチドの好ましいものとしては、 Cys39— Cys65を有し、 その N末端側に 4〜40アミノ酸、 C末端側に 4〜110アミノ酸を有するポリペプチド又 はその改変体が挙げられる。さらに好ましくは Cys39— Cys65を有し、その N末端側 及び Z又は C末端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチド又はその改変体が挙げ られる。最も好ましくは Cys39— 65Cysを有し、その N末端側及び/又は C末端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチド、又はその改変体である。このようなポリペプチド の例としては、配列番号 1のアミノ酸配列における、 Cys39— His83、 His9— Glu80 、 Phel l— His83 (配列番号 2)、 Glnl— His83、 Phel l— Asn96、 Glnl— Asn9 6、 Glnl— Cys 175等が挙げられる。
このうち、配列番号 2で示されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド、又はその改変体 が特に好ましい。
[0037] なお、 HGF受容体結合性ポリペプチドの改変体としては、前記のようにアミノ酸が 置換、欠失、又は付加されたものであって、へパリン結合活性を有するものが含まれ る力 そのような改変体は通常 HGFの部分ポリペプチドとの相同性が 90%以上、さ らに 95%以上であるのが好ましい。また、へパリン結合活性は、 Cys39— 65Cysポリ ペプチドのへパリン結合活性の 10%以上、さらに 50%以上、さらに 60%以上、さら に 70%以上、特に 80%以上を有するものが好ましい。
[0038] HGF受容体結合性ポリペプチドの標識体としては、通常診断目的に用いられる検 出可能な標識体であればいずれも挙げられる。すなわち、診断用途のために、検出 可能な部分を用いて HGF受容体結合性ポリペプチドを標識することができる。この 検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に生成することができる 。たとえば、検出可能な部分は、放射性核種、たとえば 3H、 14C、 32P、 35S、 1251 ；蛍光又は化学発光化合物たとえばフルォレセインイソチオシァネート、ローダミン、 ルシフェリン；又は酵素たとえばアルカリホスファターゼ、 j8ガラクトシダーゼ、西洋わ さびペルォキシダーゼであってよ 、。ポリペプチドを検出可能な部分に結合させる当 分野で周知の任意の方法を利用することができる。たとえば、 Hunter他、 Nature 144 : 945 (1962)； David他、 Biochemistry 13 : 1014 (1974)； Pain他、 J Imm unol Meth 40 : 219 (1982)； Nygren, Histochem and Cytochem 30 :40 7 (1982)参照。
[0039] HGF受容体結合性ポリペプチドはまた、 HGF受容体をイメージングするために、 i n vivoイメージングに有用な検出可能な部分と結合させてもよ!、。
HGF受容体結合性ペプチドを検出可能な部分たとえば放射性核種や放射線不透 過性薬剤、常磁性薬剤、界面活性剤を用いて標識し、哺乳動物の好ましくは血流中 に投与し、標識された HGF受容体結合性ポリペプチドの存在及び位置を外部から 検出する。 HGF受容体結合性ポリペプチドは、核磁気共鳴、放射化学、超音波、周 知の他の検出方法によって、哺乳動物内で検出可能な HGF受容体結合性ポリぺプ チドのどのような部分を用いて標識してもよい。具体的には、 HGF受容体と結合する ポリペプチド部分、所望により連結基、及び検出可能な部分力 なる。検出可能な部 分は γ線又は陽電子を放出する放射性診断剤、核磁気共鳴画像診断用造影剤、 X 線造影剤、又は超音波造影剤が挙げられる。
[0040] より具体的には、ポリペプチド部位のチロシン残基、ヒスチジン残基等のアミノ酸残 基や構造中に放射性核種たとえば、 11C、 13N、 150、 18F、 34mCl、 38C1、 75B r、 76Br、 77Br、 80mBr、 80Br、 82Br、 1211、 1231、 1241、 1261、 1311等を 1つ 以上直接標識した放射性診断薬、又は、 X線を吸収する、すなわち原子番号 20又 はそれ以上の原子を 1つ以上含む X線診断薬、あるいは常磁性ィ匕合物例えば-トロ キシドを含む核磁気共鳴診断用造影剤が挙げられる。
[0041] また、ポリペプチドに連結基として二官能性配位子やカルボ-ルイ匕合物等を導入し 金属錯体としてなる造影剤が挙げられる。ここで二官能性配位子としては、ポリアミノ ポリカルボン酸が好ましい。ポリアミノカルボン酸としては、エチレンジァミン四酢酸 (E DTA)、ジエチレントリアミン五酢酸（DTP A)、ジエチレントリアミン五酢酸ビスメチル アミド（DTPA— BMA)、 1, 4, 7, 10—テトラァザシクロドデカン一 1, 4, 7, 10—四 酢酸 (DOTA)及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる。ポリアミノポリカルボン酸 以外の二官能性配位子としてたとえば、 6—ハイドラジノニコチンアミド (HYNIC)及 びこれらの誘導体からなる群より選ばれる。
[0042] また、ポリペプチドと二官能性配位子の金属錯体が、内殻にある不対電子により常 磁性を示す金属イオンたとえば、 Co、 Mn、 Cu、 Cr、 Ni、 V、 Au、 Fe、 Eu、 Gd、 Dy 、 Tb、 Ho及び Erからなる群より選ばれる金属元素の常磁性イオンを金属成分とする 核磁気共鳴診断薬に有用な錯体も挙げられる。
また、ポリペプチドと二官能性配位子の金属錯体が、 X線を吸収する、すなわち原 子番号 20又はそれ以上のたとえば、 Re、 Sm、 Ho、 Lu、 Pm、 Y、 Bi、 Pb、 Os、 Pd、 Gd、 La、 Au、 Yb、 Dy、 Cu、 Rh、 Ag、及び Irからなる群より選ばれる金属元素の金 属イオンを金属成分とする X線診断薬に有用な錯体も挙げられる。
また、ポリペプチドと二官能性配位子の金属錯体が、放射性核種である、たとえば、
47Sc、 52mMn、 55Co、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 72As、 72Se、 73 Se、 75Se、 76As、 95Tc、 99mTc、 105Rh、 109Pd、 l l lln、 153Sm、 177Lu、 186Re、 188Re、 198Au、 199Au、 201T1、 211At及び 212B もなる群より選ば れる放射性核種の金属イオンを金属成分とする放射性診断薬に有用な錯体も挙げ られる。
[0043] また、本発明のポリペプチドにおける標識部位は、 Cys39— Cys65以外の部分で あることが好ましい。
[0044] さらに、 j8線、 α線及び Auger又は Coster— Kronig電子を放出する放射性核種 に結合させた HGF受容体結合性ポリペプチドは、 HGF受容体を標的にした治療薬 として使用することができる。
治療に適した放射性核種としてたとえば、 47Sc、 67Cu、 89Sr、 90Y、 103Pd、 1 05Rh、 109Pd、 l l lAg、 1251、 1311、 140La、 149Pm、 153Sm、 159Gd、 165 Dy、 166Dy、 166Ho、 169Yb、 175Yb、 177Lu、 186Re、 188Re、 192Ir、 198 Au、 199Au、 211 At, 212Bi、 212Pb、及び 217Biを有する放射'性核種との安定 な複合体を形成するように選択する。
[0045] ポリペプチド部分と結合した界面活性部分力 なり、生体適合性ガスの超微粒気泡 、液体担体、界面活性剤ミクロスフ アを含む超音波造影剤も挙げられる。
[0046] 毒素に結合させた HGF受容体結合性ポリペプチドは、 HGF受容体を標的にする ための治療薬として使用することができる。 HGF受容体結合性ポリペプチドを、当分 野で周知の手順によって細胞の細胞質中の細胞毒性効果を媒介する任意の毒素ポ リペプチドに結合させることができる。好ましい毒素ポリペプチドには、リボソーム不活 性ィ匕タンパク質、たとえば A鎖毒素（たとえばヒマ毒 A鎖）、サボリン (saporin)、ブリオ ジン（bryodin)、ゲ口-ン（gelonin)、アブリン（abrin)、ャマゴボウ抗ウィルスタンパ ク質（pokeweed antiviral protein、 PAP)など植物性毒素、 αサルシン（a— sa rein)、ァスペルギリン（aspergillin)、レストリクトシン（restrictocin)など真菌性毒素 、ジフテリア毒素（DT)など細菌性毒素、 Pseudomonas外毒素 A、胎盤性リボ核酸 やアンジォゲニンなどリボ核酸が含まれる。他の有用な毒素ポリペプチドは、アポトー シス促進ポリペプチド、たとえば Fas ligand、 TRAIL, TNF— a、 TNF— β、 Apo - 3 ligand、 Bax、 Bad, Bak、 Bim、 Bik、 Bok、 Hrkである。さらに、 1つ以上（たと えば 2、 3、 4又は 6)の毒素の複数の機能性断片（たとえば 2、 3、 4、 6、 8、 10、 15又 は 20)を HGF受容体結合性ペプチドに結合させることができる。反復が含まれてい る場合は、互いにすぐ隣接、 1つ又は複数の標的断片によって分離、又は上に記載 の結合ペプチドによって分離されて 、てもよ 、。
[0047] 本発明に用いる HGF受容体結合性ポリペプチドは、たとえば HGF蛋白質を酵素 等で分解することや、特定の目的ポリペプチドを発現している組織培養細胞を用いて 、ァフィユティークロマトグラフィーや HPLCなどのポリペプチド精製技術により、実質 的に純粋なポリペプチドを得ることができる。カロえて、 HGF受容体結合性ポリべプチ ドを生成するために、ポリペプチド合成技術を用いることもできる。ポリペプチド合成 技術には、固相合成法、液相合成法等がある（「第 5版 実験化学講座 16 有機化 合物の合成 IV カルボン酸'アミノ酸'ペプチド」日本化学会編、東京化学同人（200 5) ) 0
[0048] HGF受容体結合性ポリペプチドはまた、糸且換え方法によって生成することもできる 。ヒトの HGFの cDNA配列が知られている（Miyazawaら、 Biochem Biophys Re s Commun 163 : 967— 973 ( 1989) ; Nakamuraら、 Nature 342 : 440—443 ( 1989) )。 cDNAからタンパク質産物を発現させる方法は周知である。たとえば、 M aniatis他、 1989、「分子クロー-ング：実験室マ-ユアル（Molecular Cloning : A Laboratory Manual)」、 Cold Spring Harbor Laboratory、-ュ ~~ョ ~~ク州 、 16. 1〜17. 44ページ参照。適切な発現システムには、糸且換えバタテリオファージ 、プラスミド DNA、コスミド DNA発現ベクターを用いて形質転換させた微生物たとえ ば細菌（たとえば E. coliや B. subtilis)；組換え酵母菌発現ベクターを用いて形質 転換させた酵母菌（たとえば Saccharomycesや Pichia)；組換えウィルス発現べクタ 一（たとえばバキュロウィルス)で感染させた昆虫細胞システム;融合タンパク質ヌクレ ォチド配列を含んだ組換えウィルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイ ルス (CaMV)やタバコモザイクウィルス (TMV) )で感染させた、又は融合タンパク質 ヌクレオチド配列を含んだ組換えプラスミド発現ベクター（たとえば Tiプラスミド)を用 V、て形質転換させた植物細胞システム；哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（ たとえばメタ口チォネインプロモーター）又は哺乳動物ウイノレス由来のプロモーター（ たとえばアデノウイルス後期プロモーターやワクシニアウィルス 7. 5Kプロモーター） を含む発現構築体を用いて形質転換させた哺乳動物細胞システム (たとえば、 HEK 、 COSゝ CHO、 BHK、 293、 VERO、 HeLaゝ MDCK、 WI38、 NIH 3T3細胞）が 含まれるが、それだけには限定されない。哺乳動物から直接得た、プラスミドベクター を用いて形質転換させた、あるいはウィルスベクター（たとえば、とりわけヘルぺスウイ ルス、単純へルぺスウィルス、レトロウイルス、ワクシニアウィルス、弱毒ワクシニアウイ ルス、カナリア痘ウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、レンチウィルス、ポッ タスウィルス、レンチウィルス（HIV)、センダイウィルス、ェプスタイン一バーウィルス（ EBV)、ポリオウイルス、シンビスウィルス、シミアンウィルス 40 (SV40) )で感染させ た一次細胞又は二次細胞もまた宿主細胞として有用である。
[0049] 本発明の診断薬及び治療薬の対象疾患としては、 HGF受容体が関与している疾 患、例えば虚血性疾患及び悪性腫瘍が挙げられる。虚血性疾患としては、前記虚血 性心疾患、末梢血管疾患が挙げられる。悪性腫瘍としては、卵巣癌、脾臓癌、胃癌、 胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉 腫、ダリオ一マ、メラノーマ等が挙げられる。またさらに HGF受容体を発現し血管形 成に関連する状態にある疾患、例えば、心筋血管形成、糖尿病性網膜症、糖尿病性 血管新生、不適切な創傷治癒、炎症性疾患も診断及び治療することができる。
[0050] 本発明の診断薬及び治療薬は、静脈注射による投与が最適であるが、その他一般 的な手段たとえば、経口、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、関節内、滑液内等に投与が 可能である。
本発明の診断薬及び治療薬は、例えば放射性薬剤の場合、その投与量は、患者 の体重、年齢、性別及び SPECT装置に代表される測定機器等の諸条件によって適 宜決められる。一般的に、診断薬の場合、 1231の放射能として l l lMBq〜222MB q、治療薬の場合、 131Iの放射能として37MBq〜3700MBqの範囲でぁる。
本発明の診断薬を用いたイメージング (画像化)法としては、例えば、 1231の場合、 本薬剤を上記の投与量の範囲で静脈内に投与し約 1時間後、さらに経時的に全身 又は疾患部位周辺を γカメラを用いて Planarな ヽし断層撮影（SPECT)を行うのが 望ましい。
[0051] また、本発明の診断薬及び治療薬は、前記有効成分以外に、プロピレングリコール 等の安定化剤；酸、塩基等の pH調整剤；リン酸緩衝液等の緩衝剤；生理食塩水等の 等張剤等を添加し、製剤とすることができる。
[0052] また、前記 HGF受容体結合性ポリペプチド又はその標識体は、 HGF受容体が関 与する疾患の予防又は治療薬のスクリーニングに用いることができる。すなわち、 HG F受容体結合性ポリペプチド又はその標識体と、 HGF受容体との結合を阻害する物 質を選択すれば、当該阻害物質は HGF受容体が関与する疾患の予防又は治療薬 として有用である。当該結合阻害物質の選択方法は、通常の結合阻害試験により行 うことができる。例えば、被験物質の存在下に、 HGF受容体結合性ポリペプチド標識 体と HGF受容体を反応させ、 HGF受容体に結合した、または結合していない HGF 受容体結合性ポリペプチド標識体の量を測定すればよい。
力べして選択された結合阻害物質は HGF受容体が関与する疾患の予防又は治療 薬として有用である。
実施例
[0053] 次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例によ り何ら制約されるものではな 、。
[0054] 実施例 1
固相法を用いた自動ペプチド合成機を使用し、配列番号 2のポリペプチド (HGF ( 11 -83) -NH )を合成した。
2
[0055] <高速液体クロマトグラフィー条件 >
カラム WMC— Pack R-ODS- 5-A(250 X 4. 6mm)
移動相 溶液 A: 0. 1%TFA in Water
溶液 B: 0. 1%TFA in Water/ AcCN (30/70)
25分 linergradient 0%→100% 溶液 B
流速 1. OmLZ min 温度 35°C
検出器 UV: 210nm20. AUFS
純度 95%以上
<質量測定 >
実測測量（MALDI— TOF) : 8295. 71 (計算値 8294. 86 [M+H] +
[0056] 実施例 2
[125l]HGF (l l -83) -NH (73aa)の合成
2
実施例 1で得た HGF (l l— 83)—NH (73aa) (Lot HGF11— 83— NH )〖こ、 [
2 2
125ι]を直接導入する方法にて調製した。
[0057] 1. (73aa)トリフルォロ酢酸塩水溶液 25 L
Figure imgf000022_0001
、0. 5Mリン酸ナトリウム緩衝溶液 (pH7. 0) 50 /z L、 [12¾ヨウ化ナトリウム溶液（1— lOmCi) 10- 20 ^ Lの混合溶液に 0. 25mgZmLの p トルエンスルホンクロ口アミ ドナトリウム水溶液 10 Lを添加し、室温で 1時間放置した。この反応を数回繰り返し 行なった後、すべての反応混合物を逆相カラム（YMC— Pack R-ODS- 5-A 4. 6 X 250mm)を用いて、 A液： 0. 1%トリフルォロ酢酸水溶液と B液： 0. 1%トリフ ルォロ酢酸水溶液 Zァセトニトリル = 30Z70混合溶液 (0— 50分リニアグラジェント 、溶液 A: 100%→0%)の移動相で 1. OmLZ分の流速にて分離精製した。このとき 安定化剤として 10%ゥシ血清アルブミン水溶液 100 Lを添加した。分取溶液を室 温減圧下で有機溶媒を留去し、最終的に約 0. 5mCiZmLの 1%ゥシ血清アルブミ ン水溶液の組成になるように 10%ゥシ血清アルブミン水溶液と水を適量添カ卩した後、 0. 20 mのメンブランフィルターで濾過し、目的物の溶液を調製した。へパリン結合 活性測定実験、腫瘍細胞移植モデル動物分布実験、虚血性心疾患モデル動物分 布実験のために 8週間まで 20°Cにて貯蔵した。上記の逆相カラムを用いる条件で 分析するとき、分解物であるフリーの [12¾の放射化学的純度は 10%以下であった。
[0058] 実施例 3
へパリンァフィ-ティカラムによる [125I]HGF (11— 83)— NH (73aa)のへパリン結
2
合活性の確認
実施例 1で得られた [12¾HGF (11— 83)— NH (73aa)について、へパリンカラム を用いた高速液体クロマトグラフィーによるへノ リン結合活性の測定を行った。
陽性コントロールとして強 、へノ リン結合活性をもつ hrHGF (ペプチド研究所)を使 用した。
[0059] <高速液体クロマトグラフィー条件 >
カラム TSK— gel Heparin- 5PW(0. 75 X 7. 5cm)：東ソー製
移動相 溶液 A: 10mM リン酸 Na buffer (pH7. 5)
溶液 B: 10mM リン酸 Na buffer (pH7. 5) + 2M NaCl
0分ー3分 溶液 A 100%
3分 30分 linergradient 溶液 B 0%→100%
流速 0. 7mL/ min
温度 室温（25°C前後）
検出器 UV: 215nm及び 280nm
RI
hrHGFの保持時間は、 23. 4分で、約 1. 5M NaClで溶出された。
[0060] [12¾HGF (11— 83)— NH (73aa)の保持時間は、 20. 3分で、約 1. 3M NaC
2
1で溶出され高いへノ リン結合活性が確認された。このほかに、 4. 3分に遊離した1251 のピークが、 9. 9分に分解又は変性しへノ^ン結合活性が低下したペプチドと考えら れるピークが確認された。それぞれのピークの面積比は、 78. 1%、 3. 1%、 18. 8% であり、約 80%が強 、へパリン結合活性を保持して!/ヽた。
[0061] 実施例 4
[125I] HGF (11 -83) -NH (73aa)の c— Met発現腫瘍への集積
2
c Met発現癌細胞を皮下移植したマウスの腫瘍への [125I] HGF ( 11 83)— N H (73aa)の c Met特異的集積をオートラジオグラフィ法及び免疫組織染色法によ
2
り確認した c
[0062] 1.実験に使用した腫瘍細胞の c Metの発現の確認
McA— RH7777細胞（ラット由来肝臓癌細胞)及び HuCCT— 1細胞（ヒト由来胆 管癌細胞）に c— Metが発現していることを、ウェスタンブロッテイング法により確認し た。培養した HuCCT— 1及び McA— RH7777よりホモジネート（タンパク量 1. Omg ZmL)を調製した。これらのサンプルを、 SDS— PAGE (7. 5%ゲル）により分離後 、 PVDF膜に転写した。転写膜は、一次抗体に DL21 (マウスモノクローナル抗 c— M et抗体； upstate社）、 SP260 (ラビットポリクローナル抗 c Met抗体； Santa Crru z Biochemistry社）、二次抗体に ECL Anti— mouse IgG (アマシャムバイオサ ィエンス社）又は ECL Anti -rabbit IgG (アマシャムバイオサイエンス社）を用い て反応させた。その後、 ECL detection Kit (アマシャムバイオサイエンス社）で検 出したところ、 DL21抗体では、 HuCCTlのレーンに、予測された分子量（約 140kD a)の位置のバンドが検出された（図 1)。 SP260抗体では McA—RH7777のレーン に、約 140kDaの位置のバンドが検出された。 HuCCTlのバンドは弱く検出された（ 図 2)。これより、 McA— RH7777、 HuCCT— 1両細胞に c— Metが発現しているこ とが確認された。
[0063] 2.免疫組織染色法による c Met発現癌細胞の確認
c - Met発現 HuCCTl細胞（ヒト由来胆管癌細胞）を LabTekチェンバースライド（ NUNC社製）にて培養した。培養細胞を 10%ホルマリン緩衝液で固定を行い、 0. 2 %TritonX— 100で前処理した後、 1次抗体として、抗 c Met抗体（SP— 260、 DL 21)及び、 SP— 260の陰性コントロールとして、無免疫のゥサギ正常ィムノグロブリ ン分画（DAKO社）、 DL— 21の陰性コントロールとしてマウス IgGl (DAKO社）を添 カロし 2時間、室温で反応させた。次に、 SP— 260及び無免疫のゥサギ正常ィムノグロ ブリン分画を処理したサンプルには、シンプルスティンラット MAX— PO (R) (二チレ ィ社）を、 DL— 21及びマウス IgGlを処理したサンプルには、シンプルスティンラット MAX-PO (M) (-チレイ社)を添カ卩し 30分間室温で反応させた。 DAB基質溶液（ DAKO社)を添加し 10分間、室温で反応させ免疫組織染色を行った。その後、対比 染色として、へマトキシリン染色を行った（図 3, 4)。
その結果、抗 c Met抗体による、 c Met特異的染色像が確認された。
[0064] 3. c— Met発現癌細胞を皮下移植したマウスの腫瘍への [12¾HGF (11— 83)— N H (73aa)の c Met特異的集積のオートラジオグラフィ法及び免疫組織染色法によ
2
る確認
C Met発現 McA— RH7777細胞（ラット由来肝細胞癌細胞）懸濁液 200 μ 1 (2. 0 X 106cells)を 6週齢ヌードマウス（BALBZc nu/nu：日本エスエルシー株式会 社)の右後肢皮下に注入した。 9日目（腫瘍体積 82〜478cm3: McA— RH7777細 胞）に上記標識 HGF— fragment(370kBqZl00 1)を静脈より投与した。投与後 15分後に腫瘍と近傍筋肉を一緒に摘出し、凍結切片を作製した。凍結切片をィメー ジングプレート（富士写真フィルム株式会社）に 7日間、密着させた後、バイオ'ィメー ジングアナライザー BAS - 1800 (富士写真フィルム株式会社）にて [125I] HGF ( 11 -83) -NH (73aa)の集積像を得た（図 5)。その結果、腫瘍部位に近傍筋肉部位
2
より高い [12¾HGF (11— 83)— NH (73aa)の集積が確認された。腫瘍への集積
2
は近傍筋肉比で 4. 6〜8. 1倍であった。さらに、連続する凍結切片をへマトキシリン •ェォジン (HE)染色（図 6)及び抗 c - Met抗体 (SP— 260)を用 、て免疫組織化学 染色を行った (図 7)。腫瘍部位で c Met特異的な染色が確認され、 [12¾HGF (1 1 -83) -NH (73aa)の集積像と一致した。
2
この結果により、 [125l]HGF (l l -83) -NH (73aa)の集積力 c— Met特異的
2
集積であることが確認された。
実施例 5
[125I]HGF (11— 83) -NH (73aa)の HGF受容体への結合の確認
2
c Met発現 HuCCT— 1細胞（ヒト由来胆管癌細胞）への [12¾ HGF (11— 83) -NH (73aa)の結合力 ヒトリコンビナント HGF (hrHGF)により阻害されるかをバイ
2
ンデイングアツセィ法により確認した。
ゥシ血清アルブミン（BSA)でコーティングしたエツペンドルフチューブに結合阻害 試験用に調整した HuCCTl細胞の細胞懸濁液 100 /z L (l. 5 X 105個）を入れ、 hr HGF (ペプチド研究所)を終濃度 379nMに調整した溶液 50 μ Lを添加した。ネガテ イブコントロールとして、 rhHGF溶液の代わりにバインディングバッファー（0. 2%BS A、 20mM HEPES Hanks' solution、 pH7. 0)を 50 L添カ卩したものを用意し た。さらに、 0. 758nM [125I]HGF (11— 83)— NH (73aa)溶液を L添カロし
2
た（終濃度 0. 190nM、 hrHGFとの量比は 1 : 2000)。細胞の入ったエツペンドルフ チューブは撹拌の後、室温で 1時間インキュベート後、 4°Cで遠心（3000rpm、 3min )して細胞を沈降し、上清をァスピレーターで除いた。細胞を氷冷したバインディング バッファー 500 /z L加え撹拌後、遠心（3000rpm、 3min)する洗浄操作を 3回繰り返 した。細胞の入ったエツペンドルフチューブの放射能をガンマカウンターで測定した 。その後、 hrHGF溶液を添加したもの（hrHGF ( + ) )とバインディングバッファーを 添加したもの (hrHGF (―) )の放射能のカウント (cpm)について平均値、標準偏差 を求めた。平均値については、 Studentの t検定により平均値の差を検定した。
その結果、 HuCCTl細胞に結合した [125I]HGF (11— 83)— NH (73aa)由来の
2
放射能は、 hrHGF (―)で 26136. 2± 2580. 8cpm (mean士 SD :以下同様）となり 、 hrHGF ( + )では、 20916. 9± 1574. 2cpmとなった。モノレ濃度で 2000倍の hrH GFを添加することにより、細胞への結合は 20%減少した。また、この減少は統計学 的に有意（P = 0. 040)であった（図 8)。以上のことから、 [125l]HGF (l l -83) -N H (73aa)が、 HuCCTl細胞の HGF受容体に結合していることが明らかになった。
2
[0066] 実施例 6
[125I]HGF (11— 83)― NH (73aa)による心筋虚血モデルラットの HGF受容体発
2
現部位の確認
[0067] <心筋虚血モデルの作製 >
CD (SD) IGSラット（10週齢）ペントバルビタール Naを 35mgZkgで腹腔内に投与 し麻酔を力けた。気管を切開し、人工呼吸器を装着させた。左胸部を開胸し、この状 態を冠動脈結紮術前状態として、心電図を記録した。冠動脈とその周辺数 mmの組 織を含めて縫合糸で結紮した。心電図にて、 STの上昇により虚血状態を確認し記録 した。心電図測定後、閉胸した。気管及び皮膚を縫合した。
[0068] くオートラジオグラフィ〉
心筋虚血モデル作製後 3日後に血流イメージング剤 99mTc— MIBI (製品名 力 一ディオライト注射液 株式会社第一ラジオアイソトープ研究所)と [12¾HGF (11— 83)― NH (73aa)を投与し、 2核種オートラジオグラフィ、 HE染色により評価した。 9
2
9mTc - MIBIを大腿静脈より 60MBq投与した。 99mTc - MIBI投与 15分後に [125 l]HGF (l l -83) -NH (73aa)を大腿静脈より 740kBq投与し、 15分後に心臓を
2
摘出した。実験当日に、イメージングプレートに 30分間密着させた後、バイオ'ィメー ジングアナライザー BAS— 1800にて 99mTc - MIBIの集積像を得た（図 9)。その 後 99mTcの減衰を 7日間待ち、再度イメージングプレートに 7日間密着させた後、バ ィォ 'イメージングアナライザー BAS— 1800にて [125I]HGF (11— 83)— NH (73a
2 a)の集積像を得た (図 10)。
[0069] 2核種オートラジオグラフィの結果から、 99mTc— MIBIの集積が低下している境 界付近で [12¾HGF (11— 83)— NH (73aa)の集積が観察された (正常心筋比 1.
2
4〜2· 3倍の集積）。連続切片の HE染色から、 [125I] HGF ( 11 - 83) - NH (73aa
2
)の集積部位が HGF受容体を過剰に発現して 、るとされる梗塞境界であることが確 認された（図 11)。
[0070] 実施例 7
心筋虚血モデル HGF受容体発現部位の [12 HGF (11— 8¾— NH (73aa)によ
2
る画像化
[0071] <心筋虚血モデルの作製 >
Wistar系ラット（8週齢）にイソフルラン（フォーレン (R)アボット）にて麻酔をかけた 後、気管を切開し、麻酔器を接続した人工呼吸器を装着させた。左胸部を開胸し、こ の状態を冠動脈結紮術前状態として、心電図を記録した。冠動脈とその周辺の組織 を含めて縫合糸で結紮した。結紮する際に冠動脈と縫合糸の間にナイロン糸を挟み 込みことで結紮強度を弱め完全に血流を遮断しないようにした。心電図にて、 STの 上昇により虚血状態を確認し記録した。その後、閉胸して気管及び皮膚を縫合した。
[0072] く SPECT収集〉
イソフルラン吸入麻酔下で心筋虚血モデルラットに、 "mTc MIBIを左大腿静脈よ り投与した（90MBq)。続、て実施例 2と同様の手法を用いて調整した [12¾HGF (1 1 -83) -NH (73aa)を右大腿静脈より投与した（100MBq)。投与 30分後から、
2
ガンマカメラ (PRISM2000 島津製作所）にて Pinhole - SPECT撮像を行った (撮 像条件 Pinholeコリメーター、マトリックスサイズ 256 X 256、 Magi. 0、エネルギー ウィンドウ99 mTc : 140keV 10%、 123I : 159keV 10%、 3° 60sec/ステップ）。さ らに、撮像後心臓を摘出し、 ex vivoで Pinhole— SPECT撮像を行った (撮像条件 は同じ)。
[0073] その結果、 99mTc— MIBIの Pinhole— SPECT像にて血流の低下が観察されたこ とから、心筋虚血モデルができていることが確認された（図 12)。また、 [12¾HGF (1 1 -83) -NH (73aa)の Pinhole— SPECT像から、 "mTc— MIBIの集積が低下し
2
ている部位の境界周辺に集積が高いことが確認された（図 13)。さらに、 HGF受容体 が発現しているとされる血流低下領域で [12¾HGF (11— 83) -NH (73aa)が高
2
集積すること力 Pinhole— SPECT画像からも明らかにされた。（図 14)

Claims

請求の範囲
[1] 肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域を含むポリべプチ ド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は 付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリペプチドの標識体を含 有する肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬。
[2] へパリン結合領域が Cys39— Cys65である請求項 1記載の診断薬。
[3] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側に 4〜40アミノ酸 、 C末端側に 4〜 110アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— C ys65以外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 1又は 2記 載の診断薬。
[4] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— Cys65以 外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 1又は 2記載の診断 薬。
[5] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— Cys65以 外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 1又は 2記載の診断 薬。
[6] 前記部分ポリペプチドが、配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配 列からなり、へパリン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項 1又は 2記載の診 断薬。
[7] 肝細胞増殖因子受容体イメージング剤である請求項 1〜6の 、ずれか 1項記載の 診断薬。
[8] 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患が、虚血性疾患又は悪性腫瘍である請求 項 1〜7のいずれか 1項記載の診断薬。
[9] 肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域を含むポリべプチ ド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は 付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリペプチド、その標識体 、あるいはその毒素結合体を含有する肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の治 療薬。
[10] へパリン結合領域が Cys39— Cys65である請求項 9記載の治療薬。
[11] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側に 4〜40アミノ酸
、 C末端側に 4〜110アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 9又は 10記載の治 療薬。
[12] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 9又は 10記載の治療薬。
[13] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 9又は 10記載の治療薬。
[14] 前記部分ポリペプチド力 配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配 列からなり、へノ^ン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項 9又は 10記載の 治療薬。
[15] 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患が、虚血性疾患又は悪性腫瘍である請求 項 9〜 14のいずれか 1項記載の治療薬。
[16] 肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域を含むポリべプチ ド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は 付加したアミノ酸配列力 なり、へノ リン結合活性を有するポリペプチドの標識体の、 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の診断薬製造のための使用。
[17] へパリン結合領域が Cys39— Cys65である請求項 16記載の使用。
[18] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側に 4〜40アミノ酸 、 C末端側に 4〜 110アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— C ys65以外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 16又は 17 記載の使用。
[19] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— Cys65以 外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 16又は 17記載の 使用。
[20] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— Cys65以 外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 16又は 17記載の 使用。
[21] 前記部分ポリペプチドが、配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配 列からなり、へパリン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項 16又は 17記載の 使用。
[22] 診断薬が、肝細胞増殖因子受容体イメージング剤である請求項 16〜21のいずれ 力 1項記載の使用。
[23] 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患が、虚血性疾患又は悪性腫瘍である請求 項 16〜22のいずれか 1項記載の使用。
[24] 肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域を含むポリべプチ ド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は 付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリペプチド、その標識体 、あるいはその毒素結合体の、肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の治療薬製 造のための使用。
[25] へパリン結合領域が Cys39— Cys65である請求項 24記載の使用。
[26] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側に 4〜40アミノ酸 、 C末端側に 4〜110アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 24又は 25記載の使 用。
[27] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 24又は 25記載の使用。
[28] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 24又は 25記載の使用。
[29] 前記部分ポリペプチド力 配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配 列からなり、へノ^ン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項 24又は 25記載の 使用。
[30] 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患が、虚血性疾患又は悪性腫瘍である請求 項 24〜29の!、ずれか 1項記載の使用。
[31] 肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域を含むポリべプチ ド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は 付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリペプチドの標識体を投 与し、当該標識体を検出することを特徴とする肝細胞増殖因子受容体が関与する疾 患の診断方法。
[32] へノ リン結合領域が Cys39— Cys65である請求項 31記載の診断方法。
[33] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側に 4〜40アミノ酸 、 C末端側に 4〜 110アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— C ys65以外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 31又は 32 記載の診断方法。
[34] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— Cys65以 外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 31又は 32記載の 診断方法。
[35] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチドであり、その標識体が Cys39— Cys65以 外のアミノ酸が放射性核種により標識された標識体である請求項 31又は 32記載の 診断方法。
[36] 前記部分ポリペプチドが、配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配 列からなり、へノ^ン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項 31又は 32記載の 診断方法。
[37] 肝細胞増殖因子受容体イメージング方法である請求項 31〜36の 、ずれか 1項記 載の診断方法。
[38] 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患が、虚血性疾患又は悪性腫瘍である請求 項 31〜37のいずれか 1項記載の診断方法。
[39] 肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域を含むポリべプチ ド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は 付加したアミノ酸配列力 なり、へノ^ン結合活性を有するポリペプチド、その標識体
、あるいはその毒素結合体を投与することを特徴とする肝細胞増殖因子受容体が関 与する疾患の治療方法。
[40] へパリン結合領域が Cys39— Cys65である請求項 39記載の治療方法。
[41] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側に 4〜40アミノ酸
、 C末端側に 4〜110アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 39又は 40記載の治 療方法。
[42] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 39又は 40記載の治療方法
[43] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 39又は 40記載の治療方法
[44] 前記部分ポリペプチド力 配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配 列からなり、へパリン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項 39又は 40記載の 治療方法。
[45] 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患が、虚血性疾患又は悪性腫瘍である請求 項 39〜44の ヽずれか 1項記載の治療方法。
[46] 肝細胞増殖因子の部分ポリペプチドであって、へパリン結合領域を含むポリべプチ ド、又は当該ポリペプチドのアミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は 付加したアミノ酸配列力 なり、へノ リン結合活性を有するポリペプチド又はその標識 体と、肝細胞増殖因子受容体との結合を阻害する物質を選択することを特徴とする、 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法。
[47] へノ リン結合領域が Cys39— Cys65である請求項 46記載のスクリーニング方法。
[48] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側に 4〜40アミノ酸
、 C末端側に 4〜110アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 46又は 47記載のス クリーニング方法。
[49] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜40アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 46又は 47記載のスクリー- ング方法。
[50] 前記部分ポリペプチド力 Cys39— Cys65を有し、その N末端側及び Z又は C末 端側に 4〜30アミノ酸を有するポリペプチドである請求項 46又は 47記載のスクリー- ング方法。
[51] 前記部分ポリペプチド力 配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 又は当該アミノ酸配列の一又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配 列からなり、へパリン結合活性を有する、ポリペプチドである請求項 46又は 47記載の スクリーニング方法。
[52] 肝細胞増殖因子受容体が関与する疾患が、虚血性疾患又は悪性腫瘍である請求 項 46又は 47記載のスクリーニング方法。
[53] 請求項 46〜52のいずれか 1項記載の方法によりスクリーニングされた肝細胞増殖 因子受容体が関与する疾患の予防又は治療薬。
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