WO2018012606A1 - 反応促進剤 - Google Patents

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敦 一柳
一彦 下地
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Kikkoman Corp
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    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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    • C09B31/025—Disazo dyes containing acid groups, e.g. -COOH, -SO3H, -PO3H2, -OSO3H, -OPO2H2; Salts thereof
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    • C09B67/00—Influencing the physical, e.g. the dyeing or printing properties of dyestuffs without chemical reactions, e.g. by treating with solvents grinding or grinding assistants, coating of pigments or dyes; Process features in the making of dyestuff preparations; Dyestuff preparations of a special physical nature, e.g. tablets, films
    • C09B67/0071—Process features in the making of dyestuff preparations; Dehydrating agents; Dispersing agents; Dustfree compositions
    • C09B67/0083—Solutions of dyes

Definitions

  • the present invention relates to a reaction accelerator, for example, a peroxidase reaction accelerator.
  • HRP horseradish peroxidase
  • EC 1.11.1.7 horseradish peroxidase
  • ELISA enzyme immunoassay
  • HRP relies primarily on natural raw materials and is purified after harvesting and extracting the cultivated wasabi radish (Armoracia rusticana). For this reason, HRP production is easily affected by weather factors such as drought and temperature changes. Therefore, it is desired to effectively use limited HRP resources.
  • An approach to this problem includes a method of producing peroxidase using genetic recombination technology in order to stabilize the production amount of peroxidase.
  • C1a which is a typical peroxidase
  • Recombinant expression using the C1a gene has been attempted in E. coli, but the expression level is not high, and is about 0.11 mg / L medium (Non-patent Document 2).
  • the recombinant expression level in yeast is reported to be about 5.3 mg / L (Non-patent Document 3).
  • Patent Document 1 describes a compound that shifts the detection wavelength of a phenothiazine derivative in a method of detecting a phenothiazine derivative dye in a reaction system by absorbance measurement.
  • the present invention provides a compound that promotes an enzyme reaction catalyzed by peroxidase, that is, a peroxidase reaction accelerator. Furthermore, this invention provides the composition containing a peroxidase reaction promoter. Furthermore, the present invention provides a method for measuring hydrogen peroxide using a peroxidase and a peroxidase reaction accelerator.
  • the present inventors have conducted extensive research, and as a result, have found a compound capable of accelerating the reaction of peroxidase, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following embodiments.
  • —C 1-6 alkyl —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —CO—NH 2 , —R 3 , —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 , —SO 3 X, — Selected from the group consisting of COOX, Y, Z;
  • X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li;
  • Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX;
  • Z is selected from the group consisting of —H, —C 1-6 alkyl, —O—C 1-6 alkyl, —SO 3 X;
  • —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —
  • R 1 and R 2 are each independently The method according to 1, wherein the compound is selected from the group consisting of: wherein X, Y, and Z are as defined in 1.
  • R 1 is R 2 is selected from the group consisting of The method according to 1 or 2, wherein the compound is selected from the group consisting of: wherein X is as defined in 1.
  • the peroxidase reaction accelerator represented by the formula (I) is a peroxidase reaction accelerator represented by the following formula: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —C 2-6 alkenyl, —C 2-6 alkynyl, ⁇ O, —OH, —O—C 1-6 alkyl, —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —SO 3 X
  • An aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted by one or more substituents selected from the group,
  • peroxidase reaction accelerator represented by formula (I) is a peroxidase reaction accelerator represented by any of the following formulas: [Where: Each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is independently selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, and —COOX].
  • the peroxidase reaction accelerator represented by the formula (I) is a peroxidase reaction accelerator represented by the following formula: [Where: R 1 is a benzene ring or naphthalene ring optionally substituted by one or more substituents, The substituents include —NO 2 , —SO 3 X, and Selected from the group consisting of X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li].
  • the compound represented by the formula (I) is a compound represented by the following formula (4- (phenylazo) phenol, CAS 1689-82-3), A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], Compound represented by the following formula [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], The method according to any one of 1 to 6, which is a compound selected from the group consisting of:
  • —C 1-6 alkyl —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —CO—NH 2 , —R 3 , —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 , —SO 3 X, — Selected from the group consisting of COOX, Y, Z;
  • X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li;
  • Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX;
  • Z is selected from the group consisting of —H, —C 1-6 alkyl, —O—C 1-6 alkyl, —SO 3 X;
  • —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —
  • R 1 and R 2 are each independently The peroxidase reaction promoter according to 8, wherein X, Y and Z are selected from the group consisting of:
  • R 1 is R 2 is selected from the group consisting of The peroxidase reaction promoter according to 8 or 9, wherein X is as defined in 8, wherein the promoter is selected from the group consisting of:
  • peroxidase reaction accelerator represented by the formula (I) is a peroxidase reaction accelerator represented by any of the following formulas: [Where: Each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is independently selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, and —COOX].
  • the compound represented by the formula (I) is a compound represented by the following formula (4- (phenylazo) phenol, CAS1689-82-3), A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], The peroxidase reaction promoter according to any one of
  • a composition for measuring hydrogen peroxide comprising peroxidase and the peroxidase reaction accelerator according to any one of 8 to 14.
  • composition according to 15, wherein the peroxidase is horseradish peroxidase.
  • an enzyme reaction catalyzed by peroxidase can be promoted.
  • the preoxidase amount of the peroxidase to the diagnostic reagent and the measurement reagent can be reduced as compared with the case where the peroxidase reaction accelerator of the present invention is not added.
  • the enzyme reaction is promoted with the same peroxidase prescription amount, it is possible to increase the sensitivity of measurement and / or shorten the reaction time.
  • the results of measuring the absorbance of the reaction solution (A 694 and A 751 ) over time for 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent-A are shown.
  • the horizontal axis is time (minutes), and the vertical axis is A 694/751 .
  • the A 694/751 shows the relationship between .DELTA.A 9min and .DELTA.A 10min.
  • the present invention provides a peroxidase reaction promoter.
  • the peroxidase reaction accelerator refers to a compound that promotes an enzyme reaction catalyzed by peroxidase. Promoting an enzyme reaction catalyzed by peroxidase means more hydrogen peroxide during the same reaction time when the peroxidase reaction accelerator of the present invention is present in the system as compared to when the peroxidase reaction accelerator is not present in the system. Is decomposed, or the hydrogen peroxide decomposition reaction is completed or almost completed in a shorter time.
  • Peroxidase catalyzes a redox reaction between hydrogen peroxide and a color former. By this reaction, the color former develops color.
  • the peroxidase whose reaction is promoted is horseradish peroxidase (HRP).
  • the peroxidase whose reaction is promoted is a heme-dependent peroxidase such as animal heme-dependent peroxidase, non-heme-dependent peroxidase, haloperoxidase such as lactoperoxidase, thiol peroxidase such as glutathione peroxidase, thyroid peroxidase, vanadium bromo Peroxidase, or chloride peroxidase, ascorbate peroxidase, myeloperoxidase, lignin peroxidase, soybean peroxidase, Arthromyces ramosus-derived peroxidase, Coprinus-derived peroxidase.
  • the present invention provides a measurement method using hydrogen peroxide decomposition, including a step of using peroxidase and a peroxidase reaction accelerator.
  • a peroxidase and a first reagent containing a peroxidase reaction accelerator are added to a sample containing hydrogen peroxide or a sample capable of producing hydrogen peroxide by an enzyme reaction or the like and heated.
  • the first reagent containing peroxidase and a peroxidase reaction accelerator may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing an individual component.
  • the second reagent containing the color former may be a single reagent or may contain other components.
  • the measurement may be qualitative or quantitative.
  • the measurement method of the present invention includes a step of adding and warming a first reagent containing a peroxidase and a color former to a second reagent containing a peroxidase reaction promoter, and a sample containing hydrogen peroxide or It includes a step of adding and heating a sample capable of generating hydrogen peroxide by an enzyme reaction or the like.
  • each component in the reagent may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing an individual component.
  • the above-mentioned first reagent and second reagent can be added as a single reagent in a single step. That is, in another embodiment, the measurement method of the present invention adds a measurement reagent containing a peroxidase, a peroxidase reaction accelerator, and a color former to a sample that can contain hydrogen peroxide or a sample that can produce hydrogen peroxide. A step of heating, and a step of measuring the absorbance of the reagent.
  • the measurement reagent containing peroxidase, a peroxidase reaction accelerator, and a color former may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • horseradish peroxidase can be used as the peroxidase.
  • the measurement method of the present invention may further include a step for generating hydrogen peroxide as a substrate for HRP.
  • Hydrogen peroxide production can be performed by any known reaction. For example, when hemoglobin A1c oxidase (A1cOX) capable of directly acting on HbA1c is added to a sample containing HbA1c, HbA1c is oxidized and hydrogen peroxide is generated.
  • A1cOX hemoglobin A1c oxidase
  • HRP may be free in the solution or may be immobilized on a solid phase.
  • the HRP may be used alone or linked to another compound or protein, such as an enzyme or an antibody.
  • the final concentration of the reaction accelerator of the present invention to be added to the sample solution is not particularly limited. For example, 0.01 to 200 mM, 0.02 to 150 mM, 0.03 to 100 mM, 0.04 to 80 mM, 0.05 to 60 mM, 0.06-50 mM, 0.08-40 mM, 0.1 mM-30 mM, 0.15-20 mM, 0.2-10 mM, 0.3-5 mM, 0.4-3 mM, eg 0.05-10 mM Range.
  • the final concentration of the peroxidase reaction promoter of the present invention to be added is, for example, 0.01 to 20 mM, for example 0.02 to 10 mM. It can be.
  • the final concentration of the reaction accelerator of the present invention added to the sample solution is not particularly limited. For example, 0.001 to 5% (w / v), 0.003 to 3% (w / v), 0.005 to 1 % (W / v), 0.01 to 0.5% (w / v), 0.02 to 0.3% (w / v), 0.03 to 0.1% (w / v) obtain.
  • the order of addition of the reaction accelerator and other enzymes and reagents is not limited, and may be added simultaneously or sequentially.
  • the total reaction time can be 60 minutes or less, 30 minutes or less, 20 minutes or less, preferably 15 minutes or less, and preferably about 10 minutes.
  • the heating after the addition of the first reagent can be 30 minutes or less, 20 minutes or less, 15 minutes or less, 10 minutes, for example, about 5 minutes
  • the heating after the addition of the second reagent is 30 minutes.
  • it may be about 20 minutes or less, 15 minutes or less, 10 minutes or less, for example, about 5 minutes.
  • the concentration of each component of the measurement reagent can be adjusted so that the reaction with peroxidase is completed or almost complete with respect to the concentration range of hydrogen peroxide contained in the sample or estimated to be generated in the sample. it can.
  • Completion of the reaction means that 100% of hydrogen peroxide contained in the sample or hydrogen peroxide potentially generated from the sample has reacted.
  • the reaction is almost completed, for example, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more of hydrogen peroxide contained in the sample, or hydrogen peroxide that can potentially be generated from the sample, It means that 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example, 99% or more reacted.
  • the measurement wavelength in the absorbance measurement can be selected according to the color former.
  • the measurement wavelength of absorbance can be, for example, 340 to 900 nm, 590 to 900 nm, 600 to 751 nm, and 610 to 730 nm.
  • measurements can be taken at two measurement wavelengths A 1 and A 2 to obtain the difference (sometimes referred to as A 1 -A 2 or A 1/2 ).
  • the two measurement wavelengths A 1 and A 2 can be any two wavelengths in the range of 590 to 900 nm.
  • the difference (A 1 -A 2 ) can be calculated with A 1 as the absorption wavelength of the dye and A 2 as the background wavelength.
  • the absorbance measurement wavelength may be 590 to 730 nm, for example 610 to 710 nm, when a phenothiazine derivative dye is used.
  • the background wavelength can be selected from a region in which the phenothiazine derivative dye hardly absorbs, for example, a range higher than 710 nm and not more than 900 nm.
  • a 1 A 694
  • a 2 A 751
  • a 694 -A 751 may be calculated from these.
  • Absorbance measurement may be performed using an automatic analyzer.
  • the color former is not particularly limited, but is preferably a compound whose absorbance is changed by the catalytic reaction of peroxidase in the presence of hydrogen peroxide.
  • the color former include 4-aminoantipyrine, for example, ADOS (N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine), ALOS (N-ethyl-N- (2-hydroxy-) 3-sulfopropyl) aniline), TOOS (sodium N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine), DA-67 (10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3, 7- Bis (dimethylamino) -phenocyanazine), DA-64 (N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) -diphenylamine) and the like.
  • ADOS N-ethy
  • ADOS, ALOS, and TOOS develop color when condensed with 4-aminoantipyrine.
  • DA-64 and DA-67 do not require 4-aminoantipyrine and develop color only by prescribing alone. In either case, the color reaction is catalyzed by peroxidase.
  • a color former methylene blue, 10- (acetylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine, 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine, 10- (phenyl) Carbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine, 10- (3- (methylcarboxyamino) -hexamethyl-amino) -phenothiazine, 10-((3- (methylcarboxyamino) -4-methyl-phenyl) -Amino) -phenothiazine, 10-((3- (methylcarboxyaminomethyl) -phenyl) -methylamino) -phenothiazine, 10- (1-naphthaleneamino) -phenothiazine, 10- (methyl) -phenothiazine,
  • the peroxidase is horseradish peroxidase (HRP).
  • the peroxidase is a heme-dependent peroxidase such as animal heme-dependent peroxidase, non-heme-dependent peroxidase, haloperoxidase such as lactoperoxidase (LPO), thiol peroxidase such as glutathione peroxidase (GluP), thyroid peroxidase (TPO). ), Vanadium bromoperoxidase (VBrPO), or chloride peroxidase (ClPO). These may be known or commercially available.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the peroxidase is a heme-dependent peroxidase such as animal heme-dependent peroxidase, non-heme-dependent peroxidase, haloperoxidase such as lactoperoxidase (LPO), thiol peroxidase such as gluta
  • HRP Horseradish peroxidase
  • Donor compounds are also called electron donors, and examples thereof include phenol, guaiacol, and pyrogallol compounds.
  • HRP peroxidase C1a
  • HRP has four intramolecular SS bonds.
  • calcium ions are essential for structure formation in HRP.
  • HRP requires a heme cofactor for enzyme activity.
  • the hydrogen peroxide decomposition reaction can be performed in a buffer solution.
  • the same buffer solution as the generation reaction can be used for the hydrogen peroxide decomposition reaction.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited, but can be, for example, 3 to 11, 4 to 10, 5 to 9, such as 6 to 8.
  • the reaction temperature can be, for example, 10 to 45 ° C., 10 to 40 ° C., 10 to 38 ° C., 20 to 37 ° C., for example 25 to 37 ° C.
  • the reaction time is 0.1 to 60 minutes, 0.1 to 30 minutes, 0.1 to 20 minutes, 0. It can be -15 minutes, 0.1-10 minutes, for example 0.1-5 minutes.
  • the peroxidase depends on the amount of hydrogen peroxide contained in the sample solution or the amount of a substrate capable of producing hydrogen peroxide, but for example, the final concentration is 0.01 to 300 KU / L, 0.01 to 100 KU / L, 0 It can be added to the sample to be 0.01 to 50 U / mL, 0.1 to 20 U / mL, 0.2 to 10 U / mL, 0.5 to 50 KU / L, for example 0.5 to 10 U / mL.
  • the activity “U” of peroxidase is defined as the amount of enzyme (POD) that produces 1 mg of purpurogallin in 20 seconds under the following reaction conditions as 1 kg of purpurogallin unit.
  • reagent A. 5% (W / V) pyrogallol aqueous solution B. 0.147M H 2 O 2 aqueous solution (Diluting 1.67 ml of 30% (W / V) H 2 O 2 solution with distilled water to 100 ml) C. 0.1M phosphate buffer, pH 6.0 (for reaction mixture and enzyme dilution) D. Enzyme solution of 2.0N H 2 SO 4 solution: Dissolve the enzyme preparation in 0.1M phosphate buffer, pH 6.0, previously ice-cooled, and dilute to 3.0-6.0 purpurogallin U / P with the same buffer. save
  • the absorbance at 420 nm is measured for this solution (ODtest). 4.
  • the blind test is prepared by allowing the reaction mixture 1 to stand at 20 ° C. for 20 seconds, adding 1.0 ml of H 2 SO 4 solution (D), mixing, and then adding 1.0 ml of the enzyme solution. This solution is subjected to ether extraction in the same manner as described above, and the absorbance is measured (OD blank).
  • the absorbance of the reaction solution indicates the amount of the color former that has developed color, from which the concentration of hydrogen peroxide in the sample can be determined.
  • the concentration of the substrate for generating the hydrogen peroxide can be determined.
  • a calibration curve can be created by measuring the absorbance of a standard substance containing hydrogen peroxide having a known concentration and plotting the relationship between the concentration and the absorbance. Next, the absorbance is measured for a sample containing hydrogen peroxide of unknown concentration or a substrate for generating hydrogen peroxide, and the concentration of hydrogen peroxide or a substrate for generating hydrogen peroxide is determined from the calibration curve. Yes.
  • the present invention provides a composition for measuring hydrogen peroxide containing a peroxidase reaction accelerator.
  • the composition may optionally include an enzyme capable of producing hydrogen peroxide, a peroxidase, a buffer, a stabilizer, a color former, a surfactant, and the like.
  • you may add the further enzyme and reagent for measuring compounds other than hydrogen peroxide to the composition of this invention.
  • buffer examples include N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, borate, citrate, dimethylglutamate, and tricine. , HEPES, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, phthalic acid, tartaric acid and the like.
  • a surfactant (n-octyl- ⁇ -D-glucoside, n-octyl- ⁇ -D-thioglucoside, n-type) may be used as a solubilizer, stabilizer, reactivity improver, HbA1c modifier, etc.
  • the peroxidase reaction promoter of the present invention includes a compound represented by the following formula (I).
  • R 1 and R 2 are each independently an aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted with one or more substituents, or a 10-membered condensed ring containing the carbocycle.
  • —C 1-6 alkyl —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —CO—NH 2 , —R 3 , —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 , —SO 3 X, — Selected from the group consisting of COOX, Y, Z;
  • X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li;
  • Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX;
  • Z is selected from the group consisting of —H, —C 1-6 alkyl, —O—C 1-6 alkyl, —SO 3 X;
  • —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —
  • the 6-membered monocycle may optionally be substituted by 1, 2, 3, 4 or 5 substituents, and the 10-membered condensed ring may optionally have 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 substituents. May be substituted.
  • aromatic monocyclic carbocycle examples include a benzene ring.
  • a condensed ring of an aromatic carbocycle and a carbocycle a naphthalene ring can be mentioned.
  • —C 1-6 alkyl includes methyl, ethyl, propyl (n-propyl, isopropyl), butyl (n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl), pentyl (n-pentyl, tert-pentyl, neopentyl) , Isopentyl, sec-pentyl, 3-pentyl), hexyl (n-hexyl, isohexyl, neohexyl) groups.
  • -C 2-6 alkenyl includes ethenyl group (vinyl group), 1-propenyl group, 2-propenyl group (allyl group), 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group, hexenyl group Etc.
  • Examples of —C 2-6 alkynyl include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, pentynyl group, hexynyl group and the like.
  • —O—C 1-6 alkyl is also referred to as C 1-6 alkoxy group, and examples thereof include linear or branched alkoxy groups such as methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy groups.
  • R 1 and R 2 are each independently an aromatic 6-membered monocyclic carbocycle (benzene ring) optionally substituted with one or more substituents.
  • R 1 is an aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted with one or more substituents
  • R 2 is a 10-membered carbocyclic fused ring ( Naphthalene ring).
  • R 1 and R 2 are each independently, A group selected from the group consisting of In the formula, X, Y and Z are as defined above.
  • R 1 is R 2 is selected from the group consisting of Wherein X is as defined above.
  • the peroxidase reaction accelerator of the present invention includes a peroxidase reaction accelerator represented by the following formula: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —C 2-6 alkenyl, —C 2-6 alkynyl, ⁇ O, —OH, —O—C 1-6 alkyl, —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —SO 3 X
  • An aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted by one or more substituents selected from the group, or a 10-membered conden
  • the peroxidase reaction accelerator of the present invention includes a peroxidase reaction accelerator represented by any of the following formulas: [Where: Each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is independently selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, and —COOX].
  • the peroxidase reaction accelerator of the present invention includes a peroxidase reaction accelerator represented by the following formula: [Where: R 1 is a benzene ring or naphthalene ring optionally substituted by one or more substituents, The substituents include —NO 2 , —SO 3 X, and Selected from the group consisting of X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li].
  • the peroxidase reaction accelerator of the present invention is a compound represented by the following formula (4- (phenylazo) phenol, CAS 1689-82-3), A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example, the following Alizarin Yellow GG (CAS584-42-9), A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example, the following Chrome Yellow (CAS6054-97-3), A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example, the following Direct Yellow 44 (CAS8005-52-5), A compound represented by the following formula: [Wherein each X is independently selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example
  • reaction accelerators of the present invention exclude compounds represented by the following formula (Tartrazine, CAS 1934-21-0):
  • the compounds of formula IV to formula VIII may be commercially available or their salts.
  • Other compounds of formulas I-III may be synthesized using conventional techniques or may be commercially available.
  • Whether or not a compound accelerates the hydrogen peroxide decomposition reaction by peroxidase can be evaluated by comparing the progress of the reaction when a candidate compound is added to the system with the progress of the reaction when no candidate compound is added. it can.
  • Peroxidase may be purified from natural raw materials, or commercially available products may be used.
  • Hydrogen peroxide sample of known concentration 0 to 0.0003% (w / v) Hydrogen peroxide first reagent-A (solution containing peroxidase and leuco dye) 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 0.2% (w / v) n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories) 0.067 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • HbA1c is measured according to the following procedure using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL). After adding 8 ⁇ l of ion-exchanged water to 96 ⁇ l of the first reagent-A and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, 24 ⁇ l of a hydrogen peroxide sample having a known concentration was added to perform a quantitative reaction of hydrogen peroxide at 37 ° C. for 5 minutes. Let it proceed for a minute.
  • the hydrogen peroxide concentration is plotted on the horizontal axis, and A 694/751 10 minutes after mixing the ion exchange water and the first reagent is plotted on the vertical axis, and the correlation between the hydrogen peroxide concentration and A 694/751 is plotted. Create a calibration curve to represent.
  • the same measurement as described above is performed using a hydrogen peroxide sample with an unknown concentration instead of a hydrogen peroxide sample with an unknown concentration.
  • the hydrogen peroxide concentration of the sample is determined using A 694/751 10 minutes after mixing the ion-exchanged water and the first reagent-A and the calibration curve created above.
  • Example 1 Measurement of absorbance when hydrogen peroxide detection reaction by peroxidase is completed
  • an amount of change in absorbance when hydrogen peroxide detection reaction is completed is determined using an excessive amount of peroxidase.
  • a reagent for measuring hydrogen peroxide having the following composition was prepared, and hydrogen peroxide was measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • sample 100 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 0.00012% (w / v) Hydrogen peroxide (first reagent-A) 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 0.2% (w / v) n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories) 0.067 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Second reagent) 0.48% (w / v) The compound of Comparative
  • Table 1 shows ⁇ A ( ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min ) 9 minutes and 10 minutes after mixing the second reagent and the first reagent-A.
  • FIG. 1 shows the relationship among A 694/751 , ⁇ A 9 min , and ⁇ A 10 min in Comparative Example 1.
  • ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min for the compound of the present invention there is no difference between ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min for the compound of the present invention and the comparative example. That is, it can be seen that 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent-B, the quantitative reaction of hydrogen peroxide is completed. Therefore, ⁇ A 10 min in each comparative example and the present invention was defined as ⁇ A ( ⁇ A 100% ) when the hydrogen peroxide quantitative reaction proceeded 100% under each condition.
  • Example 2 Confirmation of hydrogen peroxide detection reaction accelerating effect by peroxidase by the compound of the present invention
  • a small amount of peroxidase was used to accelerate the hydrogen peroxide detection reaction by the compound of the present invention. The degree was determined.
  • a reagent for measuring HbA1c having the following composition was prepared, and hydrogen peroxide was measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • sample 100 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 0.00012% (w / v) Hydrogen peroxide (first reagent-B) 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 0.2% (w / v) n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories) 0.013 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Second reagent) 0.48% (w / v) Any of the compound
  • ⁇ A calculated in this example was divided by 100% ⁇ A defined in Example 1 to calculate the degree of progress of the hydrogen peroxide detection reaction. 7.5 minutes and 10 minutes after mixing the second reagent and the first reagent-B (in other words, 2.5 minutes and 5 minutes after adding the sample, respectively) The progress is shown in Table 2.
  • the peroxidase reaction accelerator of the present invention By using the peroxidase reaction accelerator of the present invention, the amount of peroxidase prescribed for the hydrogen peroxide measuring reagent can be reduced. Moreover, the measurement sensitivity when the same amount of peroxidase is used can be improved.

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Abstract

ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物を提供する。　式(I)により表される化合物を含むペルオキシダーゼ反応促進剤及びこれを用いた過酸化水素測定方法。

Description

反応促進剤
　本発明は、反応促進剤、例えばペルオキシダーゼの反応促進剤に関する。
　ペルオキシダーゼは、種々の酵素測定法に広く利用されている。例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP)(EC1.11.1.7）は酵素免疫測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay、ELISA）や各種の診断キット、診断薬、検出反応等に広く利用されている。しかしながら、HRPは主として天然の原料に依存しており、栽培したワサビ大根（Armoracia rusticana）を収穫し、抽出を行った後に精製される。こうしたことから、HRPの生産量は干ばつや温度変化など天候的要因によって左右されやすい。そのため、限られたHRP資源を効果的に活用することが望まれている。
　この問題に対するアプローチとして、ペルオキシダーゼの生産量を安定させるべく、遺伝子組み換え技術を用いてペルオキシダーゼを産生する方法が挙げられる。例えば代表的なペルオキシダーゼであるC1aは、遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列が明らかになっている（非特許文献１）。C1a遺伝子を用いた組換え発現は大腸菌で試みられているが、その発現量は高いとは言えず、約0.11mg/L培地（非特許文献２）である。また、酵母での組換え発現量は約5.3mg/L（非特許文献３）との報告がある。しかしながら、この発現系ではHRPに糖鎖が付加されており、ELISAで使用する場合には抗体標識の際、糖鎖が抗体標識に影響を及ぼす可能性がある。そのため、組換え発現産物が天然の原料を置き換えるには至っていない。また、組換え発現の場合にも、依然としてペルオキシダーゼの消費量は大きく、ペルオキシダーゼの効果的な利用方法が望まれている。
　特許文献１は、反応系におけるフェノチアジン誘導体色素を吸光度測定により検出する方法において、フェノチアジン誘導体の検出波長をシフトさせる化合物を記載している。
国際公開第２００８／０９３７２２号パンフレット
Eur. J. Biochem.,1988, vol. 173, pp. 681-687 Biotechnol. Prog.,1999, vol. 15, pp. 467-471 Protein. Engineering, 2000, vol. 13,pp.377-384
　こうした問題に鑑み、本発明は、ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物、すなわちペルオキシダーゼ反応促進剤を提供する。さらに本発明はペルオキシダーゼ反応促進剤を含む組成物を提供する。さらに本発明はペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる過酸化水素測定方法を提供する。
　上記問題を解決するために、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことにペルオキシダーゼの反応を促進させることのできる化合物を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の実施形態を包含する。
[１]　ペルオキシダーゼ、及び、下記の式（I)で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、過酸化水素の測定方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[２]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは１に定義したとおりである、１に記載の方法。
[３]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 からなる群より選択され、Ｒ２が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 からなる群より選択され、式中、Ｘは１に定義したとおりである、１又は２に記載の方法。
[４]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、１に記載の方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[５]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、１に記載の方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 ［式中、
Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、それぞれ独立に、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
[６]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、１に記載の方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 ［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 からなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
[７]　式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS 1689-82-3）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
からなる群より選択される化合物である、１～６のいずれかに記載の方法。
[８]　式（I)により表される化合物を含む、ペルオキシダーゼ反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 ［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。 
[９]　式（I)により表される化合物において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは８に定義したとおりである、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
[１０]　式（I)により表される化合物において、Ｒ１が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 からなる群より選択され、Ｒ２が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 からなる群より選択され、式中、Ｘは８に定義したとおりである、８又は９に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
[１１]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。 　
[１２]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 ［式中、
Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、それぞれ独立に、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
[１３]　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 ［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 からなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
[１４]　式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS1689-82-3）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
からなる群より選択される化合物である、８～１３のいずれかに記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
[１５]　ペルオキシダーゼ及び８～１４のいずれかに記載のペルオキシダーゼ反応促進剤を含む、過酸化水素測定用組成物。
[１６]　ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、１５に記載の組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-138640号の開示内容を包含する。
　本発明の効果として、ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進することができる。これにより診断試薬や測定試薬へのペルオキシダーゼの処方量を、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤を添加しない場合と比較して、低減することができる。また同一のペルオキシダーゼの処方量であれば、酵素反応が促進されるため、測定の高感度化及び／又は反応時間短縮が可能となる。
希釈試料と第１試薬－Ａを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定した結果を示す。横軸は時間（分）であり、縦軸はＡ６９４／７５１である。また、Ａ６９４／７５１と、ΔＡ9ｍiｎ及びΔＡ10ｍiｎとの関係を示す。
　ある実施形態において、本発明は、ペルオキシダーゼ反応促進剤を提供する。ここでペルオキシダーゼ反応促進剤とは、ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物をいう。ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応を促進するとは、ペルオキシダーゼ反応促進剤が系に存在しない場合と比較して、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤が系に存在する場合、同一反応時間中により多くの過酸化水素が分解される、又は、より短時間で過酸化水素分解反応が完了する若しくはほぼ完了することをいう。
　ペルオキシダーゼとしては任意の公知のものを使用しうる。ペルオキシダーゼは、過酸化水素と発色剤との酸化還元反応を触媒する。この反応により発色剤が発色する。ある実施形態において、反応が促進されるペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。ある実施形態において、反応が促進されるペルオキシダーゼは、ヘム依存性ペルオキシダーゼ、例えば動物ヘム依存性ペルオキシダーゼ、非ヘム依存性ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えばラクトペルオキシダーゼ、チオールペルオキシダーゼ、例えばグルタチオンペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、又はクロリドペルオキシダーゼ、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、Arthromyces ramosus由来ペルオキシダーゼ、Coprinus由来ペルオキシダーゼである。本発明の反応促進剤という場合、特に断らない限りこれはペルオキシダーゼ反応促進剤を意味する。
　ある実施形態において、本発明は、ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、過酸化水素分解を利用した測定方法を提供する。ある実施形態において、本発明の測定方法は、過酸化水素を含む試料又は酵素反応等により過酸化水素が生成しうる試料にペルオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼ反応促進剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、発色剤を含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ反応促進剤を含む第１試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。発色剤を含む第２試薬は、単一の試薬でもよく、他の成分を含んでもよい。測定は定性的でも定量的でもよい。
　別の実施形態では、本発明の測定方法は、ペルオキシダーゼ反応促進剤を含む第２試薬にペルオキシダーゼ、及び発色剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、並びに、過酸化水素を含む試料又は酵素反応等により過酸化水素が生成しうる試料を添加し加温する工程を含む。やはり試薬中の各成分は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
　上記の第１試薬と第２試薬を一つの試薬として、単一工程にて添加することもできる。すなわち、別の実施形態において、本発明の測定方法は、過酸化水素を含み得る試料又は過酸化水素を生成しうる試料に、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ反応促進剤、及び発色剤を含む測定試薬を添加し加温する工程、並びに試薬の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ反応促進剤、及び発色剤を含む測定試薬は単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
　ある実施形態において、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いることができる。この場合、本発明の測定方法は、HRPの基質となる過酸化水素を生成するための工程をさらに有しうる。過酸化水素生成は、任意の公知の反応により行うことができる。例えばHbA1cに直接作用しうるヘモグロビンA1ｃオキシダーゼ（A1cOX）を、HbA1cを含む試料に添加すると、HbA1cが酸化され、過酸化水素が生じる。
　HRPは溶液中に遊離していてもよく、固相に固定化されたものでもよい。HRPは、単独でもよく、別の化合物やタンパク質、例えば酵素や抗体に連結されたものでもよい。
　試料溶液に添加する本発明の反応促進剤の終濃度は特に限定されず、例えば、０．０１～２００ｍＭ、０．０２～１５０ｍＭ、０．０３～１００ｍＭ、０．０４～８０ｍＭ、０．０５～６０ｍＭ、０．０６～５０ｍＭ、０．０８～４０ｍＭ、０．１ｍＭ～３０ｍＭ、０．１５～２０ｍＭ、０．２～１０ｍＭ、０．３～５ｍＭ、０．４～３ｍＭ、例えば０．０５～１０ｍＭの範囲であり得る。例えば試料溶液中に生成しうる過酸化水素の濃度が０～０．００５ｍＭの場合、添加する本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤の終濃度は、例えば、０．０１～２０ｍＭ、例えば０．０２～１０ｍＭとすることができる。試料溶液に添加する本発明の反応促進剤の終濃度は特に限定されず、例えば０．００１～５％（ｗ／ｖ）、０．００３～３％（ｗ／ｖ）、０．００５～１％（ｗ／ｖ）、０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）、０．０２～０．３％（ｗ／ｖ）、０．０３～０．１％（ｗ／ｖ）であり得る。なお、反応促進剤と他の酵素や試薬との添加順序は制限されず、同時でも逐次添加でもよい。
　ある実施形態において合計反応時間は、６０分以下、３０分以下、２０分以下、好ましくは１５分以下、好ましくは１０分程度とすることができる。例えば、上記の第1試薬添加後の加温を３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分、例えば５分程度とすることができ、上記の第2試薬添加後の加温を３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分、例えば５分程度とすることができる。また、試料に含まれる又は試料中に生成すると推定される過酸化水素の濃度範囲に対して、ペルオキシダーゼによる反応が完了するか又はほぼ完了するよう、測定試薬の各成分の濃度を調節することができる。反応が完了するとは、試料に含まれる過酸化水素、又は当該試料から潜在的に生成されうる過酸化水素の１００％が反応したことをいう。反応がほぼ完了するとは、試料に含まれる過酸化水素、又は当該試料から潜在的に生成されうる過酸化水素の例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上が反応したことをいう。
　吸光度測定における測定波長は、発色剤に応じて選択することができる。吸光度の測定波長は、例えば340～900nm、590～900nm、600～751nm、610～730nmでありうる。ある実施形態において、２つの測定波長A1及びA2で測定を行い、その差（A1-A2又はA1／2と表記することがある）を取得することもできる。２つの測定波長A1及びA2は、590～900nmの範囲の任意の２つの波長とすることができる。例えばA1を色素の吸光波長とし、A2をバックグラウンド波長とし、その差（A1-A2）を算出し得る。吸光度の測定波長は、フェノチアジン誘導体色素を用いる場合、590～730nm、例えば610～710nmでありうる。バックグラウンド波長は、フェノチアジン誘導体色素を用いる場合、当該フェノチアジン誘導体色素の吸収がほとんどない領域、例えば710nmより高く900nm以下である範囲から選択することができる。例えばA1＝A694とし、A2＝A751とし、これらからA694-A751を算出してもよい。吸収波長をA1＝A654としてもよい。吸光度測定は自動分析装置を用いて行ってもよい。
　発色剤は、特に限定されないが、過酸化水素存在下でのペルオキシダーゼの触媒反応により吸光度が変化する化合物が好ましい。発色剤としては、４－アミノアンチピリンや、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（Ｎ-エチル-Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル)－ｍ－トルイジンナトリウム）、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３、７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノシアジン）、ＤＡ－６４（Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４、４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４－アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ－６４、ＤＡ－６７は４－アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。さらに発色剤として、メチレンブルー、１０－（アセチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０－（フェニルカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０－（３－（メチルカルボキシアミノ）－ヘキサメチル－アミノ）－フェノチアジン、１０－（（３－（メチルカルボキシアミノ）－４－メチル－フェニル）－アミノ）－フェノチアジン、１０－（（３－（メチルカルボキシアミノメチル）－フェニル）－メチルアミノ）－フェノチアジン、１０－（１－ナフタレンアミノ）－フェノチアジン、１０－（メチル）－フェノチアジン、１０－（フェニルアミノ）－フェノチアジン、１０－（メチルアミノ）－フェノチアジン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、トルイジンブルーＯ、１，９－ジメチル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、メチレングリーン若しくはその塩、又はそのロイコ体等が挙げられるがこれに限らない。発色剤は、反応溶液における終濃度が、０.００１～１０ｍＭ、例えば０.００５～２ｍＭとなるよう添加しうる。
　測定反応に用いるペルオキシダーゼとしては任意の公知のものを使用しうる。ある実施形態において、ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）である。ある実施形態において、ペルオキシダーゼは、ヘム依存性ペルオキシダーゼ、例えば動物ヘム依存性ペルオキシダーゼ、非ヘム依存性ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えばラクトペルオキシダーゼ（LPO）、チオールペルオキシダーゼ、例えばグルタチオンペルオキシダーゼ（GluP）、甲状腺ペルオキシダーゼ（TPO）、バナジウムブロモペルオキシダーゼ（VBrPO）、又はクロリドペルオキシダーゼ（ClPO)である。これらは公知のものや市販のものを利用しうる。
　西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、以下の反応を触媒する。
ドナー化合物＋H2O2→酸化型ドナー化合物＋2H2O
　ドナー化合物は電子供与体ともいい、フェノール、グアイヤコール、ピロガロール系化合物等が挙げられる。HRPにはアイソザイムが存在するが、本明細書でHRPというとき、これは主要アイソザイムであるペルオキシダーゼC1aを指す。HRPは４つの分子内Ｓ－Ｓ結合を有する。またHRPは構造形成にカルシウムイオンが必須である。さらにHRPは酵素活性にヘム補因子を必要とする。
　過酸化水素分解反応は緩衝溶液中で行うことができる。過酸化水素生成反応も行う場合は、当該生成反応と同じ緩衝溶液を過酸化水素分解反応に使用しうる。反応溶液のｐＨは特に限定されないが、例えば３～１１、４～１０、５～９、例えば６～８でありうる。反応温度は、例えば、１０～４５℃、１０～４０℃、１０～３８℃、２０～３７℃、例えば２５～３７℃でありうる。反応時間は、０．１～６０分、０．１～３０分、０．１～２０分、０．～１５分、０．１～１０分、例えば０．１～５分であり得る。
　ペルオキシダーゼは、試料溶液中に含まれる過酸化水素、又は過酸化水素を生成しうる基質の量にもよるが、例えば終濃度が０.０１～３００ＫＵ/Ｌ、０.０１～１００ＫＵ/Ｌ、０.０１～５０Ｕ/ｍＬ、０.１～２０Ｕ/ｍＬ、０．２～１０Ｕ／ｍＬ、０.５～５０ＫＵ／Ｌ、例えば０.５～１０Ｕ／ｍＬとなるよう試料に添加することができる。ペルオキシダーゼの活性「Ｕ」は、次の反応条件下で、20秒間に1mgのプルプロガリン(purpurogallin)を生成する酵素(POD)量を1 プルプロガリン単位と定義する。
試薬：
A. 5%(W/V)ピロガロール水溶液
B. 0.147M H2O2水溶液(30%(W/V)H2O2溶液1.67mlを蒸留水で希釈して100mlとする)
C. 0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0 (反応混液及び酵素希釈用)
D. 2.0N H2SO4溶液
酵素溶液：酵素標品を予め氷冷した0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0で溶解し、同緩衝液で3.0～6.0 プルプロガリン U/Pに希釈して氷冷保存する
手順：
１　試験管(32φ×200mm)に下記反応混液を調製し、20℃で約５分間予備加温する
14.0ml 蒸留水
2.0ml ピロガロール水溶液(A)
1.0ml H2O2水溶液(B)
2.0ml リン酸緩衝液(C)
２　酵素溶液1.0mlを加え、反応を開始する
３　20℃で正確に20秒間反応させた後、H2SO4溶液(D)1.0mlを加えて反応を停止させる。反応停止後の混液から生成したプルプロガリンをエーテル15mlで抽出する。この操作を5回繰り返し、抽出液を合わせ、更にエーテルを加えて全量を100mlにする。この液について420nmにおける吸光度を測定する(ODtest)。
４　盲検は反応混液１を20℃で20秒間放置後、H2SO4溶液(D)1.0mlを加えて混和し、次いで酵素溶液1.0mlを加えて調製する。この液につき上記同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する(OD blank)。
計算式は次のとおりである：
U/ml＝ΔOD(OD test-OD blank)×希釈倍率／（0.117×1ml）
　　＝ΔOD×8.547×希釈倍率
U/mg ＝ U/ml×1/C
0.117: 1mg% プルプロガリンエーテル溶液の420nmにおける吸光度
C : 溶解時の酵素濃度(c mg/ml)
1プルプロガリン単位は13.5国際単位(o-ジアニシジンを基質とし、25℃の反応条件下)に相当する。
　吸光度測定には、任意の公知の分光光度計や検出機器を使用しうる。反応溶液の吸光度は発色した発色剤の量を示し、ここから試料中の過酸化水素濃度を決定しうる。また、過酸化水素を生成する反応と共役させた場合は、当該過酸化水素を生成するための基質の濃度を決定しうる。濃度が既知の過酸化水素を含む標準物質についての吸光度を測定し、濃度と吸光度の関係をプロットして検量線を作成しうる。次いで、濃度未知の過酸化水素、又は過酸化水素を生成するための基質を含む試料について吸光度を測定し、前記検量線から過酸化水素、又は過酸化水素を生成するための基質の濃度を決定しうる。
　ある実施形態において、本発明は、ペルオキシダーゼ反応促進剤を含む、過酸化水素測定用組成物を提供する。この組成物は場合により、過酸化水素を生成しうる酵素、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、安定化剤、発色剤、界面活性剤等を含み得る。また本発明の組成物に、過酸化水素以外の化合物を測定するためのさらなる酵素や試薬を追加してもよい。
　緩衝剤としては、例えば、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、ＨｂＡ１ｃ変性剤等として、界面活性剤（ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－マルトシド、１－ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ－１００、ブリッジ３５、ブリッジ５８、ツイーン８０、コール酸塩、ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコシド、３－オキサトリデシル－α－Ｄ－マンノシド、ｎ－ノニル－β－Ｄ－チオマルトシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトシド、トレハロースＣ８、トレハロースＣ１０、トレハロースＣ１２、トレハロースＣ１４、トレハロースＣ１６、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ－ＢＩＧＣＨＡＰ、ＭＥＧＡ－８、ＭＥＧＡ－９、ＭＥＧＡ－１０、ヘキサデシルピリジニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ノニルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、へキシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ－システイン等）、亜硝酸塩、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
　ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は以下の式（I)により表される化合物を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 ［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
　６員単環は場合により１、２、３、４若しくは５つの置換基により置換されていてもよく、１０員縮合環は場合により１、２、３、４、５、６若しくは７つの置換基により置換されていてもよい。
　芳香族の単環の炭素環としてはベンゼン環が挙げられる。芳香族の炭素環と炭素環との縮合環としてはナフタレン環が挙げられる。
　－Ｃ１－６アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル（n-プロピル、イソプロピル）、ブチル（n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル）、ペンチル（n-ペンチル、tert-ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、3-ペンチル）、ヘキシル（n-ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキシル）基が挙げられる。
　－Ｃ2－６アルケニルとしては、エテニル基（ビニル基）、１-プロペニル基、２-プロペニル基（アリル基）、１-ブテニル基、２-ブテニル基、３-ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などが挙げられる。
　－Ｃ2－６アルキニルとしては、エチニル基、１-プロピニル基、２-プロピニル基、１-ブチニル基、２-ブチニル基、３-ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などが挙げられる。
　－Ｏ－Ｃ１－６アルキルは、Ｃ１－６アルコキシ基ともいい、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基などの直鎖状又は分岐鎖状アルコキシ基が挙げられる。
　ある実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環（ベンゼン環）である。ある実施形態において、Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環であり、Ｒ２は１０員の炭素環の縮合環（ナフタレン環）である。
　ある実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 からなる群より選択される基である。式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは上記に定義したとおりである。
　ある実施形態において、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 からなる群より選択され、Ｒ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 からなる群より選択され、式中、Ｘは上記に定義したとおりである。
　ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を含む：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
　ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を含む：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 ［式中、
Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、それぞれ独立に、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
　ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を含む：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 ［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 からなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
　ある実施形態において、本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤は、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS 1689-82-3）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下のAlizarin Yellow GG（CAS584-42-9）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下のChrome Yellow（CAS6054-97-3）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下のDirect Yellow 44（CAS8005-52-5）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下の2-ヒドロキシ-1-(2-ヒドロキシ-4-スルホ-1-ナフチルアゾ)-3-ナフトエ酸（CAS 3737-95-9）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 からなる群より選択される化合物である。
　本発明の反応促進剤からは、以下の式により表される化合物(Tartrazine、CAS 1934-21-0)は除かれる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 　上記の式IV～式VIIIの化合物は市販されているものやそれらの塩を使用しうる。他の式I～IIIの化合物は慣用の手法を用いて合成するか、又は市販されているものを使用しうる。
　化合物がペルオキシダーゼによる過酸化水素分解反応を促進するか否かは、系に候補化合物を添加した場合の反応の進行と、添加しなかった場合の反応の進行とを比較することにより評価することができる。
（過酸化水素測定方法の例）
　本発明の過酸化水素測定試薬及び測定方法について例示する。ただし本発明はこれ限定されない。
　過酸化水素及び色素は市販のものを使用しうる。ペルオキシダーゼは、天然の原料から精製してもよく、又は市販品を使用してもよい。
　以下の過酸化水素測定用試薬を調製する。
濃度既知の過酸化水素試料
０～０．０００３％（ｗ／ｖ）　過酸化水素
第１試薬－Ａ（ペルオキシダーゼ、ロイコ色素を含む溶液）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
０．２％（ｗ／ｖ）　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．０６７Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
　Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して、次に示す手順に沿ってＨｂＡ１ｃを測定する。イオン交換水８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ａに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの濃度既知の過酸化水素試料を添加して過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。イオン交換水と第１試薬－Ａを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、それらの差であるＡ６９４／７５１を求める。横軸に過酸化水素の濃度を、縦軸にイオン交換水と第１試薬を混合してから１０分後のＡ６９４／７５１をプロットし、過酸化水素濃度とＡ６９４／７５１の相関性を表す検量線を作成する。
　次に、濃度既知の過酸化水素試料の代わりに、濃度未知の過酸化水素試料を用いて、上記と同様の測定を行う。イオン交換水と第１試薬－Ａを混合してから１０分後のＡ６９４／７５１と、上記で作成した検量線を用いて、試料の過酸化水素濃度を決定する。
　以下の実施例において本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。特に断らない場合、試薬は市販品を用いた。
［実施例１］ペルオキシダーゼによる過酸化水素検出反応が完遂した場合における吸光度の測定
　本実施例では、過剰量のペルオキシダーゼを用いて、過酸化水素検出反応が完遂した場合の吸光度変化量を決定する。
　以下の組成を有する過酸化水素測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して過酸化水素の測定を実施した。
（試料）
１００ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
０．０００１２％（ｗ／ｖ）　過酸化水素
（第１試薬－Ａ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
０．２％（ｗ／ｖ）　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．０６７Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
（第２試薬）
０．４８％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物（和光純薬工業）、本発明の化合物のいずれか一つ（いずれも東京化成工業）、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
　第２試薬８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ａに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの試料を添加して過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。第２試薬と第１試薬－Ａを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、第２試薬と第１試薬－Ａを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、第２試薬と第１試薬－Ａを混合してから４．８分後は、試料を添加する直前を表す。第２試薬と第１試薬－Ａを混合してから９分後、１０分後のΔＡ（ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎ）を表１に示す。また、一例として、比較例１における、Ａ６９４／７５１、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎの関係性を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
　表１に示した通り、本発明の化合物及び比較例について、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎに差は見られない。つまり、希釈試料と第１試薬－Ｂを混合してから１０分後には、過酸化水素の定量反応は完遂していることが分かる。そこで、各比較例、及び本発明におけるΔＡ１０ｍｉｎを、それぞれの条件において過酸化水素定量反応が１００％進行した時のΔＡ（ΔＡ１００％）と定義した。
［実施例２］本発明の化合物による、ペルオキシダーゼによる過酸化水素検出反応促進効果の確認
　次に本実施例では、少量のペルオキシダーゼを用いて、本発明の化合物による、過酸化水素検出反応の促進の度合いを決定した。
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して過酸化水素の測定を実施した。
（試料）
１００ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
０．０００１２％（ｗ／ｖ）　過酸化水素
（第１試薬－Ｂ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
０．２％（ｗ／ｖ）　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．０１３Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
（第２試薬）
０．４８％（ｗ／ｖ）　表２における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
　第２試薬８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの試料を添加して過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。第２試薬と第１試薬－Ｂを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、第２試薬と第１試薬－Ｂを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、第２試薬と第１試薬－Ｂを混合してから４．８分後は、試料を添加する直前を表す。
　次に、本実施例で算出されたΔＡを実施例１で定義したΔＡ１００％で割り、過酸化水素検出反応の進行度を算出した。第２試薬と第１試薬－Ｂを混合してから７．５分後及び１０分後（換言すると、それぞれ試料を添加してから２．５分及び５分後）の過酸化水素検出反応の進行度を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000072
　表２に示した通り、Tartrazine、Alizarin Yellow GG、Chrome Yellow、Direct Yellow44、4-(フェニルアゾ)フェノール、及び2-ヒドロキシ-1-(2-ヒドロキシ-4-スルホ-1-ナフチルアゾ)-3-ナフトエ酸は、ペルオキシダーゼを用いた過酸化水素検出反応を促進した。
　本発明のペルオキシダーゼ反応促進剤を用いることにより、過酸化水素測定試薬に処方するペルオキシダーゼの量を低減することができる。また、同量のペルオキシダーゼを用いた場合の測定感度を向上させることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　ペルオキシダーゼ、及び、下記の式（I)で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、過酸化水素の測定方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
    －Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  2. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは請求項１に定義したとおりである、請求項１に記載の方法。
  3. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤において、Ｒ１が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     からなる群より選択され、Ｒ２が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     からなる群より選択され、式中、Ｘは請求項１に定義したとおりである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    －Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  5. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、
    Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、それぞれ独立に、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
  6. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、
    Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
    前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     からなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
  7. 　式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS1689-82-3）、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    からなる群より選択される化合物である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　式（I)により表される化合物を含む、ペルオキシダーゼ反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     ［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
    －Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  9. 　式（I)により表される化合物において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは請求項８に定義したとおりである、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
  10. 　式（I)により表される化合物において、Ｒ１が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     からなる群より選択され、Ｒ２が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     からなる群より選択され、式中、Ｘは請求項８に定義したとおりである、請求項８又は９に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
  11. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     ［式中、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    －Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  12. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記のいずれかの式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     ［式中、
    Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、それぞれ独立に、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択される]。
  13. 　式（I)により表されるペルオキシダーゼ反応促進剤が、下記の式で表されるペルオキシダーゼ反応促進剤である、請求項８に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     ［式中、
    Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
    前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     からなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
  14. 　式（I)により表される化合物が、以下の式により表される化合物（4-(フェニルアゾ)フェノール、CAS1689-82-3）、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     ［式中、Ｘは、それぞれ独立に、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    からなる群より選択される化合物である、請求項８～１３のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤。
  15. 　ペルオキシダーゼ及び請求項８～１４のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ反応促進剤を含む、過酸化水素測定用組成物。
  16. 　ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１５に記載の組成物。
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