WO2017222042A1 - 眼用医薬組成物 - Google Patents

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WO2017222042A1
WO2017222042A1 PCT/JP2017/023170 JP2017023170W WO2017222042A1 WO 2017222042 A1 WO2017222042 A1 WO 2017222042A1 JP 2017023170 W JP2017023170 W JP 2017023170W WO 2017222042 A1 WO2017222042 A1 WO 2017222042A1
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pharmaceutical composition
composition according
density lipoprotein
compound
alkyl
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PCT/JP2017/023170
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華子 池田
村上　達也
彰 垣塚
長久 吉村
謙史 須田
裕子 三輪
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国立大学法人京都大学
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present application relates to an ophthalmic pharmaceutical composition characterized in that an active ingredient for the treatment and / or prevention of eye diseases is contained in high-density lipoprotein.
  • Certain 4-amino-naphthalene-1-sulfonic acid derivatives having VCP (valosin-containing protein) ATPase inhibitory activity have a cytoprotective effect on various cells through suppression of intracellular ATP decrease and suppression of endoplasmic reticulum stress.
  • -It has a cell death inhibitory effect (Patent Document 1) and is known to be effective for the treatment and / or prevention of eye diseases such as glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, or ischemic eye disease.
  • Non-patent Documents 5 and 6 As drug carriers currently applied in the ophthalmic field, liposomes for reaching the posterior segment are known (Patent Documents 5 and 6). The smaller the size of the liposome for reaching the posterior eye part, the higher the reachability to the posterior eye part is expected (Non-patent Document 3), and a report suggesting that the size of the eye drop drug carrier is desirably 20 nm or less (Non-Patent Document 4). However, there are few reports that liposomes with a size of less than 100 nm can generally be prepared.
  • Non-patent Document 5 A high density lipoprotein (cHDL) fused with a cytophilic peptide for the purpose of intracellular delivery of anticancer agents to malignant tumor cells is known (Non-patent Document 5). Lipoproteins with a particle size of 100 nm or less for the purpose of drug delivery as eye drops are not known.
  • the present application aims to provide an ophthalmic pharmaceutical composition comprising a 4-amino-naphthalene-1-sulfonic acid derivative.
  • the present application relates to the formula (I) contained in high density lipoprotein: [Where, Ra is halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl, aryl, halo or alkyl substituted aryl, alkoxy, hydroxy or carboxy substituted alkoxy, aryloxy, halo or alkyl substituted aryloxy, CHO, C (O) -alkyl, C (O ) -Aryl, C (O) -alkyl-carboxyl, C (O) -alkylene-carboxyester and cyano, m is an integer selected from 0 to 4] Or an ester, oxide, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof (hereinafter referred to as the pharmaceutical composition of the present application).
  • the present application provides an ophthalmic pharmaceutical composition comprising a 4-amino-naphthalene-1-sulfonic acid derivative.
  • FIG. 1 shows the results of the cytotoxicity test.
  • the figure shows the results of comparing cHDL and rHDL with HBSS / HEPES solution as a negative control and benzalkonium chloride as a positive control.
  • FIG. 2 is a fluorescence micrograph showing the results of a confirmation test for reaching the posterior eye tissue.
  • This figure shows the result of comparing cHDL and HBSS / HEPES solutions 30 minutes after instillation.
  • FIG. 3 shows the fluorescence intensity in the confirmation test for reaching the posterior eye tissue.
  • the figure shows the results compared to cHDL, rHDL, HBSS / HPES solution as a negative control, and DSPC ssLip, a small size liposome as a positive control.
  • FIG. 1 shows the results of the cytotoxicity test.
  • the figure shows the results of comparing cHDL and rHDL with HBSS / HEPES solution as a negative control and benzalkon
  • FIG. 4 shows the area of choroidal neovascularization after instillation of pazopanib in a model test (choroidal neovascularization model) of the posterior ocular drug delivery system.
  • This drawing shows the result of comparing pazopanib encapsulated in cHDL with pazopanib not encapsulated.
  • FIG. 5 shows the choroidal neovascular area after instillation of pazopanib-encapsulated cHDL in a model test (choroidal neovascularization model) of the posterior ocular drug delivery system.
  • This drawing shows the result of comparison between cHDL containing pazopanib and cHDL not containing pazopanib.
  • FIG. 6 is a fluorescence micrograph showing the results of a test for confirming the arrival of coumarin-6 encapsulated in cHDL using DMPC, DPPC, or DSPC as a phospholipid, and reaching the posterior eye tissue. This figure shows the result of each cHDL 30 minutes after instillation.
  • FIG. 7 shows the fluorescence intensity in the arrival confirmation test for the posterior segment tissue shown in FIG. This figure shows the results of comparing cHDL using DMPC, DPPC, or DSPC.
  • FIG. 8 shows inclusion in cHDL bound to TAT peptide, penetratin (PEN) peptide, or polyarginine (R8) as a cell membrane permeable peptide (also referred to herein as CPP), and HDL not bound to CPP.
  • 6 is a fluorescence micrograph showing the results of a confirmation test of the arrival of coumarin-6 on the posterior eye tissue. This figure shows the result of each cHDL 30 minutes after instillation.
  • FIG. 9 shows the fluorescence intensity in the arrival confirmation test for the posterior segment tissue shown in FIG. This figure shows the result of comparing cHDL bound with TAT peptide, penetratin (PEN) peptide, or polyarginine (R8) and cHDL not bound with CPP.
  • FIG. 10 is a fluorescence micrograph showing the results of a confirmation test of cHDL produced using various concentrations of coumarin-6 to reach the posterior eye tissue.
  • This drawing shows the result of comparison of cHDL solutions having a concentration of coumarin-6 of 0.03 mM, 0.05 mM, 0.1 mM or 0.2 mM 30 minutes after instillation.
  • FIG. 11 shows the fluorescence intensity in the arrival confirmation test for the posterior segment tissue shown in FIG.
  • This drawing shows the result of comparison of each cHDL when the concentration of coumarin-6 is 0.03 mM, 0.05 mM, 0.1 mM, or 0.2 mM.
  • FIG. 12 shows choroidal neovascular areas after instillation of cHDL, captisol, and ssLip encapsulating pazopanib, respectively, in a model test (angiogenesis model) of the posterior segment drug delivery system. This figure shows the result of comparing cHDL and captisol or cHDL and ssLip.
  • FIG. 13 shows the concentration of Compound 1 in the retina and vitreous in rats instilled with Compound 1 solution, DSPC-Compound 1 or DC (10) -Compound 1 (indicated as PBS, DSPC_HDL, and DC_HDL, respectively). Indicates.
  • Alkyl means a monovalent saturated aliphatic hydrocarbyl group having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl is, for example, straight and branched chain hydrocarbyl groups such as methyl (CH 3 —), ethyl (CH 3 CH 2 —), n-propyl (CH 3 CH 2 CH 2 —), isopropyl ((CH 3 ) 2 CH-), n-butyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2- ), isobutyl ((CH 3 ) 2 CHCH 2- ), sec-butyl ((CH 3 ) (CH 3 CH 2 ) CH-), t -Butyl ((CH 3 ) 3 C-), n-pentyl (CH 3 CH 2 CH 2 CH 2- ) and neopentyl ((CH 3 ) 3 CCH 2- ) are meant, but not limited to.
  • substituted means that one or more hydrogen atoms of the group are replaced by the same or different designated substituents.
  • Alkylene means a divalent saturated aliphatic hydrocarbyl group having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms. Alkylene groups include branched and straight chain hydrocarbyl groups.
  • Alkoxy means a group of —O-alkyl where alkyl is defined herein. Alkoxy includes, for example, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, t-butoxy, sec-butoxy and n-pentoxy.
  • Aryl means a monovalent aromatic carbocyclic group of from 6 to 14 carbon atoms having one ring (eg, phenyl) or multiple condensed rings (eg, naphthyl or anthryl). Aryl groups typically include phenyl and naphthyl. “Aryloxy” refers to the group —O-aryl where aryl is defined herein and includes, for example, phenoxy and naphthoxy.
  • Cyano refers to the group —CN.
  • Carboxyl or “carboxy” means —COOH or a salt thereof.
  • Carboxyester means a radical of —C (O) O-alkyl, where alkyl is defined herein.
  • Halo means halogens, including fluoro, chloro, bromo and iodo.
  • Hydroxy refers to the group —OH.
  • substituents not explicitly defined in this specification is performed by naming the terminal portion of the functional group and then naming the adjacent functional group toward the point of attachment.
  • substituent “arylalkyloxycarbonyl” refers to (aryl)-(alkyl) -O—C (O) —.
  • a compound of formula (I) as used herein means a compound included in formula (I) as described herein and a specific compound of formula (I). The term further includes stereoisomers and tautomers of the compound.
  • the compounds of formula (I), and their esters, oxides, prodrugs, pharmaceutically acceptable salts and solvates may be collectively referred to as “active ingredients of the present application”. is there.
  • a compound of Formula (I) or an ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof is used.
  • a compound of Formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof is used.
  • stereoisomer means compounds that differ in the chirality of one or more stereocenters.
  • Stereoisomers include enantiomers and diastereomers.
  • the compounds of formula (I) may contain asymmetrically substituted carbon atoms. Such asymmetrically substituted carbon atoms can result in compounds that exist in other stereoisomeric forms that can be defined as absolute stereochemistry, such as enantiomers, diastereomers, and (R)-or (S) -forms.
  • absolute stereochemistry such as enantiomers, diastereomers, and (R)-or (S) -forms.
  • tautomer refers to another form of a compound that differs in the position of the proton, such as enolketo and imine enamine tautomers, or a ring —NH— group and a ring ⁇ N— group. By tautomeric forms of heteroaryl groups containing ring atoms attached to both.
  • ester means an ester that is hydrolyzed in vivo, including those that are easily degraded in the human body to release the parent compound or a salt thereof.
  • Suitable ester groups are, for example, those derived from pharmaceutically acceptable aliphatic carboxylic acids, in particular alkanoic acids, alkenoic acids, cycloalkanoic acids and alkanedioic acids, where each alkyl or alkenyl group is preferably 6 Having no more than carbon atoms).
  • Specific examples of esters include formate, acetate, propionate, butyrate, acrylic acid and ethyl succinate.
  • oxide means that the nitrogen ring atom of the heteroaryl group is oxidized to form an N-oxide.
  • prodrug as used herein is within the scope of reasonable medical judgment and is used in contact with human or animal tissue without undue toxicity, irritation, allergic response, etc. Means a prodrug of a compound suitable for use at a reasonable benefit / risk ratio and effective for its intended use, as well as the zwitterionic form of the compound, if possible.
  • Prodrugs are compounds that are rapidly transformed in vivo to yield the parent compound of the above formula, for example by hydrolysis in blood. General explanations are T. Higuchi and V. Stella, Pro drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the ACS Symposium Series and Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, Americanocimoneus , 1987 (both are hereby incorporated by reference).
  • “Pharmaceutically acceptable salt” means pharmaceutically acceptable salts derived from a variety of organic and inorganic counterions well known in the art, such as sodium, potassium, calcium, magnesium, ammonium and tetraalkyl. Salts with ammonium, as well as salts with organic or inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, tartaric acid, mesylic acid, acetic acid, maleic acid and oxalic acid.
  • a pharmaceutically acceptable salt of a compound means a pharmaceutically acceptable salt, including a salt of an oxide, ester or prodrug of a compound of formula (I).
  • the term “pharmaceutically acceptable salt” includes non-toxic acid or alkaline earth metal salts of compounds of formula (I). These salts can be prepared in situ during the final isolation and purification of the compound of formula (I) or by reacting the base or acid functionality separately with a suitable organic or inorganic acid or base, respectively.
  • Typical salts are: acetate, adipate, alginate, citrate, aspartate, benzoate, benzenesulfonate, bisulfate, butyrate, camphorate, camphorsulfonate, Digluconate, cyclopentanepropionate, dodecyl sulfate, ethane sulfonate, glucoheptanoate, glycerophosphate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, fumarate, hydrochloride, hydrogen bromide Acid salt, hydroiodide salt, 2-hydroxyethanesulfonate, lactate, maleate, methanesulfonate, nicotinate, 2-naphthalenesulfonate, oxalate, pamoate, pectinic acid Salt, persulfate, 3-phenylpropionate, picrate, pivalate, propionate, succinate, sulf
  • Basic nitrogen-containing groups also include alkyl halides such as methyl, ethyl, propyl and butyl chlorides, bromides and iodides; dialkyl sulfates such as dimethyl, diethyl, dibutyl and diamyl sulfate, decyl, lauryl and myristyl. And quaternized with reactants such as long chain halides such as stearyl chloride, bromide and iodide, aralkyl halides such as benzyl and phenethyl chloride and others. Thereby a product is obtained which dissolves or disperses in water or oil.
  • alkyl halides such as methyl, ethyl, propyl and butyl chlorides, bromides and iodides
  • dialkyl sulfates such as dimethyl, diethyl, dibutyl and diamyl sulfate, decyl, lauryl and
  • Base addition salts may be used in situ during the final isolation and purification of the compound of formula (I), or with a carboxylic acid group and a suitable base such as a pharmaceutically acceptable metal cation hydroxide, carbonate or bicarbonate or ammonia, Alternatively, it can be produced by separately reacting with an organic primary, secondary or tertiary amine.
  • Pharmaceutically acceptable salts include alkali and alkaline earth metal cations, such as sodium, lithium, potassium, calcium, magnesium, aluminum salts, and the like, as well as non-toxic ammonium, quaternary ammonium and amine cations, such as limited Not including, but limited to, ammonium, tetramethylammonium, tetraethylammonium, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, triethylamine, ethylamine, and the like.
  • Other representative organic amines useful for the formation of base addition salts include diethylamine, ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, piperazine and the like.
  • solvate means a compound as defined above combined with a stoichiometric or non-stoichiometric amount of solvent.
  • Solvates include solvates of pharmaceutically acceptable salts of the compounds of formula (I).
  • the solvent is volatile, non-toxic and / or acceptable for administration to humans in trace amounts.
  • the preferred solvate is a hydrate.
  • a compound of formula (I) or any ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof may be processed in vivo by metabolism in the human or animal body or cell to yield a metabolite.
  • metabolite means a derivative of any formula that is produced in a subject after administration of the parent compound. Derivatives may be produced from the parent compound by biochemical transformations such as oxidation, reduction, hydrolysis or conjugation in a variety of subjects, including, for example, oxide and demethylated derivatives. Metabolites of compounds of formula (I) can be identified using routine techniques known in the art. For example, Bertolini, G. et al., J. Med. Chem.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halo-substituted alkyl and alkoxy. In certain embodiments, in Formula (I), each Ra is independently selected from the group consisting of halo and alkyl. In one embodiment, in Formula (I), there are two Ra, one is halo and the other is alkyl.
  • the pharmaceutical composition comprises the following compound included in formula (I) or an ester, oxide, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof: 4-Amino-3- (6-phenylpyridin-3-ylazo) naphthalene-1-sulfonic acid; 4-Amino-3- (6-p-toluylpyridin-3-ylazo) naphthalene-1-sulfonic acid; 4-Amino-3- (6-m-toluylpyridin-3-ylazo) naphthalene-1-sulfonic acid; 4-Amino-3- (6-o-toluylpyridin-3-ylazo) naphthalene-1-sulfonic acid; 4-Amino-3- (6-biphenyl-2-ylpyridin-3-ylazo) naphthalene-1-sulfonic acid; 3- [6- (2-acetylphenyl) pyridin-3-ylazo] -4-a
  • the active ingredient has the formula 4-amino-3- [6- (4-fluoro-2-methylphenyl) pyridin-3-ylazo] naphthalene-1-sulfonic acid sodium salt represented by: or its free form, or its ester, oxide, Prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate.
  • high density lipoprotein means a lipoprotein including apolipoprotein AI (apoA-I), which is chemically synthesized from naturally occurring HDL or apolipoprotein and phospholipid. Any of reconstructed (ie, artificial) HDL manufactured by a technique or a genetic engineering technique may be used.
  • HDL contains apolipoprotein and phospholipid as main components.
  • HDL is obtained as a cytophilic peptide-binding HDL (also referred to as cHDL herein) by binding a cytophilic peptide (also referred to as CP herein) as a functional peptide. be able to.
  • HDL may contain a fluorescent labeling substance as an optional component.
  • the density of HDL in the case of naturally occurring HDL, is in the range of about 1.063 to 1.210 g / mL (see Antonio M. Gotto, Jr. et al. MethodsmolEnzymol.mol1986; 128: 3-41). is there.
  • it typically follows the size of naturally occurring HDL, but can be adjusted to the desired density at the time of manufacture, for example, the density of natural low density lipoprotein (LDL) of about 1 A range of 0.019 to about 1.063 g / mL (see Antonio M. Gotto, Jr. et al., Ibid.) May also be included.
  • LDL natural low density lipoprotein
  • the particle size of HDL is in the range of about 5 to 12 nm in the case of naturally derived HDL (see the same document by Antonio M. Gotto, Jr. et al.).
  • the size is typically in accordance with the size of naturally occurring HDL, but can be adjusted to a desired particle size at the time of manufacture.
  • the diameter of natural LDL is about 18 to about
  • the range of 25 nm can also be included and can be adjusted to particle sizes of less than about 1000 nm, less than about 200 nm, or less than about 100 nm.
  • HDL is expected to increase reachability to the posterior segment as the size is small, and therefore the particle size is typically less than about 100 nm in diameter, preferably Is from about 10 to about 50 nm, more preferably from about 10 to about 20 nm.
  • particle size means the volume average diameter measured by the dynamic light scattering method, and is an ordinary measuring device such as a commercially available Nanotrac UPA-EX250 particle size analyzer (Nikkiso Co., Ltd .; Tokyo, Japan) Can be measured by.
  • Apolipoprotein as a constituent means a protein portion other than lipids constituting lipoprotein.
  • the term “apolipoprotein” includes apolipoproteins generally known to be contained in natural lipoproteins and variants thereof.
  • the apolipoprotein is, for example, a protein belonging to the group of apolipoproteins A to E or a variant thereof, and preferably apolipoprotein AI (apoA-I), apolipoprotein A-II (apoA-II), apolipoprotein C (ApoC), apolipoprotein E (apoE), or a variant thereof.
  • the HDL in the present application includes apoA-I or a variant thereof, and may further include another apolipoprotein.
  • a variant of an apolipoprotein means a variant or analog having a function equivalent to that of an apolipoprotein (for example, a lipid binding function) (that is, a functional equivalent).
  • apolipoprotein variants include partial fragments of apolipoproteins and combinations thereof.
  • Variants of apoA-I include an N-terminal globular domain-deficient apoA-I that lacks an N-terminal globular domain (eg, N-terminal 1-43 amino acids), such as an N-terminal 43 amino acid-deficient apoA-I, or N-terminal 44 amino acid deletion apoA-I is mentioned.
  • Phospholipid as a constituent means a lipid having one or more phosphate ester moieties.
  • the phospholipid in the present application includes phospholipids generally known to be contained in natural lipoproteins.
  • the phospholipid is preferably a phospholipid known to be contained in natural HDL, but is not limited thereto.
  • Examples of the phospholipid include sphingophospholipid having a sphingosine skeleton and glycerophospholipid having a glycerin skeleton.
  • sphingophospholipids include sphingomyelin, sphingosine-1-phosphate, and ceramide.
  • examples of the glycerophospholipid include phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, and phosphatidylethanolamine, and phosphatidylcholine is preferable.
  • the glycerophospholipid is preferably a glycerophospholipid having a long chain alkyl group.
  • the acyl group in the acyl group has about 9 to about 23 carbon atoms (that is, a fatty acid group having about 10 to about 24 carbon atoms), preferably about 11 Preferred are glycerophospholipids of from about 17 (ie fatty acid groups having from about 12 to about 18 carbon atoms), more preferably from about 13 to about 17 (ie fatty acid groups having from about 14 to about 18 carbon atoms).
  • the fatty acid group may contain one or more carbon-carbon unsaturated double bonds, but preferably does not contain it.
  • phosphatidylcholines include dilauroyl phosphatidylcholine (DLPC), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), egg phosphatidylcholine (PC), and 1-palmitoyl-2- Examples include, but are not limited to oleoyl phosphatidylcholine (POPC). Phospholipids can be used alone or in combination of two or more.
  • DLPC dilauroyl phosphatidylcholine
  • DMPC dimyristoyl phosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoyl phosphatidylcholine
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • PC egg phosphatidylcholine
  • 1-palmitoyl-2- Examples include, but are not limited to oleoyl phosphati
  • HDL may contain additional lipids in addition to phospholipids.
  • Further lipids include, for example, cholesterol, 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniopropane (DOTAP), N- (2,3-dioleoyloxypropan-1-yl) -N, N, N-trimethyl chloride Ammonium (DOTMA), 1,2-dioleyl-3-dimethylammonium propane (DODAP), N, N-dimethyl- (2,3-dioleyloxy) propylamine (DODMA), 2,3-dioleyloxy-N -[2- (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetic acid (DOSPA), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide (DMRIE) 1,2-dioleoyloxypropyl-3-diethylhydroxyethy
  • the ratio of additional lipids to total lipids in HDL can be, for example, about 0-80 mol%, about 0.001-80 mol%, about 1-50%, or about 3-25 mol%.
  • Suitable phospholipid and additional lipid combinations and their molar ratios are appropriately selected based on the properties of the phospholipid and the additional lipid (eg, degree of unsaturation, charge, molecular weight, hydrophobicity, solubility, etc.).
  • the ratio of DC-Chol to total lipid in HDL is about 3 to 28 mol%, about 5 to 25 mol%, or about 7 to 15 It can be mol%, for example about 10 mol%.
  • cytophilic peptide means a peptide exhibiting cell affinity capable of binding to the cell membrane and then translocating into the cell.
  • Cell affinity includes, but is not limited to, cell membrane permeability, cell adhesion, vascular endothelial cell accumulation, endosome escape, cell nucleus accumulation, mitochondrial accumulation, and the like.
  • the cytophilic peptide is a cell membrane permeable peptide (also referred to herein as CPP).
  • Cytophilic peptides include peptides derived from natural proteins and artificially produced peptides (eg, chimeric peptides).
  • Cytophilic peptides include basic cytophilic peptides, amphiphilic cytophilic peptides, and hydrophobic cytophilic peptides due to the chemical properties of their amino acid sequences.
  • Basic cell affinity peptides are preferred, and basic cell membrane permeable peptides are more preferred.
  • a basic cell affinity peptide e.g., TAT protein (T rans- a ctivator of t ranscription protein) derived TAT peptide of HIV-1 virus, derived from Drosophila penetratin (PEN), polyarginine (e.g., arginine 8 Isomer (R8)), polyhistidine (eg, histidine 16 mer (H16)), antibacterial peptide-derived LL-37 peptide), amphiphilic cytophilic peptide (eg, transportan which is a chimeric peptide) And Pep-1 peptide), and a hydrophobic cell affinity peptide (for example, a mitochondrial targeting signal (MTS) that is a peptide derived from a signal peptide of a membrane protein).
  • TAT protein T rans- a ctivator of t ranscription protein
  • PEN Drosophila penetratin
  • polyarginine e.g., arginine 8 Isomer (
  • the cytophilic peptide is at least one selected from the group consisting of TAT peptide, penetratin, polyarginine (R8), LL-37, transportan, Pep-1 and MTS.
  • the affinity peptide is at least one selected from the group consisting of TAT peptide, penetratin and polyarginine (R8)
  • the cytophilic peptide is from the group consisting of penetratin and polyarginine (R8).
  • the cytophilic peptide is penetratin.
  • the cytophilic peptide forms a cytophilic peptide-bound HDL (cHDL) by binding to HDL.
  • the binding technique may be a chemical synthesis technique (eg, a coupling method) or a biological technique (eg, a genetic engineering method).
  • the functional group on HDL that binds the cytophilic peptide and the position thereof can be appropriately modified.
  • the cytophilic peptide is preferably bound on the apolipoprotein, more preferably at the C-terminus of the apolipoprotein.
  • the apolipoprotein to which the cell affinity peptide is bound may be a fusion protein of the cell affinity peptide and the apolipoprotein.
  • a fusion protein can be obtained by binding and expressing a gene encoding a cytophilic peptide and a gene encoding an apolipoprotein by a genetic engineering method.
  • the fusion protein of a cell affinity peptide and an apolipoprotein can be a fusion protein in which one cell affinity peptide and one apolipoprotein are fused.
  • Examples of genetic engineering techniques include DNA editing using methylase or DNA polymerase I / DNA ligase, and polymerase chain reaction (PCR). Specifically, a cell affinity peptide gene having a restriction enzyme recognition sequence added at both ends is inserted into a restriction enzyme recognition site of an E. coli expression vector using DNA ligase. A vector having a cytophilic peptide gene inserted in the forward direction is selected by DNA sequence analysis. Next, a gene in which a restriction enzyme recognition sequence is added to both ends of the apolipoprotein gene is prepared by PCR, and inserted into a restriction enzyme recognition site of an E. coli expression vector using DNA ligase.
  • a gene for a polypeptide in which an apolipoprotein is fused with a cytophilic peptide can be prepared.
  • a cell affinity peptide gene in which the restriction enzyme Pst ⁇ ⁇ ⁇ I, Xba I recognition site of the E. coli expression vector pCOLD I is added with a Pst I recognition site at the 5 ′ end and an Xba I recognition sequence at the 3 ′ end, for example, penetratin gene is DNA ligase. insert.
  • the apoA-I gene for example, a gene in which a restriction enzyme Kpn I recognition sequence is added to the 5 ′ end side of the N-terminal globular domain-deficient apoA-I gene and a restriction enzyme Pst ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ I recognition sequence is added to the 3 ′ end side is subjected to PCR. And is inserted between the Kpn I and Pst I recognition sites of the above-described pCOLD I using a DNA ligase.
  • a gene for a fusion protein in which a cytophilic peptide is fused to the C-terminal side of apoA-I can be prepared.
  • HDL can contain one or more active ingredients of the present application per molecule.
  • HDL may contain, for example, about 3 to about 15 moles, or about 4 to about 12 moles of active ingredient of the present invention per mole of apolipoprotein.
  • the HDL can include, for example, about 50 to about 500 moles, about 70 to about 300 moles, or about 80 moles to about 180 moles of phospholipid per mole of apolipoprotein.
  • the HDL includes phospholipids and additional lipids
  • the HDL contains phospholipids, for example, from 50 to about 500 moles, from about 70 to about 300 moles, from about 80 moles to about 180 moles per mole of apolipoprotein. Or about 100 moles to about 130 moles.
  • the HDL can be, for example, about ⁇ 30 to about 30 mV, about ⁇ 20 to about 20 mV, about ⁇ 15 to about 15 mV, about ⁇ 10 to about 10 mV, about ⁇ 5 to about 5 mV, about ⁇ 2 to about 2 mV. Or an electrokinetic potential (zeta potential) of about ⁇ 1.5 to 1.5 mV.
  • the HDL has a positive zeta potential, eg, a zeta potential of 0 to about 30 mV, 0 to about 15 mV, 0 to about 5 mV, 0 to about 2 mV, or 0 to about 1.5 mV.
  • the zeta potential can be measured by an ordinary measurement apparatus such as a commercially available Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Malvern, U. K.) by light scattering electrophoresis or the like.
  • the present application provides HDL that can be used as a carrier for posterior segment drug delivery, and includes HDL containing additional lipids in addition to apolipoproteins and phospholipids.
  • the “rear eye part drug delivery carrier” means a carrier for delivering a drug to the rear eye part.
  • a posterior segment drug delivery system can be constructed by combining the posterior segment drug delivery carrier with a drug effective for diagnosis, prevention or treatment of posterior segment disease.
  • ophthalmic pharmaceutical composition means a pharmaceutical composition for topical administration to the eye.
  • the ophthalmic pharmaceutical composition is preferably an eye drop administered non-invasively.
  • aqueous eye drops for example, aqueous eye drops, in-use eye drops, suspension eye drops, or oily eye drops / It can be an eye ointment.
  • the pharmaceutical composition of the present application may contain pharmaceutically acceptable additives for ophthalmic use, such as buffering agents, tonicity agents, pH adjusting agents, surfactants, stabilizers, preservatives and the like.
  • the additive is not particularly limited as long as it does not interfere with the effect of the pharmaceutical composition of the present application, and can be appropriately blended within a concentration range that does not cause problems such as eye irritation according to various uses.
  • the buffering agent include phosphate (for example, sodium phosphate), acetate (for example, sodium acetate) and the like.
  • the isotonic agent include inorganic salts such as sodium chloride and glycerin such as concentrated glycerin.
  • the pH adjuster include organic acids such as boric acid.
  • Surfactants include nonionic surfactants (eg, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbitan monooleate), amphoteric surfactants (eg, glycine type such as alkyldiaminoethylglycine, lauryl dimethyl). Betaine acetate forms such as aminoacetic acid betaine), anionic surfactants (eg, sulfonates such as sodium tetradecene sulfonate, alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate), and cationic surfactants (eg, Alkyl quaternary ammonium salts such as benzalkonium chloride), and nonionic surfactants are preferred.
  • nonionic surfactants eg, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polyoxyethylene sorbitan monooleate
  • amphoteric surfactants eg, glycine type such as alkyldiamin
  • the stabilizer examples include organic acid salts (for example, sodium citrate, mannitol) and the like.
  • examples of the preservative include benzalkonium chloride and paraben.
  • the pharmaceutical composition of the present application may contain additives such as a thickener (for example, sodium alginate), a chelating agent (for example, sodium edetate), and a fragrance (for example, menthol).
  • the pH of the pharmaceutical composition of the present application is usually preferably in the range of 4 to 8 as long as it is within the range acceptable for ophthalmic preparations.
  • Further active ingredients include, for example, drugs for the treatment of glaucoma or ocular hypertension (e.g. pilocarpine, distigmine, carteolol, timolol, betaxolol, nipradilol, levobunolol, bunazosin, dipivefrin, brimonidine, isopropylunoprostone, latanoprost, travoprost , Tafluprost, bimatoprost, lipazil, dorzolamide, brinzolamide, etc.), vascular regression drugs (eg, ranibizumab, pegaptanib, aflibercept, etc.), but are not limited thereto.
  • drugs for the treatment of glaucoma or ocular hypertension e.g. pilocarpine, distigmine, carteolol, timolol, betaxolol, nipradilol, levobunolol,
  • Additional active ingredients can be present in the pharmaceutical composition of the present application and may be provided separately from the pharmaceutical composition of the present application.
  • combining” or “in combination with” a pharmaceutical composition of the present application and an additional active ingredient includes not only the use of dosage forms containing all ingredients and the use of a combination of dosage forms containing each ingredient separately. As long as they are used for the treatment and / or prophylaxis of eye diseases, it also means that each component is administered simultaneously or sequentially, or any component is delayed. Two or more additional active ingredients can be used in combination with the pharmaceutical composition of the present application.
  • Treatment of ocular diseases including but not limited to laser surgery, surgery, photodynamic therapy, etc., may be performed before, after, or simultaneously with administration of the pharmaceutical composition of the present application.
  • the ophthalmic disease can be treated by administering the pharmaceutical composition of the present application to a patient suffering from an ocular disease, particularly a posterior ocular disease.
  • “treating” or “treatment” refers to reducing or eliminating the cause of a disease, delaying or stopping the progression of the disease, and / or symptoms of the disease in a subject suffering from the disease. Means mitigation, mitigation, improvement or elimination.
  • Ophthalmic diseases can be prevented by administering the pharmaceutical composition of the present application to patients who are at risk of suffering from eye diseases, particularly posterior eye diseases.
  • prevent or “prevention” means preventing the onset of the disease in a subject who is not afflicted with the disease but who is at risk of being afflicted.
  • Subjects to be prevented include subjects with any abnormality in the eye tissue (eg, high intraocular pressure, drusen accumulation under the retinal pigment, myopia), genetic risk of eye disease (eg, causative genes such as retinitis pigmentosa and glaucoma, Subjects with a genetic polymorphism disease genotype that has been shown to have a high risk of disease, other diseases that increase the prevalence of eye diseases (eg, metabolic diseases such as diabetes, dyslipidemia, Subjects suffering from thrombosis, autoimmune diseases, renal dysfunction, hypertension), subjects using drugs that induce eye diseases (eg, steroids, etc.).
  • any abnormality in the eye tissue eg, high intraocular pressure, drusen accumulation under the retinal pigment, myopia
  • genetic risk of eye disease eg, causative genes such as retinitis pigmentosa and glaucoma
  • Subjects with a genetic polymorphism disease genotype that has been shown to have a high risk of disease
  • eye diseases that can be treated and / or prevented by the pharmaceutical composition of the present application include glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, ischemic eye disease, and myopia due to myopia.
  • Glaucoma includes normal-tension glaucoma or glaucoma that is refractory to intraocular pressure-lowering therapy.
  • Retinitis pigmentosa includes hereditary retinitis pigmentosa and sporadic retinitis pigmentosa.
  • Age-related macular degeneration includes wet age-related macular degeneration and atrophic age-related macular degeneration.
  • Ischemic eye diseases include all eye diseases resulting from or associated with ischemia of the eye, such as central retinal artery occlusion, branch retinal artery occlusion, ischemic optic neuropathy, central retinal vein occlusion, Includes retinal vein branch occlusion, diabetic retinopathy and ocular hypertension or optic neuropathy or optic neuropathy.
  • Ischemic eye disease can be acute and can involve ischemia-reperfusion injury.
  • a method for the treatment and / or prophylaxis of ophthalmic diseases comprising administering the pharmaceutical composition of the present application to a subject is provided.
  • the use of the pharmaceutical composition of the present application in the treatment and / or prevention of eye diseases is provided.
  • HDL contained in the pharmaceutical composition of the present application is, for example, i) a step of producing crude HDL by mixing an apolipoprotein solution and a liposome containing phospholipid (and further lipid if necessary) (Spontaneous interaction method); and ii) removing crude HDL by ultracentrifugation. Purification to obtain HDL, In which the active ingredient of the present application is contained in an apolipoprotein solution, in a liposome, or mixed with the crude HDL obtained in step i) prior to step ii). .
  • HDL contained in the pharmaceutical composition of the present application is, for example, i) micellized by mixing phospholipids (and optionally additional lipids) and cholic acid (eg, at the phase transition temperature of the phospholipids), mixing the resulting micelle solution with the apolipoprotein solution, Ii) to produce crude HDL (cholate-dialysis method); and ii) purification of crude HDL by ultracentrifugation to obtain HDL,
  • the active ingredient of the present application is micellized with a phospholipid or the like, included in an apolipoprotein solution, or mixed with the crude HDL obtained in step i) prior to step ii). be able to.
  • HDL typically, for example, several to several thousand times mole, several tens to several hundred times mole, such as about 5 times to about 2000 times mole, about 1 mole of apolipoprotein, 20-fold to about 500-fold moles, about 30-fold to about 200-fold moles of phospholipid are used as starting materials.
  • HDL typically, for example, about 0.01 to about 15 g, about 0.05 to about 10 g, about 0.07 to about 7 g, or about 0.1 to 1 g of apolipoprotein.
  • ⁇ 3.5 g of the active ingredient of the present application is used as starting material. In some embodiments, from about 0.3 to about 3.5 g of the active ingredient of the present application may be used as a starting material.
  • the obtained HDL can be adjusted to fine particles using a gel filtration chromatography method, an ultracentrifugation method, an ultrasonic irradiation method, a freeze-thaw method, a homogenization method, or the like, but is not limited to these methods.
  • the present application provides a cytophilic peptide-bound high density lipoprotein (cHDL) ⁇ which is apolipoprotein, phospholipid and cytophilic peptide (wherein the phospholipid is a fatty acid having 12 to 18 carbon atoms).
  • the glycerophospholipid of the group and the cytophilic peptide is a basic cell membrane permeable peptide) and the particle size is less than about 100 nm in diameter (eg, about 10-20 nm in diameter) ⁇
  • a pharmaceutical composition for the treatment and / or prophylaxis of eye diseases comprising the active ingredient of the present application contained therein.
  • the present application provides a cytophilic peptide-bound high density lipoprotein (cHDL) ⁇ which comprises an N-terminal globular domain-deficient apoA-I, DSPC, DC-Chol and penetratin and has a particle size of about 10-20 nm in diameter.
  • cHDL cytophilic peptide-bound high density lipoprotein
  • a pharmaceutical composition for treatment and / or prevention of at least one disease selected from the group consisting of glaucoma, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration and ischemic eye disease, comprising the active ingredient of the present application contained therein I will provide a.
  • Formula (I) contained in high-density lipoprotein [Where, Ra is halo, hydroxy, alkyl, halo substituted alkyl, aryl, halo or alkyl substituted aryl, alkoxy, hydroxy or carboxy substituted alkoxy, aryloxy, halo or alkyl substituted aryloxy, CHO, C (O) -alkyl, C (O ) -Aryl, C (O) -alkyl-carboxyl, C (O) -alkylene-carboxyester and cyano, m is an integer selected from 0 to 4] Or an ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the cell affinity peptide is a cell membrane permeable peptide.
  • the cytophilic peptide is at least one selected from the group consisting of TAT peptide, penetratin, polyarginine (R8), LL-37, transportan, Pep-1 and MTS, [2] or [ 3] The pharmaceutical composition according to [3].
  • the high density lipoprotein comprises at least one phospholipid selected from the group consisting of dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) and distearoylphosphatidylcholine (DSPC). 6] The pharmaceutical composition according to any one of the above.
  • the high-density lipoprotein comprises distearoylphosphatidylcholine (DSPC) and 3 ⁇ - [N- (N′N′-dimethylaminoethyl) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol), and DC relative to the total amount of DSPC and DC-Chol
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • DC-Chol 3 ⁇ - [N- (N′N′-dimethylaminoethyl) carbamoyl] cholesterol
  • DC-Chol 3 ⁇ - [N- (N′N′-dimethylaminoethyl) carbamoyl] cholesterol
  • the high density lipoprotein comprises a fusion protein of penetratin and N-terminal globular domain-deficient apolipoprotein AI, distearoylphosphatidylcholine (DSPC) and DC-cholesterol, according to any one of [1] to [14]
  • the pharmaceutical composition according to any one of [1] to [16], wherein the high-density lipoprotein has a diameter of about 10 to 20 nm.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo, hydroxy, alkyl, halo-substituted alkyl and alkoxy.
  • Composition [19] The pharmaceutical composition according to any one of [1] to [18], wherein in formula (I), each Ra is independently selected from the group consisting of halo and alkyl.
  • each Ra is independently selected from the group consisting of halo and alkyl.
  • two Ra are present, one is halo and the other is alkyl.
  • the compound of formula (I) is of the formula
  • the high density lipoprotein comprises from about 3 to about 15 moles of the compound of formula (I) or an ester, oxide, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof per mole of apolipoprotein [1] ] Thru
  • HDL high density lipoprotein
  • a fusion protein was produced in which a TAT peptide having a cell-affinity action was linked to the C-terminus of apoA-I lacking the N-terminal 43 amino acids lacking the N-terminal globular domain (1-43 amino acids).
  • a cHDL was prepared by mixing the fusion type apoA-I with a liposome having a particle size of about 100 nm composed of dimistril phosphatidylcholine (DMPC) and the fluorescent labeling substance coumarin-6 (Spontaneous interaction method).
  • DMPC dimistril phosphatidylcholine
  • cHDL was purified by ultracentrifugation.
  • rHDL reconstituted HDL containing no cytophilic peptide was prepared.
  • ssLip small uni-lamella vesicle
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • the obtained cHDL, rHDL and liposome were examined for protein, phospholipid and coumarin-6 content, particle size, and surface potential.
  • the protein concentration was determined by the Lowry method, the phospholipid concentration was determined by the C test (C test Wako (registered trademark) ), and the coumarin-6 concentration was determined by fluorescence spectroscopy using a fluorescence spectrophotometer FluoroMax.
  • the particle size and surface charge state were determined as volume average diameter (MV) and zeta potential using dynamic light scattering (DLS), respectively.
  • Nanotrac UPA-EX250 particle size analyzer Nikkiso Co., Ltd .; Tokyo, Japan
  • Zetasizer Nano Z Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Malvern, U. K.) were used.
  • the sample was diluted with a 100% PBS solution, and when measuring the zeta potential, the sample was diluted 10-fold with ultrapure water.
  • HDL having a particle diameter of 10 to 20 nm could be obtained by the Spontaneous interaction method and the ultracentrifugation method.
  • Table 1 shows the size of each HDL and the concentrations of the proteins, phospholipids and coumarin-6 constituting it, and the zeta potential.
  • Example 2 Toxicity assessment (method) of HDL
  • cytotoxicity tests were performed using cultured human cornea cells. Enzymatic activity of cells treated with cHDL, rHDL, and control benzalkonium chloride was measured by a colorimetric method. CCK-8 (Cell Counting Kit-8) was used as a detection reagent.
  • a 6 to 8 week-old C57BL6 mouse retina was irradiated with an argon laser to produce a choroidal neovascularization.
  • 3 ⁇ L of ophthalmic solution was instilled three times a day, and the eyeball was removed one week later.
  • the choroidal neovascularization was stained by immunostaining, and the area of the choroidal neovascularization was measured under a confocal microscope by the flat mount method.
  • cHDL was prepared by the following method. Carbon numbers of fatty acid groups of DMPC, DPPC, and DSPC are 14, 16, and 18, respectively. Specifically, cHDL was prepared by preparing micelles consisting of coumarin-6, phospholipid and cholic acid in advance, and mixing the micelle with the same fusion type apoA-I as in Experiment 1 at the phase transition temperature of phospholipid. (Cholic acid dialysis method).
  • phase transition temperature of each phospholipid is as follows: DMPC is 24 ° C., DPPC is 40-41 ° C., and DSPC is 55 ° C.
  • concentration of coumarin-6 was unified to 0.05 ⁇ mol / ml.
  • the obtained cHDL was purified by ultracentrifugation according to the method of Experiment 1. According to the method of Experiment 1, the contents of the obtained cHDL protein, phospholipid and coumarin-6, and the particle size were measured.
  • cHDL By cholic acid dialysis and ultracentrifugation, cHDL having a particle diameter of 10 to 20 nm could be obtained.
  • the particle size of each cHDL and each concentration of protein, phospholipid and coumarin-6 constituting the cHDL are as shown in Table 2 below.
  • the obtained cHDL was purified by ultracentrifugation according to the method of Experiment 1. According to the method of Experiment 1, the content, particle size, and surface potential of the obtained cHDL protein, phospholipid, and coumarin-6 were measured.
  • cHDL By cholic acid dialysis and ultracentrifugation, cHDL having a particle diameter of 10 to 20 nm could be obtained.
  • Table 3 shows the particle size of each cHDL, the concentrations of the protein, phospholipid and coumarin-6 constituting the cHDL, and the zeta potential.
  • the fluorescence intensity of the inner retina was compared by confocal microscopy. The results are shown in FIG. The fluorescence intensity increased in the order of PEN> R8 ⁇ TAT> CPP. In addition, the fluorescence intensity results were quantified according to the method of Experiment 3 (FIG. 9). This result shows that the above-mentioned HDL allows coumarin-6 to reach the inner layer of the retina. In particular, cHDL bound with a cytophilic peptide can reach coumarin-6 to the retina to a very high degree. . It was also suggested that PEN improves the retina arrival efficiency most.
  • pazopanib dissolved in DMSO was mixed with ssLip prepared in the same manner as in Experiment 1, and then purified by removing unencapsulated pazopanib using a gel filtration column to prepare a comparative ssLip solution.
  • the mixture was dialyzed overnight against a PBS solution, and the precipitate was removed by ultracentrifugation according to Experiment 1 (HDL purification).
  • the obtained HDL and Compound 1 were mixed at various weight ratios at 55 ° C. for 30 minutes.
  • the cHDL was purified using a gel filtration column, and the contents of the fusion protein and Compound 1 were measured using the Lowry method and the colorimetric method (472 nm), respectively.
  • Table 6 shows the zeta potential and the particle sizes before and after purification of the obtained DOTAP-compound 1, DC-compound 1 and DSPC-compound 1.
  • the numbers in parentheses after DOTAP and DC indicate the mole percent of DOTAP or DC-cholesterol relative to the total amount of DSPC and DOTAP or DC-cholesterol.
  • DOTAP-Compound 1 had a very large particle size and varied.
  • DC-compound 1 has a relatively large particle size, but when purified by ultracentrifugation, particles having a particle size within the theoretical HDL value were obtained.
  • a fusion protein in which penetratin was connected to the C-terminus of N-terminal 44 amino acid-deficient apoA-I was dissolved in 4 M urea (buffer solution: PBS) at a concentration of 1.5 mg / ml, and Compound 1 was dissolved in this (750 ⁇ g fusion) 750 ⁇ g of compound 1) per protein.
  • the mixture was dialyzed overnight against PBS solution and the precipitate was removed by ultracentrifugation (286,000 g, 106 min) (HDL purification). The HDL fraction was collected and diluted and concentrated (Amicon Ultra 100K). PBS was used as a diluent.
  • DSPC-compound 1 was also prepared in the same manner as described above.
  • the animal was euthanized and the eyeball was removed.
  • the removed eyeball is immediately washed thoroughly with physiological saline, frozen at -80 ° C, and then the eyeball is halved with a scalpel blade in the coronal direction, using a glass with a sherbet-like vitreous body.
  • the retina was detached and collected.
  • the insulator touching the eyeball wall and the intraocular tissue was used separately.
  • the collected samples were weighed together for 6 eyes, frozen at ⁇ 80 ° C., and homogenized for measurement of Compound 1 concentration.
  • the frozen sample was crushed with a multi-bead shocker, and 5 times the sample weight of pure water was added and mixed.
  • the concentration of Compound 1 in the sample was measured by LC_MSMS.
  • the pharmaceutical composition of the present application can reach the posterior eye segment by topical administration of a compound of formula (I) or an ester, oxide, prodrug, pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof. Therefore, the risk of side effects due to systemic administration can be reduced.
  • the pharmaceutical composition of the present application can be instilled, but instillation is safer and simpler than intravitreal injection, which is also used for local administration to the eye.

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Abstract

本願は、高密度リポタンパク質中に含まれる式（Ｉ）の化合物、または、それらのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む眼用医薬組成物を提供する。式（Ｉ）中、Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、ｍは０～４から選択される整数である。

Description

眼用医薬組成物
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１６－１２５８６０号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本願は、眼疾患の処置および／または予防に有効な成分を高密度リポタンパク質中に含むことを特徴とする、眼用医薬組成物に関する。
　ＶＣＰ（valosin-containing protein）ＡＴＰａｓｅ阻害活性を有するある種の４－アミノ－ナフタレン－１－スルホン酸誘導体は、細胞内ＡＴＰ減少の抑制、小胞体ストレスの抑制を介し、種々の細胞に対する細胞保護効果・細胞死抑制効果を有し（特許文献１）、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性または虚血性眼疾患などの眼疾患の処置および／または予防に有効であることが知られている（特許文献２～４、非特許文献１および２）。これらの疾患では後眼部に存在する網膜組織や視神経が損傷を受けるが、一般的に、点眼により薬剤を後眼部に到達させることは困難である。実際に、腹腔内投与等により全身投与された４－アミノ－ナフタレン－１－スルホン酸誘導体が眼疾患の処置および／または予防に有効であることは報告されているが、単独で点眼投与された場合に、十分な量で後眼部へ到達することは確認されていない。
　近年、後眼部への薬物送達効率の向上を目的として、薬物キャリアを用いた点眼用ドラッグデリバリーの開発が試みられている。現在眼科領域に応用されている薬物キャリアとしては、後眼部到達用リポソームが知られている（特許文献５および６）。後眼部到達用リポソームのサイズが小さいほど、後眼部への到達性が高まることが期待されており（非特許文献３）、点眼用ドラッグキャリアのサイズは２０ｎｍ以下が望ましいことを示唆する報告もある（非特許文献４）。しかしながら、一般に１００ｎｍ未満のサイズのリポソームを作製できるという報告は少ない。
　悪性腫瘍細胞への抗癌剤細胞内デリバリーを目的とする、細胞親和性ペプチドを融合した高密度リポタンパク質（ｃＨＤＬ）が知られている（非特許文献５）。点眼剤としての薬物デリバリーを目的とする、粒径１００ｎｍ以下のリポタンパク質は知られていない。
国際公開第２０１２／０１４９９４号パンフレット 国際公開第２０１２／０４３８９１号パンフレット 国際公開第２０１４／１２９４９５号パンフレット 国際公開第２０１５／１２９８０９号パンフレット 国際公開第２００９／１０７７５３号パンフレット 特開２０１１－２４６４６４号公報
池田華子 他著、Sci Rep 4, 5970, 2014 中野紀子 他著、Heliyon 2, e00096, 2016 廣中耕平 他著、J Controlled Release 2009; 136: 247-53 Kompella, U. B. 他著、Molecular Vision 2006; 12: 1185-1198 村上達也 他著、Nanomedicine (London, U. K.) 2010; 5: 867-79
　本願は、４－アミノ－ナフタレン－１－スルホン酸誘導体を含む眼用医薬組成物を提供することを目的とする。
　本願は、高密度リポタンパク質中に含まれる式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
の化合物、または、それらのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む眼用医薬組成物（以下、本願の医薬組成物と称する）を提供する。
　本願により、４－アミノ－ナフタレン－１－スルホン酸誘導体を含む眼用医薬組成物が提供される。
図１は、細胞毒性試験の結果を示す。本図面は、ｃＨＤＬおよびｒＨＤＬを、ネガティブコントロールとしてのＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液、およびポジティブコントロールとしての塩化ベンザルコニウムと比較した結果を示す。 図２は、後眼部組織への到達確認試験の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。本図面は、点眼３０分後のｃＨＤＬおよびＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液を比較した結果を示す。 図３は、後眼部組織への到達確認試験における蛍光強度を示す。本図面は、ｃＨＤＬ、ｒＨＤＬ、ネガティブコントロールとしてのＨＢＳＳ／ＨＰＥＳ溶液、およびポジティブコントロールとしての小サイズのリポソームであるＤＳＰＣ ｓｓＬｉｐと比較した結果を示す。 図４は、後眼部薬物デリバリーシステムのモデル試験（脈絡膜血管新生モデル）における、パゾパニブ（Pazopanib）点眼後の脈絡膜新生血管面積を示す。本図面は、ｃＨＤＬ中に内包されたパゾパニブと、内包されていないパゾパニブとを比較した結果を示す。 図５は、後眼部薬物デリバリーシステムのモデル試験（脈絡膜血管新生モデル）における、パゾパニブ内包ｃＨＤＬの点眼後の脈絡膜新生血管面積を示す。本図面は、パゾパニブを内包するｃＨＤＬと、内包していないｃＨＤＬとを比較した結果を示す。 図６は、リン脂質としてＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＳＰＣを使用したｃＨＤＬに内包させたクマリン－６の、後眼部組織への到達確認試験の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。本図面は、点眼３０分後の各ｃＨＤＬの結果を示す。 図７は、図６に示す後眼部組織への到達確認試験における蛍光強度を示す。本図面は、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＳＰＣを使用したｃＨＤＬを比較した結果を示す。 図８は、細胞膜透過性ペプチド（本明細書中、ＣＰＰとも記載する）としてＴＡＴペプチド、ペネトラチン（ＰＥＮ）ペプチド、またはポリアルギニン（Ｒ８）を結合したｃＨＤＬ、およびＣＰＰを結合していないＨＤＬに内包させたクマリン－６の、後眼部組織への到達確認試験の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。本図面は、点眼３０分後の各ｃＨＤＬの結果を示す。 図９は、図８に示す後眼部組織への到達確認試験における蛍光強度を示す。本図面は、ＴＡＴペプチド、ペネトラチン（ＰＥＮ）ペプチド、またはポリアルギニン（Ｒ８）を結合したｃＨＤＬと、ＣＰＰを結合していないｃＨＤＬとを比較した結果を示す。 図１０は、種々の濃度のクマリン－６を使用して製造したｃＨＤＬの、後眼部組織への到達確認試験の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。本図面は、点眼３０分後の、クマリン－６の濃度が０.０３ｍＭ、０.０５ｍＭ、０.１ｍＭまたは０.２ｍＭのｃＨＤＬ溶液を比較した結果を示す。 図１１は、図１０に示す後眼部組織への到達確認試験における蛍光強度を示す。本図面は、クマリン－６の濃度が０.０３ｍＭ、０.０５ｍＭ、０.１ｍＭまたは０.２ｍＭの場合について各ｃＨＤＬを比較した結果を示す。 図１２は、後眼部薬物デリバリーシステムのモデル試験（血管新生モデル）において、それぞれパゾパニブを内包するｃＨＤＬ、カプチゾール、およびｓｓＬｉｐの点眼後の脈絡膜新生血管面積を示す。本図面は、ｃＨＤＬとカプチゾール、またはｃＨＤＬとｓｓＬｉｐとを対比した結果を示す。 図１３は、化合物１溶液、ＤＳＰＣ－化合物１またはＤＣ（１０）－化合物１（図面中、それぞれＰＢＳ、ＤＳＰＣ＿ＨＤＬ、ＤＣ＿ＨＤＬと示す）を点眼したラットにおける化合物１の網膜・硝子体中への到達濃度を示す。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「２０±１０％～３０±１０％」を含むものとする。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　「アルキル」は、１～１０個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を有する、１価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキルは、例えば直鎖および分枝鎖ヒドロカルビル基、例えばメチル（ＣＨ３－）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２－）、ｎ－プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ－）、ｎ－ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２－）、ｓｅｃ－ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ－）、ｔ－ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ－）、ｎ－ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－）およびネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２－）を意味するが、これらに限定されない。
　基の接頭語「置換」は、当該基の１個以上の水素原子が、同一または異なる指定する置換基によって置換されていることを意味する。
　「アルキレン」は、１～１０個の炭素原子、好ましくは１～６個の炭素原子を有する、２価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。アルキレン基は、分枝鎖および直鎖ヒドロカルビル基を含む。
　「アルコキシ」は、－Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている）の基を意味する。アルコキシは、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシおよびｎ－ペントキシを含む。
　「アリール」は１個の環（例えばフェニル）または複数の縮合環（例えばナフチルまたはアントリル）を有する６～１４個の炭素原子の１価芳香族性炭素環式基を意味する。アリール基は典型的には、フェニルおよびナフチルを含む。
　「アリールオキシ」は、－Ｏ－アリール（ここで、アリールは本明細書に定義されている）の基を意味し、例えばフェノキシおよびナフトキシを含む。
　「シアノ」は、－ＣＮの基を意味する。
　「カルボキシル」または「カルボキシ」は－ＣＯＯＨまたはその塩を意味する。
　「カルボキシエステル」は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている）の基を意味する。
　「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含むハロゲンを意味する。
　「ヒドロキシ」は－ＯＨの基を意味する。
　特に定めのない限り、本明細書において明示的に定義されていない置換基の命名法は、官能基の末端部分を命名し、次いで結合点に向かって隣接する官能基を命名して行う。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は、（アリール）－（アルキル）－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－を意味する。
　上記定義は許容されない置換パターン（例えば５個のフルオロ基で置換されたメチル）を含むことを意図しないと理解される。かかる許容されない置換パターンは、当業者に周知である。
　「式（Ｉ）の化合物」は、本明細書において使用するとき、本明細書に記載の式（Ｉ）に含まれる化合物、および式（Ｉ）の具体的な化合物を意味する。該用語はさらに、化合物の立体異性体および互変異性体を含む。本明細書において、式（Ｉ）の化合物、並びに、それらのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩および溶媒和物を総称して、「本願の有効成分」と記載することがある。ある実施態様では、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を用いる。ある実施態様では、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を用いる。
　本明細書において使用するとき、用語「立体異性体」は、１個以上の立体中心のキラリティーが異なる化合物を意味する。立体異性体はエナンチオマーおよびジアステレオマーを含む。式（Ｉ）の化合物は、非対称的に置換された炭素原子を含んでいる場合がある。かかる非対称的に置換された炭素原子は、エナンチオマー、ジアステレオマーおよび（Ｒ）－または（Ｓ）－型のような絶対立体化学として定義され得る他の立体異性形態で存在する化合物をもたらし得る。その結果、化合物のすべてのかかる可能な異性体、それらの光学的に純粋な形態における個々の立体異性体、それらの混合物、ラセミ混合物（またはラセミ体）、ジアステレオマーの混合物ならびに１個のジアステレオマーが意図される。用語「Ｓ」および「Ｒ」立体配置は、本明細書において使用するとき、IUPAC 1974 RECOMMENDATIONS FOR SECTION E, FUNDAMENTAL STEREOCHEMISTRY, Pure Appl. Chem. 45:13 30 (1976) によって定義されるとおりである。
　本明細書において使用するとき、用語「互変異性体」は、エノールケトおよびイミンエナミン互変異性体のようなプロトンの位置が異なる化合物の別の形態または環－ＮＨ－基および環＝Ｎ－基の両方と結合した環原子を含むヘテロアリール基の互変異性型を意味する。
　本明細書において使用するとき、用語「エステル」は、インビボで加水分解されるエステルを意味し、人体で容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は例えば、薬学的に許容される脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は有利には６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例は、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルを含む。
　本明細書において使用するとき、用語「オキシド」は、ヘテロアリール基の窒素環原子が酸化され、Ｎ－オキシドを形成しているものを意味する。
　用語「プロドラッグ」は、本明細書において使用するとき、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー性応答等なくヒトまたは動物の組織と接触させて使用するのに適した、合理的な利益／危険比で釣り合った、そして意図した使用に有効な化合物のプロドラッグ、ならびに可能であれば当該化合物の双性イオン形態を意味する。プロドラッグは、インビボで速やかに、例えば血中で加水分解によって変換されて、上記式の親化合物をもたらす化合物である。一般的な説明は、T. Higuchi and V. Stella, Pro drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium SeriesおよびEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987に記載されている（いずれも参照により本明細書に引用する）。
　「薬学的に許容される塩」は当該技術分野で周知の多様な有機および無機対イオンに由来する薬学的に許容される塩を意味し、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびテトラアルキルアンモニウムとの塩、ならびに有機もしくは無機酸との塩、例えば塩酸、臭化水素酸、酒石酸、メシル酸、酢酸、マレイン酸およびオキサル酸との塩を含む。化合物の薬学的に許容される塩は、式（Ｉ）の化合物のオキシド、エステルまたはプロドラッグの塩を含む、薬学的に許容される塩を意味する。
　本明細書において使用するとき、用語「薬学的に許容される塩」は、式（Ｉ）の化合物の非毒性酸またはアルカリ土類金属塩を含む。これらの塩は、式（Ｉ）の化合物の最終単離および精製中にインサイチュで、あるいは塩基もしくは酸官能基と好適な有機もしくは無機酸もしくは塩基を別に、それぞれ反応させて製造することができる。代表的な塩は：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ブチル酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、オキサル酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩を含むが、これらに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルの塩化物、臭素化物およびヨウ化物のようなアルキルハライド；ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル硫酸のようなジアルキル硫酸、デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルの塩化物、臭素化物およびヨウ化物のような長鎖ハライド、ベンジルおよびフェネチルの塩化物のようなアラルキルハライドならびに他のもののような反応剤で４級化されていてもよい。それによって、水または油に溶解または分散する生成物が得られる。
　薬学的に許容される酸付加塩を形成するために使用することができる酸の例は、塩酸、硫酸およびリン酸のような無機酸およびシュウ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、コハク酸およびクエン酸のような有機酸を含む。塩基付加塩は、式（Ｉ）の化合物の最終単離および精製中にインサイチュで、あるいはカルボン酸基と好適な塩基、例えば薬学的に許容される金属カチオンのヒドロキシド、カルボネートもしくはビカルボネートまたはアンモニア、または有機第１級、第２級もしくは第３級アミンとを別に反応させて製造することができる。薬学的に許容される塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属のカチオン、例えばナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウムの塩等、ならびに非毒性アンモニウム、第４級アンモニウムおよびアミンのカチオン、例えば限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むが、これらに限定されない。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンは、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等を含む。
　本明細書において使用するとき、用語「溶媒和物」は、化学量論または非化学量論量の溶媒と結合した上記定義の化合物を意味する。溶媒和物は、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩の溶媒和物を含む。溶媒は、揮発性であり、非毒性であり、かつ／または、痕跡量でヒトへの投与に許容される。好適な溶媒和物は水和物である。
　式（Ｉ）の化合物またはその何れかのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物がヒトまたは動物体または細胞における代謝によって、インビボで処理されて代謝産物を生じ得ることが当業者には明らかであろう。用語「代謝産物」は、本明細書において使用するとき、親化合物の投与後、対象において生産される何れかの式の誘導体を意味する。誘導体は、多様な対象における生化学的変換、例えば酸化、還元、加水分解または結合によって親化合物から生産されてよく、例えばオキシドおよび脱メチル化誘導体を含む。式（Ｉ）の化合物の代謝産物は、当該技術分野で既知の日常的な技術を用いて同定することができる。例えば Bertolini, G. et al., J. Med. Chem. 40:2011 2016 (1997)； Shan, D. et al., J. Pharm. Sci. 86(7):765 767； Bagshawe K., Drug Dev. Res. 34:220 230 (1995)； Bodor, N., Advances in Drug Res. 13:224 331 (1984)； Bundgaard, H., Design of Prodrugs (Elsevier Press 1985)；およびLarsen, I. K., Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard Larsen et al., eds., Harwood Academic Publishers, 1991) を参照されたい。式（Ｉ）の化合物またはそれらの何れかのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の代謝産物である個々の化合物は、本願の有効成分に含まれると理解されるべきである。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される。
　ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒａは２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである。
　ある実施態様において、医薬組成物は、式（Ｉ）に含まれる下記の化合物または、それらのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む：
４－アミノ－３－（６－フェニルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ｐ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ｍ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ｏ－トルイルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－（６－ビフェニル－２－イルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
３－［６－（２－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレン－１－スルホン酸；
３－［６－（３－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレン－１－スルホン酸；
３－［６－（４－アセチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］－４－アミノナフタレンスルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,４－ジクロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－クロロフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－イソプロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－イソプロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－フェノキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－メトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,３－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,５－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３,５－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－トリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－｛４－［５－（１－アミノ－４－スルホナフタレン－２－イルアゾ）ピリジン－２－イル］フェニル｝－４－オキソブチル酸メチルエステル；
４－アミノ－３－（６－ビフェニル－３－イルピリジン－３－イルアゾ）ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－シアノフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－シアノフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３,５－ビストリフルオロメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレンスルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－ベンゾイルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（５－フルオロ－２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－フルオロ－６－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－プロポキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（５－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－フルオロ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－ブトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－ヘキシルオキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－ブチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－ヒドロキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－｛６－［２－（６－ヒドロキシヘキシルオキシ）フェニル］ピリジン－３－イルアゾ｝ナフタレン－１－スルホン酸；
４－｛２－［５－（１－アミノ－４－スルホナフタレン－２－イルアゾ）ピリジン－２－イル］フェノキシ｝ブチル酸；
４－アミノ－３－｛６－［２－（３－ヒドロキシプロポキシ）フェニル］ピリジン－３－イルアゾ｝ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２－イソブトキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（５－クロロ－２－ヒドロキシフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４'－クロロ－４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（４,３',５'－トリメチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３'－クロロ－４－メチルビフェニル－２－イル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（２,６－ジメチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－イソプロポキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸；
４－アミノ－３－［６－（３－ホルミル－２－ブトキシ－５－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸。
　ある実施態様において、有効成分は、下記式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表される４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩、またはその遊離形、または、そのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。
　式（Ｉ）の化合物、特に、上記の化合物の特性および合成方法は、国際公開第２０１２／０１４９９４号、国際公開第２０１２／０４３８９１号、国際公開第２０１４／１２９４９５号パンフレット、国際公開第２０１５／１２９８０９号パンフレット（特許文献１～４）に詳細に記載されている。これらの文献の全体を出典明示により本明細書の一部とする。
　本願に関して、「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）」とは、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）を含むリポタンパク質を意味し、天然由来のＨＤＬ、またはアポリポタンパク質とリン脂質とから化学合成的な手法もしくは遺伝子工学的な手法により製造される再構成（すなわち、人工）ＨＤＬのいずれであってもよい。ＨＤＬは、主な構成成分としてアポリポタンパク質およびリン脂質を含む。また、ＨＤＬは、機能性ペプチドとしての細胞親和性ペプチド（本明細書中、ＣＰとも記載する）を結合することによって、細胞親和性ペプチド結合ＨＤＬ（本明細書中、ｃＨＤＬとも記載する）として得ることができる。また、ＨＤＬは、任意の構成成分として蛍光標識物質を含んでいてもよい。
　本願に関して、ＨＤＬの密度は、天然由来のＨＤＬの場合、約１.０６３～１.２１０ｇ／ｍＬの範囲（Antonio M. Gotto, Jr.らMethods Enzymol. 1986; 128: 3-41を参照）である。再構成ＨＤＬの場合、典型的には天然由来のＨＤＬの大きさに準じるが、製造時に所望の密度に調整することができるため、例えば天然の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の密度である約１.０１９～約１.０６３ｇ／ｍＬの範囲（Antonio M. Gotto, Jr.らの同文献を参照）をも含み得る。
　ＨＤＬの粒径は、天然由来のＨＤＬの場合、約５～１２ｎｍの範囲（Antonio M. Gotto, Jr.らの同文献を参照）である。再構成ＨＤＬの場合、典型的には天然由来のＨＤＬの大きさに準じるが、製造時に所望の粒径に調整することができるため、例えば天然のＬＤＬの粒径である直径が約１８～約２５ｎｍの範囲（Antonio M. Gotto, Jr.らの同文献を参照）をも含み得て、また直径が約１０００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満の粒径に調整することもできる。ＨＤＬは、細胞親和性ペプチドの結合の有無に関係なく、そのサイズが小さいほど、後眼部への到達性が高まることが期待され、従って典型的には粒径は直径が約１００ｎｍ未満、好ましくは約１０～約５０ｎｍ、より好ましくは約１０～約２０ｎｍである。本願に関して、「粒径」は、動的光散乱法により測定した体積平均径を意味し、通常の測定装置、例えば、市販の Nanotrac UPA-EX250 particle size analyzer (Nikkiso Co., Ltd.; Tokyo, Japan) により測定し得る。
　構成成分としての「アポリポタンパク質」とは、リポタンパク質を構成する脂質以外のタンパク質部分を意味する。本明細書中、「アポリポタンパク質」なる用語は、天然のリポタンパク質中に含まれることが一般に知られるアポリポタンパク質およびその改変体を含む。アポリポタンパク質は、例えば、アポリポタンパク質Ａ～Ｅの群に属するタンパク質またはその改変体であり、好ましくはアポリポタンパク質Ａ－Ｉ（ａｐｏＡ－Ｉ）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ（ａｐｏＡ－ＩＩ）、アポリポタンパク質Ｃ（ａｐｏＣ）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）、またはその改変体である。本願におけるＨＤＬは、ａｐｏＡ－Ｉまたはその改変体を含み、さらに別のアポリポタンパク質を含んでもよい。本明細書において、アポリポタンパク質の改変体とは、アポリポタンパク質と同等の機能（例えば、脂質結合機能）を有する変異体または類似体等（つまり、機能的同等物）を意味する。アポリポタンパク質の改変体としては、例えば、アポリポタンパク質の部分断片およびそれらの組み合わせを挙げられる。ａｐｏＡ－Ｉの改変体としては、Ｎ末端の球状ドメイン（例えば、N末端の１－４３アミノ酸）を欠く、Ｎ末端球状ドメイン欠損ａｐｏＡ－Ｉ、例えば、Ｎ末端４３アミノ酸欠損ａｐｏＡ－Ｉ、または、Ｎ末端４４アミノ酸欠損ａｐｏＡ－Ｉを挙げられる。
　構成成分としての「リン脂質」とは、１つまたは複数のリン酸エステル部位を有する脂質を意味する。本願におけるリン脂質とは、天然のリポタンパク質中に含まれることが一般に知られるリン脂質を含む。本願において、リン脂質は、天然のＨＤＬ中に含まれることが知られるリン脂質が好ましいが、これに限定されない。リン脂質としては、例えば、スフィンゴシンを骨格とするスフィンゴリン脂質およびグリセリンを骨格とするグリセロリン脂質が挙げられる。
　スフィンゴリン脂質としては、例えばスフィンゴミエリン、スフィンゴシン－１－リン酸、セラミドを挙げられる。グリセロリン脂質としては、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを挙げられ、ホスファチジルコリンが好ましい。グリセロリン脂質は、長鎖アルキル基を有するグリセロリン脂質が好ましく、例えばアシル基におけるアルキル基の炭素数が約９～約２３（つまり、炭素数が約１０～約２４の脂肪酸基）、好ましくは約１１～約１７（つまり、炭素数が約１２～約１８の脂肪酸基）、より好ましくは約１３～約１７（つまり、炭素数が約１４～約１８の脂肪酸基）のグリセロリン脂質が好ましい。脂肪酸基は１個以上の炭素－炭素不飽和二重結合を含んでいてもよいが、含まないことが好ましい。ホスファチジルコリンの典型的な例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、エッグホスファチジルコリン（ＰＣ）、および１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を挙げられるが、これらに限定されるものではない。リン脂質は、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
　ＨＤＬは、リン脂質に加えて、さらなる脂質を含み得る。さらなる脂質としては、例えば、コレステロール、１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（２,３－ジオレイルオキシプロパン－１－イル）－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１,２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ,Ｎ－ジメチル－（２,３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、２,３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ,Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１,２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１,２－ジオレオイルオキシプロピル－３－ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、３β－［Ｎ－（Ｎ'Ｎ'－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、コレステリルヘミスクシナート（ＣＨＥＭＳ）、１,２－ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、一般式：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨ２）２、Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨ２）２）２またはＲ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２（式中、Ｘは、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ＜であり；Ｒ１およびＲ２は、互いに同一であるかまたは異なって、飽和もしくは不飽和のＣ６～Ｃ２０脂肪族基である）で表されるデンドロン脂質（例えば、デンドロン脂質Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ１２、Ｄ２２、Ｄ３２（Funakoshi））等が挙げられる。ＨＤＬ中の総脂質に対するさらなる脂質の割合は、例えば、約０～８０モル％、約０.００１～８０モル％、約１～５０％または約３～２５モル％であり得る。好適なリン脂質とさらなる脂質の組み合わせおよびそれらのモル比は、リン脂質とさらなる脂質の性質（例えば、不飽和度、電荷、分子量、疎水性、溶解性など）に基づいて適宜選択される。例えば、リン脂質がＤＳＰＣであり、さらなる脂質がＤＣ－Ｃｈｏｌである場合、ＨＤＬ中の総脂質に対するＤＣ－Ｃｈｏｌの割合は、約３～２８モル％、約５～２５モル％または約７～１５モル％、例えば約１０モル％であり得る。
　本願に関して、「細胞親和性ペプチド（ＣＰ）」とは、細胞膜に結合し、その後細胞内に移行することが可能な細胞親和性を示すペプチドを意味する。「細胞親和性」には、細胞膜透過性、細胞接着性、血管内皮細胞集積性、エンドソーム脱出性、細胞核集積性、ミトコンドリア集積性などを含むが、これらに限定されない。ある態様において、細胞親和性ペプチドは、細胞膜透過性ペプチド（本明細書中、ＣＰＰとも記載する）である。細胞親和性ペプチドは、天然のタンパク質由来のペプチドおよび人工的に製造されたペプチド（例えば、キメラペプチド）を含む。細胞親和性ペプチドは、そのアミノ酸配列による化学的特性により、塩基性細胞親和性ペプチド、両親媒性細胞親和性ペプチド、および疎水性細胞親和性ペプチドを含む。塩基性細胞親和性ペプチドが好ましく、塩基性細胞膜透過性ペプチドがより好ましい。例えば、塩基性細胞親和性ペプチド（例えば、ＨＩＶ－１ウイルスのＴＡＴタンパク質（Trans-activator of transcription protein）由来のＴＡＴペプチド、ショウジョウバエ由来のペネトラチン（ＰＥＮ）、ポリアルギニン（例えば、アルギニンの８量体（Ｒ８））、ポリヒスチジン（（例えば、ヒスチジンの１６量体（Ｈ１６））、抗菌性ペプチド由来のＬＬ－３７ペプチド）、両親媒性細胞親和性ペプチド（例えば、キメラペプチドであるトランスポータンやＰｅｐ－１ペプチド）、および疎水性細胞親和性ペプチド（例えば、膜タンパク質のシグナルペプチド由来のペプチドであるミトコンドリアターゲティングシグナル（ＭＴＳ））からなる群から選ばれる少なくとも１種を挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、細胞親和性ペプチドは、ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、ポリアルギニン（Ｒ８）、ＬＬ－３７、トランスポータン、Ｐｅｐ－１およびＭＴＳからなる群から選択される少なくとも１種である。さらなる実施態様では、細胞親和性ペプチドは、ＴＡＴペプチド、ペネトラチンおよびポリアルギニン（Ｒ８）からなる群から選択される少なくとも１種である。さらなる実施態様では、細胞親和性ペプチドは、ペネトラチンおよびポリアルギニン（Ｒ８）からなる群から選択される少なくとも１種である。さらなる実施態様では、細胞親和性ペプチドは、ペネトラチンである。
　細胞親和性ペプチドは、ＨＤＬと結合することで、細胞親和性ペプチド結合ＨＤＬ（ｃＨＤＬ）を形成する。結合手法は、化学合成的な手法（例えば、カップリング方法）または生物学的手法（例えば、遺伝子工学的方法）であってよい。細胞親和性ペプチドを結合するＨＤＬ上の官能基およびその位置は、適宜改変し得る。細胞親和性ペプチドは、好ましくはアポリポタンパク質上で結合しており、より好ましくはアポリポタンパク質のＣ末端で結合している。細胞親和性ペプチドの結合したアポリポタンパク質は、細胞親和性ペプチドとアポリポタンパク質との融合タンパク質であってよい。融合タンパク質は、遺伝子工学的方法により、細胞親和性ペプチドをコードする遺伝子とアポリポタンパク質をコードする遺伝子とを結合し発現させることで、得ることができる。細胞親和性ペプチドとアポリポタンパク質との融合タンパク質は、細胞親和性ペプチド１個とアポリポタンパク質１個が融合した融合タンパク質であり得る。
　遺伝子工学的手法としては、メチラーゼやＤＮＡポリメラーゼＩ／ＤＮＡリガーゼを用いるＤＮＡ編集や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を挙げられる。具体的には、大腸菌発現ベクターの制限酵素認識部位に、両端に制限酵素認識配列を付加した細胞親和性ペプチド遺伝子をＤＮＡリガーゼで挿入する。ＤＮＡシークエンス解析により、細胞親和性ペプチド遺伝子が順方向で挿入されたベクターを選択する。次に、アポリポタンパク質遺伝子の両端に制限酵素認識配列を付加した遺伝子をＰＣＲ法により作製し、大腸菌発現ベクターの制限酵素認識部位にＤＮＡリガーゼを用いて挿入する。以上の操作により、アポリポタンパク質に細胞親和性ペプチドが融合されたポリペプチドの遺伝子を作製できる。例えば、大腸菌発現ベクターｐＣＯＬＤ Ｉの制限酵素Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ認識部位に、５'末端にＰｓｔ Ｉ、３'末端にＸｂａ Ｉ認識配列を付加した細胞親和性ペプチド遺伝子、例えばペネトラチン遺伝子をＤＮＡリガーゼで挿入する。次に、ａｐｏＡ－Ｉ遺伝子、例えばＮ末端球状ドメイン欠損ａｐｏＡ－Ｉ遺伝子の５'末端側に制限酵素Ｋｐｎ Ｉ認識配列を、３'末端側に制限酵素Ｐｓｔ Ｉ認識配列を付加した遺伝子をＰＣＲ法により作製し、上記のｐＣＯＬＤ ＩのＫｐｎ ＩとＰｓｔ Ｉ認識部位間にＤＮＡリガーゼを用いて挿入する。以上の操作により、ａｐｏＡ－ＩのＣ末端側に細胞親和性ペプチドが融合された融合タンパク質の遺伝子を作製できる。
　ＨＤＬは、１分子当たり１分子以上の本願の有効成分を含むことができる。ある態様では、ＨＤＬは、本発明の有効成分を、アポリポタンパク質１モル当たり、例えば、約３～約１５モル、または、約４～約１２モル含み得る。
　ある態様では、ＨＤＬは、リン脂質を、アポリポタンパク質１モル当たり、例えば、約５０～約５００モル、約７０～約３００モル、または、約８０モル～約１８０モル含み得る。また、ＨＤＬがリン脂質およびさらなる脂質を含む態様においては、ＨＤＬは、リン脂質を、アポリポタンパク質１モル当たり、例えば、５０～約５００モル、約７０～約３００モル、約８０モル～約１８０モル、または、約１００モル～約１３０モル含み得る。
　ある態様では、ＨＤＬは、例えば、約－３０～約３０ｍＶ、約－２０～約２０ｍＶ、約－１５～約１５ｍＶ、約－１０～約１０ｍＶ、約－５～約５ｍＶ、約－２～約２ｍＶ、または約－１.５～１.５ｍＶの界面動電電位（ゼータ電位）を有する。さらなる態様では、ＨＤＬは正のゼータ電位、例えば、０～約３０ｍＶ、０～約１５ｍＶ、０～約５ｍＶ、０～約２ｍＶ、または０～約１.５ｍＶのゼータ電位を有する。ゼータ電位は、光散乱電気泳動法などにより、通常の測定装置、例えば、市販のZetasizer Nano Z（Malvern Instruments, Malvern, U. K.）により測定できる。
　ある態様では、本願は、後眼部薬物デリバリー用キャリアとして使用し得るＨＤＬであって、アポリポタンパク質およびリン脂質に加えて、さらなる脂質を含むＨＤＬを提供する。「後眼部薬物デリバリー用キャリア」とは、後眼部へ薬物を送達するための担体を意味する。後眼部薬物デリバリー用キャリアを、後眼部疾患の診断、予防または治療に有効な薬物と組み合わせることにより、後眼部薬物デリバリー用システムを構築することができる。
　本願に関して、「眼用医薬組成物」は、眼に局所投与するための医薬組成物を意味する。眼用医薬組成物は、好ましくは、非侵襲的に投与される点眼剤である。点眼剤の剤型は、本願の有効成分の水に対する溶解性と水溶液中での安定性に応じて、例えば、水性点眼剤、用時溶解点眼剤、懸濁性点眼剤、または油性点眼剤／眼軟膏剤であり得る。
　本願の医薬組成物は、眼用として医薬的に許容され得る添加剤、例えば緩衝化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤等を含み得る。添加剤は、本願の医薬組成物の効果を妨げない限り、特に制限されず、各種用途に応じて、眼刺激等の問題がない濃度範囲内で適宜配合することができる。緩衝化剤としては、例えばリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）などが挙げられる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウムなどの無機物塩、濃グリセリンなどのグリセリンなどを挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えばホウ酸などの有機酸等を挙げられる。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類）、両性界面活性剤（例えば、アルキルジアミノエチルグリシンなどのグリシン型、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインなどの酢酸ベタイン型）、陰イオン性界面活性剤（例えば、テトラデセンスルホン酸ナトリウムなどのスルホン酸塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩）、および陽イオン性界面活性剤（例えば、塩化ベンザルコニウムなどのアルキル第４級アンモニウム塩）が挙げられ、非イオン性界面活性剤が好ましい。安定化剤としては、例えば有機酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム、マンニトール）などが挙げられる。防腐剤としては、例えば塩化ベンザルコニウム、パラベンなどが挙げられる。本願の医薬組成物は、増粘剤（例えば、アルギン酸ナトリウム）、キレート剤（例えば、エデト酸ナトリウム）、香料（例えば、メントール）等の添加剤を含んでもよい。本願の医薬組成物のｐＨは、眼科製剤に許容される範囲内である限りにおいて、通常４～８の範囲内が好ましい。
　本願の医薬組成物を、さらなる有効成分と組み合わせることも可能である。さらなる有効成分としては、例えば、緑内障または高眼圧症の処置用薬物（例えば、ピロカルピン、ジスチグミン、カルテオロール、チモロール、ベタキソロール、ニプラジロール、レボブノロール、ブナゾシン、ジピベフリン、ブリモニジン、イソプロピルウノプロストン、ラタノプロスト、トラボプロスト、タフルプロスト、ビマトプロスト、リパスジル、ドルゾラミド、ブリンゾラミド等）、血管退縮治療薬（例えば、ラニビズマブ、ペガプタニブおよびアフリベルセプト等）が含まれるが、これらに限定されない。
　さらなる有効成分およびその治療上有効量は、通常の臨床医の技術および判断の範囲内で決定され得る。さらなる有効成分は、本願の医薬組成物中に存在してもよく、本願の医薬組成物とは別に提供されてもよい。
　本願に関して、本願の医薬組成物とさらなる有効成分を「組み合わせる」または「併用する」ことは、全成分を含有する投与形の使用および各成分を別個に含有する投与形の組合せの使用のみならず、それらが眼疾患の処置および／または予防に使用される限り、各成分を同時もしくは連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種以上のさらなる有効成分を本願の医薬組成物と組み合わせて使用することも可能である。
　本願の医薬組成物の投与の前、後、または同時に、レーザー手術、外科手術、光線力学療法等を含むがこれらに限定されない、眼疾患の処置を行ってもよい。
　眼疾患、特に後眼部疾患を患っている患者に本願の医薬組成物を投与することにより、眼疾患を処置し得る。本願に関して、「処置する」または「処置」は、疾患に罹患している対象において、疾患の原因を軽減または除去すること、疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、疾患の症状を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
　眼疾患、特に後眼部疾患に罹患する危険を有する患者に本願の医薬組成物を投与することにより、眼疾患を予防し得る。本願に関して、「予防する」または「予防」は、疾患に罹患していないが、罹患する恐れのある対象において、疾患の発症を防止することを意味する。予防対象には、眼組織に何らかの異常（例えば、高眼圧、網膜色素上皮下のドルーゼン蓄積、近視）を有する対象、眼疾患の遺伝的リスク（例えば、網膜色素変性や緑内障などの原因遺伝子、疾患罹患の危険性が高いことが明らかになっている遺伝子多型の疾患遺伝子型）を有する対象、眼疾患の罹患率を高める他の疾患（例えば、糖尿病、脂質異常症等の代謝性疾患、血栓症、自己免疫疾患、腎機能障害、高血圧）に罹患している対象、眼疾患を誘発する薬物（例えば、ステロイドなど）を使用している対象が含まれる。
　本願の医薬組成物により処置および／または予防し得る眼疾患には、例えば、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性、虚血性眼疾患および近視などによる網脈絡膜萎縮が含まれる。緑内障は、正常眼圧緑内障または眼圧降下療法に不応性の緑内障を含む。網膜色素変性症は、遺伝性網膜色素変性症および孤発性網膜色素変性症を含む。加齢黄斑変性は、滲出型加齢黄斑変性および萎縮型加齢黄斑変性を含む。虚血性眼疾患には、眼の虚血に起因または関連するすべての眼疾患が含まれ、例えば、網膜中心動脈閉塞症、網膜動脈分枝閉塞症、虚血性視神経症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、糖尿病性網膜症および高眼圧症に基づく視神経疾患または視神経障害が含まれる。虚血性眼疾患は急性であり得、虚血再灌流障害を伴い得る。
　ある態様では、本願の医薬組成物を対象に投与することを含む、眼疾患の処置および／または予防方法が提供される。別の態様では、眼疾患の処置および／または予防における本願の医薬組成物の使用が提供される。
　本願の医薬組成物に含まれるＨＤＬは、例えば、
ｉ）アポリポタンパク質溶液と、リン脂質（および必要に応じてさらなる脂質）を含むリポソームとを混合することにより、粗ＨＤＬを製造する工程（Spontaneous interaction 法）；および
ｉｉ）超遠心法により粗ＨＤＬを精製しＨＤＬを得る工程、
を含む方法において、本願の有効成分を、アポリポタンパク質溶液に含めるか、リポソーム中に含めるか、あるいは工程ｉｉ）に先立ち工程ｉ）で得られた粗ＨＤＬと混和することで、製造することができる。
　あるいは、本願の医薬組成物に含まれるＨＤＬは、例えば、
ｉ）リン脂質（および必要に応じてさらなる脂質）とコール酸とを、（例えばリン脂質の相転移温度で）混和することによりミセル化し、得られたミセル溶液をアポリポタンパク質溶液と混合し、混合物を透析して粗ＨＤＬを製造する工程（コール酸透析（cholate-dialysis）法）；および
ｉｉ）超遠心法により粗ＨＤＬを精製してＨＤＬを得る工程、
を含む方法において、本願の有効成分を、リン脂質等と共にミセル化するか、アポリポタンパク質溶液に含めるか、あるいは工程ｉｉ）に先立ち工程ｉ）で得られた粗ＨＤＬと混和することで、製造することができる。
　ＨＤＬを製造する際、典型的には、例えば、アポリポタンパク質の１モルに対して、数倍～数千倍モル、数十倍～数百倍モル、例えば約５倍～約２０００倍モル、約２０倍～約５００倍モル、約３０倍～約２００倍モルのリン脂質を出発物質として使用する。
　ＨＤＬを製造する際、典型的には、アポリポタンパク質１ｇに対して、例えば、約０.０１～約１５ｇ、約０.０５～約１０ｇ、約０.０７～約７ｇ、または、約０.１～約３.５ｇの本願の有効成分を出発物質として使用する。ある態様では、約０.３～約３.５ｇの本願の有効成分を出発物質として使用し得る。
　得られたＨＤＬは、ゲル濾過クロマトグラフィー法、超遠心法、超音波照射法、凍結融解法、ホモジナイゼーション法などを用いて微粒子に調整することができるが、これらの方法に限定されない。
　ある態様では、本願は、細胞親和性ペプチド結合高密度リポタンパク質（ｃＨＤＬ）｛これは、アポリポタンパク質、リン脂質および細胞親和性ペプチド（ここで、該リン脂質は、炭素数が１２～１８の脂肪酸基のグリセロリン脂質であり、細胞親和性ペプチドは、塩基性細胞膜透過性ペプチドである）を含み、粒径が直径約１００ｎｍ未満（例えば、直径約１０～２０ｎｍ）である｝
中に含まれる本願の有効成分を含む、眼疾患の処置および／または予防のための医薬組成物を提供する。
　ある態様では、本願は、細胞親和性ペプチド結合高密度リポタンパク質（ｃＨＤＬ）｛これは、Ｎ末端球状ドメイン欠損ａｐｏＡ－Ｉ、ＤＳＰＣ、ＤＣ－Ｃｈｏｌおよびペネトラチンを含み、粒径が直径約１０～２０ｎｍである｝
中に含まれる本願の有効成分を含む、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性および虚血性眼疾患からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患の処置および／または予防のための医薬組成物を提供する。
　例えば、本願は下記の実施態様を提供する。
［１］高密度リポタンパク質中に含まれる式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 〔式中、
Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
ｍは０～４から選択される整数である〕
の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む眼用医薬組成物。
［２］高密度リポタンパク質が細胞親和性ペプチドと結合している、［１］に記載の医薬組成物。
［３］細胞親和性ペプチドが細胞膜透過性ペプチドである、［２］に記載の医薬組成物。
［４］細胞親和性ペプチドが、ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、ポリアルギニン（Ｒ８）、ＬＬ－３７、トランスポータン、Ｐｅｐ－１およびＭＴＳからなる群から選択される少なくとも１種である、［２］または［３］に記載の医薬組成物。
［５］細胞親和性ペプチドが、ＴＡＴペプチド、ペネトラチンおよびポリアルギニン（Ｒ８）からなる群から選択される少なくとも１種である、［２］ないし［４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［６］細胞親和性ペプチドがペネトラチンである、［２］ないし［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］高密度リポタンパク質が、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択される少なくとも１種のリン脂質を含む、［１］ないし［６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］高密度リポタンパク質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む、［１］ないし［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］高密度リポタンパク質がさらなる脂質を含む、［７］または［８］に記載の医薬組成物。
［１０］さらなる脂質が３β－［Ｎ－（Ｎ'Ｎ'－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）である、［９］に記載の医薬組成物。
［１１］高密度リポタンパク質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）および３β－［Ｎ－（Ｎ'Ｎ'－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を含み、ＤＳＰＣとＤＣ－Ｃｈｏｌの総量に対するＤＣ－Ｃｈｏｌの割合が約７～１５モル％である、［１］ないし［１０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１２］高密度リポタンパク質が細胞親和性ペプチドとアポリポタンパク質との融合タンパク質を含む、［１］ないし［１１］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１３］高密度リポタンパク質が、Ｎ末端球状ドメイン欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉを含む、［１］ないし［１２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１４］Ｎ末端球状ドメイン欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉが、Ｎ末端４３アミノ酸欠損アポリポタンパク質Ａ－ＩまたはＮ末端４４アミノ酸欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉである、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］高密度リポタンパク質が、ペネトラチンとＮ末端球状ドメイン欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉとの融合タンパク質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびＤＣ－コレステロールを含む、［１］ないし［１４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１６］Ｎ末端球状ドメイン欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉが、Ｎ末端４４アミノ酸欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉである、［１４］に記載の医薬組成物。
［１７］高密度リポタンパク質の粒径が直径約１０～２０ｎｍである、［１］ないし［１６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１８］式（Ｉ）中、Ｒａが、それぞれ独立して、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキルおよびアルコキシから成る群から選択される、［１］ないし［１７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１９］式（Ｉ）中、Ｒａが、それぞれ独立して、ハロおよびアルキルから成る群から選択される、［１］ないし［１８］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２０］式（Ｉ）中、Ｒａが２個存在し、一方がハロであり、他方がアルキルである、［１］ないし［１９］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２１］式（Ｉ）の化合物が、式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 の化合物である、［１］ないし［２０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２２］高密度リポタンパク質が、アポリポタンパク質１モル当たり、約３～約１５モルの式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、［１］ないし［２１］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２３］眼疾患の処置および／または予防のための、［１］ないし［２２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２４］眼疾患が、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性または虚血性眼疾患である、［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］点眼剤である、［１］ないし［２４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２６］［１］ないし［２５］のいずれかに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、眼疾患の処置および／または予防方法。
［２７］眼疾患の処置および／または予防における［１］ないし［２５］のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、発明を説明するためだけに供されるものである。
(実験１)
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の作製
（方法）
　Ｎ末端の球状ドメイン（１－４３アミノ酸）を欠くＮ末端４３アミノ酸欠損ａｐｏＡ－ＩのＣ末端に細胞親和作用を有するＴＡＴペプチドをつなげた融合タンパク質を作製した。この融合型ａｐｏＡ－Ｉに、ジミストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）と蛍光標識物質であるクマリン－６からなる粒径１００ｎｍ程度のリポソームを混和することにより、ｃＨＤＬを作製した（Spontaneous interaction法）。反応しなかったリポソームやリン脂質ミセル、またリン脂質や蛍光物質と結合していないアポリポタンパク質を除去するために、超遠心法によりｃＨＤＬを精製した。同様な方法で、細胞親和性ペプチドを含まない再構成ＨＤＬ（以下、ｒＨＤＬと記載する）を作製した。比較対照として、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）のサブミクロンサイズリポソーム（submicron sized small uni-lamella vesicle, ｓｓＬｉｐ）を国際公開第２００９／１０７７５３号パンフレットに記載の方法に従って調製した。
　得られたｃＨＤＬ、ｒＨＤＬおよびリポソームを、タンパク質、リン脂質およびクマリン－６の各含量、粒径、並びに表面電位について調べた。タンパク質濃度はローリー（Lowry）法で、リン脂質濃度はＣテスト（C test Wako（登録商標））で、クマリン－６濃度は蛍光分光光度計FluoroMaxを用いる蛍光分光法で求めた。粒径および表面電荷状態は、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて、それぞれ体積平均径（ＭＶ）およびゼータ電位として求めた。測定装置はそれぞれ、Nanotrac UPA-EX250 particle size analyzer (Nikkiso Co., Ltd.; Tokyo, Japan)、Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, Malvern, U. K.)を使用した。粒子径測定時にはサンプルを１００％ＰＢＳ溶液にて希釈して測定、ゼータ電位測定時には、超純水で１０倍に希釈した上で測定を行った。
（結果）
　Spontaneous interaction法と超遠心法により、粒径が直径１０～２０ｎｍのＨＤＬを得ることができた。各ＨＤＬのサイズおよびそれを構成するタンパク質、リン脂質およびクマリン－６の各濃度、並びにゼータ電位は下記表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（実験２）
ＨＤＬの毒性評価
（方法）
　実験１で得られた各ＨＤＬの角膜毒性を調べるために、ヒト角膜培養細胞を使って細胞毒性試験を行った。ｃＨＤＬ、ｒＨＤＬ、および比較対照の塩化ベンザルコニウムで処理した細胞の酵素活性を比色定量法により測定した。検出試薬としてＣＣＫ－８（Cell Counting Kit-8）を使用した。
（結果）
　ｃＨＤＬおよびｒＨＤＬは共に、ネガティブコントロールであるＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液と同等以上の細胞生存率を示し、ポジティブコントロールである塩化ベンザルコニウム（市販点眼剤に含まれている防腐剤）と比べて有意に細胞毒性が低かった（図１）。
（実験３）
ＨＤＬの網膜への到達効率
（方法）
　Ｃ５７／Ｂ６系統のマウスに、実験１で得られたｃＨＤＬ、ｒＨＤＬ、粒径１００ｎｍのＤＳＰＣリポソームをそれぞれ３μＬずつ眼表面に点眼し、３０分後に眼球を摘出し、凍結切片を作製した。コンフォーカル顕微鏡で網膜内層の蛍光強度を観察し、結果を比較した。
（結果）
　共焦点顕微鏡観察により、ｃＨＤＬ点眼群では、クマリン－６を有しないＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液の点眼群には見られない蛍光が網膜内層に観察された（図２)。
　これら蛍光強度の結果を、ｃＨＤＬ、ｒＨＤＬ、ネガティブコントロールとしてのＨＢＳＳ／ＨＰＥＳ溶液、およびポジティブコントロールとしてのＤＳＰＣ ｓｓＬｉｐについて数値化した（図３）。ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ点眼群と比較して、ｃＨＤＬ、ｒＨＤＬ、ＤＳＰＣリポソーム点眼群のいずれも網膜内層の蛍光強度は向上していた。また、ｃＨＤＬ点眼群では、ｒＨＤＬおよびＤＳＰＣリポソーム点眼群のいずれと比べても蛍光強度は高かった。このことにより、ＨＤＬはクマリン－６を網膜内層へ到達させることが示され、特に細胞親和性ペプチドを結合したｃＨＤＬは極めて高い程度でクマリン－６を網膜に到達し得ることが示唆される。
（実験４）
後眼部薬物デリバリーシステムのモデル試験（脈絡膜血管新生モデル）
（方法）
　後眼部薬物デリバリーシステムのモデル試験として脈絡膜血管新生モデルの試験を行った。
　以下の点眼液を調製した；１）１ｍｇ／ｍＬのアポリポタンパク質濃度を有するｃＨＤＬ溶液１ｍＬおよびｃＨＤＬを含まない緩衝液１ｍＬに、それぞれ１ｍｇのパゾパニブを混和したもの、２）アポリポタンパク質と等モル比のパゾパニブを内包するｃＨＤＬ溶液およびパゾパニブを内包していないｃＨＤＬ溶液（いずれもアポリポタンパク質濃度：１.５ｍｇ／ｍＬ）。ここで、パゾパニブを内包したｃＨＤＬ溶液は、実験１におけるクマリン－６の代わりにパゾパニブを用いて調製した。
　６～８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの網膜にアルゴンレーザーを照射し、脈絡膜新生血管を作製した。レーザー照射直後から１週間、点眼液を一日三回、一回３μＬ点眼し、１週間後に眼球摘出した。免疫染色法にて脈絡膜新生血管を染色し、フラットマウント法にてコンフォーカル顕微鏡下で脈絡膜新生血管の面積を測定した。
（結果）
　上記１）および２）の比較結果を各々図４および５に示す。いずれの場合もパゾパニブを内包したｃＨＤＬ溶液の点眼で脈絡膜新生血管の面積が縮小しており、血管新生阻害作用を有するパゾパニブがｃＨＤＬへの内包を通じて疾患部位まで到達していることが示唆された。このことは、パゾパニブが後眼部へ到達し、血管新生を抑制することを示唆する。
（実験５）
種々のリン脂質を用いるｃＨＤＬ
１）ｃＨＤＬの作製
（方法）
　異なるリン脂質（具体的には、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣの三種類）を用いて、ｃＨＤＬを、以下の方法により作製した。ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣの脂肪酸基の炭素数は、各々１４、１６、１８である。
　具体的には、クマリン－６、リン脂質およびコール酸からなるミセルを事前に作製し、そのミセルと実験１と同じ融合型ａｐｏＡ－Ｉをリン脂質の相転移温度で混和することによりｃＨＤＬを作製した（コール酸透析法）。ここで、各リン脂質の相転移温度は以下の通りである：ＤＭＰＣは２４℃、ＤＰＰＣは４０－４１℃、およびＤＳＰＣは５５℃。クマリン－６の濃度は０.０５μｍｏｌ／ｍｌに統一して使用した。得られたｃＨＤＬを、実験１の方法に準じて超遠心法により精製した。実験１の方法に準じて、得られたｃＨＤＬのタンパク質、リン脂質およびクマリン－６の各含量、並びに粒径を測定した。
（結果）
　コール酸透析法と超遠心法により、粒径が直径１０～２０ｎｍのｃＨＤＬを得ることができた。各ｃＨＤＬの粒径およびそれを構成するタンパク質、リン脂質およびクマリン－６の各濃度は下記表２の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
２）ｃＨＤＬの網膜への到達効率
（方法）
　上記製造した各種ｃＨＤＬの網膜への到達効率を調べた。具体的には、実験３と同様の方法で、コンフォーカル顕微鏡で網膜内層の蛍光強度を観察し、結果を比較した。
（結果）
　共焦点顕微鏡観察により、網膜内層の蛍光強度を比較した。結果を図６に示す。ＤＳＰＣ＞ＤＰＰＣ＞ＤＭＰＣの順に蛍光強度が高かった。また、これら蛍光強度の結果を実験３の方法に準じて数値化した（図７）。この結果から、上記のｃＨＤＬはクマリン－６を網膜内層へ到達させることが示され、グリセロリン脂質のアシル基におけるアルキル基の炭素数が多いほど、ｃＨＤＬの網膜への到達効率が高いことが示唆された。
（実験６）
種々の細胞膜透過性ペプチドを用いるｃＨＤＬ
１）ｃＨＤＬの作製
（方法）
　異なるＣＰＰ（具体的には、ＴＡＴペプチド、ペネトラチン（ＰＥＮ）ペプチド、ポリアルギニン（Ｒ８）の三種類）を、遺伝子工学的手法により、Ｎ末端４３アミノ酸欠損ａｐｏＡ－Ｉ（ＴＡＴペプチド）またはＮ末端４４アミノ酸欠損ａｐｏＡ－Ｉ（ＰＥＮおよびＲ８）のＣ末端に融合した融合タンパク質を作製した。次に、実験５と同様の方法でＤＳＰＣおよびクマリン－６を用いてｃＨＤＬを作製した。クマリン－６の濃度は０.０３μｍｏｌ／ｍｌに統一して使用した。得られたｃＨＤＬを、実験１の方法に準じて超遠心法により精製した。実験１の方法に準じて、得られたｃＨＤＬのタンパク質、リン脂質およびクマリン－６の各含量、粒径、並びに表面電位を測定した。
（結果）
　コール酸透析法と超遠心法により、粒径が直径１０～２０ｎｍのｃＨＤＬを得ることができた。各ｃＨＤＬの粒径サイズおよびそれを構成するタンパク質、リン脂質およびクマリン－６の各濃度、並びにゼータ電位は下記表３の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
２）ｃＨＤＬの網膜への到達効率
（方法）
　上記製造した各種ｃＨＤＬの網膜への到達効率を調べた。具体的には、実験３と同様の方法で、共焦点顕微鏡で網膜内層の蛍光強度を観察し、結果を比較した。
（結果）
　共焦点顕微鏡観察により、網膜内層の蛍光強度を比較した。結果を図８に示す。ＰＥＮ＞Ｒ８≧ＴＡＴ＞ＣＰＰなしの順に蛍光強度が高かった。また、これら蛍光強度の結果を実験３の方法に準じて数値化した（図９）。この結果から、上記のＨＤＬはクマリン－６を網膜内層へ到達させることが示され、特に細胞親和性ペプチドを結合したｃＨＤＬは極めて高い程度でクマリン－６を網膜に到達し得ることが示唆される。また、ＰＥＮが最も網膜への到達効率を向上させることが示唆された。
（実験７）
網膜への薬剤到達における濃度依存性
　ＰＥＮペプチド、ＤＳＰＣおよびクマリン－６を含むｃＨＤＬを用いて、網膜への薬剤到達における濃度依存性を検証した。
（方法）
　クマリン－６の濃度が０.０３μｍｏｌ／ｍｌ、０.０５μｍｏｌ／ｍｌ、０.１μｍｏｌ／ｍｌ、０.２μｍｏｌ／ｍｌでそれぞれ調整したｃＨＤＬ溶液を、上記実験５または６と同様な方法を用いて製造した。次いで、実験３と同様の方法で各溶液を投与したマウスの網膜内層の蛍光強度を比較した。
（結果）
　結果を図１０に示す。クマリン－６の濃度が高いほど蛍光強度が高い傾向が認められた。また、これら蛍光強度の結果を実験３の方法に準じて数値化した（図１１）。この結果から、ｃＨＤＬ中に含有されている薬剤の濃度が高ければ、網膜へ高濃度の薬剤を到達させることができることが示唆され、よって網膜への薬剤到達における量は、適用するｃＨＤＬ中に含有されている薬剤の量に依存することが分かった。
（実験８）
ｃＨＤＬと従来のキャリアとの比較実験
（方法）
　薬剤としてパゾパニブを選択し、ポジティブコントロールキャリアとして治験などで一般的に使われているカプチゾール、および実験３において比較対象とした粒径１００ｎｍのＤＳＰＣリポソーム（ＤＳＰＣ ｓｓＬｉｐ）を選択した。実験４の２）と同様の方法にて調製したｃＨＤＬを使用した。比較対象として、Yafai et al. Eur J Pharmacol. 2011; 666: 12-8および特表第２０１３－５２５５０１号公報に記載の方法と同様に、７％カプチゾール溶液にパゾパニブを溶解することで比較カプチゾール溶液を作製した。また、実験１と同様の方法で作製したｓｓＬｉｐに、ＤＭＳＯに溶解したパゾパニブを混和し、次いでゲル濾過カラムを用いて内包されていないパゾパニブを除去することで精製し、比較ｓｓＬｉｐ溶液を作製した。
　本実験ではパゾパニブ濃度を統一するために、国際公開第２０１１－０６９０５３号パンフレットおよびEscudero-Ortiz et al. Ther Drug Monit. 2015; 37: 172-9に記載の方法に準じる超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）により、各サンプルのパゾパニブ濃度を測定した。濃度が既知のパゾパニブ標準物質溶液を用いてクロマトグラフィーの保持時間を確認し、保持時間に位置するピークの面積を計量することで検量線を作成した。各サンプルでも同一の保持時間に位置するピーク面積を計量し、検量線からパゾパニブ濃度を定量し、各サンプルが同一濃度になるよう適宜希釈した。
　これら調製した各溶液を、マウスへの点眼の回数を１日２回に変更した点を除き、実験４に記載する方法に準じて血管新生モデルのマウスに点眼適用し、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の面積の縮小の効果を調べた。
（結果）
　結果を図１２に示す。ｃＨＤＬをキャリアとして用いた場合は、比較対象のカプチゾールおよびｓｓＬｉｐのいずれかを用いた場合と比較して、脈絡膜新生血管の面積が有意に縮小していた（図１２）。このことから、血管新生作用を有する薬剤がｃＨＤＬへの内包を通じて疾患部位まで有効に到達していることが示唆された。
（実験９）
化合物１を内包するｃＨＤＬ（ＤＳＰＣ－化合物１）の作製
　以下の構造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 を有する化合物（化合物１：４－アミノ－３－［６－（４－フルオロ－２－メチルフェニル）ピリジン－３－イルアゾ］ナフタレン－１－スルホン酸ナトリウム塩）を内包するｃＨＤＬを作製した。
１）ｃＨＤＬと化合物１の重量比の検討
（方法）
　リン脂質（ＤＳＰＣ）１０ｍｇに対して３０ｍｇ／ｍｌコール酸ナトリウム溶液（緩衝液：ＰＢＳ）７０６μｌに分散し、コール酸ミセルを作製した。Ｎ末端４４アミノ酸欠損ａｐｏＡ－ＩのＣ末端にペネトラチンをつなげた融合タンパク質を、１.５ｍｇ／ｍｌとなるよう４Ｍ尿素（緩衝液：ＰＢＳ）に溶解した。コール酸ミセルと融合タンパク質溶液を、ＤＳＰＣ：融合タンパク質＝２００：１のモル比で、５５℃で、３０分間混和した。混合物をＰＢＳ溶液で終夜透析し、実験１に準じて超遠心法により沈殿物を除去した（ＨＤＬ精製）。得られたＨＤＬと化合物１を、様々な重量比で、５５℃で、３０分間混和した。ゲル濾過カラムを用いてｃＨＤＬを精製し、融合タンパク質および化合物１の含有量を、各々Ｌｏｗｒｙ法および比色法（４７２ｎｍ）を用いて測定した。
（結果）
　表４に示す通り、化合物１を内包するｃＨＤＬ（ＤＳＰＣ－化合物１）が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
２）ＤＳＰＣ－化合物１作製の再現性
　化合物１の添加量を１５００μｇとして、再度ＤＳＰＣ－化合物１を作製し、融合タンパク質、化合物１、リン脂質（Ｃテスト）の含有量を測定した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 化合物１／ＨＤＬ比が表５に示す結果と近似するＤＳＰＣ－化合物１が得られた。ＤＬＳにより測定した粒径は１４.９５ｎｍであり、ＨＤＬの粒径として合理的な範囲にあった。
（実験１０）
化合物１を内包するＨＤＬにおける脂質の検討
（方法）
　リン脂質にカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を加えてゼータ電位を変化させたサンプルの有効性を確認するために、実験９と同様の方法で、各々の脂質の含有比率を変えて作製した。使用した化合物１の量は、ＤＯＴＡＰ－化合物１、ＤＣ－化合物１ともに、融合タンパク質１ｇに対してそれぞれ、２gの割合で加えて作製した。
（結果）
　得られたＤＯＴＡＰ－化合物１、ＤＣ－化合物１およびＤＳＰＣ－化合物１のゼータ電位および精製前後の粒径を表６に示す。ＤＯＴＡＰおよびＤＣの後の括弧内の数字はＤＳＰＣとＤＯＴＡＰまたはＤＣ－コレステロールの総量に対するＤＯＴＡＰまたはＤＣ－コレステロールのモル％を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　ＤＯＴＡＰ－化合物１は粒径が非常に大きく、ばらつきがあった。ＤＣ－化合物１は比較的粒径が大きいが、超遠心法で精製すると、粒径がＨＤＬ理論値内の粒子が得られた。
（実験１１）
化合物１を内包するｃＨＤＬ（ＤＣ－化合物１）の作製
（方法）
　ＤＳＰＣとＤＣ－ｃｈｏｌの混合物（ＤＳＰＣ－ＤＣ－ｃｈｏｌ）（ＤＳＰＣ：ＤＣ－ｃｈｏｌ＝９：１、８：２、または７：３（モル比））を１００％エタノールに５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、蒸発させ、凍結乾燥した。これを３０ｍｇ／ｍｌコール酸ナトリウム溶液（緩衝液：ＰＢＳ）にＤＳＰＣ１０ｍｇに対して７０６μｌの割合で分散し、コール酸ミセルを作製した。Ｎ末端４４アミノ酸欠損ａｐｏＡ－ＩのＣ末端にペネトラチンをつなげた融合タンパク質を４Ｍ尿素（緩衝液：ＰＢＳ）に１.５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、これに化合物１を溶解した（７５０μｇの融合タンパク質に対して７５０μｇの化合物１）。この溶液とコール酸ミセルを、ＤＳＰＣ－ＤＣ－ｃｈｏｌ：融合タンパク質＝２００：１のモル比で、５５℃で、３０分間混和した。混合物をＰＢＳ溶液で終夜透析し、超遠心法（２８６,０００ｇ、１０６分間）により沈殿物を除去した（ＨＤＬ精製）。ＨＤＬ分画を回収し、希釈濃縮（Amicon Ultra 100K）した。希釈液にはＰＢＳを使用した。ＤＳＰＣ－化合物１も同時に上記と同様の方法で作製した。
（結果）
　得られたＤＳＰＣ－化合物１およびＤＣ（１０）－化合物１の融合タンパク質、化合物１およびリン脂質の含有量、粒径並びにゼータ電位を、実験１および９に準じて測定した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（実験１２）
　高密度リポタンパク質中に含まれる化合物１の網膜および硝子体組織への到達効率を調べた。
化合物１の網膜および硝子体組織への到達効率
（方法）
　６－８週齢のオスのＳＤラットを、（１）化合物１溶液（化合物１濃度：４ｍＭ、溶媒ＰＢＳ）、（２）ＤＳＰＣ－化合物１（化合物１濃度４.７ｍＭ）、（３）ＤＣ（１０）－化合物１（化合物１濃度３.９ｍＭ）を点眼する３群にそれぞれ３匹６眼ずつに分け、覚醒下に１回点眼した（５μｌ）。表７に記載のＤＳＰＣ－化合物１およびＤＣ（１０）－化合物１を、化合物１が上記の濃度になるまで濃縮して使用した。覚醒した状態で３０分経過した後、安楽死させ、眼球を摘出した。摘出した眼球をすぐに生理食塩水で十分に洗浄し、－８０℃に冷凍した後、メス刃にて冠状断方向で眼球を半割し、シャーベット状になった硝子体とともに、鑷子を用いて網膜を剥離し回収した。その際に角膜、強膜に触れないよう、眼球壁と眼内組織に触れる鑷子は分けて使用した。回収したサンプルは６眼まとめて重量を計測し、－８０℃にて冷凍し、化合物１濃度測定のためホモジナイズした。ホモジネート調製に際しては、冷凍したサンプルをマルチビーズショッカーにて破砕し、サンプル重量の５倍量の純水を加えて混和した。サンプル中の化合物１濃度は、ＬＣ＿ＭＳＭＳにて測定した。
　結果を図１３に示す。ＤＳＰＣ－化合物１またはＤＣ（１０）－化合物１を点眼したラットにおいて、点眼３０分後の網膜および硝子体組織中に化合物１が検出された。このことは、両方の高密度リポタンパク質中に含まれる化合物１が網膜および硝子体組織に到達し、ＤＣ（１０）－化合物１の送達効率が高いことを示す。
　本願の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物またはそれらのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を局所投与により後眼部に到達させることができる。従って、全身的投与による副作用のリスクを軽減し得る。また、本願の医薬組成物は点眼し得るが、点眼は、同様に眼への局所投与に用いられる硝子体内注射より、安全かつ簡便である。

Claims (19)

  1. 　高密度リポタンパク質中に含まれる式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、
    Ｒａはハロ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ置換アルキル、アリール、ハロまたはアルキル置換アリール、アルコキシ、ヒドロキシまたはカルボキシ置換アルコキシ、アリールオキシ、ハロまたはアルキル置換アリールオキシ、ＣＨＯ、Ｃ（Ｏ）－アルキル、Ｃ（Ｏ）－アリール、Ｃ（Ｏ）－アルキル－カルボキシル、Ｃ（Ｏ）－アルキレン－カルボキシエステルおよびシアノから成る群から選択され、
    ｍは０～４から選択される整数である〕
    の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む眼用医薬組成物。
  2. 　高密度リポタンパク質が細胞親和性ペプチドと結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　細胞親和性ペプチドが、ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、ポリアルギニン（Ｒ８）、ＬＬ－３７、トランスポータン、Ｐｅｐ－１およびＭＴＳからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 　細胞親和性ペプチドが、ＴＡＴペプチド、ペネトラチンおよびポリアルギニン（Ｒ８）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２または請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　細胞親和性ペプチドがペネトラチンである、請求項２ないし請求項４のいずれかに記載の医薬組成物。
  6. 　高密度リポタンパク質が、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択される少なくとも１種のリン脂質を含む、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の医薬組成物。
  7. 　高密度リポタンパク質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含む、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の医薬組成物。
  8. 　高密度リポタンパク質がさらなる脂質を含む、請求項６または請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　さらなる脂質が３β－［Ｎ－（Ｎ’Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　高密度リポタンパク質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）および３β－［Ｎ－（Ｎ’Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）を含み、ＤＳＰＣとＤＣ－Ｃｈｏｌの総量に対するＤＣ－Ｃｈｏｌの割合が約７～１５モル％である、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の医薬組成物。
  11. 　高密度リポタンパク質が細胞親和性ペプチドとアポリポタンパク質との融合タンパク質を含む、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の医薬組成物。
  12. 　高密度リポタンパク質が、Ｎ末端球状ドメイン欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉを含む、請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の医薬組成物。
  13. 　高密度リポタンパク質が、ペネトラチンとＮ末端球状ドメイン欠損アポリポタンパク質Ａ－Ｉとの融合タンパク質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびＤＣ－コレステロールを含む、請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の医薬組成物。
  14. 　高密度リポタンパク質の粒径が直径約１０～２０ｎｍである、請求項１ないし請求項１３のいずれかに記載の医薬組成物。
  15. 　式（Ｉ）の化合物が、式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     の化合物である、請求項１ないし請求項１４のいずれかに記載の医薬組成物。
  16. 　高密度リポタンパク質が、アポリポタンパク質１モル当たり、約３～約１５モルの式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１ないし請求項１５のいずれかに記載の医薬組成物。
  17. 　眼疾患の処置および／または予防のための、請求項１ないし請求項１６のいずれかに記載の医薬組成物。
  18. 　眼疾患が、緑内障、網膜色素変性症、加齢黄斑変性または虚血性眼疾患である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 　点眼剤である、請求項１ないし請求項１８のいずれかに記載の医薬組成物。
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