WO2017217731A1 - 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 - Google Patents

유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼 Download PDF

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black ginseng
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장상민
김귀덕
차정단
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재단법인 진안홍삼연구소
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    • A23V2300/38—Multiple-step

Definitions

  • the present invention is to provide a method for producing black ginseng without loss of effective ginsenosides by increasing the ginseng using a heat medium indirect heating device without directly applying high temperature heat to ginseng during the steaming process.
  • Ginseng is a herbal medicine that has long been known for its efficacy and effectiveness.
  • the ginseng is used as it is, fresh ginseng ( ⁇ ⁇ , fresh ginseng), or dried and prepared in the form of white ginseng ( ⁇ ⁇ , white ginseng) or steamed red ginseng ( ⁇ ⁇ , red ginseng) used in the form of It became.
  • ginseng According to the processing method of ginseng, a new ingredient that does not exist in the ginseng is produced, it is possible to develop a new processed ginseng showing a better effect on various physiological activities including antioxidant activity than ginseng.
  • red ginseng which has been known to have been manufactured for about 1,000 years, undergoes secondary conversion during the steaming process, resulting in new active ingredients unique to red ginseng or red ginseng. .
  • Ginsenoside which is an alcohol of R1, R2, and R3 of protopanaxadiol or protopanaxatriol, which is a triterpene.
  • a compound having an ester-bonded structure of sugars such as glucose, rhamnose, xylose, and arabinose in the OH group more than 30 species have been identified to date, and have anticancer action, antidiabetic action, central nerve suppression effect, arteriosclerosis and It is known to exhibit pharmacologically active effects such as prevention of hypertension, promoting liver function and removing hangover, anti-fatigue, antistress action, antioxidant activity, anti-inflammatory activity, protein synthesis promotion and immune enhancing effect.
  • ginsenosides are generally known to be present in fresh ginseng, but some specific ginsenosides are known to be present only in processed ginseng.
  • Rb1 and Rg1 are present in ginseng
  • Rg3 and Rg5 are not present in ginseng, but are present in red ginseng and black ginseng, a type of processed ginseng prepared by steaming and drying ginseng.
  • Ginsenosides present in the processed ginseng are superior to other ginsenosides such as cancer prevention, cancer cell growth inhibition, blood pressure lowering, neuroprotective neuroprotection, antithrombotic activity and antioxidant activity. has been reported, and studies on ginsenosides present only in these processed ginseng have been actively conducted.
  • ginseng According to the conventional method of preparing 9 9 9 red ginseng, there are 9 cauldrons or steamers and a vacuum dryer, and steaming steamed water into a cauldron or steamer and repeating the drying process 9 times.
  • Nine cauldrons or steamers were used sequentially.
  • ginseng does not burst during the steaming process, or because moisture is hardly transferred to the inside, so excessive steaming may occur, and if steaming at a high temperature of 100 ° C. or higher, a large amount of carcinogens such as benzopyrene may be generated. have.
  • the applicant has devised a method for preparing black ginseng, but can also reduce the benzopyrene content without losing the effective ginsenosides.
  • Fig. 7 shows the main ginsenoside Rg1, Re of ginseng according to the steam direct steam steaming of fresh ginseng
  • the results show changes in the contents of the specific ginsenosides Rg2, Rh1 and Rg3 of RC ginseng, Rb1 and red ginseng.
  • Rb1 among the major ginsenosides of fresh ginseng showed a tendency to decrease continuously from 2 steaming to 9 steaming, and only a small amount was observed for 9 steaming, and Rg1 did not change much until 3 steaming. There was a tendency to decrease rapidly after the first time, and hardly detected after 9 steaming treatments.
  • red ginseng-specific ginsenoside Rg3 was present in the early ginseng in a very small amount and increased after 6 times.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing black ginseng without loss of effective ginsenosides by increasing the ginseng using indirect heat without directly applying high temperature heat to ginseng during the steaming process.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing black ginseng without loss of effective ginsenosides, which enables the black ginseng prepared by using indirect heat to retain antioxidant and thrombi soluble functions.
  • the present invention is to solve the technical problem by providing a method for producing black ginseng without the loss of effective ginsenosides by using a heat medium indirect heating device without directly applying high temperature heat to ginseng during steaming process. .
  • washing ginseng to remove foreign substances on the surface of ginseng Predrying step of drying the washed ginseng by hot air or sun; Pre-heating step of putting the dried ginseng into the steamer to increase the temperature from room temperature to 80 ⁇ 85 °C using direct heat using steam; Steam stop step of stopping steam injection; First steaming using indirect heat of 85 ⁇ 95 °C using a heat medium indirect heating device; First drying step of cooling the first ginseng ginseng to 20 ⁇ 40 °C to dry for 1 to 2 days; Pre-heating step of putting the first dry ginseng into the steamer to increase the temperature from room temperature to 80 ⁇ 85 °C using direct heat using steam; Steam stop step of stopping steam injection; Secondary steaming using indirect heat of 85-95 ° C.
  • the production method according to the present invention has the effect of maintaining ginsenosides which may be lost during the steaming process by using indirect heat rather than using steam direct heat.
  • the production method according to the present invention has the effect of reducing benzopyrene which is likely to occur in high temperature steaming by using indirect heat.
  • Black ginseng prepared according to the method of the present invention possesses antioxidant and thrombolytic function.
  • Black ginseng prepared according to the present invention has the effect of increasing the thrombolytic function by inhibiting the expression of VCAM-1, ICAM-1, IL-6, TNF- ⁇ and E-Selectin.
  • Black ginseng prepared according to the present invention has the effect of improving the symptoms caused by thrombosis.
  • Example 1 shows a method for producing black ginseng according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of DPPH antioxidant activity of Taegeuksam, red ginseng and black ginseng.
  • Figure 3 shows the results of measuring the ABTS antioxidant activity of Taegeuksam, red ginseng and black ginseng.
  • Figure 4 shows the thrombolytic activity test results of red ginseng extract.
  • Figure 5 shows the thrombolytic activity test results of black ginseng extract.
  • Figure 6 shows the cytotoxicity test results of ginseng extract, Taegeuk ginseng extract, red ginseng extract and black ginseng extract.
  • Figure 7 shows the results of VCAM-1 expression of ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 8 shows the VCAM-1 expression results of red ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 9 shows the expression results of VCAM-1 of Taeguk extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 10 shows the results of ICAM-1 expression of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 1 shows the results of ICAM-1 expression of Taegeuksam extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 12 shows the IL-6 expression results of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 14 shows the results of TNF- ⁇ expression of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 15 shows the TNF- ⁇ expression results of Taekuk ginseng extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 16 shows the results of E-Selectin expression of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 17 shows the E-Selectin expression results of Taegeuksam extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 18 shows the results of confirming the expression of VCAM-1, ICAM-1, E-Selectin protein of red ginseng extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • Example 1 Manufacturing method of black ginseng without loss of effective ginsenosides
  • Washing step Put ginseng into the cylindrical washer and wash it repeatedly three times for 5 ⁇ 10 minutes to prevent the damage of ginseng and completely remove foreign substances such as soil or vinyl from the surface of ginseng.
  • Predrying Step Dry the washed ginseng for 3 ⁇ 10 hours in a hot air dryer set at 40 ⁇ 50 °C, or 1 ⁇ 2 days in the sun.
  • Preheating step Put dry ginseng into steamer and increase the temperature rapidly from room temperature to 80 ⁇ 90 °C using direct heat using steam.
  • Steam stop step Stop steam injection and keep for 10 ⁇ 20 minutes.
  • 5 1st jeungsam stage Increasing 5 ⁇ 10 hours at 85 ⁇ 95 °C using indirect heat such as thermal oil without spraying steam directly on ginseng surface.
  • 8 Second drying step Secondly ginseng second ginseng to dry the ginseng in the same way as 6 above.
  • 9 3rd jeungsam step 2nd jeungsam ginseng second ginseng in the same way as the above 3 ⁇ 5 to third jeungsam.
  • the third ginseng is dried for 1 to 2 days in a 40 ⁇ 60 °C drying chamber to remove moisture on the surface of the ginseng, and dried to dry less than 15% final moisture in the drying room to produce black ginseng.
  • the black ginseng steaming process may be increased 4 to 5 times as needed.
  • black ginseng prepared by the procedure described in Example 1 possesses antioxidant and thrombolytic function, it can be used as a pharmaceutical composition for symptoms caused by thrombosis.
  • a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent or the like is added to the black ginseng extract or extract or dry powder prepared according to Example 1 to provide a pharmaceutical unit dosage form.
  • Example 3 Food composition using black ginseng without loss of effective ginsenosides
  • black ginseng prepared by the process described in Example 1 has antioxidant and thrombolytic function, it is used in various types of food compositions such as functional drinks, various foods, dietary supplements, teas, confectionery, gum, tea, vitamin complexes, and the like. Can be.
  • the black ginseng extract was obtained by purchasing five kinds of commercially available black ginseng, and the ginsenoside content and the benzopyrene content contained in the black ginseng extract were analyzed using HPLC (high-performance liquid chromatography). Specifically, five kinds of black ginseng were ground, distilled water was added and left at room temperature, followed by extraction and filtration with ethanol, followed by concentration under reduced pressure and lyophilization to obtain solid black ginseng extracts, respectively. Then, distilled water was added to each of the solid black ginseng extracts, suspended, mixed with ether, added to a separatory funnel, and allowed to stand at room temperature to obtain an aqueous layer.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • Methanol was added to each of the obtained analytical samples, dissolved, filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and analyzed for ginsenoside content and benzopyrene content using HPLC.
  • Benzopyrene is a component that is detected from carbonized black ginseng during steaming, and is known as one of cancer causing substances.
  • the benzopyrene content was used as an indicator for confirming the occurrence of side effects caused by the steaming process.
  • Table 1 shows the results of analyzing ginsenoside content of five kinds of black ginseng using HPLC. There were almost no ginsenosides Rb1 and Rg1 in commercial black ginseng, and the content of Rg3 was 0.6. The commercially available black ginseng showed a low content of ginsenosides of Rb1 and Rg1.
  • Benzopyrene (BG) BG 1 BG 2 BG 3 BG 4 BG 5 BG average Content ( ⁇ g / kg) 0.89 0.94 0.93 0.73 0.68 0.83
  • Table 2 shows the results of analyzing the benzopyrene content of five black ginsengs using HPLC.
  • the commercially available black ginseng contained 0.6-0.9 ⁇ g / kg of benzopyrene, and the average was 0.8 ⁇ g / kg. It contained kg, which satisfies the standard set by the Ministry of Food and Drug Safety (2.0 ⁇ g / kg), but it was determined that steady management would be necessary to maintain stable quality.
  • Example 1 The black ginseng prepared through three steaming steps of Example 1 was prepared in the same manner as in Experimental Example 1, and then analyzed ginsenoside content and benzopyrene content using HPLC. See Table 3 and Table 4 for the analysis results.
  • Table 3 shows the results of analyzing ginsenosides content of black ginseng prepared through 9 steaming and 9 sachets steamed commercially and black ginseng prepared through three steaming processes of Example 1, In comparison, the total contents of Rb1, Rg1, Rg3 and Rg5 were increased in black ginseng prepared through three steaming processes.
  • Ginseng products in the Ministry of Food and Drug Safety are health functional foods and have the effect of improving fatigue and immunity when the sum of Rg1 and Rb1, the indicators of ginseng, is ingested more than 3 ⁇ 80mg / g per day. Notice.
  • Rg1, Rb1, and Rg3 which is an indicator component of red ginseng
  • Rg1, Rb1, and Rg3 which is an indicator component of red ginseng
  • it not only improves fatigue and immunity, but also improves blood flow and memory through platelet aggregation inhibition. It has been reported that it has an effect of increasing antioxidant activity.
  • commercially available black ginseng has a problem in that the functionalities of Rg1 and Rb1 are inferior since the contents of Rg1 and Rb1, which are inherent to ginseng, are hardly present.
  • the black ginseng prepared through the three steaming processes of Example 1 can be expected to have an effect on the functionality of Rg1 and Rb1 with a total content of Rg1 and Rb1 of 3.47 mg / g. Furthermore, since the total content of Rg1, Rb1 and Rg3 is 5.48 mg / g, it can be seen that the effects of Rg1, Rb1 and Rg3 are further enhanced.
  • Table 4 shows the results of analyzing the benzopyrene content of black ginseng prepared through 9 steaming and 9 sachets steaming commercially and black ginseng prepared through three steaming processes of Example 1, compared to commercially available black ginseng. It was found that the benzopyrene content was decreased in black ginseng prepared through steaming.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the DPPH antioxidant activity of Taegeuksam, red ginseng and black ginseng, Taegeuksam (TGG), red ginseng (RGG) and black ginseng (BGG) was confirmed that the DPPH antioxidant activity increases as the steaming degree increases.
  • FIG. 3 shows the results of the measurement of the ABTS antioxidant activity of Taegeuksam, red ginseng and black ginseng, Taegeuksam (TGG), red ginseng (RGG) and black ginseng (BGG) was found to increase the ABTS antioxidant activity as the steaming degree increases.
  • the fibrin method of Haverkate-trass was modified in part. 10 ml of the solution completely dissolved so that the final concentration of fibrinogen with PBS was 0.6% was transferred to a Petri dish, and 1 unit / ml of thrombin solution dissolved in PBS was allowed to stand at room temperature for 30 to 50 minutes to solidify. After that, ginseng extract, Taegeuksam, red ginseng and black ginseng were prepared in the same manner as in Example (3-1), and ginseng extract, Taegeuk ginseng extract, red ginseng extract, and black ginseng extract were used as test solutions.
  • the ginseng extract, taeguk ginseng extract, red ginseng extract and black ginseng extract were used by dripping on a fibrin plate by concentration on a 6mm filter paper disc and using plasmin from human plasma 1unit / ml as positive control, 5% CO set at 35-37 ° C. After reacting for 3 to 4 hours in 2 incubation, the activity was measured by measuring the width of the transparent ring formed by dissolving the fibrin plate.
  • Human umbilical vein endothelial cells are purchased from Lonza (Walkers ville, MD) and from EBM-2 Bullet kit growth medium Incubation in a 5% CO 2 incubation set to 35 ⁇ 37 °C. During the experiment, HUVECs were used passaged 4-9 times. When HUVEC is filled in 90 ⁇ 95% of the culture dish, Ginseng Extract, Taegeuk Ginseng Extract, Red Ginseng Extract and Black Ginseng Extract are treated by concentration and pretreated for 1 hour, followed by LPS (1 ⁇ g / mL), TNF- ⁇ (10ng). / mL), palmitate and high glucose (50mM) were treated hourly.
  • Cytotoxicity against ginseng extract, taeguk ginseng extract, red ginseng extract and black ginseng extract was tested by MTT assay. Inoculate cells per well (1 ⁇ 10 5 cells) on a 24 well plate and incubate for 24 to 28 hours in a 5% CO 2 incubation set at 35 to 37 ° C. to obtain a cell monolayer. Incubate for 48 hours. After incubation for 24 to 28 hours, the supernatant was removed and 450-500 uL of MTT solution was added to each well and allowed to stand for 3 to 4 hours in 5% CO 2 incubation set at 35 to 37 ° C. Then, after completely removing the MTT solution, the formazan crystals formed in cells were dissolved with 1 mL dimethyl sulfoxide (DMSO), and the absorbance was measured at 570 nm with an ELISA plate reader.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • RNA pellet was dried.
  • the extracted total RNA was quantified using a UV spectrophotometer and calibrated to a concentration of 1mg / mL and stored frozen at -70 °C.
  • RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction
  • the extracted total RNA was synthesized cDNA using a cDNA synthesis kit (TaKaRa, USA). 1 ⁇ l of cDNA mixture and PCR mixture (dNTP Mixture, 10 ⁇ taq buffer, taq polymerase, PCR primer, DW) were mixed for PCR to identify VCAM-1 and ICAM-1. The reaction was carried out with a PCR cycle repeated 25 to 30 times. At this time, in order to confirm that the same amount of RNA was used in each RT-PCR, PCR was performed using the housekeeping gene GAPDH.
  • the cells were divided into 2 ⁇ 10 6 cells per plate in a 100 mm culture dish and the cells were cultured under various treatment conditions.
  • the cultured cells were recovered, washed with d-PBS, and washed with lysis buffer (20 mM Hepes pH 7.0, 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 20 mM ⁇ -glycerophosphate).
  • FIGS. 4 and 5 Experiment results refer to FIGS. 4 and 5.
  • Figure 4 shows the thrombolytic activity test results of red ginseng extract
  • Figure 5 shows the thrombolytic activity test results of black ginseng extract
  • red ginseng extract increased solubility in a concentration-dependent manner, especially black ginseng extract Solubility was highest in the extract.
  • FIG. 6 shows the results of cytotoxicity test of ginseng extract, taeguk ginseng extract, red ginseng extract and black ginseng extract, and ginseng extract, taeguk ginseng extract, red ginseng extract and black ginseng extract showed no cytotoxicity up to 2 mg / mL concentration. .
  • FIGS. 7, 8 and 9 show the results of VCAM-1 expression of ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 8 shows the VCAM-1 expression results of red ginseng extract in HUVEC.
  • Figure 9 shows the results of VCAM-1 expression of taeguk extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • ginseng extract did not show a concentration-dependent inhibitory effect, but red ginseng extract showed a strong concentration-dependent inhibition, Taeguksam and black ginseng extract also showed a VCAM-1 expression in a concentration-dependent manner In particular, black ginseng extract was reduced by more than 35% from 0.25 mg / mL concentration.
  • FIGS. 10 and 11 show the results of ICAM-1 expression of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC
  • Figure 11 shows the results of ICAM-1 expression of Taegeuk ginseng extract and black ginseng extract in HUVEC
  • ginseng extract has a concentration-dependent inhibitory effect
  • Red ginseng extract showed strong concentration-dependent inhibition, but decreased from 0.125 mg / mL to 38%.
  • Taegeuk ginseng extract and black ginseng extract also suppressed ICAM-1 expression in a concentration-dependent manner.
  • FIGS. 12 and 13 shows the results of IL-6 expression of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC
  • FIG. 13 shows the results of IL-6 expression of taeguk extract and black ginseng extract in HUVEC, ginseng extract, Taegeuk ginseng extract, red ginseng extract and red ginseng Water extract was confirmed that IL-6 expression is strongly inhibited in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 15 shows the results of TNF- ⁇ expression of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC
  • FIG. 15 shows the results of TNF- ⁇ expression of Taegeuk ginseng extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • Black ginseng extract was confirmed that the TNF- ⁇ expression is suppressed in a concentration-dependent manner, in particular strong inhibition was confirmed in black ginseng extract.
  • FIGS. 16 and 17 show the results of E-Selectin expression of ginseng extract and red ginseng extract in HUVEC
  • FIG. 17 shows the results of E-Selectin expression of Taegeuk ginseng extract and black ginseng extract in HUVEC.
  • Black ginseng extract was confirmed that the E-Selectin expression is inhibited in a concentration-dependent manner, especially strong red ginseng extract and black ginseng extract.
  • FIG. 18 confirmed the expression of VCAM-1, ICAM-1, and E-Selectin proteins in red ginseng extract and black ginseng extract in HUVEC. As a result, it was observed that protein expression was suppressed in a concentration-dependent manner when red ginseng and black ginseng extract were treated.
  • the effect of inhibiting the expression of various vascular inflammation-related factors using ginseng extract, taeguk ginseng extract, red ginseng extract and black ginseng extract was confirmed that the red ginseng extract and black ginseng extract exhibited a thrombus suppressing effect.
  • various inflammation-related protein expression was also found to be more effective in red ginseng extract and black ginseng extract. * In particular, the treatment of inflammatory mediators, LPS, seems to increase TNF- ⁇ , suggesting that it is involved in the expression of cell adhesion factors.

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Abstract

본 발명은, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 인삼표면의 이물질을 제거하기 위해 인삼을 세척하는 단계; 세척한 인삼을 열풍 또는 햇볕으로 건조시키는 예비건조단계; 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계; 스팀분사를 정지하는 스팀정지단계; 열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 1차 증삼하는 단계; 1차 증삼한 인삼을 20~40℃에 냉각하여 1~2일 건조시키는 1차 건조단계; 1차 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계; 스팀분사를 정지하는 스팀정지단계; 열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 2차 증삼하는 단계; 2차 증삼한 인삼을 20~40℃에 냉각하여 1~2일 건조시키는 2차 건조단계; 2차 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계; 스팀분사를 정지하는 스팀정지단계; 열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 3차 증삼하는 단계; 및 3차 증삼한 인삼을 40~60℃ 건조실에서 1~2일 건조하는 3차 건조단계;를 포함하는, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법에 관한 것이다.

Description

유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 흑삼
본 발명은, 흑삼 증숙공정시 인삼에 고온의 열을 직접 가하지 않고 열매체유 간접열장치를 이용하여 증삼함으로써, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법을 제공하는 것이다.
인삼은 이미 오래전부터 그 효능 및 유효성이 잘 알려져 온 한약재이다. 상기 인삼은 수삼(水蔘, fresh ginseng)을 그대로 사용하거나, 건조시켜 백삼(白蔘, white ginseng)의 형태로 제조하여 사용하거나 또는 증숙시켜 홍삼(紅蔘, red ginseng)의 형태로 제조하여 사용되었다.
한편, 인삼의 가공방법에 따라 인삼에 존재하지 않는 새로운 성분이 생성되며, 인삼에 비해서 항산화작용을 비롯한 여러 가지 생리활성에 대해서 보다 우수한 효과를 나타내는 새로운 가공 인삼을 개발할 수 있다. 특히, 약 1,000년 전부터 제조되어 온 것으로 알려진 홍삼은 증숙공정을 거치는 동안 2차적 성분변환이 일어나 수삼이나 백삼에 존재하지 않는 홍삼 특유의 새로운 약효성분들이 생성되기도 하고, 어떤 활성성분은 함량 증가가 일어난다.
지금까지 연구된 바에 의하면, 인삼에 존재하는 활성성분은 대체로 진세노사이드(Ginsenoside)이라고 알려져 있는데, 진세노사이드는 트리터펜(triterpene)인 비당부(protopanaxadiol 또는 protopanaxatriol)의 R1, R2, R3의 알콜성 OH기에 글루코스, 람노스, 자일로스, 아라비노스와 같은 당류가 에스테르 결합된 구조를 갖는 화합물로서, 현재까지 30종 이상이 밝혀져 있으며, 항암작용, 항당뇨작용, 중추신경 억제작용, 동맥경화 및 고혈압의 예방, 간기능 촉진 및 숙취제거 효과, 항피로, 항스트레스 작용, 항산화작용, 항염활성, 단백질합성 촉진작용 및 면역 증강작용 등의 약리활성 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
이들 진세노사이드는 대체로 수삼에 존재하는 것으로 알려져 있으나, 특정한 일부 진세노사이드는 가공된 인삼에만 존재하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 진세노사이드 중에서 Rb1 및 Rg1 등은 수삼에 많이 존재하며 Rg3 및 Rg5 등은 수삼에 존재하지 않고, 수삼을 증숙 및 건조시켜 제조된 가공된 인삼의 일종인 홍삼과 흑삼에 존재하는 것으로 알려져 있다.
이처럼 가공된 인삼에만 존재하는 진세노사이드는 암예방작용, 암세포성장 억제작용, 혈압강하 작용, 뇌신경세포 보호작용, 항혈전작용 및 항산화작용 등의 약리활성 효과가 다른 진세노사이드 보다도 우수하다는 연구결과가 보고되고 있어, 이들 가공된 인삼에만 존재하는 진세노사이드에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
최근에는, 이들 가공된 인삼에만 존재하는 진세노사이드의 함량을 더욱 높이기 위한 많은 연구가 진행되었으며, 그 결과 태극삼(太極蔘, taeguk ginseng), 흑삼(黑蔘, black ginseng) 등의 가공인삼이 개발되었다. 특히, 흑삼은 통상 9번 증숙시킨후 건조하는 9증9포 과정을 거쳐 인삼이 검은색으로 변하도록 가공하였으나, 9증9포 과정을 거치면서 인삼에 존재하던 진세노사이드는 줄어들었지만, 가공된 인삼에만 존재하는 진세노사이드의 함량이 증진되는 것으로 알려져 있다.
종래의 기술에 의한 9증9포 홍삼의 제조방법은 9개의 가마솥 또는 증삼기와 진공건조기를 구비한 후, 가마솥 또는 증삼기에 수삼을 넣고 증숙 시키고, 건조하는 과정을 9번 반복하는 것으로 매번 증숙할 때에는 9개의 가마솥 또는 증숙기를 순차적으로 사용하였다. 이와 같은 기술은 증숙과정에서 인삼이 터지거나 수분이 내부까지 전달되기 어렵기 때문에, 과도하게 증숙을 하게 되기도 하고, 100℃이상인 고온에서 증숙하게 되면 벤조피렌과 같은 발암물질이 다량 생성될 수 있다는 문제점이 있다.
따라서 본 출원인은 흑삼을 제조하되 유효 진세노사이드가 손실되지 않으면서 벤조피렌 함량도 저감시킬 수 있는 제조법을 안출하였다.
한편, 선행문헌을 살펴보면, 먼저, 고려인삼학회 문헌 '증숙 횟수에 따른 고려인삼의 이화학적 특성 변화' p266, Fig.7은 수삼의 스팀 직접열 증숙 횟수에 따른 수삼의 주요 진세노사이드 Rg1, Re, RC 및 Rb1와 홍삼의 특이 진세노사이드 Rg2, Rh1 및 Rg3 등의 함량 변화를 나타낸 결과가 기재되어있다.
개략적으로 살펴보면, 수삼의 주요 진세노사이드 중 Rb1은 2회 증숙부터 지속적으로 감소경향을 나타내다가 9회 증숙시에는 미량만 나타내었고, Rg1의 경우 3회 증숙처리 시까지는 큰 변화가 없었으나 이후 4회 이후부터 급격히 감소하는 경향을 나타내어 9회 증숙처리 후에는 거의 검출되지 않았다. 반면 홍삼 특이 진세노사이드 Rg3의 경우 초기 수삼에는 거의 미량으로 존재하다가 6회 이후에야 증가하기 시작하였다.
즉 증숙횟수를 증가할수록 진세노사이드 Rb1 및 Rg1은 4~5회 이후에는 급속히 감소하여 손실되기 시작함을 알 수 있고, Rg3는 6회가 넘어가야 유효량이 증가하므로, 스팀 직접열 방식의 증숙으로는 Rb1, Rg1 및 Rg3가 모두 일정 수준 이상 포함되도록 하는 것이 어렵다는 것을 알 수 있다.
또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1071851호 "Rg3 및 Rh2의 함량이 증가된 흑삼추출물의 제조방법"에는 증숙공정을 9회 반복수행하여 흑삼을 제조하는 방법에 있어 1회 및 6회차 증숙공정시 5 내지 15기압의 압력하에 증숙과정을 거쳐 흑삼을 제조함으로써 Rg3와 Rh2의 함량이 증가된 흑삼 추출물을 제조하는 방법이 기재되어 있다.
즉 고압증숙의 경우에 증숙횟수가 증가할수록 Rg3 및 Rh2 함유량이 증가하는 것에 관한 것으로서(식별항목 [0046], 표 3 참조), 증숙횟수가 거듭될수록 홍삼 특유의 진세노사이드가 증가되는 것을 분석했다는 점에서 긍정적이지만, Rb1 및 Rg1의 함유량 변화에 대해서는 분석되어 있지 않다.
본 발명의 해결과제는, 흑삼 증숙공정시 인삼에 고온의 열을 직접 가하지 않고 간접열을 이용하여 증삼함으로써, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 해결과제는, 간접열을 이용하여 제조된 흑삼이 항산화 및 혈전 용해 기능성을 보유하도록 할 수 있는, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 흑삼 증숙공정시 인삼에 고온의 열을 직접 가하지 않고 열매체유 간접열장치를 이용하여 증삼함으로써, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
구체적으로, 인삼표면의 이물질을 제거하기 위해 인삼을 세척하는 단계; 세척한 인삼을 열풍 또는 햇볕으로 건조시키는 예비건조단계; 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계; 스팀분사를 정지하는 스팀정지단계; 열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 1차 증삼하는 단계; 1차 증삼한 인삼을 20~40℃에 냉각하여 1~2일 건조시키는 1차 건조단계; 1차 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계; 스팀분사를 정지하는 스팀정지단계; 열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 2차 증삼하는 단계; 2차 증삼한 인삼을 20~40℃에 냉각하여 1~2일 건조시키는 2차 건조단계; 2차 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계; 스팀분사를 정지하는 스팀정지단계; 열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 3차 증삼하는 단계; 및 3차 증삼한 인삼을 40~60℃ 건조실에서 1~2일 건조하는 3차 건조단계;를 포함하는, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법을 제공함으로써, 해결과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 제조방법은, 스팀 직접열을 이용하지 않고 간접열을 이용함으로써 증숙 공정시 손실될 수 있는 진세노사이드를 유지시킬 수 있는 효능을 보유하고 있다. 본 발명에 따른 제조방법은, 간접열을 이용함으로써 고온 증숙에서 발생 가능성이 높은 벤조피렌을 저감시킬 수 있는 효능을 보유하고 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 흑삼은 항산화 및 혈전 용해 기능성을 보유하고 있다. 본 발명에 따라 제조된 흑삼은, VCAM-1, ICAM-1, IL-6, TNF-α 및 E-Selectin의 발현을 억제하여 혈전 용해 기능을 상승시키는 효과를 보유하고 있다. 본 발명에 따라 제조된 흑삼은 혈전증에 따라 발생되는 증상을 개선할 수 있는 효능을 보유하고 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 흑삼의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 2는 태극삼, 홍삼 및 흑삼의 DPPH 항산화 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 태극삼, 홍삼 및 흑삼의 ABTS 항산화 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 홍삼추출물의 혈전용해 활성시험결과를 나타낸 것이다.
도 5는 흑삼추출물의 혈전용해 활성시험결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물의 세포독성실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HUVEC에서 인삼추출물의 VCAM-1 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HUVEC에서 홍삼추출물의 VCAM-1 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼물추출물의 VCAM-1 발현결과를 나타낸 것이다.
도 10은 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 ICAM-1 발현결과를 나타낸 것이다.
도 1은 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼추출물의 ICAM-1 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 IL-6 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 TNF-α 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 15은 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼추출물의 TNF-α 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 16는 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 E-Selectin 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼추출물의 E-Selectin 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 HUVEC에서 홍삼추출물과 흑삼물추출물의 VCAM-1, ICAM-1, E-Selectin 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 3회 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼을 나타낸 것이다.
실시예 1. 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법
(1-1) 제조방법
진안지역에서 재배된 4년근 인삼을 채굴하여 크기와 모양이 비슷하게 선별하고 채취하여 흙이나 비닐 등 이물질을 완전히 제거한 뒤 증삼장치와 건조장치를 이용하여 흑삼을 제조하였다. 상기 흑삼을 제조하는 방법은 도 1을 참조하며, 구체적인 방법은 다음과 같다.
① 세척단계 : 인삼을 원통형세척기에 넣고, 인삼이 손상되는 것을 방지하기 위해 5~10분간 3회 반복해서 세척하여 인삼표면의 흙이나 비닐 등의 이물질을 완전히 제거한다. ② 예비건조단계 : 세척한 인삼을 40~50℃로 설정된 열풍건조기에서 3~10시간 건조 시키거나, 햇볕에서 1~2일 건조한다. ③ 예열단계 : 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~90℃까지 빠르게 온도를 높인다. ④ 스팀 정지단계 : 스팀분사를 정지하여 10~20분간 유지한다. ⑤ 1차 증삼단계 : 인삼 표면에 직접 접촉하는 스팀의 분사 없이 열매체유 등 간접열을 이용하여 85~95℃에서 5~10시간 증삼한다. ⑥ 1차 건조단계 : 1차 증삼한 인삼을 20~40℃로 냉각하여 인삼표면의 수분이 제거되도록 1~2일간 건조한다. ⑦ 2차 증삼단계 : 1차 건조한 인삼을 상기 ③ ~ ⑤와 동일한 방법으로 인삼을 2차 증삼한다. ⑧ 2차 건조단계 : 2차 증삼한 인삼을 상기 ⑥과 동일한 방법으로 인삼을 2차 건조한다. ⑨ 3차 증삼단계 : 2차 증삼한 인삼을 상기 ③ ~ ⑤와 동일한 방법으로 인삼을 3차 증삼한다. ⑩ 3차 건조단계 : 상기 3차 증삼한 인삼을 40~60℃ 건조실에서 1~2일간 건조하여 인삼 표면의 수분을 제거하고 건조실에서 최종 수분이 15% 이하가 되도록 건조하여 흑삼을 제조한다. 상기 흑삼 증숙공정은 필요에 따라 4~5회 더 증삼할 수 있다.
실시예 2. 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼을 이용한 약학적 조성물
실시예 1에 기재된 과정으로 제조된 흑삼은 항산화 및 혈전 용해 기능성을 보유하고 있으므로, 혈전증으로 인해 발생되는 증상에 약학적 조성물로 이용될 수 있다. 약학적 조성물을 제조하기 위해서, 실시예 1에 따라 제조된 흑삼 추출물 또는 엑기스 또는 건조 분말 등에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형 제형으로 제공한다.
실시예 3. 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼을 이용한 식품 조성물
실시예 1에 기재된 과정으로 제조된 흑삼은 항산화 및 혈전 용해 기능성을 보유하고 있으므로, 기능성 음료, 각종 식품류, 건강보조식품, 차, 과자류, 껌, 차, 비타민 복합제 등과 같이 다양한 형태의 식품 조성물로 이용될 수 있다.
실험예 1. 시판되는 흑삼의 성분 분석
(1-1) 실험방법
시중에서 판매하는 흑삼 5종을 구입하여 흑삼추출물을 수득하고, HPLC(고속액체크로마토그래피)를 이용하여 상기 흑삼추출물에 포함된 진세노사이드함량 및 벤조피렌함량을 분석하였다. 구체적으로, 상기 흑삼 5종을 마쇄하고, 증류수를 가하여 실온에 방치한 후 에탄올을 가하여 추출 및 여과한 다음, 감압농축기에 농축하고 동결건조하여 고체상의 흑삼 추출물을 각각 수득하였다. 그런 다음, 상기 각각의 고체상의 흑삼 추출물에 증류수를 가하여 현탁시키고 에테르를 첨가하여 혼합한 다음, 분별깔대기에 가하고 실온에서 방치한 다음 수층을 수득하였다. 상기 수득한 각 분석시료에 메탄올을 가하여 용해시키고, 0.45㎛ 필터로 여과한 다음, HPLC를 이용하여 진세노사이드함량 및 벤조피렌함량을 분석하였다. 벤조피렌은 증숙시 탄화된 흑삼으로부터 검출되는 성분으로서, 암 유발물질 중의 하나로 알려져 있는 바, 벤조피렌 함량은 증숙공정에 의한 부작용의 발생 여부를 확인하기 위한 지표로 사용하였다.
(1-2) 실험결과
실험결과는 표 1 및 표 2를 참조한다.
함량(mg/g) 흑삼시판-1 흑삼시판- 2 흑삼시판- 3 흑삼시판- 4 흑삼시판- 5 흑삼시판-평균
Rg1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Re 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Rf 0.18 0.08 0.13 0.25 0.66 0.26
Rh1(s)+Rg2(s) 0.53 0.33 0.40 0.89 1.63 0.75
Rb1 0.00 0.00 0.06 0.00 0.11 0.04
Rc 0.00 0.00 0.02 0.00 0.06 0.02
Ra1 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Rb2 0.04 0.04 0.04 0.05 0.09 0.05
Rb3 0.00 0.00 0.00 0.00 0.02 0.00
Rd 0.02 0.03 0.09 0.02 0.12 0.05
Rg3(s) 0.73 0.72 0.63 1.40 1.70 1.04
Rg5 1.13 1.31 0.88 2.66 2.01 1.60
합계 2.63 2.51 2.26 5.26 6.40 3.81
표 1은 HPLC를 이용하여 흑삼 5종의 진세노사이드함량을 분석한 결과로, 시중에서 판매되는 흑삼에는 진세노사이드 Rb1 및 Rg1의 함량이 거의 존재하지 않은 것으로 나타났으며, Rg3의 함량은 0.6~1.7mg/g이 함유되어 있는 것으로 보아, 시중에 판매되고 있는 흑삼은 Rb1 및 Rg1의 진세노사이드의 함량이 적은 것으로 나타났다.
Benzopyrene(BG) BG 1 BG 2 BG 3 BG 4 BG 5 BG 평균
함량(㎍/kg) 0.89 0.94 0.93 0.73 0.68 0.83
표 2는 HPLC를 이용하여 흑삼 5종의 벤조피렌(Benzopyrene) 함량을 분석한 결과로, 시중에서 판매되는 흑삼에는 벤조피렌 함량이 0.6~0.9㎍/kg을 함유하는 것으로 나타났으며, 평균적으로 0.8㎍/kg을 함유하고 있어 식품의약품안전처에서 정한 기준(2.0㎍/kg)은 만족하였으나, 안정적인 품질유지를 위해 꾸준한 관리가 필요할 것으로 판단되었다.
실험예 2. 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 성분분석
상기 실시예 1의 3회 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 흑삼 추출물을 제조한 후 HPLC를 이용하여 진세노사이드함량 및 벤조피렌함량을 분석하였다. 분석결과는 표 3 및 표 4를 참조한다.
함량(mg/g) 흑삼시판(9증) 흑삼제조(3증)
Rg1 0.00 0.41
Re 0.00 0.49
Rf 0.26 0.58
Rh1(s)+Rg2(s) 0.75 1.28
Rb1 0.04 3.06
Rc 0.02 1.60
Ra1 0.00 0.97
Rb2 0.05 1.46
Rb3 0.00 0.20
Rd 0.05 0.96
Rg3(s) 1.04 2.01
Rg5 1.60 1.95
합계 3.81 14.97
표 3은 시중에서 판매되는 9증9포의 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼과 실시예 1의 3회 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼의 진세노사이드 함량을 분석한 결과로, 시중에서 판매되는 흑삼에 비해 3회 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼에서 Rb1, Rg1, Rg3 및 Rg5의 총 함량이 증가하였다. 식품의약안전처에서 인삼 제품은 건강기능 식품으로서 인삼의 지표성분인 Rg1과 Rb1의 합이 1일 기준으로 3~80mg/g 이상 섭취하였을 때 피로개선과 면역력을 증진시킬 수 있는 효과를 보유하고 있다고 고시하고 있다. 또한, 홍삼의 지표 성분인 Rg1, Rb1 및 Rg3의 합이 1일 기준으로 3~80mg/g 이상 섭취하였을 때 피로개선과 면역력을 증진시킬 뿐만 아니라 혈소판 응집억제를 통한 혈액흐름개선과 기억력을 개선 시키고, 항산화 활성을 증가시키는 효과를 보유하고 있다고 고시하고 있다. 그러나 시중에서 판매되는 흑삼은 인삼 고유의 성분인 Rg1과 Rb1의 함량이 거의 존재하지 않아 Rg1과 Rb1의 기능성이 떨어지는 문제점이 있다.
반면, 실시예 1의 3회 증숙공정을 거쳐 제조한 흑삼은 Rg1과 Rb1의 총 함량이 3.47mg/g으로 Rg1과 Rb1의 기능성에 대한 효과를 기대할 수 있다. 나아가 Rg1, Rb1 및 Rg3의 총 함량이 5.48mg/g이 되므로 Rg1, Rb1 및 Rg3의 효과가 더욱 증진됨을 알 수 있다.
Benzopyrene 흑삼시판(9증) 흑삼제조(3증)
함량(㎍/kg) 0.83 0.51
표 4는 시중에서 판매되는 9증9포의 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼과 실시예 1의 3회 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼의 벤조피렌 함량을 분석한 결과로, 시중에서 판매되는 흑삼에 비해 3회 증숙공정을 거쳐 제조된 흑삼에서 벤조피렌함량이 감소하는 것으로 나타났다.
실험예 3. 태극삼, 홍삼 및 흑삼의 항산화 활성분석
(3-1) 시험용액제조
① 태극삼, 홍삼 및 흑삼을 마쇄하여 분말을 제조한다. ② 3개의 tube에 상기 제조한 분말 1~2g, 50% ethanol 40~50ml을 각각 넣어 80~85℃에서 2시간~2시간 30분 동안 환류 추출하고 3000rpm에서 10~15분 동안 원심분리하여 상등액만 취하였다. ③ 상기 상층액만 취하고 남은 잔사에 50% ethanol을 30~40ml 넣어 상기 ②와 같은 과정으로 환류 추출 및 원심분리한 후 상등액만 모아 100ml로 정용한 추출물(태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물)을 시험용액으로 이용하였다.
(3-2) DPPH 항산화 활성 측정
상기 (3-1)에서 제조한 추출물 2~3ml, ethanol 1~2ml 및 1mM DPPH 용액 1~2ml를 순차적으로 넣고 혼합하여 암소에서 30~50분 동안 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정결과는 도 2를 참조한다. 도 2는 태극삼, 홍삼 및 흑삼의 DPPH 항산화 활성 측정 결과를 나타낸 것으로, 태극삼(TGG), 홍삼(RGG) 및 흑삼(BGG)은 증숙도가 증가함에 따라 DPPH 항산화 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
(3-3) ABST 항산화 활성 측정
상기 (3-1)에서 제조한 추출물 100~120㎖, 증류수 2~3ml 및 radical 용액 2~3ml를 순차적으로 넣고 혼합하여 암소에서 30~50분 동안 방치한 후 735nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정결과는 도 3을 참조한다. 도 3은 태극삼, 홍삼 및 흑삼의 ABTS 항산화 활성 측정 결과를 나타낸 것으로, 태극삼(TGG), 홍삼(RGG) 및 흑삼(BGG)은 증숙도가 증가함에 따라 ABTS 항산화 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 인삼, 태극삼, 홍삼 및 흑삼의 혈전용해 활성분석
(4-1) 실험방법
① 혈전용해 활성시험
Haverkate-trass의 fibrin 법을 일부 변형하여 측정하였다. PBS로 fibrinogen의 최종농도가 0.6%가 되도록 완전히 용해시킨 용액 10ml를 Petri dish에 옮기고 PBS에 녹인 thrombin 용액 1unit/ml를 30~50분 동안 상온에 방치하여 고화시켰다. 그 후 인삼, 태극삼, 홍삼 및 흑삼을 상기 실시예 (3-1)과 같은 방법으로 제조한 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물을 시험용액으로 사용하였다. 상기 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물을 6mm filter paper disc에 농도별로 fibrin plate 상에 점적하여 사용하고 positive control로 plasmin from human plasma 1unit/ml을 사용하여 35~37℃으로 설정된 5% CO2 incubation 에서 3~4시간 동안 반응시킨 후 fibrin plate가 용해되어 형성된 투명환의 넓이를 측정하여 활성도를 측정하였다.
② 세포배양
HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)은 Lonza (Walkers ville, MD)에서 구입하고 EBM-2 Bullet kit growth medium에서 35~37℃으로 설정된 5% CO2 incubation에서 배양하였다. 실험하는 동안, HUVEC은 4∼9회 계대배양 한 것을 사용하였다. 배양접시에 HUVEC이 90∼95% 정도 채워졌을 때, 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물을 농도별로 처리한 후 1시간 동안 전처치 한 뒤 LPS(1μg/mL), TNF-α(10ng/mL), palmitate 및 high glucose(50mM)를 시간별로 처리하였다.
③ 세포독성시험
인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물에 대한 세포독성은 MTT assay로 시험하였다. 24 well plate에 well당 세포(1×105 cells)를 접종하여 35~37℃으로 설정된 5% CO2 incubation에서 24~28시간 배양하여 세포 단층을 얻은 후, 각 추출물을 농도별로 처리하여 24~48시간 동안 배양하였다. 24~28시간 배양 후 상층액을 제거하고 MTT 용액 450~500uL을 각 well에 가하여 35~37℃으로 설정된 5% CO2 incubation에서 3~4시간 동안 정치하였다. 그 후 MTT 용액을 완전히 제거한 후 1mL dimethyl sulfoxide(DMSO)로 세포 내에 형성된 formazan 결정체를 용해하여 ELISA plate reader로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
④ ELISA
24 well plate에 cell(5x105 cells/well)을 배양한 후 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼물추출물과 LPS(1μg/mL), TNF-α(10 ng/mL), palmitate 및 high glucose(50mM)를 처리한 후 상층액을 항체가 코팅되어진 96 well plate (ICAM-1, VACM-1, Seletin kit)에 100μL 넣은 후 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후에,Washing buffer(0.05% Tween 20 in d-PBS)로 4~5회 세척하고 biotin-conjugated anti-human antibody (ICAM-1, VCAM-1 및 Seletin)를 blocking buffer에 1:500으로 희석하여 100~150㎕씩 첨가하여 상온에서 1-2시간 동안 방치하였다. 그 후에, washing buffer로 4회 세척하고 streptavidin-HRP를 첨가한 후 30~50분간 반응시킨 후 4~5회 세척하였다. 그 후에, substrate를 100㎕ 첨가하여 빛이 들어오지 않는 상온에서 30~50분 동안 반응시킨 후 stop buffer를 첨가하고 microplate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
⑤ 총 RNA 분리 및 정량
HUVEC 세포를 100mm culture dish에 plate당 2×106 cell을 분주하고 다양한 처리조건으로 세포를 배양하였다. 배양된 세포로부터 상등액을 제거한 후 d-PBS를 이용하여 세척하고 1ml의 Trizol reagent를 가하여 culture dish 바닥에 점도가 사라질 때까지 pipetting하고 microcentrifuge에 옮겼다. 세포가 완전히 용해될 때까지, 대략 5분간 inversion한 후에 chloroformdmf 200㎕를 가하고 15초 동안 교반 하였다. 상온에서 10분 정도 방치한 후 원심분리 (12,000xg, 4℃, 15분)하였다. 상등액을 새로운 tube에 옮긴 후 isoprophanol을 상등액과 동량으로 가하고 inversion한 후 원심분리 (12,000 xg, 4 ℃, 15분)하였다. 상등액을 버리고 pellet을 75% DEPC-treated cold ethanol로 세척한 후, RNA pellet이 건조된 상태에서 DEPC-treated dH2O에 용해시켰다. 이때 추출된 total RNA는 UV spectrophotometer를 이용하여 정량하고 1mg/mL 농도가 되도록 보정하여 -70℃에 냉동보관하였다.
⑥ RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 VCAM-1과 ICAM-1의 mRNA 발현량을 측정하였다. 추출된 total RNA는 cDNA synthesis kit (TaKaRa, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. VCAM-1과 ICAM-1을 확인하기 위한 PCR을 위하여 생성된 cDNA mixture 1㎕와 PCR mixture (dNTP Mixture, 10×taq buffer, taq polymerase, PCR primer, DW)를 혼합하여 총 25㎕의 반응액을 25~30회 반복하는 PCR cycle로 반응하였다. 이때 각각의 RT-PCR에서 동량의 RNA가 사용되었음을 확인하기 위하여 housekeeping gene인 GAPDH를 사용하여 함께 PCR을 진행하였다.
⑦ 총 단백질의 분리 및 정량
세포를 100mm culture dish에 plate당 2×106 세포를 분주하고 다양한 처리조건으로 세포를 배양하였다. 배양된 세포를 회수하여 d-PBS를 이용하여 세척하고 세포침전물에 lysis buffer (20mM Hepes pH 7.0, 2mM EGTA, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 150mM NaCl, 20mM β-glycerophosphate, 5 ng/ml leupeptin, 0.1 unit/ml aprotinin) 200-500μL 넣고 침전물을 녹인 후에 ice에 30～60분간 방치해 놓은 후에 원심분리 (4℃, 13000rpm, 10분)하여 상등액을 취해 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질의 양을 정량하였다.
⑧ Western blot analysis
실험에 이용할 20-50㎍의 단백질을 적당한 농도의 SDS-PAGE gel에 전기 영동한 후 PVDF membrane에 transfer하였다. 단백질이 옮겨진 membrane은 1시간 동안 상온에서 5% skim milk in TBST (Tris Buffered Saline with Tween; 25 mM Tris, 140mM NaCl, 3mM KCl, 0.05% Tween-20, pH 8.0)를 blocking buffer로 만들어 처리한 후 1차 항체를 넣고 4℃에서 overnight 처리하였다. 0.25% TBST로 3회 세척 후 HRP-conjugated secondary antibody in blocking buffer를 3시간 동안 상온에서 처리하였다. 0.25% TBST로 3회 세척 후에 detection reagent (ECL)를 가한 후 Kodak scientific imaging film에 노출시켜 각각의 단백질 발현을 확인하였다.
⑨ ROS 측정
HUVEC을 100mm culture dish에 2x106 cells을 배양한 후 각각의 처리조건에 맞춰 각 추출물(인삼, 태극삼, 홍삼, 흑삼물추출물)과 LPS (1 μg/mL), TNF-α (10 ng/mL), palmitate, high glucose (50 mM)를 처리한 후 상층액을 제거한 후 1×PBS로 세척하였다. 세포에 cell lysis buffer (RIPA buffer)를 처리한 후 세포를 녹인 후 원심분리하여 상층액 (단백질)을 분리하였다. Total ROS 측정을 위한 항체가 코팅되어진 96 well plate (ROS ELISA KIT, Cell Signaling)에 단백질을 100 μL 넣은 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후에, washing buffer (0.05% Tween 20 in d-PBS)로 4회 세척하고 biotin-conjugated anti-human antibody를 blocking buffer에 1:500으로 희석하여 100㎕씩 첨가하여 상온에서 1~2시간 동안 방치하였다. 그 후에, washing buffer로 4회 세척하고 streptavidin-HRP를 첨가한 후 30~50분간 반응시킨 후 4~5회 세척하였다. 그 후에, substrate를 100㎕ 첨가하여 빛이 들어오지 않는 상온에서 30~50분 동안 반응시키고 stop buffer를 첨가한 후 microplate reader를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
(4-2) 실험결과
① 혈전용해 활성시험결과
실험결과는 도 4 및 도 5를 참조한다. 도 4는 홍삼추출물의 혈전용해 활성시험결과를 나타낸 것이고, 도 5는 흑삼추출물의 혈전용해 활성시험결과를 나타낸 것으로, 혈전용해 활성시험결과 홍삼물추출물은 농도의존적으로 용해도가 증가하였으며, 특히 흑삼물추출물에서 용해도가 가장 높게 나타났다.
② 세포독성시험 결과
실험결과는 첨부된 도면의 도 6을 참조한다. 도 6은 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물의 세포독성실험 결과를 나타낸 것으로, 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼추출물은 2 mg/mL 농도까지 세포독성이 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
③ VCAM-1 발현 효과
실험결과는 도 7, 도 8, 도 9를 참조한다. 도 7은 HUVEC에서 인삼추출물의 VCAM-1 발현 결과를 나타낸 것이다. 도 8은 HUVEC에서 홍삼추출물의 VCAM-1 발현 결과를 나타낸 것이다. 도 9는 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼물추출물의 VCAM-1 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 7, 도 8 및 도 9를 참조한 결과, 인삼물추출물은 농도의존적으로 억제효과를 보이지 않았으나 홍삼물추출물은 농도의존적으로 강한 억제를 보였고, 태극삼과 흑삼물추출물도 농도의존적으로 VCAM-1 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 흑삼물추출물은 0.25 mg/mL 농도에서부터 35% 이상 감소 되었다.
④ ICAM-1 발현 효과
실험결과는 도 10 및 도 11을 참조한다. 도 10은 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 ICAM-1 발현 결과를 나타낸 것이고, 도 11은 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼추출물의 ICAM-1 발현 결과를 나타낸 것으로, 인삼물추출물은 농도의존적으로 억제효과를 보이지 않았으나, 홍삼물추출물은 농도의존적으로 강한 억제를 보였으며, 0.125 mg/mL 농도부터 38% 정도 감소하였다. 또한, 태극삼추출물과 흑삼물추출물도 농도의존적으로 ICAM-1 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
⑤ IL-6 발현 효과
실험결과는 도 12 및 도 13을 참조한다. 도 12는 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 IL-6 발현 결과를 나타낸 것이고, 도 13은 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼추출물의 IL-6 발현 결과를 나타낸 것으로, 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 홍삼물추출물은 농도의존적으로 IL-6 발현이 강하게 억제되는 것을 확인하였다.
⑥ TNF-α 발현 효과
실험결과는 14 및 도 15를 참조한다. 도 14는 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 TNF-α 발현 결과를 나타낸 것이고, 도 15은 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼추출물의 TNF-α 발현 결과를 나타낸 것으로, 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼물추출물 및 흑삼추출물은 농도의존적으로 TNF-α 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 흑삼추출물에서 강한 억제를 확인하였다.
⑦ E-Selectin 발현 효과
실험결과는 도 16 및 도 17을 참조한다. 도 16는 HUVEC에서 인삼추출물 및 홍삼추출물의 E-Selectin 발현 결과를 나타낸 것이고, 도 17은 HUVEC에서 태극삼추출물 및 흑삼추출물의 E-Selectin 발현 결과를 나타낸 것으로, 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼물추출물 및 흑삼추출물은 농도의존적으로 E-Selectin 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 홍삼추출물과 흑삼물추출물에서 강한 억제를 확인하였다.
⑧ HUVEC에서 단백질발현
실험결과는 도 18을 참조한다. 도 18은 HUVEC에서 홍삼추출물과 흑삼물추출물의 VCAM-1, ICAM-1, E-Selectin 단백질발현을 확인한 결과, 홍삼과 흑삼물추출물 처리시 농도의존적으로 단백질 발현이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
본 발명은 인삼추출물, 태극삼추출물, 홍삼추출물 및 흑삼물추출물을 이용하여 각종 혈관염증관련 인자의 발현 억제효과를 관찰한 결과, 홍삼추출물과 흑삼물추출물이 혈전억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 다양한 염증관련 단백질 발현도 홍삼추출물과 흑삼물추출물에서 더 효과가 좋은 것으로 확인되었다. *특히 염증매개물인 LPS를 처리했을 때 TNF-α가 높게 증가되는 것으로 보아 세포부착인자의 발현에 관여하는 것으로 사료되어진다.

Claims (6)

  1. 인삼표면의 이물질을 제거하기 위해 인삼을 세척하는 단계;
    세척한 인삼을 열풍 또는 햇볕으로 건조시키는 예비건조단계;
    건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계;
    스팀분사를 정지하는 스팀정지단계;
    열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 1차 증삼하는 단계;
    1차 증삼한 인삼을 20~40℃에 냉각하여 1~2일 건조시키는 1차 건조단계;
    1차 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계;
    스팀분사를 정지하는 스팀정지단계; 열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 2차 증삼하는 단계;
    2차 증삼한 인삼을 20~40℃에 냉각하여 1~2일 건조시키는 2차 건조단계;
    2차 건조한 인삼을 증삼기에 넣고 스팀을 사용한 직접열을 이용해 실온에서 80~85℃까지 승온하는 예열단계;
    스팀분사를 정지하는 스팀정지단계;
    열매체유 간접열 장치를 이용하여 85~95℃의 간접열을 이용해 3차 증삼하는 단계; 및
    3차 증삼한 인삼을 40~60℃ 건조실에서 1~2일 건조하는 3차 건조단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼은, 벤조피렌활성을 억제시키고 DPPH항산화활성 및 ABST항산화활성을 증가시킴으로써 항산화 기능을 보유하고, VCAM-1, ICAM-1, IL-6, TNF-α 및 E-Selectin의 발현을 억제함으로써 혈전을 용해하는 기능을 보유하는 것을 특징으로하는, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼은, Rg1과 Rb1의 총 함량이 2.5mg이상 함유되도록 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는, 유효 진세노사이드의 손실이 없는 흑삼.
  4. 청구항 1에 기재된 제조방법으로 제조된 흑삼을 유효성분으로 함유하는, 혈전증을 개선할 수 있는 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 기재된 제조방법으로 제조된 흑삼을 유효성분으로 함유하는, 혈전증을 개선할 수 있는 식품조성물.
  6. 청구항 1에 기재된 제조방법으로 제조된 흑삼.
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