WO2017164436A1 - 고형암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커 - Google Patents

고형암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커 Download PDF

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    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a marker for predicting treatment responsiveness to an anticancer agent in a solid cancer patient, and more particularly, to a method for identifying the SNP of the PIK3R1 gene and providing information for determining whether a PI3K ⁇ inhibitor is treated.
  • Gastric cancer is particularly high in Asia and is the leading cause of cancer-related deaths (Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008.
  • Int J Cancer 2010; 127: 2893917 In Korea, 16.2% of cancer patients (20.3% of male cancer patients and 11.2% of female cancer patients) are estimated to be gastric cancer patients.
  • the annual age-standardized incidence of gastric cancer is 61.2 / 100,000 for men and 23.9 / 100,000 for women (Jung, KW, Park S, Kong HJ, Won YJ, Boo YK, Shin HR, et al. Statistics in Korea: Incidence, Mortality and Survival in 2006-2007. J Korean Med Sci 2010; 25: 1113-21).
  • phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-phosphatase Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, PI3K
  • PI3K phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase
  • PI3K is an enzyme that converts phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PI (3,4,5) P3), an active signaling intermediate.
  • PI (3,4,5) P3 activates pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1 (PDK1), which in turn activates Akt.
  • PI3K consists of two subunits, p110 and p85, each with multiple subtypes. Focusing on one subunit, p110, it has two subtypes, PIK3CA and PIK3CB, showing unusually redundant functions.
  • PTEN phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10
  • PTEN is a negative regulator of PI3K that dephosphorylates PI (3,4,5) P3 and inhibits the PI3K signaling pathway.
  • Activation of the PI3K signaling pathway is known to result from elevated levels of higher receptor tyrosine kinase (RTK) signals, such as mutations in PI3KCA (phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide) or lack of PTEN.
  • RTK receptor tyrosine kinase
  • RTK activation of PI3K modifies cells, causes dependence on PIK3CA, and deficiency of PTEN is also known to increase underlying Akt and PI3K activity, but it is known to act primarily through PI3KCB. From a reducing point of PI3K signaling, PI3K activates PDK1 and Akt and modifies cells.
  • inhibitors that specifically act on PI3K beta-isoform are known to have effects with moderate cytotoxicity in cancer patients who do not express PTEN protein. Recently, it has been reported that inhibiting the activity of PI3K beta-isoform in animal models that do not express PTEN can effectively inhibit cancer development (Jia S et al., Nature.Vol. 454, pp776-9, 2008). Wee S et al., PNAS.Vl. 105, pp13057-62. 2008; Torbett NE et al., Biochem J. Vol. 415. pp97-110. 2008; Jing Ni et al., Cancer Discovery.Vol. 5 pp 425-33.2012).
  • GSK2636771 One of the inhibitors specific to PI3K beta-isoform, GSK2636771, is a very fast phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit beta isoform (GSK2636771).
  • Compounds that selectively potently inhibit PI3K ⁇ ) can be found, and the substitution of Benzimidazole in this compound led to potent PI3K ⁇ inhibition, which was found to be a leader in this group of compounds (Rivero, RA et al. 103rd Annu Meet). Am Assoc Cancer Res (AACR) (March 31-April 4, Chicago) 2012, Abst 2913).
  • PI3K ⁇ inhibition has been shown to inhibit tumor formation in phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN (PTEN) -deficient tumors.
  • GSK-2636771 has been shown to inhibit RAC serine / Inhibition of phosphorylation of threonine-protein kinase (Akt), which has been reported to have dose-dependent results in mouse models of xenograft human PTEN-deficient tumor cells (Hardwicke, MA et al. 243rd ACS Natl Meet (March 25) -29, San Diego) 2012, Abst MEDI 21).
  • GSK-2636771 was reported to have EC50 effective concentrations of 36 and 72 nM, respectively, against PTEN-deficient cells, PC-3 (human prostate cancer cells) and HCC70 (human breast duct carcinoma) cells.
  • the PI3K ⁇ inhibitor did not raise glucose and insulin levels, and a single dose of GSK-2636771 reduced Akt phosphorylation (Ser473) in a mouse model of PC-3 cell xenografts.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method capable of confirming the reactivity of an inhibitor specifically acting on the PI3K beta-isoform.
  • SNP rs3730089
  • the effect of the specifically acting inhibitor is excellent, and the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a method for providing information for predicting the treatment responsiveness to anticancer drugs in patients with solid cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a primer and / or probe composition for predicting the reactivity of an anticancer agent in a solid cancer patient and a kit for predicting the reactivity for an anticancer agent in a solid cancer patient comprising the same.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a patient-specific solid cancer treatment.
  • the present invention relates to an anticancer agent of a solid cancer patient comprising the step of identifying a SNP (NCBI refSNP ID: rs3730089) located at the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the PIK3R1 gene in a sample. It provides a method of providing information for predicting the responsiveness to the reaction.
  • a SNP NCBI refSNP ID: rs3730089
  • the present invention can also identify a polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases comprising the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs3730089) in the PIK3R1 gene, or a complementary polynucleotide thereof.
  • a primer composition for predicting reactivity to an anticancer agent in a solid cancer patient is also identified.
  • the present invention also specifically relates to polynucleotides or complementary polynucleotides consisting of 10 or more consecutive bases comprising the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs3730089) in the PIK3R1 gene.
  • a probe composition for predicting reactivity of an anticancer agent in a hybrid cancer patient to hybridize is provided.
  • the present invention also includes the steps of (a) identifying a SNP (NCBI refSNP ID: rs3730089) located at the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the PIK3R1 gene in a sample; And (b) if present in the SNP, phosphoinositide 3-kinase beta (phosphoinositide 3-kinase ⁇ , PI3K ⁇ ) inhibitors provide a patient-specific solid cancer drug selection method comprising the step of selecting a patient for treatment of solid cancer.
  • a SNP NCBI refSNP ID: rs3730089
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the overall flow of the experiment for predicting the anticancer drug reactivity with the SNP discovered in the present invention.
  • Figure 2 summarizes the whole exome sequencing results of detecting the degree of mutation of PI3K related genes for 51 gastric cancer cell lines used in the present invention.
  • Figure 3 is a graph summarizing the association between gene reactivity and responsiveness to PI3K ⁇ inhibitors for 51 gastric cancer cell lines used in the present invention.
  • Figure 4 (A) is a result of statistical analysis of the association between the PI3K ⁇ inhibitor reactivity and PI3K-related gene mutations, (B) is a result of statistically analyzing the M326I mutation of PIK3R1 and PI3K ⁇ inhibitor in the gene to be.
  • FIG. 5 is a result of analyzing the reactivity and statistical significance of the PI3K ⁇ inhibitor according to the presence or absence of PI3K-related gene mutations by volcano graph.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing the relationship between heterozygosity of M326I mutation of PIK3R1 and reactivity to PI3K ⁇ inhibitor.
  • FIG. 7 shows the results of protein three-dimensional structural analysis of how M326I mutation of PIK3R1 changes the structure of PIK3R1 to increase the reactivity to PI3K ⁇ inhibitors.
  • 7B is a three-dimensional model that analyzes how the site of GSK2636771 binding to wild-type and mutant PIK3R1 occurs.
  • FIG. 9 is a conceptual diagram of a method for selecting a patient-specific solid cancer treatment agent of the present invention.
  • 10 is a result showing that the SNP of the present invention can measure the reactivity to PI3K ⁇ inhibitors in various solid cancers as well as gastric cancer.
  • the mutation information of the PI3K-related genes are identified through whole exome sequencing in various gastric cancer cell lines, and the reactivity of the PI3K ⁇ inhibitors of each cell line is confirmed through a cell viability assay.
  • the present invention provides an anticancer agent for a solid cancer patient comprising identifying a SNP (NCBI refSNP ID: rs3730089) located at the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the PIK3R1 gene in a sample.
  • SNP NCBI refSNP ID: rs3730089
  • SEQ ID NO: 1 The NCBI refSNP ID for the SNP in SEQ ID NO: 1 indicates the sequence of the SNP and its position. Those skilled in the art can easily identify the position and sequence of the SNP using the number. It will be apparent to those skilled in the art that the specific sequence corresponding to the refSNP ID of the SNP registered in the NCBI may be slightly changed depending on the results of the subsequent gene studies, and such altered sequences are also included within the scope of the present invention.
  • Identification of the genotype of the SNP of the present invention sequencing analysis, sequencing analysis using an automatic sequencing analyzer, pyrosequencing, hybridization by microarray, PCR-RELP method (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP method ( single strand conformation polymorphism), PCR-SSO (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO and dot hybridization combined ASO (allele specific oligonucleotide) hybridization, TaqMan-PCR, MALDI-TOF / MS, RCA ( rolling circle amplification), high resolution melting (HRM) method, primer extension method, Southern blot hybridization method, dot hybridization method and the like.
  • PCR-RELP method restriction fragment length polymorphism
  • PCR-SSCP method single strand conformation polymorphism
  • PCR-SSO specific sequence oligonucleotide
  • PCR-SSO and dot hybridization combined ASO allele specific oligonucleotide hybridization
  • results of the SNP polymorphism can be statistically processed using statistical analysis methods commonly used in the art, for example, Student's t-test and Chi-square test (Chi- continuous variables, categorical variables, and odds ratios obtained through square test, linear regression line analysis, and multiple logistic regression analysis. Can be analyzed using variables such as% confidence interval.
  • the term "prediction" means that the patient responds favorably or unfavorably to a therapy, such as chemotherapy, to treat the patient, eg, surgical removal of certain therapeutic agents, and / or primary tumors, and / or cancer. Survival and / or likelihood after treatment with chemotherapy for a certain period of time without relapse.
  • a therapy such as chemotherapy
  • the predictive methods of the present invention can be used clinically for treatment decisions by selecting the most appropriate mode of treatment for patients with solid cancer.
  • the predictive methods of the present invention determine whether a patient preferentially responds to a treatment regimen, such as, for example, a treatment regimen, including administration of a given therapeutic agent or combination, surgical intervention, chemotherapy, etc. It is possible to predict whether long term survival is possible.
  • the present invention provides a method for identifying a polynucleotide or a complementary polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases including the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs3730089) in the PIK3R1 gene.
  • the present invention relates to a primer composition for predicting the reactivity of an anticancer agent in a solid cancer patient.
  • the appropriate length of the primer may vary depending on the purpose of use, but may generally consist of 15 to 30 bases.
  • the primer sequence need not be completely complementary to the template, but should be sufficiently complementary to hybridize with the template.
  • the primer may hybridize to a DNA sequence including a polymorphic site to amplify a DNA fragment comprising a polymorphic site.
  • the primer of the present invention can be used in diagnostic kits or prediction methods for detecting alleles and predicting responsiveness to anticancer agents in solid cancer patients.
  • the present invention provides a polynucleotide or a complementary polynucleotide consisting of 10 or more consecutive bases comprising the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs3730089) in the PIK3R1 gene;
  • the present invention relates to a probe composition for predicting reactivity to an anticancer agent of a specific hybridizing cancer patient.
  • the probe may be allele-specific, which means to hybridize specifically to each allele. That is, it means hybridizing to specifically distinguish bases of the polymorphic sites present in the polymorphic sequence.
  • hybridization is usually carried out under stringent conditions, for example salt concentrations of 1 M or less and temperatures of 25 ° C. or higher.
  • stringent conditions for example salt concentrations of 1 M or less and temperatures of 25 ° C. or higher.
  • 5XSSPE 750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4
  • 25-30 ° C. may be suitable for allele specific probe hybridization.
  • the probe means a hybridization probe, and means an oligonucleotide capable of sequence-specific binding to the complementary strand of a nucleic acid.
  • the allele-specific probe of the present invention may have a polymorphic site among nucleic acid fragments derived from two individuals of the same species, but may hybridize to a DNA fragment derived from one individual but not to a fragment derived from another individual. In this case, hybridization conditions should be strict enough to hybridize to only one of the alleles, as the hybridization conditions show a significant difference in hybridization strength between alleles.
  • the central region is preferably aligned with the polymorphic region of the polymorphic sequence. This can lead to good hybridization differences between different allelic forms.
  • the probe of the present invention can be used in diagnostic kits or prediction methods for detecting alleles and predicting responsiveness to anticancer agents in solid cancer patients.
  • the present invention also includes an antibody or aptamer that specifically binds to a polypeptide encoded by a polynucleotide comprising the 21st base of the sequence represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI refSNP ID: rs3730089) in the PIK3R1 gene.
  • the present invention relates to a composition for predicting reactivity to an anticancer agent in a solid cancer patient.
  • the present invention relates to a kit for predicting reactivity to an anticancer agent in a solid cancer patient comprising any one of the above compositions of the present invention.
  • the kit may include the polynucleotide, the antibody and the aptamer of the present invention, as well as one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method.
  • the kit of the present invention may be a kit comprising the necessary elements necessary to perform PCR, test tubes or other suitable containers, reaction buffers (variable pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), Enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like.
  • the kit of the present invention may be a kit for predicting lung cancer prognosis including essential elements necessary for performing a DNA chip, and the DNA chip kit may be attached with a polynucleotide, primer or probe specific for the SNP.
  • the substrate may comprise a nucleic acid corresponding to the quantitative control gene or fragment thereof.
  • the anticancer agent may be used without limitation as long as it is a medicament capable of inhibiting solid cancer, preferably, it may be a phosphoinositide 3-kinase ⁇ (PI3K ⁇ ) inhibitor, more preferably May be selected from the group consisting of GSK2636771, SAR260301, TGX-221, AZD5482, and KIN-193.
  • PI3K ⁇ phosphoinositide 3-kinase ⁇
  • the solid cancer is selected from the group consisting of gastric cancer, liver cancer, glioblastoma, ovarian cancer, colon cancer, head and neck cancer, bladder cancer, renal cell cancer, breast cancer, metastatic cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, melanoma and lung cancer It may be characterized by, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preparing a SNP (NCBI refSNP ID: rs3730089) located at a 21st base of a sequence represented by SEQ ID NO: 1 in a PIK3R1 gene in a sample; And (b) screening for phosphoinositide 3-kinase beta (PI3K ⁇ ) inhibitors when present with SNPs as patient-specific solid cancer therapeutics.
  • a SNP NCBI refSNP ID: rs3730089
  • step (a) may be characterized in that it further comprises the step of measuring the expression level of the PTEN protein.
  • the expression level of the PTEN protein of the present invention can determine the amount of protein using an antibody that specifically binds to the protein of the gene.
  • Analytical methods for measuring protein levels using antibodies include Western blot, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Radioimmunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, and tissue immunostaining. , Immunoprecipitation analysis, complement fixation analysis, FACS, protein chip, etc., but is not limited thereto.
  • the gene expression level of PTEN can be analyzed by measuring the amount of mRNA, mRNA expression level is DNA chip, reverse transcription PCR (Reverse transcription-PCR, RT-PCR), competitive RT-PCR (Competitive RT- PCR, Real-time PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting (Northern blotting), etc., but are not limited thereto.
  • step (a) (a) variation of phosphatidylinositol 4,5-biphosphate 3-kinase catalyst subunit alpha (Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha, PIK3CA) in the sample Confirming; And (b) if a mutation is present, selecting the phosphoinositide 3-kinase alpha (PI3K ⁇ ) inhibitor as a patient-specific solid cancer treatment.
  • PI3K ⁇ phosphoinositide 3-kinase alpha
  • the mutation of PIK3CA may be selected from the group consisting of P140R, I381M, E453K, E542K, E545K and H1047R in PIK3CA represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the mutation of PIK3CA can be confirmed by a method using an antibody specific to each mutation or by sequencing, PCR, and the like.
  • the phosphoinositide 3-kinase alpha (PI3K ⁇ ) inhibitors are HS-173, Alpelisib (BYL719), CH5132799, Gedatolisib (PF-05212384, PKI-587), PIK-75 , A66 and YM201636 may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the samples can be used as long as the genetic sample derived from the patient, the genetic sample may be DNA or RNA, meaning that derived from the patient is separated from the patient's blood, tissue samples, feces, urine and sputum, etc. Means a genetic sample.
  • the method of isolating genomic DNA from a patient to obtain a genetic sample of the present invention can be accomplished through methods known in the art. For example, it can be done by directly purifying DNA from tissue, blood or cells, or by specifically amplifying and isolating specific regions using amplification methods such as PCR.
  • DNA means not only DNA but also cDNA synthesized from mRNA.
  • Obtaining nucleic acids from a subject may use, for example, PCR amplification, ligase chain reaction (LCR), transcription amplification, self-sustaining sequence replication, and nucleic acid based sequence amplification (NASBA).
  • Sequencing analysis is a way to decipher the entire DNA of living things.
  • High throughput sequencing is a method of deciphering all DNA sequences that make up more than 90% of the genome, including the region encoding the protein.
  • the mass produced genome sequence provides only the sequence information consisting of the four bases of A-T-G-C and the information indicating the quality of the bases. It is possible to grasp the position of the gene and the structure of the gene from the sequence information of the nucleotide sequence.
  • a large base sequence fragments a very long DNA molecule into a read, connects nucleotide sequences of short fragment sequences to overlapping sites, and then uses a bioinformatics technique to determine the gene location. .
  • a sequencing method of detecting gene structure and mutations by comparing a large number of fragment sequences of a specific organism with established human genome reference sequences was applied.
  • Whole exome sequnecing is one of the target sequencing methods for analyzing a part of a specific genome and sequencing the exon region encoding a protein.
  • GDNA was extracted to analyze WES of 51 gastric cancer cell lines, and QC for gDNA was Agilent, 2200 TapeStation System. Sample purification was performed using the Agencourt AMPure XP kit. The library for running WES used Agilent's SureSelect Library Prep Kit. Agilent's SureSelect Automated Hybridization Kit was used to capture the whole exome of the human genome, and sequencing was performed with 150bp paired end running using Illumina's HiSeq 2500. The analysis for each variation was analyzed with Varscan2.3.5.
  • Reactivity to PI3K ⁇ inhibitors was performed on gastric cancer cell lines.
  • Cell viability was measured by MTT assay after exposure to 51 gastric cancer cell lines for 72 hours after treatment with PI3K ⁇ inhibitor at various concentrations ranging from 0.001 to 100 uM.
  • the measured cell viability was calculated using the CalcuSyn Version 2.0 (Biosoft) program to calculate the IC50 (inhibitory concentration 50).
  • the calculated IC50 values were sorted in a low order and compared with mutations in PI3K related genes (FIG. 3). According to the variation of the PI3K-related genes, the average of the IC50 values for the PI3K ⁇ inhibitors between the two groups was compared (FIG. 4).
  • the volcano plot was confirmed with reference to data published by the Sanger Institute (FIG. 5).
  • the PIK3R1 M326I mutation was found to be statistically significant and responsive to PI3K ⁇ inhibitors.
  • Example 6 Relationship between PIK3R1 M326I mutations and PI3K ⁇ inhibitors in various types of cancer patients
  • the method for identifying the SNP of the PIK3R1 gene according to the present invention can predict with high accuracy whether a specific anticancer agent will work effectively or not for a solid cancer patient, and select a small group that is effective for chemotherapy of a specific anticancer agent, It can be useful in determining the treatment of patients with solid cancer.

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Abstract

본 발명은 고형암 환자의 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 마커에 관한 것으로, 본 발명에 따른 마커는 고형암 환자 중에서 특정 항암제의 항암 화학요법에 효과가 있는 소그룹을 선별하거나, 고형암 환자의 치료요법을 결정하는 데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

고형암 환자의 항암제 치료 반응성 예측용 마커
본 발명은 고형암 환자의 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 PIK3R1 유전자의 SNP를 확인하여 PI3Kβ 억제제의 처리 유무를 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
위암은 특히 아시아에서 높은 발생빈도를 보이며 암 관련 사망의 주된 원인이 되고 있다(Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 2010; 127: 2893917). 우리나라에서는 암 환자의 16.2% (남성 암 환자의 20.3% 및 여성 암 환자의 11.2%)가 위암 환자인 것으로 추정된다. 위암의 연간 연령표준화(age-standardized) 발병률은 남성의 경우 61.2/100,000이며 여성의 경우 23.9/100,000이다(Jung, KW, Park S, Kong HJ, Won YJ, Boo YK, Shin HR, et al. Cancer Statistics in Korea: Incidence, Mortality and Survival in 2006-2007. J Korean Med Sci 2010; 25: 1113-21).
포스파티딜이노시톨-4,5-바이포스페이트 3- 인산화 효소(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, PI3K)에 의한 신호전달 경로는 위암에서 가장 자주 변이가 발생하는 신호전달 경로 중의 하나이다.
PI3K는 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate를 활성 신호전달 중간체인 phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PI(3,4,5)P3)로 변환시키는 효소이다. PI(3,4,5)P3는 pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1 (PDK1)를 활성화시키고, 이어서 Akt를 활성화시킨다. PI3K는 p110과 p85의 두 가지 서브유닛으로 구성되어 있으며, 이것들은 각각 복수의 아형을 가지고 있다. 하나의 서브유닛인 p110에 초점을 맞추어 보면, 이것은 PIK3CA와 PIK3CB의 두 가지 아형을 가지고 있으며, 특이하게 중복된 기능을 보여준다. PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)은 PI(3,4,5)P3을 탈인산화시키고 PI3K 신호전달경로를 저해하는 PI3K의 음성 조절자이다. PI3K 신호전달경로의 활성화는 PI3KCA (phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide)의 변이 또는 PTEN의 결핍과 같은 상위의 수용체 타이로신 카이네이즈(RTK) 신호가 상승함으로써 발생한다고 알려져 있다. PI3K의 RTK 활성화는 세포를 변형시키고, PIK3CA에 대한 의존을 야기하며, PTEN의 결손 또한 하부의 Akt 활성과 PI3K 활성을 증가시킨다고 알려져 있으나, 이것은 PI3KCB를 통하여 주로 작용한다고 알려져 있다. PI3K 신호전달의 환원적인 관점에서는 PI3K가 PDK1과 Akt를 활성화시키고 세포를 변형시키는 것이다.
한편, PI3K beta-isoform에 특이적으로 작용하는 억제제는 PTEN 단백질 발현되지 않는 암 환자에게서 적당한 세포독성을 가지면서 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는 PTEN이 발현되지 않는 동물모델에서 PI3K beta-isoform의 활성을 억제할 경우, 효과적으로 암 발생을 억제할 수 있다는 것이 보고되었다(Jia S et al., Nature. Vol. 454, pp776-9, 2008; Wee S et al., PNAS. Vl. 105, pp13057-62. 2008; Torbett NE et al., Biochem J. Vol. 415. pp97-110. 2008; Jing Ni et al., Cancer Discovery. Vol. 5. pp425-33. 2012).
PI3K beta-isoform에 특이적으로 작용하는 억제제 중의 하나인 GSK2636771은 TGX-221 화합물을 기반으로 구조-활성 관계의 최적화를 진행한 결과, 매우 빠르게 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit beta isoform (PI3Kβ)에 선택적으로 강력하게 저해하는 화합물을 찾아낼 수 있는데, 이 화합물의 Benzimidazole의 치환은 강력한 PI3Kβ 저해를 이끌었으며, 이 화합물 그룹에서 선도물질로 밝혀졌다.(Rivero, R.A. et al. 103rd Annu Meet Am Assoc Cancer Res (AACR) (March 31-April 4, Chicago) 2012, Abst 2913).
이전의 연구에서 PI3Kβ 저해는 phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase와 dual-specificity protein phosphatase PTEN (PTEN)-결핍 종양에서 종양 형성을 저해하는 효과를 보였는데, GSK-2636771은 RAC serine/threonine-protein kinase (Akt)의 인산화를 저해하고, 이것은 인간의 PTEN-결핍 종양세포를 이종이식한 마우스 모델에서 용량 의존적인 결과를 보이는 것으로 알려졌다(Hardwicke, M.A. et al. 243rd ACS Natl Meet (March 25-29, San Diego) 2012, Abst MEDI 21).
또한, GSK-2636771은 PTEN-결핍 세포인 PC-3 (인간의 전립선 암세포)과 HCC70 (인간의 유방 유관암) 세포에 대하여 EC50 유효활성 농도는 각각 36과 72 nM인 것으로 보고되었고, 마우스에서 GSK-2636771 100 mg/kg으로 시험했을 때, PI3Kβ 억제제는 포도당과 인슐린 수치를 올리지 않았으며, PC-3세포를 이종이식한 마우스 모델에서 GSK-2636771의 1회 투여는 Akt 인산화(Ser473)를 감소시키는 것으로 알려져 있으며(Wooster, R. 103rd Annu Meet Am Assoc Cancer Res (AACR) (March 31-April 4, Chicago) 2012, Abst), 현재 임상 시험이 진행 중이다.
하지만, 현재까지 PI3K beta-isoform에 특이적으로 작용하는 억제제에 대한 반응성을 확인할 수 있는 유전자 바이오마커는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 PI3K beta-isoform에 특이적으로 작용하는 억제제에 대한 반응성을 확인할 수 있는 방법을 개발하기 위해, 예의 노력한 결과, PIK3R1 유전자의 SNP(rs3730089)가 존재할 경우, PI3K beta-isoform에 특이적으로 작용하는 억제제의 효과가 뛰어나다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 고형암 환자의 항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위한 정보 제공방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 프라이머 및/또는 프로브 조성물과 이를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 환자 맞춤형 고형암 치료제 선별방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에서 PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기에 위치하는 SNP(NCBI refSNP ID: rs3730089)를 확인하는 단계를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs3730089)로 표시되는 서열의 21번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 확인할 수 있는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 프라이머 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs3730089)로 표시되는 서열의 21번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 시료에서 PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기에 위치하는 SNP(NCBI refSNP ID: rs3730089)를 확인하는 단계; 및 (b) SNP가 존재할 경우, 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제를 환자 맞춤형 고형암 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 환자 맞춤형 고형암 치료제 선별방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에서 발굴한 SNP와 항암제 반응성을 예측하기 위한 실험의 전체적인 흐름을 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 사용한 51개 위암 세포주에 대하여, PI3K 관련 유전자들의 변이 정도를 검출한 전장 엑솜 시퀀싱(whole exome sequencing) 결과를 요약한 것이다.
도 3은 본 발명에서 사용한 51개 위암 세포주에 대하여 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성과 유전자 변이의 연관성을 정리한 그래프이다.
도 4의 (A)는 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성과 PI3K 관련 유전자 변이의 연관성을 통계적으로 분석한 결과이고, (B)는 유전자 중, PIK3R1의 M326I 변이와 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성을 통계적으로 분석한 결과이다.
도 5는 PI3K 관련 유전자 변이 유무에 따른 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성과 통계적 의미를 볼케이노 그래프로 분석한 결과이다. 또한 PIK3R1의 야생형과 M326I 변이형 내에서 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성 결과를 빈도로 분석한 결과이다.
도 6은 PIK3R1의 M326I 변이의 이형접합성(heterozygosity)과 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성 사이의 관계를 분석한 결과이다.
도 7은 PIK3R1의 M326I 변이가 어떻게 PIK3R1의 구조를 변화시켜 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성을 높이는 지를 단백질 3차원 구조분석을 통해 밝혀낸 결과이다.
7A: 야생형과 돌연변이 PIK3R1의 3차원 구조를 분석하고, 각각의 결합에너지를 계산한 결과이다.
7B: 야생형 및 돌연변이 PIK3R1에 GSK2636771이 결합하는 부위가 어떻게 구조변화가 생기는지를 분석한 3차원 모델이다.
도 8은 본 발명의 SNP를 이용할 경우, 높은 정확도로 PI3Kβ 억제제에 대한반응성을 예측할 수 있다는 것을 나타내는 결과이다.
도 9는 본 발명의 환자 맞춤형 고형암 치료제 선별방법에 대한 개념도이다.
도 10은 본 발명의 SNP를 이용하여 위암 뿐만 아니라, 다양한 고형암에서 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성을 측정할 수 있다는 것을 나타내는 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 고형암 환자에서 항암제에 대한 반응성을 예측할 수 있는 방법을 개발하고 그 정확도를 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 다양한 위암 세포주에서 전장 엑솜 시퀀싱(whole exome sequencing)을 통해 PI3K 관련 유전자의 변이 정보를 파악하고, 각 세포주의 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성을 세포 생사 판별시험(cell viability assay)를 통해 확인한 다음, 통계분석을 통하여 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성과 연관되어 있는 PI3K 관련 유전자의 변이를 선별하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 51개의 위암 세포주에 대하여 whole exome sequencing을 통해 PI3K 관련 유전자의 변이 정보를 확보한 다음, PI3Kβ 억제제를 이용한 세포 생사 판별 시험을 수행하고, 기존에 PI3Kβ 억제제의 반응성과 관련이 있는 PTEN 단백질의 발현 레벨도 분석하여(도 1 내지 도 3), 최종적으로 PIK3R1의 M326I 변이(NCBI refSNP ID:rs3730089)가 PI3Kβ 억제제의 반응성을 예측할 수 있다는 사실을 확인하였다(도 4 내지 도 6).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 시료에서 PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기에 위치하는 SNP(NCBI refSNP ID: rs3730089)를 확인하는 단계를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
이 서열은 이하의 서열번호 1에 나타낸다. 서열번호 1에서 SNP에 대한 NCBI의 refSNP ID는 상기 SNP의 서열 및 그 위치를 나타내는 것이다. 당업자라면 상기 번호를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다. NCBI에 등록되어 있는 SNP의 refSNP ID에 해당하는 구체적인 서열은 계속되는 유전자에 대한 연구 결과에 따라 약간씩 변경될 수 있으며, 이러한 변경된 서열 또한 본 발명의 범위 내에 포함됨은 당업자에게 자명할 것이다.
서열번호 1: rs3730089
AACGGTATGA ATAACAATAT[G/A]TCCTTACAAG ATGCTGAATG
본 발명의 SNP의 유전자형의 확인은 시퀀싱 분석, 자동 염기서열 분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법 (restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법 (single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법 (specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO (allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법 (rolling circle amplification), HRM (high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 나아가, 상기 SNP 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다변량 로지스틱 회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio) 및 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 화학요법 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다.
본 발명의 예측 방법은 고형암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs3730089)로 표시되는 서열의 21번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 확인할 수 있는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 프라이머 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성될 수 있다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 진단 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.
본 발명은 또다른 관점에서, PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs3730089)로 표시되는 서열의 21번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 프로브 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific)일 수 있으며, 이는 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행된다. 예를 들어, 5XSSPE (750mM NaCl, 50mM Na Phosphate, 5mM EDTA, pH 7.4) 및 25 ~ 30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화 하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않을 수 있다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 진단 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1(NCBI refSNP ID: rs3730089)로 표시되는 서열의 21번째의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, 본 발명의 상기 조성물 중 어느 하나를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 키트는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 항체 및 압타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 양태로서, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다. 다른 일 양태로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 폐암 생존 예후 예측용 키트일 수 있으며, DNA 칩 키트는 상기 SNP 에 대한 특이적인 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 고형암을 억제할 수 있는 약제이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제일 수 있고, 더욱 바람직하게는 GSK2636771, SAR260301, TGX-221, AZD5482 및 KIN-193으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고형암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 시료에서 PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기에 위치하는 SNP(NCBI refSNP ID: rs3730089)를 확인하는 단계; 및 (b) SNP가 존재할 경우, 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제를 환자 맞춤형 고형암 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 환자 맞춤형 고형암 치료제 선별방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계 이후에 PTEN 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 PTEN 단백질의 발현 수준은 상기 유전자의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산(Radioimmunodiffusion), 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, PTEN의 유전자 발현량을 mRNA의 양을 측정하여 분석할 수 있으며, mRNA의 발현 수준은 DNA 칩, 역전사 PCR(Reverse transcription-PCR, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 PCR(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계 이전에 (a) 시료에서 포스파티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트 3-카이네이즈 촉매 서브유닛 알파(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha, PIK3CA)의 변이를 확인하는 단계; 및 (b) 변이가 존재하면, 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 알파(phosphoinositide 3-kinase α, PI3Kα) 억제제를 환자 맞춤형 고형암 치료제로 선별하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 PIK3CA의 변이는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PIK3CA에서, P140R, I381M, E453K, E542K, E545K 및 H1047R로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서 PIK3CA의 변이는 각 변이에 특이적인 항체를 이용한 방법 또는 시퀀싱, PCR 등을 통하여 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 알파(phosphoinositide 3-kinase α, PI3Kα) 억제제는 HS-173, Alpelisib(BYL719), CH5132799, Gedatolisib (PF-05212384, PKI-587), PIK-75, A66 및 YM201636 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 환자로부터 유래한 유전자 시료이면 모두 이용가능하고, 유전자 시료는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 환자로부터 유래한다는 의미는 환자의 혈액, 조직샘플, 대변, 소변 및 객담 등에서 분리한 유전자 시료를 의미한다.
본 발명의 유전자 시료를 얻기 위해 환자로부터 게놈DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직, 혈액 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응 (LCR), 전사증폭 (transcription amplification), 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 위암 세포주 전장 엑솜 시퀀싱 분석
시퀀싱 분석은 생명체가 가지고 있는 전체 DNA를 해독하는 방법이다. 대량염기서열 분석(high throughput sequencing)은 단백질을 암호화하고 있는 영역을 비롯한 유전체의 90%이상을 차지하는 DNA 염기서열들을 모두 해독하는 방법이다. 대량으로 생산된 유전체 염기서열은 A-T-G-C의 4개 염기로 구성된 순서정보와 염기의 퀄리티를 나타내는 정보들만 제공한다. 염기서열의 순서 정보로부터 유전자의 위치와 유전자의 구조를 파악할 수 있다. 유전자의 위치를 파악하기 위해서 대량염기서열은 매우 긴 DNA 분자를 단편(read)으로 만든 후, 짧은 단편 서열들의 염기서열들을 중첩되는 부위를 연결시킨 다음 생물정보학적인 기법을 적용하여 유전자 위치를 파악한다. 본 발명에서는 특정 생물체의 대량의 단편 서열들을 확립되어 있는 인간 유전체 레퍼런스 염기서열와 비교하여 유전자의 구조와 변이들을 검출하는 염기서열 재분석(resequencing) 방법을 적용하였다. Whole exome sequnecing은 특정 유전체의 일부분을 분석하기 위한 target sequencing 방법의 하나로 단백질을 암호화 하고 있는 엑손 영역을 시퀀싱하는 방법이다. 인간 유전체에는 약 180,000개의 엑손이 있으며 이들의 총 길이는 30 MB정도로 인간 유전체의 1% 정도에 해당한다.
51개 위암 세포주의 WES를 분석하기 위해 gDNA를 추출하였고, gDNA에 대한 QC는 Agilent, 2200 TapeStation System를 사용했다. 샘플 정제는 Agencourt AMPure XP kit를 사용했다. WES 수행을 위한 라이브러리는 Agilent사의 SureSelect Library Prep Kit를 사용했다. 인간 유전체의 whole exome의 capture를 위해서 Agilent사의 SureSelect Automated Hybridization Kit를 사용했으며, sequencing은 Illumina사의 HiSeq 2500을 이용해서 150bp paired end running으로 수행했다. 각 변이에 대한 분석은 Varscan2.3.5로 분석했다.
PIK3R1 M326I 변이를 검출하기 위해 PI3Kβ 억제제의 약물 감수성에 대한 표현형과의 PIK3R1 M326I 유전자형 간에 상관관계를 분석하기 위해 연관성 연구 (association study)를 적용하였다. 이 방법은 전체 집단에서 PI3Kβ 억제제에 반응하지 않는 집단보다 반응하는 집단 내에 높은 빈도로 존재하는 유전자에 의해 결정하는 방법이다.
그 결과 51개 위암 세포주에서 표 1 및 도 2에 개시된 바와 같이 유전자들의 변이가 발생한 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2016002896-appb-T000001
Figure PCTKR2016002896-appb-I000001
실시예 2: PI3Kβ억제제와 관련된 유전자 변이 발굴
PI3Kβ억제제에 대한 반응성을 위암 세포주를 대상으로 수행했다. 51개 위암 세포주를 대상으로 PI3Kβ 억제제를 0.001 ~ 100 uM까지 다양한 농도로 처리하여 72시간동안 노출시킨 후에 MTT assay를 통해 cell viability를 측정했다. 측정된 cell viability는 CalcuSyn Version 2.0 (Biosoft) 프로그램을 이용해서 IC50 (inhibitory concentration 50)를 계산했다. 계산된 IC50의 값을 낮은 순서 (sensitive)로 정렬하여 PI3K 관련 유전자들의 변이와 비교 분석했다 (도 3). PI3K 관련 유전자의 변이 유무에 따라서 두 그룹간의 PI3Kβ억제제에 대한 IC50값의 평균을 비교했다 (도 4). 두 그룹간의 평균 비교는 Independent samples T test 방법 (IBM SPSS Statistics 20)으로 평가했다. 그 결과 PI3K 관련 유전자들 중에서 PIK3R1의 M326I변이가 있는 경우, 야생형에 비해 PI3Kβ억제제에 대한 IC50값이 낮음을 확인했다 (p=0.003).
실시예 3: PIK3R1 M326I 변이와 PI3Kβ 억제제의 관련성 규명
PI3K 관련 유전자들의 변이와 PI3Kβ 억제제 IC50의 관계를 효과적으로 시각화하기 위해서 Sanger Institute에서 발표한 자료를 참고하여 volcano plot으로 확인했다 (도 5). PI3K 관련 유전자들 중 PIK3R1 M326I 변이가 있는 경우, 통계적으로 유의하게 PI3Kβ 억제제에 대해 반응성이 좋은 것을 확인했다.
또한, PIK3R1 유전자의 대립형질 (allele)의 변이 빈도 (variant allele frequency, VAF)에 따른 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성을 분석한 결과, 두 요인간의 상관관계는 확인할 수 없었다 (도 6).
실시예 4: PIK3R1 M326I 변이의 PI3Kβ 억제제 반응성에 대한 작용 메카니즘 분석
PIK3R1 M326I의 변이가 PIK3R1 단백질 구조에 미치는 영향을 in silico 상에서 분석했다. PIK3R1의 326번째 아미노산은 p110단백질의 활성을 조절할 수 있는 nSH2 domain에 가까이 위치하고 있다. 그 결과 M326I에 변이가 있는 경우, PIK3R1(p85)와 p110이 결합했을 때 p110의 활성 구조에 변화가 생기게 되는 것을 in slico 상에서 확인했다 (도 7). PIK3R1 야생형에 비해 변이가 있는 경우, p110의 억제 기능이 약해질 것이라고 예상된다. 또한 PIK3R1 M326I변이와 PI3Kβ (p110β) 의 결합에서 ATP 결합 부위에 결합하는 PI3Kβ 억제제의 결합력이 높아졌다 (도 7, 표 2). 이러한 현상으로 PIK3R1 M326I변이가 있는 경우, PI3Kβ 억제제에 반응성이 좋을 것이라고 분석했다.
Figure PCTKR2016002896-appb-T000002
실시예 5: 바이오마커에 따른 PI3Kβ 억제제 반응성 예측율
전체 군을 대상으로 PI3Kβ 억제제에 대한 반응성을 확인한 결과, ~37%의 낮은 빈도로 반응성을 예측하였다. 기존에 알려진 PI3Kβ 억제제 반응성 예측마커인 PTEN 단백질의 결손 혹은 낮은 발현은 전체 군에서 15% 내외로 나타났으며, 이들군에 대한 PI3Kβ 억제제 반응성 예측 정확도는 ~60%로 전체군을 대상으로 분석했을때보다 증가했다. 그러나 본 연구결과에서 확인된 PIK3R1 M326I 유전자 변이를 기존의 PTEN 결손과 함께 추가해서 PI3Kβ 억제제 반응성을 분석하면 대상군이 최대 35%로 증가되고, 이들 군에 대한 PI3Kβ 억제제 반응성 예측 정확도는 ~75%로 전체군 또는 PTEN 결손군을 대상으로 분석했을 때보다 증가함을 확인했다 (도 8).
따라서 본 연구 결과, 전체 암 환자들 대상으로 PIK3CA 변이가 있는 10% 환자군은 PI3Kα 억제제를 통한 치료를 시행하고, 나머지 PIK3CA 변이가 없는 90%의 환자들 중에서 PTEN 결손 (~15%)이나 PIK3R1 M326I 변이 (~25%)가 있는 환자들의 경우에는 PI3Kβ 억제제를 통한 치료의 수행을 제시한다 (도 9)
실시예 6: 다양한 종류의 암 환자에서 PIK3R1 M326I 변이와 PI3Kβ 억제제의 관련성 규명
51개의 위암 세포주뿐만 아니라 10개의 대장암 세포주와 10개의 유방암 세포주를 대상으로 위암 세포주와 동일하게 PIK3R1 M326I 변이와 PI3Kβ 억제제의 관련성을 분석했다. 그 결과, 위암 세포주만을 분석했을 때와 동일하게 대장암과 유방암에서도 PIK3R1 M326I 변이가 있는 경우, 야생형에 비해 PI3Kβ 억제제에 대해 반응성이 좋은 것을 확인했다 (도 10)
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 PIK3R1 유전자의 SNP를 확인하는 방법은 고형암 환자에 대하여, 특정 항암제가 효과적으로 작용할지 작용하지 않을 지를 높은 정확도로 예측할 수 있어, 특정 항암제의 항암 화학요법에 효과가 있는 소그룹을 선별하거나, 고형암 환자의 치료요법을 결정하는 데 유용하게 활용할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (19)

  1. 시료에서 PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기에 위치하는 SNP(NCBI refSNP ID: rs3730089)를 확인하는 단계를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항암제는 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제는 GSK2636771, SAR260301, TGX-221, AZD5482 및 KIN-193으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 고형암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드를 확인할 수 있는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 프라이머 조성물.
  6. PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 혼성화하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 프로브 조성물.
  7. 제1항의 SNP(NCBI refSNP ID: rs3730089)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제는 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제는 GSK2636771, TGX-221, AZD5482 및 KIN-193으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제5항의 프라이머, 제6항의 프로브, 또는 제7항의 항체 또는 압타머를 포함하는 고형암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 키트.
  11. 다음의 단계를 포함하는 환자 맞춤형 고형암 치료제 선별방법:
    (a) 시료에서 PIK3R1 유전자 중의 서열번호 1로 표시되는 서열의 21번째의 염기에 위치하는 SNP(NCBI refSNP ID: rs3730089)를 확인하는 단계; 및
    (b) SNP가 존재할 경우, 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제를 환자 맞춤형 고형암 치료제로 선별하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 베타(phosphoinositide 3-kinase β, PI3Kβ) 억제제는 GSK2636771, TGX-221, AZD5482 및 KIN-193으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 PTEN 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 (a) 단계 이전에 하기의 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 시료에서 포스파티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트 3-카이네이즈 촉매 서브유닛 알파(Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha, PIK3CA)의 변이를 확인하는 단계; 및
    (b) 변이가 존재하면, 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 알파(phosphoinositide 3-kinase α, PI3Kα) 억제제를 환자 맞춤형 고형암 치료제로 선별하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 PIK3CA의 변이는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 PIK3CA에서, P140R, I381M, E453K, E542K, E545K 및 H1047R로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 포스포이노시타이드 3-카이네이즈 알파(phosphoinositide 3-kinase α, PI3Kα) 억제제는 HS-173, Alpelisib(BYL719), CH5132799, Gedatolisib (PF-05212384, PKI-587), PIK-75, A66 및 YM201636으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 고형암은 위암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 흑색종 및 폐암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 시료는 환자로부터 유래한 유전자 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 시료는 환자로부터 유래한 유전자 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
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CN112695114A (zh) * 2020-12-25 2021-04-23 华智生物技术有限公司 一种用于检测抗稻瘟病Pik基因的SNP分子标记及其应用
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