CN104411824B

CN104411824B - 与多囊卵巢综合征相关的snp标记

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Publication number: CN104411824B
Application number: CN201280074086.1A
Authority: CN
Inventors: 陈子江; 赵涵; 贺林; 师咏勇; 马金龙; 赵跃然; 耿玲; 游力
Original assignee: SHANDONG SHANDA AFFILIATED REPRODUCTION HOSPITAL CO Ltd; Shanghai Jiaotong University; Shandong University
Current assignee: SHANDONG SHANDA AFFILIATED REPRODUCTION HOSPITAL CO Ltd; Shanghai Jiaotong University; Shandong University
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2032-06-18
Also published as: EP2861735A4; EP2861735A1; CN104411824A; WO2013189015A1

Abstract

本发明提供与PCOS相关的SNP标记、用于检测所述SNP标记的探针、芯片、引物、试剂盒和方法。另外，本发明还提供所述探针、芯片和引物在预测和诊断PCOS风险中的应用。

Description

与多囊卵巢综合征相关的SNP标记

技术领域

本发明涉及与多囊卵巢综合征(PCOS)相关的SNP(单核苷酸多态性)标记。本发明进一步涉及用于检测所述SNP的探针、芯片、引物和方法。另外，本发明涉及所述探针、芯片和引物在预测和诊断PCOS风险中的应用。

背景技术

PCOS是一种表现为存在以下两种或多种特征的临床症状：长期排卵过少或排卵停止、雄激素过多和多囊卵巢¹。作为无排卵性不孕症的最常见原因，PCOS影响了6-8％的育龄妇女² _, ³。另外，PCOS与重要的内分泌代谢紊乱和广泛范围的不利后遗症(包括血脂障碍、动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和2型糖尿病)相关^4-6。大约50％的患有PCOS的女性存在胰岛素抵抗。⁷在患有葡萄糖耐量降低(IGT)和糖尿病的女性中，约有20％被确认在年轻时患有PCOS^8-10。

PCOS的发病机制尚不完全清楚。人们早已认识到了可遗传倾向，但遗传因素和环境因素之间存在复杂的相互作用。已经对至少70个候选基因进行了关联性研究，这些基因主要涉及生殖激素、胰岛素抵抗和慢性炎症，例如，促卵泡激素受体(FSHR)、细胞色素P450家族11A(CYP11A)、胰岛素受体(INSR)和白细胞介素-6(IL-6)^11-15；然而，没有一个基因一致地与PCOS相关联¹⁶。

发明内容

本发明涉及与PCOS相关的SNP。具体地，本发明提供了与PCOS相关的SNP标记。此外，本发明提供了用于检测所述SNP的探针、芯片、引物和方法。另外，本发明还涉及所述探针、芯片和引物在预测和诊断PCOS风险中的应用。

本发明的一个方面提供SNP标记，其核苷酸序列如下所示：SEQ ID NO.1，其中，N为C或T；SEQ ID NO.2，其中，N为A或G；SEQ ID NO.3，其中，N为C或T；SEQ ID NO.4，其中，N为A或C；SEQ ID NO.5，其中，N为C或T；SEQ ID NO.6，其中，N为A或C；SEQ ID NO.7，其中，N为C或T；SEQ ID NO.8，其中，N为C或T；SEQ ID NO.9，其中，N为A或G；SEQ ID NO.10，其中，N为C或T；SEQ ID NO.11，其中，N为C或T；SEQ ID NO.12，其中，N为C或T；SEQ ID NO.13，其中，N为A或G；SEQ ID NO.14，其中，N为C或T；SEQ ID NO.15，其中，N为A或G；SEQ ID NO.16，其中，N为C或T；SEQ ID NO.17，其中，N为A或T；SEQ ID NO.18，其中，N为C或G；SEQ ID NO.19，其中，N为C或T；SEQ ID NO.20，其中，N为C或T；SEQ ID NO.21，其中，N为C或T；SEQ ID NO.22，其中，N为A或G；SEQ ID NO.23，其中，N为A或G；SEQ ID NO.24，其中，N为C或T；SEQ ID NO.25，其中N为A或G；SEQ ID NO.26，其中，N为C或T；SEQ ID NO.27，其中，N为A或T；SEQ ID NO.28，其中，N为G或T；SEQ ID NO.29，其中，N为A或G；SEQ ID NO.30，其中，N为C或T；SEQ ID NO.31，其中，N为A或G；SEQ ID NO.32，其中，N为C或T；SEQ ID NO.33，其中，N为C或T；SEQ IDNO.34，其中，N为C或T；SEQ ID NO.35，其中，N为C或T；SEQ ID NO.36，其中，N为A或G；SEQ IDNO.37，其中，N为C或T；SEQ ID NO.38，其中，N为C或T；SEQ ID NO.39，其中，N为C或T；SEQ IDNO.40，其中，N为A或C；SEQ ID NO.41，其中，N为G或T；SEQ ID NO.42，其中，N为G或T；SEQ IDNO.43，其中，N为C或T；SEQ ID NO.44，其中，N为A或G；或SEQ ID NO.45，其中，N为C或T。

本发明的另一个方面提供用于检测在本发明的SNP标记的N位点处的基因型的探针。

本发明的又一个方面提供一种用于检测在本发明的SNP标记的N位点处的基因型的芯片，其中，所述芯片包含本发明的一种或多种探针。

本发明的又一个方面提供用于确定在本发明的SNP标记的N位点处的基因型的引物。

本发明的又一个方面提供一种用于检测在SNP标记的N位点处的基因型的试剂盒，其包含本发明的探针、芯片或引物。

本发明的又一个方面提供本发明的引物、探针、芯片和试剂盒在制备用于预测或诊断PCOS的试剂中的应用。

本发明的又一个方面提供本发明的引物、探针、芯片和试剂盒在预测或诊断PCOS中的应用。

本发明的又一个方面提供一种基于SNP标记预测或诊断PCOS的方法，其中，所述方法包括确定在本发明的SNP标记的N位点处的基因型。

附图说明

图1：GWAS meta-分析(GWAS meta-analysis)的全基因组Manhattan图。通过质量控制的SNP标记显示为负log₁₀P-值。水平实线表示10^-5的P值。对于那些在以前的GWAS中识别的并在此处重复的标记，在50kb与PCOS相关的SNP内的标记被标记成红色，而那些在当前研究中首次识别的标记，在50kb与PCOS相关的SNP内的标记被标记成绿色。

图2：来自GWAS I的3个PCOS基因座(2pl6.3、2p21和9q33.3)的区域图。(a-c)用作为基因组位置(hg18)的函数的P值(以-log₁₀值计)绘制在GWAS中的通过质量控制措施的基因分型的SNP(a)2pl6.3、(b)2p21、和(c)9q33.3。在各组中，索引关联SNP以菱形表示。绘制估计的重组率(从HapMap得到)以反映局部LD结构。基因注释取自美国加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器。LD区块是从HapMap计划获得(发布22，CHB+JPT)。

图3A-3H：8个新发现PCOS基因座的区域图。用作为基因组位置(NCBI Build 37)的函数的meta-分析P值(以-log₁₀值计)绘制通过质量控制的基因分型和填补的(imputed)SNP。在各组中，基因分型的SNP被绘制成圆，而填补的SNP被绘制成十字。索引关联SNP以紫色表示，P_gwas-meta是初始数据集的合并结果，而P_{GWAS-REP-Meta}是初始和后续的数据集的合并结果，以菱形(对于索引SNP)或方形(对于这一区域的另一独立SNP)表示。绘制估计的重组率(从l000GenomeASI得到)以反映局部LD结构。基因注释取自美国加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器。

图4A-4B：45个SNP标记的PCR电泳图。

具体实施方式

如发明中所用，术语“单核苷酸多态性”或“SNP”是指当在基因组序列中一个核苷酸(例如，腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G))改变为另一个核苷酸时发生的DNA序列变化或遗传性变型。

在本发明中，使用按照NCBI dbSNP数据库的rs识别码(identifier numbers)识别SNP。

术语“基因型”指的是个体或样品中所含的一个或多个基因的等位基因的描述。如发明中所使用的，对个体的基因型和源自该个体的样品的基因型没有加以区别。术语“比值比(odd ratio)”或“OR”是指具有所述标记(多态性)的个体的患病可能性相对于没有该标记(多态性)的个体的患病可能性的比率。

在第一个方面，本发明提供SNP标记，其核苷酸序列如下所示：SEQ ID NO.1，其中，N为C或T；SEQ ID NO.2，其中，N为A或G；SEQ ID NO.3，其中，N为C或T；SEQ ID NO.4，其中，N为A或C；SEQ ID NO.5，其中，N为C或T；SEQ ID NO.6，其中，N为A或C；SEQ ID NO.7，其中，N为C或T；SEQ ID NO.8，其中，N为C或T；SEQ ID NO.9，其中，N为A或G；SEQ ID NO.10，其中，N为C或T；SEQ ID NO.11，其中，N为C或T；SEQ ID NO.12，其中，N为C或T；SEQ ID NO.13，其中，N为A或G；SEQ ID NO.14，其中，N为C或T；SEQ ID NO.15，其中，N为A或G；SEQ ID NO.16，其中，N为C或T；SEQ ID NO.17，其中，N为A或T；SEQ ID NO.18，其中，N为C或G；SEQ ID NO.19，其中，N为C或T；SEQ ID NO.20，其中，N为C或T；SEQ ID NO.21，其中，N为C或T；SEQ ID NO.22，其中，N为A或G；SEQ ID NO.23，其中，N为A或G；SEQ ID NO.24，其中，N为C或T；SEQ ID NO.25，其中N为A或G；SEQ ID NO.26，其中，N为C或T；SEQ ID NO.27，其中，N为A或T；SEQ ID NO.28，其中，N为G或T；SEQ ID NO.29，其中，N为A或G；SEQ ID NO.30，其中，N为C或T；SEQ IDNO.31，其中，N为A或G；SEQ ID NO.32，其中，N为C或T；SEQ ID NO.33，其中，N为C或T；SEQ IDNO.34，其中，N为C或T；SEQ ID NO.35，其中，N为C或T；SEQ ID NO.36，其中，N为A或G；SEQ IDNO.37，其中，N为C或T；SEQ ID NO.38，其中，N为C或T；SEQ ID NO.39，其中，N为C或T；SEQ IDNO.40，其中，N为A或C；SEQ ID NO.41，其中，N为G或T；SEQ ID NO.42，其中，N为G或T；SEQ IDNO.43，其中，N为C或T；SEQ ID NO.44，其中，N为A或G；或SEQ ID NO.45，其中，N为C或T。

该方面的一种实施方式提供选自以上标记中大于一个的SNP标记，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个SNP标记。

在本发明中，每个SNP标记都是指被认为与PCOS相关联的SNP。如在本发明中所用，SNP标记和对应的SNP涉及在核苷酸片段中的相同位点。特别是当适用于检测在SNP标记的N位点的基因型时，应当理解的是，这意味着检测在相应SNP的相应位点处的基因型，反之亦然。各个SNP标记的SNP列于下表1中。

在另一个方面，本发明提供用于检测在本发明的一个或多个SNP标记的N位点处的基因型的探针。

该方面的一种实施方式提供列于表1中的用于各个SNP标记的探针。

表1各个SNP标记的SNP和探针

在又一个方面，本发明提供一种用于检测在本发明的一个或多个SNP标记的N位点处的基因型的芯片，其中，所述芯片包含本发明的探针。

在此方面的一种实施方式中，所述芯片用于检测在本发明的45个SNP标记的N位点处的基因型。更优选地，所述芯片包括如SEQ ID NO.46-135所示的探针。

在此方面的另一种实施方式中，所述芯片用于检测在如SEQ ID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示的SNP标记的N位点处的基因型。更优选地，所述芯片包含如SEQ ID NO.56、57、66、67、88、89、90、91、94、95、102、103、104、105、110、111、112、113、114、115、118、119、126、127、128、129、130、131、132和133所示的探针。

在又一个方面，本发明提供用于检测在本发明的一个或多个SNP标记的N位点处的基因型的引物。

在此方面的一种实施方式中，各个SNP标记的引物列于表2中。

表245个SNP标记的引物

在又一个方面，本发明提供用于检测在本发明的一个或多个SNP标记的N位点处的基因型的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明的探针、芯片或引物。

在此方面的一种实施方式中，所述试剂盒用于检测在本发明的至少15个SNP标记的N位点处的基因型。优选地，所述试剂盒用于检测在本发明的45个SNP的N位点处的基因型。更优选地，所述试剂盒包含如SEQ ID NO.46-135所示的探针。

在此方面的另一种实施方式中，所述试剂盒用于检测在如SEQ ID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示的15个SNP标记的N位点处的基因型。更优选地，所述试剂盒包括由如SEQ ID NO.56、57、66、67、88、89、90、91、94、95、102、103、104、105、110、111、112、113、114、115、118、119、126、127、128、129、130、131、132和133所示的探针组成的探针。

在此方面的另一种实施方式中，所述试剂盒包含用于检测在本发明的45个SNP的N位点处的基因型的引物。更优选地，所述试剂盒包含由如SEQ ID NO.136-221所示的引物组成的引物。

在此方面的另一种实施方式中，所述试剂盒包含用于确定在本发明的15个SNP标记的N位点处的基因型的引物，其中，15个SNP标记如SEQ ID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示。优选地，所述试剂盒包含由如SEQ ID NO.146、147、152、153、174、175、176、177、180、181、188、189、190、191、196、197、198、199、200、201、204、205、212、213、214、215、216、217、218和219所示的引物组成的引物。

在另一个方面，本发明提供本发明的引物、探针、芯片或试剂盒在制备用于预测或诊断PCOS的试剂中的应用，其中，所述引物、探针、芯片或试剂盒用于检测在本发明的SNP标记的N位点处的基因型。在一种实施方式中，检测本发明的至少15个SNP标记，优选本发明的全部45个SNP标记，的N位点处的基因型。在另一种实施方式中，检测本发明的15个SNP标记的N位点处的基因型，其中，所述15个SNP如SEQ ID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示。

在另一个方面，本发明提供本发明的引物、探针、芯片或试剂盒在预测或诊断PCOS中的应用，其中，所述引物、探针、芯片或试剂盒用于检测在本发明的SNP标记的N位点处的基因型。

本发明的又一个方面提供一种预测或诊断PCOS的方法，其中，所述方法包括确定在本发明的一个或多个SNP标记的N位点处的基因型。

在此方面的一种实施方式中，所述方法包括确定在本发明的至少15个SNP标记，优选本发明的全部45个SNP标记，的N位点处的基因型。

在此方面的另一种实施方式中，所述方法包括：确定在本发明的15个SNP标记的N位点处的基因型，其中，所述15个SNP标记如SEQ ID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示。

在此方面的又一种实施方式中，确定在SNP标记的N位点处的基因型是(例如，使用本发明的探针或芯片)通过杂交进行的。

在此方面的又一种实施方式中，确定在SNP标记的N位点处的基因型是使用本发明的引物通过测序进行的，例如，PCR、实时定量PCR或MassARRAY(Sequenom)。

在此方面的又一种实施方式中，本方法包括以下步骤：从受试者的外周血或唾液中提取DNA，确定在一个或多个SNP标记的N位点处的基因型，以及分析结果以预测PCOS风险或诊断PCOS。

实施方式

受试者

所评估的全部中国汉族样本是从中国多家协作医院获得。2254个中国汉族PCOS样本和3001个对照的探索组(GWAS I和II)主要是从中国北方招募。8226个病例和7578个对照的后续重复样本(REP I和II)是从中国各地的29个省(山东、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、河南、天津、北京、山西、陕西、甘肃、宁夏、江苏、安徽、上海、广东、广西、福建、浙江、湖北、湖南、江西、四川、重庆、新疆、云南、贵州和海南)收集。根据在200345中提议的鹿特丹标准(Rotterdam Consensus)诊断PCOS患者。从医疗档案中获得患者的临床数据。以月经周期长度超过35天或一年内≤8个月经周期史来评价排卵过少/排卵停止。当在卵巢中扫描到≥12个测量直径2-9mm小囊或卵巢体积在10ml以上时确定为多囊卵巢形态。如果有关于高雄激素血症和/或多毛症的证据，则证实雄激素过多症。排除具有其他原因的月经稀发或雄激素过多症的患者。从经过由内科专家全面临床检查的病例中收集临床资料。从通过结构式问卷的病例和对照中收集附加人口统计信息。所有的参与者提供了书面知情同意书。该研究得到了各医院的制度伦理委员会批准，并根据赫尔辛基宣言(Declaration ofHelsinki)的原则进行。

DNA提取

从所有参与者中收集EDTA抗凝结静脉血样本。使用Flexi Gene DNA试剂盒(Qiagen)通过标准程序从外周血淋巴细胞中提取基因组DNA，并稀释至用于全基因组基因分型的工作浓度50ng/μL和用于验证研究的工作浓度15-20ng/μL。

GWAS基因分型和质量控制

Affymetrix全基因组阵列(Affymetrix Genome-Wide Arrays)用于探索阶段(discovery phase)：使用Affymetrix全基因组人类SNP阵列6.0(Affymetrix Genome-WideHuman SNP Array 6.0)进行GWAS数据集(GWAS Data Set)1，以及使用Axiom全基因组阵列对GWAS数据集2的样品进行基因分型。GWAS数据的质量控制过滤如下进行：对于ContrastQC为0.4以上的SNP 6.0阵列不考虑进一步数据分析，而对于Axiom阵列，0.82以上的DishQC(DQC)认为是通过。对于SNP6.0使用鸟食算法(birdseed algorithm)生成基因型数据，而对于Axiom阵列使用Axiom GT1算法。对于样本过滤，排除产生少于95％的基因座的基因型的阵列。对于SNP过滤(样本过滤之后)，去掉在病例或对照样本中检出率(call rate)<95％的SNP。排除MAF(次要等位基因频率)<1％的SNP，或在对照中明显偏离哈迪温伯格平衡(HWE，P≤1E-5)的SNP。

未分型SNP的填补(Imputation)分析

使用MACH^17-18对两个GWAS数据集分别进行填补，以通过阵列类型进行meta-分析。用于90CHB+JPT受试者的分阶段单倍型(180个单倍型)用作填补基因型的参考。因为缺乏功效(power)，从关联分析中排除用信息内容r²<0.3填补的任何SNP。另外，使用1000个基因组单倍型I期中期发布(Jun2011)作为参考，采用IMPUTEv2^19-20对8个新识别的区域(0.5MB实现P_GWAS-META<10^-5的任何SNP的任一侧)进行第二填补步骤。具有适当信息<0.4填补的任何SNP被视为差的填补。SNP QC过滤的标准与基因分型的标准相同。

群体亚结构(Population substructure)分析

使用如在软件EIGENSTRAT²¹中实施的主成分分析(PCA)评价人群亚结构。每个受试者生成20个主成分(PC)。进行两次PCA，第一次PCA用于结合HapMap数据分析研究数据(1510个病例和2106个对照)。绘制前两个主成分，排除43个病例和9个对照。对其余试验样品进行第二次PCA。所述PC是为关联分析生成的。

关联分析

使用logistic回归来确定在病例和对照之间是否存在PC分值上的显著差异；显著PC在关联分析中用作协变量，以纠正群体分层(population stratification)。调整后，观察到小的分层(λ＝1.07，λ₁₀₀₀＝1.04，标准化为1000²²的样本量)。

GWAS数据集(GWAS Data Sets)的Meta-分析

使用Meta分析来合并GWAS数据集。使用PLINK²³进行meta-分析。使用Q统计学P值对三个阶段的异质性进行评价。使用Mantel-Haenszel法计算固定效应评价(fixed effectestimate)。

SNP选择和重复

使用下列标准选择SNP用于验证：来自GWAS-Meta分析的强显著SNP(P_GWAS-META≤10^-5)被选定为重复I。一般来讲，在重复I中显示名义显著性(P<0.05)或在重复I中不显著，但GWAS-REP1meta-分析P值小于5×10^-6的那些SNP在重复II中仍然保持。除了rs2059807(其使用TaqMan测定法(Applied Biosystems)进行基因分型)以外，大多数重复的研究使用Sequenom MassARRAY系统。

统计分析

使用PLINK²³进行单标记水平的全基因组关联分析以及病例-对照样本的HWE分析；R套装用于全基因组P值标绘图。使用LocusZoom²⁴生成区域图。在重复研究中，用SHEsis²⁵进行等位基因关联分析。采用PLINK²³使用meta-分析合并GWAS和重复数据。条件logistic回归用来测试单个SNP的独立影响^26-27。

结果

总共发现45个SNP与PCOS相关联。详细的分析信息列于表3-5。

事实上，所述SNP表示与PCOS相关联且可以包括许多SNP的区域。在这些区域中，发现对于首次识别的基因座(2pl6.3、2p21和9q33.3)的显著证据²⁶，代表这些区域的SNP为rs13405728(2p16.3；P_GWAS-meta＝3.77×10^-9)、rs13429458(2p21，P_GWAS-meta＝4.17×10^-13)、rs12478601(2p21，P_GWAS-meta＝3.37×10^-10)、rs2479106(9q33.3，P_GWAS-meta＝5.14×10^-10)和rs10818854(9q33.3，P_GWAS-meta＝2.50E-04)。在GWAS-Meta分析中，在除报道的3个以外的其他19个区域中的SNP表现出与PCOS易感性相关联(P_GWAS-meta值<10^-5)。然而，在位于2p16.3中但在之前的GWAS中不直接支持的FSHR基因中的变体，仍显示P_GWAS-meta值<10^-5。条件logistic分析支持，在FSHR中的信号不依赖于先前的报告。因此，本发明人从全部的20个区域中选择最显著的SNP用于验证(重复I研究)。

在这20个区域中，在重复I期中验证7个(P<0.05具有相同的等位基因比值比趋势)，其他3个区域在GWAS-REP1meta分析中具有P<5×10^-6的SNP。在一个独立的样品组(重复Ⅱ)中将来自这10个区域的SNP再次分型。其结果是，通过在固定效应模型下全部阶段的meta-分析，在8个区域(9q22.32、11q22.1、12q13.2、12q14.3、16q12.1、19p13.3、20q13.2和FSHR基因(2p16.3))的常见变体显示出总体的关联的组合证据(P值<5×10^-8)。研究结果有力地支持这些区域和PCOS之间的关联性。

在9q22.32上，最显著的SNP是rs3802457(P_{GWAS-REP-Meta}＝5.28×10^-14，OR_{GWAS-REP-Meta}＝0.77)，其位于C9orf3基因的内含子区域(图3)。控制rs3802457，rs4385527(P_{GWAS-REP-Meta}＝5.87×10^-9，OR_{GWAS-REP-Meta}＝0.84)显示在条件logistic回归分析中的独立关联性，并且其也位于C9orf3。C9orf3是M1锌氨基肽酶家族的成员。它是一种催化从蛋白质或肽的氨基末端去除氨基酸的锌依赖性金属肽酶，并且可以在血管紧张素IV的产生中发挥作用。据报道，在C9orf3内的SNP rs3802458与在接受前列腺癌放射性治疗的非裔美国男子中的勃起功能障碍(ED)的发展相关联²⁸。当人们发展成性激素的量不足或过剩的状况时，在男性中发生ED，而在女性中发生PCOS。有趣的是，FSHR基因(rs2268363)已被确定为与ED最显著相关联²⁸，FSHR和PCOS之间的强关联性证据也被确定(下面讨论)。

在11q22.1上，rs1894116(P_{GWAS-REP-Meta}＝1.08×10^-22，OR_{GWAS-REP-Meta}＝1.27)位于YAP1(MIM：606608)的内含子区域(图3)。控制rs1894116，条件logistic回归分析表明，没有额外的关联信号。含有WW结构域的YAP1是能够同时用作辅激活物和辅阻遏物的转录调控因子，并且是在通过限制增殖和促进细胞凋亡而在器官大小控制和肿瘤抑制中起关键作用的Hippo信号通路中的关键下游调节靶标。YAP过表达改变与细胞增殖、凋亡、迁移、粘附和上皮间质转变相关联的基因的表达²⁹。由于卵黄囊无血管发生(avasculogenesis)和尿囊和绒毛膜之间的附着失败，Yap1无效突变的小鼠胚胎在胚胎日E9.5和E10.5之间死亡³⁰。

在12q13.2上，最显著的SNP rs705702(P_{GWAS-REP-Meta}＝8.64×10^-26，OR_{GWAS-REP-Meta}＝1.27)位于RAB5B(MIM：179514)和SUOX(MIM：606887)之间的基因间区域(图3)。控制rs705702，条件logistic回归分析表明，没有额外的关联信号。RAB5B是RAS超家族的成员，并且它与质膜和早期内涵体相关联。SUOX编码位于线粒体膜间隙的同源二聚体蛋白。有几个SNP显示与PCOS风险相关的证据。其中，rs2292239(P_{GWAS-REP-Meta}＝2.72×10^-22，OR_{GWAS-REP-Meta}＝1.25)似乎是最有趣的一个，据报道其与1型糖尿病^31-33和1型糖尿病的自身抗体³⁴相关联。Rs2292239位于ERBB3的内含子7。ERBB3，一种磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt途径的活化剂，是调节细胞存活和囊泡运输的表皮生长因子酪氨酸激酶受体家族中的成员。ERBB3在确定抗原呈递细胞功能中起关键作用³⁵。

在12q14.3上，rs2272046(P_{GWAS-REP-Meta}＝1.95×10^-21，OR_{GWAS-REP-Meta}＝0.70)位于HMGA2(MIM：600698)的内含子区域，HMGA2编码具有结构DNA结合结构域的蛋白并作为转录调控因子(图3)。控制rs2272046，在这一区域没有额外的关联信号。HMGA2先前已确定与成人身高³⁶、血管瘤(包括粘液瘤和肺错构瘤)³⁷和2型糖尿病³⁸相关联。有趣的是，在该基因中的突变可导致具有体重显著减少、减少脂肪组织量和两性不育症的“侏儒”鼠³⁹，这表明其在生长和繁殖中的重要作用。

在16q12.1上，最显著SNP是rs4784165(P_{GWAS-REP-Meta}＝3.64×10^-11，OR_{GWAS-REP-Meta}＝1.15)(图3)。控制rs4784165，条件logistic回归分析表明，没有额外的关联信号。TOX3(MIM：611416)是距该最高信号(top signal)最近的基因。TOX3属于通过弯曲和解旋DNA而在染色质结构的修饰中充当建筑因子的大而多样的HMG-box蛋白家族⁴⁰。

在19p13.3上，rs2059807(P_{GWAS-REP-Meta}＝1.09×10^-8，OR_{GWAS-REP-Meta}＝1.14)位于INSR基因(MIM：147670)的内含子区域(图3)。控制rs2059807，条件logistic回归分析表明，没有额外的关联信号。INSR在胰岛素代谢中起重要作用。胰岛素受体的酪氨酸激酶结构域的突变已显示出会引起严重的高胰岛素血症和胰岛素耐受性^41-43。在以前的研究中，据报道，在INSR基因中的常见SNP与中国汉族人和高加索人中的PCOS有关联⁴⁴ _, ⁴⁵。INSR无效小鼠生长缓慢，7日龄死亡，伴有酮酸中毒、高血清胰岛素和甘油三酯、低糖原储备和脂肪肝⁴⁶。

在20q13.2上，最高信号是rs6022786(P_{GWAS-REP-Meta}＝1.83×10^-9，OR_{GWAS-REP-Meta}＝1.13)，位于基因SUMO1P1和ZNF217(MIM：602967)之间的基因间区域(图3)。控制rs6022786，条件logistic回归分析表明，没有额外的关联信号。SUMO1P1是SUMO1假基因1。ZNF217，锌指蛋白217，可以减弱由于端粒功能紊乱以及阿霉素诱导的DNA损伤导致的凋亡信号，可以在端粒危机期间通过增加细胞存活促进致瘤性转化，并且可以在化学治疗期间通过增加细胞存活促进晚期恶性肿瘤。

此外，在先前的PCOS的GWAS中已经报道了2p16.3²⁶。在该项研究中，在该区域的全球显著性发现仅位于LHCGR基因(MIM：152790)，并且最高信号并没有直接与FSHR基因(MIM：136435)连锁，这主要是由于重组热点。然而，长期以来FSHR一直被认为是最引人注目的PCOS候选基因之一⁴⁸。FSHR无效突变的女性不育，伴有小卵巢、卵泡发育受阻、萎缩性子宫和阴道闭锁，无效突变的男性尽管睾丸重量降低、少精子症和睾酮水平降低，但可育⁴⁹。在本次的研究中，在FSHR基因中的SNP满足在初始阶段进行验证的选择标准，在组合分析中获得全球显著性发现(最高信号是rs2268361，P_{GWAS-REP-Meta}＝9.89×10^-13，OR_{GWAS-REP-Meta}＝0.87)(图3)。条件logistic回归分析支持FSHR的关联独立于LHCGR中的那些先前信号。

最后，选定独立的15个SNP来代表这些与PCOS最关联的区域。所述15个SNP是指SNP标记号6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44。

基于上述研究和实践应用，检测在至少15个SNP标记(例如，本发明中的全部45个SNP标记)的N位点处的基因型，对于预测或诊断PCOS是有用的。然而，检测在6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44号的15个独立SNP标记的N位点处的基因型也有效，同时花费更少。

检测SNP标记的N位点处的基因型

有许多用于检测SNP标记的N位点处的基因型的方法，例如，通过杂交或测序。

对于杂交，探针应设计为特异性地与SNP的基因座杂交，然后杂交可以分析SNP是否存在。给出对于全部45个SNP的探针的一个实例，只是为了举例说明的目的，而并非意在限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易地设计出类似的与SNP杂交的探针，这些探针也全部落入本发明的范围。

通常，探针应当存在于载体(例如芯片)中，从而可以一次检测多于一个的SNP标记。本发明还提供一种芯片，所述芯片包含检测如SEQ ID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44所示的SNP标记(即rs13429458、rs12478601、rs13405728、rs10818854、rs2479106、rs2268361、rs2349415、rs4385527、rs3802457、rs1894116、rs705702、rs2272046、rs4784165、rs2059807和rs6022786的SNP)的探针。当选定所述探针时，本领域技术人员知晓如何制造这种芯片。

对于测序，引物应设计为目的基因座的正向和反向的引物。给出对于(表2中列出的)全部45个SNP的引物的一个实例，只是为了举例说明的目的，而并非意在限制本发明的范围。本领域的技术人员可以容易地设计出类似的引物以进行SNP标记的测序，这也全部落入本发明的范围。此外，在测序中使用的方法和试剂也是公知的现有技术。

另一种对SNP标记进行基因分型的可用方法采用Sequenom平台的iPLEX(Sequenom公司，San Diego，CA)。使用MassARRAY Assay Design 3.0软件设计用于所述SNP的聚合酶链式反应(PCR)和延伸引物。根据制造商的说明进行PCR和延伸反应，并使用SequenomiPLEX系统通过质谱法确定延伸产物大小。

预测或诊断PCOS的方法

根据本发明的45个SNP标记可用于预测或诊断PCOS。首先，从受试者的外周血或唾液中提取DNA，然后，(例如，通过用上述探针或芯片杂交或通过测序)检测在SNP的N位点处的基因型。最后，将对结果进行分析，以预测PCOS的风险。

实施例

以下的实施例只是用于举例说明的目的，而不应被认为是限制本发明的范围。

实施例1

使用表2中所列的引物通过PCR扩增全部45个SNP标记。对PCR反应进行下列步骤。

A、反应体系

B、反应步骤

通过电泳和测序检测并确认产物。图4示出了对全部45个SNP标记的电泳图。

实施例2

1、从受试者的外周血或唾液中提取DNA，纯化DNA，并调节DNA的浓度至20ng/mL。

2、通过测序检测在15个SNP标记的N位点处的基因型，所述15个SNP标记显示为SEQID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44。所使用的引物列于表2中。

3、方法：

I.PCR反应

A、反应体系

B、反应步骤

C、PCR产物的纯化

在室温下使用25μL PEG(22％，w/v)和2μL NaCl(5M)使PCR产物沉淀。然后，在4℃下将板储存30分钟。在4℃下，用80μL的75％乙醇通过离心将残留的PEG洗涤3次。

D、纯化的PCR产物的循环测序

将纯化的DNA溶于5μL ddH₂O。

然后，将板充分混合并短暂旋转。通过快速加热至96℃进行初始变性过程并且持续1分钟。进行25个循环的反应：96℃以上变性10秒钟，50℃以上退火5秒，以及60℃以上延伸4分钟。快速降温至4℃。产物备用直到纯化。

E、乙醇/EDTA/乙酸钠沉淀

2μL的125mM EDTA和2μL的3M乙酸钠加入到每个孔中。然后将50μL的100％乙醇加入到各孔中。将板密封并通过翻转4次混合。将板在室温下孵育15分钟。然后用75％乙醇将沉淀的DNA漂洗3次。

F、在ABI 3730XL遗传分析仪上的毛细管电泳

每孔中加入10μL的HI-DI甲酰胺并在95℃下变性5分钟。将沉淀的DNA加样到ABI3730XL遗传分析仪上用于毛细管电泳。

II.MassARRAY

A、主要仪器和试剂

1)扩增：ABI9700 384Dual；

2)机械手臂：MassARRAY Nanodispenser RS1000；

3)分析：MassARRAY Compact System；

4)试剂：用于Compact 384的完整基因分型试剂盒

B、程序

进行384个PCR反应(相同的多重测定，不同的DNA)。这些说明涉及进行用于整个384孔微孔板的反应的PCR，其中，相同的测定将应用到不同的DNA。

如下表中所述制备PCR混合物

1)对于多重PCR混合物，在不含DNA的情况下，按照试剂在表中出现的顺序添加试剂，用于384个反应(相同的多重测定，不同的DNA)。

2)在384孔微孔板(Marsh Biomedical Products公司#SP 0401Sequen)的每个孔中添加1μL适当的基因组DNA(5-10ng/μL)。

3)将4μL的PCR混合物分配给384孔板的每个孔中。

4)将微孔板在1000RPM下离心1分钟。

5)轻轻混合或漩涡该板，并且在热循环前旋转减慢。

6)384孔微孔板进行如下热循环：

制备SAP酶液

1)按照试剂在下表中出现的顺序添加试剂到1.5mL管中，以制备SAP酶液。

SAP酶溶液的体积

2)将含有SAP的酶溶液的1.5mL管进行漩涡五秒钟以混合溶液。

3)在5000RPM下，将1.5mL管SAP酶液离心十秒钟。

4)将2μL的SAP酶液加入到384孔样品微孔板的每个孔中。

5)用板密封膜密封384孔样品微孔板。

6)以1000RPM离心384孔样品微孔板1分钟。

7)孵育384孔样品微孔板如下：

37℃ 40分钟

85℃ 5分钟

4℃ 永远

制备High Plex iPLEX黄金反应混合物(相同的多重测定，不同的DNA)

1)如下表中所述，在1.5mL管中，制备高plex iPLEX黄金反应混合物。按照试剂在下表中出现的顺序添加试剂。

多重High plex iPLEX黄金反应混合物(相同的多重测定，不同的DNA)

2)将混合物微孔板以1000RPM离心一分钟。

3)添加2μL High Plex iLEX黄金反应到384孔样品微孔板。

4)用板密封膜密封所述384孔样品微孔板。

5)将384孔样品微孔板以1000RPM离心一分钟。

6)将384孔样品微孔板进行热循环如下：

提纯High Ple iPLEX黄金反应产物。High plex iPLEX黄金反应产物的提纯包括向样品微孔板中加入水而后加入清洁树脂。将清洁树脂散布到384孔凹坑板上。加入超纯水(nanopure water)至384孔样品微孔板的每个孔中。向384孔样品微孔板添加清洁树脂。

将384孔样品微孔板旋转并离心。

获取光谱

ACQUIRE模块控制MassARRAY Analyzer Compact(Compact)以从SpectroCHIPs获得光谱。由于每个SpectroCHIP由Compact处理，光谱数据自动处理，并保存到MassARRAY数据库。

该方法涉及与PCOS最相关的15个SNP标记，其可信度是较高的。检测过程能够以更低成本更容易地进行。

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Claims

1.用于预测PCOS风险的引物组或探针组，其中，所述引物组或探针组由用于检测选自SEQ ID NO.1-45中的至少15个SNP标记的N位点处的基因型的引物或探针组成，其中，所述至少15个SNP标记包含SEQ ID NO.6、11、22、23、25、29、30、33、34、35、37、41、42、43和44。

2.根据权利要求1所述的引物组或探针组，其中，所述引物组包含核苷酸序列SEQ IDNO.146、147、152、153、174、175、176、177、180、181、188、189、190、191、196、197、198、199、200、201、204、205、212、213、214、215、216、217、218和219。

3.根据权利要求1所述的引物组或探针组，其中，所述探针组包含核苷酸序列SEQ IDNO.56、57、66、67、88、89、90、91、94、95、102、103、104、105、110、111、112、113、114、115、118、119、126、127、128、129、130、131、132和133。

4.根据权利要求1所述的引物组或探针组，其中，所述引物组或探针组由用于检测SEQID NO.1-45中的45个SNP标记的N位点处的基因型的引物或探针组成。

5.包含权利要求1-4中任一项所述的引物组或探针组的试剂盒。

6.包含权利要求1或3-4中任一项所述的探针组的芯片。

7.权利要求1-4中任一项所述的引物组或探针组在制备预测PCOS风险的试剂中的应用。