WO2017154171A1 - 画像取得装置および画像取得方法 - Google Patents

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    • G01N2021/6463—Optics

Definitions

  • the present invention relates to an image acquisition device and an image acquisition method.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and an image acquisition apparatus and an image acquisition method capable of obtaining necessary sensitivity in a shorter exposure time compared to the case of using a lock-in amplifier. The purpose is to provide.
  • a scanning unit that scans illumination light emitted from a light source, and the illumination light that is scanned by the scanning unit is collected on a sample, while signal light generated at each scanning position of the sample
  • An optical system that collects the light, a detector that detects the signal light collected by the optical system and generates a detection signal, a signal control unit that generates a periodic signal repeated at a predetermined period, and the signal
  • a light control unit that temporally controls the position or intensity of the illumination light according to the periodic signal generated by the control unit, and the detection signal generated by the detector according to the periodic signal generated by the signal control unit
  • a calculation unit that processes the frequency of the detection signal by the period of the periodic signal generated by the signal control unit, and before the shift by the frequency shift unit.
  • a detection signal which is an image acquisition device comprising an integrator for integrating an integer multiple of the integration time period of the periodic signal.
  • each scanning position of the sample is irradiated via the optical system, and the signal light generated at each scanning position is collected by the optical system. Lighted. The collected signal light is detected by a detector to generate a detection signal, and the generated detection signal is processed in the arithmetic unit.
  • the light control unit controls the irradiation position and intensity of the illumination light on the sample in accordance with the periodic signal generated by the signal control unit.
  • the signal control unit generates the frequency of the detection signal generated by the detector. After being shifted by the frequency shift means by the period of the periodic signal, the integrator is integrated with an integration time that is an integral multiple of the period of the periodic signal in the integrator. Thereby, arbitrary signals can be separated and extracted from the detection signals detected in the mixed state.
  • a lock-in amplifier is not used for signal separation and extraction, and an integrator that operates according to a periodic signal generated by the signal control unit is used.
  • the required refresh rate is no longer necessary, and a signal with the required sensitivity is extracted with a shorter exposure time, and the extracted signal is applied to each scanning position, whereby an image of the sample can be acquired.
  • the light control unit may alternately switch the position or intensity of the illumination light between two states according to the periodic signal.
  • the signal control unit is configured to link the other two with reference to the periodic signal input to any one of the light control unit, the frequency shift unit, and the integrator. The phase of the periodic signal input to the other two may be adjusted.
  • the said signal control part may be provided in either the said light control part, the said frequency shift means, and the said integrator.
  • an A / D converter for digitizing the detection signal is provided, the frequency shift means assigns a digital code to the detection signal according to the periodic signal, and the integrator performs digital integration. May be.
  • the A / D converter may have an offset adjustment function.
  • the resolution of the detection signal can be improved by the A / D converter having the offset function.
  • the illumination light is irradiated to the sample via a plurality of paths, and at least one of the light control unit, the signal control unit, and the calculation unit is configured so that each of the route passing through the path A plurality may be provided corresponding to the illumination light.
  • a modulation step for temporally controlling the position or intensity of illumination light emitted from a light source according to a periodic signal repeated at a predetermined cycle, and the illumination light controlled in the modulation step A scanning step for scanning the sample, a detection step for detecting a signal light generated at each scanning position of the illumination light scanned in the scanning step to generate a detection signal, and the detection signal generated in the detection step A frequency shift step that shifts the frequency of the periodic signal by the period of the periodic signal, and an integration step that integrates the detection signal shifted by the frequency shift step with an integral time that is an integral multiple of the period of the periodic signal. It is an acquisition method.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating detection signals after integration. It is a block diagram which shows the image acquisition method which concerns on one Embodiment of this invention. It is a block diagram which shows the 1st modification of the image acquisition apparatus of FIG. It is a block diagram which shows the 2nd modification of the image acquisition apparatus of FIG. It is a block diagram which shows the 3rd modification of the image acquisition apparatus of FIG. It is a block diagram which shows the 4th modification of the image acquisition apparatus of FIG. It is a block diagram which shows the 5th modification of the image acquisition apparatus of FIG.
  • the image acquisition apparatus 1 is a confocal microscope, and includes a light source 2 that emits laser light (illumination light), and a light control unit 3 that temporally modulates the position of the laser light from the light source 2. It has.
  • the image acquisition apparatus 1 also collects a scanner (scanning unit) 4 that scans the laser beam temporally modulated by the light control unit 3 two-dimensionally and the laser beam scanned by the scanner 4 on the sample A.
  • an objective lens (optical system) 5 that condenses the fluorescence generated at the irradiation position of the laser beam on the sample A is provided.
  • the image acquisition device 1 also has a dichroic mirror 6 that separates the fluorescent light collected by the objective lens 5 and returned via the scanner 4 from the optical path of the laser light, and a position optically conjugate with the focal position of the objective lens 5.
  • a pinhole 7 is provided, and a detector (PMT: photomultiplier tube) 8 that detects the fluorescence that has passed through the pinhole 7 and generates a detection signal.
  • PMT photomultiplier tube
  • the image acquisition apparatus 1 includes a calculation unit 9 that processes the detection signal generated by the detector 8 and an image processing unit (PC: personal computer) that generates an image based on the detection signal processed by the calculation unit 9. ) 10. Further, the light control unit 3 and the calculation unit 9 are connected to a signal control unit 11 that generates a predetermined periodic signal for synchronizing them.
  • PC personal computer
  • the light control unit 3 includes a first beam splitter 12 that branches the laser light from the light source 2 into two optical paths L1 and L2, and the optical paths L1 and L2 that are branched by the first beam splitter 12.
  • a first beam splitter 12 that branches the laser light from the light source 2 into two optical paths L1 and L2, and the optical paths L1 and L2 that are branched by the first beam splitter 12.
  • AOM acousto-optic modulators
  • second beam splitter 14 for multiplexing the laser beams modulated by the acousto-optic modulators 13a and 13b.
  • reference numeral 15 denotes a mirror for constituting an optical path.
  • One optical path L1 is set so that the optical axis is shifted by the mirror 15 and the two laser beams combined by the second beam splitter 14 are incident on the scanner 4 at different angles.
  • the laser beam that has passed through one optical path L1 is condensed at a position on the sample A that is optically non-conjugated with the pinhole 7.
  • the laser beam that has passed through the other optical path L2 is condensed at a position on the sample A that is optically conjugate with the pinhole 7.
  • the two acousto-optic modulators 13a and 13b operate exclusively according to the periodic signal output from the signal control unit 11.
  • the laser light emitted from the light source 2 is a timing at which the intensity of the laser light passing through the two optical paths L1 and L2 is inverted by operating the two acousto-optic modulators 13a and 13b in synchronization with the periodic signal.
  • FIG. 2 (a) the laser beam focused on the conjugate position and the laser beam focused on the non-conjugated position are alternately generated as shown in FIG.
  • the two states with different laser light positions can be switched alternately in time.
  • the calculation unit 9 includes an A / D converter (not shown), a frequency shift unit 16, and an integrator 17.
  • the detection signal detected by the detector 8 is converted into a digital signal by an A / D converter and then input to the frequency shift means 16.
  • the frequency shift means 16 shifts the frequency of the detection signal generated by the detector 8 by the period of the periodic signal generated by the signal control unit 11.
  • the frequency shift means 16 is a digital frequency shift means that assigns a sign at a timing synchronized with a periodic signal, but may be a method of assigning positive or negative by a switch in an electric circuit, but is not limited thereto. Is not to be done.
  • the integrator 17 integrates the output from the frequency shift means 16 with an integration time that is an integral multiple of the period of the periodic signal generated by the signal control unit 11. In the example shown in FIG. 2, integration is performed with an integration time twice as long as the period of the periodic signal.
  • the output from the integrator 17 is shown in FIG. Thereby, only the fluorescence generated by subtracting the out-of-focus fluorescence from the fluorescence obtained by mixing the fluorescence generated at the focal position of the objective lens 5 and the out-of-focus fluorescence generated outside the focus, that is, the fluorescence generated at the focal position of the objective lens 5 only. Can be calculated.
  • the image processing unit 10 generates a fluorescence image of the sample A by associating the fluorescence intensity output from the calculation unit 9 with the scanning position information by the scanner 4 when the fluorescence is detected. Yes. Since the fluorescence intensity output from the calculation unit 9 does not include the intensity of the out-of-focus fluorescence, a clear fluorescence image with little noise can be acquired.
  • the image acquisition method according to the present embodiment is modulated by a modulation step S1 that temporally modulates the position of the laser light emitted from the light source 2 in accordance with a periodic signal generated at a predetermined period generated by the signal control unit 11.
  • a scanning step S2 for scanning the sample A with the laser beam by the scanner 4 a detection step S3 for generating a detection signal by detecting fluorescence generated at each scanning position of the scanned laser beam, and a detection signal
  • the frequency shift step S4 for shifting the frequency by the period of the periodic signal generated by the signal control unit 11, and the shifted detection signal are integrated with an integral time that is an integral multiple of the period of the periodic signal generated by the signal control unit 11. Integration step S5.
  • the arithmetic unit 9 demodulates the fluorescence generated from the focal position of the objective lens 5 by the frequency shift means 16 and the integrator 17. Therefore, the refresh rate required when using the lock-in amplifier is unnecessary, and there is an advantage that a fluorescent image having a necessary sensitivity can be acquired with a short exposure time. On the contrary, there is an advantage that a sufficiently bright fluorescent image can be acquired by performing exposure with an exposure time for obtaining a fluorescent image having a necessary sensitivity by a lock-in amplifier.
  • the present invention is not limited to this.
  • the signal control unit 11 uses a periodic signal input to any one of the light control unit 3, the frequency shift unit 16, and the integrator 17 as a reference, and inputs the other two to interlock with the other two. You may have the phase adjustment function which adjusts the phase of a signal.
  • the signal control unit 11 is described as a separate device from the light control unit 3, the frequency shift unit 16, and the integrator 17, but instead, the signal control unit 11 includes the light control unit 3, the frequency shift unit, and the frequency shift unit 16. Any one of the means 16 and the integrator 17 may be provided.
  • the signal control unit 11 is provided in the light control unit 3, and the light control unit 3 is controlled by a periodic signal generated by itself, and the frequency shift means 16 and the integrator are controlled by the periodic signal generated by the light control unit 3. 17 may be controlled.
  • a digital frequency shifter is adopted as the frequency shift means 16 of the arithmetic unit 9 and a digital integrator is adopted as the integrator 17. Since code assignment is performed by software after A / D conversion, there is an advantage that frequency shift can be performed without changing hardware even if the waveform of the signal changes.
  • a multiplier made of an analog circuit may be adopted as the frequency shift means 16 and an integrator made of an analog circuit may be adopted as the integrator 17.
  • an integrator made of an analog circuit may be adopted as the integrator 17.
  • the frequency shift means 16 a multiplier made of an analog circuit may be adopted, an A / D converter for converting the output of the multiplier into a digital signal may be provided, and a digital integrator may be adopted.
  • the A / D converter that converts the detection signal detected by the detector 8 into a digital signal is preferably provided with an offset adjustment function.
  • the acoustooptic modulators 13a and 13b are used as the light control unit 3 has been exemplified.
  • a combination with a plate or the like may be used.
  • the laser light source itself may be directly controlled.
  • a device that changes the direction of laser light such as an acousto-optic polarizer or an electro-optic polarizer, may be employed.
  • the light source 18 is a laser light source that emits an ultrashort pulse laser beam
  • the dichroic mirror 6 that branches fluorescence from the optical path of the ultrashort pulse laser beam is disposed between the objective lens 5 and the scanner 4.
  • the pinhole 7 provided in FIG. 1 is excluded.
  • two laser light sources (light sources) 19a and 19b that emit ultra-short pulse laser beams having different wavelengths, and ultra-short pulse laser beams from the laser light sources 19a and 19b, respectively, have different patterns.
  • Two light control units 20a and 20b to modulate, two calculation units 21a and 21b that demodulate desired fluorescence from detected fluorescence, and two pairs of light control units 20a and 20b and calculation units 21a and 21b are different.
  • Two signal controllers 22a and 22b for supplying periodic signals are provided. Thereby, two fluorescence signals can be acquired simultaneously.
  • two pairs of signal control units 22a and 22b, light control units 20a and 20b, and arithmetic units 21a and 21b are provided, three or more pairs may be provided instead.
  • only two calculation units 21 a and 21 b are provided, and the single light control unit 3 and the two pairs of calculation units 21 a and 21 b are synchronized by a periodic signal from the single signal control unit 11. May be activated.
  • a multi-point scanner such as a Nipou disk is employed as the scanner 22, and a sensor array is employed as the detector 23.
  • Two arithmetic units 21a and 21b are provided corresponding to the laser light passing through a plurality of optical paths branched by the Nipkow disk.
  • the light modulation controls the light source intensity, switches the saturation / non-saturation of the focused fluorescence, and images the difference between the saturation / non-saturation, thereby improving resolution.
  • two pairs of light sources 19a and 19b and light control units 20a and 20b are provided, and two light control units 20a and 20b and a single calculation unit 9 are connected to a single signal control unit 11.
  • an SRS (Stimulated Raman Scattering) microscope that uses the vibration of the molecules of the sample A generated by the frequency difference when two types of laser beams having different frequencies are superimposed and irradiated onto the sample A is used. It can be applied to a nonlinear microscope.
  • the two light sources 19a and 19b are laser light sources that emit ultrashort pulse laser beams having different wavelengths, respectively, and the periodic signal to the arithmetic unit 9 modulates one of the ultrashort pulse laser beams.
  • the light control unit 20a Synchronized with the periodic signal to.
  • a single laser light source 24 that emits an ultrashort pulse laser beam is adopted, and the two beams branched by the beam splitter 12 are used.
  • the light control units 20a and 20b may be arranged on the two optical paths L1 and L2, respectively.
  • two laser light sources 19a and 19b that emit an ultrashort pulse laser beam having the same wavelength may be employed.

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Abstract

ロックインアンプを使用する場合と比較して、より短い露光時間で、必要な感度を得ることを目的として、本発明に係る画像取得装置（１）は、光源（２）から射出された照明光を走査する走査部（４）と、走査される照明光を試料（Ａ）に集光する一方、試料（Ａ）の各走査位置において発生した信号光を集光する光学系（５）と、集光された信号光を検出して検出信号を生成する検出器（８）と、所定の周期で繰り返される周期信号を発生させる信号制御部（１１）と、発生した周期信号に従い、照明光の位置または強度を時間的に制御する光制御部（３）と、発生した周期信号に従い、検出器（８）により生成された検出信号を処理する演算部（９）とを備え、演算部（９）が、周期信号の周期分だけ検出信号の周波数をシフトする周波数シフト手段（１６）と、シフトされた検出信号を周期信号の周期の整数倍の積分時間で積分する積分器（１７）とを備える。

Description

画像取得装置および画像取得方法
　本発明は、画像取得装置および画像取得方法に関するものである。
　強い信号に混じっている微小信号を検出して画像化するために、ロックインアンプを使用する画像取得方法が知られている（例えば、特許文献１から４参照。）。
ＷＯ２００６／０６１９４７号パンフレット ＷＯ２０１５／０３０２０２号パンフレット 特表２０１４－５０７６２７号公報 ＷＯ２０１４／０２７４４９号パンフレット
　特許文献１から４の技術のように微小信号の検出にロックインアンプを使用する場合、ロックインアンプのリフレッシュレート分だけ待たなければならず、必要な感度で微小信号を分離するために露光時間を増加させる必要がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、ロックインアンプを使用する場合と比較して、より短い露光時間で、必要な感度を得ることができる画像取得装置および画像取得方法を提供することを目的としている。
　本発明の一態様は、光源から射出された照明光を走査する走査部と、該走査部により走査される前記照明光を試料に集光する一方、該試料の各走査位置において発生した信号光を集光する光学系と、該光学系により集光された前記信号光を検出して検出信号を生成する検出器と、所定の周期で繰り返される周期信号を発生させる信号制御部と、該信号制御部が発生した前記周期信号に従い、前記照明光の位置または強度を時間的に制御する光制御部と、前記信号制御部が発生した前記周期信号に従い、前記検出器により生成された前記検出信号を処理する演算部とを備え、該演算部が、前記信号制御部が発生した前記周期信号の周期分だけ前記検出信号の周波数をシフトする周波数シフト手段と、該周波数シフト手段によりシフトされた前記検出信号を前記周期信号の周期の整数倍の積分時間で積分する積分器とを備える画像取得装置である。
　本態様によれば、光源から射出された照明光が走査部によって走査されると、光学系を経由して試料の各走査位置に照射され、各走査位置において発生した信号光が光学系によって集光される。集光された信号光は検出器によって検出されることにより検出信号が生成され、生成された検出信号が演算部において処理される。
　光制御部によって、試料における照明光の照射位置および強度が、信号制御部が発生した周期信号に従って制御され、演算部においては、検出器により生成された検出信号の周波数が、信号制御部が発生した周期信号の周期分だけ周波数シフト手段によってシフトされた後に、積分器において周期信号の周期の整数倍の積分時間で積分される。これにより、混合された状態で検出された検出信号の中から任意の信号を分離抽出することができる。
　この場合において、本実施形態によれば、信号の分離抽出にロックインアンプを用いておらず、信号制御部が発生した周期信号に従って動作する積分器を用いているので、ロックインアンプにおいて必要であったリフレッシュレートが不要となり、より短い露光時間で必要な感度の信号を抽出し、抽出された信号を各走査位置に当てはめることで、試料の画像を取得することができる。
　上記態様においては、前記光制御部が、前記周期信号に従い、前記照明光の位置または強度を２つの状態間で交互に切り替えてもよい。
　また、上記態様においては、前記信号制御部が、前記光制御部、前記周波数シフト手段および前記積分器のいずれか１つに入力する前記周期信号を基準として、他の２つを連動させるように、他の２つに入力する前記周期信号の位相調整を行ってもよい。
　また、上記態様においては、前記信号制御部が、前記光制御部、前記周波数シフト手段および前記積分器のいずれかに設けられていてもよい。
　また、上記態様においては、前記検出信号をデジタル化するＡ／Ｄ変換器を備え、前記周波数シフト手段が、前記周期信号に従って前記検出信号にデジタル符号割り当てを行い、前記積分器がデジタル積分を行ってもよい。
　また、上記態様においては、前記Ａ／Ｄ変換器が、オフセット調整機能を有していてもよい。
　オフセット機能を有するＡ／Ｄ変換器により、検出信号の分解能を向上することができる。
　また、上記態様においては、前記照明光が複数の経路を経由して前記試料に照射され、前記光制御部、前記信号制御部および前記演算部の少なくとも１つが、各前記経路を経由する各前記照明光に対応して複数備えられていてもよい。
　また、本発明の他の態様は、所定の周期で繰り返される周期信号に従って、光源から射出された照明光の位置または強度を時間的に制御する変調ステップと、該変調ステップにおいて制御された照明光を試料において走査する走査ステップと、該走査ステップにおいて走査された照明光の各走査位置において発生した信号光を検出して検出信号を生成する検出ステップと、該検出ステップにおいて生成された前記検出信号の周波数を、前記周期信号の周期分だけシフトする周波数シフトステップと、該周波数シフトステップによりシフトされた前記検出信号を前記周期信号の周期の整数倍の積分時間で積分する積分ステップとを含む画像取得方法である。
　本発明によれば、ロックインアンプを使用する場合と比較して、より短い露光時間で、必要な感度を得ることができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る画像取得装置を示すブロック図である。 図１の画像取得装置における、（ａ）光制御部から出力されるレーザ光、（ｂ）検出器により検出された蛍光の検出信号、（ｃ）周波数シフト手段によるシフト後の検出信号、（ｄ）積分後の検出信号をそれぞれ示す図である。 本発明の一実施形態に係る画像取得方法を示すブロック図である。 図１の画像取得装置の第１の変形例を示すブロック図である。 図１の画像取得装置の第２の変形例を示すブロック図である。 図１の画像取得装置の第３の変形例を示すブロック図である。 図１の画像取得装置の第４の変形例を示すブロック図である。 図１の画像取得装置の第５の変形例を示すブロック図である。
　以下、本発明の一実施形態に係る画像取得装置１について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る画像取得装置１は、共焦点顕微鏡であって、レーザ光（照明光）を射出する光源２と、光源２からのレーザ光の位置を時間的に変調する光制御部３とを備えている。また、画像取得装置１は、光制御部３により時間的に変調されたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ（走査部）４と、該スキャナ４により走査されたレーザ光を試料Ａに集光する一方、試料Ａにおけるレーザ光の照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズ（光学系）５とを備えている。
　また、画像取得装置１は、対物レンズ５により集光されスキャナ４を経由して戻る蛍光をレーザ光の光路から分離するダイクロイックミラー６と、対物レンズ５の焦点位置と光学的に共役な位置に配置されるピンホール７と、該ピンホール７を通過した蛍光を検出し検出信号を生成する検出器（ＰＭＴ：光電子増倍管）８とを備えている。
　さらに、画像取得装置１は、検出器８において生成された検出信号を処理する演算部９と、該演算部９による処理後の検出信号に基づいて画像を生成する画像処理部（ＰＣ：パーソナルコンピュータ）１０とを備えている。
　また、光制御部３および演算部９にはこれらを同期させる所定の周期信号を発生する信号制御部１１が接続されている。
　本実施形態においては、光制御部３は、光源２からのレーザ光を２つの光路Ｌ１，Ｌ２に分岐する第１ビームスプリッタ１２と、該第１ビームスプリッタ１２により分岐された各光路Ｌ１，Ｌ２に設けられた音響光学変調器（ＡＯＭ）１３ａ，１３ｂと、各音響光学変調器１３ａ，１３ｂにより変調されたレーザ光を合波する第２ビームスプリッタ１４とを備えている。図中、符号１５は、光路を構成するためのミラーである。
　一方の光路Ｌ１は、ミラー１５によって光軸をずらし、第２ビームスプリッタ１４による合波後の２つのレーザ光がスキャナ４に異なる角度で入射するように設定されている。これにより、一方の光路Ｌ１を通過したレーザ光は、ピンホール７とは光学的に非共役な試料Ａ上の位置に集光させられるようになっている。また、他方の光路Ｌ２を通過したレーザ光は、ピンホール７と光学的に共役な試料Ａ上の位置に集光させられるようになっている。
　２つの音響光学変調器１３ａ，１３ｂは、信号制御部１１から出力される周期信号に従って、排他的に動作するようになっている。すなわち、光源２から発せられたレーザ光は、２つの音響光学変調器１３ａ，１３ｂを周期信号に同期して作動させることによって、２つの光路Ｌ１，Ｌ２を通過するレーザ光の強度を反転したタイミングで時間的に交互に増減させて、図２（ａ）に示されるように、共役な位置に集光されるレーザ光と、非共役な位置に集光されるレーザ光として交互に生成され、レーザ光の位置を異ならせた２つの状態が時間的に交互に切り替えられるようになっている。
　演算部９は、図１に示されるように、図示しないＡ／Ｄ変換器と、周波数シフト手段１６と積分器１７とを備えている。
　検出器８により検出された検出信号は、Ａ／Ｄ変換器によってデジタル信号に変換された後に、周波数シフト手段１６に入力されるようになっている。
　周波数シフト手段１６は、検出器８により生成された検出信号の周波数を、信号制御部１１が発生した周期信号の周期分だけシフトするようになっている。本実施形態においては、周波数シフト手段１６は、周期信号に同期したタイミングで符号を割り当てるデジタル周波数シフト手段であるが、ほかに電気回路でスイッチにより正負を割り当てる方法であってもよく、これらに限定されるものではない。
　例えば、図２（ａ）のレーザ光が試料Ａに照射された結果、発生した蛍光が検出器８によって検出されることにより生成された検出信号が、図２（ｂ）のようになった場合に周波数シフト手段１６を通過させることにより、図２（ｃ）に示されるように、非共役な位置において発生した蛍光の符号が反転させられる。
　積分器１７は、信号制御部１１が発生した周期信号の周期の整数倍の積分時間で、周波数シフト手段１６からの出力を積分するようになっている。図２に示す例では、周期信号の周期の２倍の積分時間で積分するようになっている。積分器１７からの出力を図２（ｄ）に示す。
　これにより、対物レンズ５の焦点位置において発生した蛍光と焦点外において発生した焦点外蛍光とが混合された蛍光から焦点外蛍光を減算した蛍光、すなわち、対物レンズ５の焦点位置において発生した蛍光のみを算出することができるようになっている。
　画像処理部１０は、演算部９から出力された蛍光強度を、該蛍光が検出された時点でのスキャナ４による走査位置情報と対応づけることにより、試料Ａの蛍光画像を生成するようになっている。演算部９から出力された蛍光強度は、焦点外蛍光の強度を含まないので、ノイズの少ない鮮明な蛍光画像を取得することができる。
　このように構成された本実施形態に係る画像取得装置１を用いた画像取得方法について、以下に説明する。
　本実施形態に係る画像取得方法は、信号制御部１１が発生した所定の周期で繰り返される周期信号に従って、光源２から射出されたレーザ光の位置を時間的に変調する変調ステップＳ１と、変調されたレーザ光をスキャナ４によって試料Ａにおいて走査する走査ステップＳ２と、走査されたレーザ光の各走査位置において発生した蛍光を検出して検出信号を生成する検出ステップＳ３と、生成された検出信号の周波数を、信号制御部１１が発生した周期信号の周期分だけシフトする周波数シフトステップＳ４と、シフトされた検出信号を信号制御部１１が発生した周期信号の周期の整数倍の積分時間で積分する積分ステップＳ５とを含んでいる。
　このように、本実施形態に係る画像取得装置１および画像取得方法によれば、演算部９が、周波数シフト手段１６と積分器１７によって対物レンズ５の焦点位置から発生した蛍光を復調しているので、ロックインアンプを用いる場合に必要であったリフレッシュレートが不要であり、短い露光時間で必要な感度の蛍光画像を取得することができるという利点がある。逆に、ロックインアンプにより必要な感度の蛍光画像を得るための露光時間で露光することにより、十分に明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
　なお、本実施形態においては、共焦点顕微鏡からなる画像取得装置１において、焦点外蛍光を除去した蛍光画像を取得する場合について説明したが、これに限定されるものではない。
　信号制御部１１は、光制御部３、周波数シフト手段１６および積分器１７のいずれか１つに入力する周期信号を基準として、他の２つを連動させるように他の２つに入力する周期信号の位相を調整する位相調整機能を有していてもよい。
　また、信号制御部１１を、光制御部３、周波数シフト手段１６および積分器１７とは別体の装置として記載したが、これに代えて、信号制御部１１は、光制御部３、周波数シフト手段１６および積分器１７のいずれか１つに備えられていてもよい。
　例えば、信号制御部１１が光制御部３に備えられ、光制御部３がそれ自体で発生する周期信号によって制御されるとともに、光制御部３が発生する周期信号によって周波数シフト手段１６および積分器１７が制御されることにしてもよい。
　また、本実施形態においては、演算部９の周波数シフト手段１６としてデジタル周波数シフタを採用し、積分器１７としてデジタル積分器を採用した。Ａ／Ｄ変換した後、符号割り当てをソフトウェアで行うので、信号の波形が変化してもハードウェアを変更せずに周波数シフトを行うことができるという利点がある。
　これに代えて、周波数シフト手段１６としてアナログ回路からなる乗算器を採用し、積分器１７としてアナログ回路からなる積分器を採用してもよい。また、周波数シフト手段１６として、アナログ回路からなる乗算器を採用し、乗算器の出力をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器を備えるとともに、デジタル積分器を採用してもよい。
　周波数シフト手段１６としてアナログ回路からなる乗算器を採用することにより、周波数シフトを正確に行うことができ、積分時に検出信号を取りこぼすことがないという利点がある。
　また、積分器１７としてデジタル積分器を採用することにより、コンデンサ開放の時間が不要となり高速処理を行うことができるという利点がある。
　また、検出器８により検出された検出信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器にオフセット調整機能が備えられていることが好ましい。
　オフセット調整によってノイズを打ち消すことができるとともに、所望の信号に多くのメモリを割り当てることができダイナミックレンジを向上できるという利点がある。
　また、光制御部３として、音響光学変調器１３ａ，１３ｂを用いる場合を例示したが、これに代えて、レーザ光の強度を変調する音響光学素子、電気光学素子、ＮＤフィルタ、波長板と偏光板との組み合わせ等を用いてもよい。また、レーザ光源そのものを直接制御してもよい。
　また、光制御部３として、音響光学偏光器あるいは電気光学偏光器等のレーザ光の向きを変更するデバイスを採用してもよい。
　また、共焦点顕微鏡に代えて、図４から図６に示されるように、多光子励起顕微鏡を採用してもよいし、図７に示されるように、非線形顕微鏡を採用してもよい。
　図４に示す例では、光源１８は極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源であり、蛍光を極短パルスレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー６は、対物レンズ５とスキャナ４との間に配置されている。また、図１に備えられていたピンホール７が除外されている。
　また、図５に示す例では、波長の異なる極短パルスレーザ光を射出する２つのレーザ光源（光源）１９ａ，１９ｂと、各レーザ光源１９ａ，１９ｂからの極短パルスレーザ光を異なるパターンでそれぞれ変調する２つの光制御部２０ａ，２０ｂと、検出された蛍光から所望の蛍光を復調する２つの演算部２１ａ，２１ｂと、２対の光制御部２０ａ，２０ｂおよび演算部２１ａ，２１ｂに対し異なる周期信号を供給する２つの信号制御部２２ａ，２２ｂとを備えている。これにより、２つの蛍光信号を同時に取得することができる。また、分光デバイスを備えていなくても分光することができるという利点がある。信号制御部２２ａ，２２ｂ、光制御部２０ａ，２０ｂおよび演算部２１ａ，２１ｂを２対備えることとしたが、これに代えて、３対以上備えていてもよい。
　また、図６に示すように、演算部２１ａ，２１ｂのみ２つ備え、単一の光制御部３および２対の演算部２１ａ，２１ｂを単一の信号制御部１１からの周期信号によって同期して作動させることにしてもよい。この例では、スキャナ２２としてニポウディスクのような多点スキャナを採用し、検出器２３としてセンサアレイを採用している。ニポウディスクによって分岐された複数の光路を経由するレーザ光に対応して２つの演算部２１ａ，２１ｂが備えられている。光変調が光源強度を制御し、焦点蛍光の飽和／非飽和を切り替え、飽和／非飽和の差分を画像化することで解像度を向上させることができる。
　また、図７に示すように、光源１９ａ，１９ｂおよび光制御部２０ａ，２０ｂを２対備え、２つの光制御部２０ａ，２０ｂおよび単一の演算部９を単一の信号制御部１１からの周期信号によって同期して作動させることにしてもよい。このように構成することで、周波数の異なる２種類のレーザ光を重ねて試料Ａに照射する際に周波数差によって発生する試料Ａの分子の振動を利用するＳＲＳ（誘導ラマン散乱）顕微鏡のような非線形顕微鏡に適用することができる。２つの光源１９ａ，１９ｂは、それぞれ波長の異なる極短パルスレーザ光を射出するレーザ光源であり、演算部９への周期信号は一方の極短パルスレーザ光を変調する、例えば、光制御部２０ａへの周期信号と同期している。
　また、図８に示されるように、図５の２つのレーザ光源１９ａ，１９ｂに代えて、極短パルスレーザ光を射出する単一のレーザ光源２４を採用し、ビームスプリッタ１２によって分岐された２つの光路Ｌ１，Ｌ２にそれぞれ光制御部２０ａ，２０ｂを配置してもよい。ビームスプリッタ１２を用いることなく、同一の波長の極短パルスレーザ光を射出する２つのレーザ光源１９ａ，１９ｂを採用してもよい。異なる位置に集光する極短パルスレーザ光を異なる繰り返し周期で変調し、２つの演算部９によって復調することにより、２点の信号を同時に取得でき、画像取得速度の向上を図ることができる。
　１　画像取得装置
　２，２４　光源
　３，２０ａ，２０ｂ　光制御部
　４，２２　スキャナ（走査部）
　５　対物レンズ（光学系）
　８，２３　検出器
　９，２１ａ，２１ｂ　演算部
　１１，２２ａ，２２ｂ　信号制御部
　１６　周波数シフト手段
　１７　積分器
　１９ａ，１９ｂ　レーザ光源（光源）
　Ａ　試料
　Ｓ１　変調ステップ
　Ｓ２　走査ステップ
　Ｓ３　検出ステップ
　Ｓ４　周波数シフトステップ
　Ｓ５　積分ステップ

Claims (8)

  1. 　光源から射出された照明光を走査する走査部と、
    　該走査部により走査される前記照明光を試料に集光する一方、該試料の各走査位置において発生した信号光を集光する光学系と、
    　該光学系により集光された前記信号光を検出して検出信号を生成する検出器と、
    　所定の周期で繰り返される周期信号を発生させる信号制御部と、
    　該信号制御部が発生した前記周期信号に従い、前記照明光の位置または強度を時間的に制御する光制御部と、
    　前記信号制御部が発生した前記周期信号に従い、前記検出器により生成された前記検出信号を処理する演算部とを備え、
    　該演算部が、前記信号制御部が発生した前記周期信号の周期分だけ前記検出信号の周波数をシフトする周波数シフト手段と、該周波数シフト手段によりシフトされた前記検出信号を前記周期信号の周期の整数倍の積分時間で積分する積分器とを備える画像取得装置。
  2. 　前記光制御部が、前記周期信号に従い、前記照明光の位置または強度を２つの状態間で交互に切り替える請求項１に記載の画像取得装置。
  3. 　前記信号制御部が、前記光制御部、前記周波数シフト手段および前記積分器のいずれか１つに入力する前記周期信号を基準として、他の２つを連動させるように、他の２つに入力する前記周期信号の位相調整を行う請求項１または請求項２に記載の画像取得装置。
  4. 　前記信号制御部が、前記光制御部、前記周波数シフト手段および前記積分器のいずれかに設けられている請求項３に記載の画像取得装置。
  5. 　前記検出信号をデジタル化するＡ／Ｄ変換器を備え、
    　前記周波数シフト手段が、前記周期信号に従って前記検出信号にデジタル符号割り当てを行い、
    　前記積分器がデジタル積分を行う請求項１から請求項４のいずれかに記載の画像取得装置。
  6. 　前記Ａ／Ｄ変換器が、オフセット調整機能を有する請求項５に記載の画像取得装置。
  7. 　前記照明光が複数の経路を経由して前記試料に照射され、
    　前記光制御部、前記信号制御部および前記演算部の少なくとも１つが、各前記経路を経由する各前記照明光に対応して複数備えられている請求項１から請求項６のいずれかに記載の画像取得装置。
  8. 　所定の周期で繰り返される周期信号に従って、光源から射出された照明光の位置または強度を時間的に制御する変調ステップと、
    　該変調ステップにおいて制御された照明光を試料において走査する走査ステップと、
    　該走査ステップにおいて走査された照明光の各走査位置において発生した信号光を検出して検出信号を生成する検出ステップと、
    　該検出ステップにおいて生成された前記検出信号の周波数を、前記周期信号の周期分だけシフトする周波数シフトステップと、
    　該周波数シフトステップによりシフトされた前記検出信号を前記周期信号の周期の整数倍の積分時間で積分する積分ステップとを含む画像取得方法。
     
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