WO2017126589A1 - 細胞培養基板及びその製造方法 - Google Patents

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WO2017126589A1
WO2017126589A1 PCT/JP2017/001689 JP2017001689W WO2017126589A1 WO 2017126589 A1 WO2017126589 A1 WO 2017126589A1 JP 2017001689 W JP2017001689 W JP 2017001689W WO 2017126589 A1 WO2017126589 A1 WO 2017126589A1
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adhesive
cell culture
culture substrate
resin layer
site
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PCT/JP2017/001689
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薫 須田
圭介 新宮
三澤　毅秀
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綜研化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture substrate and a method for producing the same.
  • a screening test in which a drug is administered to a cell mass (spheroid) cultured in a three-dimensional shape and the metabolic ability of the drug is measured.
  • a cell mass spheroid
  • it has been required to culture uniform spheroids with a high survival rate using a culture vessel that can be easily prepared.
  • a substrate having an adhesion region and an inhibition region for cells is used as a culture substrate.
  • Patent Document 1 a resin having a property that can be used in an adhesion region or an inhibition region is special and limited. It is difficult to synthesize such a special resin, which requires a long time and a high cost.
  • Some aspects of the present invention have been made in view of such circumstances, and can be easily produced using readily available materials, and a cell culture substrate capable of culturing uniform spheroids with high survival rate Is to provide.
  • a cell culture substrate having an adhesive site and a non-adhesive site, wherein the adhesive site and the non-adhesive site have an uneven shape
  • a cell culture substrate is provided in which the contact angle of the adhesive site with respect to pure water is greater than that of the adhesive site.
  • the present inventor provides a cell culture substrate comprising an adhesive part having a concavo-convex shape and a highly water-repellent non-adhesive part having a concavo-convex shape different from the adhesive part even when an easily available material is used. When used, it was found that uniform spheroids can be cultured with high survival rate, and the present invention has been completed.
  • the uneven pitch P 1 of the adhesive part is larger than the uneven pitch P 2 of the non-adhesive part.
  • the ratio P 1 / P 2 of the pitch P 1 between the pitch P 2 is 2 or more.
  • at least a part of the adhesive part is partitioned by a partition part, and the non-adhesive part is formed on the partition part.
  • the non-adhesive part has a plurality of columnar protrusions, the pitch at which the columnar convex parts of the non-adhesive part are formed is 50 to 2000 nm, and the columnar convex parts of the non-adhesive part are , the area of the upper surface is 1600 nm 2 ⁇ 4 [mu] m 2, the gap G 2 between the two columnar protrusions adjacent is in the range of 10 ⁇ 1960nm.
  • the adhesive part and the non-adhesive part are made of the same material.
  • a method for producing the cell culture substrate wherein the photocurable resin composition coated on a substrate is cured by irradiation with active energy rays, and the adhesive site
  • a method for producing a cell culture substrate comprising the step of forming a concavo-convex shape of the non-adhesive site.
  • the uneven shape of the adhesive part and the non-adhesive part is formed by a nanoimprint method using a mold.
  • FIG. 1 shows a cell culture substrate 1 according to an embodiment of the present invention, in which (a) is a plan view, (b) is a cross-sectional view taken along the line AA, and (c) is a case where the uneven shape of another embodiment is (b). It is sectional drawing which shows the reversed pattern.
  • FIG. 2 is an enlarged view of a region X in FIG. 1B showing an adhesive portion 3 according to an embodiment of the present invention, where FIG. 1A is a plan view and FIG. FIGS. 1A and 1B are enlarged views of a region Y in FIG. 1B showing a non-adhesive portion 5 of an embodiment of the present invention, wherein FIG. 1A is a plan view and FIG.
  • 1B is a CC cross-sectional view. It is sectional drawing of the cell culture substrate 1 of one Embodiment of this invention, (a) has the partition part 19, (b) shows the example in the case of not having a partition part.
  • the transparent base material 23 provided with the light-shielding part 21 is shown, (a) is a plan view and (b) is a DD cross-sectional view.
  • (C) to (e) show other examples of the method of forming the light shielding pattern 3. It is sectional drawing which shows the 1st to-be-transferred resin layer formation process of this invention. It is sectional drawing which shows the adhesive part resin layer formation process of this invention. It is sectional drawing which shows the composite resin layer formation process of this invention. 4 is SEM images (a) to (d) of samples 1 to 4.
  • the cell culture substrate 1 of one embodiment of the present invention includes a base material 7 and a resin layer 9 on at least one surface of the base material 7. , Having an adhesive part 3 and a non-adhesive part 5.
  • the uneven shape of the adhesive part 3 and the non-adhesive part 5 shown in FIG. 1B may be a shape in which the uneven part of either the adhesive part 3 or the non-adhesive part 5 is inverted, and any uneven part is provided.
  • the shape as shown in FIG. 1C may be reversed.
  • a non-adhesive part 5 is arranged so as to surround the adhesive part 3 and is divided into an adhesive part 3 area and a non-adhesive part 5 area.
  • a part may be interrupted.
  • the shape of the region of the adhesive part 3 is not particularly limited, and examples thereof include a circle and a polygon.
  • examples thereof include a circle and a polygon.
  • the cell culture substrate 1 may have a partition part 19 that partitions at least a part of the adhesive part. Moreover, as shown in FIG.4 (b), it does not need to have. In order to prevent the cells from being detached from the base material at the time of medium exchange or the like, it is preferable to have the partition part 19.
  • the material of the base material 7 is not specifically limited, It is preferable that they are transparent base materials, such as a resin base material and a quartz base material, and it is more preferable that it is a resin base material from a flexible viewpoint.
  • the resin constituting the resin base material include one selected from the group consisting of polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyester, polyolefin, polyimide, polysulfone, polyethersulfone, cyclic polyolefin, and polyethylene naphthalate.
  • the substrate 7 is preferably in the form of a flexible film, and the thickness is preferably in the range of 25 to 500 ⁇ m.
  • the resin constituting the resin layer 9 is not particularly limited.
  • an acrylic resin, a methacrylic resin, a styrene resin, an olefin resin, a polycarbonate resin, a polyester resin, an epoxy resin, a silicone resin, and the like are relatively easy to obtain and synthesize and are inexpensive. It is preferable to consist of resin.
  • the types of the resin material of the adhesive part 3 and the non-adhesive part 5 may be different. However, when they are the same, it is more preferable because the production is easier and efficient.
  • the adhesive portion 3 has a concavo-convex shape with a plurality of adhesive convex portions 11 and adhesive concave portions 13.
  • the shape which the convex part and the recessed part reversed may be sufficient.
  • the shape of the adhesive convex portion 11 is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape (columnar shape, polygonal columnar shape, etc.), a frustum, a microlens, and the like.
  • the shape of the adhesive recess 13 is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape (columnar shape, polygonal columnar shape, etc.), a frustum, a hole hollowed into a shape such as a microlens, and the like.
  • the pitch P 1 at which the adhesive convex portion 11 or the adhesive concave portion 13 is formed may be within a range having adhesiveness to the target cell, and is, for example, 2 to 50 ⁇ m, preferably 5 to 20 ⁇ m. More preferably, it is 7 to 15 ⁇ m. If the pitch P 1 is too small, the cell is less likely to adhere. Further, the pitch P 1 is too large, cells are difficult to form spheroids. Specifically, the pitch P 1 is, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25. , 30, 35, 40, 45, 50 ⁇ m, and may be within a range between any two of the numerical values exemplified here.
  • the uneven corrugated shape by the adhesive convex part 11 and the adhesive recessed part 13 may be regular or irregular, it is preferable that it is regular from a viewpoint of work efficiency.
  • the distance between the tips of the many convex portions or concave portions constituting the uneven shape is “pitch”, and when the uneven shape is irregularly formed, the uneven shape
  • the average value of the distances between the tips of a large number of convex portions or concave portions constituting the “pitch” is defined as “pitch”.
  • the height H 1 of the adhesive protrusion 11 is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 ⁇ m, preferably 1 to 10 ⁇ m, and more preferably 1 to 5 ⁇ m. If it is too low, it is difficult for cells to form spheroids. Moreover, it is because the adhesive convex part 11 will fall easily when too high.
  • a typical example of the adhesive part has a plurality of columnar protrusions.
  • the area of the upper surface of the columnar convex portion of the adhesive part may be within the range having adhesiveness to the target cells, and is, for example, 1 to 2400 ⁇ m 2 , preferably 16 to 360 ⁇ m 2 , more preferably. Is 36 to 196 ⁇ m 2 .
  • Gap G 1 between the two columnar protrusions adjacent may be within a range having adhesion to cells of interest, e.g., a 1 ⁇ 49 .mu.m, preferably from 4 ⁇ 19 .mu.m, more preferably 6-14 ⁇ m.
  • the adhesive portion 3 has a concavo-convex shape with a plurality of non-adhesive convex portions 15 and non-adhesive concave portions 17.
  • the shape which the convex part and the recessed part reversed may be sufficient.
  • the contact angle of the non-adhesive part 5 with respect to pure water is not particularly limited, but is larger than the adhesive part 3. If it is larger than the adhesive part 3, it is difficult for cells to adhere to the non-adhesive part 5, and spheroids are easily formed.
  • the contact angle of the non-adhesive portion 5 with respect to pure water is, for example, 90 to 180 °, preferably 105 to 180 °, more preferably 110 to 180 °, and still more preferably 115 to 180 °. .
  • Non-adhesive convex part 15 and Non-adhesive concave part 17 The shape of the non-adhesive convex portion 15 is not particularly limited, and examples thereof include a columnar shape (columnar shape, polygonal columnar shape, etc.), a frustum shape, a microlens shape, and the like.
  • the shape of the non-adhesive recess 17 is not particularly limited, and examples thereof include a hole hollowed into a columnar shape (such as a columnar shape or a polygonal columnar shape), a frustum shape, or a microlens shape.
  • Pitch P 2 of non-adhesive protrusions 15 or a non-adhesive recess 17 is formed is 50 ⁇ 2000 nm, preferably 100 ⁇ 1000 nm, more preferably 0.99 ⁇ 800 nm. If the pitch P 2 is too small, the cells can not recognize the unevenness disappears identification of adhesion and non-adhesive. Further, the pitch P 2 is too large, cells are easily adhered. Specifically, the pitch P 2 is, for example, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 , 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800.
  • corrugated shape by the non-adhesive convex part 15 and the non-adhesive recessed part 17 may be regular or irregular, it is preferable that it is regular from a viewpoint of work efficiency.
  • the distance between the tips of the many convex portions or concave portions constituting the uneven shape is “pitch”, and when the uneven shape is irregularly formed, the uneven shape
  • the average value of the distances between the tips of a large number of convex portions or concave portions constituting the “pitch” is defined as “pitch”.
  • the pitch P 1 of the uneven shape of the adhesive portion 3 is larger than the pitch P 2 of the uneven shape of the non-adhesive portion 5.
  • the larger the pitch the smaller the water contact angle and the higher the adhesion to cells, while the smaller the pitch, the larger the water contact angle and the lower the cell adhesion. Therefore, it becomes easy to create a spheroid by surrounding the uneven portion having a large pitch with the uneven portion having a small pitch.
  • the ratio P 1 / P 2 of the pitch P 1 and the pitch P 2 is 2 or more, more preferably 5 or more, and further preferably 10 or more.
  • P 1 / P 2 is large, the difference in adhesion tends to increase, and the spheroids can be cultured more efficiently as cells easily gather.
  • the upper limit of P 1 / P 2 is not particularly defined, but is 200, for example.
  • Height H 2 of the non-adhesive protrusions 15 is not particularly limited, for example, 50 ⁇ 2000 nm.
  • the height H 2 is preferably 100 to 1000 nm, more preferably 150 to 800 nm. If it is too low, the cells tend to adhere. Moreover, it is because the non-adhesive convex part 15 will fall easily when too high.
  • a typical example of the non-adhesive portion has a plurality of columnar protrusions, more specifically, a plurality of columnar protrusions.
  • the area of the upper surface of the columnar convex portion of the non-adhesive site may be in the range where the adhesiveness to the target cell is low, for example, 1600 nm 2 to 4 ⁇ m 2 . This area is preferably 810 nm 2 to 1 ⁇ m 2 , more preferably 0.02 to 0.6 ⁇ m 2 .
  • Gap G 2 between the two columnar protrusions adjacent may be within a range less adhesion to cells of interest, for example, 10 ⁇ 1960nm. Preferably, it is 60 to 960 nm. More preferably, it is 110 to 760 nm.
  • a fluorine atom-containing layer may be provided so as to cover the non-adhesive convex portion 15 and the non-adhesive concave portion 17.
  • the fluorine atom containing layer should just contain the fluorine atom, and the thickness and structure are not limited. Providing the fluorine atom-containing layer makes it difficult for cells to adhere.
  • the fluorine atom-containing layer preferably contains a fluorine-containing group.
  • the fluorine-containing group is a perfluoroalkyl group, and more specifically, a perfluoroalkylsilane group.
  • the carbon number of the perfluoroalkyl group is, for example, 1 to 10, specifically, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and the numerical values exemplified here are It may be within a range between any two.
  • the fluorine-containing group is preferably chemically bonded to the non-adhesive convex portion 15 and the non-adhesive concave portion 17 or the inorganic film.
  • the inorganic film has high adhesion to the resin layer 9, and the fluorine-containing group tends to form a strong chemical bond to the inorganic film, so that the non-adhesive convex portion 15 and the non-adhesive concave portion 17 and the fluorine atom
  • the fluorine atom-containing layer is firmly held on the non-adhesive convex portion 15 and the non-adhesive concave portion 17.
  • the inorganic film include an inorganic oxide film, an inorganic nitride film, and an inorganic oxynitride film.
  • the inorganic element constituting the inorganic film include silicon and aluminum.
  • the inorganic film is, for example, a silicon dioxide film or an aluminum oxide film.
  • the thickness of the inorganic film is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 nm.
  • the fluorine atom-containing layer can be formed by forming an inorganic film on the non-adhesive convex portion 15 and the non-adhesive concave portion 17 and reacting the inorganic film with a fluorine-containing silane coupling agent.
  • the fluorine-containing silane coupling agent is, for example, perfluoroalkyltrialkoxy (methoxy, ethoxy, etc.) silane. Even if a fluorine-containing silane coupling agent is allowed to act on the non-adhesive convex portion 15 and the non-adhesive concave portion 17 without forming an inorganic film, it is difficult to form a strong chemical bond. It is preferable to form an inorganic film on the adhesive recess 17.
  • the fluorine-containing silane coupling agent include OPTOOL DSX (manufactured by Daikin Industries).
  • the area of the adhesive site 3 may be appropriately adjusted depending on the type of cells to be cultured and the intended use of the spheroid, and is not particularly limited, but is, for example, 25 to 1000000 ⁇ m 2 and preferably 100 to 250,000 ⁇ m. 2 , more preferably 2500 to 40000 ⁇ m 2 .
  • the shape of the region of the adhesive part 3 is a square, the length of one side is 5 to 1000 ⁇ m, preferably 10 to 500 ⁇ m, more preferably 50 to 200 ⁇ m.
  • the ratio of the region of the non-adhesive site 5 to the total area of the region of the adhesive site 3 and the region of the non-adhesive site 5 is, for example, preferably 80% or less, more preferably 50% or less, and 25% or less. Is more preferable.
  • Partition 19 As shown in FIG. 4 (a), when having a partition part 19 that partitions at least a part of the adhesive part 3, the partition part 19 is preferably arranged so as to surround the adhesive part 3.
  • the region of the adhesive part 3 is formed. However, it is not always necessary to enclose without a break, and a part may be interrupted.
  • the shape of the region of the adhesive part 3 is not particularly limited, and examples thereof include a polygon such as a circle or a rectangle.
  • the non-adhesive part 5 is formed on the partition part.
  • the non-adhesive part 5 should just be formed in a part of partition part, Preferably, it forms so that at least most of the upper surfaces of the partition part 19 may be covered. Note that the non-adhesive portion 5 may cover the entire surface of the partition portion 19.
  • the height H 3 of the partition part 19 is not particularly limited, but is, for example, 5 to 100 ⁇ m, preferably 10 to 50 ⁇ m, and more preferably 15 to 25 ⁇ m. If the height H 3 is too low, easily removed by the cell and the water flow. Further, the height H 3 is too high, the oxygen supply reduces the viability of the well can not cells.
  • the height H 3 is, as shown in FIG. 4 (a), from the top of the adhesive protrusions 11, the height up to the upper end of the partition portion including a non-adhesive portion.
  • the manufacturing method of the cell culture substrate which has a partition part of one Embodiment of this invention is equipped with the non-adhesive site
  • each step will be described in more detail.
  • Non-adhesive site transfer resin layer forming step (1-1) First transferred resin layer forming step First, a transparent substrate 23 having a light shielding portion 21 as shown in FIG. As shown to 6 (a), the 1st photocurable resin composition is apply
  • the transparent base material 23 is formed of a transparent material such as a resin base material, a quartz base material, or a silicone base material, and the material is not particularly limited, but is preferably a resin base material. This is because by using the resin base material, a cell culture substrate having a desired size (also capable of a large area) can be obtained by the method of the present invention.
  • the resin constituting the resin base material include one selected from the group consisting of polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyester, polyolefin, polyimide, polysulfone, polyethersulfone, cyclic polyolefin, and polyethylene naphthalate.
  • the transparent base material 23 is preferably flexible, and when a resin base material is used, the same or different base materials are laminated, or the resin composition is laminated on the resin base material in a film form. May be.
  • the thickness of the resin base material is preferably in the range of 25 to 500 ⁇ m.
  • the light shielding portion 21 provided on the transparent base material 23 is a pattern used as a mask in the composite shape forming step.
  • the composite resin layer 45 has the light shielding portion 21 on the light shielding portion 21.
  • Corresponding adhesive part 3, partition part 19, and non-adhesive part 5 on the partition part are formed.
  • the region where the active energy ray 29 is blocked by the light shielding portion 21 becomes the adhesive portion 3.
  • “Active energy rays” is a general term for energy rays that can cure a photocurable resin composition, such as UV light, visible light, and electron beams.
  • the shape of the light shielding portion 21 is not particularly limited, and a polygon such as a pentagon or a hexagon, a circle, or the like can be used in addition to the square as shown in FIG. To correspond to.
  • the light shielding portion 21 is patterned after a light shielding material (for example, a metal material such as chrome) is deposited on the transparent substrate 23 by sputtering, or a pattern of the light shielding material is printed by a method such as ink jet printing or screen printing. Can be formed.
  • a light shielding material for example, a metal material such as chrome
  • the light-shielding portion 21 may be formed on the surface 23a of the transparent substrate 23 on which the first photocurable resin composition is applied, as shown in FIG.
  • the transparent base material 23 may be formed on the back surface 23b.
  • the light shielding portion 21 may be formed so as to be flush with the transparent base material 23 as shown in FIG. 5 (b), and the flat surface of the transparent base material 23 as shown in FIG. 5 (c). It may be formed on top, and may be embedded in the transparent substrate 23 as shown in FIG.
  • the 1st photocurable resin composition which comprises the 1st to-be-transferred resin layer 25 contains a monomer and a photoinitiator, and has the property to harden
  • monomers examples include photopolymerizable monomers for forming acrylic resins, methacrylic resins, styrene resins, olefin resins, polycarbonate resins, polyester resins, epoxy resins, silicone resins, and the like. Photopolymerizable acrylic monomers and A methacrylic monomer is preferred.
  • the photoinitiator is a component added to promote the polymerization of the monomer, and is preferably contained in an amount of 0.1 part by mass or more with respect to 100 parts by mass of the monomer.
  • the upper limit of content of a photoinitiator is not prescribed
  • the first photocurable resin composition of the present invention comprises components such as a solvent, a polymerization inhibitor, a chain transfer agent, an antioxidant, a photosensitizer, a filler, a leveling agent, etc. of the first photocurable resin composition. You may include in the range which does not affect a property.
  • 1st photocurable resin composition can be manufactured by mixing the said component by a well-known method.
  • the first photocurable resin composition is applied onto the transparent substrate 23 by a method such as spin coating, spray coating, bar coating, dip coating, die coating, or slit coating to form the first transferred resin layer 25. Is possible.
  • the first transferred resin layer 25 is usually a transparent resin layer, and its thickness is 100 nm to 1 mm, preferably 5 to 500 ⁇ m. With such a thickness, imprinting can be easily performed, and a reverse pattern of a non-adhesive portion can be formed.
  • the first mold 27 has a first pattern 28.
  • the first pattern 28 is a pattern of a desired non-adhesive portion 5.
  • the first mold 27 is formed of a transparent material such as a resin base material, a quartz base material, or a silicone base material, and can be formed of the same material as the transparent base material 23.
  • the pressure for pressing the first mold 27 against the first transferred resin layer 25 may be any pressure that can transfer the shape of the first pattern 28 to the first transferred resin layer 25.
  • the active energy ray 29 irradiated to the first transferred resin layer 25 may be irradiated with an integrated light amount sufficient to sufficiently cure the first transferred resin layer 25.
  • the integrated light amount is, for example, 100 to 10,000 mJ / cm 2 . is there.
  • the first transferred resin layer 25 is cured by irradiation with the active energy ray 29, and as shown in FIG. 6C, the first reverse pattern 32 in which the first pattern 28 is reversed, that is, desired non-adhesiveness.
  • a non-adhesive site transfer resin layer 31 in which a reverse pattern of the site 5 is formed is formed.
  • Adhesive site resin layer forming step (2-1) Second transferred resin layer forming step First, as shown in FIG. 7 (a), a second photocurable resin composition is applied on a substrate 7. The second transferred resin layer 33 is formed by coating.
  • the description of the first photocurable resin composition described above applies to the second photocurable resin composition unless it is contrary to the gist.
  • the kind of 2nd photocurable resin composition may be the same as that of a 1st photocurable resin composition, or may differ.
  • the second transferred resin layer 33 obtained by applying the second photocurable resin composition is usually a transparent resin layer, and its thickness is usually 1 ⁇ m to 1 mm, preferably 50 ⁇ m to 500 ⁇ m. . With such a thickness, imprinting can be easily performed, and an adhesive part can be formed.
  • the second mold 35 has a second pattern 36.
  • the second pattern 36 is a reverse pattern of the desired adhesive part 3.
  • the active energy ray 29 may be irradiated from the substrate side, and the second mold 35 is made of a transparent material such as a resin substrate, a quartz substrate, or a silicone substrate, or a metal material. It is also possible to form.
  • the pressure for pressing the second mold 35 against the second transferred resin layer 33 may be any pressure that can transfer the shape of the second pattern 36 to the second transferred resin layer 33.
  • the active energy ray 29 irradiated to the second transferred resin layer 33 may be irradiated with an integrated light amount sufficient to sufficiently cure the second transferred resin layer 33.
  • the integrated light amount is, for example, 100 to 10,000 mJ / cm 2 . is there.
  • the second transferred resin layer 33 is cured by irradiation with the active energy rays 29, and as shown in FIG. 7D, the second inverted pattern 40 in which the second pattern 36 is inverted, that is, desired non-adhesiveness.
  • the adhesive part resin layer 39 in which the part 5 is formed is formed.
  • Composite resin layer forming step (3-1) Third transferred resin layer forming step First, as shown in FIG. 8 (a), a third photocurable resin composition is formed on the adhesive portion resin layer 39. Is applied to form the third transferred resin layer 41.
  • the description of the first photocurable resin composition described above applies to the second photocurable resin composition unless it is contrary to the gist.
  • the type of the third photocurable resin composition may be the same as or different from the first photocurable resin composition, and may be the same as or different from the second photocurable resin composition.
  • the third transferred resin layer 41 obtained by applying the third photocurable resin composition is usually a transparent resin layer, and its thickness is 10 ⁇ m to 1 mm, preferably 50 ⁇ m to 500 ⁇ m. With such a thickness, imprinting can be easily performed, and a partition part and a non-adhesive part can be formed.
  • the pressure for pressing the non-adhesive site transfer resin layer 31 against the third transferred resin layer 41 may be any pressure that can transfer the shape of the non-adhesive site transfer resin layer 31 to the third transferred resin layer 41. .
  • the irradiation of the active energy ray 29 to the third transferred resin layer 41 is performed from the non-adhesive site transfer resin layer 31.
  • the active energy ray 29 irradiated to the third transferred resin layer 41 may be irradiated with an integrated light amount sufficient to cure the third transferred resin layer 41.
  • the integrated light amount is, for example, 100 to 10,000 mJ / cm 2 . is there.
  • the third photocurable resin composition buried in the gap of the adhesive portion resin layer 39 is cured, and the non-adhesive portion transfer is performed.
  • the third transferred resin layer 41 to which the reverse pattern of the resin layer 31 is transferred is cured to form a composite resin layer 45.
  • the partition portion 19 shown in FIG. 8E and the non-adhesive site 5 on the partition portion 19 are formed.
  • the active energy ray 29 is blocked by the light shielding portion 21 and the adhesive part 3 remains in the region where the third photocurable resin composition is not cured.
  • the non-adhesive site transfer resin layer 31 is removed, and the uncured third photocurable resin composition 42 remaining on the adhesive site 3 is removed. Is removed with a solvent to obtain the structure shown in FIG. 8E, and the production of the cell culture substrate is completed.
  • a mold having a reversal pattern of the composite resin layer 45 can be produced, and if this is used, a cell culture substrate having the same pattern as the composite resin layer 45 can be produced at a time. .
  • manufacture of a cell culture substrate as shown in FIG.4 (b) is possible by using the mold which has the inversion pattern of the adhesive part 3 and the non-adhesive part 5.
  • FIG.4 (b) is a mold which has the inversion pattern of the adhesive part 3 and the non-adhesive part 5.
  • Photopolymerizable monomer Trimethylolpropane ethylene oxide-modified triacrylate (manufactured by Osaka Organic Chemical Industry Co., Ltd., product name: Biscoat # 360) 50 parts by mass Bisphenol A ethylene oxide-modified diacrylate (manufactured by Osaka Organic Chemical Industry Co., Ltd., product name: Biscoat # 700HV) 20 parts by mass Tripropylene glycol diacrylate (manufactured by Osaka Organic Chemical Industry Co., Ltd., product name: Biscoat # 310HP) 30 parts by mass Photoinitiator 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone (manufactured by BASF Japan, product name: Irgacure 184) 5 parts by mass
  • Example 1 (Example 1) (Formation of non-adhesive part transfer resin layer)
  • the photocurable resin composition prepared as described above was applied with a bar coater so as to have a thickness of 10 ⁇ m.
  • a columnar nanopillar (pitch: 150 nm, height: 250 nm, diameter: 100 nm) mold was laminated from above with a roller so that the coated resin surface was pressed against the mold. Thereafter, UV irradiation was performed from the mold side with an integrated light amount of 500 mJ / cm 2 to cure the photocurable resin composition.
  • the mold and the resin-cured PET base material were peeled off to produce a nanohole transfer resin layer having the inverted shape of the mold.
  • the photocurable resin composition prepared above was applied to a PET substrate with a bar coater to a thickness of 10 ⁇ m, and hexagonal columnar (honeycomb) nanoholes (pitch: 12 ⁇ m, depth: 5 ⁇ m, parallel) (Width of two sides: 17 ⁇ m) Lamination was performed with a roller from above so that the coated resin surface was pressed against the mold. Thereafter, UV irradiation was performed from the PET substrate side with an integrated light amount of 500 mJ / cm 2 to cure the photocurable resin composition. The mold and the resin-cured PET base material were peeled off to produce a nanopillar transfer resin layer having the inverted shape of the mold.
  • the photocurable resin composition prepared above was applied with a bar coater so as to have a thickness of 10 ⁇ m, and the nanohole transfer resin layer was used as a mold. Lamination was performed from above with a roller so that the coated resin surface was pressed against the nanohole transfer resin layer. Thereafter, UV irradiation was performed from the nanohole transfer resin layer with an integrated light amount of 500 mJ / cm 2 to cure the photocurable resin composition. The nanohole transfer resin layer and the nanopillar transfer resin layer were peeled off, and the uncured photocurable resin composition remaining on the nanopillar transfer resin layer was removed with isopropyl alcohol to prepare a cell culture substrate.
  • Example 2 (Comparative Example 1)
  • cell culture is performed in the same manner except that a mold having not the nanohole transfer resin layer but the same lattice-shaped light-shielding portion 21 but having a concave and convex shape is used.
  • a substrate was produced.
  • Example 3 (Comparative Example 2) A cell culture substrate was prepared only by the adhesive part resin layer forming step of sample 1.
  • Example 4 (Comparative Example 3)
  • the above-prepared photo-curable resin composition was applied to a PET substrate with a bar coater so as to have a thickness of 10 ⁇ m, and UV irradiation was performed from the PET substrate side with an integrated light amount of 500 mJ / cm 2 , thereby photocuring.
  • the functional resin composition was cured.
  • ⁇ Water contact angle measurement> About the obtained sample 1, 0.5 microliters of ion-exchange water is dripped at the surface of the adhesion part of the said sample 1, and the non-adhesion part under 25 degreeC using a contact angle measuring apparatus (made by dataphysics), and it contacts water. The angle (water contact angle) was measured and found to be 100 ° and 115 °, respectively.
  • ⁇ Cell culture method The cell culture substrate was placed on the bottom of a 6-well plate (Thermo Fisher Scientific) and immersed in 70% ethanol for 1 hour. Then, it was washed 3 times with PBS having a pH of 7.4 (hereinafter the same) and dried. Next, rat hepatocytes were suspended in DMEM (Thermo Fisher Scientific) medium, seeded on a well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, and then cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 14 days. . The medium was changed on the next day of the culture, and thereafter every other day.
  • DMEM Thermo Fisher Scientific
  • FIGS. 9A to 9D show SEM images when samples 1 to 4 are used.
  • Sample 1 aggregates in a spherical shape in the lattice, the size of each aggregate is close, and uniform spheroids are formed.
  • Sample 2 is agglomerated to some extent, but it straddles the lattice and cannot be said to be spherical, and it cannot be said that the size is uniform. Unlike sample 1, it is presumed that it is caused by having no non-adhesive site on the lattice.
  • Sample 3 is agglomerated but only slightly rounded, and the sizes are also greatly different. It is presumed that this is because they are not surrounded by non-adhesive sites and there are no partitions.
  • Sample 4 is only thinly spread.
  • Drug metabolism was evaluated 1, 7, and 14 days after sowing. After 1, 7, 14 days, the medium is replaced with induction medium (3-MC 0.333 mM) and incubated for 24 hours. Then, it was replaced with a reaction medium (PBS 50 ml, Dicarol 25 ⁇ M, Probenecid 2 mM, ethoxyresorufin 20 ⁇ M) warmed to 37 ° C., incubated for 60 minutes, and then adjusted to pH 7.4 with HCl. 200 ⁇ l of supernatant and 200 ⁇ l of blank (unreacted reaction medium) were placed in a 96-well plate, and the amount of fluorescence [530/590] was measured with a fluorescence plate reader.
  • induction medium 3-MC 0.333 mM
  • a reaction medium PBS 50 ml, Dicarol 25 ⁇ M, Probenecid 2 mM, ethoxyresorufin 20 ⁇ M
  • Table 3 shows the drug metabolism evaluation of samples 1 to 4.
  • sample 1 it is presumed that the amount of drug metabolism is large, spheroids are formed, and oxygen is sufficiently supplied.
  • Sample 2 had a relatively high amount of drug metabolism but was inferior to sample 1.
  • the amount of drug metabolism was about 30 to 40% less than in sample 1.
  • sample 4 the amount of drug metabolism was greatly reduced.

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Abstract

入手容易な材料を用いて簡便に作製可能であり、且つ、高い生存率で均一スフェロイドを培養可能な複合パターン培養基板を提供する。 本発明のいくつかの態様によれば、接着性部位と、非接着性部位とを有する細胞培養基板であって、前記接着性部位および前記非接着性部位は、凹凸形状を有し、前記非接着性部位の純水に対する接触角は、前記接着性部位より大きい、細胞培養基板が提供される。

Description

細胞培養基板及びその製造方法
　本発明は、細胞培養基板及びその製造方法に関する。
　一般に医薬品開発の現場では、三次元形状に培養した細胞塊（スフェロイド）に薬剤を投与してその薬物への代謝能を測定するスクリーニング検査が知られている。この代謝検査の効率を上げるために、近年では簡便に用意できる培養容器を用い、高い生存率で均一なスフェロイドを培養することが求められている。スフェロイド培養用容器には、特許文献１に開示されているように、細胞に対する接着領域と阻害領域とを有する基板などが培養基板として用いられている。
特開２００７－２６９９７３号公報
　比較的均一なスフェロイドを培養することはできるが、接着領域あるいは阻害領域に用いることが出来る性質を有する樹脂は、特殊であり限定的である（特許文献１）。このような特殊な樹脂を合成することは困難であり、長い時間および高いコストを要する。
　本発明のいくつかの態様はこのような事情に鑑みてなされたものであり、入手容易な材料を用いて簡便に作製可能であり、且つ、高い生存率で均一スフェロイドを培養可能な細胞培養基板を提供するものである。
　本発明のいくつかの態様によれば、接着性部位と、非接着性部位とを有する細胞培養基板であって、前記接着性部位および前記非接着性部位は、凹凸形状を有し、前記非接着性部位の純水に対する接触角は、前記接着性部位より大きい、細胞培養基板が提供される。
　本発明者は、入手容易な材料を用いた場合においても、凹凸形状を有する接着性部位と、接着性部位とは異なる凹凸形状を有する撥水性の高い非接着性部位とを備える細胞培養基板を用いると、高い生存率で均一スフェロイドを培養可能であることを見出し、本発明の完成に到った。
　以下、本発明の種々の実施形態を例示する。以下に示す実施形態は互いに組み合わせ可能である。
　好ましくは、前記接着性部位の凹凸形状のピッチＰ１は、前記非接着性部位の凹凸形状のピッチＰ２より大きい。
　好ましくは、前記ピッチＰ１と前記ピッチＰ２の比Ｐ１／Ｐ２は、２以上である。
　好ましくは、前記接着性部位の少なくとも一部分は、仕切り部により仕切られ、前記非接着性部位は、前記仕切り部上に形成されている。
　好ましくは、前記非接着性部位は、複数の柱状凸部を有し、前記非接着性部位の柱状凸部が形成されるピッチが５０～２０００ｎｍであり、前記非接着性部位の柱状凸部は、上面の面積が１６００ｎｍ２～４μｍ２であり、隣接した２つの柱状凸部の間の隙間Ｇ２が１０～１９６０ｎｍの範囲内である。
　好ましくは、前記接着性部位および前記非接着性部位は、同一の材料で構成されている。
　本発明の別の観点によれば、前記細胞培養基板の製造方法であって、基材上に塗布した光硬化性樹脂組成物に対して活性エネルギー線を照射して硬化し、前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状を形成する工程を備える、細胞培養基板の製造方法が提供される。
　好ましくは、前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状は、モールドを用いてナノインプリント法によって形成される。
本発明の一実施形態の細胞培養基板１を示し、（ａ）は平面図、（ｂ）はＡ－Ａ断面図、（ｃ）は他の実施機形態の凹凸形状が（ｂ）の場合と反転したパターンを示す断面図である。 本発明の一実施形態の接着性部位３を示す図１（ｂ）における領域Ｘの拡大図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）はＢ－Ｂ断面図である。 本発明の一実施形態の非接着性部位５を示す図１（ｂ）における領域Ｙの拡大図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）はＣ－Ｃ断面図である。 本発明の一実施形態の細胞培養基板１の断面図であり、（ａ）は仕切り部１９を有し、（ｂ）は仕切り部を有しない場合の例を示す。 遮光部２１が設けられた透明基材２３を示し、（ａ）は平面図、（ｂ）はＤ－Ｄ断面図である。（ｃ）～（ｅ）は、遮光パターン３の形成方法の別例を示す。 本発明の第１被転写樹脂層形成工程を示す断面図である。 本発明の接着性部位樹脂層形成工程を示す断面図である。 本発明の複合樹脂層形成工程を示す断面図である。 サンプル１～４のＳＥＭ画像（ａ）～（ｄ）である。
　以下、図１～図４を参照しながら本発明の好ましい実施の形態について具体的に説明する。
１．細胞培養基板
　図１（ｂ）に示すように、本発明の一実施形態の細胞培養基板１は、基材７と、基材７の少なくとも一方の面に樹脂層９を備え、樹脂層９は、接着性部位３と非接着性部位５を有する。図１（ｂ）に示す接着性部位３と非接着性部位５の凹凸形状は、接着性部位３および非接着性部位５のいずれかのみの凹凸が反転した形状でもよく、さらにいずれもの凹凸が反転した図１（ｃ）に示すような形状であってもよい。
　好ましくは、接着性部位３を囲むように非接着性部位５が配置され、接着性部位３の領域と非接着性部位５の領域に分かれている。ただし、必ずしも切れ目なく囲む必要はなく、一部が途切れていてもよい。
　接着性部位３の領域の形状は、特に制限されないが円形、多角形などが挙げられ、例えば、図１（ａ）に示すような正方形の領域を形成している実施形態が考えられる。
　また、細胞培養基板１は、図４（ａ）に示すように、接着性部位の少なくとも一部を仕切る、仕切り部１９を有していてもよい。また、図４（ｂ）に示すように、有していなくてもよい。培地交換時などに基材から細胞が剥離しないためには、仕切り部１９を有することが好ましい。
＜基材７＞
　基材７の材質は、特に限定されないが、樹脂基材、石英基材などの透明基材であることが好ましく、可撓性の観点から樹脂基材であることがさらに好ましい。樹脂基材を構成する樹脂としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、環状ポリオレフィンおよびポリエチレンナフタレートからなる群から選ばれる１種からなるものである。また、基材７は可撓性を有するフィルム状であることが好ましく、その厚さは２５～５００μｍの範囲であることが好ましい。
＜樹脂層９＞
　樹脂層９を構成する樹脂は特に限定されないが、例えば、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、スチレン樹脂、オレフィン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂などの比較的入手・合成が容易で安価な樹脂からなることが好ましい。接着性部位３と非接着性部位５の樹脂材料の種類は異なっていてもよいが、同一のである場合には作製がより容易であり、効率的であるためより好ましい。
＜接着性部位３＞
　図２に示すように、接着性部位３は、複数の接着性凸部１１および接着性凹部１３による凹凸形状を有する。なお、凸部と凹部とが反転した形状でも良い。
＜接着性凸部１１および接着性凹部１３＞
　接着性凸部１１の形状は特に制限されないが、柱状（円柱状、多角柱状など）、錐台、マイクロレンズなどが挙げられる。接着性凹部１３の形状についても特に制限されないが、柱状（円柱状、多角柱状など）、錐台、マイクロレンズなどの形状にくり抜いたホールなどが挙げられる。
　接着性凸部１１または接着性凹部１３が形成されるピッチＰ１は、対象とする細胞に対する接着性を有する範囲内であればよく、例えば、２～５０μｍであり、好ましくは５～２０μｍであり、より好ましくは７～１５μｍである。ピッチＰ１が小さすぎる場合には、細胞が接着しにくい。また、ピッチＰ１が大きすぎると、細胞がスフェロイドを形成しにくい。ピッチＰ１は、具体的には例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０μｍであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。なお、接着性凸部１１および接着性凹部１３による凹凸形状は、規則的であっても不規則であってもよいが、作業効率の観点から規則的であることがの好ましい。凹凸形状が規則的に形成されている場合には、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離を「ピッチ」とし、凹凸形状が不規則に形成されている場合、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離の平均値を「ピッチ」とする。
　接着性凸部１１の高さＨ１は、特に制限されないが、例えば、１～２０μｍであり、好ましくは１～１０μｍであり、より好ましくは１～５μｍである。低すぎると、細胞がスフェロイドを形成しにくい。また、高すぎると、接着性凸部１１が倒壊しやすくなるからである。
　前記接着性部位の典型例は、複数の柱状凸部を有する。前記接着性部位の柱状凸部の上面の面積は、対象とする細胞に対する接着性を有する範囲内であればよく、例えば、１～２４００μｍ２であり、好ましくは１６～３６０μｍ２であり、より好ましくは３６～１９６μｍ２である。隣接した２つの柱状凸部の間の隙間Ｇ１は、対象とする細胞に対する接着性を有する範囲内であればよく、例えば、１～４９μｍであり、好ましくは４～１９μｍであり、より好ましくは６～１４μｍである。
＜非接着性部位５＞
　図３に示すように、接着性部位３は、複数の非接着性凸部１５および非接着性凹部１７による凹凸形状を有する。なお、凸部と凹部とが反転した形状でもよい。
　また、非接着性部位５の純水に対する接触角は特に制限されないが、接着性部位３より大きい。接着性部位３より大きいと、非接着性部位５に細胞が接着しにくく、スフェロイドを形成しやすい。非接着性部位５の純水に対する接触角は、例えば、９０～１８０°であり、好ましくは１０５～１８０°であり、より好ましくは１１０～１８０°であり、さらに好ましくは１１５～１８０°である。
＜非接着性凸部１５および非接着性凹部１７＞
　非接着性凸部１５の形状は特に制限されないが、柱状（円柱状、多角柱状など）、錐台状、マイクロレンズ状などが挙げられる。非接着性凹部１７の形状についても特に制限されないが、柱状（円柱状、多角柱状など）、錐台状、マイクロレンズ状などの形状にくり抜いたホールなどが挙げられる。
　非接着性凸部１５または非接着性凹部１７が形成されるピッチＰ２が５０～２０００ｎｍであり、好ましくは１００～１０００ｎｍであり、より好ましくは１５０～８００ｎｍである。ピッチＰ２が小さすぎる場合には、細胞が凹凸を認識できなくなり、接着性と非接着性の識別が無くなってしまう。また、ピッチＰ２が大きすぎると、細胞が接着しやすい。ピッチＰ２は、具体的には例えば、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００ｎｍであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。なお、非接着性凸部１５および非接着性凹部１７による凹凸形状は、規則的であっても不規則であってもよいが、作業効率の観点から規則的であることが好ましい。凹凸形状が規則的に形成されている場合には、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離を「ピッチ」とし、凹凸形状が不規則に形成されている場合、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離の平均値を「ピッチ」とする。
　前記接着性部位３の凹凸形状の前記ピッチＰ１は、前記非接着性部位５の凹凸形状の前記ピッチＰ２より大きい。ピッチが大きい方が水の接触角が小さくなり、また細胞に対する接着性が高い傾向にあり、一方でピッチが小さいほうが水の接触角が大きくなり、また細胞に対する接着性が低い傾向にある。従って、ピッチの小さい凹凸形状の部位により、ピッチの大きい凹凸形状の部位を囲むことによりスフェロイドを作成しやすくなる。好ましくは、前記ピッチＰ１と前記ピッチＰ２の比Ｐ１／Ｐ２は、２以上であり、より好ましくは５以上であり、さらに好ましくは１０以上である。Ｐ１／Ｐ２が大きいと接着性に差が大きくなる傾向にあり、細胞が集まりやすくなる分より効率的にスフェロイドを培養可能である。Ｐ１／Ｐ２の上限は、特に規定されないが、例えば、２００である。
　非接着性凸部１５の高さＨ２は、特に制限されないが、例えば、５０～２０００ｎｍである。高さＨ２は、好ましくは、１００～１０００ｎｍであり、より好ましくは、１５０～８００ｎｍである。低すぎると、細胞が接着しやすい。また、高すぎると、非接着性凸部１５が倒壊しやすくなるからである。
　前記非接着性部位の典型例は、複数の柱状凸部、より具体的には複数の円柱状の凸部を有する。前記非接着性部位の柱状凸部の上面の面積は、対象とする細胞に対する接着性が低い範囲内であればよく、例えば、１６００ｎｍ２～４μｍ２である。この面積は、好ましくは、８１０ｎｍ２～１μｍ２であり、より好ましくは０．０２～０．６μｍ２である。隣接した２つの柱状凸部の間の隙間Ｇ２は、対象とする細胞に対する接着性が低い範囲内であればよく、例えば、１０～１９６０ｎｍである。好ましくは、６０～９６０ｎｍである。より好ましくは、１１０～７６０ｎｍである。
　フッ素原子含有層が非接着性凸部１５および非接着性凹部１７を覆うように設けられていてもよい。フッ素原子含有層は、フッ素原子を含んでいればよく、その厚さや構成は限定されない。フッ素原子含有層を設けることによって細胞が接着しにくくなる。フッ素原子含有層は、フッ素含有基を含むことが好ましい。フッ素含有基は、一例では、パーフルオロアルキル基であり、より具体的には、パーフルオロアルキルシラン基である。パーフルオロアルキル基の炭素数は、例えば１～１０であり、具体的には例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。フッ素含有基は、好ましくは、非接着性凸部１５および非接着性凹部１７、または無機膜に化学結合されている。一般に、無機膜は樹脂層９との密着性が高く、フッ素含有基は、無機膜に対して強固な化学結合を形成しやすいので、非接着性凸部１５および非接着性凹部１７とフッ素原子含有層の間に無機膜を設けることによってフッ素原子含有層が非接着性凸部１５および非接着性凹部１７上に強固に保持される。無機膜としては、無機酸化膜、無機窒化膜、無機酸窒化膜などが挙げられる。無機膜を構成する無機元素しては、ケイ素やアルミニウムが挙げられる。無機膜は、例えば、二酸化ケイ素膜や酸化アルミニウム膜である。無機膜の厚さは、特に限定されないが、例えば、１～２０ｎｍである。
　フッ素原子含有層は、一例では、非接着性凸部１５および非接着性凹部１７上に無機膜を形成し、無機膜とフッ素含有シランカップリング剤を反応させることによって形成することができる。フッ素含有シランカップリング剤は、例えば、パーフルオロアルキルトリアルコキシ（メトキシ、エトキシなど）シランである。無機膜を形成せずに非接着性凸部１５および非接着性凹部１７にフッ素含有シランカップリング剤を作用させても強固な化学結合が形成されにくいので、予め非接着性凸部１５および非接着性凹部１７上に無機膜を形成することが好ましい。フッ素含有シランカップリング剤の例としては、オプツールＤＳＸ（ダイキン工業社製）が挙げられる。
＜接着性部位３の領域＞
　接着性部位３の領域の面積は、培養する細胞の種類およびスフェロイドの使用目的により適宜調整すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、２５～１００００００μｍ２であり、好ましくは１００～２５００００μｍ２であり、より好ましくは２５００～４００００μｍ２である。接着性部位３の領域の形状が、正方形である場合には、一辺の長さが、５～１０００μｍであり、好ましくは１０～５００μｍであり、より好ましくは５０～２００μｍである。
＜非接着性部位５の領域＞
　非接着性部位５の領域が接着性部位の領域に対して大きすぎると、細胞が接着性部位３の領域へ移動するのが困難であるためスフェロイドを形成しにくい。よって、接着性部位３の領域と非接着性部位５の領域の面積の合計に対する非接着性部位５の領域の比率は、例えば、８０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましく、２５％以下がさらに好ましい。
＜仕切り部１９＞
　図４（ａ）に示すように、接着性部位３の少なくとも一部を仕切る、仕切り部１９を有している場合、好ましくは、仕切り部１９は、接着性部位３を囲むように配置され、接着性部位３の領域を形成する。ただし、必ずしも切れ目なく囲む必要はなく、一部が途切れていてもよい。なお、接着性部位３の領域の形状は、特に制限されないが円形または四角形などの多角形などが挙げられる。好ましくは、非接着性部位５は仕切り部上に形成される。非接着性部位５は、仕切り部の一部に形成されていればよく、好ましくは、少なくとも仕切り部１９の上面の大部分を覆うように形成される。なお、非接着性部位５は、仕切り部１９の全面を覆っていてもよい。
　仕切り部１９の高さＨ３は、特に制限されないが、例えば、５～１００μｍであり、好ましくは１０～５０μｍであり、より好ましくは１５～２５μｍである。高さＨ３が低すぎると、細胞が水流などにより剥離しやすい。また、高さＨ３が高すぎると、酸素供給が十分に行えず細胞の生存率を低下させる。なお、高さＨ３は、図４（ａ）に示すように、接着性凸部１１の上端から、非接着性部位を含めた仕切り部の上端までの高さである。
２．細胞培養基板の製造方法
　次に、図５～図８を用いて、細胞培養基板の製造方法について説明する。
　本発明の一実施形態の、仕切り部を有する細胞培養基板の製造方法は、非接着性部位転写用樹脂層形成工程と、接着性部位樹脂層形成工程と、複合樹脂層形成工程とを備える。
　以下、各工程についてさらに詳細に説明する。
（１）非接着性部位転写用樹脂層形成工程
（１－１）第１被転写樹脂層形成工程
　まず、図５（ａ）に示すような遮光部２１を有する透明基材２３上に、図６（ａ）に示すように、第１光硬化性樹脂組成物を塗布して第１被転写樹脂層２５を形成する。
＜透明基材＞
　透明基材２３は、樹脂基材、石英基材、シリコーン基材などの透明材料で形成され、その材質は、特に限定されないが、樹脂基材であることが好ましい。樹脂基材を用いることによって、本発明の方法によって所望するサイズの（大面積も可能な）細胞培養基板が得られるからである。樹脂基材を構成する樹脂としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、環状ポリオレフィンおよびポリエチレンナフタレートからなる群から選ばれる１種からなるものである。また、透明基材２３は可撓性を有することが好ましく、樹脂基材を用いる場合には、同種または異種の基材を積層したり、樹脂基材に樹脂組成物を膜状に積層させたりしてもよい。樹脂基材の厚さは２５～５００μｍの範囲であることが好ましい。
　透明基材２３に設けられる遮光部２１は、複合形状形成工程においてマスクとして利用するパターンであり、図８（ｂ）～（ｅ）に示すように、複合樹脂層４５には、遮光部２１に対応する接着性部位３、仕切り部１９、仕切り部上の非接着性部位５が形成される。図８（ｂ）に示す活性エネルギー線照射工程において、遮光部２１によって活性エネルギー線２９が遮られている領域が接着性部位３となる。「活性エネルギー線」は、ＵＶ光、可視光、電子線などの、光硬化性樹脂組成物を硬化可能なエネルギー線の総称である。遮光部２１の形状は、特に限定されず、図５（ａ）に示すような正方形の他、五角形や六角形などの多角形、円形なども用いることができ、所望の接着性部位３の領域に対応させる。
　遮光部２１は、遮光材料（例えば、クロムなどの金属材料）をスパッタリングによって透明基材２３上に付着させた後にパターニングしたり、インクジェット印刷またはスクリーン印刷などの方法で遮光材料のパターンを印刷したりすることによって形成することができる。遮光部２１は、図５（ｂ）～（ｃ）に示すように、透明基材２３の、第１光硬化性樹脂組成物を塗布する面２３ａに形成してもよく、図５（ｄ）に示すように、透明基材２３の背面２３ｂ上に形成してもよい。また、遮光部２１は、図５（ｂ）に示すように、透明基材２３と面一になるように形成してもよく、図５（ｃ）に示すように透明基材２３の平坦面上に形成してもよく、図５（ｅ）に示すように透明基材２３の内部に埋設されてもよい。
＜第１光硬化性樹脂組成物＞
　第１被転写樹脂層２５を構成する第１光硬化性樹脂組成物は、モノマーと、光開始剤を含有し、活性エネルギー線の照射によって硬化する性質を有する。
　モノマーとしては、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、スチレン樹脂、オレフィン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂等を形成するための光重合性のモノマーが挙げられ、光重合性のアクリル系モノマーおよび／またはメタクリル系モノマーが好ましい。
　光開始剤は、モノマーの重合を促進するために添加される成分であり、前記モノマー１００質量部に対して０．１質量部以上含有されることが好ましい。光開始剤の含有量の上限は、特に規定されないが、例えば前記モノマー１００質量部に対して２０質量部である。
　本発明の第１光硬化性樹脂組成物は、溶剤、重合禁止剤、連鎖移動剤、酸化防止剤、光増感剤、充填剤、レベリング剤等の成分を第１光硬化性樹脂組成物の性質に影響を与えない範囲で含んでいてもよい。
　第１光硬化性樹脂組成物は、上記成分を公知の方法で混合することにより製造することができる。第１光硬化性樹脂組成物は、スピンコート、スプレーコート、バーコート、ディップコート、ダイコートおよびスリットコート等の方法で透明基材２３上に塗布して第１被転写樹脂層２５を形成することが可能である。
　第１被転写樹脂層２５は、通常は、透明樹脂層であり、その厚さは、１００ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは、５～５００μｍである。このような厚さとすれば、インプリント加工が行い易く、また非接着性部位の反転パターンを形成することができる。
（１－２）転写及び硬化工程
　次に、図６（ａ）～（ｃ）に示すように、第１モールド２７の第１パターン２８を第１被転写樹脂層２５に対して押し付けた状態で第１モールド２７を通じて第１被転写樹脂層２５に活性エネルギー線２９を照射することによって第１パターン２８が転写された非接着性部位転写用樹脂層３１を形成する。
　第１モールド２７は、第１パターン２８を有する。本実施形態では、第１パターン２８は、所望の非接着性部位５のパターンである。
　第１モールド２７は、樹脂基材、石英基材、シリコーン基材などの透明材料で形成され、透明基材２３と同様の材質で形成可能である。
　第１モールド２７を第１被転写樹脂層２５に押し付ける圧力は、第１パターン２８の形状を第１被転写樹脂層２５に転写可能な圧力であればよい。
　第１被転写樹脂層２５へ照射する活性エネルギー線２９は、第１被転写樹脂層２５が十分に硬化する程度の積算光量で照射すればよく、積算光量は、例えば１００～１００００ｍＪ／ｃｍ２である。活性エネルギー線２９の照射によって、第１被転写樹脂層２５が硬化されて、図６（ｃ）に示すように、第１パターン２８が反転された第１反転パターン３２、すなわち所望の非接着性部位５の反転パターンが形成された非接着性部位転写用樹脂層３１が形成される。
（２）接着性部位樹脂層形成工程
（２－１）第２被転写樹脂層形成工程
　まず、図７（ａ）に示すように、基材７上に、第２光硬化性樹脂組成物を塗布して第２被転写樹脂層３３を形成する。
　上述した第１光硬化性樹脂組成物の説明は、その趣旨に反しない限り、第２光硬化性樹脂組成物に当てはまる。第２光硬化性樹脂組成物の種類は、第１光硬化性樹脂組成物と同じであっても異なっていてもよい。第２光硬化性樹脂組成物を塗布して得られる第２被転写樹脂層３３は、通常は、透明樹脂層であり、その厚さは、通常１μｍ～１ｍｍ、好ましくは、５０μｍ～５００μｍである。このような厚さとすれば、インプリント加工が行い易く、また接着性部位を形成することができる。
（２－２）転写及び硬化工程
　次に、図７（ｂ）～（ｄ）に示すように、第２モールド３５の第２パターン３６を第２被転写樹脂層３３に押し付けた状態で第２被転写樹脂層３３に活性エネルギー線を照射して第２被転写樹脂層３３を硬化させることによって接着性部位樹脂層３９を形成する。
　第２モールド３５は、第２パターン３６を有する。本実施形態では、第２パターン３６は、所望の接着性部位３の反転パターンである。
　基材７が透明である場合、活性エネルギー線２９は基材側から照射してもよく、第２モールド３５は、樹脂基材、石英基材、シリコーン基材などの透明材料、もしくは金属材料で形成することも可能である。
　第２モールド３５を第２被転写樹脂層３３に押し付ける圧力は、第２パターン３６の形状を第２被転写樹脂層３３に転写可能な圧力であればよい。
　第２被転写樹脂層３３へ照射する活性エネルギー線２９は、第２被転写樹脂層３３が十分に硬化する程度の積算光量で照射すればよく、積算光量は、例えば１００～１００００ｍＪ／ｃｍ２である。活性エネルギー線２９の照射によって、第２被転写樹脂層３３が硬化されて、図７（ｄ）に示すように、第２パターン３６が反転された第２反転パターン４０、すなわち所望の非接着性部位５が形成された接着性部位樹脂層３９が形成される。
（３）複合樹脂層形成工程
（３－１）第３被転写樹脂層形成工程
　まず、図８（ａ）に示すように、接着性部位樹脂層３９上に、第３光硬化性樹脂組成物を塗布して第３被転写樹脂層４１を形成する。
　上述した第１光硬化性樹脂組成物の説明は、その趣旨に反しない限り、第２光硬化性樹脂組成物に当てはまる。第３光硬化性樹脂組成物の種類は、第１光硬化性樹脂組成物と同じであっても異なっていてもよく、第２光硬化性樹脂組成物と同じであっても異なっていてもよい。第３光硬化性樹脂組成物を塗布して得られる第３被転写樹脂層４１は、通常は、透明樹脂層であり、その厚さは、１０μｍ～１ｍｍ、好ましくは、５０μｍ～５００μｍである。このような厚さとすれば、インプリント加工が行い易く、また仕切り部および非接着性部位を形成することができる。
（３－２）転写及び硬化工程
　次に、図８（ｂ）～（ｅ）に示すように、非接着性部位転写用樹脂層３１をモールドとして第３被転写樹脂層４１に押し付けた状態で第３被転写樹脂層４１に活性エネルギー線を照射して第３被転写樹脂層４１を硬化させることによって複合樹脂層４５を形成する。
　非接着性部位転写用樹脂層３１を第３被転写樹脂層４１に押し付ける圧力は、非接着性部位転写用樹脂層３１の形状を第３被転写樹脂層４１に転写可能な圧力であればよい。
　第３被転写樹脂層４１への活性エネルギー線２９の照射は、非接着性部位転写用樹脂層３１から行う。
　第３被転写樹脂層４１へ照射する活性エネルギー線２９は、第３被転写樹脂層４１が十分に硬化する程度の積算光量で照射すればよく、積算光量は、例えば１００～１００００ｍＪ／ｃｍ２である。活性エネルギー線２９の照射によって、遮光部２１によって遮られていない領域では、接着性部位樹脂層３９の隙間に埋められた第３光硬化性樹脂組成物が硬化されると共に、非接着性部位転写用樹脂層３１の反転パターンが転写された第３被転写樹脂層４１が硬化されて複合樹脂層４５が形成される。この工程で第３光硬化性樹脂組成物が硬化された領域に、図８（ｅ）に示す仕切り部１９、および仕切り部１９上の非接着性部位５が形成される。一方、遮光部２１によって活性エネルギー線２９が遮られて第３光硬化性樹脂組成物が硬化されなかった領域に接着性部位３がそのまま残る。
　次に、図８（ｄ）～（ｅ）に示すように、非接着性部位転写用樹脂層３１を取り外し、接着性部位３上に残っている未硬化の第３光硬化性樹脂組成物４２を溶剤で除去して、図８（ｅ）に示す構造を得て、細胞培養基板の製造が完了する。
　上記で形成された複合樹脂層４５を用いれば、複合樹脂層４５の反転パターンを有するモールドを作成でき、これを用いれば一度で複合樹脂層４５と同じパターンを有する細胞培養基板を作成可能である。
　なお、仕切り部を有しない場合には、接着性部位３および非接着性部位５の反転パターンを有するモールドを用いることで、図４（ｂ）に示すような細胞培養基板の製造が可能である。
１．細胞培養基板サンプルの作製
　以下、細胞培養および薬物代謝評価に用いた細胞培養基板サンプルの作製について説明する。
＜光硬化性樹脂組成物の調製＞
　まず、光重合性モノマー及び光開始剤を以下に示す割合で配合して光硬化性樹脂組成物を調製した。
光重合性モノマー
　トリメチロールプロパンエチレンオキサイド変性トリアクリレート（大阪有機化学工業社製、品名：ビスコート＃３６０）５０質量部
　ビスフェノールＡエチレンオキサイド変性ジアクリレート　（大阪有機化学工業社製、品名：ビスコート＃７００ＨＶ）　２０質量部
　トリプロピレングリコールジアクリレート　（大阪有機化学工業社製、品名：ビスコート＃３１０ＨＰ）　３０質量部
光開始剤
　１－ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン（ＢＡＳＦジャパン社製、品名：イルガキュア１８４）　５質量部
＜サンプルの作製＞
[サンプル１]（実施例１）
（非接着性部位転写用樹脂層形成）
　図５に示すような遮光部２１が複数の正方形として設けられたＰＥＴ基材４７に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を１０μｍ厚になるようにバーコーターで塗工をし、円柱状のナノピラー（ピッチ：１５０ｎｍ、高さ：２５０ｎｍ、直径：１００ｎｍ）モールドに対して、塗工した樹脂面をモールドに押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、モールド側から積算光量５００ｍＪ／ｃｍ２でＵＶ照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。モールドと樹脂硬化させたＰＥＴ基材を剥離し、上記モールドの反転形状であるナノホール転写樹脂層を作製した。
（接着性部位樹脂層形成）
　ＰＥＴ基材に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を１０μｍ厚になるようにバーコーターで塗工をし、六角柱状（ハニカム）のナノホール（ピッチ：１２μｍ、深さ：５μｍ、平行する二辺の幅：１７μｍ）モールドに対して、塗工した樹脂面をモールドに押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、ＰＥＴ基材側から積算光量５００ｍＪ／ｃｍ２でＵＶ照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。モールドと樹脂硬化させたＰＥＴ基材を剥離し、上記モールドの反転形状であるナノピラー転写樹脂層を作製した。
（複合樹脂層形成）
　ナノピラー転写樹脂層に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を１０μｍ厚になるようにバーコーターで塗工をし、モールドとしてナノホール転写樹脂層を用いて、ナノホール転写樹脂層に対して、塗工した樹脂面をナノホール転写樹脂層に押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、ナノホール転写樹脂層から積算光量５００ｍＪ／ｃｍ２でＵＶ照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。ナノホール転写樹脂層とナノピラー転写樹脂層を剥離し、ナノピラー転写樹脂層上に残っている未硬化の光硬化性樹脂組成物をイソプロピルアルコールで除去し、細胞培養基板を作製した。
[サンプル２]（比較例１）
　サンプル１の複合樹脂層形成工程において、モールドとしてナノホール転写樹脂層ではなく、同じの格子状の遮光部２１を有するが、凹凸形状を有しない平面のものを用いた以外は同様にして、細胞培養基板を作製した。
[サンプル３]（比較例２）
　サンプル１の接着性部位樹脂層形成工程のみにより、細胞培養基板を作成した。
[サンプル４]（比較例３）
　ＰＥＴ基材に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を１０μｍ厚になるようにバーコーターで塗工をし、ＰＥＴ基材側から積算光量５００ｍＪ／ｃｍ２でＵＶ照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。
＜サンプル１の各部の測定＞
　サンプル１の一部を切除して、走査型電子顕微鏡（日本電子社製、型式：ＪＳＭ－７８００Ｆ）を用いて形状を観察し、同顕微鏡に付属するソフトウェア（ＰＣ-ＳＵＭ）を用いて各部を測定した。接着性部位および非接着性部位についての結果を表１に示し、仕切り部についての結果を表２に示す。なお、サンプル１においては仕切り部の上面の面積と、非接着部位の領域の面積とはほぼ等しい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜水接触角測定＞
　得られたサンプル１について、接触角測定装置（ｄａｔａｐｈｙｓｉｃｓ社製）を用いて、２５℃下において、当該サンプル１の接着部および非接着部の表面にイオン交換水０．５μｌ滴下し、水の接する角度（水接触角）を測定したところ、それぞれ、１００°、１１５°であった。
２．細胞培養・薬物代謝
　本発明の細胞培養基板を用いる、細胞培養および薬物代謝の結果について説明する。
＜細胞培養方法＞
　細胞培養基板を６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の底面に配置して７０％エタノールへ１時間浸漬した。その後、ｐＨが７．４のＰＢＳ（以下同じ）で３回洗浄し乾燥した。
　次に、ラット肝細胞をＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）培地に懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ウェルプレートに播種した後、３７℃，５％ＣＯ２条件下で１４日間培養した。培地交換は培養翌日に行い、その後は１日置きに行った。
＜凝集形状＞
　スフェロイドの形成について調べるため、播種後１４日後の凝集形状をＳＥＭを用いて観察した。サンプル１～４を用いた場合のＳＥＭ画像を図９（ａ）～（ｄ）に示す。
　サンプル１では、格子内で球状に凝集し各凝集体の大きさも近く、均一なスフェロイドが形成されている。サンプル２では、ある程度凝集しているが、格子を跨いでおり球状とはいえず、また、大きさも揃っているとはいえない。サンプル１と異なり格子上に非接着性部位を有していないことが原因ではないかと推測される。サンプル３では、凝集はしているが、多少の丸みを帯びているのみであり、大きさもそれぞれ大きく異なっている。非接着性部位により囲まれていなく、さらに仕切り部もないためであると推測される。サンプル４では、薄く広がるのみである。
＜薬物代謝評価＞
　薬物代謝評価は、播種後１、７、１４日後に行った。１、７、１４日後に培地を誘導培地（３－ＭＣ　０．３３３ｍＭ）に置換し、２４時間インキュベーションする。その後、３７℃に加温した反応培地（ＰＢＳ　５０ｍｌ、Ｄｉｃｕｍａｒｏｌ　２５μＭ、Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ　２ｍＭ、エトキシレゾルフィン　２０μＭ））に置換し、６０分間インキュベーションした後、ＨＣｌでｐＨを７．４に調節した。９６穴のプレートに上清２００μｌ、ブランク（未反応の反応培地）２００μｌを入れ、蛍光プレートリーダで蛍光量　［５３０／５９０］を測定した。
　サンプル１～４の薬物代謝評価を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　サンプル１では、薬物代謝量が多く、スフェロイドが形成されている上に酸素供給が十分に行われているものと推測される。サンプル２では、比較的薬物代謝量が多いがサンプル１には劣った。サンプル３では、薬物代謝量はサンプル１の３～４割程度少なかった。サンプル４では、薬物代謝量は大きく低下した。
１：細胞培養基板、３：接着性部位、５：非接着性部位、１９：仕切り部、２９：活性エネルギー線、Ｐ１：接着性部位の凹凸形状のピッチ、Ｐ２：非接着性部位の凹凸形状のピッチＰ２、Ｇ２：隣接した２つの柱状凸部の間の隙間

Claims (8)

  1. 接着性部位と、非接着性部位とを有する細胞培養基板であって、
    前記接着性部位および前記非接着性部位は、凹凸形状を有し、
    前記非接着性部位の純水に対する接触角は、前記接着性部位より大きい、細胞培養基板。
  2. 前記接着性部位の凹凸形状のピッチＰ１は、前記非接着性部位の凹凸形状のピッチＰ２より大きい、請求項１に記載の細胞培養基板。
  3. 前記ピッチＰ１と前記ピッチＰ２の比Ｐ１／Ｐ２は、２以上である、請求項２に記載の細胞培養基板。
  4. 前記接着性部位の少なくとも一部分は、仕切り部により仕切られ、
    前記非接着性部位は、前記仕切り部上に形成されている、請求項１～３の何れか１つに記載の細胞培養基板。
  5. 前記非接着性部位は、複数の柱状凸部を有し、
    前記非接着性部位の柱状凸部が形成されるピッチが５０～２０００ｎｍであり、
    前記非接着性部位の柱状凸部は、上面の面積が１６００ｎｍ２～４μｍ２であり、
    隣接した２つの柱状凸部の間の隙間Ｇ２が１０～１９６０ｎｍの範囲内である、請求項２～４の何れか１つに記載の細胞培養基板。
  6. 前記接着性部位および前記非接着性部位は、同一の材料で構成されている、請求項１～５の何れか１つに記載の細胞培養基板。
  7. 請求項１～６の何れか１つに記載の細胞培養基板の製造方法であって、
    基材上に塗布した光硬化性樹脂組成物に対して活性エネルギー線を照射して硬化し、前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状を形成する工程を備える、細胞培養基板の製造方法。
  8. 前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状は、モールドを用いてナノインプリント法によって形成される、請求項７に記載の細胞培養基板の製造方法。
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