JPWO2017126589A1 - 細胞培養基板及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
入手容易な材料を用いて簡便に作製可能であり、且つ、高い生存率で均一スフェロイドを培養可能な複合パターン培養基板を提供する。本発明のいくつかの態様によれば、接着性部位と、非接着性部位とを有する細胞培養基板であって、前記接着性部位および前記非接着性部位は、凹凸形状を有し、前記非接着性部位の純水に対する接触角は、前記接着性部位より大きい、細胞培養基板が提供される。
Description
本発明は、細胞培養基板及びその製造方法に関する。
一般に医薬品開発の現場では、三次元形状に培養した細胞塊(スフェロイド)に薬剤を投与してその薬物への代謝能を測定するスクリーニング検査が知られている。この代謝検査の効率を上げるために、近年では簡便に用意できる培養容器を用い、高い生存率で均一なスフェロイドを培養することが求められている。スフェロイド培養用容器には、特許文献1に開示されているように、細胞に対する接着領域と阻害領域とを有する基板などが培養基板として用いられている。
比較的均一なスフェロイドを培養することはできるが、接着領域あるいは阻害領域に用いることが出来る性質を有する樹脂は、特殊であり限定的である(特許文献1)。このような特殊な樹脂を合成することは困難であり、長い時間および高いコストを要する。
本発明のいくつかの態様はこのような事情に鑑みてなされたものであり、入手容易な材料を用いて簡便に作製可能であり、且つ、高い生存率で均一スフェロイドを培養可能な細胞培養基板を提供するものである。
本発明のいくつかの態様によれば、接着性部位と、非接着性部位とを有する細胞培養基板であって、前記接着性部位および前記非接着性部位は、凹凸形状を有し、前記非接着性部位の純水に対する接触角は、前記接着性部位より大きい、細胞培養基板が提供される。
本発明者は、入手容易な材料を用いた場合においても、凹凸形状を有する接着性部位と、接着性部位とは異なる凹凸形状を有する撥水性の高い非接着性部位とを備える細胞培養基板を用いると、高い生存率で均一スフェロイドを培養可能であることを見出し、本発明の完成に到った。
以下、本発明の種々の実施形態を例示する。以下に示す実施形態は互いに組み合わせ可能である。
好ましくは、前記接着性部位の凹凸形状のピッチP1は、前記非接着性部位の凹凸形状のピッチP2より大きい。
好ましくは、前記ピッチP1と前記ピッチP2の比P1/P2は、2以上である。
好ましくは、前記接着性部位の少なくとも一部分は、仕切り部により仕切られ、前記非接着性部位は、前記仕切り部上に形成されている。
好ましくは、前記非接着性部位は、複数の柱状凸部を有し、前記非接着性部位の柱状凸部が形成されるピッチが50〜2000nmであり、前記非接着性部位の柱状凸部は、上面の面積が1600nm2〜4μm2であり、隣接した2つの柱状凸部の間の隙間G2が10〜1960nmの範囲内である。
好ましくは、前記接着性部位および前記非接着性部位は、同一の材料で構成されている。
好ましくは、前記接着性部位の凹凸形状のピッチP1は、前記非接着性部位の凹凸形状のピッチP2より大きい。
好ましくは、前記ピッチP1と前記ピッチP2の比P1/P2は、2以上である。
好ましくは、前記接着性部位の少なくとも一部分は、仕切り部により仕切られ、前記非接着性部位は、前記仕切り部上に形成されている。
好ましくは、前記非接着性部位は、複数の柱状凸部を有し、前記非接着性部位の柱状凸部が形成されるピッチが50〜2000nmであり、前記非接着性部位の柱状凸部は、上面の面積が1600nm2〜4μm2であり、隣接した2つの柱状凸部の間の隙間G2が10〜1960nmの範囲内である。
好ましくは、前記接着性部位および前記非接着性部位は、同一の材料で構成されている。
本発明の別の観点によれば、前記細胞培養基板の製造方法であって、基材上に塗布した光硬化性樹脂組成物に対して活性エネルギー線を照射して硬化し、前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状を形成する工程を備える、細胞培養基板の製造方法が提供される。
好ましくは、前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状は、モールドを用いてナノインプリント法によって形成される。
好ましくは、前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状は、モールドを用いてナノインプリント法によって形成される。
以下、図1〜図4を参照しながら本発明の好ましい実施の形態について具体的に説明する。
1.細胞培養基板
図1(b)に示すように、本発明の一実施形態の細胞培養基板1は、基材7と、基材7の少なくとも一方の面に樹脂層9を備え、樹脂層9は、接着性部位3と非接着性部位5を有する。図1(b)に示す接着性部位3と非接着性部位5の凹凸形状は、接着性部位3および非接着性部位5のいずれかのみの凹凸が反転した形状でもよく、さらにいずれもの凹凸が反転した図1(c)に示すような形状であってもよい。
図1(b)に示すように、本発明の一実施形態の細胞培養基板1は、基材7と、基材7の少なくとも一方の面に樹脂層9を備え、樹脂層9は、接着性部位3と非接着性部位5を有する。図1(b)に示す接着性部位3と非接着性部位5の凹凸形状は、接着性部位3および非接着性部位5のいずれかのみの凹凸が反転した形状でもよく、さらにいずれもの凹凸が反転した図1(c)に示すような形状であってもよい。
好ましくは、接着性部位3を囲むように非接着性部位5が配置され、接着性部位3の領域と非接着性部位5の領域に分かれている。ただし、必ずしも切れ目なく囲む必要はなく、一部が途切れていてもよい。
接着性部位3の領域の形状は、特に制限されないが円形、多角形などが挙げられ、例えば、図1(a)に示すような正方形の領域を形成している実施形態が考えられる。
また、細胞培養基板1は、図4(a)に示すように、接着性部位の少なくとも一部を仕切る、仕切り部19を有していてもよい。また、図4(b)に示すように、有していなくてもよい。培地交換時などに基材から細胞が剥離しないためには、仕切り部19を有することが好ましい。
<基材7>
基材7の材質は、特に限定されないが、樹脂基材、石英基材などの透明基材であることが好ましく、可撓性の観点から樹脂基材であることがさらに好ましい。樹脂基材を構成する樹脂としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、環状ポリオレフィンおよびポリエチレンナフタレートからなる群から選ばれる1種からなるものである。また、基材7は可撓性を有するフィルム状であることが好ましく、その厚さは25〜500μmの範囲であることが好ましい。
基材7の材質は、特に限定されないが、樹脂基材、石英基材などの透明基材であることが好ましく、可撓性の観点から樹脂基材であることがさらに好ましい。樹脂基材を構成する樹脂としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、環状ポリオレフィンおよびポリエチレンナフタレートからなる群から選ばれる1種からなるものである。また、基材7は可撓性を有するフィルム状であることが好ましく、その厚さは25〜500μmの範囲であることが好ましい。
<樹脂層9>
樹脂層9を構成する樹脂は特に限定されないが、例えば、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、スチレン樹脂、オレフィン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂などの比較的入手・合成が容易で安価な樹脂からなることが好ましい。接着性部位3と非接着性部位5の樹脂材料の種類は異なっていてもよいが、同一のである場合には作製がより容易であり、効率的であるためより好ましい。
樹脂層9を構成する樹脂は特に限定されないが、例えば、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、スチレン樹脂、オレフィン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂などの比較的入手・合成が容易で安価な樹脂からなることが好ましい。接着性部位3と非接着性部位5の樹脂材料の種類は異なっていてもよいが、同一のである場合には作製がより容易であり、効率的であるためより好ましい。
<接着性部位3>
図2に示すように、接着性部位3は、複数の接着性凸部11および接着性凹部13による凹凸形状を有する。なお、凸部と凹部とが反転した形状でも良い。
図2に示すように、接着性部位3は、複数の接着性凸部11および接着性凹部13による凹凸形状を有する。なお、凸部と凹部とが反転した形状でも良い。
<接着性凸部11および接着性凹部13>
接着性凸部11の形状は特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台、マイクロレンズなどが挙げられる。接着性凹部13の形状についても特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台、マイクロレンズなどの形状にくり抜いたホールなどが挙げられる。
接着性凸部11の形状は特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台、マイクロレンズなどが挙げられる。接着性凹部13の形状についても特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台、マイクロレンズなどの形状にくり抜いたホールなどが挙げられる。
接着性凸部11または接着性凹部13が形成されるピッチP1は、対象とする細胞に対する接着性を有する範囲内であればよく、例えば、2〜50μmであり、好ましくは5〜20μmであり、より好ましくは7〜15μmである。ピッチP1が小さすぎる場合には、細胞が接着しにくい。また、ピッチP1が大きすぎると、細胞がスフェロイドを形成しにくい。ピッチP1は、具体的には例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50μmであり、ここで例示した数値の何れか2つの間の範囲内であってもよい。なお、接着性凸部11および接着性凹部13による凹凸形状は、規則的であっても不規則であってもよいが、作業効率の観点から規則的であることがの好ましい。凹凸形状が規則的に形成されている場合には、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離を「ピッチ」とし、凹凸形状が不規則に形成されている場合、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離の平均値を「ピッチ」とする。
接着性凸部11の高さH1は、特に制限されないが、例えば、1〜20μmであり、好ましくは1〜10μmであり、より好ましくは1〜5μmである。低すぎると、細胞がスフェロイドを形成しにくい。また、高すぎると、接着性凸部11が倒壊しやすくなるからである。
前記接着性部位の典型例は、複数の柱状凸部を有する。前記接着性部位の柱状凸部の上面の面積は、対象とする細胞に対する接着性を有する範囲内であればよく、例えば、1〜2400μm2であり、好ましくは16〜360μm2であり、より好ましくは36〜196μm2である。隣接した2つの柱状凸部の間の隙間G1は、対象とする細胞に対する接着性を有する範囲内であればよく、例えば、1〜49μmであり、好ましくは4〜19μmであり、より好ましくは6〜14μmである。
<非接着性部位5>
図3に示すように、接着性部位3は、複数の非接着性凸部15および非接着性凹部17による凹凸形状を有する。なお、凸部と凹部とが反転した形状でもよい。
図3に示すように、接着性部位3は、複数の非接着性凸部15および非接着性凹部17による凹凸形状を有する。なお、凸部と凹部とが反転した形状でもよい。
また、非接着性部位5の純水に対する接触角は特に制限されないが、接着性部位3より大きい。接着性部位3より大きいと、非接着性部位5に細胞が接着しにくく、スフェロイドを形成しやすい。非接着性部位5の純水に対する接触角は、例えば、90〜180°であり、好ましくは105〜180°であり、より好ましくは110〜180°であり、さらに好ましくは115〜180°である。
<非接着性凸部15および非接着性凹部17>
非接着性凸部15の形状は特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台状、マイクロレンズ状などが挙げられる。非接着性凹部17の形状についても特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台状、マイクロレンズ状などの形状にくり抜いたホールなどが挙げられる。
非接着性凸部15の形状は特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台状、マイクロレンズ状などが挙げられる。非接着性凹部17の形状についても特に制限されないが、柱状(円柱状、多角柱状など)、錐台状、マイクロレンズ状などの形状にくり抜いたホールなどが挙げられる。
非接着性凸部15または非接着性凹部17が形成されるピッチP2が50〜2000nmであり、好ましくは100〜1000nmであり、より好ましくは150〜800nmである。ピッチP2が小さすぎる場合には、細胞が凹凸を認識できなくなり、接着性と非接着性の識別が無くなってしまう。また、ピッチP2が大きすぎると、細胞が接着しやすい。ピッチP2は、具体的には例えば、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000nmであり、ここで例示した数値の何れか2つの間の範囲内であってもよい。なお、非接着性凸部15および非接着性凹部17による凹凸形状は、規則的であっても不規則であってもよいが、作業効率の観点から規則的であることが好ましい。凹凸形状が規則的に形成されている場合には、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離を「ピッチ」とし、凹凸形状が不規則に形成されている場合、凹凸形状を構成する多数の凸部または凹部の先端間の距離の平均値を「ピッチ」とする。
前記接着性部位3の凹凸形状の前記ピッチP1は、前記非接着性部位5の凹凸形状の前記ピッチP2より大きい。ピッチが大きい方が水の接触角が小さくなり、また細胞に対する接着性が高い傾向にあり、一方でピッチが小さいほうが水の接触角が大きくなり、また細胞に対する接着性が低い傾向にある。従って、ピッチの小さい凹凸形状の部位により、ピッチの大きい凹凸形状の部位を囲むことによりスフェロイドを作成しやすくなる。好ましくは、前記ピッチP1と前記ピッチP2の比P1/P2は、2以上であり、より好ましくは5以上であり、さらに好ましくは10以上である。P1/P2が大きいと接着性に差が大きくなる傾向にあり、細胞が集まりやすくなる分より効率的にスフェロイドを培養可能である。P1/P2の上限は、特に規定されないが、例えば、200である。
非接着性凸部15の高さH2は、特に制限されないが、例えば、50〜2000nmである。高さH2は、好ましくは、100〜1000nmであり、より好ましくは、150〜800nmである。低すぎると、細胞が接着しやすい。また、高すぎると、非接着性凸部15が倒壊しやすくなるからである。
前記非接着性部位の典型例は、複数の柱状凸部、より具体的には複数の円柱状の凸部を有する。前記非接着性部位の柱状凸部の上面の面積は、対象とする細胞に対する接着性が低い範囲内であればよく、例えば、1600nm2〜4μm2である。この面積は、好ましくは、810nm2〜1μm2であり、より好ましくは0.02〜0.6μm2である。隣接した2つの柱状凸部の間の隙間G2は、対象とする細胞に対する接着性が低い範囲内であればよく、例えば、10〜1960nmである。好ましくは、60〜960nmである。より好ましくは、110〜760nmである。
フッ素原子含有層が非接着性凸部15および非接着性凹部17を覆うように設けられていてもよい。フッ素原子含有層は、フッ素原子を含んでいればよく、その厚さや構成は限定されない。フッ素原子含有層を設けることによって細胞が接着しにくくなる。フッ素原子含有層は、フッ素含有基を含むことが好ましい。フッ素含有基は、一例では、パーフルオロアルキル基であり、より具体的には、パーフルオロアルキルシラン基である。パーフルオロアルキル基の炭素数は、例えば1〜10であり、具体的には例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10であり、ここで例示した数値の何れか2つの間の範囲内であってもよい。フッ素含有基は、好ましくは、非接着性凸部15および非接着性凹部17、または無機膜に化学結合されている。一般に、無機膜は樹脂層9との密着性が高く、フッ素含有基は、無機膜に対して強固な化学結合を形成しやすいので、非接着性凸部15および非接着性凹部17とフッ素原子含有層の間に無機膜を設けることによってフッ素原子含有層が非接着性凸部15および非接着性凹部17上に強固に保持される。無機膜としては、無機酸化膜、無機窒化膜、無機酸窒化膜などが挙げられる。無機膜を構成する無機元素しては、ケイ素やアルミニウムが挙げられる。無機膜は、例えば、二酸化ケイ素膜や酸化アルミニウム膜である。無機膜の厚さは、特に限定されないが、例えば、1〜20nmである。
フッ素原子含有層は、一例では、非接着性凸部15および非接着性凹部17上に無機膜を形成し、無機膜とフッ素含有シランカップリング剤を反応させることによって形成することができる。フッ素含有シランカップリング剤は、例えば、パーフルオロアルキルトリアルコキシ(メトキシ、エトキシなど)シランである。無機膜を形成せずに非接着性凸部15および非接着性凹部17にフッ素含有シランカップリング剤を作用させても強固な化学結合が形成されにくいので、予め非接着性凸部15および非接着性凹部17上に無機膜を形成することが好ましい。フッ素含有シランカップリング剤の例としては、オプツールDSX(ダイキン工業社製)が挙げられる。
<接着性部位3の領域>
接着性部位3の領域の面積は、培養する細胞の種類およびスフェロイドの使用目的により適宜調整すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、25〜1000000μm2であり、好ましくは100〜250000μm2であり、より好ましくは2500〜40000μm2である。接着性部位3の領域の形状が、正方形である場合には、一辺の長さが、5〜1000μmであり、好ましくは10〜500μmであり、より好ましくは50〜200μmである。
接着性部位3の領域の面積は、培養する細胞の種類およびスフェロイドの使用目的により適宜調整すればよく、特に制限されるものではないが、例えば、25〜1000000μm2であり、好ましくは100〜250000μm2であり、より好ましくは2500〜40000μm2である。接着性部位3の領域の形状が、正方形である場合には、一辺の長さが、5〜1000μmであり、好ましくは10〜500μmであり、より好ましくは50〜200μmである。
<非接着性部位5の領域>
非接着性部位5の領域が接着性部位の領域に対して大きすぎると、細胞が接着性部位3の領域へ移動するのが困難であるためスフェロイドを形成しにくい。よって、接着性部位3の領域と非接着性部位5の領域の面積の合計に対する非接着性部位5の領域の比率は、例えば、80%以下が好ましく、50%以下がより好ましく、25%以下がさらに好ましい。
非接着性部位5の領域が接着性部位の領域に対して大きすぎると、細胞が接着性部位3の領域へ移動するのが困難であるためスフェロイドを形成しにくい。よって、接着性部位3の領域と非接着性部位5の領域の面積の合計に対する非接着性部位5の領域の比率は、例えば、80%以下が好ましく、50%以下がより好ましく、25%以下がさらに好ましい。
<仕切り部19>
図4(a)に示すように、接着性部位3の少なくとも一部を仕切る、仕切り部19を有している場合、好ましくは、仕切り部19は、接着性部位3を囲むように配置され、接着性部位3の領域を形成する。ただし、必ずしも切れ目なく囲む必要はなく、一部が途切れていてもよい。なお、接着性部位3の領域の形状は、特に制限されないが円形または四角形などの多角形などが挙げられる。好ましくは、非接着性部位5は仕切り部上に形成される。非接着性部位5は、仕切り部の一部に形成されていればよく、好ましくは、少なくとも仕切り部19の上面の大部分を覆うように形成される。なお、非接着性部位5は、仕切り部19の全面を覆っていてもよい。
図4(a)に示すように、接着性部位3の少なくとも一部を仕切る、仕切り部19を有している場合、好ましくは、仕切り部19は、接着性部位3を囲むように配置され、接着性部位3の領域を形成する。ただし、必ずしも切れ目なく囲む必要はなく、一部が途切れていてもよい。なお、接着性部位3の領域の形状は、特に制限されないが円形または四角形などの多角形などが挙げられる。好ましくは、非接着性部位5は仕切り部上に形成される。非接着性部位5は、仕切り部の一部に形成されていればよく、好ましくは、少なくとも仕切り部19の上面の大部分を覆うように形成される。なお、非接着性部位5は、仕切り部19の全面を覆っていてもよい。
仕切り部19の高さH3は、特に制限されないが、例えば、5〜100μmであり、好ましくは10〜50μmであり、より好ましくは15〜25μmである。高さH3が低すぎると、細胞が水流などにより剥離しやすい。また、高さH3が高すぎると、酸素供給が十分に行えず細胞の生存率を低下させる。なお、高さH3は、図4(a)に示すように、接着性凸部11の上端から、非接着性部位を含めた仕切り部の上端までの高さである。
2.細胞培養基板の製造方法
次に、図5〜図8を用いて、細胞培養基板の製造方法について説明する。
次に、図5〜図8を用いて、細胞培養基板の製造方法について説明する。
本発明の一実施形態の、仕切り部を有する細胞培養基板の製造方法は、非接着性部位転写用樹脂層形成工程と、接着性部位樹脂層形成工程と、複合樹脂層形成工程とを備える。
以下、各工程についてさらに詳細に説明する。
以下、各工程についてさらに詳細に説明する。
(1)非接着性部位転写用樹脂層形成工程
(1−1)第1被転写樹脂層形成工程
まず、図5(a)に示すような遮光部21を有する透明基材23上に、図6(a)に示すように、第1光硬化性樹脂組成物を塗布して第1被転写樹脂層25を形成する。
(1−1)第1被転写樹脂層形成工程
まず、図5(a)に示すような遮光部21を有する透明基材23上に、図6(a)に示すように、第1光硬化性樹脂組成物を塗布して第1被転写樹脂層25を形成する。
<透明基材>
透明基材23は、樹脂基材、石英基材、シリコーン基材などの透明材料で形成され、その材質は、特に限定されないが、樹脂基材であることが好ましい。樹脂基材を用いることによって、本発明の方法によって所望するサイズの(大面積も可能な)細胞培養基板が得られるからである。樹脂基材を構成する樹脂としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、環状ポリオレフィンおよびポリエチレンナフタレートからなる群から選ばれる1種からなるものである。また、透明基材23は可撓性を有することが好ましく、樹脂基材を用いる場合には、同種または異種の基材を積層したり、樹脂基材に樹脂組成物を膜状に積層させたりしてもよい。樹脂基材の厚さは25〜500μmの範囲であることが好ましい。
透明基材23は、樹脂基材、石英基材、シリコーン基材などの透明材料で形成され、その材質は、特に限定されないが、樹脂基材であることが好ましい。樹脂基材を用いることによって、本発明の方法によって所望するサイズの(大面積も可能な)細胞培養基板が得られるからである。樹脂基材を構成する樹脂としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、環状ポリオレフィンおよびポリエチレンナフタレートからなる群から選ばれる1種からなるものである。また、透明基材23は可撓性を有することが好ましく、樹脂基材を用いる場合には、同種または異種の基材を積層したり、樹脂基材に樹脂組成物を膜状に積層させたりしてもよい。樹脂基材の厚さは25〜500μmの範囲であることが好ましい。
透明基材23に設けられる遮光部21は、複合形状形成工程においてマスクとして利用するパターンであり、図8(b)〜(e)に示すように、複合樹脂層45には、遮光部21に対応する接着性部位3、仕切り部19、仕切り部上の非接着性部位5が形成される。図8(b)に示す活性エネルギー線照射工程において、遮光部21によって活性エネルギー線29が遮られている領域が接着性部位3となる。「活性エネルギー線」は、UV光、可視光、電子線などの、光硬化性樹脂組成物を硬化可能なエネルギー線の総称である。遮光部21の形状は、特に限定されず、図5(a)に示すような正方形の他、五角形や六角形などの多角形、円形なども用いることができ、所望の接着性部位3の領域に対応させる。
遮光部21は、遮光材料(例えば、クロムなどの金属材料)をスパッタリングによって透明基材23上に付着させた後にパターニングしたり、インクジェット印刷またはスクリーン印刷などの方法で遮光材料のパターンを印刷したりすることによって形成することができる。遮光部21は、図5(b)〜(c)に示すように、透明基材23の、第1光硬化性樹脂組成物を塗布する面23aに形成してもよく、図5(d)に示すように、透明基材23の背面23b上に形成してもよい。また、遮光部21は、図5(b)に示すように、透明基材23と面一になるように形成してもよく、図5(c)に示すように透明基材23の平坦面上に形成してもよく、図5(e)に示すように透明基材23の内部に埋設されてもよい。
<第1光硬化性樹脂組成物>
第1被転写樹脂層25を構成する第1光硬化性樹脂組成物は、モノマーと、光開始剤を含有し、活性エネルギー線の照射によって硬化する性質を有する。
第1被転写樹脂層25を構成する第1光硬化性樹脂組成物は、モノマーと、光開始剤を含有し、活性エネルギー線の照射によって硬化する性質を有する。
モノマーとしては、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、スチレン樹脂、オレフィン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂等を形成するための光重合性のモノマーが挙げられ、光重合性のアクリル系モノマーおよび/またはメタクリル系モノマーが好ましい。
光開始剤は、モノマーの重合を促進するために添加される成分であり、前記モノマー100質量部に対して0.1質量部以上含有されることが好ましい。光開始剤の含有量の上限は、特に規定されないが、例えば前記モノマー100質量部に対して20質量部である。
本発明の第1光硬化性樹脂組成物は、溶剤、重合禁止剤、連鎖移動剤、酸化防止剤、光増感剤、充填剤、レベリング剤等の成分を第1光硬化性樹脂組成物の性質に影響を与えない範囲で含んでいてもよい。
第1光硬化性樹脂組成物は、上記成分を公知の方法で混合することにより製造することができる。第1光硬化性樹脂組成物は、スピンコート、スプレーコート、バーコート、ディップコート、ダイコートおよびスリットコート等の方法で透明基材23上に塗布して第1被転写樹脂層25を形成することが可能である。
第1被転写樹脂層25は、通常は、透明樹脂層であり、その厚さは、100nm〜1mm、好ましくは、5〜500μmである。このような厚さとすれば、インプリント加工が行い易く、また非接着性部位の反転パターンを形成することができる。
(1−2)転写及び硬化工程
次に、図6(a)〜(c)に示すように、第1モールド27の第1パターン28を第1被転写樹脂層25に対して押し付けた状態で第1モールド27を通じて第1被転写樹脂層25に活性エネルギー線29を照射することによって第1パターン28が転写された非接着性部位転写用樹脂層31を形成する。
次に、図6(a)〜(c)に示すように、第1モールド27の第1パターン28を第1被転写樹脂層25に対して押し付けた状態で第1モールド27を通じて第1被転写樹脂層25に活性エネルギー線29を照射することによって第1パターン28が転写された非接着性部位転写用樹脂層31を形成する。
第1モールド27は、第1パターン28を有する。本実施形態では、第1パターン28は、所望の非接着性部位5のパターンである。
第1モールド27は、樹脂基材、石英基材、シリコーン基材などの透明材料で形成され、透明基材23と同様の材質で形成可能である。
第1モールド27を第1被転写樹脂層25に押し付ける圧力は、第1パターン28の形状を第1被転写樹脂層25に転写可能な圧力であればよい。
第1被転写樹脂層25へ照射する活性エネルギー線29は、第1被転写樹脂層25が十分に硬化する程度の積算光量で照射すればよく、積算光量は、例えば100〜10000mJ/cm2である。活性エネルギー線29の照射によって、第1被転写樹脂層25が硬化されて、図6(c)に示すように、第1パターン28が反転された第1反転パターン32、すなわち所望の非接着性部位5の反転パターンが形成された非接着性部位転写用樹脂層31が形成される。
(2)接着性部位樹脂層形成工程
(2−1)第2被転写樹脂層形成工程
まず、図7(a)に示すように、基材7上に、第2光硬化性樹脂組成物を塗布して第2被転写樹脂層33を形成する。
(2−1)第2被転写樹脂層形成工程
まず、図7(a)に示すように、基材7上に、第2光硬化性樹脂組成物を塗布して第2被転写樹脂層33を形成する。
上述した第1光硬化性樹脂組成物の説明は、その趣旨に反しない限り、第2光硬化性樹脂組成物に当てはまる。第2光硬化性樹脂組成物の種類は、第1光硬化性樹脂組成物と同じであっても異なっていてもよい。第2光硬化性樹脂組成物を塗布して得られる第2被転写樹脂層33は、通常は、透明樹脂層であり、その厚さは、通常1μm〜1mm、好ましくは、50μm〜500μmである。このような厚さとすれば、インプリント加工が行い易く、また接着性部位を形成することができる。
(2−2)転写及び硬化工程
次に、図7(b)〜(d)に示すように、第2モールド35の第2パターン36を第2被転写樹脂層33に押し付けた状態で第2被転写樹脂層33に活性エネルギー線を照射して第2被転写樹脂層33を硬化させることによって接着性部位樹脂層39を形成する。
次に、図7(b)〜(d)に示すように、第2モールド35の第2パターン36を第2被転写樹脂層33に押し付けた状態で第2被転写樹脂層33に活性エネルギー線を照射して第2被転写樹脂層33を硬化させることによって接着性部位樹脂層39を形成する。
第2モールド35は、第2パターン36を有する。本実施形態では、第2パターン36は、所望の接着性部位3の反転パターンである。
基材7が透明である場合、活性エネルギー線29は基材側から照射してもよく、第2モールド35は、樹脂基材、石英基材、シリコーン基材などの透明材料、もしくは金属材料で形成することも可能である。
第2モールド35を第2被転写樹脂層33に押し付ける圧力は、第2パターン36の形状を第2被転写樹脂層33に転写可能な圧力であればよい。
第2被転写樹脂層33へ照射する活性エネルギー線29は、第2被転写樹脂層33が十分に硬化する程度の積算光量で照射すればよく、積算光量は、例えば100〜10000mJ/cm2である。活性エネルギー線29の照射によって、第2被転写樹脂層33が硬化されて、図7(d)に示すように、第2パターン36が反転された第2反転パターン40、すなわち所望の非接着性部位5が形成された接着性部位樹脂層39が形成される。
(3)複合樹脂層形成工程
(3−1)第3被転写樹脂層形成工程
まず、図8(a)に示すように、接着性部位樹脂層39上に、第3光硬化性樹脂組成物を塗布して第3被転写樹脂層41を形成する。
(3−1)第3被転写樹脂層形成工程
まず、図8(a)に示すように、接着性部位樹脂層39上に、第3光硬化性樹脂組成物を塗布して第3被転写樹脂層41を形成する。
上述した第1光硬化性樹脂組成物の説明は、その趣旨に反しない限り、第2光硬化性樹脂組成物に当てはまる。第3光硬化性樹脂組成物の種類は、第1光硬化性樹脂組成物と同じであっても異なっていてもよく、第2光硬化性樹脂組成物と同じであっても異なっていてもよい。第3光硬化性樹脂組成物を塗布して得られる第3被転写樹脂層41は、通常は、透明樹脂層であり、その厚さは、10μm〜1mm、好ましくは、50μm〜500μmである。このような厚さとすれば、インプリント加工が行い易く、また仕切り部および非接着性部位を形成することができる。
(3−2)転写及び硬化工程
次に、図8(b)〜(e)に示すように、非接着性部位転写用樹脂層31をモールドとして第3被転写樹脂層41に押し付けた状態で第3被転写樹脂層41に活性エネルギー線を照射して第3被転写樹脂層41を硬化させることによって複合樹脂層45を形成する。
次に、図8(b)〜(e)に示すように、非接着性部位転写用樹脂層31をモールドとして第3被転写樹脂層41に押し付けた状態で第3被転写樹脂層41に活性エネルギー線を照射して第3被転写樹脂層41を硬化させることによって複合樹脂層45を形成する。
非接着性部位転写用樹脂層31を第3被転写樹脂層41に押し付ける圧力は、非接着性部位転写用樹脂層31の形状を第3被転写樹脂層41に転写可能な圧力であればよい。
第3被転写樹脂層41への活性エネルギー線29の照射は、非接着性部位転写用樹脂層31から行う。
第3被転写樹脂層41へ照射する活性エネルギー線29は、第3被転写樹脂層41が十分に硬化する程度の積算光量で照射すればよく、積算光量は、例えば100〜10000mJ/cm2である。活性エネルギー線29の照射によって、遮光部21によって遮られていない領域では、接着性部位樹脂層39の隙間に埋められた第3光硬化性樹脂組成物が硬化されると共に、非接着性部位転写用樹脂層31の反転パターンが転写された第3被転写樹脂層41が硬化されて複合樹脂層45が形成される。この工程で第3光硬化性樹脂組成物が硬化された領域に、図8(e)に示す仕切り部19、および仕切り部19上の非接着性部位5が形成される。一方、遮光部21によって活性エネルギー線29が遮られて第3光硬化性樹脂組成物が硬化されなかった領域に接着性部位3がそのまま残る。
次に、図8(d)〜(e)に示すように、非接着性部位転写用樹脂層31を取り外し、接着性部位3上に残っている未硬化の第3光硬化性樹脂組成物42を溶剤で除去して、図8(e)に示す構造を得て、細胞培養基板の製造が完了する。
上記で形成された複合樹脂層45を用いれば、複合樹脂層45の反転パターンを有するモールドを作成でき、これを用いれば一度で複合樹脂層45と同じパターンを有する細胞培養基板を作成可能である。
なお、仕切り部を有しない場合には、接着性部位3および非接着性部位5の反転パターンを有するモールドを用いることで、図4(b)に示すような細胞培養基板の製造が可能である。
1.細胞培養基板サンプルの作製
以下、細胞培養および薬物代謝評価に用いた細胞培養基板サンプルの作製について説明する。
以下、細胞培養および薬物代謝評価に用いた細胞培養基板サンプルの作製について説明する。
<光硬化性樹脂組成物の調製>
まず、光重合性モノマー及び光開始剤を以下に示す割合で配合して光硬化性樹脂組成物を調製した。
光重合性モノマー
トリメチロールプロパンエチレンオキサイド変性トリアクリレート(大阪有機化学工業社製、品名:ビスコート#360)50質量部
ビスフェノールAエチレンオキサイド変性ジアクリレート (大阪有機化学工業社製、品名:ビスコート#700HV) 20質量部
トリプロピレングリコールジアクリレート (大阪有機化学工業社製、品名:ビスコート#310HP) 30質量部
光開始剤
1−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン(BASFジャパン社製、品名:イルガキュア184) 5質量部
まず、光重合性モノマー及び光開始剤を以下に示す割合で配合して光硬化性樹脂組成物を調製した。
光重合性モノマー
トリメチロールプロパンエチレンオキサイド変性トリアクリレート(大阪有機化学工業社製、品名:ビスコート#360)50質量部
ビスフェノールAエチレンオキサイド変性ジアクリレート (大阪有機化学工業社製、品名:ビスコート#700HV) 20質量部
トリプロピレングリコールジアクリレート (大阪有機化学工業社製、品名:ビスコート#310HP) 30質量部
光開始剤
1−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン(BASFジャパン社製、品名:イルガキュア184) 5質量部
<サンプルの作製>
[サンプル1](実施例1)
(非接着性部位転写用樹脂層形成)
図5に示すような遮光部21が複数の正方形として設けられたPET基材47に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、円柱状のナノピラー(ピッチ:150nm、高さ:250nm、直径:100nm)モールドに対して、塗工した樹脂面をモールドに押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、モールド側から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。モールドと樹脂硬化させたPET基材を剥離し、上記モールドの反転形状であるナノホール転写樹脂層を作製した。
(非接着性部位転写用樹脂層形成)
図5に示すような遮光部21が複数の正方形として設けられたPET基材47に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、円柱状のナノピラー(ピッチ:150nm、高さ:250nm、直径:100nm)モールドに対して、塗工した樹脂面をモールドに押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、モールド側から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。モールドと樹脂硬化させたPET基材を剥離し、上記モールドの反転形状であるナノホール転写樹脂層を作製した。
(接着性部位樹脂層形成)
PET基材に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、六角柱状(ハニカム)のナノホール(ピッチ:12μm、深さ:5μm、平行する二辺の幅:17μm)モールドに対して、塗工した樹脂面をモールドに押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、PET基材側から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。モールドと樹脂硬化させたPET基材を剥離し、上記モールドの反転形状であるナノピラー転写樹脂層を作製した。
PET基材に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、六角柱状(ハニカム)のナノホール(ピッチ:12μm、深さ:5μm、平行する二辺の幅:17μm)モールドに対して、塗工した樹脂面をモールドに押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、PET基材側から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。モールドと樹脂硬化させたPET基材を剥離し、上記モールドの反転形状であるナノピラー転写樹脂層を作製した。
(複合樹脂層形成)
ナノピラー転写樹脂層に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、モールドとしてナノホール転写樹脂層を用いて、ナノホール転写樹脂層に対して、塗工した樹脂面をナノホール転写樹脂層に押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、ナノホール転写樹脂層から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。ナノホール転写樹脂層とナノピラー転写樹脂層を剥離し、ナノピラー転写樹脂層上に残っている未硬化の光硬化性樹脂組成物をイソプロピルアルコールで除去し、細胞培養基板を作製した。
ナノピラー転写樹脂層に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、モールドとしてナノホール転写樹脂層を用いて、ナノホール転写樹脂層に対して、塗工した樹脂面をナノホール転写樹脂層に押し当てるように上からローラーでラミネートを行った。その後、ナノホール転写樹脂層から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。ナノホール転写樹脂層とナノピラー転写樹脂層を剥離し、ナノピラー転写樹脂層上に残っている未硬化の光硬化性樹脂組成物をイソプロピルアルコールで除去し、細胞培養基板を作製した。
[サンプル2](比較例1)
サンプル1の複合樹脂層形成工程において、モールドとしてナノホール転写樹脂層ではなく、同じの格子状の遮光部21を有するが、凹凸形状を有しない平面のものを用いた以外は同様にして、細胞培養基板を作製した。
サンプル1の複合樹脂層形成工程において、モールドとしてナノホール転写樹脂層ではなく、同じの格子状の遮光部21を有するが、凹凸形状を有しない平面のものを用いた以外は同様にして、細胞培養基板を作製した。
[サンプル3](比較例2)
サンプル1の接着性部位樹脂層形成工程のみにより、細胞培養基板を作成した。
サンプル1の接着性部位樹脂層形成工程のみにより、細胞培養基板を作成した。
[サンプル4](比較例3)
PET基材に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、PET基材側から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。
PET基材に対して、上記調製の光硬化性樹脂組成物を10μm厚になるようにバーコーターで塗工をし、PET基材側から積算光量500mJ/cm2でUV照射を行い、光硬化性樹脂組成物を硬化させた。
<サンプル1の各部の測定>
サンプル1の一部を切除して、走査型電子顕微鏡(日本電子社製、型式:JSM−7800F)を用いて形状を観察し、同顕微鏡に付属するソフトウェア(PC-SUM)を用いて各部を測定した。接着性部位および非接着性部位についての結果を表1に示し、仕切り部についての結果を表2に示す。なお、サンプル1においては仕切り部の上面の面積と、非接着部位の領域の面積とはほぼ等しい。
サンプル1の一部を切除して、走査型電子顕微鏡(日本電子社製、型式:JSM−7800F)を用いて形状を観察し、同顕微鏡に付属するソフトウェア(PC-SUM)を用いて各部を測定した。接着性部位および非接着性部位についての結果を表1に示し、仕切り部についての結果を表2に示す。なお、サンプル1においては仕切り部の上面の面積と、非接着部位の領域の面積とはほぼ等しい。
<水接触角測定>
得られたサンプル1について、接触角測定装置(dataphysics社製)を用いて、25℃下において、当該サンプル1の接着部および非接着部の表面にイオン交換水0.5μl滴下し、水の接する角度(水接触角)を測定したところ、それぞれ、100°、115°であった。
得られたサンプル1について、接触角測定装置(dataphysics社製)を用いて、25℃下において、当該サンプル1の接着部および非接着部の表面にイオン交換水0.5μl滴下し、水の接する角度(水接触角)を測定したところ、それぞれ、100°、115°であった。
2.細胞培養・薬物代謝
本発明の細胞培養基板を用いる、細胞培養および薬物代謝の結果について説明する。
本発明の細胞培養基板を用いる、細胞培養および薬物代謝の結果について説明する。
<細胞培養方法>
細胞培養基板を6ウェルプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)の底面に配置して70%エタノールへ1時間浸漬した。その後、pHが7.4のPBS(以下同じ)で3回洗浄し乾燥した。
次に、ラット肝細胞をDMEM(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)培地に懸濁し、1×105cells/wellで、ウェルプレートに播種した後、37℃,5%CO2条件下で14日間培養した。培地交換は培養翌日に行い、その後は1日置きに行った。
細胞培養基板を6ウェルプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)の底面に配置して70%エタノールへ1時間浸漬した。その後、pHが7.4のPBS(以下同じ)で3回洗浄し乾燥した。
次に、ラット肝細胞をDMEM(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)培地に懸濁し、1×105cells/wellで、ウェルプレートに播種した後、37℃,5%CO2条件下で14日間培養した。培地交換は培養翌日に行い、その後は1日置きに行った。
<凝集形状>
スフェロイドの形成について調べるため、播種後14日後の凝集形状をSEMを用いて観察した。サンプル1〜4を用いた場合のSEM画像を図9(a)〜(d)に示す。
スフェロイドの形成について調べるため、播種後14日後の凝集形状をSEMを用いて観察した。サンプル1〜4を用いた場合のSEM画像を図9(a)〜(d)に示す。
サンプル1では、格子内で球状に凝集し各凝集体の大きさも近く、均一なスフェロイドが形成されている。サンプル2では、ある程度凝集しているが、格子を跨いでおり球状とはいえず、また、大きさも揃っているとはいえない。サンプル1と異なり格子上に非接着性部位を有していないことが原因ではないかと推測される。サンプル3では、凝集はしているが、多少の丸みを帯びているのみであり、大きさもそれぞれ大きく異なっている。非接着性部位により囲まれていなく、さらに仕切り部もないためであると推測される。サンプル4では、薄く広がるのみである。
<薬物代謝評価>
薬物代謝評価は、播種後1、7、14日後に行った。1、7、14日後に培地を誘導培地(3−MC 0.333mM)に置換し、24時間インキュベーションする。その後、37℃に加温した反応培地(PBS 50ml、Dicumarol 25μM、Probenecid 2mM、エトキシレゾルフィン 20μM))に置換し、60分間インキュベーションした後、HClでpHを7.4に調節した。96穴のプレートに上清200μl、ブランク(未反応の反応培地)200μlを入れ、蛍光プレートリーダで蛍光量 [530/590]を測定した。
薬物代謝評価は、播種後1、7、14日後に行った。1、7、14日後に培地を誘導培地(3−MC 0.333mM)に置換し、24時間インキュベーションする。その後、37℃に加温した反応培地(PBS 50ml、Dicumarol 25μM、Probenecid 2mM、エトキシレゾルフィン 20μM))に置換し、60分間インキュベーションした後、HClでpHを7.4に調節した。96穴のプレートに上清200μl、ブランク(未反応の反応培地)200μlを入れ、蛍光プレートリーダで蛍光量 [530/590]を測定した。
サンプル1〜4の薬物代謝評価を表3に示す。
サンプル1では、薬物代謝量が多く、スフェロイドが形成されている上に酸素供給が十分に行われているものと推測される。サンプル2では、比較的薬物代謝量が多いがサンプル1には劣った。サンプル3では、薬物代謝量はサンプル1の3〜4割程度少なかった。サンプル4では、薬物代謝量は大きく低下した。
1:細胞培養基板、3:接着性部位、5:非接着性部位、19:仕切り部、29:活性エネルギー線、P1:接着性部位の凹凸形状のピッチ、P2:非接着性部位の凹凸形状のピッチP2、G2:隣接した2つの柱状凸部の間の隙間
Claims (8)
- 接着性部位と、非接着性部位とを有する細胞培養基板であって、
前記接着性部位および前記非接着性部位は、凹凸形状を有し、
前記非接着性部位の純水に対する接触角は、前記接着性部位より大きい、細胞培養基板。 - 前記接着性部位の凹凸形状のピッチP1は、前記非接着性部位の凹凸形状のピッチP2より大きい、請求項1に記載の細胞培養基板。
- 前記ピッチP1と前記ピッチP2の比P1/P2は、2以上である、請求項2に記載の細胞培養基板。
- 前記接着性部位の少なくとも一部分は、仕切り部により仕切られ、
前記非接着性部位は、前記仕切り部上に形成されている、請求項1〜3の何れか1つに記載の細胞培養基板。 - 前記非接着性部位は、複数の柱状凸部を有し、
前記非接着性部位の柱状凸部が形成されるピッチが50〜2000nmであり、
前記非接着性部位の柱状凸部は、上面の面積が1600nm2〜4μm2であり、
隣接した2つの柱状凸部の間の隙間G2が10〜1960nmの範囲内である、請求項2〜4の何れか1つに記載の細胞培養基板。 - 前記接着性部位および前記非接着性部位は、同一の材料で構成されている、請求項1〜5の何れか1つに記載の細胞培養基板。
- 請求項1〜6の何れか1つに記載の細胞培養基板の製造方法であって、
基材上に塗布した光硬化性樹脂組成物に対して活性エネルギー線を照射して硬化し、前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状を形成する工程を備える、細胞培養基板の製造方法。 - 前記接着性部位および前記非接着性部位の凹凸形状は、モールドを用いてナノインプリント法によって形成される、請求項7に記載の細胞培養基板の製造方法。
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