WO2017065428A1 - 중공형 다공성 미립구의 제조방법 - Google Patents

중공형 다공성 미립구의 제조방법 Download PDF

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WO2017065428A1
WO2017065428A1 PCT/KR2016/010855 KR2016010855W WO2017065428A1 WO 2017065428 A1 WO2017065428 A1 WO 2017065428A1 KR 2016010855 W KR2016010855 W KR 2016010855W WO 2017065428 A1 WO2017065428 A1 WO 2017065428A1
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WO
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oil
hollow porous
microspheres
porous microspheres
pore
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PCT/KR2016/010855
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French (fr)
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김혁
아영창
최성욱
문승관
박원석
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(주)아모레퍼시픽
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
    • C08L101/16—Compositions of unspecified macromolecular compounds the macromolecular compounds being biodegradable

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a scaffold for tissue engineering that can be delivered in a living tissue such as skin tissue.
  • Filler (filler) of the medical devices for cosmetic surgery sold for the purpose of cosmetic surgery is used to inject into the skin tissue wrinkles and depressions.
  • Most fillers are injected into the skin tissue to improve skin wrinkles or depressions in such a way as to increase the volume of the skin tissue through the volume of the material itself.
  • the most commonly used fillers include intangible substances in the form of gels such as hyaluronic acid and collagen, but have a problem that their cosmetic treatment effects are not maintained for a long time as they are absorbed into skin tissues over time.
  • porous material which is a filler component, developed in the past, is not possible to be implanted into the skin tissue through injection because it is several tens of mm in size. There was a drawback to be implanted into the skin tissue only through surgery to cut the skin tissue.
  • water-soluble polymer materials such as alginate, collagen, gelatin, and the like are used as porogens for forming pores in hydrophobic biodegradable polymer microspheres, and O / Multi emulsion, such as oil in water (W), water in oil (W / O), water in oil in water (W / O / W), or oil in water in oil (O / W / O)
  • O / Multi emulsion such as oil in water (W), water in oil (W / O), water in oil in water (W / O / W), or oil in water in oil (O / W / O)
  • An object of the present invention is to provide a method for preparing a scaffold for tissue engineering that can be delivered in biological tissues, such as skin tissue.
  • the process is simple, but can easily control the porosity and the shape of the pores of the porous microspheres, can be injected into the skin tissue through injection, can increase the volume of the skin tissue by proliferating the cells in the porous microspheres It is to provide a method for producing a porous microspheres.
  • one aspect of the present invention is a hollow porous microspheres manufacturing method
  • Preparing a polymer solution comprising dissolving a pore-forming substance and a hydrophobic biodegradable polymer in a volatile solvent
  • the oily polymer solution contained in the emulsion in the form of oil in water is O / W.
  • S (Oil in Solid) microspheres can be easily realized without the internal phase stabilizer required for the production of double emulsion type microspheres, and the washing process for removing the internal phase stabilizer can be considered. no need. Therefore, using a conventional hydrophilic pore-forming inducing material, it is possible to simplify the production process than the technology prepared by the W / O / W or O / W / O method through separate primary and secondary emulsification process.
  • the present invention can easily adjust the micropore rate and the shape and size of the pore in the microspheres, it is possible to manufacture micropores included in the hollow and the partition wall surrounding the skin tissue cells in the microspheres, and excellent pore uniformity Do.
  • the hollow porous microspheres have a dual structure including a bulkhead and a large cavity formed in the center of the particle, so that the skin tissue cells in vivo use the micropores as channels. It can be easily moved into the hollow porous microspheres, and the moved skin tissue cells can effectively proliferate within the macrocavity.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for manufacturing hollow porous microspheres according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing an electron scanning micrograph of the particle surface and the section according to the type and content of porogen when the hollow porous microspheres according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing a live / dead staining confocal micrograph of culturing fibroblasts in hollow porous microspheres according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the cell growth rate through MTT assay after culturing fibroblasts in hollow porous microspheres according to an embodiment of the present invention.
  • Average diameter in the present specification means a value obtained by averaging the diameter that is a line segment connecting both ends of the cross section of the object, for example, in the case of the cavity of the present invention when the cavity formed in the hollow porous microspheres is not a sphere It may mean the average value of the diameter of the cavity itself. Or it may mean an average value of the diameter of each cavity present in the plurality of microspheres. In the case of micropores, when the micropores themselves are not spherical, they may mean an average value of diameters of the micropores themselves or an average value of diameters of the plurality of micropores.
  • the present invention provides a method for preparing a polymer solution comprising dissolving a pore-forming substance and a hydrophobic biodegradable polymer in a volatile solvent; Dispersing the polymer solution in an aqueous solution containing water or a phase stabilizer to form an emulsion in the form of oil in water (O / W); Volatile solvent was volatilized on the aqueous solution in which the polymer solution was dispersed to solidify the hydrophobic biodegradable polymer, so that spontaneous phase separation between the hydrophobic biodegradable polymer and the pore-forming substance occurred, thereby causing the oil in water (O / W) emulsion.
  • an oil phase containing a hydrophobic biodegradable polymer is used as a continuous phase, and an aqueous phase containing a pore-forming substance for forming pores is formed.
  • an aqueous phase containing a pore-forming substance for forming pores is formed.
  • continuous stirring and temperature control were essential to uniformize the size and distribution of the discontinuous phase in the prepared primary emulsion.
  • composition uniformity and composition stability can be secured without a separate operation.
  • the hydrophobic biodegradable polymer since a hydrophobic fluid having a lower density than water is used, which is incompatible with the hydrophobic biodegradable polymer as a pore-forming substance, the hydrophobic biodegradable polymer is solidified when the volatile solvent in the polymer solution is removed.
  • the hydrophobic and liquid pore-forming inducing substance which is incompatible with the hydrophobic biodegradable polymer, is naturally phase separated to form pores in the microspheres composed of the hydrophobic biodegradable polymer. Therefore, even if the hydrophobic biodegradable polymer is kept in solution before solidification, the composition uniformity can be secured. If the hydrophobic biodegradable polymer is solidified, the pore uniformity and stability are determined by the strength of the hydrophobic biodegradable polymer. It can be secured.
  • the pore-forming substance is incompatible with the hydrophobic biodegradable polymer and may include a hydrophobic fluid having a lower density than water.
  • the pore-forming inducer is also called porogen.
  • the pore-forming inducing substance is not compatible with the hydrophobic biodegradable polymer, and may be included without limitation as long as the hydrophobic fluid having a lower density than water.
  • the pore-forming material may be a material having a boiling point at 250 ° C. or less at 1 atm, and may be a liquid material at 1 atm and 30 to 150 ° C.
  • the pore-forming substance may be at least one selected from the group consisting of alkanes, vegetable oils, and mixtures thereof.
  • the alkanes are at least one selected from the group consisting of Octane, Undecane, Tridecane, Pentadecane, and mixtures thereof.
  • the present invention may form pores by applying other materials in addition to the specific materials, in one embodiment, the present invention is hollow and according to the concentration and type of porogen forming pores in the production of the hollow porous microspheres
  • the size and shape of the micropores can be controlled, and the pore uniformity can also be increased.
  • the pore-forming substance may be included in an amount of 0.1 to 50% by weight, more specifically 1 to 10% by weight, based on the total weight of the polymer solution.
  • the hydrophobic biodegradable polymer according to an embodiment of the present invention is polylactic acid (Poly-L-Lactic Acid, PLLA), polyglycolic acid (polyglycolic acid, PGA), polylactic acid-glycolic acid copolymer (poly (lactic- co-glycolic acid, PLGA), poly- ⁇ - (caprolactone) (Polycaprolactone, PCL), polyanhydrides, polyorthoesters, polyviniyalcohols, polyethyleneglycols , Polyurethane, polyacrylic acid, poly-N-isopropyl acrylamide, poly (ethylene oxide) -poly (propylene oxide) -poly (ethylene oxide) copolymer (poly ethylene oxide) -poly propylene oxide-polyethylene oxide copolymer), copolymers thereof, and mixtures thereof may include one or more, but safe and degradable when injected into the skin tissue If possible, it is possible to include all without limitation.
  • the step of converting the oil-based polymer solution contained in the oil (emulsion) of the oil in water (O / W) form into oil / solid (O / S) microspheres may include: Supplying the polymer solution in a discontinuous phase to the water or aqueous solution containing a phase stabilizer in an aqueous phase including a phase stabilizer as a continuous phase.
  • the aqueous solution containing the phase stabilizer is an aqueous solution containing a material that stabilizes the interface, for example, polyvinyl alcohol (Polyvinyl alcohol, PVA), polyvinylpyrrolidone (Polyvinyl pirrolidone), polyethylene glycol-co-poly Polyethylene glycol-co-polyproplene glycol, polyethylene glycol-co-polypropylene glycol-co-polyethylene glycol, polyethylene glycol-co-polylactic acid glycol-co-polylactic acid) and polyethylene glycol-co-polylactide-polyethylene glycol (polyethylene glycol-co-polylactic acid-co- polyethylene glycol) is an aqueous solution in which one or more phase stabilizers selected from the group consisting of.
  • a material that stabilizes the interface for example, polyvinyl alcohol (Polyvinyl alcohol, PVA), polyvinylpyrrolidone (Polyvinyl pirrolidone), poly
  • the step of dispersing the polymer solution in an aqueous solution containing water or a phase stabilizer is an embodiment comprising the water or phase stabilizer in a microfluidic device as an aqueous solution containing the water or phase stabilizer in a continuous phase
  • the aqueous solution may include the step of supplying the polymer solution in a discontinuous phase.
  • the step is to control the rate of supplying the polymer solution into the discontinuous phase in the micro-conduit for transporting the continuous phase to the size and shape of one or more of the particles of the porous porous microspheres, and pores such as hollow and micro pores It may further comprise the step of adjusting.
  • the step of converting the oily polymer solution contained in the oil in water (O / W) emulsion (emulsion) according to an embodiment of the present invention into O / S (Oil in Solid) microspheres, the film ( Membrane) The step of supplying the polymer solution in the discontinuous phase to the aqueous solution containing the water or phase stabilizer in the aqueous phase in the emulsifying apparatus as a continuous phase.
  • the discontinuous phase is transferred to the conduit through which the continuous phase flows through a membrane having a constant pore size.
  • the step is performed by adjusting the pore size formed in the membrane of the membrane emulsifier. Adjusting the size and shape of one or more of the particles of the hollow porous microspheres, and pores such as hollow and fine pores.
  • microfluidic device or the membrane emulsification device, it is possible to control the size and shape of the microspheres and the particle size distribution of the hollow and the pores when the microspheres are manufactured.
  • the cavity formed in the center of the hollow porous microspheres may have an average diameter of 5 to 150 ⁇ m. If the diameter of the cavity is less than 5 ⁇ m difficult growth of cells, if the diameter of more than 150 ⁇ m microspheres are too weak to be destroyed during in vivo injection.
  • the average diameter of the cavity is 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, 13 ⁇ m or more, 15 ⁇ m or more, 17 ⁇ m or more, 20 ⁇ m or more, 23 ⁇ m or more, 25 ⁇ m or more, 27 ⁇ m or more, 30 ⁇ m or more, 33 At least 35 ⁇ m, at least 35 ⁇ m, at least 37 ⁇ m, at least 40 ⁇ m, at least 43 ⁇ m, at least 45 ⁇ m, at least 48 ⁇ m, at least 50 ⁇ m, at least 60 ⁇ m, at least 70 ⁇ m, at least 80 ⁇ m, at least 90 ⁇ m, at least 100 ⁇ m.
  • the average diameter of the cavity is 150 ⁇ m or less, 140 ⁇ m or less, 130 ⁇ m or less, 120 ⁇ m or less, 110 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 90 ⁇ m or less, 80 ⁇ m or less, 70 ⁇ m or less, 60 ⁇ m or less, 50 ⁇ m 47 ⁇ m or less, 45 ⁇ m or less, 43 ⁇ m or less, 40 ⁇ m or less, 37 ⁇ m or less, 35 ⁇ m or less, 33 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less, 28 ⁇ m or less, 25 ⁇ m or less, 23 ⁇ m or less, 20 ⁇ m or less, It may be 18 ⁇ m or less, 15 ⁇ m or less, 13 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or less, or 5 ⁇ m, but any size may be included without limitation if the skin tissue cells
  • the particles of the hollow porous microspheres included in the composition according to the present invention may have an average diameter of 50 to 200 ⁇ m, it is possible to inject into the skin tissue through injection, the proliferation of skin tissue cells If possible, all of the above ranges may be included.
  • the hollow porous microspheres can be administered through a needle having an inner diameter of 300 ⁇ m or less in the skin tissue by having a small particle size in the above range, so that the existing porous materials have a large particle size You can resolve the shortcomings that had to be implanted by incision.
  • the diameter of the hollow porous microspheres is less than 50 ⁇ m, it is difficult to proliferate the skin tissue cells, and when the diameter is more than 200 ⁇ m, the procedure using the needle is not easy.
  • the average diameter of the hollow porous microsphere particles is 50 ⁇ m or more, 60 ⁇ m or more, 70 ⁇ m or more, 80 ⁇ m or more, 90 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, 110 ⁇ m or more, 120 ⁇ m or more, 130 ⁇ m or more, 140 Or at least 150 ⁇ m, at least 160 ⁇ m, at least 160 ⁇ m, at least 170 ⁇ m, at least 180 ⁇ m, at least 190 ⁇ m, or at least 200 ⁇ m.
  • the average diameter of the hollow porous microsphere particles is 200 ⁇ m or less, 190 ⁇ m or less, 180 ⁇ m or less, 170 ⁇ m or less, 160 ⁇ m or less, 150 ⁇ m or less, 140 ⁇ m or less, 130 ⁇ m or less, 120 ⁇ m or less, 110 ⁇ m Up to 100 ⁇ m, up to 90 ⁇ m, up to 80 ⁇ m, up to 70 ⁇ m, up to 60 ⁇ m or up to 50 ⁇ m.
  • the volume of the hollow porous microspheres may be 20 to 80% by volume relative to the total volume of the hollow porous microspheres. If less than 20% by volume, there is not enough space for the skin tissue cells to proliferate. If the volume is greater than 80% by volume, the thickness of the partition wall becomes too thin, so that the shape of the microspheres may be maintained without collapse. In one embodiment, the thickness of the partition wall may be 1/5 to 1/2 of the total diameter of the hollow porous microspheres.
  • the micropores included in the partition wall of the hollow porous microspheres may have an average diameter of 5 to 50 ⁇ m as an embodiment.
  • the hollow porous microspheres are less than 5 ⁇ m, the skin tissue cells cannot migrate into the microspheres when the hollow porous microspheres are injected into the subcutaneous tissue.
  • the preferred porosity of the hollow porous microspheres may be an average of 20 to 80%.
  • the step of removing the pore-forming substance contained in the porous microspheres is an example of washing the microspheres with water and then lyophilizing to remove the pore-forming substance. It may include.
  • the freeze drying may be vacuum drying.
  • the above-mentioned pore-forming substance used in the present invention maintains a liquid phase at 1 atm and 30 to 150 ° C., and has a boiling point at 1 atm and 250 ° C. or lower, thereby volatilizing the porous microspheres using the hydrophobic biodegradable polymer of the present invention. It does not evaporate or evaporate and remains filled with voids in the porous microspheres. Therefore, the pore stability may be maximized while maintaining the pore forming material, which forms pores in the porous microspheres, until the pore forming material is removed through lyophilization.
  • the manufactured hollow porous microspheres manufactured by the above-described manufacturing method may include: a cavity formed at the center; And a partition wall including micropores surrounding the cavity.
  • an embodiment of the present invention may provide a composition for injection of skin tissue regeneration or skin tissue volume enhancement comprising hollow porous microspheres.
  • cells existing in the living tissue may penetrate into the hollow porous microspheres and grow and divide to form new living tissue.
  • the size and shape of the micropores of the cavity and the partition wall formed in the center of the microsphere can be freely adjusted, and the hollow type Fibroblasts, adipocytes, etc., which are present outside the porous microspheres, may penetrate into the porous microspheres, thereby giving a space for growth and division.
  • the present invention is a technique for producing a scaffold for tissue engineering that can be delivered in biological tissues, such as skin tissue, hollow porous microspheres prepared according to the present invention to improve the skin wrinkles or depressions through skin tissue regeneration In addition, it can be applied to the pharmaceutical industry, such as bone tissue regeneration.
  • the hollow porous microspheres of the present invention may be used for the purpose of aging including skin wrinkles, skin tone improvement or fillers or lifting (lifting) for improving skin elasticity, and tissue regeneration of skin. If it is by, but not limited to this may include all. For example, it may be used for artificial skin, artificial cartilage, bone filler, molded prosthesis, and the like.
  • Hollow porous microspheres according to an embodiment of the present invention were prepared by the following method (see FIG. 1).
  • Step 1 Simple Fluid Device fluidic device
  • a 30 gauge needle turned at 90 ° to a PVC tube, and a micro glass tube was inserted between the needle and the PVC tube to prepare a microfluidic device.
  • the fabricated microfluidic device was filled with a fine gap using an epoxy adhesive.
  • Step 2 Alkanes included PLLA Preparation of the solution
  • PLLA PLLA
  • dichloromethane 34355-0350, Junsei
  • alkanes as pore-forming inducers, specifically Octane , 412236, Sigma-aldrich
  • Undecane Undecane, U407, Sigma-aldrich
  • Tridecane Tridecane, T57401, Sigma-aldrich
  • Pentadecane Pentadecane, 76510, Sigma-aldrich
  • Step 3 Uniform PLLA emulsion Produce
  • the PLLA solution obtained in step 2 was a continuous phase of 2% PVA solution, the flow rate was 1.5 ml per minute, and the PLLA solution containing alkanes was discontinuous phase. Using a 30 gauge syringe needle, the flow rate was 0.1 ml per minute to form an emulsion of a constant size.
  • the emulsion obtained in step 3 was dispersed in a 2% PVA collection phase and stirred at 150 rpm, followed by sufficient volatilization of dichloromethane.
  • Step 5 remove porosity inducing substance to impart porosity
  • the PLLA beads obtained in step 4 were washed several times with distilled water (D.W.), and then sublimated alkanes using a lyophilizer to prepare porous PLLA beads, hollow porous microspheres of uniform size.
  • FIG. 2 Each hollow porous microspheres prepared above are shown in FIG. 2. It can be seen that the cavity is more effectively produced in the center of the microspheres as the content of the pore-forming substance is increased or as the length of the hydrocarbon chain is increased.
  • Hollow porous microspheres according to an embodiment of the present invention were prepared by the following method.
  • Step 1 Simple Fluid Device fluidic device
  • a 30 gauge needle turned at 90 ° to a PVC tube, and a micro glass tube was inserted between the needle and the PVC tube to prepare a microfluidic device.
  • the fabricated microfluidic device was filled with a fine gap using an epoxy adhesive.
  • Step 2 containing vegetable oil PLLA Preparation of the solution
  • Step 3 Uniform PLLA emulsion Produce
  • the PLLA solution obtained in step 2 is a continuous phase of 2% PVA solution, the flow rate is 1.5 ml per minute, and the PLLA solution containing vegetable oil is discontinuous phase.
  • the flow rate was 0.1 ml per minute to form an emulsion of a constant size.
  • Step 4 Uniform PLLA Bead Produce
  • the emulsion obtained in step 3 was dispersed in a 2% PVA collection phase and stirred at 150 rpm, followed by sufficient volatilization of dichloromethane.
  • Step 5 Remove porosity inducing substance to impart porosity
  • step 4 After washing the PLLA beads obtained in step 4 several times with distilled water (DW), the vegetable oil was removed using a lyophilizer to prepare porous PLLA beads as hollow porous microspheres of uniform size .
  • DW distilled water
  • porous pores (small pores: 3 wt%) containing no hollows and porous pores (large pores: containing 6 wt% of tridecanes as alkanes) of Example 1 were each 70.
  • the NIH3T3 fibroblasts were dispersed in culture medium at a concentration of 1 ⁇ 10 3 cells / mL, stirred for 6 hours using a spinner flask, and the porous particles were transferred to a culture plate and cultured.
  • the present invention can provide the following embodiments as an example.
  • the first embodiment is a method for producing hollow porous microspheres, the method comprising: preparing a polymer solution comprising dissolving a pore-forming substance and a hydrophobic biodegradable polymer in a volatile solvent; Dispersing the polymer solution in an aqueous solution containing water or a phase stabilizer to form an emulsion in the form of O / W (Oil in Water); Volatile solvents were volatilized on the aqueous solution in which the polymer solution was dispersed to solidify the hydrophobic biodegradable polymer, thereby causing spontaneous phase separation between the hydrophobic biodegradable polymer and the pore-forming substance to form an emulsion in O / W (Oil in Water) form.
  • a hollow porous microspheres comprising converting the oily polymer solution contained in the emulsion into O / S (Oil in Solid) microspheres; And removing the pore-forming inducing material contained in the hollow porous microspheres, thereby providing a method of manufacturing hollow porous microspheres.
  • the second embodiment can provide a method for producing hollow porous microspheres, in which the pore-forming inducing substance is incompatible with a hydrophobic biodegradable polymer and is a hydrophobic fluid having a lower density than water.
  • the pore-forming substance is at least one selected from the group consisting of alkanes, vegetable oils, and mixtures thereof. It is possible to provide a method for producing porous microspheres.
  • the alkanes are selected from the group consisting of Octane, Undecane, Tridecane, Pentadecane, and mixtures thereof.
  • the vegetable oil may provide at least one selected from the group consisting of soybean oil, corn oil, cottonseed oil, olive oil, grapeseed oil, walnut oil, sesame oil, perilla oil and mixtures thereof, a method for producing hollow porous microspheres. .
  • the oily polymer solution contained in the emulsion in the form of oil in water is O / S (Oil in).
  • Solid) converting the microspheres comprising supplying the polymer solution in a discontinuous phase to the aqueous solution containing the water or phase stabilizer in a continuous phase of the aqueous solution containing the water or phase stabilizer in a microfluidic device It can provide a method for producing hollow porous microspheres.
  • the size and shape of at least one of particles and pores of the hollow porous microspheres are controlled by controlling the rate of supplying the polymer solution to the discontinuous phase in any one or more of the first to fifth embodiments. Further comprising the step, it can provide a method for producing a hollow porous microspheres.
  • the oily polymer solution contained in the emulsion in the form of O / W (Oil in Water) is O / S (Oil in).
  • the step of converting into a microsphere comprising the step of supplying the polymer solution in a discontinuous phase to the aqueous solution containing the water or phase stabilizer in a continuous phase of the aqueous solution containing the water or phase stabilizer in a film emulsifier It can provide a method for producing hollow porous microspheres.
  • the eighth embodiment further includes the step of adjusting the size and shape of at least one of particles and pores of the hollow porous microspheres by adjusting the pore size formed in the membrane of the membrane emulsifying apparatus in the seventh embodiment. It is possible to provide a method for producing porous microspheres.
  • the step of removing the pore-forming substance contained in the microspheres may include lyophilizing the microspheres with water, followed by lyophilization. Comprising a step of removing, it can provide a method for producing a hollow porous microspheres.
  • the hydrophobic biodegradable polymer may include polylactic acid (PLLA), polyglycolic acid (PGA), Polylactic acid-glycolic acid copolymer (poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA), poly- ⁇ - (caprolactone) (Polycaprolactone, PCL), polyanhydrides, polyorthoesters, poly Polyviniyalcohol, polyethyleneglycol, polyurethane, polyacrylic acid, poly-N-isopropyl acrylamide, poly (ethylene oxide) -poly ( Hollow porous microspheres, at least one selected from the group consisting of propylene oxide) -poly ethylene oxide-poly propylene oxide-polyethylene oxide copolymer, copolymers thereof and mixtures thereof It can provide a crude method.
  • the manufactured porous porous microspheres may include a cavity formed at the center; And it may provide a method for producing a hollow porous microspheres comprising a partition wall including the micropores surrounding the cavity.
  • the twelfth embodiment can provide a composition for injection of skin tissue regeneration or skin tissue volume enhancement comprising hollow porous microspheres prepared according to any one or more of the production methods of the first to tenth embodiments.

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Abstract

본 발명은 기공 형성 유도 물질과 소수성 생분해성 고분자를 휘발성 용매에 용해시키는 것을 포함하는 고분자 용액의 제조 단계; 상기 고분자 용액을 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 분산시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)을 형성하는 단계; 상기 고분자 용액이 분산된 수용액 상에서 휘발성 용매를 휘발시켜 상기 소수성 생분해성 고분자를 고형화하여, 소수성 생분해성 고분자와 상기 기공 형성 유도 물질간의 자발적 상분리를 발생시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 것을 포함하는 중공형 다공성 미립구의 제조단계; 및 상기 중공형 다공성 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함하는 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공한다.

Description

중공형 다공성 미립구의 제조방법
본 발명은 피부조직과 같은 생체조직 내에 전달될 수 있는 조직공학용 스케폴더를 제조하는 방법에 관한 것이다.
미용시술을 목적으로 판매되고 있는 미용시술용 의료기기 중 필러(filler)는 주름 및 함몰부위 피부조직에 주입하는 방식으로 사용된다. 대부분의 필러들은 피부조직에 주입되어 그 물질 자체의 부피를 통해 피부 조직의 부피를 증대시키는 방식으로 피부 주름 또는 함몰부위를 개선한다. 현재 가장 많이 사용되는 필러로는 히알루론산과 콜라겐 등의 겔 형태의 무형 물질이 있으나, 시간의 경과에 따라 피부 조직내로 흡수되어 그 미용 시술 효과가 장기간 유지되지 않는다는 문제가 있다.
또한, 미용시술용 의료기기로서 폭넓은 사용범위를 가지기 위해서는 주사를 통해 전달해야 하는데, 기존에 개발된 필러 성분인 다공성 재료들은 크기가 수십 ㎜이상이어서 주사를 통해 피부조직에 이식하는 것이 불가능하고, 오직 피부조직을 절개하는 수술을 통해 피부조직 내에 이식되어야 하는 단점이 있었다.
종래의 상기 다공성 재료 제조방법으로 소수성 생분해성 고분자 미립구에 공극을 형성하기 위한 포로겐(porogen)으로 알지네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin) 과 같은 수용성 고분자 물질을 적용하여, O/W(Oil in Water), W/O(Water in Oil), W/O/W(Water in Oil in Water), 또는 O/W/O(Oil in Water in Oil)와 같은 다중에멀젼 (multi emulsion)을 형성하는 기술이 있다. 그러나 상기 O/W 형태의 공정으로는 큰 기공을 갖는 미립구를 형성하기 어렵다. W/O, W/O/W 및 O/W/O 형태의 공정의 경우 이중 유화공정이 필요하고, 이중유화를 안정화하기 위한 내부 상안정화제와 외부 상안정화제가 동시에 요구된다. 또한 제조되는 미립자의 비중이 물보다 무거워, 침전된 미립자를 수득하기 위해서는 필터링 공정이 별도로 필요하다는 단점이 있다. 또한 제조공정이 복잡하고 제어할 인자가 많아 회분식 반응공정에 의해 제조가 이루어지므로 생산효율이 떨어지며, 미립구에 형성되는 공극의 균일성이 낮고, 공정 중 손실율이 높아 산업적 응용이 어렵다는 문제가 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국공개특허공보 제2011-0075618호
본 발명의 목적은 피부조직과 같은 생체조직 내에 전달될 수 있는 조직공학용 스케폴더를 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 구체적으로, 공정이 단순하면서도 다공성 미립구의 공극율 및 공극의 형태를 용이하게 조절할 수 있어, 주사를 통해 피부 조직내로 주입할 수 있고, 상기 다공성 미립구내에서 세포를 증식시켜 피부조직의 부피를 증대시킬 수 있는 다공성 미립구의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 관점은 중공형 다공성 미립구의 제조방법으로,
기공 형성 유도 물질과 소수성 생분해성 고분자를 휘발성 용매에 용해시키는 것을 포함하는 고분자 용액의 제조 단계;
상기 고분자 용액을 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 분산시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)을 형성하는 단계;
상기 고분자 용액이 분산된 수용액 상에서 휘발성 용매를 휘발시켜 상기 소수성 생분해성 고분자를 고형화하여, 소수성 생분해성 고분자와 상기 기공 형성 유도 물질간의 자발적 상분리를 발생시켜 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 중공형 다공성 미립구의 제조단계; 및
상기 중공형 다공성 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함하는,
중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은 다공성 미립구에 포함되는 소수성 생분해성 고분자와 기공 형성 유도 물질과의 자발적 상분리로 인해 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구 형태의 구조로 손쉽게 구현할 수 있어 이중유화형태의 미립구 제조시 요구되는 내부상 안정화제를 첨가하지 않고 제조할 수 있으며, 이로 인한 내부상 안정화제 제거를 위한 세척공정을 고려할 필요가 없다. 따라서, 종래 친수성 기공 형성 유도 물질을 사용하여, 별도의 1차 및 2차 유화 공정 통해 W/O/W나 O/W/O 방식으로 제조했던 기술보다 생산공정을 단순화시킬 수 있다.
본 발명은 미립구내 공극율 및 공극의 형태 및 크기를 용이하게 조절할 수 있어, 미립구내 피부 조직 세포가 증식할 수 있는 중공 및 이를 둘러싼 격벽에 포함되는 미세기공들을 제조하는 것이 가능하고, 기공 균일도가 우수하다.
이와 같이 상기 본 발명의 제조방법에 따르면 중공형 다공성 미립구는 입자 내 중앙에 형성된 거대공동과 미세기공을 격벽을 포함하는 이중 구조를 가지므로, 생체 내 피부 조직세포가 채널로 상기 미세기공을 이용하여 상기 중공형 다공성 미립구 안으로 용이하게 이동할 수 있으며, 상기 거대공동 내에서 상기 이동한 피부 조직 세포가 효과적으로 증식할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 중공형 다공성 미립구를 제조하는 방법에 대한 개략적인 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 중공형 다공성 미립구 제조 시 포로겐의 종류 및 함량에 따른 입자 표면과 절편의 전자주사현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 중공형 다공성 미립구에서 섬유아세포를 배양한 Live/dead 염색 공초점현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 중공형 다공성 미립구에서 섬유아세포를 배양한 후 MTT assay를 통해 세포 성장률을 나타낸 도이다.
본 명세서에서 "평균 직경"은 대상의 횡단면의 양끝을 잇는 선분인 지름을 평균한 값을 의미하며, 예를 들면 본 발명의 공동의 경우 중공형 다공성 미립구내 형성되는 공동이 정 구형이 아닐 때 상기 공동 자체가 갖는 지름의 평균값을 의미할 수 있다. 또는 복수 개의 미립구내에 존재하는 각 공동들의 지름의 평균값을 의미할 수도 있다. 미세기공의 경우, 미세기공 자체가 정 구형이 아닐 때 상기 미세기공 자체가 갖는 지름의 평균값 또는 복수 개의 미세기공의 직경들의 평균값을 의미할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기공 형성 유도 물질과 소수성 생분해성 고분자를 휘발성 용매에 용해시키는 것을 포함하는 고분자 용액의 제조 단계; 상기 고분자 용액을 물 또는 상안정화제(phase stabilizer)를 포함하는 수용액에 분산시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)을 형성하는 단계; 상기 고분자 용액이 분산된 수용액 상에서 휘발성 용매를 휘발시켜 상기 소수성 생분해성 고분자를 고형화하여, 소수성 생분해성 고분자와 상기 기공 형성 유도 물질간의 자발적 상분리가 발생하여 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 중공형 다공성 미립구의 제조단계; 및 상기 중공형 다공성 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공한다.
종래 다공성 미립구를 제조하기 위한 기술로 적용되어온 다중에멀젼 형성기술, 즉 다중 유화 기술에서는 소수성 생분해성 고분자를 포함하는 오일상을 연속상으로 하고, 공극을 형성하기 위한 기공 형성 유도 물질을 함유하는 수상을 불연속상으로 적용하여 1차 에멀젼을 형성하여야 한다. 이때 제조되는 1차 에멀젼 내 불연속상의 크기와 분포를 균일하게 만들기 위하여는 지속적인 교반과 온도조절이 필수적이었다. 하지만, 본 발명의 일 실시예들에 따르면 소수성 생분해성 고분자와 공극 및 기공 형성 유도 물질이 동일한 용매에 용해되므로, 별도의 조작없이 조성균일성과 조성안정성을 확보할 수 있다.
또한, 종래 다중 에멀젼 형성기술에서는 2차 에멀젼을 형성시킨 후 2차 에멀젼 내 불연속상의 크기와 형태 균일성을 유지하기 위한 교반과 온도유지는 가능하지만, 2차 에멸전 내에 형성된 불연속상 내 불연속상, 즉 수용성 고분자와 같은 기공 형성 유도 물질을 포함한 수용액의 크기와 분포를 소수성 생분해성 고분자가 고형화되어 안정화될 때까지 제어할 수 있는 수단이 없다는 문제가 있다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따르면 기공 형성 유도 물질로 소수성 생분해성 고분자와 상용성이 없고 밀도가 물보다 낮은 소수성 유체를 사용하므로, 고분자 용액 내의 휘발성 용매가 제거되면 소수성 생분해성 고분자는 고형화되고, 소수성 생분해성 고분자와 상용성이 없는 소수성이며 액상인 기공 형성 유도 물질은 자연스럽게 상분리되어 소수성 생분해성 고분자로 구성된 미립구 내에 공극을 형성하게 된다. 따라서, 별도의 조작없이도 소수성 생분해성 고분자가 고형화되기 전 용액상을 유지하므로 조성 균일성을 확보할 수 있으며, 수소성 생분해성 고분자가 고형화되면 소수성 생분해성 고분자가 갖는 강도에 의해 공극 균일성과 안정성을 확보할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 기공 형성 유도 물질은 소수성 생분해성 고분자와 상용성이 없고, 밀도가 물보다 낮은 소수성 유체를 포함할 수 있다. 상기 기공 형성 유도 물질은 포로겐(porogen)이라고도 한다. 상기 기공 형성 유도 물질은 소수성 생분해성 고분자와 상용성이 없고, 밀도가 물보다 낮은 소수성 유체라면 제한되지 않고 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 기공 형성 유도 물질은 1atm에서 250℃ 이하에서 끓는 점을 갖는 물질일 수 있으며, 1atm, 30 내지 150℃에서 액상인 물질일 수 있다. 예를 들어, 상기 기공 형성 유도 물질은 알케인(alkane) 류, 식물성 기름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 실시예로서 상기 알케인류는 옥테인(Octane), 운데케인(Undecane), 트리데케인(Tridecane), 펜타데케인(Pentadecane) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 식물성 기름은 콩기름, 옥수수기름, 면실유, 올리브유, 포도씨유, 호두기름, 참기름, 들기름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 구체적인 물질들 외에 다른 물질을 적용하여 기공을 형성할 수도 있으며, 일 실시예로서, 본 발명은 상기 중공형 다공성 미립구의 제조시 기공을 형성하는 포로겐의 농도 및 종류에 따라 중공 및 미세기공의 크기와 형태를 조절할 수 있으며, 기공 균일도도 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 기공 형성 유도 물질은 고분자 용액 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%, 보다 구체적으로는 1 내지 10 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 소수성 생분해성 고분자는 폴리락트산(Poly-L-Lactic Acid, PLLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(Polycaprolactone, PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(Poly-N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체(poly ethylene oxide)-poly propylene oxide-poly ethylene oxide copolymer), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 피부 조직 내에 주입되었을 때 안전하면서 분해 가능한 것이라면 이에 제한되지 않고 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 단계는, 상기 물 또는 상안정화제(phase stabilizer)를 포함하는 수용액을 연속상(continuous phase)으로 하여 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 상기 고분자 용액을 불연속상(discontinuous phase)으로 공급하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 상안정화제를 포함하는 수용액은 계면을 안정화시키는 물질들을 포함하는 수용액으로, 예를 들어 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol, PVA), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinyl pirrolidone), 폴리에틸렌글리콜-co-폴리프로필렌글리콜(polyethylene glycol-co-polyproplene glycol), 폴리에틸렌글리콜-co-폴리프로필렌글리콜-co-폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-co-polyproplene glycol- co-polyethylene glycol), 폴리에틸렌글리콜-co-폴리락틱산(polyethylene glycol-co-polylactic acid) 및 폴리에틸렌글리콜-co-폴리락타이드-폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-co-polylactic acid-co- polyethylene glycol) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 상안정화제가 용해된 수용액이다.
구체적으로, 상기 고분자 용액을 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 분산시키는 단계는 일 실시예로서 미세유체장치에 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액을 연속상으로 하여 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 단계는 상기 연속상을 이송하는 미세도관내에 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 속도를 조절하여 중공형 다공성 미립구의 입자 및, 중공 및 미세 기공과 같은 기공 중 하나 이상의 크기 및 형태를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또는, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 단계는, 막(membrane) 유화장치에 상기 수용성 용액을 연속상으로 하여 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 단계를 포함할 수 있다. 미세유체장치에서 사용하는 미세도관 대신 공극의 크기가 일정한 막(membrane)을 통해 불연속상을 연속상이 흐르는 도관으로 이송하는 것으로, 이때, 상기 단계는 상기 막 유화장치의 막에 형성된 공극 크기를 조절하여 중공형 다공성 미립구의 입자 및, 중공 및 미세 기공과 같은 기공 중 하나 이상의 크기 및 형태를 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 미세유체장치 또는 막유화장치를 이용하면 미립구 제조 시 미립구의 크기와 형태, 중공 및 기공의 입도 분포를 제어할 수 있다.
일 실시예로서 상기 중공형 다공성 미립구의 중앙에 형성된 공동은 5 내지 150 ㎛의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 공동의 직경이 5㎛ 미만이면 세포의 성장이 어려우며, 150 ㎛ 초과이면 미립구의 강도가 너무 약해 생체 내 주입 시 파괴될 수 있다. 구체적으로, 상기 공동의 평균 직경은 5 ㎛ 이상, 10 ㎛ 이상, 13 ㎛ 이상, 15 ㎛ 이상, 17 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상, 23 ㎛ 이상, 25 ㎛ 이상, 27 ㎛ 이상, 30 ㎛ 이상, 33 ㎛ 이상, 35 ㎛ 이상, 37 ㎛ 이상, 40 ㎛ 이상, 43 ㎛ 이상, 45 ㎛ 이상, 48 ㎛ 이상, 50 ㎛ 이상, 60㎛ 이상, 70㎛ 이상, 80㎛ 이상, 90㎛ 이상, 100㎛ 이상, 110㎛ 이상, 120㎛ 이상, 130㎛ 이상, 140㎛ 이상 또는 150㎛일 수 있다. 또한, 상기 공동의 평균 직경은 150 ㎛ 이하, 140 ㎛ 이하, 130 ㎛ 이하, 120 ㎛ 이하, 110 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이하, 90 ㎛ 이하, 80 ㎛ 이하, 70 ㎛ 이하, 60 ㎛ 이하, 50 ㎛ 이하, 47 ㎛ 이하, 45 ㎛ 이하, 43 ㎛ 이하, 40㎛ 이하, 37 ㎛ 이하, 35 ㎛ 이하, 33 ㎛ 이하, 30 ㎛ 이하, 28 ㎛ 이하, 25 ㎛ 이하, 23 ㎛ 이하, 20 ㎛ 이하, 18 ㎛ 이하, 15 ㎛ 이하, 13 ㎛ 이하, 10 ㎛ 이하 또는 5 ㎛ 일 수 있으나, 피부 조직 세포의 증식이 가능한 크기라면 상기 크기에 제한되지 않고 모두 포함할 수 있다.
일 실시예로서, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 상기 중공형 다공성 미립구의 입자는 50 내지 200㎛의 평균 직경을 가질 수 있으나, 주사를 통해 피부 조직내 주입이 가능하고, 피부 조직 세포의 증식이 가능하다면 상기 범위에 제한되지 않고 모두 포함될 수 있다. 상기 중공형 다공성 미립구는 상기와 같은 범위의 작은 입자크기를 가짐으로써 피부 조직 내에 내경이 300 ㎛ 이하의 내경을 갖는 주사바늘을 통해 투여될 수 있어, 기존의 다공성 재료들이 큰 입자 크기로 인해 피부조직을 절개하여 이식되어야 했던 단점을 해결할 수 있다. 상기 중공형 다공성 미립구의 직경이 50 ㎛ 미만이면 피부 조직 세포의 증식이 어려우며, 200 ㎛ 초과이면 주사바늘을 이용한 시술이 용이하지 않다. 구체적으로, 상기 중공형 다공성 미립구 입자의 평균 직경은 50 ㎛ 이상, 60 ㎛ 이상, 70㎛ 이상, 80 ㎛ 이상, 90 ㎛ 이상, 100 ㎛ 이상, 110 ㎛ 이상, 120 ㎛ 이상, 130 ㎛ 이상, 140 ㎛ 이상, 150 ㎛ 이상, 160 ㎛ 이상, 170 ㎛ 이상, 180 ㎛ 이상, 190 ㎛ 이상 또는 200 ㎛ 일 수 있다. 또한, 상기 중공형 다공성 미립구 입자의 평균 직경은 200 ㎛ 이하, 190 ㎛ 이하, 180 ㎛ 이하, 170 ㎛ 이하, 160 ㎛ 이하, 150 ㎛ 이하, 140 ㎛ 이하, 130 ㎛ 이하, 120 ㎛ 이하, 110 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이하, 90 ㎛ 이하, 80 ㎛ 이하, 70 ㎛ 이하, 60 ㎛ 이하 또는 50㎛일 수 있다.
일 실시예로서, 상기 중공형 다공성 미립구의 공동의 부피는 상기 중공형 다공성 미립구 전체 부피에 대하여 20 내지 80 부피%일 수 있다. 상기 20 부피% 미만일 경우 피부 조직 세포가 증식할 공간이 충분하지 않으며, 80 부피% 초과일 경우, 격벽의 두께가 너무 얇아지므로 미립구의 형태가 유지되지 않고 무너질 수 있다. 일 실시예로서 상기 격벽의 두께는 상기 중공형 다공성 미립구 전체 직경의 1/5 내지 1/2일 수 있다.
구체적으로, 상기 중공형 다공성 미립구의 격벽에 포함되는 미세기공은 일 실시예로서 5 내지 50 ㎛의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 5 ㎛ 미만이면 상기 중공형 다공성 미립구를 피하조직에 주입하였을 때 피부 조직 세포가 미립구 내부로 이동할 수 없으며, 상기 50 ㎛ 초과이면 격벽내 기공이 차지하는 부피가 증가하여 미립구의 형태가 유지되기 어렵다.
예를 들어, 상기 중공형 다공성 미립구의 바람직한 공극율은 평균 20 내지 80%일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 다공성 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계는 일 실시예로서 상기 미립구를 물로 세척한 후 동결건조시켜 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 동결건조는 진공건조일 수 있다. 본 발명에서 사용하는 상술된 기공 형성 유도 물질은 1atm, 30 내지 150℃에서 액상을 유지하고, 1atm, 250℃ 이하에서 끓는점을 가지고 있어, 본 발명의 소수성 생분해성 고분자를 이용한 다공성 미립구 제조공정 중 휘발되거나 증발되지 않고 다공성 미립구내에 공극을 채운 상태로 남아있게 된다. 따라서, 상기와 같이 기공 형성 유도 물질을 동결건조를 통해 제거하기 전까지 다공성 미립구내에 공극을 형성한 기공 형성 유도 물질이 유지되면서 공극안정성을 극대화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 상술된 제조방법으로 제조된 상기 제조되는 중공형 다공성 미립구는, 중앙에 형성된 공동; 및 상기 공동을 둘러싸는 미세기공을 포함하는 격벽을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예는 중공형 다공성 미립구를 포함하는 피부 조직 재생 또는 피부 조직 볼륨 증진 주사용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 본 발명의 일 실시예들에 따른 중공형 다공성 미립구를 주사용 조성물에 포함하여 피부 조직 내로 주입하면, 생체 내 피부 조직 세포가 상기 미세기공을 통해 상기 중공형 다공성 미립구 안으로 이동하고, 중앙의 공동에서 상기 이동한 피부 조직 세포가 증식하여 피부 조직 세포가 증식하여 피부 조직을 재생시키거나 볼륨을 증진시킬 수 있다. 즉, 생체조직 내에 존재하는 세포들이 상기 중공형 다공성 미립구 내에 침투하고, 성장 분열하여 신규 생체조직을 형성할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 공극 및 기공 형성 유도 물질과 소수성 생분해성 고분자의 혼합비를 조절함으로써 미립구 중앙에 형성되는 공동의 및 격벽의 미세 기공의 크기와 형태를 자유롭게 조절할 수 있어, 상기 중공형 다공성 미립구 외부에 존재하는 섬유아세포, 지방세포 등이 다공성 미립구 내로 침투한 후, 성장하고 분열할 수 있는 공간을 부여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면 일정 기간 경과 후 상기 중공형 다공성 미립구가 피부 내에서 생분해된 후에도 상기 새롭게 증식된 피부 조직 세포가 그 부피를 유지하므로, 피부 주름 또는 피부 함몰 부위 등의 피부 조직 볼륨 증진 효과를 증대시킬 뿐만아니라 그 효과를 안전하고 오랫동안 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명은 피부조직과 같은 생체조직 내에 전달될 수 있는 조직공학용 스케폴더를 제조하는 기술로서, 상기 본 발명에 따라 제조된 중공형 다공성 미립구는 피부 조직 재생을 통하여 피부 주름 또는 함몰부위의 개선뿐만 아니라, 뼈 조직의 재생과 같은 의약 산업에도 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상기 중공형 다공성 미립구는 피부 주름을 포함하는 노화 개선, 피부 톤 개선 또는 피부 탄력 개선용 필러(filler) 또는 리프팅(lifting) 등을 목적으로 사용될 수 있으나, 피부의 조직 재생에 의한 것이라면 이에 제한되지 않고 모두 포함될 수 있다. 예를 들면, 인공피부, 인공연골, 뼈 충진제, 성형 보형물 등에 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 중공형 다공성 미립구 제조 1
본 발명의 일 실시예에 따른 중공형 다공성 미립구를 하기의 방법으로 제조하였다(도 1 참조).
단계 1: 미세 유체 장치(simple fluidic device)의 제작
PVC 튜브에 90°로 꺾은 30 게이지 주사바늘을 넣고, 주사바늘과 PVC 튜브 사이에 미세 유리관을 삽입하여 미세 유체 장치를 제작했다. 제작된 미세 유체 장치는 에폭시접착제를 이용하여 미세한 틈새를 메웠다.
단계 2: 알케인류가 포함된 PLLA 용액의 제조
소수성 생분해성 고분자로 PLLA (RESOMER LR 704S, Evonik Industries AG) 0.1 g, 휘발성 용매로 디클로로메탄(Dichloromethane; 34355-0350, Junsei) 10 g, 기공 형성 유도물질로 알케인류 물질, 구체적으로 옥테인(Octane, 412236, Sigma-aldrich) 또는 운데케인(Undecane, U407, Sigma-aldrich) 또는 트리데케인(Tridecane, T57401, Sigma-aldrich) 또는 펜타데케인(Pentadecane, 76510, Sigma-aldrich)을 각각 0.1g, 0.3g 및 0.6g 섞어 소수성 생분해성 고분자 (PLLA) 용액을 제조하였다.
단계 3: 균일한 PLLA 에멀젼 제조
상기 단계 2에서 얻은 PLLA 용액을 미세 유체 장치를 이용하여 2% PVA용액을 연속상(continuous phase)으로 하여 그 유속을 분당 1.5 ml로 하고, 알케인류가 포함된 PLLA 용액을 비연속상(discontinuous phase)으로 하여 30 게이지 주사기 바늘을 이용, 유속을 분당 0.1 ml로 하여 일정한 크기의 에멀젼이 형성되게 하였다.
단계 4: 균일한 중공형 다공성 미립구의 제조
상기 단계 3에서 얻은 에멀젼을 2% PVA 수집상(collection phase)에 분산시켜 150 rpm으로 교반시킨 후, 디클로로메탄을 충분히 휘발시켰다.
단계 5: 기공 형성 유도 물질을 제거하여 다공성 부여
상기 단계 4에서 얻은 PLLA 비드를 증류수(D.W.)로 수차례 세척 후, 동결건조기를 이용하여 알케인류를 승화시켜 균일한 크기의 중공형 다공성 미립구인 다공성 PLLA 비드를 제조하였다.
상기 제조된 각 중공형 다공성 미립구를 도 2에 나타내었다. 기공 형성 유도 물질의 함량이 증가함에 따라, 또는 탄화수소 사슬의 길이가 길어짐에 따라 미립구 중앙에 공동이 더 효과적으로 제조됨을 확인할 수 있다.
[실시예 2] 중공형 다공성 미립구 제조 2
본 발명의 일 실시예에 따른 중공형 다공성 미립구를 하기의 방법으로 제조하였다.
단계 1: 미세 유체 장치(simple fluidic device)의 제작
PVC 튜브에 90°로 꺾은 30 게이지 주사바늘을 넣고, 주사바늘과 PVC 튜브 사이에 미세 유리관을 삽입하여 미세 유체 장치를 제작했다. 제작된 미세 유체 장치는 에폭시접착제를 이용하여 미세한 틈새를 메웠다.
단계 2: 식물성 기름이 포함된 PLLA 용액의 제조
소수성 생분해성 고분자로 PLLA (RESOMER LR 704S, Evonik Industries AG) 0.1 g을 Dichloromethane (34355-0350, Junsei) 10 g, 기공 형성 유도 물질로 면실유 또는 콩기름을 각각 0.5g에 섞어 소수성 생분해성 고분자 (PLLA) 용액을 제조하였다.
단계 3: 균일한 PLLA 에멀젼 제조
상기 단계 2에서 얻은 PLLA 용액을 미세 유체 장치를 이용하여 2% PVA용액을 연속상(continuous phase)으로 하여 그 유속을 분당 1.5 ml로 하고, 식물성 기름이 포함된 PLLA용액을 비연속상(discontinuous phase)으로 하여 30 게이지 주사기 바늘을 이용, 유속을 분당 0.1 ml로 하여 일정한 크기의 에멀젼이 형성되게 하였다.
단계 4: 균일한 PLLA 비드의 제조
상기 단계 3에서 얻은 에멀젼을 2% PVA 수집상(collection phase)에 분산시켜 150 rpm으로 교반시킨 후, 디클로로메탄(Dichloromethane)을 충분히 휘발시켰다.
단계 5: 내부 기공 형성 유도 물질을 제거하여 다공성 부여
상기 단계 4에서 얻은 PLLA 비드를 증류수(D.W.)로 수차례 세척 후, 동결건조기를 이용하여 식물성 기름을 제거하여 균일한 크기의 중공형 다공성 미립구인 다공성 PLLA 비드를 제조하였다.
[시험예 1] 피부 조직 세포의 배양
본 발명의 일 실시예에 따른 중공형 다공성 미립구의 중공 형성 여부에 따른 세포 이동성 및 증식 효능을 비교하기 위한 실험을 하기와 같이 진행하였다.
비교예로서 중공을 포함하지 않는 다공성 미립구(small pores: 트리데케인 3wt%) 및 상기 실시예 1의 중공을 포함하는 다공성 미립구(Large pores: 알케인류로 트리데케인을 6wt% 포함)를 각각 70% 에탄올에 멸균처리 후, PBS로 충분히 세척하여 NIH3T3 섬유아세포를 이식하여 세포 증식 거동을 관찰하였다. NIH3T3 섬유아세포를 1 x 103 cells/mL농도로 배양배지에 분산시켜 스피너 플라스크(spinner flask)를 이용하여 6시간 교반 후, 다공성 입자를 배양용기(culture Plate)에 옮겨 배양하였다. 세포배양 1, 3, 7, 10 일차에 상기 배양한 각 다공성 미립구 입자를 LIVE/DEAD 염색한 후, 세포 부착 및 증식 유무를 공초점현미경과 MTT assay를 통해 확인하였다. 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 중공을 포함하는 중공형 다공성 미립구(Large pores)가 중공을 포함하지 않고 미세기공만을 포함하는 다공성 미립구(Small pores)에 비해 내부 기공으로의 NIH3T3 섬유아세포 침투 및 증식이 10일차까지 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있다. 이는 다공성 미립구내 포함된 중공이 세포 침투 및 증식에 있어 큰 효과가 있음을 의미한다.
본 발명은 일 실시예로서 다음의 실시형태들을 제공할 수 있다.
제1실시형태는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법으로, 기공 형성 유도 물질과 소수성 생분해성 고분자를 휘발성 용매에 용해시키는 것을 포함하는 고분자 용액의 제조 단계; 상기 고분자 용액을 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 분산시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)을 형성하는 단계; 상기 고분자 용액이 분산된 수용액 상에서 휘발성 용매를 휘발시켜 상기 소수성 생분해성 고분자를 고형화하여, 소수성 생분해성 고분자와 상기 기공 형성 유도 물질간의 자발적 상분리를 발생시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 것을 포함하는 중공형 다공성 미립구의 제조단계; 및 상기 중공형 다공성 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제2실시형태는, 제1실시형태에 있어서 상기 기공 형성 유도 물질은 소수성 생분해성 고분자와 상용성이 없고, 밀도가 물보다 낮은 소수성 유체인, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제3실시형태는, 제1실시형태 및 제2실시형태 중 어느 하나 이상에 있어서 상기 기공 형성 유도 물질은 알케인(alkane)류, 식물성 기름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제4실시형태는, 제3실시형태에 있어서 상기 알케인류는 옥테인(Octane), 운데케인(Undecane), 트리데케인(Tridecane), 펜타데케인(Pentadecane) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 식물성 기름은 콩기름, 옥수수기름, 면실유, 올리브유, 포도씨유, 호두기름, 참기름, 들기름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제5실시형태는, 제1실시형태 내지 제4실시형태 중 어느 하나 이상에 있어서 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 단계는, 미세유체장치에 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액을 연속상으로 하여 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제6실시형태는, 제1실시형태 내지 제5실시형태 중 어느 하나 이상에 있어서 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 속도를 조절하여 중공형 다공성 미립구의 입자 및 기공 중 하나 이상의 크기 및 형태를 조절하는 단계를 더 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제7실시형태는, 제1실시형태 내지 제6실시형태 중 어느 하나 이상에 있어서 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 단계는, 막 유화장치에 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액을 연속상으로 하여 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제8실시형태는, 제7실시형태에 있어서 상기 막 유화장치의 막에 형성된 공극 크기를 조절하여 중공형 다공성 미립구의 입자 및 기공 중 하나 이상의 크기 및 형태를 조절하는 단계를 더 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제9실시형태는, 제1실시형태 내지 제8실시형태 중 어느 하나 이상에 있어서 상기 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계는, 상기 미립구를 물로 세척한 후 동결건조시켜 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제10실시형태는, 제1실시형태 내지 제9실시형태 중 어느 하나 이상에 있어서 상기 소수성 생분해성 고분자는 폴리락트산(Poly-L-Lactic Acid, PLLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(Polycaprolactone, PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(Poly-N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체(poly ethylene oxide)-poly propylene oxide-poly ethylene oxide copolymer), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제11실시형태는, 제1실시형태 내지 제10실시형태 중 어느 하나 이상에 있어서 상기 제조되는 중공형 다공성 미립구는, 중앙에 형성된 공동; 및 상기 공동을 둘러싸는 미세기공을 포함하는 격벽을 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법을 제공할 수 있다.
제12실시형태는, 제1실시형태 내지 제10실시형태 중 어느 하나 이상의 제조방법에 따라 제조된 중공형 다공성 미립구를 포함하는 피부 조직 재생 또는 피부 조직 볼륨 증진 주사용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 실시형태들은 본 발명의 설명을 위해 개시되었으며, 상기 설명은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 따라서, 본 발명의 의미 및 범위를 벗어나지 않는 한, 다양한 수정, 변형, 및 대체가 당해 기술분야의 통상의 기술자에게서 발생될 수 있다.

Claims (12)

  1. 중공형 다공성 미립구의 제조방법으로,
    기공 형성 유도 물질과 소수성 생분해성 고분자를 휘발성 용매에 용해시키는 것을 포함하는 고분자 용액의 제조 단계;
    상기 고분자 용액을 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 분산시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)을 형성하는 단계;
    상기 고분자 용액이 분산된 수용액 상에서 휘발성 용매를 휘발시켜 상기 소수성 생분해성 고분자를 고형화하여, 소수성 생분해성 고분자와 상기 기공 형성 유도 물질간의 자발적 상분리를 발생시켜 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 것을 포함하는 중공형 다공성 미립구의 제조단계; 및
    상기 중공형 다공성 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함하는,
    중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기공 형성 유도 물질은 소수성 생분해성 고분자와 상용성이 없고, 밀도가 물보다 낮은 소수성 유체인, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 기공 형성 유도 물질은 알케인(alkane)류, 식물성 기름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 알케인류는 옥테인(Octane), 운데케인(Undecane), 트리데케인(Tridecane), 펜타데케인(Pentadecane) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
    상기 식물성 기름은 콩기름, 옥수수기름, 면실유, 올리브유, 포도씨유, 호두기름, 참기름, 들기름 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인,
    중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 단계는, 미세유체장치에 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액을 연속상으로 하여 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 속도를 조절하여 중공형 다공성 미립구의 입자 및 기공 중 하나 이상의 크기 및 형태를 조절하는 단계를 더 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 O/W(Oil in Water) 형태의 에멀젼(emulsion)에 포함된 오일상 고분자 용액을 O/S(Oil in Solid) 미립구로 변환시키는 단계는, 막 유화장치에 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액을 연속상으로 하여 상기 물 또는 상안정화제를 포함하는 수용액에 상기 고분자 용액을 불연속상으로 공급하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 막 유화장치의 막에 형성된 공극 크기를 조절하여 중공형 다공성 미립구의 입자 및 기공 중 하나 이상의 크기 및 형태를 조절하는 단계를 더 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미립구에 포함된 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계는, 상기 미립구를 물로 세척한 후 동결건조시켜 기공 형성 유도 물질을 제거하는 단계를 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 소수성 생분해성 고분자는 폴리락트산(Poly-L-Lactic Acid, PLLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(Polycaprolactone, PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(Poly-N-isopropyl acrylamide), 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체(poly ethylene oxide)-poly propylene oxide-poly ethylene oxide copolymer), 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조되는 중공형 다공성 미립구는,
    중앙에 형성된 공동; 및 상기 공동을 둘러싸는 미세기공을 포함하는 격벽을 포함하는, 중공형 다공성 미립구의 제조방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 중공형 다공성 미립구를 포함하는 피부 조직 재생 또는 피부 조직 볼륨 증진 주사용 조성물.
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