WO2017014162A1 - アミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬・予防薬および治療用・予防用食品組成物 - Google Patents

アミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬・予防薬および治療用・予防用食品組成物 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an amyloid ⁇ fibril degrading agent, a therapeutic / prophylactic agent for a disease caused by fibrosis of amyloid ⁇ , and a therapeutic / preventive food composition.
  • Amyloid ⁇ (also referred to as amyloid ⁇ protein or amyloid ⁇ peptide) is a protein consisting of about 40 amino acids. In the brain of Alzheimer's disease patients, amyloid ⁇ fibers aggregated and fibrillated accumulate. I know that Amyloid ⁇ is a water-soluble protein that is released outside the cell and is not toxic to nerve cells. However, amyloid ⁇ is toxic to neurons only by forming amyloid ⁇ fibrils (for example, patents). Reference 1), accumulation of amyloid ⁇ fibrils is considered to be one of the causes of Alzheimer's disease.
  • amyloid ⁇ 40 having a C residue consisting of 40 residues and Val having a C terminal consisting of 40 residues and amyloid ⁇ 42 having a C terminal consisting of 42 residues are known.
  • ⁇ 40 is produced nearly 10 times more than amyloid ⁇ 42 (Non-patent Document 1). It is known that amyloid ⁇ 42 is highly aggregated and accumulates preferentially in the brain of Alzheimer's disease patients from the beginning. Further, as gene mutations related to familial Alzheimer's disease, mutations such as the Egyptian mutation (T714A) present in the precursor protein (APP) of amyloid ⁇ aggregated without significantly affecting the total production of amyloid ⁇ .
  • T714A Japanese mutation
  • APP precursor protein
  • Patent Document 2 describes an amyloid ⁇ protein production / secretion inhibitor containing vinpocetine and its derivatives.
  • Patent Document 3 describes a peptide that can inhibit fibrosis of amyloid ⁇ peptide.
  • earthworm extract and earthworm dry powder have been used as preventive and therapeutic agents for various diseases mainly in Eastern countries since ancient times, and so far, calculus reducing agent and elimination accelerator for bladder, treatment for jaundice, delivery Use as an accelerator, a tonic, a hair-growth agent, a tonic, an antipyretic agent, a curative treatment agent, a blood circulation promoter, a half-body involuntary treatment agent, an indirect analgesic agent, a urinating agent, a bronchial asthma agent, and a hypertension treatment agent is known.
  • an accelerator a tonic, a hair-growth agent, a tonic, an antipyretic agent, a curative treatment agent, a blood circulation promoter, a half-body involuntary treatment agent, an indirect analgesic agent, a urinating agent, a bronchial asthma agent, and a hypertension treatment agent is known.
  • an indirect analgesic agent a urinating agent
  • bronchial asthma agent a
  • an object of the present invention is to provide an amyloid ⁇ -fibrinolytic agent containing a natural product as an active ingredient, a therapeutic or preventive agent for a disease caused by fibrillation of amyloid ⁇ , a treatment for a disease caused by fibrillation of amyloid ⁇ , or It is to provide a food composition for prevention.
  • amyloid ⁇ fibril degrading agent of the present invention is characterized by containing a dry earthworm powder, a ground product and / or an extract as an active ingredient.
  • the therapeutic or preventive agent for a disease caused by amyloid ⁇ fibrosis comprises the amyloid ⁇ fibril degrading agent.
  • the food composition for treating or preventing a disease caused by amyloid ⁇ fibrosis comprises the amyloid ⁇ fibril degrading agent.
  • the disease caused by amyloid ⁇ fibrosis is preferably Alzheimer's disease.
  • the disease caused by fibrosis of amyloid ⁇ is preferably Alzheimer's disease.
  • the method for producing an amyloid ⁇ fibril degrading agent of the present invention is characterized by using a dry earthworm powder, a ground product and / or an extract.
  • raw earthworms are brought into contact with at least one metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium, and thereafter, powdered hydroxycarboxylic acid and raw Contact with earthworm, adjust to pH 2-5 by dilution with water, hold for 3-180 minutes, wash raw earthworm with water, grind, and freeze-dry the obtained ground product with water or ethanol It is preferable to provide a step of dissolving or removing the insoluble fraction in an aqueous solution.
  • metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium
  • the raw earthworm is brought into contact with at least one metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium, and then the raw earthworm is adjusted to pH 2-5. After immersing in the prepared hydroxycarboxylic acid aqueous solution and holding for 3 to 180 minutes, the raw earthworms are washed with water and ground, and the resulting ground product is freeze-dried and dissolved in water or an aqueous ethanol solution. It is preferable to provide the process of removing or separating a part.
  • the method for producing a therapeutic or prophylactic agent for a disease caused by amyloid ⁇ fibrosis is characterized by using a dry earthworm powder, a ground product and / or an extract.
  • the method for producing a food composition for treating or preventing a disease caused by fibrosis of amyloid ⁇ according to the present invention is characterized by using a dry earthworm powder, a ground product and / or an extract.
  • the method for decomposing amyloid ⁇ fibril according to the present invention is characterized by using a dry powder, ground product and / or extract of earthworm.
  • the dry earthworm powder, ground product or extract of the present invention is for use in the treatment of diseases caused by fibrillation of amyloid ⁇ .
  • the method for treating or preventing a disease caused by fibrillation of amyloid ⁇ is characterized by administering an effective amount of a dry earthworm powder, a ground product and / or an extract to a subject.
  • an amyloid ⁇ -fibrinolytic agent containing a natural product as an active ingredient, a therapeutic or prophylactic agent for a disease caused by fibrillation of amyloid ⁇ , a food for treatment or prevention of a disease caused by fibrillation of amyloid ⁇ A composition can be provided.
  • the earthworm used as a raw material is not particularly limited, and for example, red earthworm (Lumbricus rubellus), LT earthworm (Lumbricus terrestris), earthworm (Eisenia foetida), brown earthworm (Allophophora cricket), Dendrobena octaedra), Sakuramimizu (Allolobophora japonica Michaelsen), Hatamizumi (Drawida hatamimizu Haemi), Semimizumi-Puretims (Petetima mizumifu).
  • a dry earthworm powder means a powder obtained by drying an untreated or pretreated earthworm ground product or extract.
  • the earthworm ground product is a liquid or paste-like material obtained by grinding an untreated or pretreated earthworm.
  • the earthworm extract means an extract obtained by dissolving or removing an untreated or pretreated earthworm or a ground product thereof in water or an organic solvent, and removing or separating the insoluble fraction.
  • the said pre-processing is not specifically limited, The removal process etc. of the filth etc. which are mentioned later are mentioned.
  • the earthworm dry powder, ground product and extract may be post-treated, and examples of the post-treatment include granulation, filtration, purification, concentration, dilution and pH adjustment.
  • the grinding method for obtaining a ground product of earthworms is not particularly limited, and for example, grinding can be performed using a homogenizer, a blender, a homomixer, a grinder, a pressurized cell disrupter, or the like.
  • the extraction method for obtaining the earthworm extract is not particularly limited.
  • the earthworm dry powder or the ground product can be dissolved in the extraction solvent, and the insoluble fraction can be removed or separated for extraction.
  • the extraction solvent include water, aqueous solutions, and organic solvents such as ethanol, acetone, and ethyl acetate. One kind may be used alone, or two or more kinds may be combined. Among these, water, ethanol or an aqueous ethanol solution is preferable.
  • the drying method for obtaining a dried product of earthworms is not particularly limited, and drying can be performed by a drying method such as freeze drying, heat drying, and spray drying. Among these, lyophilization is preferable for the reasons described later.
  • an effective amount of the earthworm dry powder, ground product or extract may be blended depending on the purpose.
  • the appropriate blending amount depends on various factors such as the purpose, administration route and form, and the production method of earthworm dry powder, etc., but digested matter remaining in the digestive tract of earthworms described later, soil adhering to the body skin, etc.
  • the earthworm is ground and converted to the weight of the dry earthworm powder obtained by freeze-drying the ground material, to prevent the disease caused by fibrosis of amyloid ⁇ or to treat the mild disease.
  • the purpose is preferably 1 to 15,000 mg per day, more preferably 12 to 1,800 mg per day, and still more preferably 120 to 180 mg per day.
  • it is preferably 1 to 15,000 mg per day, more preferably 18 to 3,600 mg per day, more preferably 180 per day. ⁇ 360 mg.
  • the shape of the amyloid ⁇ fibril degrading agent, therapeutic agent, prophylactic agent and food composition of the present invention is not particularly limited, and any of solid, powder, semi-solid and liquid may be used.
  • the dry powder, ground product or extract of earthworm can be used as it is.
  • the amyloid ⁇ fibril degrading agent, therapeutic agent and prophylactic agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier, for example, tablets, granules, powders, capsules, soft capsules, liquids, injections.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, tablets, granules, powders, capsules, soft capsules, liquids, injections.
  • it can be administered orally or parenterally (for example, intravenous administration, direct administration to the affected area, etc.) as a suppository, sustained release agent and the like.
  • an excipient As a pharmaceutically acceptable carrier, an excipient, a binder, a disintegrant, a fluidizing agent, a lubricant, a coating agent, a suspending agent, a coloring agent, a sweetening agent, a surfactant, or the like may be used. And can be in the form of a general pharmaceutical preparation according to known methods. In addition, other therapeutic / prophylactic ingredients and pharmaceutically acceptable additives may be included.
  • the amyloid ⁇ fibril degrading agent and food composition of the present invention may contain additives usually used in foods.
  • an excipient a binder, a disintegrant, a fluidizing agent, a lubricant, a coating agent, a suspending agent, a coloring agent, a sweetening agent, or a surfactant can be used. It can be in the form of a simple food composition. Moreover, you may contain the component derived from another foodstuff or foodstuff.
  • earthworm dry powder among the earthworm dry powder, ground product and extract, it is preferable to use earthworm dry powder from the viewpoint of storage stability in the production process.
  • the earthworm dry powder may be dissolved and / or dispersed in a liquid such as water in advance, and then mixed with other components such as conventional carriers and additives used pharmaceutically and / or in foods.
  • a disease caused by fibrosis of amyloid ⁇ is not particularly limited, but besides Alzheimer's disease, Down's syndrome can be mentioned.
  • the removal method is not particularly limited, and can be removed using a known method.
  • a method in which an earthworm organism is immersed in an aqueous solution of an alkali salt such as sodium salt or potassium salt to excrete the loess in the digestive tract JP-A-1-47718, JP-A-1-47719, 1-47720 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-268639
  • a method in which the earthworm organism is left in an acid aqueous solution maintained at 6 to 26 ° C. for 0.1 to 5 hours to remove feces in the digestive tract (Method described in JP-A-3-72427) can be used.
  • the metal chloride is at least one metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium. That is, it is at least one selected from the group consisting of potassium chloride, sodium chloride, magnesium chloride and calcium chloride. Moreover, these mixtures may be sufficient and the mixture of these and the other harmless component which can be added to a foodstuff may be sufficient. Examples of such a mixture include salt, rock salt, and sun salt.
  • the metal chloride can be used by sprinkling a powdered product on a raw earthworm, which causes contact between the earthworm and the metal chloride.
  • hydroxycarboxylic acid it is preferable to contact the raw earthworm with hydroxycarboxylic acid as described below after contacting the earthworm with the metal chloride. Moreover, without making contact with the metal chloride, the contact between hydroxycarboxylic acid and earthworm can be performed as described below.
  • the contact with the hydroxycarboxylic acid can also be carried out by sprinkling powdered hydroxycarboxylic acid over raw earthworms. Further, it may be immersed in an aqueous hydroxycarboxylic acid solution having a pH of 2 to 5.
  • the contact with the hydroxycarboxylic acid is preferably carried out immediately after the contact with the metal chloride.
  • the earthworm and hydroxycarboxylic acid are contacted after removing the metal chloride by washing with water, a dry earthworm powder with high enzyme activity is obtained.
  • washing with water before contact with the hydroxycarboxylic acid washing with water is preferably performed within 30 minutes, more preferably within 20 minutes after the start of contact with the metal chloride.
  • the washing method is not particularly limited, and a known method can be employed.
  • hydroxycarboxylic acid forms an uncomfortable living environment for earthworms, raw earthworms try to improve their living environment by releasing bodily fluids and excreta by self-preserving instinct. Moreover, since hydroxycarboxylic acid has bactericidal properties, it plays the role of promoting excretion of digests remaining in the digestive organ as described above, and can be expected to have an effect of sterilizing miscellaneous bacteria attached to earthworms.
  • the crystalline hydroxycarboxylic acid used in the above method can be used regardless of the number of hydroxy groups or carboxyl groups as long as it shows a crystalline form under the conditions of use. That is, any of monohydroxymonocarboxylic acid, monohydroxypolycarboxylic acid, polyhydroxymonocarboxylic acid, and polyhydroxypolycarboxylic acid may be used.
  • hydroxycarboxylic acid used in the present invention examples include glycolic acid, lactic acid, acetic acid, ⁇ -hydroxypropionic acid, ⁇ -hydroxy-n-butyric acid, ⁇ -hydroxy-n-butyric acid, ⁇ -hydroxy-n-valeric acid, Examples include ⁇ -hydroxy-n-valeric acid, malic acid, ⁇ -methylmalic acid, ⁇ -hydroxyglutaric acid, ⁇ -hydroxyglutaric acid, citric acid, malonic acid, and succinic acid. Of these, lactic acid, acetic acid, malic acid, citric acid, malonic acid and succinic acid are preferred because they can be used for foods and are easily available. Hydroxycarboxylic acid may be used individually by 1 type, and 2 or more types may be mixed and used for it.
  • the earthworm living body treated with hydroxycarboxylic acid is washed with water and then ground into a liquid or pasty ground product. Washing is preferably performed with pure water.
  • the washing method is not particularly limited, and a known water washing method can be employed.
  • the total time of the treatment process before attrition that is, the time from sprinkling metal chlorides to raw earthworms until the washing with hydroxycarboxylic acid with water is preferably within 240 minutes in total.
  • the above-mentioned grinding method is not particularly limited, and for example, a homogenizer, a blender, a homomixer, a grinder, or a pressurized cell disrupter is usually used at 1 to 25 ° C. From the viewpoint of suppressing the decomposition of earthworm components, it is preferably carried out at a low temperature, and a temperature of 2 to 15 ° C. is preferred.
  • the ground product obtained by grinding the earthworms is accommodated in, for example, a stainless steel tray and freeze-dried.
  • the enzyme contained in the earthworm organism does not act on the living cells but acts on the dead cells instantaneously, so there is a risk of generating spoilage gas.
  • instantaneously It is preferable to perform freeze-drying after quenching and freezing to 18 ° C. to ⁇ 35 ° C. to suppress the action of the enzyme.
  • the freezing is preferably performed at a low temperature of ⁇ 18 ° C. to ⁇ 35 ° C. for 20 to 240 hours, more preferably 50 to 170 hours.
  • the ground product is frozen at a temperature of ⁇ 18 ° C. to ⁇ 35 ° C. for 20 to 240 hours, and then at several temperatures at a temperature of ⁇ 60 ° C. to + 90 ° C.
  • the sterilized light yellow earthworm dry powder can be obtained by freeze-drying for 10 to 60 hours while increasing the temperature and dividing the pressure in several steps at a pressure of 25 to 40 Pa and reducing the pressure in several steps.
  • a step of removing or separating the insoluble fraction by dissolving the lyophilized product in water or an aqueous ethanol solution.
  • the step of removing or separating the insoluble fraction can be performed by standing precipitation, centrifugation, filtration, or the like, as described above.
  • the step of dissolving in water or an aqueous ethanol solution is preferably performed while stirring or shaking.
  • the time required for dissolution in water is preferably 1 to 120 minutes, more preferably 5 to 80 minutes.
  • the ethanol concentration of the aqueous ethanol solution is not particularly limited, but is preferably 10 to 70% (v / v), more preferably 30 to 60%.
  • the supernatant of amyloid ⁇ fibril degrading agent, therapeutic agent, prophylactic agent and food composition of the present invention dissolved in water or ethanol aqueous solution as described above may be used in the state of aqueous solution as it is, It may be used as a concentrated liquid, or may be dried and used in a powder form. A supernatant obtained by drying and powdering may be used by dissolving in water. Moreover, the powder which freeze-dried earthworm paste can also be used as it is, without melt
  • the raw earthworm is placed in a bread box before the treatment for placing the raw earthworm in an uncomfortable environment, that is, prior to contacting the raw earthworm with a metal chloride or hydroxycarboxylic acid. It is preferable to move to a flat box such as the above and leave it in a light place for 10 to 50 hours to remove dirt attached to the body skin.
  • the standing time in the light is more preferably 12 to 24 hours.
  • the accommodation amount at this time is preferably such an amount that earthworms are stacked to a thickness of 30 to 60 mm, preferably 40 to 50 mm.
  • the filth attached to the earthworm skin can be peeled off, for example, by covering the raw earthworm with a nonwoven fabric and adsorbing the filth on it.
  • a nonwoven fabric By combining this leaving in the light place and removal of dirt adhering to the body skin and contact with the above-mentioned metal chlorides and / or hydroxycarboxylic acids, it is possible to further discharge and remove toxic substances in the earthworm body. I can expect.
  • the following method is particularly preferable from the viewpoint of storage stability of the dry powder.
  • A-1 contacting the earthworm with at least one metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium; Thereafter, the powdered hydroxycarboxylic acid and raw earthworm are brought into contact, diluted with water to adjust the pH to 2 to 5, held for 3 to 180 minutes, washed with water, ground, and the obtained ground product.
  • the manufacturing method of the dry powder of earthworm provided with the process of freeze-drying.
  • A-2) contacting the earthworm with at least one metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium; Thereafter, the raw earthworms are immersed in a hydroxycarboxylic acid aqueous solution adjusted to pH 2 to 5 and held for 3 to 180 minutes, and then the raw earthworms are washed with water and ground, and the obtained ground product is freeze-dried.
  • Manufacturing method of earthworm dry powder (A-3) In (A-1) or (A-2), the milled product is freeze-dried and dissolved in water or an aqueous ethanol solution, and the insoluble fraction is removed or separated, followed by further freeze-drying.
  • the manufacturing method of the dry powder of earthworm provided with a process.
  • the obtained dried product may be heat-treated from the viewpoint of sterilization of the dried product.
  • the temperature of heat processing is 110 degreeC or more and less than 130 degreeC.
  • the sterilization of the dried product may be insufficient, and when it is 130 ° C. or more, the enzyme contained in the dried earthworm is deactivated and the activity is lowered, which is not preferable. More preferably, it is 115 to 125 ° C.
  • the heating method is not particularly limited, and examples thereof include a method of applying hot air, a method of using a heating jacket, a method of heating on a tray or the like and a method of using a constant temperature and temperature chamber.
  • the heating time is preferably 30 seconds to 130 minutes, more preferably 30 minutes to 90 minutes, and even more preferably 60 minutes to 90 minutes. If the heating time is too short, sterilization may be insufficient, and if the heating time is too long, the enzyme activity is lost. In addition, since enzyme activity will be lost when the said heat processing is performed to the enzyme in a liquid, it is preferable to perform heat processing with respect to the dry powder of earthworm.
  • the following method is preferred as a method for obtaining a ground product of earthworm.
  • B-1 contacting the earthworm with at least one metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium; Thereafter, the powdered hydroxycarboxylic acid and raw earthworm are brought into contact with each other, diluted with water to adjust the pH to 2 to 5, held for 3 to 180 minutes, washed with water, and ground.
  • Method for producing crushed material is preferred as a method for obtaining a ground product of earthworm.
  • (B-2) contacting the earthworm with a chloride of a metal selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium; Thereafter, a method for producing a ground product of earthworms comprising a step of immersing the raw earthworms in a hydroxycarboxylic acid aqueous solution adjusted to pH 2 to 5 and holding for 3 to 180 minutes, and then washing and grinding the raw earthworms.
  • the following method is preferred as a method for obtaining the earthworm extract.
  • C-1 contacting the earthworm with at least one metal chloride selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium; Thereafter, the powdered hydroxycarboxylic acid and raw earthworm are brought into contact, diluted with water to adjust the pH to 2 to 5, held for 3 to 180 minutes, washed with water, ground, and the obtained ground product.
  • a method for producing an extract of earthworm comprising a step of dissolving a freeze-dried product in water or an aqueous ethanol solution and removing or separating an insoluble fraction.
  • C-2 contacting the earthworm with a chloride of a metal selected from the group consisting of potassium, sodium, magnesium and calcium; Thereafter, the raw earthworms are immersed in a hydroxycarboxylic acid aqueous solution adjusted to pH 2 to 5 and held for 3 to 180 minutes. The raw earthworms are washed with water and ground, and the obtained ground product is freeze-dried.
  • a method for producing an extract of earthworm comprising a step of dissolving in water or an aqueous ethanol solution to remove or separate an insoluble fraction.
  • raw earthworms were taken out from the soiled aqueous citric acid solution, washed with water, and ground at 10 ° C. using a homogenizer to prepare earthworm paste.
  • this earthworm paste is sucked and degassed to remove the gas contained therein, and then transferred to a stainless steel tray, where it is rapidly cooled to ⁇ 35 ° C. and maintained at this temperature for 50 hours. And gradually frozen.
  • the frozen earthworm paste is kept at -35 ° C. and a pressure of 0 Pa for 2 hours, and then heated to a temperature of 25 ° C., then 40 Pa for 10 hours, then 40 ° C. and a pressure of 35 Pa for 14 hours, then 65 ° C. and a pressure of 35 Pa for 12 hours. Drying was performed, and finally, the temperature was set to 80 ° C., and vacuum lyophilization was performed by maintaining the pressure at 25 Pa for 6 hours. By this treatment, a light yellow earthworm dry powder having a water content of 8% by mass was obtained.
  • the supernatant of the extract obtained above was diluted to 50 mg / mL in terms of dry earthworm powder with 50 mM phosphate buffer pH 7.0 (hereinafter buffer) containing 150 mM sodium chloride. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation (10,000 ⁇ g, 4 ° C., 15 minutes) to prepare an earthworm dry powder extract.
  • buffer 50 mM phosphate buffer pH 7.0
  • Amyloid ⁇ 42 (Amiloid ⁇ -Protein (Human 1-42), 4349-v, Lot. 650312) manufactured by Peptide Research Institute Co., Ltd. was dissolved to 75 mM with 75% trifluoroethanol, and further 50 mM phosphorus containing 150 mM potassium chloride. The acid buffer was adjusted to 25 ⁇ M using pH 7.0. This solution was incubated at 25 ° C. for 2 weeks to allow fibrosis.
  • the fibers were collected by centrifugation (14,000 ⁇ g, 25 ° C., 20 minutes), adjusted to 25 ⁇ M with a buffer, and further subjected to an ultrasonic bath for 10 minutes to obtain an amyloid ⁇ fiber-containing solution.
  • the fluorescence emission rate after 240 minutes was determined from the following formula, assuming that the fluorescence emission rate at 0 hour was 100%.
  • ThT is a small organic molecule that specifically binds to amyloid fibrils and emits fluorescence.
  • the amyloid ⁇ fiber-containing solution prepared above was not mixed with the earthworm dry powder extract, but was mixed with buffer as a control, the amount of fluorescence emitted by ThT was measured, and the fluorescence emission rate after 240 minutes Asked.
  • the amount of fluorescence emitted by ThT is shown in Tables 1 and 2, respectively.
  • the fluorescence emission rate after 240 minutes is shown in Table 3 and FIG.
  • the ThT fluorescence emission rate is greatly reduced, indicating that the earthworm dry powder has an action of decomposing amyloid ⁇ fibers.

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Abstract

天然物を有効成分として含有するアミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物を提供することにある。ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を有効成分として含有する、アミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物である。アミロイドβの線維化に起因する疾患は、アルツハイマー病であることが好ましい。

Description

アミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬・予防薬および治療用・予防用食品組成物
　本発明は、アミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬・予防薬および治療用・予防用食品組成物に関する。
　アミロイドβ（アミロイドβ蛋白質またはアミロイドβペプチドとも言う）は、約４０残基のアミノ酸からなる蛋白質であり、アルツハイマー病患者の脳内には、アミロイドβが凝集して線維化したアミロイドβ線維が蓄積していることがわかっている。アミロイドβは細胞外に放出される水溶性の蛋白質であり、それ自体は神経細胞に対して毒性を示さないが、アミロイドβ線維を形成することによって初めて神経細胞に毒性を与えることから（例えば特許文献１）、アミロイドβ線維の蓄積がアルツハイマー病を引き起こす原因の１つであると考えられている。
　アミロイドβの主な分子種としては、４０残基からなるＣ末端がＶａｌのアミロイドβ４０と、４２残基からなるＣ末端がＡｌａのアミロイドβ４２が知られており、通常の神経細胞においては、アミロイドβ４０がアミロイドβ４２と比べて１０倍近く多く産生される（非特許文献１）。アミロイドβ４２は凝集性が高く、アルツハイマー病患者の脳においても初期から優位に蓄積することが知られている。また、家族性アルツハイマー病に関連する遺伝子変異として、アミロイドβの前駆タンパク質（ＡＰＰ）に存在するＩｒａｎｉａｎ変異（Ｔ７１４Ａ）等の変異が、アミロイドβの総産生量には大きな影響を与えずに、凝集性の高いアミロイドβ４２の産生比率を上昇させることが知られている。また、このような遺伝子変異として、アミロイドβの総産生量を増加させる変異やアミロイドβの凝集性を高める遺伝子変異も知られている。
　従来、アミロイドβを標的としたアルツハイマー病の治療薬の開発が進められている。例えば、特許文献２には、ビンポセチンおよびその誘導体を含有するアミロイドβ蛋白産生・分泌阻害剤が記載されている。また、特許文献３には、アミロイドβペプチドの線維化を阻害しうるペプチドが記載されている。
　一方、ミミズ抽出物やミミズ乾燥粉末は、古来より主として東洋諸国において、各種疾病の予防剤、治療剤として用いられており、これまでに膀胱内結石縮小剤及び排出促進剤、黄疸治療剤、分娩促進剤、強壮剤、育毛剤、強精剤、解熱剤、ひきつけ治療剤、血行促進剤、半身不随治療剤、間接鎮痛剤、排尿剤、気管支喘息剤、高血圧症治療剤としての用途が知られている。
　しかし、これまでアルツハイマー病の予防・治療にミミズを利用した報告例はない。
特許４２２７２４５号公報 特開平８－２８３１５７号公報 特許５４６４３８３号公報
Ａｓａｍｉ－Ｏｄａｋａ，　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　１９９５，　３４（３２）；１０２７２－１０２７８ Ｉｗａｔｓｕｂｏ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｎ（１９９４），　１３（１）；４５－５３）
　アルツハイマー病の予防や治療には長期間の薬剤の投与を伴うと考えられることから、安全で副作用の少ない薬剤が特に必要であり、アミロイドβの線維化を妨げる天然物由来の予防・治療薬が求められていた。
　そこで本発明の目的は、天然物を有効成分として含有するアミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物を提供することにある。
　即ち、本発明のアミロイドβ線維分解剤は、ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を有効成分として含有することを特徴とするものである。
　本発明のアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬は、前記アミロイドβ線維分解剤を含有することを特徴とするものである。
　本発明のアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物は、前記アミロイドβ線維分解剤を含有することを特徴とするものである。
　本発明のアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬は、前記アミロイドβの線維化に起因する疾患が、アルツハイマー病であることが好ましい。
　本発明のアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物は、前記アミロイドβの線維化に起因する疾患が、アルツハイマー病であることが好ましい。
　本発明のアミロイドβ線維分解剤の製造方法は、ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするものである。
　本発明のアミロイドβ線維分解剤の製造方法は、生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、その後、粉末状ヒドロキシカルボン酸と生ミミズとを接触させ、水で希釈してｐＨ２～５に調整し、３～１８０分間保持した後、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥したものを水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離する工程を備えることが好ましい。
　本発明のアミロイドβ線維分解剤の製造方法は、生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、その後、生ミミズをｐＨ２～５に調整したヒドロキシカルボン酸水溶液中に浸漬し、３～１８０分間保持したのち、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥したものを水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離する工程を備えることが好ましい。
　本発明のアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬の製造方法は、ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするものである。
　本発明のアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物の製造方法は、ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするものである。
　本発明のアミロイドβ線維の分解方法は、ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするものである。
　本発明のミミズの乾燥粉末、摩砕物または抽出物は、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療における使用のためのものである。
　本発明のアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療方法または予防方法は、ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を、対象に有効量を投与することを特徴とするものである。
　本発明により、天然物を有効成分として含有するアミロイドβ線維分解剤、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物を提供することができる。
アミロイドβ線維含有溶液と、アミロイドβ線維含有溶液とミミズ乾燥粉末抽出液との混合溶液の、チオフラビンＴ（以下ＴｈＴ）蛍光発光量を比較したグラフ図である。
　本発明方法においては、原料に用いられるミミズは特に限定されず、例えばアカミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ　ｒｕｂｅｌｌｕｓ）、ＬＴミミズ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、シマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ　ｆｏｅｔｉｄａ）、カッショクツリミミズ（Ａｌｌｏｌｏｂｏｐｈｏｒａ　ｃａｌｉｇｉｎｏｓａ）、ムラサキツリミミズ（Ｄｅｎｄｒｏｂａｅｎａ　ｏｃｔａｅｄｒａ）、サクラミミズ（Ａｌｌｏｌｏｂｏｐｈｏｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ）、ハッタミミズ（Ｄｒａｗｉｄａ　ｈａｔｔａｍｉｍｉｚｕ　Ｈａｔａｉ）、セグロミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ　ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ　Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ）、フツウミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ　ｃｏｍｍｕｎｉｓｓｉｍａ）、ハタケミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ　ａｇｒｅｓｔｉｓ）、シーボルトミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ　ｓｉｅｂｏｌｄｉ　Ｈｏｒｓｔ）、ヒトツモンミミズ（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ　ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉ）、イソミミズ（Ｐｏｎｔｏｄｒｉｌｕｓ　ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅｎｓｉｓ　Ｉｉｚｕｋａ）、イトミミズ（Ｔｕｂｉｆｅｘ　ｈａｔｔａｉ　Ｎｏｍｕｒａ）、ゴトウイトミミズ（ユリミミズ）［Ｌｉｍｎｏｄｒｉｌｕｓ　ｇｏｔｏｉ　Ｈａｔａｉ＝Ｌ．ＳｏｃｉａｌｉｓＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ］などを用いることができる。
　本発明において、ミミズの乾燥粉末とは、未処理の又は前処理をしたミミズの摩砕物又は抽出物を乾燥して得た粉末を意味する。また、ミミズの摩砕物とは、未処理の又は前処理をしたミミズを摩砕した液状ないしペースト状のものである。ミミズの抽出物とは、未処理の又は前処理をしたミミズ又はその摩砕物を、水または有機溶媒に溶解し、不溶性画分を除去または分離して得たエキスを意味する。前記前処理は特に限定されるものではなく、後述する汚物等の除去処理等が挙げられる。また、ミミズの乾燥粉末、摩砕物および抽出物は後処理がされていてもよく、後処理としては造粒、濾過、精製、濃縮、希釈およびｐＨ調製等が挙げられる。
　ミミズの摩砕物を得るための摩砕方法は特に限定されず、例えば、ホモジナイザー、ブレンダー、ホモミキサー、擂潰機、加圧型細胞破壊装置等を用いて摩砕することができる。
　ミミズの抽出物を得るための抽出方法は特に限定されず、例えば、ミミズの乾燥粉末又は摩砕物を抽出溶媒に溶解し、不溶性画分を除去又は分離して抽出することができる。抽出溶媒としては、水、水溶液並びにエタノール、アセトン及び酢酸エチル等の有機溶媒が挙げられ、１種を単独で、又は、２種以上を組み合わせてもよい。中でも、水、エタノール又はエタノール水溶液が好ましい。
　ミミズの乾燥物を得るための乾燥方法は特に限定されず、凍結乾燥、加熱乾燥及び噴霧乾燥等の乾燥方法により乾燥することができる。中でも、後述の理由により、凍結乾燥が好ましい。
　本発明において、ミミズの乾燥粉末、摩砕物または抽出物は、その目的に合わせて効果的な量を配合すればよい。適切な配合量は、目的、投与経路及び形態、ミミズの乾燥粉末等の製造方法等の様々な因子に依存するが、後述するミミズの消化管内に残留する消化物、体皮に付着する汚物等を除去した後、ミミズを摩砕し、摩砕物を凍結乾燥して得られたミミズの乾燥粉末の重量に換算して、アミロイドβの線維化に起因する疾患の予防又は軽度の疾患の治療を目的としては、好ましくは１日あたり１～１５，０００ｍｇ、より好ましくは１日あたり１２～１，８００ｍｇ、さらに好ましくは１日あたり１２０～１８０ｍｇである。また、アミロイドβの線維化に起因する重度の疾患の治療を目的としては、好ましくは１日あたり１～１５，０００ｍｇ、より好ましくは１日あたり１８～３，６００ｍｇ、さらに好ましくは１日あたり１８０～３６０ｍｇである。
　本発明のアミロイドβ線維分解剤、治療薬、予防薬及び食品組成物の形状は特に限定されず、固形、粉末、半固形及び液体のいずれでもよい。
　本発明において、ミミズの乾燥粉末、摩砕物または抽出物はそのまま使用することができる。また、特に本発明のアミロイドβ線維分解剤、治療薬及び予防薬においては、薬学的に許容しうる担体を含んでもよく、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤等として、経口的または非経口的（例えば、静脈投与、直接患部に投与等）に投与することができる。薬学的に許容しうる担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、滑沢剤、コーティング剤、懸濁化剤、着色剤、甘味剤または界面活性剤等を用いることができ、公知の方法に従って一般的な医薬製剤の形態とすることができる。また、他の治療・予防成分や薬学的に許容しうる添加剤を含んでもよい。
　また、本発明、特に本発明のアミロイドβ線維分解剤及び食品組成物においては、食品に通常に使用される添加剤を含んでもよい。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、滑沢剤、コーティング剤、懸濁化剤、着色剤、甘味剤または界面活性剤等を用いることができ、公知の方法に従って一般的な食品組成物の形態とすることができる。また、他の食品又は食品由来の成分を含んでもよい。
　本発明において、ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び抽出物の中でも、製造工程における保存安定性の観点から、ミミズの乾燥粉末を用いることが好ましい。ミミズの乾燥粉末は、予め水等の液体に溶解及び／又は分散させてから、薬学的に及び又は食品に使用される通常の担体、添加剤等の他の成分と混合してもよい。
　本発明において、アミロイドβの線維化に起因する疾患は特に限定されないが、アルツハイマー病の他には、ダウン症候群が挙げられる。
　ミミズを原料として経口投与するためには、ミミズの消化管内に残留する消化物、体皮に付着する汚物等を除去することが好ましい。本発明おいては、除去方法は特に限定されず、公知の方法を用いて除去することができる。例えば、ミミズ生体をナトリウム塩又はカリウム塩のようなアルカリ塩の水溶液中に浸せきして、消化管内の黄土を排泄させる方法（特開平１－４７７１８号公報、特開平１－４７７１９号公報、特開平１－４７７２０号公報および特開平１－２６８６３９号公報に記載の方法）、ミミズ生体を６～２６℃に維持した酸水溶液中に０．１～５時間放置して消化管内の糞土を除去する方法（特開平３－７２４２７号公報に記載の方法）などを用いることができる。
　本発明においては、除去方法として、下記の金属の塩化物および／またはヒドロキシカルボン酸とミミズとを接触させることが好ましい。
　上記金属の塩化物は、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物である。即ち、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種である。また、これらの混合物でもよく、これらと、食品への添加が可能な他の無害な成分との混合物であってもよい。そのような混合物としては、例えば食塩、岩塩、天日塩が挙げられる。上記金属の塩化物は、粉末状のものを生ミミズにふりかけることにより用いることができ、これによりミミズと金属の塩化物の接触が起きる。
　生ミミズに上記金属の塩化物を接触させた後、生ミミズと下記のようにヒドロキシカルボン酸を接触させることが好ましい。また、上記金属の塩化物との接触をさせずに、下記のようにヒドロキシカルボン酸とミミズとの接触を行うこともできる。
　上記ヒドロキシカルボン酸との接触についても、粉末状のヒドロキシカルボン酸を生ミミズにふりかけることにより行うことができる。また、ｐＨ２～５のヒドロキシカルボン酸水溶液中に浸漬してもよい。金属の塩化物との接触を経てからヒドロキシカルボン酸との接触を行う場合は、ヒドロキシカルボン酸との接触は、上記金属の塩化物との接触の後速やかに行うことが好ましい。また、生ミミズとヒドロキシカルボン酸とを接触させる前に、ミミズを水洗することが好ましい。水洗により上記金属の塩化物を除いてからミミズとヒドロキシカルボン酸とを接触させると酵素活性の高いミミズ乾燥粉末が得られる。ヒドロキシカルボン酸との接触前に水洗を行う場合は、金属の塩化物との接触開始後、好ましくは３０分、より好ましくは２０分以内に水洗を行う。水洗方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
　生ミミズを長時間ヒドロキシカルボン酸粉末と接触させておくと死滅し、生活機能を消失し、消化管内の消化物を排泄しなくなるので、可及的速やかに、好ましくは３０秒以内、より好ましくは２０秒以内にヒドロキシカルボン酸を水で希釈し、ｐＨを２～５の範囲に調整することが好ましい。
　ヒドロキシカルボン酸はミミズにとって不快生活環境を形成するため、生ミミズは、自己保存本能により体液、排泄物を放出して生活環境を改善しようとする。また、ヒドロキシカルボン酸は殺菌性を有するため、上記のように消化器内に残留する消化物等の排泄を促す役割を果すとともに、ミミズに付着した雑菌を殺菌するという効果が期待できる。
　上記方法において用いられる結晶状ヒドロキシカルボン酸は、使用条件下で結晶状体を示すものであれば、そのヒドロキシ基数又はカルボキシル基数には関係なく用いることができる。すなわち、モノヒドロキシモノカルボン酸、モノヒドロキシポリカルボン酸、ポリヒドロキシモノカルボン酸、ポリヒドロキシポリカルボン酸のいずれでもよい。
　本発明で用いるヒドロキシカルボン酸としては、例えば、グリコール酸、乳酸、酢酸、β‐ヒドロキシプロピオン酸、α‐ヒドロキシ‐ｎ‐酪酸、β‐ヒドロキシ‐ｎ‐酪酸、α‐ヒドロキシ‐ｎ‐吉草酸、β‐ヒドロキシ‐ｎ‐吉草酸、リンゴ酸、α‐メチルリンゴ酸、α‐ヒドロキシグルタル酸、β‐ヒドロキシグルタル酸、クエン酸、マロン酸およびコハク酸などが挙げられる。中でも食品に対して使用可能で入手が容易である点で乳酸、酢酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸およびコハク酸が好ましい。ヒドロキシカルボン酸は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
　生ミミズの組織の６５％は水分である。生ミミズの保身機能が働く時間としては、ある程度余裕はあるが、生ミミズが死滅してしまうと酵素が働いてしまうので、不快生活環境下に置く時間の制御は慎重に行う必要がある。この時間は、条件により左右されるが、通常は３～１８０分の範囲である。
　ヒドロキシカルボン酸で処理したミミズ生体は、水で洗浄したのち、摩砕して液状ないしペースト状の摩砕物にすることが好ましい。洗浄は好ましくは純水で行う。洗浄方法は特に限定されず、公知の水洗方法を採用することができる。また、摩砕前の処理工程の合計時間、即ち、生ミミズに金属の塩化物を振りかけてから、ヒドロキシカルボン酸の水による洗浄を終えるまでの時間は、合計で２４０分以内が好ましい。
　上記摩砕方法は特に限定されず、例えば、ホモジナイザー、ブレンダー、ホモミキサー、擂潰機、加圧型細胞破壊装置を用い、通常１～２５℃で行われる。ミミズ構成成分の分解抑制の観点から低温下で行うことが好ましく、２～１５℃の温度が好ましい。
　ミミズの摩砕により得られた摩砕物は、例えばステンレス鋼製トレーに収容され、凍結乾燥に付される。この際、ミミズ生体に含まれる酵素は、生細胞には作用しないが死細胞に対しては瞬時に作用するため、腐敗性ガスが発生するおそれがあり、これを防止するために瞬間的に－１８℃～－３５℃に急冷・凍結して酵素の作用を抑制した後に、凍結乾燥を行うことが好ましい。
　このように、ミミズ本来の薬理作用を損なわずに粉末化するには、迅速に凍結することが好ましいが、一方においてあまり短時間で凍結させるとミミズペーストの主成分であるタンパク質とともに存在する不純物がスポット状の不凍結部分を形成し、分離されないことがあるので、過度に急速な凍結は好ましくない。したがって、凍結は好ましくは－１８℃から－３５℃の低温で２０～２４０時間、より好ましくは５０～１７０時間を要して行う。
　凍結乾燥に際しては、水分とともに不純分が残留することなく除去し得る条件を選ぶことが重要である。そのためには、圧力５０Ｐａ以下、－６０℃ないし＋９０℃の温度において、温度を段階的に上げながら１０～６０時間の範囲で制御して行うのが好ましい。
　凍結乾燥の方法としては、例えば、前記したように摩砕物を－１８℃ないし－３５℃の温度で２０～２４０時間を要して凍結したのち、－６０℃～＋９０℃の温度において、数段階に分け昇温し、圧力２５～４０Ｐａにおいて、数段階に分け減圧しながら、１０～６０時間凍結真空乾燥させることで無菌状態の淡黄色ミミズ乾燥粉末を得ることができる。
　さらに、前記摩砕物を凍結乾燥したものを水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離する工程を備えることが好ましい。不溶性画分を除去または分離する工程は、上記と同様に、放置による沈殿、遠心、濾過等によることができる。水またはエタノール水溶液に溶解する工程は、攪拌ないし振とうしながら行うことが好ましい。水への溶解に要する時間は好ましくは、１～１２０分間、より好ましくは５～８０分間である。エタノール水溶液のエタノール濃度は特に制限されないが、好ましくは１０～７０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは３０～６０％である。
　本発明のアミロイドβ線維分解剤、治療薬、予防薬及び食品組成物は、上記のように水またはエタノール水溶液に溶解したものの上清を、そのまま水溶液の状態で用いてもよく、水分を飛ばして濃縮液として用いてもよく、乾燥させて粉末状にして用いることもできる。上清を乾燥して粉末状にしたものを水に溶解して用いてもよい。また、ミミズペーストを凍結乾燥した粉末を、水またはエタノール水溶液に溶解せずにそのまま用いることもできる。
　また、本発明においては、除去方法としては、生ミミズを不快環境下に置く処理の前、即ち上記の生ミミズを金属の塩化物またはヒドロキシカルボン酸に接触させるのに先立ち、生ミミズをパン箱のような平箱に移し、明所にて１０～５０時間放置し、体皮に付着した汚物を除去することが好ましい。明所での放置時間は、より好ましくは１２～２４時間である。この際の収容量としては、ミミズが３０～６０ｍｍ、好ましくは４０～５０ｍｍの厚さに積み重なる程度の量が好ましい。この平箱内には、砂、泥のような異物が存在しないようにし、またミミズは夜行性で暗所では生活活動が活発となり、体力を消耗するおそれがあるため、夜間は電照培養方式などにより明るく保つことが好ましい。この処置により生ミミズは、自己防御本能を発揮し、消化管内に残留する消化物を排泄し、この排泄物で全身を覆い、水分が蒸発するのを防いで、生活環境を維持しようとするので、この覆っている汚物すなわち排泄物を適当な手段で剥ぎ取ることを繰り返せば、最終的に消化管内の消化物及び体皮に付着した汚物を除去することができる。
　ミミズの体皮に付着した汚物の剥ぎ取りは、例えば不織布で生ミミズを被覆し、汚物をそれに吸着させて行うことができる。この明所での放置および体皮に付着した汚物の除去と、上記の金属の塩化物および／またはヒドロキシカルボン酸との接触とを組み合わせることにより、一層のミミズ体内の有毒物の排出、除去が期待できる。
　本発明において、ミミズの乾燥粉末を得る方法としては、特に乾燥粉末の保存安定性の観点から、下記の方法が好ましい。
（Ａ－１）生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、
　その後、粉末状ヒドロキシカルボン酸と生ミミズとを接触させ、水で希釈してｐＨ２～５に調整し、３～１８０分間保持した後、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥する工程を備えるミミズの乾燥粉末の製造方法。
（Ａ―２）生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、
　その後、生ミミズをｐＨ２～５に調整したヒドロキシカルボン酸水溶液中に浸漬し、３～１８０分間保持したのち、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥する工程を備えるミミズの乾燥粉末の製造方法。
（Ａ－３）前記（Ａ－１）又は（Ａ－２）において、前記摩砕物を凍結乾燥したものを水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離した後、さらに凍結乾燥する工程を備えるミミズの乾燥粉末の製造方法。
　また、生ミミズを摩砕してなる摩砕物を凍結乾燥した後、乾燥物の殺菌の観点から、得られた乾燥物を加熱処理してもよい。加熱処理の温度は１１０℃以上１３０℃未満であることが好ましい。加熱温度が１１０℃未満であると、乾燥物の殺菌が不十分なことがあり、１３０℃以上であるとミミズ乾燥物に含まれる酵素が失活してしまい活性が下がるので好ましくない。より好ましくは、１１５～１２５℃である。加熱方法は特に限定されず、熱風をかける方法、加熱ジャケットを用いる方法、トレイ等に載せてヒーターで加熱する方法、定温恒温器を使用する方法などが挙げられる。加熱時間は好ましくは、３０秒～１３０分、より好ましくは、３０分～９０分、さらに好ましくは６０分～９０分である。加熱時間があまり短いと殺菌が不十分な場合があり、あまり長いと酵素の活性が失われるため好ましくない。尚、液体中の酵素に上記加熱処理を行うと酵素活性が失われてしまうことから、加熱処理は、ミミズの乾燥粉末に対して行うことが好ましい。
　本発明において、ミミズの摩砕物を得る方法としては、下記の方法が好ましい。
（Ｂ－１）生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、
　その後、粉末状ヒドロキシカルボン酸と生ミミズとを接触させ、水で希釈してｐＨ２～５に調整し、３～１８０分間保持した後、生ミミズを水洗し、摩砕する工程を備えるミミズの摩砕物の製造方法。
（Ｂ－２）生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる金属の塩化物と接触させ、
　その後、生ミミズをｐＨ２～５に調整したヒドロキシカルボン酸水溶液中に浸漬し、３～１８０分間保持したのち、生ミミズを水洗し、摩砕する工程を備えるミミズの摩砕物の製造方法。
　本発明において、ミミズの抽出物を得る方法としては、下記の方法が好ましい。
（Ｃ－１）生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、
　その後、粉末状ヒドロキシカルボン酸と生ミミズとを接触させ、水で希釈してｐＨ２～５に調整し、３～１８０分間保持した後、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥したものを、水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離する工程を備えるミミズの抽出物の製造方法。
（Ｃ－２）生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる金属の塩化物と接触させ、
　その後、生ミミズをｐＨ２～５に調整したヒドロキシカルボン酸水溶液中に浸漬し、３～１８０分間保持したのち、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥したものを、水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離する工程を備えるミミズの抽出物の製造方法。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、以下の実施例により何ら制限されるものでは無い。尚、以下において「％」とあるのは、特に断りのない限り全て質量基準である。
［ミミズ乾燥粉末の調製］
　２４時間明所に放置後、体皮に付着する汚物を剥ぎ取った生のアカミミズ３０ｋｇを平皿に約５ｃｍの厚さに拡げ、この上に塩化ナトリウム２５０ｇを均一に振りかけた。２０分後、ミミズを水洗いした。その後、クエン酸２５０ｇを同様に振りかけた後１５秒で純水３０リットルを加えて希釈した。この時、水を加えた直後のｐＨは２．２５であり、完全に希釈したときのｐＨは２．７４であった。クエン酸粉末を振りかけると、ミミズは一気に黄色い体液を放出した。水で希釈した後に、その状態で２０分間保持した。次いで、汚れたクエン酸水溶液から生ミミズを取り出し、水洗したのち、ホモジナイザーを用いて１０℃において摩砕し、ミミズペーストを調製した。次に、このミミズペーストを吸引脱気して、その中に含まれているガスを除いたのち、ステンレス鋼製トレーに移し、瞬間的に－３５℃まで急冷し、この温度に５０時間維持して徐々に凍結した。凍結したミミズペーストを－３５℃で圧力０Ｐａを２時間保ったのち、温度２５℃まで昇温し、４０Ｐａで１０時間、次いで４０℃、圧力３５Ｐａで１４時間、次いで６５℃、圧力３５Ｐａで１２時間乾燥し、最後に温度を８０℃とし、圧力２５Ｐａにおいて６時間保つことにより真空凍結乾燥を行った。この処理により含水量８質量％の淡黄色のミミズ乾燥粉末を得た。
［ミミズ乾燥粉末抽出液の調製］
　上記で得られたミミズ乾燥粉末から２５ｇ採取し、蒸留水５００ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌抽出した。得られた抽出液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１５分間）し、上清を採取した。
　上記で得た抽出液の上清を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（以下ｂｕｆｆｅｒ）でミミズ乾燥粉末量換算で２５ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。その後、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１５分間）で上清を採取し、ミミズ乾燥粉末抽出液を調製した。
［アミロイドβ線維の調製］
　アミロイドβ４２（ペプチド研究所社製Ａｍｉｌｏｉｄ　β－Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｕｍａｎ１－４２），４３４９－ｖ、Ｌｏｔ．６５０３１２）を７５％トリフルオロエタノールで０．５ｍＭになるよう溶解し、さらに１５０ｍＭ塩化カリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用いて２５μＭに調整した。この溶液を２５℃で２週間インキュベートし線維化させた。これを遠心分離（１４，０００×ｇ、２５℃、２０分間）で線維を回収し、ｂｕｆｆｅｒで２５μＭに調整し、さらに超音波浴を１０分間行い、アミロイドβ線維含有溶液を得た。
［アミロイドβ線維分解測定方法］
　上記で調製したアミロイドβ線維含有溶液（１７９容量部）とミミズ乾燥粉末抽出液（１容量部）を混合し、３７℃でインキュベートした。混合溶液を０および２４０分でサンプリングを行った。サンプリングした混合溶液１８０μＬに２００μＭチオフラビンＴ（以下ＴｈＴ、シグマアルドリッチＴ３５１６－５Ｇ、Ｌｏｔ．０８８Ｋ１６６５）を３０μＬ加えて、蛍光光度計（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒで励起波長フィルター４４０ｎｍおよび測定波長フィルター４８５ｎｍを使用）でアミロイドβ線維との結合によってＴｈＴが発する蛍光発光量を３回測定した。測定したＴｈＴの蛍光発光量の平均値から、０時間の蛍光発光率を１００％として、２４０分後の蛍光発光率を以下の式から求めた。尚、ＴｈＴは、アミロイド線維と特異的に結合し蛍光を発する有機小分子である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　同様に、上記で調製したアミロイドβ線維含有溶液を、ミミズ乾燥粉末抽出液と混合せずに、コントロールとしてｂｕｆｆｅｒと混合して、ＴｈＴが発する蛍光発光量を測定し、２４０分後の蛍光発光率を求めた。
　ＴｈＴが発する蛍光発光量をそれぞれ表１、２に示す。また、２４０分後の蛍光発光率を表３および図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ミミズ乾燥粉末抽出液との混合溶液の場合、ＴｈＴ蛍光発光率が大きく減少していることから、ミミズ乾燥粉末がアミロイドβ線維を分解する作用を奏することがわかる。

Claims (13)

  1. 　ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβ線維分解剤。
  2. 　請求項１記載のアミロイドβ線維分解剤を含有することを特徴とする、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬。
  3. 　請求項１記載のアミロイドβ線維分解剤を含有することを特徴とする、アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物。
  4. 　前記アミロイドβの線維化に起因する疾患が、アルツハイマー病である請求項２記載の治療薬または予防薬。
  5. 　前記アミロイドβの線維化に起因する疾患が、アルツハイマー病である請求項３記載の治療用または予防用食品組成物。
  6. 　ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするアミロイドβ線維分解剤の製造方法。
  7. 　生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、
    　その後、粉末状ヒドロキシカルボン酸と生ミミズとを接触させ、水で希釈してｐＨ２～５に調整し、３～１８０分間保持した後、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥したものを水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離する工程を備える請求項６記載のアミロイドβ線維分解剤の製造方法。
  8. 　生ミミズをカリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属の塩化物と接触させ、
    　その後、生ミミズをｐＨ２～５に調整したヒドロキシカルボン酸水溶液中に浸漬し、３～１８０分間保持したのち、生ミミズを水洗し、摩砕し、得られた摩砕物を凍結乾燥したものを水またはエタノール水溶液に溶解し、不溶性画分を除去または分離する工程を備える請求項６記載のアミロイドβ線維分解剤の製造方法。
  9. 　ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療薬または予防薬の製造方法。
  10. 　ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療用または予防用食品組成物の製造方法。
  11. 　ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を使用することを特徴とするアミロイドβ線維の分解方法。
  12. 　アミロイドβの線維化に起因する疾患の治療における使用のためのミミズの乾燥粉末、摩砕物または抽出物。
  13. 　ミミズの乾燥粉末、摩砕物及び／又は抽出物を、対象に有効量を投与することを特徴とするアミロイドβの線維化に起因する疾患の治療方法または予防方法。
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