WO2017010100A1 - 細胞投与用、保存用、又は培養用容器 - Google Patents

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梢 駒澤
美子 茂原
孝之 傳寶
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • the present invention relates to a fluororesin containing one or more —CF 3 end groups, or the total number of non-fluorinated group ends and —CF 2 H group ends in the fluororesin is 70 or less per 1 ⁇ 10 6 carbon atoms.
  • the present invention relates to a container for use in administration, storage, or culture of mammalian cells, wherein a surface in contact with mammalian cells is formed by a certain fluororesin.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (Embryonic Stem cells; ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) have unlimited proliferation ability and pluripotency into various tissue cells It is a cell.
  • Human pluripotent stem cells are further differentiated into cells having various functions by induction of differentiation in vitro, and then administered to patients who are expected to have administration effects, and are expected to be applied to regenerative medicine.
  • somatic stem cells such as mesenchymal stem cells are also expected to have therapeutic effects obtained by the release of trophic factors and cytokines, as well as the effect of differentiation and complementation of their constituent cells after homing to tissue damage sites. Research is being attempted. In order to realize these, it is necessary to stably culture or store high-quality cells in large quantities and to administer them while maintaining the quality.
  • a bag-shaped culture container As a container for culturing suspension cells, a bag-shaped culture container (bag) has been devised (Patent Document 1).
  • a bag is composed of a poly (ethylene butylene) polystyrene block copolymer and a polymer alloy in which an ethylene acrylate copolymer is mixed with a polymer mixture of polypropylene, and has excellent transparency and gas permeability.
  • bags suitable for culturing adherent cells have also been devised (Patent Documents 2 and 3).
  • the bag disclosed in Patent Document 2 has been improved so that the inner surface of the bag is subjected to corona discharge treatment to increase hydrophilicity and cells can be easily adhered.
  • the bag disclosed in Patent Document 3 is made of a synthetic resin sheet having a predetermined bending rigidity so that the bag is not easily deformed during culture, and the container is deformed when the bag is moved. It is characterized in that it can prevent cell detachment and death caused by doing so.
  • commercially available bags are also known, for example, a CultiLife [registered trademark] Spin bag (manufactured by TAKARA) made of ethylene (Et) -vinyl acetate (VA) copolymer (EVA), or a fluororesin.
  • VueLife FEP Bag 32-C manufactured by American Fluoroseal Corporation
  • culture bag A-1000NL manufactured by Nipro
  • FEP tetrafluoroethylene
  • HFP hexafluoropropylene copolymer
  • An object of the present invention is to provide a container that can administer, store, or prepare a mammalian cell-containing solution having a high concentration and a high proportion of living cells.
  • Mammalian cells are administered using a container in which a surface in contact with mammalian cells is formed with a fluororesin having a total number of 70 or less per 1 ⁇ 10 6 carbons, and mammals are used in such containers.
  • a surface in contact with a mammalian cell is formed by a fluororesin in which the total number of non-fluorinated group ends and —CF 2 H group ends in the fluororesin is 70 or less per 1 ⁇ 10 6 carbons.
  • a container for administration, storage, or culture of a mammalian cell characterized by comprising: (2) a fluororesin containing end groups of -CF 3 1 or more, for administration of mammalian cells, wherein a surface in contact with the mammalian cells are formed, for storage, or the culture vessel.
  • the fluororesin is at least one fluororesin selected from a tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer and a tetrafluoroethylene-perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (1)
  • a mammalian cell-containing solution is administered or stored using the administration, storage, or culture container of the present invention, or when mammalian cells are cultured, cell adhesion to the inner surface of the container and cell viability decrease are reduced. Because it can be effectively suppressed, it is possible to administer, store, or prepare a liquid containing a high concentration of mammalian cells containing a high proportion of living cells. Regeneration using a liquid containing mammalian cells (suspension) It contributes to medical care.
  • a CF 3 for use in administration, storage, or culture of mammalian cells is used.
  • the resin is generically referred to as “the present fluororesin”, and is not particularly limited as long as the surface is in contact with mammalian cells (mammalian cell-containing solution).
  • the entire container is the present fluororesin. May be formed.
  • the container of the present invention is characterized in that the surface of the container that comes into contact with mammalian cells is formed of the present fluororesin.
  • a mammalian cell-containing solution is administered or stored using a container having such characteristics, or when mammalian cells are cultured, cell adhesion and cell viability decrease are effectively suppressed.
  • culture of suspension cells administration and / or storage of adhesive cell-containing solution and suspension culture of adhesive cells can be suitably used.
  • the above containers are matrigel, entactin, fibronectin, temperature-responsive polymer (such as PIPAAm), polycation (such as polylysine), gelatin, lectin, many
  • the inner surface of the container is not coated (or arranged) with cell adhesive substances such as sugars (hyaluronic acid, etc.), polylactic acid, polyglycolic acid, ⁇ -aminocaprolactone, type I collagen, type IV collagen, chitosan, laminin. Those are preferred.
  • “storage” includes storage during transfer.
  • suspension cells examples include suspension cells such as red blood cells and white blood cells (derived from peripheral blood) (neutrophils, monocytes [monocytes, lymphocytes], macrophages, etc.).
  • the adhesive cells include embryonic stem cells (embryonic stem cells: ES cells), embryonic germ cells (embryonic germ cells: EG cells), germ line stem cells (germline stem cells: GS cells), and induced pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells such as (iPS cells; induced pluripotent stem cell), multipotent stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, myocardial progenitor cells, vascular endothelial progenitor cells, neural progenitor cells, fat precursors Stem cells such as cells, dermal fibroblasts, skeletal muscle myoblasts, osteoblasts, odontoblasts, etc., cardiomyocytes, vascular endothelial cells, nerve cells, fat cells, skin fibers Mature cells such as cells, skeletal muscle cells, bone cells, hepatocyte (hepatocyte) cells, umbilical vein endothelial cells, cutaneous microlymphatic endothelial
  • the fluororesin of the present invention preferably does not contain a —CF 2 H group end, but the end of a non-fluorinated group in the fluororesin (for example, —COF, —COOH, and —COOH, —CH 2 OH, —CONH associated with water) 2, the total of the functional groups) such as -COOCH 3 and -CF 2 H group terminal is preferably less than 70 amino 1 ⁇ 10 6 per carbon, more preferably less than 35 1 ⁇ 10 6 per carbon. Furthermore, 20 or less per 1 ⁇ 10 6 carbon is more preferable, and 10 or less per 1 ⁇ 10 6 carbon is particularly preferable.
  • the surface in contact with the mammalian cell is obtained by the fluororesin in which the total number of non-fluorinated group ends and —CF 2 H group ends in the fluororesin is 70 or less per 1 ⁇ 10 6 carbons.
  • fluororesin in which the total number of non-fluorinated group ends and —CF 2 H group ends in the fluororesin is 70 or less per 1 ⁇ 10 6 carbons.
  • the fluororesin may be a fluororesin that includes one or more —CF 3 end groups and has a more stabilized end structure. Fluorinated resins in which is fluorinated and has —CF 3 are also included.
  • the above-mentioned —CF 3 terminal group can be analyzed by high-temperature 19 F NMR measurement.
  • non-fluorinated group terminal means a terminal having reactivity and generally called an unstable terminal.
  • Specific examples of the non-fluorinated group terminal include —COF, —COOH, water and Mention may be made of functional groups such as —COOH, —CH 2 OH, —CONH 2 , —COOCH 3 .
  • the total of non-fluorinated group terminals (for example, —COF, —COOH, and functional groups such as —COOH, —CH 2 OH, —CONH 2 , —COOCH 3 associated with water) in the present fluororesin is 1 ⁇ carbon. 70 or less per 10 6 is preferable, and 50 or less per 1 ⁇ 10 6 carbon is more preferable. Further, more preferably less 35 1 ⁇ 10 6 per carbon, carbon 1 ⁇ 10 15 per 6 or less is more preferable, more preferably still not more than 10 pieces 1 ⁇ 10 6 per carbon, 1 ⁇ 10 5 cells per 6 carbons The following is particularly preferable, and 2 or less per 1 ⁇ 10 6 carbon is particularly preferable.
  • fluororesin examples include polytetrafluoroethylene (PTFE), tetrafluoroethylene (TFE) -hexafluoropropylene (HFP) copolymer (FEP), and TFE-perfluoroalkyl vinyl ether (PAVE).
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • TFE tetrafluoroethylene
  • HFP tetrafluoropropylene
  • PAVE TFE-perfluoroalkyl vinyl ether
  • a copolymer (PFA) can be mentioned, Among these, FEP and PFA are preferable and FEP can be illustrated suitably.
  • the “TFE-HFP copolymer” means a copolymer containing at least TFE and HFP. That is, the “TFE-HFP copolymer” includes a binary copolymer of TFE and HFP (TFE / HFP copolymer; FEP), and a copolymer of TFE, HFP and vinyl fluoride (VF).
  • TFE / HFP / VF copolymer Polymer (TFE / HFP / VF copolymer), TFE / HFP / vinylidene fluoride (VDF) copolymer (TFE / HFP / VDF copolymer), TFE / HFP / perfluoro (alkyl vinyl ether) ( Terpolymers such as copolymers with PAVE) (TFE / HFP / PAVE copolymer), and copolymers of TFE, HFP, VF and VDF (TFE / HFP / VF / VDF copolymer).
  • TFE / HFP / VF / PAVE copolymer TFE / HFP / VF / PAVE copolymer
  • TFE / HFP / VDF / PAVE copolymer TFE / HFP / VD
  • Quaternary copolymers such as TFE / HFP / VF / VDF / PAVE copolymer
  • quaternary copolymers such as TFE / HFP / VF / VDF / PAVE copolymer.
  • the TFE-HFP copolymer is preferably a TFE / HFP copolymer or a TFE / HFP / PAVE copolymer.
  • the mass ratio of TFE to HFP in such a TFE / HFP copolymer is preferably 80 to 97/3 to 20, and more preferably 84 to 92/8 to 16.
  • the mass ratio of TFE, HFP and PAVE in the TFE / HFP / PAVE copolymer is preferably 70 to 97/3 to 20 / 0.1 to 10, more preferably 81 to 92/5 to 16 / 0.3. ⁇ 5 is more preferred.
  • TFE-PAVE copolymer means a copolymer containing at least TFE and PAVE. That is, the “TFE-PAVE copolymer” includes a binary copolymer of TFE and PAVE (TFE / PAVE copolymer; PFA), and a copolymer of TFE, PAVE and hexafluoropropylene (HFP).
  • TFE-PAVE copolymer includes a binary copolymer of TFE and PAVE (TFE / PAVE copolymer; PFA), and a copolymer of TFE, PAVE and hexafluoropropylene (HFP).
  • TFE / PAVE / HFP copolymer TFE / PAVE / vinylidene fluoride (VDF) copolymer (TFE / PAVE / VDF copolymer), TFE / PAVE / chlorotrifluoroethylene (CTFE) Terpolymers such as TFE / PAVE / CTFE copolymer, TFE / PAVE / HFP / VDF copolymer (TFE / PAVE / HFP / VDF copolymer), TFE Copolymer of TFE / PAVE / HFP / CTFE (TFE / PAVE / HFP / CTFE copolymer), TFE / PAVE / VDF / CTFE Quaternary copolymers such as TFE / PAVE / VDF / CTFE copolymer, and TFE / PAVE / HFP / VDF / CTFE copolymer (TFE / PAVE / HFP / HFP
  • the PAVE constituting the PAVE unit is not particularly limited.
  • perfluoro (methyl vinyl ether) [PMVE] perfluoro (ethyl vinyl ether) [PEVE], perfluoro (propyl vinyl ether) [PPVE], perfluoro ( Butyl vinyl ether), perfluoro (pentyl vinyl ether), perfluoro (hexyl vinyl ether), perfluoro (heptyl vinyl ether) and the like.
  • the mass ratio of TFE to PAVE in the TFE-PAVE copolymer is preferably 90 to 98/2 to 10, more preferably 92 to 97/3 to 8.
  • the end group of the fluororesin synthesized according to a conventional method such as suspension polymerization or emulsion polymerization is brought into contact with the fluororesin and a fluorine-containing compound (for example, a fluorine radical source) before the fluororesin is melt-extruded.
  • a fluorine-containing compound for example, a fluorine radical source
  • fluorination treatment by a known method such as a method of stabilizing treatment and a method of fluorination treatment by contacting a fluorine-containing compound and a fluorine-containing compound obtained after melt extrusion of the fluororesin Can be produced.
  • the fluorine-containing compound is brought into contact with the molded product molded from the fluororesin, such as a film molded by melting the fluororesin, a container molded from the film, or a container molded from the fluororesin. Can also be performed. Moreover, these processing methods can also be combined.
  • the total of the non-fluorinated group ends and the total of the non-fluorinated group ends and the —CF 2 H group ends are 70 per 1 ⁇ 10 6 carbon at each stage of the fluororesin, pellet, and film as raw materials. It is not necessary that the number be 70 or less per 1 ⁇ 10 6 carbons on the surface of the final container that contacts the cells. Further, if the fluorine resin containing end groups of -CF 3 one or more, fluorine resin as a raw material, pellets need not end groups -CF 3 is 1 or more at each stage of the film, final It is sufficient that the fluororesin contains one or more terminal groups of —CF 3 on the surface of the container that contacts the cells.
  • fluorine radical source examples include, but are not limited to, halogen fluoride such as IF 5 and ClF 3 , F 2 gas, CoF 3 , AgF 2 , UF 6 , OF 2 , N 2 F 2 , and CF 3 OF. Can do.
  • F 2 gas may have a concentration of 100%, but from the viewpoint of safety, it is mixed with an inert gas and diluted to 5 to 50% by mass, preferably 15 to 30% by mass.
  • the inert gas include nitrogen gas, helium gas, argon gas and the like, and nitrogen gas is preferable from the viewpoint of cost effectiveness.
  • the fluorination treatment is preferably performed at a temperature of 20 to 220 ° C., more preferably 100 to 200 ° C.
  • the fluorination treatment is preferably performed for 5 to 30 hours, more preferably for 10 to 20 hours.
  • the container obtained by the present invention may have a surface roughness adjusted for arithmetic average roughness (Ra), surface roughness root mean square roughness (RMS), and surface free energy.
  • Ra arithmetic average roughness
  • RMS surface roughness root mean square roughness
  • surface free energy is 16.5 to 18.5 (mJ / m 2 ) and the like provided with the inner surface of the container.
  • Examples of the form of the container of the present invention include dishes, well plates, bags, bottles, centrifuge tubes, vials, syringes, tubes and the like.
  • the container of the present invention is a cell administration container
  • Infusion bags, (infusion) bottles and tubes
  • the container of the present invention is a cell storage container
  • dishes, well plates, bags, bottles, centrifuge tubes and vials are preferred
  • the container of the present invention is a cell culture.
  • the bag-shaped container of the present invention can be suitably exemplified because it can be applied to all uses for cell administration, storage, and culture.
  • the above dishes, well plates, bags, bottles, centrifuge tubes, vials, syringes, tubes, etc. are compression molding, extrusion molding, transfer molding, inflation molding, blow molding, injection molding, rotational molding, lining molding, foam extrusion molding, It can be produced by combining a film forming method or the like with a sealing means such as heat sealing, high frequency fusion, or ultrasonic fusion as necessary.
  • the bag can be manufactured by stacking the fluororesin material film (sheet) and then heat-sealing the edge using an impulse sealer.
  • the film used for forming the bag may be a single-layer film or a multilayer film composed of two or more layers.
  • at least the inner surface in contact with mammalian cells is the fluororesin of the present invention.
  • the other layer film may be a layer film of the material (for example, polyolefin resin material) different from this fluororesin.
  • the film is laminated using a method such as a heat laminating method, a heat compression method, a high-frequency heating method, a solvent casting method, and an extrusion lamination method.
  • the base material such as dishes, well plates, bags, bottles, centrifuge tubes, vials, syringes, tubes, etc. manufactured from glass, metal, resin, etc.
  • the coating agent made of the fluororesin is coated with the coating agent made of the fluororesin.
  • An inventive container can also be obtained. Any method can be adopted depending on the form of the substrate. Examples of such coating treatment include spin coating, spray coating, bar coating, roll coating, dipping, brush coating, rotrining, electrostatic coating, and the like.
  • a coating layer is formed by a drying process and a high temperature heat treatment. Moreover, you may make it thick to arbitrary film thickness by further applying the coating agent containing this this fluororesin.
  • the mammalian cell-containing solution when a mammalian cell-containing solution is stored frozen, the mammalian cell-containing solution is stored at a temperature that does not freeze (usually within a range of 0 to 37 ° C., preferably 0 to 25 ° C. [room temperature]).
  • a temperature that does not freeze usually within a range of 0 to 37 ° C., preferably 0 to 25 ° C. [room temperature]
  • the mammalian cell-containing solution after storage at the non-freezing temperature is not transferred to another container. It can be used for administration (transplantation).
  • hMSC Human Mesenchymal Stem Cells
  • the survival rate of hMSC after storage as shown in Table 5, when cell bags D, F, G, J, and K (Example samples 1, 3, 4, 6, and 7) were used, respectively. They were 93%, 96%, 93%, 95%, and 96%, and all were as high as 90% or more.
  • the recovery rate of viable hMSC after storage was as follows: Cell Bags A, B, C, H, L, and M (Comparative Samples 1 and 2) 3, 4, 5, and 6) compared to (34%, 37%, 31%, 37%, 31%, and 32%, respectively) cell bags D, F, G, J, and It was higher when stored in K (Example Samples 1, 3, 4, 6, and 7) (46%, 66%, 92%, 66%, and 77%, respectively).
  • the survival rate of hMSC after storage was as high as 95% when the cell bag G (Example Sample 4) was used.
  • the recovery rate of viable hMSC after storage was as shown in Table 9 when stored in cell bags B and L (Comparative Samples 2 and 5) (27 each). % And 22%) were higher when stored in the cell bag G (Example sample 4) (76%).
  • the survival rates of hMSC after storage were 93% and 93 when cell bags E, F, I, and K (Example samples 2, 3, 5, and 7) were used, respectively. %, 91%, and 92%, all being as high as 90% or more.
  • the recovery rate (cell survival rate x cell recovery rate) of viable hMSC after storage as shown in Table 12, compared with the case where it was stored in the cell bag B (Comparative Example Sample 2) (45%), It was higher when stored in cell bags E, F, I, and K (Example Samples 2, 3, 5, and 7) (77%, 69%, 76%, and 61%, respectively).
  • Example samples 1 to 7 show that cell adhesion and cell survival on the inner surface of the container can be obtained by administering, storing, or culturing cells using cell bags D to G and I to K (Example samples 1 to 7). Since the rate reduction can be effectively suppressed, it is shown that a cell-containing solution having a high concentration and a high proportion of living cells can be administered, stored, or prepared.
  • a cell-containing solution having a high concentration and a high proportion of living cells can be administered, stored, or prepared, which contributes to regenerative medicine using a mammalian cell-containing solution (suspension). It is.

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Abstract

－ＣＦ３の末端基を少なくとも一部含むフッ素樹脂素材で哺乳動物細胞と接触する表面が形成されている容器、あるいは、フッ素樹脂における非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂材で哺乳動物細胞と接触する表面が形成されている容器を用いて哺乳動物細胞を投与したり、かかる容器内で、哺乳動物細胞を保存又は培養すると、容器内面への細胞接着や細胞生存率低下を効果的に抑制できる。したがって、これらの容器を使用することにより、高濃度でかつ生細胞の割合が高い哺乳動物細胞含有液を投与、保存、又は調製することが可能であり、哺乳動物細胞含有液（懸濁液）を用いた再生医療に資するものである。

Description

細胞投与用、保存用、又は培養用容器
　本発明は、－ＣＦ３の末端基を１つ以上含むフッ素樹脂や、フッ素樹脂における非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により、哺乳動物細胞と接触する表面が形成されている、哺乳動物細胞の投与、保存、又は培養に用いるための容器に関する。
　胚性幹細胞（Embryonic Stem cell；ＥＳ細胞)や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、無限の増殖能力と多様な組織細胞への多分化能を有する細胞である。ヒト多能性幹細胞は、さらに試験管内での分化誘導によって各種の機能を有した細胞へと分化させた後に投与効果が期待される患者に投与し、再生医療への応用が期待されている。また、間葉系幹細胞などの体性幹細胞についても、栄養因子やサイトカインの放出によって得られる治療効果や、組織の損傷部位にホーミングした後にその構成細胞に分化し補完修復する効果が期待され、臨床研究が試みられている。これらを実現するためには、高品質の細胞を安定的に大量培養又は保存することや、その品質を保ったまま投与することが必要である。
　浮遊性細胞を培養する容器として、バッグ形状の培養容器（バッグ）が考案されている（特許文献１）。かかるバッグは、ポリ（エチレンブチレン）ポリスチレンブロック共重合体と、ポリプロピレンの重合体混合物にエチレンアクリル酸エステル共重合体を混合したポリマーアロイとからなり、透明性やガス透過性が優れている点に特徴がある。他方、接着性細胞の培養に適したバッグも考案されている（特許文献２、３）。特許文献２に開示されているバッグは、バッグ内表面をコロナ放電処理することにより親水性を高め、細胞が接着しやすくなるように改良されたものである。また、特許文献３に開示されているバッグは、培養中にバッグが容易に変形しないように、所定の折り曲げ剛性を有する合成樹脂シートからなるものであり、バッグを移動させたときに容器が変形することにより生じる細胞の剥離や死滅を防ぐことができる点に特徴がある。
　さらに、バッグの市販品も知られており、例えば、エチレン（Ｅｔ）－酢酸ビニル（ＶＡ）共重合体（ＥＶＡ）素材のCultiLife［登録商標］Spinバッグ（TAKARA社製）や、フッ素樹脂であるテトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）－ヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）共重合体（ＦＥＰ）を材料としたVueLife FEP Bag 32-C（American Fluoroseal Corporation社製）、カルチャーバッグＡ－１０００ＮＬ（ニプロ社製）等が市販されている。
　しかしながら、これらのバッグはいずれも、接着性細胞のバッグ内表面への接着を抑制し、浮遊状態で細胞を維持又は培養するためのものではない。
　一方、食品加熱加工具の表面を、ＴＦＥ－パーフルオロアルキルビニルエーテル（ＰＦＶＥ）共重合体（ＰＦＡ）の不安定末端基をフッ素化させることにより除去したフッ素樹脂フィルムで被覆すると、焦げ付きに対する防汚性が向上することが知られている（特許文献４）。しかしながら、末端基をフッ素化させたフッ素化樹脂による、細胞接着性については知られていない。
特開平３－６５１７７号公報 特開平６－９８７５６号公報 特開２００８－１７８３９号公報 特許３９６２１５３号公報
　本発明の課題は、高濃度でかつ生細胞の割合が高い哺乳動物細胞含有液を投与、保存、又は調製することができる容器を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、－ＣＦ３の末端基を１つ以上含むフッ素樹脂や、フッ素樹脂における非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により、哺乳動物細胞と接触する表面が形成されている容器を用いて、哺乳動物細胞を投与したり、かかる容器中で哺乳動物細胞を保存又は培養したりすると、容器内面への細胞接着や細胞生存率低下が効果的に抑制され、高濃度でかつ生細胞の割合が高い哺乳動物細胞含有液を投与、保存、又は調製できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）フッ素樹脂における非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により、哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器。
（２）－ＣＦ３の末端基を１つ以上含むフッ素樹脂により、哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器。
（３）非フッ素化基末端が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする、上記（２）記載の哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器。
（４）フッ素樹脂が、テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン系共重合体、及びテトラフルオロエチレン－パーフルオロアルキルビニルエーテル系共重合体から選ばれる少なくとも１つのフッ素樹脂であることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
（５）バッグであることを特徴とする上記（１）～（４）のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
（６）哺乳動物細胞が接着性細胞であることを特徴とする上記（１）～（５）のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
（７）哺乳動物細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする上記（１）～（６）のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
　本発明の投与用、保存用、又は培養用容器を用いて哺乳動物細胞含有液を投与又は保存したり、哺乳動物細胞を培養したりすると、容器内表面への細胞接着や細胞生存率低下を効果的に抑制できるため、高濃度でかつ生細胞の割合が高い哺乳動物細胞含有液を投与、保存、又は調製することが可能であり、哺乳動物細胞含有液（懸濁液）を用いた再生医療に資するものである。
　本発明の投与用、保存用、又は培養用容器（以下、単に「本発明の容器」ということがある）としては、哺乳動物細胞の投与、保存、又は培養に用いるための、－ＣＦ３の末端基を１つ以上含むフッ素樹脂や、フッ素樹脂における非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂（以下、これらフッ素樹脂を総称して「本件フッ素樹脂」ということがある）により哺乳動物細胞（哺乳動物細胞含有液）と接触する表面が形成されている容器であれば特に制限されず、容器全体が本件フッ素樹脂により形成されていてもよい。本発明の容器は、哺乳動物細胞と接触する容器表面が本件フッ素樹脂で形成されている点に特徴がある。かかる特徴を有する容器を用いて哺乳動物細胞含有液を投与又は保存したり、哺乳動物細胞を培養したりすると、細胞接着や細胞生存率低下が効果的に抑制されるため、本発明の容器は、浮遊性細胞含有液の投与及び／又は保存や、浮遊性細胞の培養の他、接着性細胞含有液の投与及び／又は保存や、接着性細胞の浮遊培養に好適に用いることができる。細胞含有液の投与及び／又は保存や、細胞の浮遊培養に用いる場合、上記容器は、マトリゲル、エンタクチン、フィブロネクチン、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ等）、ポリカチオン（ポリリジン等）、ゼラチン、レクチン、多糖類（ヒアルロン酸等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ε－アミノカプロラクトン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、キトサン、ラミニンなどの細胞接着性物質でその容器内表面がコーティング（又は配置）されていないものが好ましい。なお、本発明において、「保存」には、移送中の保存も含まれる。
　上記浮遊性細胞としては、赤血球、（末梢血由来の）白血球（好中球、単核球［単球、リンパ球］、マクロファージ等）などの浮遊性細胞を挙げることができる。
　上記接着性細胞としては、胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）、生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞；induced pluripotent stem cell）等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞等の複能性幹細胞、心筋前駆細胞、血管内皮前駆細胞、神経前駆細胞、脂肪前駆細胞、皮膚線維芽細胞、骨格筋筋芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞等の単能性幹細胞（前駆細胞）などの幹細胞や、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、皮膚線維細胞、骨格筋細胞、骨細胞、ヘパトサイト（肝）細胞、臍帯静脈内皮細胞、皮膚微小リンパ管内皮細胞、表皮角化細胞、気管支上皮細胞、メラノサイト細胞、平滑筋細胞、象牙細胞等の成熟細胞を挙げることができ、間葉系幹細胞が好ましい。
　本件フッ素樹脂は－ＣＦ２Ｈ基末端を含まないものが好ましいが、フッ素樹脂における非フッ素化基末端（例えば、－ＣＯＦ、－ＣＯＯＨ、及び水と会合した－ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＣＨ３等の官能基）と－ＣＦ２Ｈ基末端との合計が、炭素１×１０６当たり７０個以下であることが好ましく、炭素１×１０６当たり３５個以下がより好ましい。さらに、炭素１×１０６当たり２０個以下がより好ましく、炭素１×１０６当たり１０個以下が特に好ましい。
　すなわち、本発明として、フッ素樹脂における非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により、哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器を挙げることができる。
　なお、上記の－ＣＯＦ、－ＣＯＯＨ、及び水と会合した－ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＣＨ３、－ＣＦ２Ｈの、炭素１×１０６当たりの数は、ＦＴ－ＩＲより算出することができる。
　また、本件フッ素樹脂としては、－ＣＦ３の末端基を１つ以上含み、より安定化された末端構造を有するフッ素樹脂であればよく、本件フッ素樹脂には、非フッ素化基末端の一部がフッ素化され、－ＣＦ３を有するフッ素樹脂も含まれる。
　上記の－ＣＦ３末端基は、高温１９Ｆ　ＮＭＲ測定により分析することができる。
　本発明において、「非フッ素化基末端」とは、反応性を有し、一般に不安定末端といわれる末端を意味し、非フッ素化基末端としては、具体的に－ＣＯＦ、－ＣＯＯＨ、水と会合した－ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＣＨ３等の官能基を挙げることができる。
　本件フッ素樹脂における非フッ素化基末端（例えば、－ＣＯＦ、－ＣＯＯＨ、及び水と会合した－ＣＯＯＨ、－ＣＨ２ＯＨ、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＯＣＨ３等の官能基）の合計は、炭素１×１０６当たり７０個以下が好ましく、炭素１×１０６当たり５０個以下がより好ましい。さらに、炭素１×１０６当たり３５個以下がより好ましく、炭素１×１０６当たり１５個以下がさらに好ましく、炭素１×１０６当たり１０個以下がさらにより好ましく、炭素１×１０６当たり５個以下が特に好ましく、炭素１×１０６当たり２個以下が特により好ましい。
　すなわち、本発明の一態様として、－ＣＦ３の末端基を１つ以上含むフッ素樹脂における非フッ素化基末端が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器を挙げることができる。
　本件フッ素樹脂としては、具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）－ヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）系共重合体（ＦＥＰ）、ＴＦＥ－パーフルオロアルキルビニルエーテル（ＰＡＶＥ）系共重合体（ＰＦＡ）を挙げることができ、これらの中でも、ＦＥＰ、ＰＦＡが好ましく、ＦＥＰを好適に例示することができる。
　上記「ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体」とは、少なくともＴＦＥとＨＦＰとを含む共重合体を意味する。すなわち、「ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体」には、ＴＦＥとＨＦＰとの２元共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ共重合体；ＦＥＰ）の他、ＴＦＥとＨＦＰとビニルフルオライド（ＶＦ）との共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとビニリデンフルオライド（ＶＤＦ）との共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＤＦ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとパーフルオロ（アルキルビニルエーテル）（ＰＡＶＥ）との共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体）等の３元共重合体や、ＴＦＥとＨＦＰとＶＦとＶＤＦとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ／ＶＤＦ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとＶＦとＰＡＶＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ／ＰＡＶＥ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとＶＤＦとＰＡＶＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＤＦ／ＰＡＶＥ共重合体）等の４元共重合体や、ＴＦＥとＨＦＰとＶＦとＶＤＦとＰＡＶＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ／ＶＤＦ／ＰＡＶＥ共重合体）等の５元共重合体も含まれる。
　上記ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体としては、ＴＦＥ／ＨＦＰ共重合体やＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体が好ましい。かかるＴＦＥ／ＨＦＰ共重合体におけるＴＦＥとＨＦＰとの質量比は、８０～９７／３～２０が好ましく、８４～９２／８～１６がより好ましい。また、上記ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体におけるＴＦＥとＨＦＰとＰＡＶＥとの質量比は、７０～９７／３～２０／０．１～１０が好ましく、８１～９２／５～１６／０．３～５がより好ましい。
　上記「ＴＦＥ－ＰＡＶＥ系共重合体」とは、少なくともＴＦＥとＰＡＶＥとを含む共重合体を意味する。すなわち、「ＴＦＥ－ＰＡＶＥ系共重合体」には、ＴＦＥとＰＡＶＥとの２元共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ共重合体；ＰＦＡ）の他、ＴＦＥとＰＡＶＥとヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）との共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ／ＨＦＰ共重合体）、ＴＦＥとＰＡＶＥとビニリデンフルオライド（ＶＤＦ）との共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ／ＶＤＦ共重合体）、ＴＦＥとＰＡＶＥとクロロトリフルオロエチレン（ＣＴＦＥ）との共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ／ＣＴＦＥ共重合体）等の３元共重合体や、ＴＦＥとＰＡＶＥとＨＦＰとＶＤＦとの共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ／ＨＦＰ／ＶＤＦ共重合体）、ＴＦＥとＰＡＶＥとＨＦＰとＣＴＦＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ／ＨＦＰ／ＣＴＦＥ共重合体）、ＴＦＥとＰＡＶＥとＶＤＦとＣＴＦＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ／ＶＤＦ／ＣＴＦＥ共重合体）等の４元共重合体や、ＴＦＥとＰＡＶＥとＨＦＰとＶＤＦとＣＴＦＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＰＡＶＥ／ＨＦＰ／ＶＤＦ／ＣＴＦＥ共重合体）等の５元共重合体も含まれる。
　上記ＰＡＶＥ単位を構成するＰＡＶＥとしては、特に限定されず、例えば、パーフルオロ（メチルビニルエーテル）〔ＰＭＶＥ〕、パーフルオロ（エチルビニルエーテル）〔ＰＥＶＥ〕、パーフルオロ（プロピルビニルエーテル）〔ＰＰＶＥ〕、パーフルオロ（ブチルビニルエーテル）、パーフルオロ（ペンチルビニルエーテル）、パーフルオロ（ヘキシルビニルエーテル）、パーフルオロ（ヘプチルビニルエーテル）等を挙げることができる。
　上記ＴＦＥ－ＰＡＶＥ系共重合体におけるＴＦＥとＰＡＶＥの質量比は、９０～９８／２～１０が好ましく、９２～９７／３～８がより好ましい。
　本件フッ素樹脂は、懸濁重合や乳化重合等の定法にしたがって合成したフッ素樹脂の末端基を、フッ素樹脂を溶融押出する前にフッ素樹脂とフッ素含有化合物（例えば、フッ素ラジカル源）とを接触させて安定化処理を行う方法や、フッ素樹脂を溶融押出した後に得られたフッ素樹脂のペレットとフッ素含有化合物とを接触させてフッ素化処理を行う方法等の公知の方法によってフッ素化処理することにより作製することができる。また、フッ素樹脂製造時（重合反応時）、フッ素モノマーと共に末端基を制御できる連鎖移動剤や重合触媒を使用して得ることもできる。そしてまた、本件フッ素樹脂として市販品を用いることもできる。さらに、フッ素樹脂を溶融して成形したフィルムや、該フィルムから成形した容器や、フッ素樹脂から成形した容器等のように、フッ素樹脂より成形した成形物に対してフッ素含有化合物を接触させてフッ素化処理を行うこともできる。また、これらの処理方法を組み合わせることもできる。
　すなわち、前記非フッ素化基末端の合計や、非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端との合計は、原料となるフッ素樹脂、ペレット、フィルムの各段階において炭素１×１０６当たり７０個以下である必要はなく、最終的な容器の細胞と接触する表面において炭素１×１０６当たり７０個以下であればよい。また、－ＣＦ３の末端基を１つ以上含むフッ素樹脂の場合、原料となるフッ素樹脂、ペレット、フィルムの各段階において－ＣＦ３の末端基が１つ以上である必要はなく、最終的な容器の細胞と接触する表面においてフッ素樹脂が－ＣＦ３の末端基を１つ以上含んでいればよい。
　上記フッ素ラジカル源としては、特に限定されないがＩＦ５、ＣｌＦ３等のフッ化ハロゲン、Ｆ２ガス、ＣｏＦ３、ＡｇＦ２、ＵＦ６、ＯＦ２、Ｎ２Ｆ２、ＣＦ３ＯＦなどを挙げることができる。かかるＦ２ガスは、１００％濃度のものであってもよいが、安全性の面から不活性ガスと混合し５～５０質量％、好ましくは１５～３０質量％に希釈して使用する。かかる不活性ガスとしては、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス等を挙げることができ、費用対効果の観点から窒素ガスが好ましい。
　上記フッ素化処理は、２０～２２０℃が好ましく、より好ましくは１００～２００℃の温度下で行う。上記フッ素化処理は、５～３０時間が好ましく、より好ましくは１０～２０時間行う。
　本発明により得られた容器は、表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）、表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）、及び表面自由エネルギーを調整したものであってもよい。例えば、表面粗度のＲａが３．５～６．５ｎｍであり、表面粗度のＲＭＳが４．５～８．０ｎｍであり、かつ表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）の容器内面を備えたもの等が挙げられる。
　本発明の容器の形態としては、例えば、ディッシュ、ウェルプレート、バッグ、ボトル、遠心チューブ、バイアル、シリンジ、チューブ等を挙げることができ、本発明の容器が細胞投与用容器の場合、シリンジ、（点滴用）バッグ、（点滴用）ボトル、チューブが好ましく、本発明の容器が細胞保存用容器の場合、ディッシュ、ウェルプレート、バッグ、ボトル、遠心チューブ、バイアルが好ましく、本発明の容器が細胞培養用容器の場合、ディッシュ、ウェルプレート、バッグ、ボトルが好ましい。特に、バッグ形状の本発明の容器は、細胞の投与用、保存用、及び培養用の全ての用途に適用できるため、好適に例示することができる。
　上記ディッシュ、ウェルプレート、バッグ、ボトル、遠心チューブ、バイアル、シリンジ、チューブ等は、圧縮成形、押出成形、トランスファー成形、インフレーション成形、ブロー成形、射出成形、回転成形、ライニング成形、発泡体押出成形、フィルム成形等の成形方法と、必要に応じてヒートシール、高周波融着、超音波融着等のシール手段を組み合わせて製造することができる。
　上記バッグは、具体的には、本件フッ素樹脂素材のフィルム（シート）を重ね合わせた上で、縁部を、インパルスシーラーを用いてヒートシールすることにより製造することができる。
　上記バッグの成形に用いるフィルムは、単層フィルムでも、二層以上の多層からなる積層フィルムでもよく、多層からなる積層フィルムである場合は、少なくとも哺乳動物細胞と接触する内表面が、本件フッ素樹脂素材の層フィルムとなるようにバッグを成形すればよく、他の層フィルムは、本件フッ素樹脂と異なる素材（例えば、ポリオレフィン系樹脂素材）の層フィルムであってもよい。フィルムの積層は、熱ラミネート法、熱圧縮法、高周波加熱法、溶剤キャスティング法及び押出ラミネーション法等の方法を用いて行う。
　また、ガラス、金属、樹脂等から製造されたディッシュ、ウェルプレート、バッグ、ボトル、遠心チューブ、バイアル、シリンジ、チューブ等といった基材に、本件フッ素樹脂からなるコーティング剤で被覆処理を行うことにより本発明の容器を得ることもできる。基材の形態に応じて任意の方法が採用できる。かかる被覆処理としては、スピンコート、スプレーコート、バーコート、ロールコート、浸漬、刷毛塗り、ロトライニング、静電塗装等の方法を挙げることができる。上記フッ素樹脂コーティング剤を基材に被覆した後、乾燥処理及び高温加熱処理によりコーティング層が形成される。また、本件フッ素樹脂を含むコーティング剤をさらに重ね塗りすることにより、任意の膜厚まで厚くしてもよい。
　本発明の容器は、例えば、哺乳動物細胞含有液を凍結保存する場合、哺乳動物細胞含有液を凍結しない温度（通常０～３７℃、好ましくは０～２５℃［室温］の範囲内）で保存（少なくとも６時間）する場合、浮遊培養法により浮遊性又は接着性の哺乳動物細胞を大量生産する場合、前記凍結しない温度で保存後の哺乳動物細胞含有液を別の容器に移すことなく、そのまま投与（移植）する場合等に用いることができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．細胞バッグの製造
　１６ｃｍ×１５ｃｍサイズで厚さ１００μｍの３種類のフィルムを、インパルスシーラーを用いてシール時間５０秒、シール圧力０．２ＭＰａ、シール幅５ｍｍの条件でヒートシールすることにより、１２種類の細胞バッグ（細胞バッグＡ～Ｃ［比較例サンプル１～３］、細胞バッグＤ～Ｇ［実施例サンプル１～４］、細胞バッグＨ［比較例サンプル４］、細胞バッグＩ～Ｋ［実施例サンプル５～７］、及び細胞バッグＬ［比較例サンプル５］）を製造した（表２参照）。なお、細胞バッグＭ（比較例サンプル６）として、ポリ塩化ビニル製の細胞バッグ（川澄化学工業株式会社製のカワスミ クォドラップ バッグACP-AMPを加工）を用いた（表２参照）。
１－１　非フッ素化基末端数及び－ＣＦ２Ｈ基末端数の測定
　厚み２５０～３００μｍ程度の当該樹脂のサンプルを作製し、ＦＴ－ＩＲ　Spectrometer　１７６０Ｘ（Perkin-Elmer社製）を用いて分析を行った。
　厚み２５０～３００μｍ程度の当該樹脂のサンプルを作製するにあたっては、ペレットを油圧プレスにて圧延して作製した。また、細胞バックを構成するフィルム（ペレットから溶融成形により作製）はそのまま、厚みが足りない場合は、フィルムを重ね合わせて測定した。
　標準サンプル（もはやスペクトルに実質的に差異がみられなくなるまで充分にフッ素化したサンプル）との差スペクトルを取得し、各ピークの吸光度を読み取り、次式に従って炭素数１×１０６個あたりの非フッ素化基末端数及び－ＣＦ２Ｈ基末端数を算出した。細胞バッグＡ～Ｍそれぞれの、非フッ素化基末端数及び－ＣＦ２Ｈ基末端数を表２に示す。
非フッ素化基末端及び－ＣＦ２Ｈ基末端の個数（炭素１×１０６個あたり）＝ｌ・ｋ／ｔ
ｌ：吸光度
ｋ：補正係数（表１参照）
ｔ：サンプル厚み（ｍｍ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
１－２　－ＣＦ３末端基の有無の測定
　当該樹脂フィルムを３７０℃で溶融させてストランドを作製し、核磁気共鳴分光計ＡＶＡＮＣＥ３００ＷＢ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用いて、高温１９Ｆ　ＮＭＲによるスペクトルの測定を行った。
　当該樹脂と同じ組成比の－ＣＦ３末端基が存在しない樹脂を溶融させて作製したストランドのスペクトルとの差スペクトルを取得し、δ＝－８２ｐｐｍにピークが見られれば－ＣＦ３末端基が有り、δ＝－８２ｐｐｍにピークが見られなければ－ＣＦ３末端基が無いと判断した。細胞バッグＡ～Ｍそれぞれの、－ＣＦ３末端基の有無を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２．細胞バッグを用いたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ；Human Mesenchymal Stem Cells）の保存
　上記実施例１の細胞バッグを用いて細胞を保存した場合に、細胞接着が抑制され、浮遊状態で保存できるかどうかについて解析した。
２－１　方法
２－１－１　細胞保存液の調製
　６．０（ｗ／ｖ）％トレハロース含有ラクテック（登録商標）注（大塚製薬工場社製）と、低分子デキストランＬ注（１０［ｗ／ｖ］％デキストラン含有ラクテック注）（大塚製薬工場社製）とを１：１で混合し、細胞保存液を調製した。
２－１－２　哺乳動物細胞の調製
〔１〕４×１０５個のｈＭＳＣ（Lonza社製、PT-2501）を、７５ｃｍ２フラスコを用いてＭＳＣ培養液（Lonza社製、PT-3001）存在下で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養し、約９０％コンフルエントで定法にしたがって継代した。
〔２〕継代したｈＭＳＣ（継代回数３回の細胞、ほぼ１００％コンフルエント）の培養液をアスピレーターで除き、フラスコ当たり８ｍＬのＰＢＳ（Invitrogen社製）でｈＭＳＣをリンスした。
〔３〕ＰＢＳをアスピレーターで除き、フラスコ当たり３．７５ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（Lonza社製、CC-3232）を加え、室温で５分間静置した。
〔４〕ｈＭＳＣが９０％程度剥離するまで顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔５〕フラスコ当たり３．７５ｍＬのＭＳＣ培養液を加え、トリプシン反応を停止させ、ピペッティングによりｈＭＳＣを回収し、５０ｍＬ遠心チューブに移した。
〔６〕６００×ｇ、５分間、２５℃で遠心分離を行った。
〔７〕上清をアスピレーターで除き、１フラスコ当たり３ｍＬの上記細胞保存液を加え、ｈＭＳＣペレット（沈殿物）を懸濁した。
〔８〕１０μＬのｈＭＳＣ-ＢＭ懸濁液を採取し、細胞計数盤で細胞数を計測し、５×１０５個／ｍＬとなるように上記細胞保存液を添加し、氷冷した。
２－１－３　哺乳動物細胞の保存
〔１〕５×１０５個／ｍＬのｈＭＳＣ含有細胞保存液を、１３種類の細胞バッグＡ～Ｍ内に３ｍＬずつ播種した。
〔２〕インキュベーター（２５℃、５％ＣＯ２）（アズワン社製、PIC100）内に６時間静置・保存した後、細胞懸濁液の一部（２０μＬ）を回収し、２０μＬの０．４％トリパンブルー（Gibco社製）と混合し、細胞計数盤を用いて顕微鏡（ECLIPSE TS100、ニコン社製）下で細胞懸濁液の細胞濃度及び生細胞数を計測し、それぞれ細胞回収率（表４、７及び１０参照）及び細胞生存率（表５、８及び１１参照）を算出した。また、バッグの一部をハサミでカットし、６ウェルプレート上において、バッグに接着した細胞を顕微鏡（IX-70、オリンパス社製）下で観察した。なお、表４～表６、表７～表９、及び表１０～表１２の結果は、それぞれ独立した（ｈＭＳＣの調製時期が異なる）実験により得られたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
２－２　結果
　保存後のｈＭＳＣの回収率は、表４に示すとおり、細胞バッグＡ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｌ、及びＭ（比較例サンプル１、２、３、４、５、及び６）を用いた場合は、それぞれ３９％、４３％、３４％、４０％、３８％、及び３６％であったのに対して、細胞バッグＤ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、及びＫ（実施例サンプル１、３、４、６、及び７）を用いた場合は、それぞれ５０％、６９％、９９％、７０％、及び８０％と高かった。
　また、保存後のｈＭＳＣの生存率は、表５に示すとおり、細胞バッグＤ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、及びＫ（実施例サンプル１、３、４、６、及び７）を用いた場合、それぞれ９３％、９６％、９３％、９５％、及び９６％であり、いずれもが９０％以上と高かった。
　その結果、保存後の生存したｈＭＳＣの回収率（細胞生存率×細胞回収率）は、表６に示すとおり、細胞バッグＡ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｌ、及びＭ（比較例サンプル１、２、３、４、５、及び６）内に保存した場合（それぞれ３４％、３７％、３１％、３７％、３１％、及び３２％）と比べ、細胞バッグＤ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、及びＫ（実施例サンプル１、３、４、６、及び７）内に保存した場合（それぞれ４６％、６６％、９２％、６６％、及び７７％）の方が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
２－３　結果
　保存後のｈＭＳＣの回収率は、表７に示すとおり、細胞バッグＢ及びＬ（比較例サンプル２及び５）を用いた場合は、それぞれ３０％及び２５％であったのに対して、細胞バッグＧ（実施例サンプル４）を用いた場合は、８０％と高かった。
　また、保存後のｈＭＳＣの生存率は、表８に示すとおり、細胞バッグＧ（実施例サンプル４）を用いた場合９５％と高かった。
　その結果、保存後の生存したｈＭＳＣの回収率（細胞生存率×細胞回収率）は、表９に示すとおり、細胞バッグＢ及びＬ（比較例サンプル２及び５）内に保存した場合（それぞれ２７％、及び２２％）と比べ、細胞バッグＧ（実施例サンプル４）内に保存した場合（７６％）の方が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
２－４　結果
　保存後のｈＭＳＣの回収率は、表１０に示すとおり、細胞バッグＢ（比較例サンプル２）を用いた場合は４９％であったのに対して、細胞バッグＥ、Ｆ、Ｉ、及びＫ（実施例サンプル２、３、５、及び７）を用いた場合は、それぞれ８３％、７５％、８４％、及び６７％と高かった。
　また、保存後のｈＭＳＣの生存率は、表１１に示すとおり、細胞バッグＥ、Ｆ、Ｉ、及びＫ（実施例サンプル２、３、５、及び７）を用いた場合、それぞれ９３％、９３％、９１％、及び９２％であり、いずれもが９０％以上と高かった。
　その結果、保存後の生存したｈＭＳＣの回収率（細胞生存率×細胞回収率）は、表１２に示すとおり、細胞バッグＢ（比較例サンプル２）内に保存した場合（４５％）と比べ、細胞バッグＥ、Ｆ、Ｉ、及びＫ（実施例サンプル２、３、５、及び７）内に保存した場合（それぞれ７７％、６９％、７６％、及び６１％）の方が高かった。
　さらに、保存後のｈＭＳＣは、細胞バッグＡ～Ｃ、Ｈ、Ｌ、及びＭ（比較例サンプル１～３、４、５、及び６）の内面に接着していたのに対して、細胞バッグＤ～Ｇ、及びＩ～Ｋ（実施例サンプル１～４、及び５～７）の内面への接着性は抑制され、特に、細胞バッグＥ～Ｇ、及びＩ～Ｋ（実施例サンプル２～４、及び５～７）の内面にはｈＭＳＣはほとんど接着していなかった。
　これらの結果は、細胞バッグＤ～Ｇ、及びＩ～Ｋ（実施例サンプル１～４、及び５～７）内で細胞を保存すると、細胞バッグＡ～Ｃ、Ｈ、Ｌ、及びＭ（比較例サンプル１～３、４、５、及び６）内で細胞を保存するよりも、生細胞の接着性を有意に抑制できることを示している。
３．細胞バッグを用いたマウス間葉系幹細胞由来１０Ｔ１／２細胞の培養
　上記実施例１で製造した細胞バッグを用いて細胞を培養した場合に、細胞接着が抑制され、浮遊状態で培養できるかどうかについて解析した。
３－１　方法
〔１〕マウス間葉系幹細胞由来１０Ｔ１／２細胞を、１０％ＦＢＳ（life technologies社製、gibco standard）を含むＤＭＥＭ(nacalai tesque社製、08458-45)培養液中に、１．０×１０５個／ｍＬとなるように懸濁させ、２種類の細胞バッグＢ（比較例サンプル２）及びＧ（実施例サンプル４）内に３ｍＬずつ播種した。
〔２〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養し、４時間、１、２、３、及び６日後、細胞懸濁液の一部（１０μＬ）を回収し、１０μＬの０．４％トリパンブルー（Gibco社製）と混合し、細胞計数盤で生細胞数を計測し、細胞生存率を算出した。また、細胞バッグに接着した細胞を光学顕微鏡（Nikon社製）下で観察した。
３－２　結果
　培養後の１０Ｔ１／２細胞の生存率は、細胞バッグＧ（実施例サンプル４）及び細胞バッグＢ（比較例サンプル２）を用いた場合はともに、７０％以上と高かった。一方、培養後にバッグ内面に接着した１０Ｔ１／２細胞の割合は、細胞バッグＢを用いた場合よりも細胞バッグＧを用いた方が少なかった。
　この結果は、細胞バッグＧ（実施例サンプル４）内で細胞を培養すると、細胞バッグＢ（比較例サンプル２）内で細胞を培養するよりも、生細胞の接着性を有意に抑制できることを示している。
　上記実施例１～３の結果は、細胞バッグＤ～Ｇ及びＩ～Ｋ（実施例サンプル１～７）を用いて細胞を投与、保存、又は培養すると、容器内表面への細胞接着や細胞生存率低下を効果的に抑制できるため、高濃度でかつ生細胞の割合が高い細胞含有液を投与、保存、又は調製できることを示している。
　本発明によると、高濃度でかつ生細胞の割合が高い細胞含有液を投与、保存、又は調製することが可能であり、哺乳動物細胞含有液（懸濁液）を用いた再生医療に資するものである。

Claims (7)

  1. 　フッ素樹脂における非フッ素化基末端と－ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により、哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器。
  2. 　－ＣＦ３の末端基を１つ以上含むフッ素樹脂により、哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器。
  3. 　非フッ素化基末端が炭素１×１０６当たり７０個以下であるフッ素樹脂により哺乳動物細胞と接触する表面が形成されていることを特徴とする、請求項２記載の哺乳動物細胞の投与用、保存用、又は培養用容器。
  4. 　フッ素樹脂が、テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン系共重合体、及びテトラフルオロエチレン－パーフルオロアルキルビニルエーテル系共重合体から選ばれる少なくとも１つのフッ素樹脂であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
  5. 　バッグであることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
  6. 　哺乳動物細胞が接着性細胞であることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
  7. 　哺乳動物細胞が間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の投与用、保存用、又は培養用容器。
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