TW202126803A - 用於細胞配給、保存或培養之容器 - Google Patents
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Abstract
若使用本發明的容器，配給哺乳動物細胞，或於該容器內，保存或培養哺乳動物細胞，則可有效抑制對容器內面的細胞黏著或細胞生存率降低；其中該容器係以至少包含一部分-CF3的端基的氟樹脂質材，形成與哺乳動物細胞接觸的表面，或者以每1×106個碳原子之氟樹脂的非氟化基末端與-CF2H基末端的合計數在70個以下的氟樹脂材料，形成與哺乳動物細胞接觸的表面。因此，藉由使用該等容器，可配給、保存或調製高濃度且生細胞比率高的哺乳動物細胞含有液，對使用哺乳動物細胞含有液(懸浮液)的再生醫療有助益。
Description
本發明係關於一種為了用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，該容器係藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面；其中該氟樹脂包含1個以上的-CF3端基，或每1×106個碳原子之氟樹脂的非氟化基末端與-CF2H基末端的合計數在70個以下。
胚胎幹細胞(Embryonic Stem cell；ES細胞)或人工誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell；iPS細胞)等多能性幹細胞，是具有無限的增殖能力及對於各式各樣組織細胞的多分化能力的細胞。人多能性幹細胞對再生醫療的應用受到期待，該幹細胞進一步在試管內，藉由分化誘導而分化為具有各種功能的細胞後，對期待配給效果的患者配給。又，關於間質幹細胞等成體幹細胞亦嘗試臨床研究，期待藉由釋出營養因子或細胞激素所獲得的治療效果，或歸巢至組織的損傷部位後，分化為其構成細胞而補全修復的效果。為了實現該等幹細胞，必須穩定且大量培養或保存高品質的細胞，或在保持其品質的狀態下配給。
培養懸浮性細胞的容器已發明一種袋狀的培養容器(袋體)(專利文獻1)。該袋體係由聚(乙烯丁烯)聚苯乙烯嵌段共聚物、及於聚丙烯的聚合物混合物中混合有乙烯丙烯酸酯共聚物之聚合物摻合物所組成，其特徵在於透明性或氣體穿透性優異。另，亦已發明一種適合黏著性細胞培養的袋體(專利文獻2、3)。專利文獻2所揭示的袋體係經改良，將袋體內表面進行電暈放電處理，以提高親
水性，使得細胞容易黏著。又，專利文獻3所揭示的袋體係由具有預定的撓曲剛度的合成樹脂片材所組成，以使得袋體在培養中不易變形，其特徵在於可防止使袋體移動時容器變形，因此發生細胞剝離或壞死。
進而言之，袋體的市售品亦為人所知，例如乙烯(Et)-醋酸乙烯(VA)共聚物(EVA)質材的CultiLife[註冊商標]Spin袋體(TAKARA製)、或以氟樹脂之四氟乙烯(TFE)-六氟丙烯(HFP)共聚物(FEP)作為材料的VueLife FEP Bag 32-C(American Fluoroseal Corporation製)、培養袋A-1000NL(Nipro製)等。
然而，該等袋體均非用以抑制黏著性細胞對袋體內表面的黏著，於懸浮狀態下維持或培養細胞。
另，已習知若將食品加熱加工器具的表面，藉由氟樹脂薄膜覆蓋，會提升對於燒焦附著的抗污性，其中該氟樹脂薄膜已藉由使TFE-全氟烷基乙烯基醚(PEVE)共聚物(PFA)的不穩定端基氟化而去除(專利文獻4)。然而，關於細胞黏著性，由端基已氟化的氟化樹脂所造成的影響尚未明瞭。
先行技術文獻
專利文獻
[專利文獻1] 日本特開平3-65177號公報
[專利文獻2] 日本特開平6-98756號公報
[專利文獻3] 日本特開2008-17839號公報
[專利文獻4] 日本特許3962153號公報
本發明的課題在於提供一種容器，可配給、保存或調製高濃度且生細胞比率高的哺乳動物細胞含有液。
本發明人為了解決上述課題而銳意檢討，發現若使用一種藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面的容器，其中該氟樹脂包含1個以上的-CF3端基，或每1×106個碳原子之氟樹脂的非氟化基末端與-CF2H基末端的合計數在70個以下，則可有效抑制對容器表面的細胞黏著或細胞生存率降低，可配給、保存或調製高濃度且生細胞比率高的哺乳動物細胞含有液，終至完成本發明。
亦即，本發明如下。
(1)一種用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面，其中該氟樹脂係每1×106個碳原子之氟樹脂的非氟化基末端與-CF2H基末端的合計數在70個以下。
(2)一種用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面，其中該氟樹脂包含1個以上的-CF3端基。
(3)如上述(2)所記載的用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面，其中該氟樹脂係每1×106個碳原子之非氟化基末端在70個以下。
(4)如上述(1)~(3)中任一項所記載的用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：氟樹脂係從四氟乙烯-六氟丙烯系共聚物及四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚系共聚物選擇之至少1種氟樹脂。
(5)如上述(1)~(4)中任一項所記載的用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：該容器為袋體。
(6)如上述(1)~(5)中任一項所記載的用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：哺乳動物細胞為黏著性細胞。
(7)如上述(1)~(6)中任一項所記載的用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：哺乳動物細胞為間質幹細胞。
若使用本發明的用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，來配給或保存哺乳動物細胞，亦或配養哺乳動物細胞，可有效抑制對容器內面的細胞黏著或細胞生存率降低，因此可配給、保存或調製高濃度且生細胞比率高的哺乳動物細胞含有液，對使用哺乳動物細胞含有液(懸浮液)的再生醫療有助益。
用以實施發明之形態
本發明的用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器(以下有時僅稱為「本發明的容器」)，只要是藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面的容器均可，未特別限制，其中該氟樹脂包含1個以上的-CF3端基，或每1×106個碳原子之氟樹脂的非氟化基末端與-CF2H基末端的合計數在70個以下(以下有時總稱該等氟樹脂為「本件氟樹脂」)；容器整體由本件氟樹脂形成亦可。本發明的容器的特徵在於，與哺乳動物細胞接觸的容器表面是由本件氟樹脂形成。若使用具有該特徵的容器，來配給或保存哺乳動物細胞含有液，亦或培養哺乳動物細胞，則由於有效抑制細胞黏著或細胞生存率降低，因此本發明的容器除了可適合用於懸浮性細胞含有液的配給及/或保存，或懸浮性細胞的培養以外，還適宜用於黏著性細胞含有液的配給及/或保存，或黏著性細胞的懸浮培養。用於細胞含有液配給及/或保存，或細胞的懸浮培養時，上述容器較宜容器內表面，未塗層(或配置)Matrigel、巢蛋白(Entactin)、纖網蛋白、溫度反應性聚合物(PIPAAm等)、多價陽離子(聚離胺酸等)、明膠、凝集素、多糖類(玻尿酸等)、聚乳酸、聚乙醇酸、ε-胺基己內酯、I型膠原蛋白、IV型膠原蛋白、幾丁聚糖、層連結蛋白等細胞黏著性物質等細胞黏著性物質。再者，於本發明，「保存」亦包含搬運中的保存。
上述懸浮性細胞可舉出紅血球(來自末稍血液)、白血球(嗜中性球、單核白血球[單核球、淋巴球]、巨噬細胞等)等懸浮性細胞。
上述黏著性細胞可舉出胚胎幹細胞(embryonic stem cells：ES細胞)、胚胎生殖細胞(embryonic germ cells：EG細胞)、生殖細胞系列幹細胞(germline stem cells：GS細胞)、人工誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell；iPS細胞)等多能性幹細胞，間質幹細胞、造血系幹細胞、神經系幹細胞等複能性幹細胞，心肌前驅細胞、血管內皮前驅細胞、神經前驅細胞、脂肪前驅細胞、皮膚纖維母細胞、骨骼筋筋母細胞、骨母細胞、齒質母細胞等單能性幹細胞(前驅細胞)等幹細胞；心肌細胞、血管內皮細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚纖維細胞、骨骼筋細胞、骨細胞、肝(hepatocyte)細胞、臍帶靜脈內皮細胞、皮膚微小淋巴管內皮細胞、表皮角質細胞、支氣管上皮細胞、黑色素細胞、平滑肌細胞、齒質細胞等成熟細胞，以間質幹細胞較佳。
本件氟樹脂宜不含-CF2H基末端，氟樹脂之非氟化基末端(例如-COF、-COOH、及與水聚集的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3等官能基)與-CF2H基末端的合計，宜每1×106個碳原子在70個以下，更宜每1×106個碳原子在35個以下。進而言之，更宜每1×106個碳原子在20個以下，尤宜每1×106個碳原子在10個以下。
亦即，作為本發明，可舉出一種用於哺乳動物細胞配給、保存或培養用的容器，其特徵為：藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面；其中該氟樹脂係每1×106個碳原子之氟樹脂的非氟化基末端與-CF2H基末端的合計數在70個以下。
再者，上述-COF、-COOH及與水聚集的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3、-CF2H的每1×106個碳原子的數目，可藉由FT-IR算出。
又，本件氟樹脂若包含1個以上的-CF3的端基，具有更穩定的末端構造即可，本件氟樹脂亦包含非氟化基末端的一部分被氟化，具有-CF3的氟樹脂。
上述-CF3端基可藉由高溫19F NMR測定來分析。
於本發明，「非氟化基末端」係意味具有反應性，一般被稱為不穩定末端的末端，作為非氟化基末端具體而言可舉出-COF、-COOH及與水聚集的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3等官能基。
本件氟樹脂的非氟化基末端(例如-COF、-COOH及與水聚集的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3等官能基)的合計，宜每1×106個碳原子在70個以下，更宜每1×106個碳原子在50個以下。進而言之，更宜每1×106個碳原子在35個以下，進而宜每1×106個碳原子在15個以下，進而宜每1×106個碳原子在10個以下，尤宜每1×106個碳原子在5個以下，尤其更宜每1×106個碳原子在2個以下。
亦即，本發明的一態樣可舉出一種用於哺乳動物細胞配給、保存或培養用的容器，其特徵為：藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面；其中該氟樹脂包含1個以上的-CF3的端基，且每1×106個碳原子，該氟樹脂之非氟化基末端在70個以下。
本件氟樹脂具體而言可舉出聚四氟乙烯(PTFE)、四氟乙烯(TFE)-六氟丙烯(HFP)系共聚物(FEP)、TFE-全氟烷基乙烯基醚(PAVE)系共聚物(PFA)，該等共聚物中以FEP、PFA較佳，可適宜地例示FEP。
上述「TFE-HFP系共聚物」係意味至少包含TFE與HFP的共聚物。亦即，「TFE-HFP系共聚物」除了TFT與HFP的二元共聚物(TFE/HFP共聚物；FEP)以外，亦包含：三元共聚物，如TFT、HFP與氟乙烯(VF)的共聚物(TFE/HFP/VF共聚物)、TFT、HFP與二氟亞乙烯(VDF)的共聚物(TFE/HFP/VDF共聚物)、TFE、HFP與全氟(烷基乙烯基醚)(PAVE)的共聚物(TFE/HFP/PAVE共聚物)等；四元共
聚物，如TFT、HFP、VF與VDF的共聚物(TFE/HFP/VF/VDF共聚物)、TFT、HFP、VF與PAVE的共聚物(TFE/HFP/VF/PAVE共聚物)、TFE、HFP、VDF與PAVE的共聚物(TFE/HFP/VDF/PAVE共聚物)等；或五元共聚物，如TFE、HFP、VF、VDF與PAVE的共聚物(TFE/HFP/VDF/PAVE共聚物)等。
上述TFE-HFP系共聚物宜為TFE/HFP共聚物或TFE/HFP/PAVE共聚物。該TFE/HFP共聚物中之TFE與HFP的質量比宜為80~97/3~20，更宜為84~92/8~16。又，上述TFE/HFP/PAVE共聚物中之TFE、HFP與PAVE的質量比宜為70~97/3~20/0.1~10，更宜為81~92/5~16/0.3~5。
上述「TFE-PAVE系共聚物」係意味至少包含TFE與PAVE的共聚物。亦即，「TFE-PAVE系共聚物」除了TFT與PAVE的二元共聚物(TFE/PAVE共聚物；PFA)以外，亦包含：三元共聚物，如TFE、PAVE與六氟丙烯(HFP)的共聚物(TFE/PAVE/HFP共聚物)、TFE、PAVE與二氟亞乙烯(VDF)的共聚物(TFE/PAVE/VDF共聚物)、TFE、PAVE與三氟氯乙烯(CTFE)的共聚物(TFE/PAVE/CTFE共聚物)等；四元共聚物，如TFE、PAVE、HFP與VDF的共聚物(TFE/PAVE/HFP/VDF共聚物)、TFE、PAVE、HFP與CTFE的共聚物(TFE/PAVE/HFP/CTFE共聚物)、TFE、PAVE、VDF與CTFE的共聚物(TFE/PAVE/VDF/CTFE共聚物)等；或五元共聚物，如TFE、PAVE、HFP、VDF與CTFE的共聚物(TFE/PAVE/HFP/VDF/CTFE共聚物)等。
構成上述PAVE單位的PAVE並未特別限制，可舉出例如全氟(甲基乙烯基醚)[PMVE]、全氟(乙基乙烯基醚)[PEVE]、全氟(丙基乙烯基醚)[PPVE]、全氟(丁基乙烯基醚)、全氟(苄基乙烯基醚)、全氟(己基乙烯基醚)、全氟(庚基乙烯基醚)等。
上述TFE-PAVE系共聚物中之TFE與PAVE的質量比宜為90~98/2~10，更宜為92~97/3~8。
本件氟樹脂可藉由習知的方法進行氟化處理來製作，其中該習知的方法係使按照懸浮聚合或乳化聚合等標準方法合成的氟樹脂的端基，在熔融押出氟樹脂前，與氟樹脂及含氟化合物(例如氟自由基來源)接觸，以進行穩定化處理的方法，或使熔融押出氟樹脂後所得的氟樹脂粒與含氟化合物接觸，以進行氟化處理的方法等。又，製造氟樹脂時(聚合反應時)，亦可使用能與氟單體一同控制端基的鏈轉移劑或聚合觸媒。然後，亦可使用市售品來作為本件氟樹脂。進而言之，亦可對於由氟樹脂成形的成形物，如熔融氟樹脂而成形的薄膜、從該薄膜成形的容器或從氟樹脂成形的容器等，使含氟化合物接觸，以進行氟化處理。又，亦可組合該等處理方法。
亦即，前述非氟化基末端的合計，或非氟化基末端與-CF2H基末端的合計，不須在原料的氟樹脂、粒體、薄膜的各階段，均是每1×106個碳原子在70個以下，只要在與最終的容器的細胞接觸之表面，每1×106個碳原子在70個以下即可。又，氟樹脂包含1個以上的-CF3的端基時，於原料的氟樹脂、粒體、薄膜的各階段，-CF3的端基不須為1個以上，只要在與最終的容器的細胞接觸之表面，氟樹脂包含1個以上的-CF3的端基即可。
上述氟自由基來源並未特別限定，可舉出IF5、ClF3等氟化鹵素、F2氣體、CoF3、AgF2、UF6、OF2、N2F2、CF3OF等。該F2氣體可為100%濃度，但從安全性方面考量，宜與惰性氣體混合，稀釋成5~50質量%，更宜稀釋成15~30質量%使用。該惰性氣體可舉出氮氣、氦氣、氬氣等，從費用對效果的觀點考量，宜使用氮氣。
上述氟化處理宜為20~220℃，更宜為100~200℃的溫度下進行。上述氟化處理宜進行5~30小時，更宜進行10~20小時。
藉由本發明所獲得的容器亦可調整過表面粗度的算術平均粗度(Ra)、表面粗度的均方粗度(RMS)及表面自由能。可舉出例如備有表面粗度Ra
為3.5~6.5nm，表面粗度RMS為4.5~8.0nm，且表面自由能為16.5~18.5(mJ/m2)的容器內面的容器等。
本發明的容器形態可舉出例如盤、孔盤、袋體、瓶、離心管、小瓶、注射器、管等，本發明的容器為細胞配給用容器時，宜為注射器、(點滴用)袋體、(點滴用)瓶、管，本發明的容器為細胞保存用容器時，宜為盤、孔盤、袋體、瓶、離心管、小瓶，本發明的容器為細胞培養用容器時，宜為盤、孔盤、袋體、瓶。特言之，袋體形狀的本發明的容器可適用於細胞的配給用、保存用及培養用所有用途，因此可適宜例示。
上述盤、孔盤、袋體、瓶、離心管、小瓶、注射器、管等，可將壓縮成形、押出成形、轉注成形、充氣成形、吹塑成形、射出成形、旋轉成形、襯裏成形、發泡體押出成形、薄膜成形等成形方法，因應需要而與熱封、高頻熔接、超音波熔接等密封手段組合來製造。
具體而言，上述袋體可藉由重疊本件氟樹脂質材的薄膜(片材)後，使用瞬間封口機將緣部予以熱封來製造。
上述袋體成形所用的薄膜為單層薄膜、或由二層以上的多層所組成的疊層薄膜均可，使用由多層所組成的疊層薄膜時，至少使哺乳動物細胞接觸的內表面，成為本件氟樹脂的層薄膜而成形袋體即可，其他層的薄膜亦可為不同於本件氟樹脂的質材(例如聚烯烴系樹脂質材)的層薄膜。薄膜的疊層係採用熱積層法、熱壓縮法、高頻加熱法、溶劑澆鑄法及押出積層法等方法。
又，對於由玻璃、金屬、樹脂等製造的盤、孔盤、袋體、瓶、離心管、小瓶、注射器、管等基材，以本件氟樹脂所組成的塗層劑進行覆蓋處理，藉此亦可獲得本發明的容器。可因應基材的形態來採用任意方法。該覆蓋處理可舉出旋轉塗佈、噴霧塗佈、棒式塗佈、輥塗佈、浸漬、刷毛塗佈、批次襯裏、靜電塗裝等方法。將上述氟樹脂塗層劑覆蓋於基材後，藉由乾燥處理及高溫加
熱處理形成塗層。又，亦可藉由進一步重疊塗佈含本件氟樹脂的塗層劑，增厚至任意的膜厚。
本發明的容器可使用於例如凍結哺乳動物細胞含有液的情況，不凍結哺乳動物細胞含有液的溫度(一般在0~37℃，較宜在0~25℃的範圍內)保存(至少6小時)的情況，藉由懸浮培養法大量生產懸浮性或黏著性哺乳動物細胞的情況，以及不將在前述不凍結的溫度下保存後的哺乳動物細胞含有液，移到別的容器，並直接配給(移植)的情況等。
以下藉由實施例，更具體說明本發明，本發明的技術性範圍不限定於該等例示。
[實施例1]
1.細胞袋體製造
使用瞬間封口機，在密封時間50秒、密封壓力0.2MPa、密封寬度5mm的條件下，將尺寸16cm×15cm、厚度100μm的3種薄膜，製成12種細胞袋體(細胞袋體A~C[比較例樣本1~3]、細胞袋體D~G[實施例樣本1~4]、細胞袋體H[比較例樣本4]、細胞袋體I~K[實施例樣本5~7]、及細胞袋體L[比較例樣本5])(參考表2)。再者，細胞袋體M(比較例樣本6)使用聚氯乙烯製細胞袋體(加工川澄化學工業股份有限公司製Kawasumi Quadwrap Bag ACP-AMP)(參考表2)。
1-1 非氟化基末端數及-CF2H基末端數測定
製作該當樹脂之厚度250~300μm程度的樣本，利用FT-IR Spectrometer 1760X(Perkin-Elmer製)進行分析。
製作該當樹脂之厚度250~300μm程度的樣本時，將粒體以油壓機予以輥軋而製作。又，構成細胞袋體的薄膜(從粒體藉由熔融成形而製作)厚度不足時，將薄膜重疊而測定。
取得與標準樣本(經充分氟化，在光譜上已無實質差異的樣本)的示差譜，讀取各峰值的吸光度，按照下式算出每1×106個碳原子的非氟化基末端數及-CF2H基末端數。於表2表示細胞袋體A~M各個之非氟化基末端數及-CF2H基末端數。
非氟化基末端及-CF2H基末端的個數(每1×106個碳原子)=l‧k/t
l：吸光度
k：修正係數(參考表1)
t：樣本厚度(mm)
[表1]
[表2]
表中「袋體製造前」意味輥軋用於細胞袋體製造的粒狀氟樹脂所獲得的樣本。
表中「袋體製造後」意味從構成細胞袋體的薄膜(從粒體藉由熔融成形而製作)所獲得的樣本。
1-2 -CF3端基有無測定
以370℃熔融該樹脂薄膜，製作股線，使用核磁共振分光計AVANCE300WB(Bruker製)，進行高溫19F NMR的光譜測定。
熔融與該樹脂相同組成比、不存在-CF3端基的樹脂，製作股線，取得與該股線的光譜的示差譜，若於δ=-82ppm觀察到峰值，則判斷有-CF3端基，若於δ=-82ppm未觀察到峰值，則判斷無-CF3端基。於表3表示細胞袋體A~M各個有無-CF3端基。
[表3]
[實施例2]
2.使用細胞袋體保存來自人骨髓間質幹細胞(hMSC：Human Mesenchymal Stem Cells)
分析使用上述實施例1的細胞袋體保存細胞時，是否可抑制細胞黏著，以懸浮狀態保存。
2-1 方法
2-1-1 細胞保存液調製
以1：1混合含有6.0(w/v)%海藻糖的Lactec(註冊商標)注射液(Otsuka Pharmaceutical Factory製)，與低分子DEXTRAN L注射液(含有10[w/v]%海藻糖的Lactec注射液)(Otsuka Pharmaceutical Factory製)，調製成細胞保存液。
2-1-2 哺乳動物細胞調製
[1]將4×105個hMSC(Lonza製，PT-2501)，使用75cm2燒瓶，在MSC培養液(Lonza社製，PT-3001)存在下，以37℃、5%CO2恆溫箱培養，在約90%匯合時，按照標準方法繼代。
[2]以吸引器，去除已繼代的hMSC(繼代次數3次的細胞，大致100%匯合)的培養液，每一燒瓶以PBS(Invitrogen製)8mL清洗hMSC。
[3]以吸引器去除PBS，每一燒瓶加入胰蛋白酶-EDTA(Lonza製，CC-3232)3.75mL，在室溫下靜置5分鐘。
[4]一面在顯微鏡下觀察hMSC，直到90%程度剝離為止，一面緩慢搖晃。
[5]每一燒瓶加入MSC培養液3.75mL，使胰蛋白酶反應停止，藉由移液來回收hMSC，並移至50mL離心管。
[6]600×g，以5分鐘、25℃進行離心分離。
[7]以吸引器去除上清液，每一燒瓶加入上述細胞保存液3mL，懸浮hMSC粒體(沈澱物)。
[8]採集10μL的hMSC-BM懸浮液，以細胞計數盤測量細胞，添加上述細胞保存液以成為5×105個/mL，進行冰冷。
2-1-3 哺乳動物細胞保存
[1]於13種細胞袋體A~M內，將5×105個/mL的含有hMSC細胞保存液各接種3mL。
[2]於恆溫箱(25℃、5%CO2)(AS ONE製，PIC100)內靜置‧保存6小時後，回收一部分細胞懸浮液的(20μL)，與0.4%台盼藍(Gibco製)20μL混合，使用細胞計數盤，於顯微鏡(ECLIPSE TS100，Nikon製)下測量細胞懸浮液的細胞濃度及生細胞數，分別算出細胞回收率(參考表4、7及10)及細胞生存率(參考表5、8及11)。又，以剪刀切斷袋體的一部分，於6孔盤上，於顯微鏡(IX-70，Olympus製)下觀察黏著於袋體的細胞。再者，表4~表6、表7~表9及表10~表12的結果，分別藉由獨立(hMSC的調製時期不同)的實驗獲得。
[表4]
細胞回收率(%)表示作為相對於保存剛開始後的細胞懸浮液中的總細胞數(Pre)，保存後的細胞懸浮液中的總細胞數的比率([保存後的細胞懸浮液中的總細胞數/保存剛開始後的細胞懸浮液中的總細胞數(Pre)×100])(平均值±標準差，n=3)。再者，表中「**」及「***」表示依據Dunnett法，對於細胞袋體L(比較例樣本5)在統計學上有顯著差(p<0.01及p<0.001)。
[表5]
細胞生存率(%)表示作為相對於細胞懸浮液中的總細胞數的生細胞比率([細胞懸浮液中的生細胞數/細胞懸浮液中的總細胞數×100])(平均值±標準差，n=3)。再者，表中「*」表示依據Dunnett法，對於細胞袋體L(比較例樣本5)在統計學上有顯著差(p<0.05)。
[表6]
表6：hMSC的生細胞回收率1
生細胞回收率表示作為對細胞回收率值乘以細胞生存率值之值(平均值±標準差，n=3)。再者，表中「**」及「***」表示依據Dunnett法，對於細胞袋體L(比較例樣本5)在統計學上有顯著差(p<0.01及p<0.001)。
2-2 結果
保存後的hMSC的回收率如表4所示，相對於使用細胞袋體A、B、C、H、L及M(比較例樣本1、2、3、4、5及6)時，分別為39%、43%、34%、40%、38%及36%，使用細胞袋體D、F、G、J及K(實施例樣本1、3、4、6及7)時，分別高達50%、69%、99%、70%及80%。
又，保存後的hMSC的生存率如表5所示，使用細胞袋體D、F、G、J及K(實施例樣本1、3、4、6及7)時，分別為93%、96%、93%、95%及96%，均高達90%以上。
其結果，保存後仍生存的hMSC的回收率(細胞生存率×細胞回收率)如表6所示，比起保存於細胞袋體A、B、C、H、L及M(比較例樣本1、2、3、4、5及6)內時(分別為34%、37%、31%、37%、31%及32%)，保存於細胞袋體D、F、G、J及K(實施例樣本1、3、4、6及7)內時(分別為46%、66%、92%、66%及77%)較高。
[表7]
細胞回收率(%)表示作為相對於保存剛開始後的細胞懸浮液中的總細胞數(Pre)，保存後的細胞懸浮液中的總細胞數的比率([保存後的細胞懸浮液中的總細胞數/保存剛開始後的細胞懸浮液中的總細胞數(Pre)×100])(平均值±標準差，n=3)。再者，表中「***」表示依據Dunnett法，對於細胞袋體L(比較例樣本5)在統計學上有顯著差(p<0.001)。
[表8]
細胞生存率(%)表示作為相對於細胞懸浮液中的總細胞數的生細胞比率([細胞懸浮液中的生細胞數/細胞懸浮液中的總細胞數×100])(平均值±標準差，n=3)。
[表9]
生細胞回收率表示作為對細胞回收率值乘以細胞生存率值之值(平均值±標準差，n=3)。再者，表中「***」表示依據Dunnett法，對於細胞袋體L(比較例樣本5)在統計學上有顯著差(p<0.001)。
2-3 結果
保存後的hMSC的回收率如表7所示，相對於使用細胞袋體B及L(比較例樣本2及5)時，分別為30%及25%，使用細胞袋體G(實施例樣本4)時，分別高達80%。
又，保存後的hMSC的生存率如表8所示，使用細胞袋體G(實施例樣本4)時高達95%。
其結果，保存後仍生存的hMSC的回收率(細胞生存率×細胞回收率)如表9所示，比起保存於細胞袋體B及L(比較例樣本2及5)內時(分別為27%及22%)，保存於細胞袋體G(實施例樣本4)內時(76%)較高。
[表10]
細胞回收率(%)表示作為相對於保存剛開始後的細胞懸浮液中的總細胞數(Pre)，保存後的細胞懸浮液中的總細胞數的比率([保存後的細胞懸浮液中的總細胞數/保存剛開始後的細胞懸浮液中的總細胞數(Pre)×100])(平均值±標準差，n=3)。再者，表中「*」表示依據Dunnett法，對於細胞袋體B(比較例樣本2)在統計學上有顯著差(p<0.05)。
[表11]
細胞生存率(%)表示作為相對於細胞懸浮液中的總細胞數的生細胞比率([細胞懸浮液中的生細胞數/細胞懸浮液中的總細胞數×100])(平均值±標準差，n=3)。
[表12]
生細胞回收率表示作為對細胞回收率值乘以細胞生存率值之值(平均值±標準差，n=3)。再者，表中「*」表示依據Dunnett法，對於細胞袋體B(比較例樣本2)在統計學上有顯著差(p<0.05)。
2-4 結果
保存後的hMSC的回收率如表10所示，相對於使用細胞袋體B(比較例樣本2)時為49%，使用細胞袋體E、F、I及K(實施例樣本2、3、5及7)時，分別高達83%、75%、84%及67%。
又，保存後的hMSC的生存率如表11所示，使用細胞袋體E、F、I及K(實施例樣本2、3、5及7)時，分別為93%、93%、91%及92%，均高達90%以上。
其結果，保存後仍生存的hMSC的回收率(細胞生存率×細胞回收率)如表12所示，比起保存於細胞袋體B(比較例樣本2)內時(45%)，保存於細胞袋體E、F、I及K(實施例樣本2、3、5及7)內時(分別為77%、69%、76%及61%)較高。
進而言之，相對於保存後的hMSC黏著於細胞袋體A~C、H、L及M(比較例樣本1~3、4、5及6)的內面，對細胞袋體D~G及I~K(實施例樣本1~4及5~7)的內面的黏著性受到抑制，尤其於細胞袋體E~G及I~K(實施例樣本2~4及5~7)的內面，幾乎未黏著hMSC。
該等結果表示若於細胞袋體D~G及I~K(實施例樣本1~4及5~7)內保存細胞，比起於細胞袋體A~C、H、L及M(比較例樣本1~3、4、5及6)內保存細胞，可更顯著抑制生細胞的黏著性。
[實施例3]
3.使用細胞袋體培養來自小鼠間質幹細胞的10T1/2細胞
分析使用上述實施例1製造的細胞袋體培養細胞時，是否抑制細胞黏著，於懸浮狀態下培養。
3-1 方法
[1]於含10%FBS(life technologies製，gibco standard)之DMEM(nacalai tesque製，08458-45)培養液中，使來自小鼠間質幹細胞的10T1/2細胞懸浮而成為1.0×105個/mL，於2種細胞袋體B(比較例樣本2)及G(實施例樣本4)內各接種3mL。
[2]於恆溫箱(37℃、5%CO2)內培養4小時、1、2、3及6日後，回收一部分細胞懸浮液(10μL)，與0.4%台盼藍(Gibco製)10μL混合，使用細胞計數盤
測量生細胞數，算出細胞生存率。又，以剪刀切斷袋體的一部分，於6孔盤上，於光學顯微鏡(Nikon製)下觀察黏著於袋體的細胞。
3-2 結果
培養後的10T1/2細胞的生存率在使用細胞袋體G(實施例樣本4)及細胞袋體B(比較例樣本2)時，均高達70%以上。另，培養後黏著於細胞袋體內面的10T1/2細胞的比率，使用細胞袋體G時比使用細胞袋體B時少。
其結果，若於細胞袋體G(實施例樣本4)內培養細胞，則比起在細胞袋體B(比較例樣本2)內培養細胞，可更顯著抑制生細胞的黏著性。
上述實施例1~3的結果表示，若使用細胞袋體D~G及I~K(實施例樣本1~7)配給、保存或培養細胞，可有效抑制對容器內表面的細胞黏著或細胞生存率降低，因此可配給、保存或調製高濃度且生細胞比率高的細胞含有液。
產業上之可利用性
依據本發明，可配給、保存或調製高濃度且生細胞比率高的細胞含有液，對使用哺乳動物細胞含有液(懸浮液)的再生醫療有助益。
Claims (5)
- 一種用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其特徵為：藉由從四氟乙烯-六氟丙烯系共聚物及四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚系共聚物選擇之至少1種氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面，其中該氟樹脂包含1個以上的-CF3端基，該-CF3端基是非氟化基末端的一部分被氟化、穩定化的末端基，該前述非氟化基末端是不穩定末端基。
- 如申請專利範圍第1項之用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其藉由氟樹脂，形成與哺乳動物細胞接觸的表面，其中該氟樹脂係每1×106個碳原子之非氟化基末端在70個以下。
- 如申請專利範圍第1項之用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其為袋體。
- 如申請專利範圍第1項之用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其中哺乳動物細胞為黏著性細胞。
- 如申請專利範圍第1項之用於哺乳動物細胞配給、保存或培養之容器，其中哺乳動物細胞為間質幹細胞。
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