CN107849511B - 用于细胞施予、保存、或培养的容器 - Google Patents
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Abstract
使用下述容器施予哺乳动物细胞、或者在该容器内保存或培养哺乳动物细胞时,能够有效地抑制细胞向容器内表面的黏附以及细胞存活率降低,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由含有至少一部分‑CF3末端基团的氟树脂原料形成,或者,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由氟树脂中的非氟代基团末端和‑CF2H基团末端的总数量是每1×106个碳为70个以下的氟树脂材料形成。因此,通过使用上述容器,能够施予、保存、或制备高浓度且活细胞的比例高的含有哺乳动物细胞的液体,从而有助于利用含有哺乳动物细胞的液体(悬浮液)的再生医疗。
Description
技术领域
本发明涉及用于哺乳动物细胞的施予、保存、或培养的容器,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由含有1个以上-CF3末端基团的氟树脂、或氟树脂中的非氟代基团末端和-CF2H基团末端的总数量是每1×106个碳为70个以下的氟树脂形成。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem cell,ES细胞)、诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell,iPS细胞)等多能干细胞是具有无限的增殖能力和分化为多种组织细胞的多分化能力的细胞。对于人多能干细胞而言,期待进一步通过在试管内的分化诱导而使其分化成具有各种功能的细胞,然后施予至期待施予效果的患者,从而应用于再生医疗。另外,对于间充质干细胞等成体干细胞而言,期待其具有通过释放营养因子、细胞因子而得到的治疗效果、在聚集(homing)于组织的损伤部位后分化成该部位的构成细胞而进行补充修复的效果,并在临床研究中展开尝试。为了实现这些目的,需要稳定地大量培养或保存高品质的细胞、在维持该品质的状态下进行施予。
作为培养悬浮性细胞的容器,考虑了袋状的培养容器(袋)(专利文献1)。该袋是由在聚(乙烯丁烯)聚苯乙烯嵌段共聚物和聚丙烯的聚合物混合物中混合乙烯丙烯酸酯共聚物而得到的聚合物合金形成的,其特征在于,透明性、气体透过性优异。另一方面,也考虑了适合培养黏附性细胞的袋(专利文献2、3)。专利文献2中公开的袋经过了改良,通过对袋内表面进行电晕放电处理来提高亲水性,以使细胞容易黏附。另外,专利文献3中公开的袋由具有规定的折弯刚性的合成树脂片材形成,从而使得袋在培养中不易变形,其特征在于,能够防止由在移动袋时容器发生变形而导致的细胞剥离、死亡。
此外,袋的市售品也是已知的,例如,乙烯(Et)-乙酸乙烯酯(VA)共聚物(EVA)原料的CultiLife[注册商标]Spin袋(TAKARA公司制)、以作为氟树脂的四氟乙烯(TFE)-六氟丙烯(HFP)共聚物(FEP)为材料的VueLife FEP Bag 32-C(American FluorosealCorporation公司制)、培养袋A-1000NL(NIPRO公司制)等已有市售。
然而,这些袋均不是用于抑制黏附性细胞向袋内表面黏附、以悬浮状态维持或培养细胞的袋。
另一方面,已知使用将TFE-全氟烷基乙烯基醚(PFVE)共聚物(PFA)的不稳定末端基团进行氟取代从而将其除去而得到的氟树脂膜来覆盖食品加热加工器具的表面时,可提高针对焦渍的防污性(专利文献4)。然而,由对末端基团进行氟取代而得到的氟代树脂所带来的细胞黏附性尚未为人所知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平3-65177号公报
专利文献2:日本特开平6-98756号公报
专利文献3:日本特开2008-17839号公报
专利文献4:日本专利3962153号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于,提供能够施予、保存、或制备高浓度且活细胞的比例高的含有哺乳动物细胞的液体。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为了解决上述课题而进行了潜心研究,发现了以下情况,从而完成了本发明:使用下述容器施予哺乳动物细胞或者在该容器内保存或培养哺乳动物细胞时,能够有效地抑制细胞向容器内表面黏附以及细胞存活率降低,从而能够施予、保存、或制备高浓度且活细胞的比例高的含有哺乳动物细胞的液体,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由含有1个以上-CF3末端基团的氟树脂形成,或者所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由氟树脂中的非氟代基团末端和-CF2H基团末端的总数量是每1×106个碳为70个以下的氟树脂形成。
即,本发明如下所述。
(1)用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由氟树脂形成,所述氟树脂中的非氟代基团末端和-CF2H基团末端的总数量是每1×106个碳为70个以下。
(2)用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由含有1个以上-CF3末端基团的氟树脂形成。
(3)如上述(2)所述的用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由非氟代基团末端是每1×106个碳为70个以下的氟树脂形成。
(4)如上述(1)~(3)中任一项所述的用于施予、保存或培养的容器,其特征在于,氟树脂为选自四氟乙烯-六氟丙烯系共聚物、及四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚系共聚物中的至少一种氟树脂。
(5)如上述(1)~(4)中任一项所述的用于施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器为袋。
(6)如上述(1)~(5)中任一项所述的用于施予、保存或培养的容器,其特征在于,哺乳动物细胞为黏附性细胞。
(7)如上述(1)~(6)中任一项所述的用于施予、保存或培养的容器,其特征在于,哺乳动物细胞为间充质干细胞。
发明效果
使用本发明的用于施予、保存或培养的容器来施予或保存含有哺乳动物细胞的液体、或培养哺乳动物细胞时,能够有效地抑制细胞向容器内表面黏附以及细胞存活率降低,因此,能够施予、保存、或制备高浓度且活细胞的比例高的含有哺乳动物细胞的液体,从而有助于利用含有哺乳动物细胞的液体(悬浮液)的再生医疗。
具体实施方式
作为本发明的用于施予、保存或培养的容器(以下有时简称为“本发明的容器”),只要是用于哺乳动物细胞的施予、保存、或培养的容器,且其与哺乳动物细胞(含有哺乳动物细胞的液体)接触的表面由含有1个以上-CF3末端基团的氟树脂、或氟树脂中的非氟代基团末端和-CF2H基团末端的总数量是每1×106个碳为70个以下的氟树脂(以下有时将这些氟树脂总称为“本申请的氟树脂”)形成即可,不受特别限制,容器整体也可由本申请的氟树脂形成。本发明的容器的特征在于,与哺乳动物细胞接触的容器表面由本申请的氟树脂形成。使用具有该特征的容器施予或保存含有哺乳动物细胞的液体、或培养哺乳动物细胞时,能够有效地抑制细胞黏附及细胞存活率降低,因此,本发明的容器可适用于含有悬浮性细胞的液体的施予及/或保存、悬浮性细胞的培养、以及含有黏附性细胞的液体的施予及/或保存、黏附性细胞的悬浮培养。用于含有细胞的液体的施予及/或保存、细胞的悬浮培养时,对于上述容器而言,优选的是,该容器的内表面未使用下述细胞黏附性物质进行涂布(或配置):基质胶(matrigel)、巢蛋白(entactin)、纤连蛋白(fibronectin)、温度响应性聚合物(PIPAAm等)、聚阳离子(聚赖氨酸等)、明胶、凝集素、多糖类(透明质酸等)、聚乳酸、聚乙醇酸、ε-氨基己内酯、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、脱乙酰壳多糖、层粘连蛋白等。需要说明的是,本发明中,“保存”也包括运送中的保存。
作为上述悬浮性细胞,可举出红细胞、(源于末梢血的)白细胞(嗜中性粒细胞、单核细胞(mononuclear cell)[单核细胞(monocyte)、淋巴细胞]、巨噬细胞等)等悬浮性细胞。
作为上述黏附性细胞,可举出胚胎干细胞(embryonic stem cells:ES细胞)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells:EG细胞)、生殖细胞系干细胞(germline stem cells:GS细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞,induced pluripotent stem cell)等多能干细胞(pluripotent stem cell),间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞等专能干细胞(multipotent stem cell),心肌前体细胞、血管内皮前体细胞、神经前体细胞、脂肪前体细胞、真皮成纤维细胞(dermal fibroblasts)、骨格肌成肌细胞、成骨细胞、成牙本质细胞(odontoblast)等单能干细胞(前体细胞)等干细胞;心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、脂肪细胞、皮肤纤维细胞、骨格肌细胞、骨细胞、肝细胞、脐静脉内皮细胞、真皮淋巴微血管内皮细胞(日文:皮膚微小リンパ管内皮細胞)、表皮角质形成细胞、支气管上皮细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞、牙本质细胞(dentin cell)等成熟细胞。优选间充质干细胞。
本申请的氟树脂优选不含有-CF2H基团末端,但氟树脂中的非氟代基团末端(例如,-COF、-COOH、及与水缔合(日文:会合)的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3等官能团)和-CF2H基团末端的总计优选是每1×106个碳为70个以下,更优选是每1×106个碳为35个以下。进一步优选是每1×106个碳为20个以下,特别优选是每1×106个碳为10个以下。
即,作为本发明,可举出下述用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由氟树脂中的非氟代基团末端和-CF2H基团末端的总数量是每1×106个碳为70个以下的氟树脂形成。
需要说明的是,上述的-COF、-COOH、及与水缔合的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3、-CF2H的每1×106个碳的数量可通过FT-IR计算。
另外,作为本申请的氟树脂,只要是含有1个以上-CF3末端基团、且具有更加稳定化的末端结构的氟树脂即可,本申请的氟树脂也包括非氟代基团末端的一部分被氟取代、具有-CF3的氟树脂。
上述的-CF3末端基团可通过高温19F NMR测定进行分析。
本发明中,所谓“非氟代基团末端”,表示具有反应性、通常被称为不稳定末端的末端,作为非氟代基团末端,可具体举出-COF、-COOH、与水缔合的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3等官能团。
本申请的氟树脂中的非氟代基团末端(例如,-COF、-COOH、及与水缔合的-COOH、-CH2OH、-CONH2、-COOCH3等官能团)总计优选是每1×106个碳为70个以下,更优选是每1×106个碳为50个以下。进而,更优选是每1×106个碳为35个以下,进一步优选是每1×106个碳为15个以下,更进一步优选是每1×106个碳为10个以下,特别优选是每1×106个碳为5个以下,特别更优选是每1×106个碳为2个以下。
即,作为本发明的一个方式,可举出用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由下述氟树脂形成,所述氟树脂含有1个以上-CF3末端基团,且氟树脂中的非氟代基团末端是每1×106个碳为70个以下。
作为本申请的氟树脂,具体而言,可举出聚四氟乙烯(PTFE)、四氟乙烯(TFE)-六氟丙烯(HFP)系共聚物(FEP)、TFE-全氟烷基乙烯基醚(PAVE)系共聚物(PFA),其中,优选FEP、PFA,可优选示例FEP。
上述“TFE-HFP系共聚物”,表示至少包含TFE和HFP的共聚物。即,“TFE-HFP系共聚物”中,除了TFE与HFP形成的二元共聚物(TFE/HFP共聚物,FEP)以外,也包括TFE、HFP与氟乙烯(VF)形成的共聚物(TFE/HFP/VF共聚物),TFE、HFP与偏氟乙烯(VDF)形成的共聚物(TFE/HFP/VDF共聚物),TFE、HFP与全氟(烷基乙烯基醚)(PAVE)形成的共聚物(TFE/HFP/PAVE共聚物)等三元共聚物;TFE、HFP、VF与VDF形成的共聚物(TFE/HFP/VF/VDF共聚物),TFE、HFP、VF与PAVE形成的共聚物(TFE/HFP/VF/PAVE共聚物),TFE、HFP、VDF与PAVE形成的共聚物(TFE/HFP/VDF/PAVE共聚物)等四元共聚物;TFE、HFP、VF、VDF与PAVE形成的共聚物(TFE/HFP/VF/VDF/PAVE共聚物)等五元共聚物。
作为上述TFE-HFP系共聚物,优选TFE/HFP共聚物、TFE/HFP/PAVE共聚物。该TFE/HFP共聚物中的TFE与HFP的质量比优选为80~97/3~20,更优选为84~92/8~16。另外,上述TFE/HFP/PAVE共聚物中的TFE、HFP与PAVE之间的质量比优选为70~97/3~20/0.1~10,更优选为81~92/5~16/0.3~5。
上述“TFE-PAVE系共聚物”表示至少包含TFE与PAVE的共聚物。即,“TFE-PAVE系共聚物”中,除了TFE与PAVE形成的二元共聚物(TFE/PAVE共聚物,PFA)以外,也包括TFE、PAVE与六氟丙烯(HFP)形成的共聚物(TFE/PAVE/HFP共聚物),TFE、PAVE与偏氟乙烯(VDF)形成的共聚物(TFE/PAVE/VDF共聚物),TFE、PAVE与氯三氟乙烯(CTFE)形成的共聚物(TFE/PAVE/CTFE共聚物)等三元共聚物;TFE、PAVE、HFP与VDF形成的共聚物(TFE/PAVE/HFP/VDF共聚物),TFE、PAVE、HFP与CTFE形成的共聚物(TFE/PAVE/HFP/CTFE共聚物),TFE、PAVE、VDF与CTFE形成的共聚物(TFE/PAVE/VDF/CTFE共聚物)等四元共聚物;TFE、PAVE、HFP、VDF与CTFE形成的共聚物(TFE/PAVE/HFP/VDF/CTFE共聚物)等五元共聚物。
作为构成上述PAVE单元的PAVE,不受特别限制,可举出例如全氟(甲基乙烯基醚)〔PMVE〕、全氟(乙基乙烯基醚)〔PEVE〕、全氟(丙基乙烯基醚)〔PPVE〕、全氟(丁基乙烯基醚)、全氟(戊基乙烯基醚)、全氟(己基乙烯基醚)、全氟(庚基乙烯基醚)等。
上述TFE-PAVE系共聚物中的TFE与PAVE的质量比优选为90~98/2~10,更优选为92~97/3~8。
本申请的氟树脂可通过下述方法等已知的方法进行氟化处理而制备:基于悬浮聚合、乳液聚合等常规方法合成氟树脂,在将氟树脂进行熔融挤出前使氟树脂与含氟化合物(例如,氟自由基源)接触,对氟树脂的末端基团进行稳定化处理的方法;在将氟树脂熔融挤出后,使得到的氟树脂的粒料与含氟化合物接触,进行氟化处理的方法。另外,制造氟树脂时(聚合反应时),可与氟单体一同使用能够控制末端基团的链转移剂、聚合催化剂而得到。另外,作为本申请的氟树脂,也可使用市售品。此外,也可使如将氟树脂熔融而成型得到的膜、由该膜成型得到的容器、由氟树脂成型得到的容器等这样的由氟树脂成型得到的成型物与含氟化合物接触,实施氟化处理。另外,也可将这些处理方法组合。
即,上述非氟代基团末端的总计、或者、非氟代基团末端和-CF2H基团末端的总计并非必须在用作原料的氟树脂、粒料、膜的各阶段中均是每1×106个碳为70个以下,只要在最终的容器的与细胞接触的表面中是每1×106个碳为70个以下即可。另外,含有1个以上-CF3末端基团的氟树脂的情况下,-CF3末端基团并非必须在用作原料的氟树脂、粒料、膜的各阶段中均为1个以上,只要在最终的容器的与细胞接触的表面中,氟树脂含有1个以上-CF3末端基团即可。
作为上述氟自由基源,不受特别限定,可举出IF5、ClF3等卤素氟化物、F2气体、CoF3、AgF2、UF6、OF2、N2F2、CF3OF等。该F2气体可以为100%浓度,但从安全性方面考虑,可与非活性气体混合,稀释为5~50质量%、优选稀释为15~30质量%进行使用。作为该非活性气体,可举出氮气、氦气、氩气等,从性价比的观点考虑,优选氮气。
上述氟化处理优选于20~220℃、更优选于100~200℃的温度进行。上述氟化处理优选实施5~30小时,更优选实施10~20小时。
对于根据本发明得到的容器,也可对表面粗糙度的算术平均粗糙度(Ra)、表面粗糙度的均方根粗糙度(RMS)、及表面自由能进行调整。可举出例如具有表面粗糙度Ra为3.5~6.5nm、表面粗糙度的RMS为4.5~8.0nm、且表面自由能为16.5~18.5(mJ/m2)的容器内表面的容器等。
作为本发明的容器的形态,可举出例如皿(dish)、有孔培养板(well plate)、袋、瓶、离心管、小瓶(vial)、注射器、管(tube)等,本发明的容器为用于施予细胞的容器时,优选注射器、(点滴用)袋、(点滴用)瓶、管,本发明的容器为用于保存细胞的容器时,优选皿、有孔培养板、袋、瓶、离心管、小瓶,本发明的容器为用于培养细胞的容器时,优选皿、有孔培养板、袋、瓶。尤其袋状的本发明的容器能够适用于细胞的施予用途、保存用途、及培养用途这样的所有用途,因此可优选示例。
上述皿、有孔培养板、袋、瓶、离心管、小瓶、注射器、管等可将压缩成型、挤出成型、传递成型、吹胀成型、吹塑成型、注射成型、旋转成型、衬里成型(lining molding)、发泡体挤出成型、膜成型等成型方法与根据需要而采用的热封、高频熔接、超声波熔接等密封手段组合来制造。
对于上述袋而言,具体而言,可在将本申请的氟树脂原料的膜(片)叠合后,使用脉冲密封机将缘部热封来制造。
用于上述袋的成型的膜可以是单层膜,也可以是由两层以上的多层形成的层合膜,由多层形成的层合膜的情况下,以至少与哺乳动物细胞接触的内表面成为本申请的氟树脂原料的层膜的方式来成型袋即可,其他的层膜可以是与本申请的氟树脂不同的原料(例如,聚烯烃系树脂原料)的层膜。膜的层合可利用热层压法、热压缩法、高频加热法、溶剂浇铸法及挤出层压法等方法进行。
另外,通过用含有本申请的氟树脂的涂覆剂对利用玻璃、金属、树脂等制造的皿、有孔培养板、袋、瓶、离心管、安瓿、注射器、管等基材进行被覆处理,也能够得到本发明的容器。可根据基材的形态而采用任意的方法。作为该被覆处理,可举出旋涂法、喷涂法、棒涂法、辊涂法、浸渍、刷涂、旋转涂衬(rotolining)、静电涂敷等方法。将上述氟树脂涂覆剂被覆于基材后,通过干燥处理及高温加热处理形成涂覆层。另外,通过进一步叠涂含有本申请的氟树脂的涂覆剂,可增厚至任意的膜厚。
本发明的容器例如可用于下述情况:将含有哺乳动物细胞的液体冷冻保存的情况;将含有哺乳动物细胞的液体于不冻结的温度(通常为0~37℃,优选为0~25℃[室温]的范围内)保存(至少6小时)的情况;利用悬浮培养法大量生产悬浮性或黏附性的哺乳动物细胞的情况;不将于上述不冻结的温度保存后的含有哺乳动物细胞的液体移至其他容器而是直接施予(移植)的情况;等等。
以下,通过实施例对本发明进行更具体的说明,但本发明的技术范围并不限于这些示例。
[实施例1]
1.细胞袋的制造
使用脉冲密封机,将大小为16cm×15cm、厚100μm的3种膜在密封时间为50秒、密封压力为0.2MPa、密封宽度为5mm的条件下进行热封,由此制造12种细胞袋(细胞袋A~C[比较例试样1~3]、细胞袋D~G[实施例试样1~4]、细胞袋H[比较例试样4]、细胞袋I~K[实施例试样5~7]、及细胞袋L[比较例试样5])(参见表2)。需要说明的是,作为细胞袋M(比较例试样6),使用了聚氯乙烯制的细胞袋(经加工的川澄化学工业株式会社制KawasumiKuodorappu bag ACP-AMP)(参见表2)。
1-1非氟代基团末端数量及-CF2H基团末端数量的测定
制作厚度为250~300μm左右的该树脂的试样,使用FT-IR Spectrometer 1760X(Perkin-Elmer公司制)进行分析。
制作厚度为250~300μm左右的该树脂的试样时,使用油压机将粒料压延而进行制作。另外,直接使用构成细胞袋的膜(由粒料通过熔融成型进行制作)进行测定,厚度不足时将膜叠合进行测定。
获得与标准试样(已经充分氟化至在图谱中实质上观察不到差异的试样)的差光谱,读取各峰处的吸光度,按照下式算出每1×106个碳原子数的非氟代基团末端数量及-CF2H基团末端数量。细胞袋A~M各自的非氟代基团末端数量及-CF2H基团末端数量示于表2。
非氟代基团末端及-CF2H基团末端的个数(每1×106个碳)=l·k/t
l:吸光度
k:校正系数(参见表1)
t:试样厚度(mm)
[表1]
表1:各非氟代基团末端基团及-CF2H基团末端的吸收波数及校正系数
[表2]
表2:细胞袋的非氟代基团末端数量及-CF2H基团末端数量
表中的“袋制造前”,是指将用于制造细胞袋的粒料状的氟树脂压延得到的试样。
表中的“袋制造后”,是指由构成细胞袋的膜(由粒料通过熔融成型而制作)得到的试样。
1-2-CF3末端基团的有无的测定
使该树脂膜于370℃熔融,制作线束,使用核磁共振光谱仪AVANCE300WB(Bruker公司制),实施利用高温19F NMR的光谱的测定。
获得与线束(该线束是将与上述树脂为相同组成比且不存在-CF3末端基团的树脂进行熔融而制作得到的)的光谱之间的差光谱,若在δ=-82ppm处观察到峰,则判断为具有-CF3末端基团,若在δ=-82ppm处未观察到峰,则判断为不存在-CF3末端基团。将细胞袋A~M各自的-CF3末端基团的有无示于表3。
[表3]
表3:-CF3末端基团的有无
[实施例2]
2.使用了细胞袋的源于人骨髓的间充质干细胞(hMSC,Human Mesenchymal StemCells)的保存
针对使用上述实施例1的细胞袋保存细胞时是否能够抑制细胞黏附、以悬浮状态保存进行了分析。
2-1方法
2-1-1细胞保存液的制备
将含有6.0(w/v)%海藻糖的Lactec(注册商标)注射液(Lactec Injection)(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)和低分子葡聚糖L注射液(Low MolecularDextran Injection)(含有10[w/v]%葡聚糖的Lactec注射液)(Otsuka PharmaceutialFactory,Inc.制)以1:1混合,制备细胞保存液。
2-1-2哺乳动物细胞的制备
〔1〕使用75cm2烧瓶,在MSC培养液(Lonza公司制,PT-3001)存在下,将4×105个hMSC(Lonza公司制,PT-2501)在5%CO2培养箱中于37℃培养,约90%汇合时,按照常规方法进行传代。
〔2〕使用抽吸器(aspirator)除去经过传代的hMSC(传代次数为3次的细胞,几乎100%汇合)的培养液,每个烧瓶使用8mL的PBS(Invitrogen公司制)来洗涤hMSC。
〔3〕使用抽吸器除去PBS,每烧瓶加入3.75mL的胰蛋白酶-EDTA(Lonza公司制,CC-3232),于室温静置5分钟。
〔4〕一边在显微镜下观察,一边缓缓摇晃,直到hMSC剥离90%左右为止。
〔5〕每个烧瓶加入3.75mL的MSC培养液,终止胰蛋白酶反应,通过吹吸(pippeting)回收hMSC,移至50mL离心管。
〔6〕以600×g、5分钟、25℃进行离心分离。
〔7〕使用抽吸器除去上清液,每1个烧瓶加入3mL的上述细胞保存液,将hMSC颗粒(沉淀物)进行悬浮。
〔8〕采集10μL的hMSC-BM悬浮液,使用细胞计数盘计数细胞数量,添加上述细胞保存液,使细胞数量为5×105个/mL,进行冰冷。
2-1-3哺乳动物细胞的保存
〔1〕向13种细胞袋A~M内分别接种3mL含有5×105个/mL的hMSC的细胞保存液。
〔2〕在培养箱(25℃,5%CO2)(AS ONE公司制,PIC100)内静置/保存6小时后,回收细胞悬浮液的一部分(20μL),与20μL的0.4%台盼蓝(trypan blue)(Gibco公司制)混合,使用细胞计数盘在显微镜(ECLIPSE TS100,尼康公司制)下对细胞悬浮液的细胞浓度及活细胞数量进行计量,算出各自的细胞回收率(参见表4、7及10)及细胞存活率(参见表5、8及11)。另外,用剪刀剪下袋的一部分,在6孔培养板上,对黏附于袋的细胞进行显微镜(IX-70,奥林帕斯公司制)下观察。需要说明的是,表4~表6、表7~表9、及表10~表12的结果分别是通过独立的(hMSC的制备时间不同)实验得到的。
[表4]
表4:hMSC的细胞回收率(%)1
细胞回收率(%)以保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量相对于刚刚开始保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量(Pre)的比例([保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量/刚刚开始保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量(Pre)×100])的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。需要说明的是,表中“**”及“***”表示相对于细胞袋L(比较例试样5)而言经Dunnett法分析具有统计学上的显著差异(p<0.01及p<0.001)。
[表5]
表5:hMSC的细胞存活率(%)1
细胞存活率(%)以细胞悬浮液中的活细胞相对于总细胞数量的比例([细胞悬浮液中的活细胞数量/细胞悬浮液中的总细胞数量×100])的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。需要说明的是,表中“*”表示相对于细胞袋L(比较例试样5)而言经Dunnett法分析具有统计学上的显著差异(p<0.05)。
[表6]
表6:hMSC的活细胞的回收率1
活细胞的回收率以细胞回收率值乘以细胞存活率值所得到的值的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。需要说明的是,表中“**”及“***”表示相对于细胞袋L(比较例试样5)而言经Dunnett法分析具有统计学上的显著差异(p<0.01及p<0.001)。
2-2结果
保存后的hMSC的回收率如表4所示,使用了细胞袋A、B、C、H、L及M(比较例试样1、2、3、4、5及6)的情况下,分别为39%、43%、34%、40%、38%及36%,相对于此,使用了细胞袋D、F、G、J及K(实施例试样1、3、4、6及7)的情况下,分别高达50%、69%、99%、70%及80%。
另外,保存后的hMSC的存活率如表5所示,使用了细胞袋D、F、G、J及K(实施例试样1、3、4、6及7)的情况下,分别为93%、96%、93%、95%及96%,均高达90%以上。
结果,保存后的存活hMSC的回收率(细胞存活率×细胞回收率)如表6所示,较之在细胞袋A、B、C、H、L及M(比较例试样1、2、3、4、5及6)内保存的情况(分别为34%、37%、31%、37%、31%及32%)而言,在细胞袋D、F、G、J及K(实施例试样1、3、4、6及7)内保存的情况(分别为46%、66%、92%、66%及77%)更高。
[表7]
表7:hMSC的细胞回收率(%)2
细胞回收率(%)以保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量相对于刚刚开始保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量(Pre)的比例([保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量/刚刚开始保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量(Pre)×100])的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。需要说明的是,表中“***”表示相对于细胞袋L(比较例试样5)而言经Dunnett法分析具有统计学上的显著差异(p<0.001)。
[表8]
表8:hMSC的细胞存活率(%)2
细胞存活率(%)以细胞悬浮液中的活细胞相对于总细胞数量的比例([细胞悬浮液中的活细胞数量/细胞悬浮液中的总细胞数量×100])的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。
[表9]
表9:hMSC的活细胞的回收率2
活细胞的回收率以细胞回收率值乘以细胞存活率值所得到的值的形式来表示(平均值±标准偏差,n=3)。需要说明的是,表中“***”表示相对于细胞袋L(比较例试样5)而言经Dunnett法分析具有统计学上的显著差异(p<0.001)。
2-3结果
保存后的hMSC的回收率如表7所示,使用了细胞袋B及L(比较例试样2及5)的情况下,分别为30%及25%,相对于此,使用了细胞袋G(实施例试样4)的情况下高达80%。
另外,保存后的hMSC的存活率如表8所示,使用了细胞袋G(实施例试样4)的情况下高达95%。
结果,保存后的存活hMSC的回收率(细胞存活率×细胞回收率)如表9所示,较之在细胞袋B及L(比较例试样2及5)内保存的情况(分别为27%及22%)而言,在细胞袋G(实施例试样4)内保存的情况(76%)更高。
[表10]
表10:hMSC的细胞回收率(%)3
细胞回收率(%)以保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量相对于刚刚开始保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量(Pre)的比例([保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量/刚刚开始保存后的细胞悬浮液中的总细胞数量(Pre)×100])的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。需要说明的是,表中“*”表示相对于细胞袋B(比较例试样2)而言经Dunnett法分析具有统计学上的显著差异(p<0.05)。
[表11]
表11:hMSC的细胞存活率(%)3
细胞存活率(%)以细胞悬浮液中的活细胞相对于总细胞数量的比例([细胞悬浮液中的活细胞数量/细胞悬浮液中的总细胞数量×100])的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。
[表12]
表12:hMSC的活细胞的回收率3
活细胞的回收率以细胞回收率值乘以细胞存活率值而得到的值的形式进行表示(平均值±标准偏差,n=3)。需要说明的是,表中“*”表示相对于细胞袋B(比较例试样2)而言经Dunnett法分析具有统计学上的显著差异(p<0.05)。
2-4结果
保存后的hMSC的回收率如表10所示,使用了细胞袋B(比较例试样2)的情况下为49%,相对于此,使用了细胞袋E、F、I及K(实施例试样2、3、5及7)的情况下,分别高达83%、75%、84%及67%。
另外,保存后的hMSC的存活率如表11所示,使用了细胞袋E、F、I及K(实施例试样2、3、5及7)的情况下,分别为93%、93%、91%及92%,均高达90%以上。
结果,保存后的存活hMSC的回收率(细胞存活率×细胞回收率)如表12所示,较之在细胞袋B(比较例试样2)内保存的情况(45%)而言,在细胞袋E、F、I及K(实施例试样2、3、5及7)内保存的情况(分别为77%、69%、76%及61%)更高。
此外,保存后的hMSC黏附于细胞袋A~C、H、L及M(比较例试样1~3、4、5及6)的内表面,相对于此,保存后的hMSC向细胞袋D~G及I~K(实施例试样1~4及5~7)的内表面的黏附性被抑制,尤其在细胞袋E~G及I~K(实施例试样2~4及5~7)的内表面上几乎未黏附hMSC。
这些结果表明,较之在细胞袋A~C、H、L及M(比较例试样1~3、4、5及6)内保存细胞而言,在细胞袋D~G及I~K(实施例试样1~4及5~7)内保存细胞时,能够显著地抑制活细胞的黏附性。
[实施例3]
3.使用了细胞袋的源于小鼠间充质干细胞的10T1/2细胞的培养针对使用上述实施例1中制造的细胞袋培养细胞时是否能够抑制细胞黏附、以悬浮状态培养进行了分析。
3-1方法
〔1〕使源于小鼠间充质干细胞的10T1/2细胞以成为1.0×105个/mL的方式悬浮于含有10%FBS(life technologies公司制,gibco standard)的DMEM(nacalai tesque公司制,08458-45)培养液中,向2种细胞袋B(比较例试样2)及G(实施例试样4)内分别接种3mL。
〔2〕在培养箱(37℃,5%CO2)内进行培养,于4小时、1天、2天、3天及6天后,回收细胞悬浮液的一部分(10μL),与10μL的0.4%台盼蓝(Gibco公司制)混合,使用细胞计数盘计数活细胞数量,算出细胞存活率。另外,在光学显微镜(尼康公司制)下对黏附于细胞袋的细胞进行观察。
3-2结果
对于培养后的10T1/2细胞的存活率而言,使用了细胞袋G(实施例试样4)及细胞袋B(比较例试样2)的情况下均高达70%以上。另一方面,较之使用了细胞袋B的情况而言,使用了细胞袋G的情况下,在培养后黏附于袋内表面的10T1/2细胞的比例更少。
该结果表明,较之在细胞袋B(比较例试样2)内培养细胞而言,在细胞袋G(实施例试样4)内培养细胞时,能够显著地抑制活细胞的黏附性。
上述实施例1~3的结果表明,使用细胞袋D~G及I~K(实施例试样1~7)施予、保存或培养细胞时,由于能够有效地抑制细胞向容器内表面的黏附、能够有效地抑制细胞存活率降低,因此,能够施予、保存或制备高浓度且活细胞的比例高的含有细胞的液体。
产业上的可利用性
根据本发明,能够施予、保存或制备高浓度且活细胞的比例高的含有细胞的液体,从而有助于利用含有哺乳动物细胞的液体(悬浮液)的再生医疗。
Claims (6)
1.用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由氟树脂形成,所述氟树脂中的非氟代基团末端和-CF2H基团末端的总数量是每1×106个碳为70个以下,所述氟树脂为选自四氟乙烯-六氟丙烯系共聚物、及四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚系共聚物中的至少一种氟树脂。
2.用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由含有1个以上-CF3末端基团的氟树脂形成,所述氟树脂为选自四氟乙烯-六氟丙烯系共聚物、及四氟乙烯-全氟烷基乙烯基醚系共聚物中的至少一种氟树脂。
3.如权利要求2所述的用于哺乳动物细胞的施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器的与哺乳动物细胞接触的表面由非氟代基团末端是每1×106个碳为70个以下的氟树脂形成。
4.如权利要求1~3中任一项所述的用于施予、保存或培养的容器,其特征在于,所述容器为袋。
5.如权利要求1~4中任一项所述的用于施予、保存或培养的容器,其特征在于,哺乳动物细胞为黏附性细胞。
6.如权利要求1~5中任一项所述的用于施予、保存或培养的容器,其特征在于,哺乳动物细胞为间充质干细胞。
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