CN1860218A - 细胞处理装置、组织再生用组合物及组织再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的主要目的在于,在再生医疗中能够在不被周围环境污染的情况下保存和输送采集或培养了的细胞,以及能够将此细胞容易地注入到生物体内。因此,从生物体采集细胞,将采集的细胞或者将此细胞培养后得到的细胞保存在注射器型的保存容器中,将保存在此保存容器中的细胞移植到生物体内。这里的细胞保存容器优选与细胞相接触的容器内壁中的一部分或更多由细胞非粘附性材料形成。这样,细胞在容器内部除了能够摄取细胞生存所必需的氧之外,还能防止粘附于容器内壁上,因此在再生医疗的现场中使用时,不需对细胞进行剥离处理,就能够容易且迅速地向生物体进行细胞移植。
Description
技术领域
本发明涉及再生医疗、特别涉及用于再生医疗的细胞处理装置以及组织再生用组合物。
背景技术
近年来,随着分子细胞生物学、细胞工程学的进步,将从生物体中取出的分化了的细胞或者具有多分化功能及自我复制能力的细胞(干细胞)移植于患者以进行治疗的再生医疗的研究也一直在进行。所谓的再生医疗是指将分化了的细胞或者干细胞移植到生物体组织的缺损部位或疾病的责任病巢部位而使目标组织(含有脏器)修复并恢复的治疗方法。一般来说,在再生医疗中,将采集的细胞暂时单独或者在支架的存在下在专用容器内培养,将由此得到的分化了的细胞或者未分化的细胞通过外科处理移植于目标部位。
这样,在再生医疗中伴随着用于细胞移植的切开术,经常进行外科处理,对患者的负担大,因此研究了将培养了的细胞直接注入至体内的方法。如向关节注入软骨细胞或其前体细胞、向脑注入神经细胞、生理活性物质产生细胞或其前体细胞、向心脏注入心肌细胞或其前体细胞等,能够成为有力的治疗方法。实施该治疗时,经过使用胰蛋白酶、EDTA(乙二胺四乙酸、通称依地酸)等将粘附于容器壁的细胞剥离、洗涤等工序后,采集规定量。通常使用注射器或导管注入生物体内。
另外,在再生医疗的细胞移植中,不仅细胞的采集、培养、分化诱导、向生物体内移植等一系列的工序比较麻烦,而且为了防止来自周围的污染(沾染),必须在洁净的环境下、且使用熟练的尖端技术进行一系列的操作。因此,如果没有设备完整的设施、具有尖端技术的人员,难以实施细胞移植治疗。另外,除了操作之外,在如何不被周围环境污染的情况下,将采集或培养了的细胞输送到无菌室或培养箱等规定设备中也具有困难性。
发明内容
本发明以此背景为基础而完成,其主要目的在于,在再生医疗中,能够在不被周围污染的情况下将采集或培养了的细胞保存和输送,以及能够容易地将此细胞注入至生物体内。
然而在为了达成此目的研究中,已知具有以下所列举出的课题,因此本发明中也以解决这些课题为目的。
即,在以往的再生医疗中并不存在无论谁都能够简单地进行再生医疗一系列操作的细胞处理装置,上述的一系列操作是指将细胞采集、保存、培养,在使用时可简单地将此细胞移植于体内。
具体地说,多数的细胞如果不粘附于支架上的话则不能生存和增殖,因此细胞粘附于成为支架的培养容器的壁面。因此,在将细胞进行生物体移植时,必须将粘附于容器表面的细胞剥离。可以对此细胞进行物理剥离,也可以使用胰蛋白酶或EDTA等药剂进行剥离,但这些操作有可能对细胞产生坏的影响。并且,这种细胞操作如果没有设备完整的设施和具有尖端技术的人员,是难以实施的。
这样,可以说目前的情况下,由于必须将培养了的细胞暂时从容器壁面剥离下来,因此不能简单地进行细胞移植。
因此,本发明的目的在于提供一种细胞处理装置,该装置与以往相比具有简单的结构、而且能够防止污染而良好地保存细胞、并且在细胞移植治疗中,不用进行从容器上将细胞剥离的处理,就能够容易地将该细胞注入至生物体。
上述主要的目的可通过以下方法达成,即在组织再生方法中,将从生物体采集的细胞或者将此细胞培养后得到的细胞保存于作为细胞处理装置的注射器型装置中(即,通过活塞的手动操作、控制空气压力等机械手段对此装置施力,使该装置中的液体储存空间的体积发生变化,由此使内容物流入或流出(通过加压,将内容物从排出口排出)的装置),并将保存于该装置的细胞移植于生物体内。
即,通过使用注射器型的细胞处理装置,在再生医疗现场进行细胞移植时,通过与通常医疗用注射器同样的操作,能够将细胞移植于生物体内。因此,并不限于具有尖端且熟练技术的人员,都能比较容易且迅速地进行细胞移植,因此有利。另外,注射器型的细胞处理装置具有能够简单地控制内容物的排出量、流入量,以及控制内压变化速度的优点。
另外,为了达成上述目的也进行了涉及以下细胞处理装置和组织再生用组合物的发明。将这些发明组合,则在达成可以不被周围污染的情况下培养、保存、输送细胞,容易地将细胞注入至生物体内这一主要目的上也是非常有效的。
为了达成本目的,本发明人等将作为本发明的细胞处理器具制成能够液密地储存含有细胞的流动性处理对象物的细胞处理装置,其构成为至少在与上述细胞接触部位的至少一部分中设置有使得细胞生存所必需量的气体(用于呼吸的氧气、用于维持pH的二氧化碳等)透过的区域。
这里,“使气体透过的区域(透气性区域)”是指与细胞能够接触的地方由具有透气性、且对液体为非透过性的材料所形成的区域。在不能与细胞接触的地方设置透气性区域时,该透气性区域不一定必须具有液密性。
本发明中的透气性区域是指氧透过度为大于等于0.1mL/cm2·24hr·atm的区域。对于透气性区域的面积没有特别限制,但从向细胞充分提供必需的氧的方面看,优选细胞处理装置在与细胞悬浮液接触部分的总透氧量为大于等于1mL/24hr·atm,特别优选为大于等于10mL/24hr·atm。
这样,在本发明的细胞处理装置中,通过透气性区域气体能够流通(气体交换性),因此在该透气性区域外的部分中,即便使用液密性及气密性的材料,也能够在该装置内部液密地保存细胞悬浮液,同时通过细胞生存所必需的氧的摄取、二氧化碳的排出等气体调节,来实现含细胞悬浮液的培养液的pH条件等状态的维持。因此,能够在防止用于再生医疗的采集的细胞在该装置内的失活的同时输送该装置,同时也能够在该装置内部良好地使细胞增殖或分化诱导。
这里,如果将上述透气性区域整个设置在上述细胞处理装置中的细胞储存部分,则相对于细胞悬浮液中的细胞整体,容易均等且充分地发挥气体交换性。因此,即便不是那么优异的透气性材料,也能够得到充分的气体交换性。
另一方面,使用具有较优异透气性的材料时,没有必要用此材料构成上述细胞处理装置的全部,只要至少在细胞储存部分中的与细胞悬浮液相接触的内壁上部分地设置即可。此时,可以以矩形、圆形等形状形成具有规定面积的区域。
在上述注射器型细胞处理装置的情况下,优选在储存细胞的主体部的整体或一部分、接触细胞的活塞的一部分上形成透气性区域。在上述主体部的一部分上形成透气性区域时,由于面积有限,因此也依赖于细胞生存所需气体(氧气、二氧化碳)的必需最低浓度,优选使用透气性较高的材料,按照能够充分确保生存所需的气体的方式进行设计。换而言之,细胞生存所需气体的量根据细胞不同而不同,但为了使细胞生存,优选使用具有高透气性的材料来充分地进行气体交换。
另外,由于材料的选择范围有所限制等原因,在上述主体部的一部分形成透气性区域时,通过形成各自独立的多个区域,则均等且充分量地向上述细胞储存部分的整体供给气体的效果有所提高,因此优选。
在上述主体部的一部分设置透气性区域时,作为具有优异透气性的例子可以列举出多孔质膜。在此多孔质膜中控制孔径,由此能够维持液密性,因此发现,如果使用将孔加工成可确保液密性的程度的膜,即便是比较小的面积也能够确保充分的透气量。
另外,作为上述透气性区域如果采用多孔质膜,还能够通过多孔质膜,将储存于细胞处理装置中的细胞悬浮液中所存在的气泡安全地排出至细胞处理装置的外部。
注射器型细胞处理装置的情况下,作为储存细胞的主体部的形态,可以列举出直接将细胞储存于筒状容器(外筒体)的形态;以及将通过推压力的作用而内部空间可缩小的蛇纹状、囊状、管状等所谓的袋状容器收纳于外筒体内的形态。前者的情况下,优选在外筒体、用于确保液密性的盖子、活塞等处形成透气性区域。后者形态的情况下,通过在收纳于内部的容器的至少一部分上形成透气性区域,能够向细胞供给气体,而且特别在后者情况下,在外筒体中收纳袋状容器的状态下,优选按照袋状容器中与装置外部之间能够进行气体交换的方式在袋状容器以外的部分(活塞、外筒体等部位)上形成透气性区域。另外,袋状的容器装卸自如,安装的状态下细胞的保存和培养是当然的,卸载的状态下也能够实施细胞的保存和培养。其原因在于,此容器本身为液密性,同时具备透气性。
另外,作为形成透气性区域的膜,可以使用由透气性良好的高分子材料形成的薄膜,但即便透气性不是那么优异的高分子材料,通过制成多孔质膜、并适当设定孔径,也能够赋予透气性以及对液体的非透过性。因此,在能够使得细胞处理装置为液密性的同时,也能够防止细胞悬浮液的一部分从透气膜部分漏出。
另外,在本发明中,使用细胞难以粘附的材料形成与细胞处理装置的细胞悬浮液相接触的部位是有效的。作为细胞粘附性的评价方法,可以通过免疫学方法检测形成黏着斑(粘附斑)的辅助蛋白质进行评价,或通过计算细胞粘附数进行评价。
这样,通过降低细胞处理装置内面的细胞粘附性,能够在保存中防止细胞粘附于细胞处理装置壁面。由此,在再生医疗的现场能够得到以下效果。
即,一直以来,在再生医疗中移植的细胞,如利用细胞培养用培养皿等来培养保存,但由于在这种以往的细胞处理装置中细胞粘附于其内面,因此向生物体内移植时必须进行细胞的剥离处理。另外,为了进行该剥离处理,必须在高度防污染的设备中由具有高超技术的熟练的人员进行操作,不能容易地进行再生医疗。与此相对,由于本发明的细胞处理装置在将细胞从该细胞处理装置取出时,不需要细胞的剥离处理,不进行物理的剥离操作、不使用药剂,可以在不损害细胞的情况下移植于生物体,因此可具有能够良好地实施再生医疗的效果。并且由于不进行细胞的剥离处理就可将保存于细胞处理装置中的细胞直接移植于生物体内,因此能够节省移植操作的烦琐,同时即便是不具有那么高度熟练技术的人员也能容易地进行细胞移植操作。
并且,本发明人等对用于使再生医疗用的细胞增殖、分化诱导的支架的材料和形状,以其独特的构想为基础进行了反复研究,结果发现将支架的形状制成粒子形状、同时使用生物体吸收性材料形成支架,由此能够大幅度简化伴随着细胞培养的操作,进而完成了本发明的组织再生用组合物的研究。即,本发明的组织再生用组合物,具有流动性介质和成为细胞支架的粒子形状的细胞支架粒子,其构成是:细胞支架粒子由生物体吸收性材料构成,且细胞粘附于该细胞支架粒子上。
通过这种本发明的组织再生用组合物,能够使从生物体采集的细胞在支架粒子的表面上增殖或者向目标细胞分化诱导。在此期间,细胞粘附于支架粒子而增殖,通常在流动性介质(培养液(包括体液))中具有流动性。并且,进行细胞移植时,能够将此细胞培养粒子直接注入到生物体内。
因此,不必像以往那样在细胞增殖后实施细胞剥离处理,能够大大提高再生医疗中的细胞移植操作的效率。另外,由于不必进行细胞剥离处理,因此不必担心损伤细胞。此组织再生用组合物在向患部注入时,并非一定要使用在支架粒子上粘附有细胞的物质,也可以仅将支架粒子注入,成为宿主细胞的支架。
另外,由于使用生物体吸收性材料形成支架粒子,因此注入到生物体后经过一定时间后,支架粒子通过生物体吸收而消失。因此,也不需要手术后除去支架的操作。
这里,将细胞移植到人体时,把将在培养液中悬浮有细胞的物质移植到人体的方法作为一种尝试,在此方法中,由于流动性高,因此细胞流失,细胞难以适当地固定生长在移植部位。为了解决此问题,尝试将在分散用基质中(高粘性溶液、如明胶、骨胶原等)分散移植用细胞而得到的悬浮液(高粘度溶液)移植到患部的方法,以使得细胞不流失,但这种方法中,分散用的基质成为了障碍,因而不能适当地固定生长在移植部位上。但是,上述组织再生用组合物,由于细胞粘附于粒子表面,因此尝试细胞移植时,不易发生该问题,细胞可以良好地固定生长。
并且,由于支架为粒子状,因此每单位体积的表面积高,所以在少量的支架上能够有效地粘附很多细胞。
如果将由这种细胞培养粒子构成的组织再生用组合物保存在上述具有注射器样式的细胞处理装置中,则在移植时,能够从该细胞处理装置中容易且迅速地将细胞移植到生物体内。因此,能够减轻例如体力较差的幼儿、老人等患者的手术等,并且能够在再生医疗中减轻患者的负担。
进而,通过将此组织再生用组合物收纳于上述细胞处理装置中,能够达到将细胞的输送、培养、向人体的细胞移植为止的阶段性工序作为一个环节、在一个容器中简单实施的效果。即,由于上述细胞处理装置具备透气性区域,因此能够在该装置中进行保存和培养,所以能够省去特意将细胞转移到细胞培养专用容器中的操作,而且该装置为注射器型的形态,由此发挥出能够使用相同装置,通过针、导管等导管将在内部保存及培养的细胞直接进行移植操作的较高的效果。
在利用上述细胞处理装置实施移植时,如果细胞粘附于装置壁面,则所注入的细胞数减少,因此不能将必需量的细胞移植到人体内。这里,为了解决此问题,赋予装置内壁面以细胞非粘附的上述特性来减少细胞粘附数是有效的,但是,在使用培养和分化时需要支架的粘附性细胞时,此细胞失去了支架。此时如果使用上述生物体吸收性的支架粒子,则为这种细胞提供支架,因此非常有效。
当细胞粘附部位为多个时,有向易粘附的部位粘附的倾向,因此支架粒子为了发挥作用,与装置内壁面相比,当然必须是细胞更易粘附的材料。
附图说明
图1是作为实施方式1的细胞处理装置的注射器的结构图。
图2是作为实施方式2的细胞处理装置的注射器的结构图。
图3是作为实施方式3的细胞处理装置的注射器的结构图。
图4是作为实施方式4的细胞处理装置的注射器的结构图。
图5是本发明的细胞处理装置的性能数据。
图6是实施方式5的细胞处理装置的结构图。
图7是实施方式6的细胞处理装置的结构图。
图8是作为实施方式7的细胞处理装置的注射器的结构图。
图9是作为实施方式8的细胞处理装置的注射器的结构图。
图10是本发明的组织再生用组合物的构成图。
具体实施方式
首先,对本发明的组织再生方法进行说明。
本发明的组织再生方法基本上含有以下的步骤。
i.从生物体采集细胞的采集步骤
首先,从生物体采集特定的细胞。
ii.分离和纯化步骤
通过FACS(流式细胞仪)等分离和纯化所采集的细胞。
iii.将细胞保存于细胞处理装置中的保存步骤
其后,将细胞保存于细胞处理装置。
iv.增殖步骤
将保存有细胞的细胞处理装置保存于细胞培养设备(CPC)等中。然后,在该细胞培养设备等中使细胞处理装置中的细胞增殖以及根据需要进行分化诱导。
v.移植步骤
使用上述细胞处理装置,将增殖和分化诱导了的细胞移植于生物体内。
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这里,在iii~v的步骤中,使用以下实施方式1~8所示的注射器型细胞处理器具,由此能够在保存、输送、增殖、移植的再生医疗的全部工序中使用同一个装置进行一系列的操作,因此可以不将细胞转移至其他容器,能够安全且迅速的推进到下一个工序,使迅速的治疗成为可能。
特别是在再生医疗现场中的细胞移植时,其有用性高,能够与通常医疗用注射器同样地进行操作,将保存的细胞移植到生物体内。因此,不仅限于具有高度且熟练技术的人员,也能够容易且迅速地进行细胞移植。并且,还能够在保存细胞的同时进行输送。
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另外,在实际的再生医疗现场中,进行各步骤的场所多是相互分开的,但本发明的细胞处理装置能够将液体密封来进行处理,因此也适于将细胞输送至分开的地方。
例如,在iii的保存步骤中,通过用于从生物体中将细胞取出到培养为止、或到移植为止的期间内的细胞保存,也能够同样容易且迅速地处理细胞。或者,在iv的增殖步骤中,培养细胞时也能使用本发明的细胞处理装置。并且,能够作为细胞的培养装置使用,其后能够作为原样保存细胞的手段进行利用。
一般来说,细胞悬浮液由培养液和细胞构成。培养液可以直接使用以往使用的培养液,但考虑到将培养液与细胞一起移植到生物体内时的安全性,优选尽可能不添加或者减少添加可能成为感染原因的物质(病毒、感染性蛋白质等)。
这里,在细胞悬浮液中可以含有用于再生医疗的治疗用途等中的各种细胞。细胞可以根据治疗目的使用上述各种细胞种类。该细胞种类没有特别限制,具体的例子除了可以列举出胚胎性干细胞(embryonic stemcells:ES细胞)、胚胎性生殖细胞(embryonic germ cells:EG细胞)、成体干细胞(adult stem cells:AS细胞、也称为成人干细胞)、间充质干细胞、神经干细胞、血管内皮干细胞、造血系干细胞、肝干细胞等干细胞,还可列举出骨细胞、软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞、腱细胞、脂肪细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、毛囊细胞、血细胞等分化了的细胞或其前体细胞。这样,可以使用以胚胎性干细胞为首的各分化程度不同的干细胞和分化成各组织的细胞。其中,使用粘附性细胞时,可以有效赋予细胞处理装置以细胞非粘附性和使用微粒子状的支架。原因在于粘附性细胞在增殖和分化时必需支架。
这种细胞可以通过公知的方法进行采集。即,从生物体的规定部位分离组织(细胞),从其中将必要的细胞选择性地分离后,根据需要添加细胞增殖因子或生长因子等进行培养。该培养优选在专用的培养箱中实施。将由此培养的细胞储存于注射器型的细胞处理装置内部,在适于保存的条件下保存直至用于治疗。
给出细胞与培养液的组合例。
即,培养细胞使用人间充质干细胞(human mesenchymal stem cell)时,可在440mL的人间充质干细胞基础培养基(POIETICS公司美国)中添加间充质干细胞生长添加物(50mL)、L-谷氨酰胺(10mL)、青霉素/链霉素(0.5mL)作为培养液。
作为使用软骨细胞时的软骨分化诱导培养基(培养液),可以使用在hMSC分化的基础培养基(185mL)中添加了地塞米松(1mL)、丙酮酸钠(2mL)、抗坏血酸(2mL)、脯氨酸(2mL)、ITS+添加物(2mL)、L-谷氨酰胺(4mL)、青霉素/链霉素(2mL)的培养基。
另一方面,对由本发明的细胞培养粒子所构成的组织再生用组合物在后面进行详述。
以下,对使用注射器型的细胞处理装置来保存细胞悬浮液的情况进行详细说明。
1.关于本发明的细胞处理装置
(实施方式1)
1-1.注射器型细胞处理装置1的结构
图1所示为作为一例本发明的细胞处理装置的实施方式1的注射器型细胞处理装置1的结构图。图1(A)为立体图、图1(B)为侧面图、图1(C)为图1(B)的X-X’剖面图。
图1所示的注射器型细胞处理装置1的结构大致分为注射器主体部2、活塞(plunger)(也称作推压件或piston)40等。注射器主体部2中储存有细胞悬浮液100。
注射器主体部2由将细胞非粘附性材料注射成形为圆筒形状而形成的筒状体3和后述的透气膜20构成。
筒状体3的前端侧面形成有圆盘状前端面110和在其上突出的饵部120。饵部120的前端通常施有盖60。从注射器主体部2的后端12侧插入活塞40,由此注射器主体部2内部被密封为液密性。此外,饵部120的其余的内部用树脂等进行密封,在使用时(细胞移植时)可以将密封破坏。
这里的筒状体3的材料只要是能够成形的材料即可,可以使用通常用于注射器中的材料,但作为本发明的特征之一,优选筒状体3的材料使用难以粘附细胞的材料。详细内容如后所述,筒状体3的一部分使用此细胞非粘附性材料,由此能够防止细胞粘附于筒状体3内部,且可以在悬浮于培养液中的同时良好的保存。
这里所说的“细胞非粘附性”是指细胞完全不粘附或者即便粘附也只是粘附了可简单剥离的程度。
活塞40通过将聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯等材料注射成形而成,具有在十字剖面形状的主体42的两端形成有在直径方向扩展的圆盘状端部的结构。上述端部中的一个为在轴方向上插入至注射器主体部2内部的活塞头部43,另一端部为使用者用手指进行推压的推压端部41,此推压端部41用于将活塞40推入至注射器主体部2内部。
活塞头43由弹性部件构成,使得在注射器主体部2(详细地说为筒状体3和透气膜20)内部中,能够液密地保持细胞悬浮液100。
(关于细胞非粘附性材料)
这里的“细胞是否难以粘附的评价”、换而言之“是否具有细胞非粘附性的评价”,如可通过免疫学方法检测形成黏着斑(粘附斑)的辅助蛋白质进行评价,或通过计算细胞粘附数进行评价。
作为上述细胞非粘附性材料,优选的材料如下。即,根据保存的细胞种类的不同而不同,但一般来说,由亲水性材料或者疏水性材料形成的材料以及表面带有负电荷的材料多具有细胞非粘附性,可作为优选的材料。作为亲水性材料,优选对水接触角为50度或以下的材料;作为疏水性材料,优选对水接触角为100度或以上的材料。
作为优选的亲水性材料的例子,可以列举出在基材表面通过接枝共聚或者化学反应等方法结合或者在表面上覆盖有丙烯酰胺系聚合物、甲基丙烯酰胺系聚合物、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、葡聚糖、透明质酸、葡糖胺聚糖、蛋白多糖、角叉菜聚糖及蛋白质等的材料。关于基材表面的调整和覆盖处理,必须在利用注射成形等制作基材后另外进行。
作为疏水性材料,可以列举出聚四氟乙烯、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯等氟系树脂及硅树脂。
作为表面带有负电荷的材料,可以列举出在表面上结合有聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸、藻酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素或者硫酸皮肤素的材料。其中特别优选表面具有羧基的材料。该材料的表面平滑,在细胞非粘附性上优异,因此优选。
上述材料中由于硅树脂在透气性上也优异,因此其是优选的材料。另外,由于聚四氟乙烯以及四氟乙烯-六氟丙烯共聚物与多孔质膜相比,能够得到更高的透气性,因此同样优选。
优选使用该细胞非粘附性材料来构成与细胞相接触的垫圈部分。
(关于透气性区域)
筒状体3的周壁30上设有在厚度方向上贯通筒状体3的贯通孔。这里如图1(A)所示,为多个(这里为4根)将该注射器轴方向作为长度方向的长方形状的狭缝31,但此长方形状的狭缝31为贯通孔形状的一个例子,其形状和个数并不限定于此。
并且,如图1(C)所示,在狭缝31内部设置有圆筒状的透气膜20,此透气膜20在与注射器主体部2的内周面相接触的同时,长度与除去饵部120的狭缝31的全长相应。该透气膜20可以由比狭缝31的主材料的透气性还高的材料(如由透气性材料构成的膜)构成。此透气膜20遮挡上述长方形状的狭缝31,从该长方形状的狭缝31中部分地露出至外部的部分成为由多个透气性单位区域构成的透气性区域21。
另外,也可以不将透气膜20制成筒状,而是制成长方形状的膜,将其按照液密地遮挡各狭缝31的方式从筒状体3的外侧附着配置。
作为上述透气性材料,可以使用相对于细胞悬浮液100为非透过性(即,能保持液密性)的透气性树脂。此透气性树脂可以为例如硅树脂、聚-4-甲基-1-戊烯(P4M1P)、聚异戊二烯、聚丁二烯、乙烯-醋酸乙烯共聚物、低密度聚乙烯及聚苯乙烯等。这些透气性材料在塑料材料中具有较好的透气性,但如果厚度增加则透气性降低。因此,透气膜20的壁厚通常优选为200μm或以下,特别优选100μm或以下。
另外,作为透气性材料,除此之外还可利用多孔质膜,此多孔质膜的孔径设定在规定值以下,以使得在能够防止细胞悬浮液100漏出到外部的同时,可防止细菌侵入至细胞悬浮液100中等的污染。此时,多孔质膜的原材料优选疏水性的高分子材料。多孔质膜的孔径优选设在1μm或以下,更优选为0.4μm或以下。作为此疏水性材料,可以利用聚四氟乙烯(PTFE)、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)以及聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)等。另外,还可以使用疏水性聚偏氟乙烯。
这里,作为上述透气膜20的材料,更优选使用作为多孔质膜材料的上述疏水性材料等,或者上述透气性树脂材料的硅树脂、聚乙烯或聚苯乙烯,原因在于,通过使用这些材料,透气膜20能够具有透气性和细胞非粘附性两种性能。上述疏水性材料中多见呈细胞非粘附性的材料。
注射器型细胞处理装置1优选在保存细胞悬浮液100之前预先进行灭菌处理。保存细胞时,细胞悬浮液100被储存在注射器主体2的筒状体3内部的透气膜20内侧的活塞头43和饵部120之间(参照图1(C))。细胞悬浮液100可为如下的状态:如从饵部120放入至注射器主体部2内部,之后通过用盖60或者树脂将饵部120密封来液密地保持;或者先将饵部前端120密封,之后从筒状体3的后端12侧将细胞悬浮液100放入。
这里虽然没有图示,但在注射器型细胞处理装置1内,在储存了细胞悬浮液100的同时还可储存若干气体。但是,如果该气体成为气泡混入至培养液中,则有可能破坏细胞,因此优选尽可能不含有气体。
1-2.注射器型细胞处理装置1的效果
实施方式1的注射器型细胞处理装置1中,筒状体3由相对于细胞悬浮液100为非透过性的材料构成,其周面30上形成有狭缝31,在该区域上形成有透气性区域21,其是用具有对细胞悬浮液100为非透过性、但对气体具有透过性的性质的材料形成的。由此,由于筒状体3不必一定为透气性,因此能够使用上述各种材料,通过通常的注射成形等工序容易地制作。并且,也容易确保作为注射器所必需的刚性和强度。
另外,此注射器型细胞处理装置1除了如上所述在注射器主体部2内部储存细胞悬浮液100之外,细胞悬浮液100还保持着能通过透气性区域21与外部气体进行气体交换。因此,细胞能够从注射器型细胞处理装置1外部摄取生存所必需的氧,并且可以通过二氧化碳维持培养液的pH,因此抑制了活性的降低,可以良好地保存。
细胞悬浮液100中存在的气泡,如在搬运细胞处理装置时与细胞相接触,则可能成为破坏细胞的原因。本实施方式1的注射器型细胞处理装置1中,在透气性区域使用多孔质膜时,这种气泡可以通过透气性区域21在防止污染的同时将气泡排除到外部,因此细胞不会被破坏,能够安全地将其保存。
并且,注射器型细胞处理装置1通过设有透气性区域21,能够与外部进行气体交换,但按照细菌不会从该透气性区域21浸入至注射器主体部2内部的方式形成。因此能够防止污染的发生,良好地保存细胞。该污染的防止效果的程度如前所述,作为透气膜20的材料,例如使用透气性材料时适当设定其部件厚度、或者使用多孔质膜时适当设定其孔径,由此进行适当调整。但是,此种调节必须要考虑到兼具作为细胞处理装置所必需的透气性来进行。
以上的本发明的细胞处理装置所具备的透气性效果,在再生医疗现场,如从医院外采集细胞并将其安全输送到具备临床检查设备的专门机构时,是特别要求的,本实施方式1的注射器型细胞处理装置1作为满足此要求的细胞处理装置可发挥有效的效果。
并且,注射器型细胞处理装置1被制为医疗用注射器的样式,因此在再生医疗中使用时,将饵部120的前端的盖60打开,将饵部120与针、血管内导管或者其他导管相连接。然后,仅用手指将活塞40的推压端部41推入即可将细胞注入至生物体内。因此,通过与通常的注射器操作几乎相同的操作,不需要复杂的操作,即便不是具有高超技术的熟练的人员也能将细胞注入至生物体的患部,并且能够容易且迅速地实施再生医疗。
另外,使用多孔质膜形成透气性区域时也能够具有以下效果:即通过将活塞40的推压端部41向饵部120侧推入,对细胞悬浮液100施加压力,能够简单地进行从透气性区域21将气泡除去的操作。
并且,注射器型细胞处理装置1,当注射器主体部2的筒状体3以及透气膜20中的一个或者两个是由细胞非粘附性材料构成时,在与细胞悬浮液100相接触的内壁的一部分或者整体上细胞都不粘附。由此,细胞在培养液中以悬浮的状态被保存,因此在从注射器型细胞处理装置1将细胞移植到生物体内时,不需要进行将细胞从筒状体3内壁上剥离处理的工序,可以减少此工序的繁琐操作。另外,由于细胞在培养液中悬浮,因此仅推入活塞40,细胞就能与培养液一起顺畅地从注射器型细胞处理装置1内部被移植到生物体内。
注射器型细胞处理装置1,通过在注射器主体部2使用上述细胞非粘附性材料,能够达到从根本上回避以往伴随细胞剥离处理的问题的效果,这些问题即在物理剥离细胞时对细胞的损伤问题、或者使用药剂(胰蛋白酶、EDTA等剥离剂)进行剥离处理时该药剂对细胞和移植对象的生物体的不良影响的问题、必须进行细胞的洗涤处理或者利用温度变化处理进行细胞剥离处理等的繁琐处理问题等。
如果使用本实施方式1的注射器型细胞处理装置1,则如上所述能够在再生医疗现场非常容易、迅速及准确地进行细胞移植操作,因此即便在不具备那么高超设备的机构中,也能够避免污染等问题的发生,同时良好地实施再生医疗。本发明的细胞处理装置能够良好地满足这种在再生医疗的操作中所要求的条件。
如上所述,通过将保存在注射器型细胞处理装置1内部的细胞注入到生物体患部或者血管内,能够应用于对变形性关节炎、类风湿性关节炎、假关节、进行性肌肉营养不良、心肌梗塞、脑中风、帕金森氏病、脊髓损伤、腱损伤、糖尿病、肝功能障碍、消化器官机能障碍、皮肤损伤、白血病、血液类疾病等的治疗中。
一般来说,细胞与培养液(或者培养基)一起培养保存,利用本实施方式1的注射器型细胞处理装置1,与细胞悬浮液一起直接注入至生物体内时,需要选择对生物体具有安全组成的培养液。
例如,在向变形性关节炎患者注入软骨细胞或者其前体细胞时、向帕金森氏病患者的脑中注入神经细胞或其前体细胞时、或者向心脏病患者注入心肌细胞时、向人注入细胞时等情况下,优选不含有牛血清等生物体来源成分的合成培养基或使用了患者本身血清的培养基。
(实施方式2)
图2所示为作为本发明的细胞处理装置一例的实施方式2的注射器型细胞处理装置1的结构的剖面图。与实施方式1不同,在注射器主体部2中,不在筒状体3的周壁上设置贯通孔,而是在该筒状体3的前端面1100上形成透气性区域。此透气性区域,具体地说,在形成注射器主体部2时,可以是仅前端面1100部分由透气性材料构成、也可以通过下列的方式来形成:在前端面1100上开设贯通孔,熔融粘着或粘合透气膜来覆盖该贯通孔,由此配设为液密性。
上述细胞非粘附性材料以及上述透气膜材料,可以使用与实施方式1所列举出的材料相同的材料。在饵部前端120处通常如图2所示那样施加有盖60,或者用树脂将内部密封,由此液密地保持注射器型细胞处理装置1内部。
通过具有这样结构的实施方式2的注射器型细胞处理装置1,也能达到与实施方式1几乎相同的效果(气体交换性、将气泡从细胞悬浮液100中除去、以及能够容易且迅速地进行细胞移植等效果)。
除此以外,本实施方式2的注射器型细胞处理装置1还具有以下较高的效果:即虽然注射器主体部2的内壁大部分与细胞悬浮液100相接触,但由于该筒状体3由细胞非粘附性材料构成,因此细胞不会粘附于注射器主体部2的内壁,能够在培养液中以悬浮的状态保存。
本实施方式2的注射器型细胞处理装置1与实施方式1不同,注射器主体部2的圆筒状内壁上没有设置贯通孔,因此在进行除去气泡的操作时,将饵部120朝上、从注射器主体部2内部将活塞40向饵部120侧推入时,能够容易地将气泡集中在前端面1100附近,在将漏液抑制在最低限的同时,可以容易地将该气泡从前端面1100除去,因此优选。这样,能够达到防止气泡混入至细胞悬浮液100中,同时良好地将细胞移植到生物体侧的效果。
活塞头44也可由透气性材料构成。这样的话,细胞悬浮液100能够更加良好地与外部进行气体交换,因此优选。
另外,还优选使用细胞非粘附性材料构成活塞头44,努力使细胞不粘附。
(实施方式3)
图3所示为本发明的细胞处理装置的实施方式3的注射器型细胞处理装置1的结构的剖面图。与上述实施方式1和2的不同之处为,其具有以下特征:注射器主体部2由与以往注射器主体同样的筒状体构成、活塞头44由透气性材料构成。透气性材料可以使用在上述实施方式1或2中所列举出的材料。
活塞头44被嵌合固定于活塞40的主体42的注射器侧前端,以使得液密地连接于注射器主体部2内壁。这里的活塞头44仅选择性的透过气体,因此细胞悬浮液100的溶液不会漏出到外部。
本实施方式3中也优选使用上述细胞非粘附性材料构成注射器主体部2及活塞头44。
通过具有这样构成的实施方式3的注射器型细胞处理装置1也能达到与实施方式2几乎相同的效果。
本实施方式3的注射器型细胞处理装置1,通过该具有透气性的活塞头44,能够防止细菌等导致的污染的发生、同时细胞悬浮液100中的细胞可与外部进行气体交换,因此能够在抑制细胞活性降低的同时良好地保存细胞。另外,还能得到以下效果:即有效地将细胞悬浮液100中含有的气泡从活塞头44除去到外部,从而防止气泡导致的细胞破坏的发生。
使用本实施方式3的注射器型细胞处理装置1进行除去气泡的操作时,与实施方式2相反,优选将饵部120向下进行操作,其原因在于将细胞悬浮液100中的气泡集中于活塞头44的透气膜附近,易于排出。
本实施方式3中,给出了活塞头44整体都具有透气性的结构例,但本发明并不限定于此,例如还可以先利用与以往同样的弹性部件制作活塞头的主体,在其主面设置贯通孔,按照将由此形成的贯通部分覆盖的方式设置透气性区域(例如透气膜),从而构成活塞头。
(实施方式4)
图4所示为本发明的细胞处理装置的实施方式4的注射器型细胞处理装置1的结构的外观图。本实施方式4的特征在于,注射器主体部2由上述细胞非粘附材料构成,同时在注射器主体部2中不设透气性区域,而在注射器主体部2的饵部120前端设置带有过滤膜的盖130,此过滤膜将透气膜131作为过滤装置。透气膜的材料(透气性材料)、以及细胞非粘附性材料都可使用上述各实施方式1~3中所列举出的材料。
具有这种构成的本实施方式4的注射器型细胞处理装置1中,通过盖130中的透气膜131,注射器型细胞处理装置1的内外也可进行气体交换,因此达到了与上述各实施方式1~3几乎同样的效果。
实施方式4的注射器型细胞处理装置1的除气泡操作也与实施方式3同样,先将盖130朝上,推入活塞40,由此将细胞悬浮液100中的气泡集中于饵部120周围(以及透气膜131周围),可将其良好地除去。
上述实施方式2、3、4的注射器型细胞处理装置1的结构为在活塞40滑动方向的前方或后方设有透气性区域。通过这样设置在滑动方向的前方或后方,伴随着活塞40的滑动操作,能够容易地将气泡从该透气性区域赶出。
这里,在实施方式1~4中列举出的透气膜20、131、前端面1100或者活塞头44中,通过使用由上述疏水性材料构成的多孔质膜,或者使用硅树脂、聚乙烯或聚苯乙烯等透气性树脂材料,能够同时具有透气性和细胞非粘附性,使得细胞在细胞悬浮液100中更良好的悬浮、储存或者顺畅地进行细胞移植。
(相对于实施方式1~4的变形例及性能比较试验)
在上述实施方式1~4中给出了由细胞非粘附性材料构成注射器主体部2整体的例子,但本发明中不一定非要使用该细胞非粘附性材料构成注射器主体部2整体,仅用细胞非粘附性材料构成与细胞悬浮液100相接触的内壁即可。另外,即便使用细胞非粘附性材料部分地构成与细胞悬浮液100相接触的注射器主体部2的内壁,也能期待恰当的效果。但是,为了充分地得到本发明的效果,优选还是尽可能使用细胞非粘附性材料构成与细胞悬浮液100相接触的注射器主体部2内壁的整体,或者使用细胞非粘附性材料构成注射器主体部2的整体。
性能比较试验
这里为了比较现有技术的注射器与本发明的注射器的性能,以下述a~g的模式为基础在各注射器内进行细胞培养,计算细胞的生存率。作为本发明品,使用了实施方式2和4的注射器。
图5为显示实验结果的数据。
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a.使用悬浮细胞培养用的培养皿进行培养
b.使用现有结构(聚丙烯制)的医疗用注射器,将饵部的前端盖住,在密封的状态下培养
c.使用实施方式2的医疗用注射器(前端面设有透气膜、注射器主体部由细胞非粘附性材料制成),将饵部的前端盖住,在密封的状态下培养
d.使用实施方式2的医疗用注射器(前端面设有透气膜、注射器主体部由细胞非粘附性材料制成),在饵部的前端安装实施方式4的带有过滤膜的盖子(小型),在此状态下培养
e.使用实施方式2的医疗用注射器(前端面设有透气膜、注射器主体部由细胞非粘附性材料制成),在饵部的前端安装实施方式4的带有过滤膜的盖子(大型),在此状态下培养
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在a的悬浮细胞培养用培养皿中进行的培养(面积为21cm2),作为在悬浮体系中的培养。
过滤膜使用e-PTFE制、厚度为70μm、孔径为0.1μm的膜。
各尺寸如下所示。
带有小型过滤膜的盖的透气膜面积:约43mm2
带有大型过滤膜的盖的透气膜面积:约113mm2
注射器内容积:10mL
透气性前端面面积:约70mm2
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这里,细胞生存率的具体评价方法如下所述。
即,将从小鼠骨髓中的造血干细胞(HSC)浓缩分离出来的表面标记Leneage negative Scal+skit+(以下KSL:悬浮系细胞)进行纯化,使KSL细胞数10000个悬浮于2mL培养液中,在各注射器内部培养3天,之后使用表面标记和群落分析评价存活的HSC数。
培养液的种类如下。
StemSpan培养基(Stemcell Technology)
50ng/mL小鼠干细胞因子(mSCF;Peprotech)
20ng/mL人flt-3配体(Peprotech)
20ng/mL小鼠血小板生成素(mTPO;Stemcell Technology)
添加的抗生素种类:0.05μg/mL链霉素
由图5所示的实验结果可知,首先在使用了现有医疗用注射器的b中,细胞失活严重,与此相对,作为实施例的注射器的d和e的模式得到了最高的性能。此结果表现出,在实施例的注射器中,通过设置于注射器主体部前端面的透气膜和安装在饵部的带过滤膜的盖,可得到较高的气体交换性,相对于储存在注射器内部的细胞悬浮液可进行良好的气体交换,其结果发挥了优异的细胞保存性能。
这样在本发明中,如果互相组合各实施方式的细胞处理装置的特征部分,则可期待能够获得非常高的细胞保存性能。例如,在上述数据中示例了将实施方式2和4组合的例子,但通过进行如实施方式1那样在注射器主体部侧面设置透气性区域、如实施方式3那样使活塞头具有透气性的组合,能够具有更大面积的透气性区域。由此,细胞悬浮液中的细胞能够与外部更加良好地进行气体交换,从而抑制细胞的活性降低。另外,从细胞混悬液中除去气泡的效率也提高,能够不导致细胞破坏而更加安全地保存细胞。
如c所示可知,即便在不安装带过滤膜的盖子时,通过在注射器主体部的前端面上设置透气膜,也至少能够维持与在细胞培养用培养皿中的培养条件大致相同、或者更好的细胞活性。另一方面,考虑到b中的细胞活性下降,可知即使仅用现有的医疗用注射器作为细胞处理装置,也不能得到本发明那样良好的细胞保存性能。
通过以上的考察可知,实施方式1~4所示的注射器型细胞处理装置同时具有在细胞移植时可迅速且容易将细胞移植的性能以及高水平的细胞保存性能。
(实施方式5)
图6为显示实施方式5的细胞处理装置200的结构的外观图。
该细胞处理装置200由具有透气性和可挠性的材料构成,整体为圆筒状,其主体的周壁部201形成蛇纹状,由此在维持圆筒形状的同时能够伸缩。主体周壁部201的前端部形成有饵部203,不使用时嵌合有盖60,由此液密地保持主体周壁部201内部。细胞悬浮液100(未图示)储存在细胞处理装置200的内部。
作为构成细胞处理装置200的材料,可以使用在实施方式1~4中列举出的透气性材料。但是,本实施方式5中,由于此透气性材料几乎构成了细胞处理装置的整体,因此,在考虑到将细胞处理装置的形状保持在圆筒形状的情况下,优选使用具有适当刚性的材料。另外,作为细胞处理装置200的材料使用多孔质膜时,细胞处理装置的透明性下降,有时无法确认其中的细胞悬浮液100。此时,可以使用透气性树脂材料构成细胞处理装置200的一部分(主体周壁部201的后端部202),确保细胞处理装置的透明性,使得能够确认储存于内部的细胞悬浮液100。对后述实施方式6的细胞处理装置300也可使用此办法。
通过具有上述结构的实施方式5的细胞处理装置200,由于该细胞处理装置200整体都由上述透气性材料制成,因此能够防止液密地储存于内部的细胞悬浮液100被细菌等污染的发生,并且能够遍布细胞处理装置200内壁整体的宽广面积来摄取细胞生存所需的氧。因此,与仅一部分为透气性的细胞处理装置相比,能够显著得到良好的气体交换性能。特别是由于细胞处理装置200形成为蛇纹状,因此在保存时也能容易地保持原有的容器形态,并且,能够确保扩大与细胞的气体交换相关的细胞处理装置的表面积。
而且,细胞处理装置200与上述各实施方式1~4的构成相比,还具有结构简单,制造容易的优点。而且,由于细胞处理装置200不需要活塞,因此也不必担心保存中由于注射器主体部与活塞之间的间隙而发生漏液(封口泄漏)。
这种细胞处理装置200的优异性能在再生医疗中的使用时也有所发挥。即,使用时将盖60打开,在饵部203处安装针或者导管,对应生物体内部的规定位置,仅通过手动或者夹具推压主体周壁部201的后端部202,就能够在回避发生污染的情况下容易且迅速地将内部的细胞注入至生物体侧。另外,当装置的一部分使用多孔质膜时,通过推压后端部202也能有效地进行将细胞悬浮液100中的气泡除去的操作。
(实施方式6)
图7所示为显示实施方式6的细胞处理装置300的结构的外观图。
该细胞处理装置300由与上述细胞处理装置200同样的具有透气性和可挠性的材料构成,其主体周壁部301形成为细长的袋(管)状。主体周壁部301的前端部形成有饵部303,不使用时该饵部303上嵌合有盖60,由此液密地保持内部。并且,在主体周壁部301中,从后端部302侧插通扁平环状的操作环304。细胞悬浮液100(未图示)液密地储存在细胞处理装置300的内部。
通过具有这种结构的实施方式6的细胞处理装置300也能达到与实施方式5几乎相同的效果,但由于结构上的不同,特别是在细胞处理装置300中,由于不需要像实施方式5的细胞处理装置200那样,加工成蛇纹状等,因此还具有制造变得更加容易的优点。
通过该细胞处理装置300,在再生医疗中使用时,首先将盖60打开,在饵部303上安装针或者导管,保持主体周壁部301的后端部302。然后,用手指向前方移动操作环304。仅通过进行这种简单的操作,受到操作环304的压力,主体周壁部301被推压,就可以从饵部303将细胞悬浮液100排出。由此,与实施方式5几乎同样,能够达到在回避发生污染的同时,容易且迅速地将内部细胞注入至生物体侧的效果。
上述实施方式5和6中,细胞处理装置整体为蛇纹状或者具有可挠性的细长袋状,但本发明的细胞处理装置并不限定于此形状,也可以是例如圆柱状、球状、长方体状,只要作为细胞处理装置的材料,至少由作为上述细胞处理装置200、300的构成材料而列举出的材料制作即可。此种情况下,如果在该细胞处理装置上设置饵部,则使用时能够将细胞良好地移植至生物体,实现迅速的再生医疗,因此优选。
实施方式5和6中,作为细胞处理装置200、300的材料,与实施方式1~5中所列举出的透气膜20和131、前端面1100、活塞头44、细胞处理装置200同样,通过使用上述由疏水性材料构成的多孔质膜或者硅树脂、聚乙烯或聚苯乙烯等透气性树脂材料,使得细胞处理装置300具有细胞非粘附性,则细胞或细胞团块可在细胞悬浮液100中更加良好地悬浮、储存或顺畅地进行细胞移植。
上述实施方式5和6中,由于细胞悬浮液100的保存时间极短等理由,不那么要求透气性时,以将细胞或细胞团块悬浮在培养液中进行保存的效果为主要目的,在细胞处理装置200、300的材料中,可以使用作为实施方式1的注射器主体部2的材料所列举出的细胞非粘附性材料。
还可以将上述实施方式5和6中列举出的蛇纹状、管状的细胞处理装置200、300作为收纳于后述的实施方式7、8的注射器主体部2内部的囊50进行利用。
(实施方式7)
图8所示为显示实施方式7的注射器型细胞处理装置1的结构的剖面图。
该注射器型细胞处理装置1的结构中具备由筒状体3和囊50所构成的注射器主体部2及活塞40。
筒状体3和活塞40可以使用通常用于注射器的材料制作。筒状体3形成为大致的筒状,前端侧面形成有中央部带有穿孔部11的圆盘状前端面110。
囊50按照两端具有饵部51和后端部52的方式形成,是体积能够缩小的可挠性筒体的液体储存器。该囊50的后端部52与活塞头部43相向配置,通过推压其整体,成为体积可缩小的推压部,通过用活塞头43推压,内部储存物从饵部51被推出来。另外,沿着筒状体3的内周面收纳饵部51,使其比上述前端面110的穿孔部11更靠外地露出到外部,当用活塞头部43推压到前方时,储存物难以残留于囊50内。饵部51优选由比储存细胞的部位更硬的材料成形而成,以便能够盖上盖子、安装针或导管等导管。
本实施方式7的注射器型细胞处理装置1具有细胞悬浮液100被液密地储存在该囊50内的结构。这里本实施方式7中,此囊50具有主要特征。即囊50由同时具有液密性和透气性的材料构成,由此储存于内部的细胞悬浮液100中的细胞不会流出到饵部51以外的部分,并且能够与囊50的外部进行气体交换。
作为这种透气性材料,可使用在上述实施方式1~6中所列举出的透气性材料。
另外,囊50所要求的透气性根据细胞处理装置的表面积、细胞填充量、细胞种类和保存条件等的不同而不同,但必须具有填充于细胞处理装置的细胞用于生存的充分的量。透气性只要在囊50内壁上部分地具有即可,但为了充分得到透气效率,优选囊50内壁部分的整体或者囊50的整体由透气性材料构成。
在将细胞悬浮液100填充至本实施方式7的注射器型细胞处理装置1中时,可先在筒状体3的内部放置空的囊50,然后从饵部51前端将细胞悬浮液100储存在囊50的内部;也可以先在囊50内填充细胞悬浮液100,然后将其放在筒状体3的内部中。这样,为了使得囊50能够从筒状体3取出进行使用,前端面110的穿孔部11的大小必须如下设定:设定为装有盖60的饵部51能够插通的尺寸;或者在将囊50安装在筒状体3上后安装盖60时、或在将安装有盖60的饵部51插入前端面110的穿孔部11时,设定为能够变形为可插入的大小和形状。
不使用时(保存时),在饵部51的前端嵌合盖60,由此液密地保持囊50内部。
以在饵部51上良好地安装盖60为目的,优选在囊50中至少用具有某种程度刚性的材料构成饵部51。
活塞40全部与实施方式1同样,但具有以下特征,即在构成活塞头43的弹性部件上,沿着注射器轴方向形成有多个孔431。将此孔431作为流路,努力使得囊50内部的细胞悬浮液100能够与囊50外部(从活塞头43向外的外部)进行气体交换。
该注射器型细胞处理装置1基本上经过灭菌处理后使用。
具有这种构成的实施方式7的注射器型细胞处理装置1的第一特征为,囊50在防止细菌侵入等导致的污染的同时具有透气性,在囊50内部的细胞悬浮液100中所含有的细胞能够介由囊50,从活塞头43的孔431以及饵部51和穿孔部11之间的间隙与外部进行气体交换。因此,细胞悬浮液100中的细胞,能够从囊50的外部摄取生存所必需的氧,因而能够在囊50内活性不降低而被良好地保存。
本实施方式7中,与活塞头43的孔431一起,将前端面110的穿孔部11作为流路,可以进行气体交换,但只要能够从装置外部对细胞提供气体,当然并不仅限定于孔431、穿孔部11,可以在其它任何部位形成透气性区域。
作为本实施方式7以及后述的实施方式8的囊50的材料,可与实施方式1~6中所列举出的透气膜20和131、前端面1100、活塞头44、细胞处理装置200和300同样,使用上述由疏水性材料构成的多孔质膜,或者使用硅树脂、聚乙烯或聚苯乙烯等透气性树脂材料,由此囊50也具有细胞非粘附性,能够使得细胞在细胞悬浮液100中更加良好地悬浮并储存。这样,不需要像以往那样在将细胞取出时使用药剂(胰蛋白酶、EDTA等剥离剂)、通过温度变化处理将细胞从细胞处理装置中剥离的麻烦操作,能够防止细胞的物理和化学损伤,大大提高操作效率。另外,由于不需要这种剥离处理、细胞洗涤处理等繁琐操作,因此能够进行迅速的再生医疗的处置,还能够减轻对接受细胞移植的患者的负担。
实施方式7的注射器型细胞处理装置1的第二特征为,由于制作成医疗用注射器型,因此在再生医疗中使用时,与实施方式1~4的注射器型细胞处理装置1同样,能够迅速且容易地进行细胞移植的操作。
此时在本实施方式7的注射器型细胞处理装置1中,当囊50是由多孔质膜构成时,通过将膜的孔径设定在上述规定的大小,即便对囊50施加压力也不易发生漏液。因此,能够防止除气泡时宝贵的细胞悬浮液100漏出损失。此效果特别在要求确保细胞量的时候是有效的。
当由多孔性材料构成囊50时,不同情况下囊50会变白,变得不能确认囊50的内部,因此需要注意。囊50的可见性,特别在确认细胞悬浮液100的剩余量、有无污染时是必需的,因此这种情况下,可进行调节孔隙率、孔径等操作。
本实施方式7的注射器型细胞处理装置1,至少筒状体3和活塞40不与细胞悬浮液100接触,因此能够再利用。
上述例为使用透气性材料或者具有透气性和细胞非粘附性的材料构成囊50,当细胞的保存时间短等、透气性的要求不是那么重要时,也可以使用作为筒状体3的构成材料、以上述细胞非粘附性为主要目的的细胞非粘附性材料构成囊50。
(实施方式8)
图9所示为显示实施方式8的注射器型细胞处理装置1的结构的剖面图。
本实施方式8和上述实施方式7的差异为以下几点:在活塞头43上不设有孔431、在筒状体3的内部,囊前端部53被密封、在筒状体3的内部,与囊前端部53相向设置囊破坏机构13。
囊破坏机构13具体可由锋利的金属刃或者针状部件构成。图9中示例了作为囊破坏机构13而设置了金属刃的例子,但需要考虑废弃处理时,该囊破坏机构13可以由例如与注射器主体部同样的树脂部件构成。
利用具有这种结构的实施方式8的注射器型细胞处理装置1,在细胞保存时也能够达到与实施方式7的注射器型细胞处理装置1几乎相同的效果。
如图9所示,本实施方式8的注射器型细胞处理装置1,由于将设在前端面110的饵部120的开口部121作为流路,且囊50的前端部53露出在外部空气中,因此与实施方式7相比,具有可更加良好地进行气体交换和除气泡的效果。
(相对于细胞处理装置的变形例)
在上述实施方式1~8中说明的细胞处理装置的形状当然不限于所示例子,还可以是其它形状。即,只要是至少内部可液密地储存细胞的细胞处理装置、至少与上述细胞相接触的细胞处理装置内壁中的一部分或更多是由细胞非粘附性材料或者透气性材料构成即可。
例如,本发明的细胞处理装置可以是圆柱状的外观形状。此时,先在该细胞处理装置内保存细胞,使用时可在细胞处理装置的侧面安装针或者导管,同时使细胞处理装置的体积缩小,将细胞排出。
2.关于本发明的组织再生用组合物
图10所示为本发明的组织再生用组合物的局部放大图。此组织再生用组合物由细胞培养粒子1000和含有其的流动性介质2000(例如培养液)构成。
该组织再生用组合物如下所述,能够代替以往由具有较大规模结构的支架以及在该支架上分配的细胞所构成的组织再生用组合物来使用,作为再生医疗用的组织再生用组合物具有最适性能。
如该图所示那样,细胞培养粒子1000具有以下构成:即在多个分散于流动性介质2000中的、由生物体吸收性材料形成的支架粒子1001的表面上,粘附有多个细胞1002。细胞1002的粘附数根据各个支架粒子1001而改变。
支架粒子1001优选直径为10μm~2000μm的范围,特别优选为50μm~500μm的范围。通过设定为此粒径,细胞培养粒子1000可在流动性介质2000中良好地分散,因而作为组织再生用组合物整体都具有流动性。因此,如果将含有细胞培养粒子1000的组织再生用组合物保存在上述的实施方式1~8的细胞处理装置中,则能够从该细胞处理装置内部通过饵部等良好地取出至外部。另外,细胞培养粒子1000,以确保细胞的粘附面积为目的,优选为具有细胞浸入所需足够孔径的细孔的多孔质体。
作为构成支架粒子1001的上述生物体吸收性材料,可以使用公知的材料,如可使用选自脂肪族聚酯、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、乳酸-己内酰胺共聚物、乙醇酸-碳酸酯共聚物、聚对二氧环己酮、脱乙酰壳多糖、交联透明质酸、藻酸、骨胶原、昆布氨酸、纤维连接蛋白、体外连接蛋白、聚赖氨酸、纤维蛋白、磷酸钙、碳酸钙、聚氰基丙烯酸酯、聚谷氨酸、聚羟基丁酸、聚苹果酸、聚酸酐、聚原酸酯、壳质、淀粉、纤维蛋白原、羟磷灰石以及明胶中的1种或多种。这些材料可分别单独使用也可将多种组合进行使用。
作为该支架粒子1001的制造例,可以通过将在溶剂中溶解有上述生物体吸收性材料的溶液喷雾、微粒子化,之后将溶剂蒸发除去来制造;还可以通过将材料溶液分散在分散溶剂中使其乳化,接着将溶剂蒸发的方法来制造;或者将上述生物体吸收性材料的原料乳化,通过将其聚合的乳液聚合来制造。
作为将支架粒子1001制成多孔质的方法,可以列举出将生物体吸收性材料溶液乳化、冻干,接着将溶剂蒸发的冷冻干燥法。另外,还有用在生物体吸收性材料中混合有作为造孔剂的食盐、糖等粉末的混合物制成粒子,然后将造孔剂溶解除去,由此将粒子变为多孔质的方法。
另一方面,在细胞1002中,根据治疗目的可以使用上述各种细胞种类。该细胞种类没有特别限定,具体地可列举出有胚胎性干细胞(embryonic stem cells:ES细胞)、胚胎性生殖细胞(embryonic germ cells:EG细胞)、成体干细胞(adult stem cells:AS细胞、也称为成人干细胞)、间充质干细胞、神经干细胞、血管内皮干细胞、造血干细胞、肝干细胞等干细胞,另外还可以列举出骨细胞、软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、神经细胞、腱细胞、脂肪细胞、胰细胞、肝细胞、肾细胞、毛囊细胞、血细胞等分化了的细胞或其前体细胞。这样,可以使用以胚胎性干细胞为首的各分化程度不同的干细胞和分化成各组织的细胞。其中,使用粘附性细胞时,由于能够提供增殖和分化时的支架,因此有效。这里,所谓的粘附性细胞包括除了造血干细胞中的血细胞之外的几乎所有细胞。
另外,还可以使用利用基因工程学方法将这里所列举出各种细胞的任意一种改变而形成的基因改变细胞。
并且,作为上述流动性介质2000,除了一般的培养液之外,也可以使用培养液以外的介质,例如生理盐水、磷酸缓冲液等。但是此种情况下,必须将细胞培养中使用的培养液与这些介质替换。
在制造上述细胞培养粒子1000时,首先可以在培养液(流动性介质2000)中将上述细胞1002接种于支架粒子1001上,在该培养液中培养。由此,细胞1002自然地粘附于支架粒子1001的表面,构成了细胞培养粒子1000。细胞培养可按照已知的方法进行。
作为细胞培养的操作顺序的例子,首先从生物体中将细胞分离和精制,选择目标细胞,其后根据需要添加细胞增殖因子,使其增殖或者向目标细胞分化诱导,同时在培养液中添加细胞培养粒子1000,并缓慢搅拌进行培养。此时,也可在细胞培养粒子中含有细胞增殖因子等细胞增殖所必需的成分。
这里,实际的细胞培养优选在培养箱中进行。所得的组织再生用组合物,收纳于规定的细胞处理装置(优选本发明的实施方式1~8等所列举出的细胞处理装置),在适于保存的条件下保存直至用于治疗。保存优选在低温下进行,也可以在难以引起细胞失活的条件下在常温或加热下进行。
通过这种方法,细胞1002粘附于支架粒子1001的多孔质表面上的孔中,构成了细胞培养粒子1000,在细胞培养基或者分化诱导培养基内良好地培养细胞1002。
为了进一步提高细胞1002对支架粒子1001的粘附性,优选将支架粒子1001表面通过公知的方法(臭氧处理、UV处理、等离子处理等物理处理,硫酸处理、盐酸处理等化学处理,涂布处理等)实施提高细胞粘附性的处理。作为涂布材料,可以列举出用昆布氨酸、纤维连接蛋白、体外连接蛋白、聚赖氨酸、纤维蛋白(包括预凝固处理)、纤维蛋白原以及明胶或骨胶原覆盖的构成。粒子本身还可以固定、吸附各种增殖因子、激素等生理活性物质。通过此构成,支架粒子1001本身的机械强度变好,细胞1002的粘附性也提高,同时治愈效果也可能提高。
(粒子状组织再生组合物的效果)
通过具有以上构成的组织再生用组合物,细胞1002能够在支架粒子1001的表面增殖或者向目标细胞分化诱导,此期间,细胞1002与支架粒子1001一起成为微细的细胞培养粒子1000,在培养液中呈悬浮的状态,整体具有流动性。并且在再生医疗的使用时,细胞培养粒子1000能够直接注入到生物体内进行细胞移植。
由于支架粒子1001由生物体吸收性材料形成,因此如果将细胞培养粒子1000保存在上述实施方式1~8中说明的注射器型细胞处理装置中,则在使用时,该细胞培养粒子1000能够与流动性介质2000一起从饵部等顺畅地向生物体进行细胞移植。
作为通过这种注射器型细胞处理装置进行细胞移植的方法,有在未埋植支架的患部进行细胞注入的方法、对事先埋植于患部的支架反复进行细胞注入的方法等。后一方法在缓慢使患部治愈再生的情况(软骨再生、乳房再生等)下是有效的。
即,一般来说,在容器中保存细胞时,在保存过程中细胞易粘附于容器的内壁,因此难以将细胞取出至容器外,但如果保存在上述注射器型细胞处理器具中时,则在保存过程中细胞不粘附于内壁,细胞培养粒子1000在流动性介质2000中保持悬浮的状态。因此,在细胞处理器具的饵部连接上针、血管内导管,通过推入活塞等,就能将细胞培养粒子1000注入到生物体内。
在上述注射器型细胞处理器具中,在支架粒子1001上培养细胞,可以利用注射器操作将通过培养而形成的细胞培养粒子1000从细胞处理器具中注入到生物体内。
由于支架粒子1001在注入到生物体内经过一定时间后被生物体吸收而消失,因此在移植后不需要除去支架的手术。因此,对患者的负担显著降低,特别是也能减轻对体力较差的幼儿、老人等患者的负担。
如果将粒子状的组织再生用组合物保存在上述实施方式1~8中所列举出的细胞处理装置中,则能够防止细胞向细胞处理装置内壁的粘附、细胞失活、气泡导致的细胞破坏,同时良好地保存细胞。
作为本发明的组织再生用组合物适用于再生医疗的例子,通过注入到生物体的患部,可用于对变形性关节炎、类风湿性关节炎、假关节、牙周病、进行性肌肉营养不良、心肌梗塞、脑血管障碍、帕金森氏病、脊髓损伤、腱损伤、糖尿病、肝功能障碍、消化器官机能障碍、皮肤损伤、白血病、血液类疾病等的治疗中。
更具体地说,向变形性关节炎患者注入软骨细胞或其前体细胞、向牙周病患者注入骨细胞或其前体细胞、向帕金森氏病患者的脑注入神经细胞或其前体细胞、向心脏病患者注入心肌细胞或其前体细胞等。
以上的说明中,例示了作为细胞种类利用了再生医疗用细胞的例子,但作为用于本发明的细胞处理装置和组织再生用组合物的细胞,还可以使用再生医疗以外的治疗用细胞、或者其他细胞。
本发明的细胞处理装置和组织再生用组合物,通过将储存的细胞注入到生物体患部或者血管内,可应用于对变形性关节炎、类风湿性关节炎、假关节、进行性肌肉营养不良、心肌梗塞、脑中风、帕金森氏病、脊髓损伤、腱损伤、糖尿病、肝功能障碍、消化器官机能障碍、皮肤损伤、白血病、血液类疾病、毛发再生等的治疗中。
Claims (44)
1.一种细胞处理装置,其能够液密地储存含有细胞的流动性处理对象物,其特征在于,至少在与所述细胞相接触部位的一部分上设有用于使细胞生存所必需量的气体透过的透气性区域。
2.如权利要求1所述的细胞处理装置,其特征在于,所述细胞处理装置的储存细胞的部分全部为所述透气性区域。
3.如权利要求1或2所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域的透气性以换算成总透氧量计为大于等于1mL/24hr·atm或者大于等于10mL/24hr·atm。
4.如权利要求1~3任一项所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域由透气性树脂或多孔质膜形成。
5.一种组织再生方法,其包括将细胞储存在容器中的第一步骤和将保存的细胞移植到生物体的第二步骤,其特征在于,在所述第一步骤和/或第二步骤中使用权利要求1~4任一项所述的细胞处理装置。
6.如权利要求1所述的细胞处理装置,其特征在于,所述细胞处理装置具备使储存细胞的容积发生改变的容积改变机构,随着由所述容积改变机构引起的容积变化,细胞从所述细胞处理装置中排出、或者细胞流入到所述细胞处理装置中。
7.如权利要求1所述的细胞处理装置,其为具备储存细胞的主体部和可滑动地插入主体部内的活塞的注射器型细胞处理装置,该活塞被施加用于将储存在内部的细胞移植到生物体内的推压力,其特征在于,所述主体部和/或活塞的至少一部分为所述透气性区域。
8.如权利要求7所述的细胞处理装置,其特征在于,所述主体部由储存细胞并随着活塞的滑动可任意变形的袋状容器和收纳该容器的外筒部构成,所述袋状容器的至少一部分为所述透气性区域。
9.如权利要求8所述的细胞处理装置,其特征在于,所述袋状容器能够从所述外筒体中脱离,在脱离状态下能够进行细胞的处理。
10.如权利要求8或9所述的细胞处理装置,其特征在于,所述袋状容器具备排出细胞的排出部和对该袋装容器施加推压力的推压部。
11.如权利要求10所述的细胞处理装置,其特征在于,所述袋状容器除了所述排出部之外,其余全部由通过推压能够缩小的柔软材料构成。
12.如权利要求11所述的细胞处理装置,其特征在于,所述袋状容器具备形成为蛇纹状的部分,通过所述推压部施加的推压力,该蛇纹状部分缩小。
13.如权利要求11所述的细胞处理装置,其特征在于,所述袋状容器为管状。
14.如权利要求8所述的细胞处理装置,其特征在于,在所述细胞处理装置的袋状容器以外的部分上具有所述透气性区域,以使得在所述袋状容器收纳于所述外筒部中的状态下,在该袋状容器内与处理装置外部之间能够进行气体交换。
15.如权利要求8所述的细胞处理装置,其特征在于,其具备破坏机构,该机构在所述袋状容器收纳于所述外筒部中的状态下,将所述袋状容器破坏。
16.如权利要求8所述的细胞处理装置,其特征在于,所述主体部中,在活塞滑动方向的前方设有将所述细胞或者组织再生用组合物排出的排出部,该排出部按照能与针、血管内导管或者其他导管相连接的方式形成。
17.如权利要求6~16任一项所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域的透气性以换算成总透氧量计为大于等于1mL/24hr·atm或者大于等于10mL/24hr·atm。
18.如权利要求6~17任一项所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域由透气性树脂或多孔质膜形成。
19.一种组织再生方法,其包括将细胞储存在容器中的第一步骤和将保存的细胞移植到生物体的第二步骤,其特征在于,在所述第一步和/或第二步中使用权利要求6~18任一项所述的细胞处理装置。
20.如权利要求7所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域独立地设置在所述主体部的多个位置,并且各透气性单位区域沿着所述活塞的滑动方向延伸设置。
21.如权利要求20所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性单位区域由比所述主体部的主体材料的透气性更高的材料形成。
22.如权利要求7所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域位于沿着所述活塞滑动方向的部位。
23.如权利要求22所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域形成于所述活塞的前端部。
24.如权利要求22所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域位于所述主体部的排出细胞的排出部的附近。
25.如权利要求24所述的细胞处理装置,其特征在于,所述排出部形成于完全推入所述活塞时与该活塞相接触的前端面或其附近,所述透气性区域形成于所述前端面。
26.如权利要求24所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域位于堵住所述排出部的封闭部件中。
27.如权利要求20~26任一项所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域的透气性以换算成总透氧量计为大于等于1mL/24hr·atm或者大于等于10mL/24hr·atm。
28.如权利要求20~27任一项所述的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域由透气性树脂或多孔质膜形成。
29.一种组织再生用组合物,其特征在于,其构成为:具有流动性介质和成为在该流动性介质中悬浮的细胞的支架的粒子形状的细胞支架粒子,所述细胞支架粒子由生物体吸收性材料构成,同时该细胞支架粒子具有细胞粘附性。
30.如权利要求29所述的组织再生用组合物,其特征在于,所述支架粒子的直径为10μm~2000μm的范围。
31.如权利要求29或30所述的组织再生用组合物,其特征在于,所述支架粒子为多孔质的。
32.如权利要求29~31任一项所述的组织再生用组合物,其特征在于,所述支架粒子被实施了提高细胞粘附性的处理。
33.如权利要求29~32任一项所述的组织再生用组合物,其特征在于,所述细胞为选自在细胞增殖时需要支架的粘附性细胞群中的细胞。
34.一种带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,能够液密地储存含有细胞的流动性处理对象物,至少在与所述细胞相接触部位的一部分上设置有用于使细胞生存所必需量的气体透过的透气性区域,该细胞处理装置储存组织再生用组合物作为所述处理对象物,该组织再生用组合物含有流动性介质和成为在所述流动性介质中悬浮的细胞的支架并且由生物体吸收性材料构成的粒子形状的细胞支架粒子。
35.如权利要求34所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,至少所述细胞处理装置的储存细胞的部分的全部为所述透气性区域。
36.如权利要求34所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,所述细胞处理装置具备使储存细胞的空间容积发生改变的容积改变机构,随着由所述容积改变机构引起的容积变化而排出或流入细胞。
37.如权利要求34所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其为具有储存细胞的主体部和可滑动地插入至主体部内的活塞的注射器型细胞处理装置,该活塞被施加用于将储存在内部的细胞移植到生物体的推压力,其特征在于,所述主体部和/或活塞的至少一部分为所述透气性区域。
38.如权利要求34或37所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,同与所述主体部的细胞相接触的部位和所述透气性区域相比,细胞更易粘附于所述细胞支架粒子上。
39.如权利要求38所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,所述主体部在活塞的滑动方向的前方设有排出所述细胞或组织再生用组合物的排出部,该排出部连接有针、血管内导管或其他导管。
40.如权利要求38所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,所述主体部和/或活塞为与所述细胞相接触的部位,至少其中的一部分由细胞非粘附性材料构成。
41.如权利要求34~40任一项所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域的透气性以换算成总透氧量计为大于等于1mL/24hr·atm或者大于等于10mL/24hr·atm。
42.如权利要求34~41任一项所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,所述透气性区域由透气性树脂或多孔质膜形成。
43.如权利要求40~42任一项所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置,其特征在于,所述细胞非粘附性材料为亲水性材料、疏水性材料、或带有负电荷的材料中的任一种。
44.一种组织再生方法,其包括将细胞储存在容器中的第一步骤和将保存的细胞移植到生物体的第二步骤,其特征在于,在所述第一步骤和/或第二步骤中使用权利要求34~43任一项所述的带有组织再生用组合物的细胞处理装置。
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