KR20180022965A - 세포 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기 - Google Patents

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타카유키 뎀포
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다이킨 고교 가부시키가이샤
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Abstract

-CF3의 말단기를 적어도 일부 포함하는 불소 수지 소재로 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 용기, 혹은, 불소 수지에서의 비불소화기 말단과 -CF2H기 말단을 합한 수가 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지재로 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 용기를 이용하여 포유동물 세포를 투여하거나, 이러한 용기 내에서, 포유동물 세포를 보존 또는 배양하면, 용기 내면에 대한 세포 접착이나 세포 생존율 저하를 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 이들 용기를 사용함으로써, 고농도이면서 생세포의 비율이 높은 포유동물 세포 함유액을 투여, 보존, 또는 조제하는 것이 가능하여, 포유동물 세포 함유액(현탁액)을 이용한 재생 의료에 이바지하게 된다.

Description

세포 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기
본 발명은, -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하는 불소 수지나, 불소 수지에서의 비(非)불소화기 말단과 -CF2H기 말단을 합한 수가 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해, 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는, 포유동물 세포의 투여, 보존, 또는 배양에 이용하기 위한 용기에 관한 것이다.
배아줄기세포(Embryonic Stem cell;ES세포)나 인공 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell;iPS 세포) 등의 유도만능 줄기세포는, 무한한 증식 능력과 다양한 조직 세포로의 다분화능을 갖는 세포이다. 인간 유도만능 줄기세포는, 또한 시험관 내에서의 분화 유도에 의해 각종 기능을 갖는 세포로 분화시킨 후에 투여 효과가 기대되는 환자에게 투여하여, 재생 의료로의 응용이 기대되고 있다. 또한, 간엽 줄기세포 등의 체성 줄기세포에 대해서도, 영양 인자나 사이토카인의 방출에 의해 수득되는 치료 효과나, 조직의 손상 부위로 호밍(homing)한 후에 그 구성 세포로 분화하여 보완 수복하는 효과가 기대되어, 임상 연구가 시도되고 있다. 이들을 실현하기 위해서는, 고품질 세포를 안정적으로 대량 배양 또는 보존하는 것이나, 그 품질을 유지한 채로 투여하는 것이 필요하다.
부유성 세포를 배양하는 용기로서, 백(bag) 형상의 배양 용기(백)가 고안되어 있다(특허 문헌 1). 이러한 백은, 폴리(에틸렌 부틸렌) 폴리스티렌 블록 공중합체와, 폴리프로필렌의 중합체 혼합물에 에틸렌 아크릴산 에스테르 공중합체를 혼합한 폴리머 알로이(polymer alloy)로 이루어지고, 투명성이나 기체 투과성이 우수한 점에 특징이 있다. 한편, 접착성 세포의 배양에 적절한 백도 고안되어 있다(특허 문헌 2, 3). 특허 문헌 2에 개시되어 있는 백은, 백 내 표면을 코로나 방전 처리함으로써 친수성을 높여 세포가 접착되기 쉬워지도록 개량된 것이다. 또한, 특허 문헌 3에 개시되어 있는 백은, 배양 중에 백이 쉽게 변형되지 않도록, 소정의 굽힘 강성을 갖는 합성 수지 시트로 이루어지는 것으로, 백을 이동시켰을 때에 용기가 변형됨으로써 발생하는 세포의 박리나 사멸을 막을 수 있는 점에 특징이 있다.
또한, 백의 시판품도 알려져 있고, 예를 들어, 에틸렌(Et)-아세트산비닐(VA) 공중합체(EVA) 소재의 CultiLife[등록상표]Spin 백(TAKARA사 제품)이나, 불소 수지인 테트라 플루오로 에틸렌(TFE)-헥사 플루오로 프로필렌(HFP) 공중합체(FEP)를 재료로 한 VueLife FEP Bag 32-C(American Fluoroseal Corporation사 제품), 컬쳐 백 A-1000 NL(니프로사 제품) 등이 시판되고 있다.
그러나, 이들 백은 모두, 접착성 세포의 백 내 표면에 대한 접착을 억제하여, 부유 상태로 세포를 유지 또는 배양하기 위한 것이 아니다.
한편, 식품 가열 가공구의 표면을, TFE-퍼플루오로 알킬 비닐 에테르(PFVE) 공중합체(PFA)의 불안정 말단기를 불소화시킴으로써 제거한 불소 수지 필름으로 피복하면, 눌어붙음에 대한 오염 방지성이 향상되는 것이 알려져 있다(특허 문헌 4). 그러나, 말단기를 불소화시킨 불소화 수지에 의한, 세포 접착성에 대해서는 알려져 있지 않다.
일본 공개특허공보 1991-65177호 일본 공개특허공보 1994-98756호 일본 공개특허공보 2008-17839호 일본 등록특허공보 3962153호
본 발명의 과제는, 고농도이면서 생세포의 비율이 높은 포유동물 세포 함유액을 투여, 보존, 또는 조제할 수 있는 용기를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 열심히 검토하던 중, -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하는 불소 수지나, 불소 수지에서의 비불소화기 말단과 -CF2H기 말단을 합한 수가 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해, 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 용기를 이용하여, 포유동물 세포를 투여하거나, 이러한 용기 중에서 포유동물 세포를 보존 또는 배양하면, 용기 내면에 대한 세포 접착이나 세포 생존율 저하가 효과적으로 억제되어, 고농도이면서 생세포의 비율이 높은 포유동물 세포 함유액을 투여, 보존, 또는 조제할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 아래와 같다.
(1) 불소 수지에서의 비불소화기 말단과 -CF2H기 말단을 합한 수가 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해, 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
(2) -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하는 불소 수지에 의해, 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
(3) 비불소화기 말단이 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (2)에 기재된 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
(4) 불소 수지가, 테트라 플루오로 에틸렌-헥사 플루오로 프로필렌계 공중합체, 및 테트라 플루오로 에틸렌-퍼플루오로 알킬 비닐 에테르계 공중합체에서 선택되는 적어도 1개의 불소 수지인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
(5) 백인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
(6) 포유동물 세포가 접착성 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(5) 중 어느 하나에 기재된 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
(7) 포유동물 세포가 간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 상기 (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
본 발명의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기를 이용하여 포유동물 세포 함유액을 투여 또는 보존하거나 포유동물 세포를 배양하면, 용기 내 표면에 대한 세포 접착이나 세포 생존율 저하를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 고농도이면서 생세포의 비율이 높은 포유동물 세포 함유액을 투여, 보존, 또는 조제하는 것이 가능하여, 포유동물 세포 함유액(현탁액)을 이용한 재생 의료에 이바지하게 된다.
본 발명의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기(이하, 단순히 「본 발명의 용기」라고 할 수도 있다)로서는, 포유동물 세포의 투여, 보존, 또는 배양에 이용하기 위한, -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하는 불소 수지나, 불소 수지에서의 비불소화기 말단과 -CF2H기 말단을 합한 수가 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지(이하, 이들 불소 수지를 총칭하여 「본건 불소 수지」라고 할 수도 있다)에 의해 포유동물 세포(포유동물 세포 함유액)와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 용기이면 특별히 제한되지 않고, 용기 전체가 본건 불소 수지에 의해 형성되어 있을 수도 있다. 본 발명의 용기는, 포유동물 세포와 접촉하는 용기 표면이 본건 불소 수지로 형성되어 있는 점에 특징이 있다. 이러한 특징을 갖는 용기를 이용하여 포유동물 세포 함유액을 투여 또는 보존하거나 포유동물 세포를 배양하면, 세포 접착이나 세포 생존율 저하가 효과적으로 억제되므로, 본 발명의 용기는, 부유성 세포 함유액의 투여 및/또는 보존이나, 부유성 세포의 배양 외에, 접착성 세포 함유액의 투여 및/또는 보존이나, 접착성 세포의 부유 배양에 바람직하게 이용할 수 있다. 세포 함유액의 투여 및/또는 보존이나, 세포의 부유 배양에 이용하는 경우, 상기 용기는, 마트리겔(Matrigel), 엔탁틴(entactin), 피브로넥틴(Fibronectin), 온도 응답성 고분자(PIPAAm 등), 폴리양이온(polycation)(폴리리신 등), 젤라틴, 렉틴, 다당류(히알루론산 등), 폴리락트산, 폴리글리콜산, ε-아미노 카프로락톤, I형 콜라겐, IV형 콜라겐, 키토산, 라미닌 등의 세포 접착성 물질로 그 용기 내 표면이 코팅(또는 배치)되어 있지 않은 것이 바람직하다. 그리고, 본 발명에 있어서, 「보존」에는, 이송 중의 보존도 포함된다.
상기 부유성 세포로서는, 적혈구, (말초혈 유래의) 백혈구(호중구, 단핵구[단구(Monocyte), 림프구], 매크로파지 등) 등의 부유성 세포를 들 수 있다.
상기 접착성 세포로서는, 배아줄기세포(embryonic stem cells:ES세포), 배아생식세포(embryonic germ cells:EG세포), 생식 세포계 줄기세포(germline stem cells:GS세포), 인공 유도만능 줄기세포(iPS 세포;induced pluripotent stem cell) 등의 유도만능 줄기세포, 간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 등의 중복성 줄기세포, 심근 전구 세포, 혈관 내피 전구 세포, 신경 전구 세포, 지방 전구 세포, 피부 섬유아세포, 골격근 근아세포, 골아세포, 상아아세포 등의 단능성 줄기세포(전구 세포) 등의 줄기세포나, 심근 세포, 혈관 내피 세포, 신경 세포, 지방 세포, 피부 섬유 세포, 골격근 세포, 골세포, 헤파토사이트(Hepatocyte)(간) 세포, 제대 정맥 내피 세포, 피부 미소 림프관 내피 세포, 표피 각화 세포, 기관지 상피 세포, 멜라노사이트 세포, 평활근 세포, 상아 세포 등의 성숙 세포를 들 수 있고, 간엽 줄기세포가 바람직하다.
본건 불소 수지는 -CF2H기 말단을 포함하지 않는 것이 바람직하지만, 불소 수지에서의 비불소화기 말단(예를 들어, -COF, -COOH, 및 물과 회합(會合)한 -COOH, -CH2OH, -CONH2, -COOCH3 등의 작용기)과 -CF2H기 말단의 합계가, 탄소 1×106당 70개 이하인 것이 바람직하고, 탄소 1×106당 35개 이하가 보다 바람직하다. 게다가 탄소 1×106당 20개 이하가 보다 바람직하고, 탄소 1×106당 10개 이하가 특히 바람직하다.
즉, 본 발명으로서, 불소 수지에서의 비불소화기 말단과 -CF2H기 말단을 합한 수가 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해, 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기를 들 수 있다.
그리고, 상기 -COF, -COOH, 및 물과 회합한 -COOH, -CH2OH, -CONH2, -COOCH3, -CF2H의, 탄소 1×106당 수는, FT-IR로부터 산출할 수 있다.
또한, 본건 불소 수지로서는, -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하여, 보다 안정화된 말단 구조를 갖는 불소 수지이면 되고, 본건 불소 수지에는, 비불소화기 말단의 일부가 불소화되어 -CF3를 갖는 불소 수지도 포함된다.
상기 -CF3 말단기는, 고온 19F NMR 측정에 의해 분석할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「비불소화기 말단」이란, 반응성을 갖고, 일반적으로 불안정 말단이라고 하는 말단을 의미하고, 비불소화기 말단으로서는, 구체적으로 -COF, -COOH, 물과 회합한-COOH, -CH2OH, -CONH2, -COOCH3 등의 작용기를 들 수 있다.
본건 불소 수지에서의 비불소화기 말단(예를 들어, -COF, -COOH, 및 물과 회합한 -COOH, -CH2OH, -CONH2, -COOCH3 등의 작용기)의 합계는, 탄소 1×106당 70개 이하가 바람직하고, 탄소 1×106당 50개 이하가 보다 바람직하다. 더욱이 탄소 1×106당 35개 이하가 보다 바람직하고, 탄소 1×106당 15개 이하가 보다 더 바람직하고, 탄소 1×106당 10개 이하가 더욱 더 바람직하고, 탄소 1×106당 5개 이하가 특히 바람직하고, 탄소 1×106당 2개 이하가 특히 더 바람직하다.
즉, 본 발명의 일 양태로서, -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하는 불소 수지에서의 비불소화기 말단이 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기를 들 수 있다.
본건 불소 수지로서는, 구체적으로는, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌(PTFE), 테트라 플루오로 에틸렌(TFE)-헥사 플루오로 프로필렌(HFP)계 공중합체(FEP), TFE-퍼플루오로 알킬 비닐 에테르(PAVE)계 공중합체(PFA)를 들 수 있고, 이들 중에서도, FEP, PFA가 바람직하고, FEP를 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 「TFE-HFP계 공중합체」란, 적어도 TFE와 HFP를 포함하는 공중합체를 의미한다. 즉, 「TFE-HFP계 공중합체」에는, TFE와 HFP의 2원 공중합체(TFE/HFP 공중합체;FEP) 외에, TFE와 HFP와 비닐 플루오라이드(VF)의 공중합체(TFE/HFP/VF공중합체), TFE와 HFP와 비닐리덴 플루오라이드(VDF)의 공중합체(TFE/HFP/VDF 공중합체), TFE와 HFP와 퍼플루오로(알킬 비닐 에테르)(PAVE)의 공중합체(TFE/HFP/PAVE 공중합체) 등의 3원 공중합체나, TFE와 HFP와 VF와 VDF의 공중합체(TFE/HFP/VF/VDF 공중합체), TFE와 HFP와 VF와 PAVE의 공중합체(TFE/HFP/VF/PAVE 공중합체), TFE와 HFP와 VDF와 PAVE의 공중합체(TFE/HFP/VDF/PAVE 공중합체) 등의 4원 공중합체나, TFE와 HFP와 VF와 VDF와 PAVE의 공중합체(TFE/HFP/VF/VDF/PAVE 공중합체) 등의 5원 공중합체도 포함된다.
상기 TFE-HFP계 공중합체로서는, TFE/HFP 공중합체나 TFE/HFP/PAVE 공중합체가 바람직하다. 이러한 TFE/HFP 공중합체에서의 TFE와 HFP의 질량비는, 80~97/3~20이 바람직하고, 84~92/8~16이 보다 바람직하다. 또한, 상기 TFE/HFP/PAVE 공중합체에서의 TFE와 HFP와 PAVE의 질량비는, 70~97/3~20/0.1~10이 바람직하고, 81~92/5~16/0.3~5가 보다 바람직하다.
상기 「TFE-PAVE계 공중합체」란, 적어도 TFE와 PAVE를 포함하는 공중합체를 의미한다. 즉, 「TFE-PAVE계 공중합체」에는, TFE와 PAVE의 2원 공중합체(TFE/PAVE 공중합체;PFA) 외에, TFE와 PAVE와 헥사 플루오로 프로필렌(HFP)의 공중합체(TFE/PAVE/HFP 공중합체), TFE와 PAVE와 비닐리덴 플루오라이드(VDF)의 공중합체(TFE/PAVE/VDF 공중합체), TFE와 PAVE와 클로로 트리 플루오로 에틸렌(CTFE)의 공중합체(TFE/PAVE/CTFE 공중합체) 등의 3원 공중합체나, TFE와 PAVE와 HFP와 VDF의 공중합체(TFE/PAVE/HFP/VDF 공중합체), TFE와 PAVE와 HFP와 CTFE의 공중합체(TFE/PAVE/HFP/CTFE 공중합체), TFE와 PAVE와 VDF와 CTFE의 공중합체(TFE/PAVE/VDF/CTFE 공중합체) 등의 4원 공중합체나, TFE와 PAVE와 HFP와 VDF와 CTFE의 공중합체(TFE/PAVE/HFP/VDF/CTFE 공중합체) 등의 5원 공중합체도 포함된다.
상기 PAVE 단위를 구성하는 PAVE로는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 퍼플루오로(메틸 비닐 에테르)〔PMVE〕, 퍼플루오로(에틸 비닐 에테르)〔PEVE〕, 퍼플루오로(프로필 비닐 에테르)〔PPVE〕, 퍼플루오로(부틸 비닐 에테르), 퍼플루오로(펜틸 비닐 에테르), 퍼플루오로(헥실 비닐 에테르), 퍼플루오로(헵틸 비닐 에테르) 등을 들 수 있다.
상기 TFE-PAVE계 공중합체에서의 TFE와 PAVE의 질량비는, 90~98/2~10이 바람직하고, 92~97/3~8이 보다 바람직하다.
본건 불소 수지는, 현탁 중합이나 유화 중합 등의 정해진 방법에 따라 합성한 불소 수지의 말단기를, 불소 수지를 용융 압출하기 전에 불소 수지와 불소 함유 화합물(예를 들어, 불소 라디칼원(源))을 접촉시켜 안정화 처리를 수행하는 방법이나, 불소 수지를 용융 압출한 후에 수득된 불소 수지의 펠릿과 불소 함유 화합물을 접촉시켜 불소화 처리를 수행하는 방법 등의 공지된 방법에 따라 불소화 처리함으로써 제작할 수 있다. 또한, 불소 수지 제조 시(중합 반응 시), 불소 모노머와 함께 말단기를 제어할 수 있는 연쇄 이동제나 중합 촉매를 사용하여 수득할 수도 있다. 그리고 또한, 본건 불소 수지로서 시판품을 이용할 수도 있다. 또한, 불소 수지를 용융하여 성형한 필름이나, 상기 필름으로부터 성형한 용기나, 불소 수지로부터 성형한 용기 등과 같이, 불소 수지로부터 성형한 성형물에 대하여 불소 함유 화합물을 접촉시켜 불소화 처리를 수행할 수도 있다. 또한, 이들 처리 방법을 조합할 수도 있다.
즉, 상기 비불소화기 말단의 합계나, 비불소화기 말단과 -CF2H기 말단의 합계는, 원료가 되는 불소 수지, 펠릿, 필름의 각 단계에 있어서 탄소 1×106당 70개 이하일 필요는 없고, 최종적인 용기의 세포와 접촉하는 표면에 있어서 탄소 1×106당 70개 이하이면 된다. 또한, -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하는 불소 수지의 경우, 원료가 되는 불소 수지, 펠릿, 필름의 각 단계에 있어서 -CF3의 말단기가 1개 이상일 필요는 없고, 최종적인 용기의 세포와 접촉하는 표면에 있어서 불소 수지가 -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하고 있으면 된다.
상기 불소 라디칼원으로는, 특별히 한정되지 않지만 IF5, ClF3 등의 불화 할로겐, F2 기체, CoF3, AgF2, UF6, OF2, N2F2, CF3OF 등을 들 수 있다. 이러한 F2 기체는, 100% 농도인 것일 수도 있지만, 안전성 면에서 비활성 기체와 혼합하여 5~50 질량%, 바람직하게는 15~30 질량%로 희석하여 사용한다. 이러한 비활성 기체로서는, 질소 기체, 헬륨 기체, 아르곤 기체 등을 들 수 있고 비용 대비 효과의 관점에서 질소 기체가 바람직하다.
상기 불소화 처리는, 20~220℃가 바람직하고, 보다 바람직하게는 100~200℃의 온도하에서 수행한다. 상기 불소화 처리는, 5~30시간이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10~20시간 수행한다.
본 발명에 의해 수득된 용기는, 표면 조도의 산술 평균 조도(Ra), 표면 조도의 제곱 평균 조도(RMS), 및 표면 자유 에너지를 조정한 것일 수도 있다. 예를 들어, 표면 조도의 Ra가 3.5~6.5 nm이며, 표면 조도의 RMS가 4.5~8.0 nm이면서, 표면 자유에너지가 16.5~18.5(mJ/m2)인 용기 내면을 구비한 것 등을 들 수 있다.
본 발명의 용기의 형태로서는, 예를 들어, 디쉬, 웰 플레이트, 백, 보틀, 원심 튜브, 바이알(vial), 실린지(syringe), 튜브 등을 들 수 있고, 본 발명의 용기가 세포 투여용 용기인 경우, 실린지, (점적용) 백, (점적용) 보틀, 튜브가 바람직하고, 본 발명의 용기가 세포 보존용 용기인 경우, 디쉬, 웰 플레이트, 백, 보틀, 원심 튜브, 바이알이 바람직하고, 본 발명의 용기가 세포 배양용 용기인 경우, 디쉬, 웰 플레이트, 백, 보틀이 바람직하다. 특히, 백 형상의 본 발명의 용기는, 세포의 투여용, 보존용, 및 배양용의 모든 용도에 적용할 수 있으므로, 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 디쉬, 웰 플레이트, 백, 보틀, 원심 튜브, 바이알, 실린지, 튜브 등은, 압축 성형, 압출 성형, 트랜스퍼 성형, 인플레이션 성형, 블로 성형, 사출 성형, 회전 성형, 라이닝 성형, 발포체 압출 성형, 필름 성형 등의 성형 방법과, 필요에 따라 히트 실링(heat sealing), 고주파 융착, 초음파 융착 등의 실링 수단을 조합하여 제조할 수 있다.
상기 백은, 구체적으로는, 본건 불소 수지 소재의 필름(시트)을 중첩한 후, 가장자리를, 임펄스 실러(impulse sealer)를 이용하여 히트 실링함으로써 제조할 수 있다.
상기 백의 성형에 이용하는 필름은, 단층 필름일 수도, 2층 이상의 다층으로 이루어지는 적층 필름일 수도 있고, 다층으로 이루어지는 적층 필름인 경우는, 적어도 포유동물 세포와 접촉하는 내 표면이, 본건 불소 수지 소재의 층 필름이 되도록 백을 성형하면 되고, 다른 층 필름은, 본건 불소 수지와 상이한 소재(예를 들어, 폴리올레핀계 수지 소재)의 층 필름일 수도 있다. 필름의 적층은, 열 라미네이트법, 열압축법, 고주파 가열법, 용제 캐스팅법 및 압출 라미네이션법 등의 방법을 이용하여 수행한다.
또한, 유리, 금속, 수지 등으로부터 제조된 디쉬, 웰 플레이트, 백, 보틀, 원심 튜브, 바이알, 실린지, 튜브 등과 같은 기재에, 본건 불소 수지로 이루어지는 코팅제로 피복 처리를 수행함으로써 본 발명의 용기를 수득할 수도 있다. 기재의 형태에 따라 임의의 방법을 채용할 수 있다. 이러한 피복 처리로는, 스핀 코팅, 스프레이 코팅, 바 코팅, 롤 코팅, 침지, 솔칠, 로토 라이닝(roto lining), 정전 도장 등의 방법을 들 수 있다. 상기 불소 수지 코팅제를 기재에 피복한 후, 건조 처리 및 고온 가열 처리에 의해 코팅층이 형성된다. 또한, 본건 불소 수지를 포함하는 코팅제를 추가로 덧칠함으로써, 임의의 막 두께까지 두껍게 할 수도 있다.
본 발명의 용기는, 예를 들어, 포유동물 세포 함유액을 동결 보존하는 경우, 포유동물 세포 함유액을 동결하지 않는 온도(통상적으로 0~37℃, 바람직하게는 0~25℃[실온]의 범위 내)에서 보존(적어도 6시간)하는 경우, 부유 배양법에 의해 부유성 또는 접착성의 포유동물 세포를 대량 생산하는 경우, 상기 동결하지 않는 온도에서 보존 후의 포유동물 세포 함유액을 별도의 용기로 옮기지 않고, 그대로 투여(이식)하는 경우 등에 이용할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 세포 백의 제조
16cm×15cm 크기이고 두께 100μm인 3 종류의 필름을, 임펄스 실러를 이용하여 실링 시간 50초, 실링 압력 0.2 MPa, 실링 폭 5 mm의 조건에서 히트 실링함으로써, 12 종류의 세포 백(세포 백 A~C[비교예 샘플 1~3], 세포 백 D~G[실시예 샘플 1~4], 세포 백 H[비교예 샘플 4], 세포 백 I~K[실시예 샘플 5~7], 및 세포 백 L[비교예 샘플 5])을 제조했다(표 2 참조). 그리고, 세포 백 M(비교예 샘플 6)으로서, 폴리염화비닐제의 세포 백(카와스미카가쿠코교 가부시키가이샤 제품인 카와스미 쿼드랩 백 ACP-AMP를 가공)을 이용했다(표 2 참조).
1-1 비불소화기 말단수(數) 및 -CF2H기 말단수의 측정
두께 250~300μm정도의 해당 수지의 샘플을 제작하고, FT-IR Spectrometer 1760 X(Perkin-Elmer사 제품)를 이용하여 분석을 수행했다.
두께 250~300μm 정도의 해당 수지의 샘플을 제작함에 있어서는, 펠릿을 유압 프레스로 압연하여 제작했다. 또한, 세포 백을 구성하는 필름(펠릿으로부터 용융 성형에 의해 제작)은 그대로, 두께가 부족한 경우는, 필름을 중첩하여 측정했다.
표준 샘플(이미 스펙트럼에 실질적으로 차이가 보이지 않게 될 때까지 충분히 불소화한 샘플)과의 차이 스펙트럼(difference spectrum)을 취득하여, 각 피크의 흡광도를 판독하고, 다음 식에 따라 탄소수 1×106개당 비불소화기 말단수 및 -CF2H기 말단수를 산출했다. 세포 백 A~M 각각의, 비불소화기 말단수 및 -CF2H기 말단수를 표 2에 나타낸다.
비불소화기 말단 및 -CF2H기 말단의 개수(탄소 1×106개당)=lㆍk/t
l:흡광도
k:보정 계수(표 1 참조)
t:샘플 두께(mm)
[표 1]
각 비불소화기 말단기 및 -CF2H기 말단의 흡수파수 및 보정계수
Figure pct00001
[표 2]
세포 백의 비불소화기 말단수 및 -CF2H기 말단수
Figure pct00002
표 중의 「백 제조전」이란, 세포 백 제조에 이용한 펠릿형상의 불소 수지를 압연하여 수득한 샘플인 것을 의미한다.
표 중의 「백 제조후」란, 세포 백을 구성하는 필름(펠릿으로부터 용융 성형에 의해 제작)으로부터 수득한 샘플인 것을 의미한다.
1-2 -CF3 말단기 유무의 측정
해당 수지 필름을 370℃에서 용융시켜 스트랜드(strand)를 제작하고, 핵자기공명 분광계 AVANCE300WB(Bruker사 제품)를 이용하여, 고온 19F NMR에 의한 스펙트럼 측정을 수행했다.
해당 수지와 동일한 조성비의 -CF3 말단기가 존재하지 않는 수지를 용융시켜 제작한 스트랜드의 스펙트럼과의 차이 스펙트럼을 취득하고, δ=-82 ppm에 피크가 보이면 -CF3 말단기가 있고, δ=-82 ppm에 피크가 보이지 않으면 -CF3 말단기가 없다고 판단했다. 세포 백 A~M 각각의, -CF3 말단기 유무를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
-CF3 말단기 유무
Figure pct00003
실시예 2
2. 세포 백을 이용한 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hMSC;Human Mesenchymal Stem Cells)의 보존
상기 실시예 1의 세포 백을 이용하여 세포를 보존했을 경우에, 세포 접착이 억제되어, 부유 상태로 보존할 수 있을지 어떨지에 대해 해석했다.
2-1 방법
2-1-1 세포 보존액의 조제
6.0(w/v)% 트레할로오스(trehalose) 함유 락텍(Lactec)(등록상표)주(注;injection)(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)와 저분자 덱스트란 L 주(10[w/v]% 덱스트란 함유 락텍 주)(오오츠카세이야쿠코죠사 제품)를 1:1로 혼합하여, 세포 보존액을 조제했다.
2-1-2 포유동물 세포의 조제
〔1〕4×105개의 hMSC(Lonza사 제품, PT-2501)를, 75 cm2 플라스크를 이용하여 MSC 배양액(Lonza사 제품, PT-3001) 존재하에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여, 약 90% 컨플루언트(confluent)로 정해진 방법에 따라 계대했다.
〔2〕계대한 hMSC(계대 회수 3회의 세포, 거의 100% 컨플루언트)의 배양액을 아스피레이터로 제거하고, 플라스크당 8 mL의 PBS(Invitrogen사 제품)로 hMSC를 씻어냈다.
〔3〕PBS를 아스피레이터로 제거하고, 플라스크당 3.75 mL의 트립신-EDTA(Lonza사 제품, CC-3232)를 가해 실온에서 5분간 정치했다.
〔4〕hMSC가 90% 정도 박리될 때까지 현미경하에서 관찰하면서, 천천히 흔들었다.
〔5〕플라스크당 3.75 mL의 MSC 배양액을 가하고, 트립신 반응을 정지시켜, 피펫팅에 의해 hMSC를 회수하고, 50 mL 원심 튜브로 옮겼다.
〔6〕600×g, 5분간, 25℃에서 원심분리를 수행했다.
〔7〕상청액을 아스피레이터로 제거하고, 1 플라스크당 3 mL의 상기 세포 보존액을 가해 hMSC 펠릿(침전물)을 현탁시켰다.
〔8〕10μL의 hMSC-BM 현탁액을 채취하고, 세포 계수기(CELL COUNTER)로 세포수를 계측하여, 5×105개/mL가 되도록 상기 세포 보존액을 첨가하고, 빙랭(氷冷)했다.
2-1-3 포유동물 세포의 보존
〔1〕5×105개/mL의 hMSC 함유 세포 보존액을, 13 종류의 세포 백 A~M 내에 3 mL씩 파종했다.
〔2〕인큐베이터(25℃, 5% CO2)(애즈원사 제품, PIC100) 내에 6시간 정치ㆍ보존한 후, 세포 현탁액의 일부(20μL)를 회수하여, 20μL의 0.4% 트리판 블루(Gibco사 제품)와 혼합하고, 세포 계수기를 이용하여 현미경(ECLIPSE TS100, 니콘사 제품)하에서 세포 현탁액의 세포 농도 및 생세포수를 계측하고, 각각 세포 회수율(표 4, 7 및 10 참조) 및 세포 생존율(표 5, 8 및 11 참조)을 산출했다. 또한, 백의 일부를 가위로 커팅하여, 6 웰 플레이트 상에서, 백에 접착된 세포를 현미경(IX-70, Olympus사 제품)하에서 관찰했다. 그리고, 표 4~표 6, 표 7~표 9, 및 표 10~표 12의 결과는, 각각 독립적인(hMSC의 조제 시기가 상이함) 실험에 의해 수득된 것이다.
[표 4]
hMSC의 세포 회수율(%) 1
Figure pct00004
세포 회수율(%)은 보존 개시 직후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수(Pre)에 대한 보존후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수의 비율([보존후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수/보존 개시 직후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수(Pre)×100])로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3). 그리고, 표 중 「**」 및 「***」은 세포 백 L(비교예 샘플 5)에 대하여 Dunnett법에 따라 통계학적으로 유의차(p<0.01 및 p<0.001)가 있는 것을 나타낸다.
[표 5]
hMSC의 세포 생존율(%) 1
Figure pct00005
세포 생존율(%)은 세포 현탁액에서의 전체 세포수에 대한 생세포의 비율([세포 현탁액에서의 생세포수/세포 현탁액에서의 전체 세포수×100])로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3). 그리고, 표 중 「*」은 세포 백 L(비교예 샘플 5)에 대하여 Dunnett법에 따라 통계학적으로 유의차(p<0.05)가 있는 것을 나타낸다.
[표 6]
hMSC의 생세포 회수율 1
Figure pct00006
생세포의 회수율은 세포 회수율 값에 세포 생존율 값을 곱한 값으로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3). 그리고, 표 중 「**」 및 「***」은 세포 백 L(비교예 샘플 5)에 대하여 Dunnett법에 따라 통계학적으로 유의차(p<0.01 및 p<0.001)가 있는 것을 나타낸다.
2-2 결과
보존 후의 hMSC 회수율은, 표 4에 나타내는 바와 같이, 세포 백 A, B, C, H, L, 및 M(비교예 샘플 1, 2, 3, 4, 5, 및 6)을 이용했을 경우는, 각각 39%, 43%, 34%, 40%, 38%, 및 36%인데 반해, 세포 백 D, F, G, J, 및 K(실시예 샘플 1, 3, 4, 6, 및 7)를 이용했을 경우는, 각각 50%, 69%, 99%, 70%, 및 80%로 높았다.
또한, 보존 후의 hMSC의 생존율은, 표 5에 나타내는 바와 같이, 세포 백 D, F, G, J, 및 K(실시예 샘플 1, 3, 4, 6, 및 7)를 이용했을 경우, 각각 93%, 96%, 93%, 95%, 및 96%로, 모두 90% 이상으로 높았다.
그 결과, 보존 후의 생존한 hMSC의 회수율(세포 생존율×세포 회수율)은, 표 6에 나타내는 바와 같이, 세포 백 A, B, C, H, L, 및 M(비교예 샘플 1, 2, 3, 4, 5, 및 6) 내에 보존했을 경우(각각 34%, 37%, 31%, 37%, 31%, 및 32%)와 비교하여, 세포 백 D, F, G, J, 및 K(실시예 샘플 1, 3, 4, 6, 및 7) 내에 보존했을 경우(각각 46%, 66%, 92%, 66%, 및 77%)쪽이 높았다.
[표 7]
hMSC의 세포 회수율(%) 2
Figure pct00007
세포 회수율(%)은 보존 개시 직후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수(Pre)에 대한 보존후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수의 비율([보존후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수/보존 개시 직후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수(Pre)×100])로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3). 그리고, 표 중 「***」은 세포 백 L(비교예 샘플 5)에 대하여 Dunnett법에 따라 통계학적으로 유의차(p<0.001)가 있는 것을 나타낸다.
[표 8]
hMSC의 세포 생존율(%) 2
Figure pct00008
세포 생존율(%)은 세포 현탁액에서의 전체 세포수에 대한 생세포의 비율([세포 현탁액에서의 생세포수/세포 현탁액에서의 전체 세포수×100])로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3).
[표 9]
hMSC의 생세포 회수율(%) 2
Figure pct00009
생세포의 회수율은 세포 회수율 값에 세포 생존율 값을 곱한 값으로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3). 그리고, 표 중 「***」은 세포 백 L(비교예 샘플 5)에 대하여 Dunnett법에 따라 통계학적으로 유의차(p<0.001)가 있는 것을 나타낸다.
2-3 결과
보존 후의 hMSC 회수율은, 표 7에 나타내는 바와 같이, 세포 백 B 및 L(비교예 샘플 2 및 5)을 이용했을 경우는, 각각 30% 및 25%인데 반해, 세포 백 G(실시예 샘플 4)를 이용했을 경우는, 80%로 높았다.
또한, 보존 후의 hMSC 생존율은, 표 8에 나타내는 바와 같이, 세포 백 G(실시예 샘플 4)를 이용했을 경우 95%로 높았다.
그 결과, 보존 후의 생존한 hMSC의 회수율(세포 생존율×세포 회수율)은, 표 9에 나타내는 바와 같이, 세포 백 B 및 L(비교예 샘플 2 및 5) 내에 보존했을 경우(각각 27%, 및 22%)와 비교하여, 세포 백 G(실시예 샘플 4) 내에 보존했을 경우(76%)쪽이 높았다.
[표 10]
hMSC의 세포 회수율(%) 3
Figure pct00010
세포 회수율(%)은 보존 개시 직후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수(Pre)에 대한 보존후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수의 비율([보존 후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수/보존 개시 직후의 세포 현탁액에서의 전체 세포수(Pre)×100])로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3). 그리고, 표 중 「*」은 세포 백 B(비교예 샘플 2)에 대하여 Dunnett법에 따라 통계학적으로 유의차(p<0.05)가 있는 것을 나타낸다.
[표 11]
hMSC의 세포 생존율(%) 3
Figure pct00011
세포 생존율(%)은 세포 현탁액에서의 전체 세포수에 대한 생세포의 비율([세포 현탁액에서의 생세포수/세포 현탁액에서의 전체 세포수×100])로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3).
[표 12]
hMSC의 생세포 회수율 3
Figure pct00012
생세포의 회수율은 세포 회수율 값에 세포 생존율 값을 곱한 값으로서 나타낸다(평균값±표준편차, n=3). 그리고, 표 중 「*」은 세포 백 B(비교예 샘플 2)에 대하여 Dunnett법에 따라 통계학적으로 유의차(p<0.05)가 있는 것을 나타낸다.
2-4 결과
보존 후의 hMSC 회수율은, 표 10에 나타내는 바와 같이, 세포 백 B(비교예 샘플 2)를 이용했을 경우는 49%인데 반해, 세포 백 E, F, I, 및 K(실시예 샘플 2, 3, 5, 및 7)를 이용했을 경우는, 각각 83%, 75%, 84%, 및 67%로 높았다.
또한, 보존 후의 hMSC 생존율은, 표 11에 나타내는 바와 같이, 세포 백 E, F, I, 및 K(실시예 샘플 2, 3, 5, 및 7)를 이용했을 경우, 각각 93%, 93%, 91%, 및 92%로, 모두 90% 이상으로 높았다.
그 결과, 보존 후의 생존한 hMSC의 회수율(세포 생존율×세포 회수율)은, 표 12에 나타내는 바와 같이, 세포 백 B(비교예 샘플 2) 내에 보존했을 경우(45%)와 비교하여, 세포 백 E, F, I, 및 K(실시예 샘플 2, 3, 5, 및 7) 내에 보존했을 경우(각각 77%, 69%, 76%, 및 61%)쪽이 높았다.
또한, 보존 후의 hMSC는, 세포 백 A~C, H, L, 및 M(비교예 샘플 1~3, 4, 5, 및 6)의 내면에 접착되어 있었던 것에 반해, 세포 백 D~G, 및 I~K(실시예 샘플 1~4, 및 5~7)의 내면에 대한 접착성은 억제되고, 특히, 세포 백 E~G, 및 I~K(실시예 샘플 2~4, 및 5~7)의 내면에는 hMSC는 거의 접착되어 있지 않았다.
이들 결과는, 세포 백 D~G, 및 I~K(실시예 샘플 1~4, 및 5~7) 내에서 세포를 보존하면, 세포 백 A~C, H, L, 및 M(비교예 샘플 1~3, 4, 5, 및 6) 내에서 세포를 보존하는 것보다, 생세포의 접착성을 유의적으로 억제할 수 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 3
3. 세포 백을 이용한 마우스 중간엽 줄기세포 유래 10 T1/2 세포의 배양
상기 실시예 1에서 제조한 세포 백을 이용하여 세포를 배양했을 경우에, 세포 접착이 억제되어, 부유 상태로 배양할 수 있을지 어떨지에 대해 해석했다.
3-1 방법
〔1〕마우스 중간엽 줄기세포 유래 10 T1/2 세포를, 10% FBS(life technologies사 제품, gibco standard)를 포함하는 DMEM(nacalai tesque사 제품, 08458-45) 배양액 중에, 1. 0×105개/mL가 되도록 현탁시켜, 2 종류의 세포 백 B(비교예 샘플 2) 및 G(실시예 샘플 4) 내에 3 mL씩 파종했다.
〔2〕인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내에서 배양하고, 4시간, 1, 2, 3, 및 6일 후, 세포 현탁액의 일부(10μL)를 회수하여, 10μL의 0.4% 트리판 블루(Gibco사 제품)와 혼합하고, 세포 계수기로 생세포수를 계측하여, 세포 생존율을 산출했다. 또한, 세포 백에 접착된 세포를 광학 현미경(Nikon사 제품)하에서 관찰했다.
3-2 결과
배양 후의 10 T1/2 세포의 생존율은, 세포 백 G(실시예 샘플 4) 및 세포 백 B(비교예 샘플 2)를 이용했을 경우는 모두, 70% 이상으로 높았다. 한편, 배양 후에 백 내면에 접착된 10 T1/2 세포의 비율은, 세포 백 B를 이용했을 경우보다 세포 백 G를 이용한 쪽이 적었다.
이 결과는, 세포 백 G(실시예 샘플 4) 내에서 세포를 배양하면, 세포 백 B(비교예 샘플 2) 내에서 세포를 배양하는 것보다, 생세포의 접착성을 유의적으로 억제할 수 있는 것을 나타내고 있다.
상기 실시예 1~3의 결과는, 세포 백 D~G 및 I~K(실시예 샘플 1~7)를 이용하여 세포를 투여, 보존, 또는 배양하면, 용기 내 표면에 대한 세포 접착이나 세포 생존율 저하를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 고농도이면서 생세포의 비율이 높은 세포 함유액을 투여, 보존, 또는 조제할 수 있는 것을 나타내고 있다.
본 발명에 따르면, 고농도이면서 생세포의 비율이 높은 세포 함유액을 투여, 보존, 또는 조제하는 것이 가능하여, 포유동물 세포 함유액(현탁액)을 이용한 재생 의료에 이바지하게 된다.

Claims (7)

  1. 불소 수지에서의 비불소화기 말단과 -CF2H기 말단을 합한 수가 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해, 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
  2. -CF3의 말단기를 1개 이상 포함하는 불소 수지에 의해, 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
  3. 제 2항에 있어서,
    비불소화기 말단이 탄소 1×106당 70개 이하인 불소 수지에 의해 포유동물 세포와 접촉하는 표면이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 포유동물 세포의 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    불소 수지가, 테트라 플루오로 에틸렌-헥사 플루오로 프로필렌계 공중합체, 및 테트라 플루오로 에틸렌-퍼플루오로 알킬 비닐 에테르계 공중합체에서 선택되는 적어도 1개의 불소 수지인 것을 특징으로 하는, 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    백인 것을 특징으로 하는, 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포가 접착성 세포인 것을 특징으로 하는, 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물 세포가 간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 투여용, 보존용, 또는 배양용 용기.

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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102600965B1 (ko) * 2017-01-18 2023-11-13 다이킨 고교 가부시키가이샤 단백질 저흡착성을 갖는 단백질 혹은 단백질을 포함하는 조성물의 투여용, 보존용, 운반용 또는 수송용 용기 및 단백질 혹은 단백질 조성물의 제조용 기재
JP7554428B2 (ja) 2018-12-13 2024-09-20 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞培養器具および細胞の処理方法
CN113321835B (zh) * 2021-05-21 2024-04-05 江苏康进医疗器材有限公司 一种用于细胞培养袋的薄膜、制备工艺及细胞培养袋
WO2023162945A1 (ja) 2022-02-25 2023-08-31 株式会社大塚製薬工場 凍結保存用のシリンジ
WO2023162943A1 (ja) 2022-02-25 2023-08-31 ダイキン工業株式会社 細胞、核酸、又はタンパク質の凍結保存用のシリンジ
JP2024099338A (ja) * 2023-01-12 2024-07-25 東京応化工業株式会社 チューブ及び細胞培養用デバイス

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0365177A (ja) 1989-08-01 1991-03-20 Nissho Corp 細胞培養用バッグ
KR920701336A (ko) * 1989-10-06 1992-08-11 제임즈 제이 플린 어렵게-용융-가공성 중합체를 위한 압출 방법
JPH0698756A (ja) 1992-09-18 1994-04-12 Nissho Corp 付着性細胞培養用バツグ
WO2005037984A1 (ja) * 2003-10-20 2005-04-28 Jms Co., Ltd. 細胞取扱装置、組織再生用組成物及び組織再生方法
JP3962153B2 (ja) 1998-03-25 2007-08-22 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 改良された防汚性を有する食品加熱加工器具
US20070292945A1 (en) * 2004-03-25 2007-12-20 Lin Wenglong R Cell Culture Apparatus and Methods
JP2008017839A (ja) 2006-06-16 2008-01-31 Nipro Corp 細胞培養容器、その製造方法、及び細胞培養方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100497580C (zh) * 2003-10-20 2009-06-10 株式会社Jms 细胞处理装置、组织再生用组合物及组织再生方法
ATE466889T1 (de) * 2003-11-20 2010-05-15 Daikin Ind Ltd Verfahren zur herstellung von fluorhaltigen polymeren und fluorhaltige polymere
CN103748210A (zh) * 2011-02-18 2014-04-23 永生细胞公司 干细胞的包装和运输
US10280390B2 (en) 2014-12-22 2019-05-07 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation System for culture of cells in a controlled environment
US10655097B2 (en) 2014-12-22 2020-05-19 Saint-Gobain Performance Plastics Corporation T-cell culture double bag assembly
JP6165280B2 (ja) 2015-01-29 2017-07-19 ダイキン工業株式会社 細胞培養器材
JP2016146777A (ja) 2015-02-12 2016-08-18 ダイキン工業株式会社 細胞培養用バッグ及びそれを用いた細胞培養方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0365177A (ja) 1989-08-01 1991-03-20 Nissho Corp 細胞培養用バッグ
KR920701336A (ko) * 1989-10-06 1992-08-11 제임즈 제이 플린 어렵게-용융-가공성 중합체를 위한 압출 방법
JPH0698756A (ja) 1992-09-18 1994-04-12 Nissho Corp 付着性細胞培養用バツグ
JP3962153B2 (ja) 1998-03-25 2007-08-22 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 改良された防汚性を有する食品加熱加工器具
WO2005037984A1 (ja) * 2003-10-20 2005-04-28 Jms Co., Ltd. 細胞取扱装置、組織再生用組成物及び組織再生方法
US20070292945A1 (en) * 2004-03-25 2007-12-20 Lin Wenglong R Cell Culture Apparatus and Methods
JP2008017839A (ja) 2006-06-16 2008-01-31 Nipro Corp 細胞培養容器、その製造方法、及び細胞培養方法

Also Published As

Publication number Publication date
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AU2016293661A1 (en) 2018-02-01

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