WO2016129220A1 - 細胞培養用バッグ及びそれを用いた細胞培養方法 - Google Patents

細胞培養用バッグ及びそれを用いた細胞培養方法 Download PDF

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bag
cells
cell culture
cell
shaped container
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PCT/JP2016/000409
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English (en)
French (fr)
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達也 樋口
梢 駒澤
梨沙 岡入
西村　益浩
Original Assignee
ダイキン工業株式会社
株式会社大塚製薬工場
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags

Definitions

  • the present invention includes a bag-shaped container made of a tetrafluoroethylene (TFE) -hexafluoropropylene (HFP) copolymer, and the arithmetic average roughness (Ra) of the surface roughness of the inner surface of the bag-shaped container is 3.5. 6.5 nm, the root mean square roughness (RMS) of the inner surface of the bag-shaped container is 4.5 to 8.0 nm, and the surface free energy of the inner surface of the bag-shaped container is 16.5 to
  • the present invention relates to a cell culture bag of 18.5 (mJ / m 2 ) and a cell culture method for culturing cells in suspension in the bag-like container of the cell culture bag.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) are expected to be put to practical use in regenerative medicine and drug discovery research. It is necessary to stably mass-culture cells.
  • the conventional adhesion culture method using a glass or synthetic resin flask or petri dish is not suitable for mass production, so a bag capable of culturing pluripotent stem cells or a culture method using the bag Development is underway.
  • Bags for floating culture consisting of a poly (ethylene butylene) polystyrene block copolymer and a polymer alloy in which an ethylene acrylate copolymer is mixed with a polymer mixture of polypropylene are excellent in transparency and gas permeability.
  • Patent Document 1 Commercially available bags for suspension culture with excellent transparency and gas permeability are also known.
  • CultiLife [registered trademark] Spin bag manufactured by TAKARA
  • TFE-HFP VueLife FEP Bag 32-C manufactured by AmericanoseFluoroseal Corporation
  • culture bag A-1000NL manufactured by Nipro
  • An object of the present invention is to provide a cell culture bag capable of preparing a cell-containing solution having a high concentration and a high proportion of living cells such as suspension cells and pluripotent stem cells.
  • the inventors of the present invention are diligently studying to solve the above-mentioned problems.
  • the TFE-HFP copolymer film is used as a material, and the surface roughness Ra is 3.5 to 6.5 nm.
  • a cell culture bag having an inner surface of a bag-like container having an RMS of 4.5 to 8.0 nm and a surface free energy of 16.5 to 18.5 (mJ / m 2 ) is manufactured, and such a bag is used.
  • hPBMC human peripheral blood-derived mononuclear cells
  • hMSC cells human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the present invention comprises (1) a bag-like container made of a tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer, and the arithmetic average roughness (Ra) of the surface roughness of the inner surface of the bag-like container is 3.5-6. .5 nm, the root mean square roughness (RMS) of the inner surface of the bag-shaped container is 4.5 to 8.0 nm, and the surface free energy of the inner surface of the bag-shaped container is 16.5 to 18.
  • the cell culture bag according to (1) above wherein the bag-like container has a thickness of 10 to 100 ⁇ m
  • the cell culture bag according to (1) or (2) above, wherein the cells are mesenchymal stem cells or peripheral blood-derived mononuclear cells.
  • the present invention also includes (4) a bag-like container made of a tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer, and the arithmetic average roughness (Ra) of the surface roughness of the inner surface of the bag-like container is 3.5-6. .5 nm, the root mean square roughness (RMS) of the inner surface of the bag-shaped container is 4.5 to 8.0 nm, and the surface free energy of the inner surface of the bag-shaped container is 16.5 to 18. 5 (mJ / m 2 ) cell culturing method characterized in that cells are suspended in the bag-like container, and (5) the bag-like container has a thickness of 10 to 100 ⁇ m.
  • a decrease in cell viability can be effectively suppressed, and pluripotent stem cells can be efficiently induced by improving the floating state.
  • a cell suspension having a high ratio of living cells can be prepared, and a high-quality cell suspension for transplantation in regenerative medicine can be provided.
  • FIG. 1A is a diagram showing a microscopic image of the surface of a cell culture bag A (commercial product; comparative sample 1) when measured in a measuring range of 3 ⁇ m square.
  • FIG. 1B is a diagram showing a microscopic image of the surface of cell culture bag B (Example sample) when measured in a measurement range of 3 ⁇ m square.
  • Six types of cell culture bags (cell culture bag A, cell culture bag B, cell culture bags C to E [comparative sample 2 to 4], and cell culture bag F [commercial product; comparative sample 5 ]) Is a diagram showing a microscopic image of the cells when culturing hMSC cells for 1 day.
  • FIG. 6 shows microscopic images of cells when hPBMC cells were cultured for 7 days using the above six types of cell culture bags A to F.
  • the cell culture bag of the present invention is a bag for use in cell culture, comprising a bag-like container made of a TFE-HFP copolymer, and the arithmetic average roughness of the surface roughness of the inner surface of the bag-like container ( Ra) is 3.5 to 6.5 nm, the root mean square roughness (RMS) of the surface roughness of the inner surface of the bag-shaped container is 4.5 to 8.0 nm, and the surface freeness of the inner surface of the bag-shaped container is It is characterized in that the energy is 16.5 to 18.5 (mJ / m 2 ). When cells are cultured in a bag-like container having such characteristics, cell adhesion and cell viability decrease are effectively suppressed.
  • the cell culture bag of the present invention provided with such a bag-like container
  • it can be suitably used for suspension culture of adherent cells.
  • the above-mentioned bag-like container is matrigel, entactin, fibronectin, temperature-responsive polymer (PIPAAm), polycation (polylysine, etc.), gelatin, lectin, polysaccharide (hyaluronic acid, etc.), polylactic acid, polyglycol
  • a cell adhesive substance such as acid, ⁇ -aminocaprolactone, type I collagen, type IV collagen, chitosan, laminin, etc., whose inner surface is not coated (or arranged) is preferred.
  • the thickness of the bag-like container is preferably in the range of 10 to 100 ⁇ m, more preferably in the range of 15 to 95 ⁇ m, further preferably in the range of 20 to 92 ⁇ m, and more preferably in the range of 25 to 89 ⁇ m from the viewpoint of durability and cost effectiveness. Even more preferably within the range, particularly preferably within the range of 30 to 86 ⁇ m, particularly preferably within the range of 35 to 83 ⁇ m, most preferably within the range of 40 to 80 ⁇ m.
  • TFE-HFP copolymer means a copolymer containing at least TFE and HFP. That is, the “TFE-HFP copolymer” includes a binary copolymer of TFE and HFP (TFE / HFP copolymer; FEP), and a copolymer of TFE, HFP and vinyl fluoride (VF).
  • TFE / HFP / VF copolymer Polymer (TFE / HFP / VF copolymer), TFE / HFP / vinylidene fluoride (VDF) copolymer (TFE / HFP / VDF copolymer), TFE / HFP / perfluoro (alkyl vinyl ether) ( Terpolymers such as copolymers with PAVE) (TFE / HFP / PAVE copolymer), and copolymers of TFE, HFP, VF and VDF (TFE / HFP / VF / VDF copolymer).
  • TFE / HFP / VF / PAVE copolymer TFE / HFP / VF / PAVE copolymer
  • TFE / HFP / VDF / PAVE copolymer TFE / HFP / VD
  • Quaternary copolymers such as TFE / HFP / VF / VDF / PAVE copolymer
  • quaternary copolymers such as TFE / HFP / VF / VDF / PAVE copolymer.
  • the TFE-HFP copolymer of the present invention is preferably a TFE / HFP copolymer or a TFE / HFP / PAVE copolymer.
  • the mass ratio of TFE to HFP in such a TFE / HFP copolymer is preferably 80 to 97/3 to 20, and more preferably 84 to 92/8 to 16.
  • the mass ratio of TFE, HFP and PAVE in the TFE / HFP / PAVE copolymer is preferably 70 to 97/3 to 20 / 0.1 to 10, more preferably 81 to 92/5 to 16 / 0.3. ⁇ 5 is more preferred.
  • suspension cells examples include suspension cells such as red blood cells and white blood cells (derived from peripheral blood) (neutrophils, mononuclear cells [monocytes, lymphocytes], macrophages, etc.). Nuclear spheres are preferred.
  • adherent cells examples include embryonic stem cells (embryonic stem cells: ES cells), embryonic germ cells (embryonic germ cells: EG cells), germ line stem cells (germline stem cells: GS cells), induced pluripotent stem cells Pluripotent stem cells such as (iPS cells; induced pluripotent stem cell), multipotent stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, myocardial progenitor cells, vascular endothelial progenitor cells, neural progenitor cells, fat precursors Stem cells such as cells, dermal fibroblasts, skeletal muscle myoblasts, osteoblasts, odontoblasts, etc., cardiomyocytes, vascular endothelial cells, nerve cells, fat cells, skin fibers Mature cells such as cells, skeletal muscle cells, bone cells, hepatocyte (liver) cells, umbilical vein endothelial cells, cutaneous microlymphatic endothelial cells,
  • mesenchymal stem cells are preferred.
  • pluripotent stem cells are induced by suspension culture of the progenitor cells and the mature cells. Therefore, the cell culture bag of the present invention is advantageous for the preparation of pluripotent stem cells using these cells. Can be used.
  • S 0 represents the area of the reference surface
  • Z 0 represents the height of the reference surface
  • F (X, Y) represents the height of the designated surface at the coordinates (X, Y).
  • the surface roughness Ra of the inner surface of the bag-like container in the cell culture bag of the present invention may be in the range of 3.5 to 6.5 nm, for example, 3.5 to 6.3 nm, 3.5 to 6 .1 nm, 3.5-5.9 nm, 3.5-5.7 nm, 3.5-5.5 nm, 3.5-5.3 nm, 3.7-6.5 nm, 3.9-6.5 nm 4.1 to 6.5 nm, 4.3 to 6.5 nm, 4.5 to 6.5 nm, 4.7 to 6.5 nm, 4.9 to 6.5 nm, 3.7 to 6.3 nm, 3 .7 to 6.1 nm, 3.7 to 5.9 nm, 3.7 to 5.7 nm, 3.7 to 5.5 nm, 3.7 to 5.3 nm, 3.9 to 6.3 nm, 3.9 ⁇ 6.1nm, 3.9 ⁇ 5.9nm, 3.9 ⁇ 5.7nm, 3.9 ⁇ 5.5n
  • RMS of surface roughness is a square root of a value obtained by averaging the squares of deviations from the reference surface to the designated surface, and is calculated by the following equation.
  • RMS [1 / S 0 ⁇ ⁇ F (X, Y) ⁇ Z 0 ⁇ 2 dXdY] 1/2
  • S 0 represents the area of the reference surface
  • Z 0 represents the height of the reference surface
  • F (X, Y) represents the height of the designated surface at the coordinates (X, Y).
  • the RMS of the surface roughness of the inner surface of the bag-like container in the cell culture bag of the present invention may be in the range of 4.5 to 8.0 nm, for example, 4.5 to 7.8 nm, 4.5 to 7 .6 nm, 4.5 to 7.4 nm, 4.5 to 7.2 nm, 4.5 to 7.0 nm, 4.5 to 6.8 nm, 4.5 to 6.6 nm, 4.5 to 6.4 nm 4.7 to 8.0 nm, 4.9 to 8.0 nm, 5.1 to 8.0 nm, 5.3 to 8.0 nm, 5.5 to 8.0 nm, 5.7 to 8.0 nm, 5 .9 to 8.0 nm, 6.1 to 8.0 nm, 4.7 to 7.8 nm, 4.7 to 7.6 nm, 4.7 to 7.4 nm, 4.7 to 7.2 nm, 4.7 ⁇ 7.0nm, 4.7 ⁇ 6.8nm, 4.7 ⁇ 6.6nm
  • the measurement values necessary to calculate the Ra and RMS of the surface roughness are, for example, a dynamic force using a high precision large probe microscope unit AFM5200S (manufactured by HITACHI High-Tech) as an atomic force microscope (AFM).
  • AFM5200S manufactured by HITACHI High-Tech
  • surface free energy refers to a value calculated by calculation of two components of water / n-hexadecane according to the Owens-Wendt theory. Such a surface free energy value can be calculated, for example, by measuring a static contact angle with respect to water and n-hexadecane having a droplet volume of 2 ⁇ L using DropMatter 701 (manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.).
  • the surface free energy of the inner surface of the bag-like container in the cell culture bag of the present invention may be in the range of 16.5 to 18.5 (mJ / m 2 ), for example, 16.5 to 18.3 (mJ / M 2 ), 16.5 to 18.1 (mJ / m 2 ), 16.5 to 17.9 (mJ / m 2 ), 16.5 to 17.7 (mJ / m 2 ), 16.7 To 18.5 (mJ / m 2 ), 16.9 to 18.5 (mJ / m 2 ), 17.1 to 18.5 (mJ / m 2 ), 17.3 to 18.5 (mJ / m 2 ), 17.5 to 18.5 (mJ / m 2 ), 16.7 to 18.3 (mJ / m 2 ), 16.7 to 18.1 (mJ / m 2 ), 16.7 to 17 .9 (mJ / m 2 ), 16.7 to 17.7 (mJ / m 2 ), 16.9 to 18.3 (mJ /
  • the bag-like container in the cell culture bag of the present invention usually contains an FEP material at least partially so that the inside and the outside are separated from each other through the FEP in a sealed state.
  • FEP material at least partially so that the inside and the outside are separated from each other through the FEP in a sealed state.
  • the culture solution is filled into the bag-shaped container, at least 30%, preferably 50% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably, the surface that can be in contact with the culture solution.
  • 95% or more, particularly preferably 98% or more, most preferably substantially 100% is constituted by FEP.
  • “sealing” is performed, for example, by a method of closing the tube with a clamp or the like, a method of closing the tube by heat welding, or the like.
  • the bag-like container is preferably made of a flexible FEP sheet (film).
  • Examples of the shape of the bag-like container include a square, a rectangle, a rhombus, a circle, and an ellipse. A rectangle is preferable from the viewpoint of appearance and ease of manufacture.
  • At least one port made of FEP or the like for introducing or discharging a cell suspension or a culture solution can be airtightly provided.
  • the port can be provided with a closing means so that the bag-like container can be sealed.
  • the closing means include a holding body such as a clip, a communication piece (folding bar), and a cock.
  • the bag-like container in the cell culture bag of the present invention is manufactured by stacking TFE-HFP copolymer films (sheets) and then heat-sealing the edges using an impulse sealer or the like. Can do.
  • the cell culture bag of the present invention may be subjected to sterilization treatment such as ethylene oxide gas sterilization and autoclave sterilization as necessary.
  • the cell culturing method of the present invention is not particularly limited as long as it is a method of culturing the above-mentioned suspension cells or adhesive cells in the culture solution held in the bag-like container of the cell culture bag of the present invention
  • the culture medium for such cells is not particularly limited as long as the cells can survive and proliferate, and 0.1 to 30 (v / v)% serum (fetal bovine serum (FBS), calf) Culture medium for animal cell culture (DMEM, EMEM, IMDM [for example, manufactured by gibco)] containing serum [Calf bovine serum; CS], RPMI1640, ⁇ MEM, F-12, F-10, M-199, AIM- V, MSCBM [eg Lonza, etc.], commercially available B27 supplement (-insulin) (Life Technologies), N2 supplement (Life Technologies), B27 supplement (Life Technologies), K Examples include the above-mentioned culture medium for animal cell culture to which serum substitutes such as nockout ⁇ Serum Replacement (manu
  • the culture solution may be supplemented with a high molecular polymer such as methylcellulose, gellan gum, guar gum, xanthan gum, dextran as appropriate.
  • a high molecular polymer such as methylcellulose, gellan gum, guar gum, xanthan gum, dextran as appropriate.
  • the cell culture temperature is usually in the range of about 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the CO 2 concentration during the cultivation is usually within the range of about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the humidity during the cultivation is usually in the range of about 70 to 100%, preferably in the range of about 95 to 100%.
  • the Ra and RMS on the inner surface of the cell culture bag C were 4.0 nm and 5.1 nm (see Table 1), respectively, whereas the Cell Culture Bag B (Example Sample) ) Of the bag inner surface was 5.1 nm and 6.3 nm (see FIG. 1B, Table 1), respectively.
  • Ra and RMS of the bag inner surface of the cell culture bag D of PFA material are 5.5 nm and 7.5 nm, respectively, and the cell culture bag E of PFA material (Comparative Example Sample 4).
  • Ra and RMS on the inner surface of the bag are 4.5 nm and 5.7 nm, respectively, and Ra and RMS on the inner surface of the cell culture bag F (Comparative Example Sample 5) made of ethylene-vinyl acetate copolymer (EVA) material. Were 3.0 nm and 3.7 nm, respectively (see Table 1).
  • the surface free energy of the bag inner surface of the culture bag B was 17.6 (mJ / m 2 ) (see Table 1). This result shows that the surface free energy on the inner surface of the FEP material cell culture bag B (Example sample) is smaller than that of the FEP material cell culture bag A and C (Comparative sample 1 and 2). Indicated.
  • the surface free energy of the inner surface of the cell culture bag D made of PFA material is 17.5 (mJ / m 2 ), and the surface of the bag inner surface of the cell culture bag E made of PFA material (Comparative Sample 4). The free energy was 22.5 (mJ / m 2 ), and the surface free energy on the inner surface of the EVA cell culture bag F (Comparative Sample 5) was 30.0 (mJ / m 2 ). (See Table 1).
  • cell culture bag B (Example sample) is more surface than cell culture bags A and C (Comparative Example Samples 1 and 2) of the same FEP material Since it was shown that the roughness was high and the surface free energy was small, when cells were cultured using the cell culture bag B, it was analyzed whether cell adhesion was suppressed and suspension culture was possible.
  • RNA expression analysis [1] Cells are collected in a 15 mL centrifuge tube, and the total RNA of the cells is collected using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) and QIA shredder (Qiagen) according to the protocol attached to the product. Extracted. [2] The concentration of the extracted total RNA was measured using NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific). [3] Total RNA was adjusted to 20 ⁇ g / mL, and dispensed to a 96-well plate (Fast 96 well Reaction plate [Applied Biosystems, # 4309169]) at 3 ⁇ L / well.
  • the base sequences of primer sets (above “Forward Primer” and “Reverse Primer”) for amplifying cDNAs of the above two types of pluripotent stem cell marker genes, and probes that hybridize to the amplification (PCR) products (see “ The base sequence of “TaqMan® Probe”) is shown in Table 2.
  • Before indicates a cell sample immediately after culture (0 hour) in a cell culture bag.
  • pluripotent stem cell markers when the expression of pluripotent stem cell markers was analyzed, when hMSC cells were cultured using cell culture bag B (Example sample), than when hMSC cells were cultured using other cell culture bags. was also shown to increase the mRNA expression level of the pluripotent stem cell marker gene (see Table 3). These results indicate that pluripotent stem cells can be efficiently induced by suspension culture of hMSC cells using the cell culture bag B (Example sample).
  • the number of viable cells was counted with a cell counter and the cell viability was calculated (see Table 4).
  • the cells are observed under a microscope (IX-70, Olympus) (see FIG. 3), and include both suspended cells and adhered cells. 10 ⁇ L of the cell suspension was collected, mixed with 10 ⁇ L of 0.4% trypan blue (Gibco), the number of viable cells was counted with a cell counter, and the cell viability was calculated (see Table 4).
  • the present invention it is possible to prepare a high concentration and a large amount of suspension suspension and pluripotent stem cell suspension, so that it is possible to provide a high quality cell suspension for transplantation in regenerative medicine. .

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Abstract

　本発明は、浮遊性細胞や多能性幹細胞等の高濃度でかつ生細胞の割合が高い細胞含有液を調製することができる細胞培養用バッグを提供することを課題とする。　テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）－ヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）系共重合体からなる袋状容器を備え、前記袋状容器内面の表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）が３．５～６．５ｎｍであり、前記袋状容器内面の表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）が４．５～８．０ｎｍであり、かつ前記袋状容器内面の表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）である細胞培養用バッグの前記袋状容器内で、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ細胞）を培養すると、浮遊状態が向上することにより効率よく多能性幹細胞が誘導されるため、高濃度でかつ生細胞の割合が高い多能性幹細胞懸濁液の調製が可能であり、再生医療における良質な移植用細胞懸濁液を提供することができる。

Description

細胞培養用バッグ及びそれを用いた細胞培養方法
　本発明は、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）－ヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）系共重合体からなる袋状容器を備え、前記袋状容器内面の表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）が３．５～６．５ｎｍであり、前記袋状容器内面の表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）が４．５～８．０ｎｍであり、かつ前記袋状容器内面の表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）である細胞培養用バッグや、かかる細胞培養用バッグの上記袋状容器内で、細胞を浮遊培養する細胞の培養方法に関する。
　基礎研究や再生医療の現場において、哺乳動物細胞をインビトロで継代培養し、増殖させることが一般的に行われている。特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、再生医療や創薬研究への実用化が期待されており、そのためには、高品質の細胞を安定的に大量培養する必要がある。しかし、ガラス製や合成樹脂製のフラスコ又はシャーレを用いた従来の接着培養法では、大量生産には不向きであることから、多能性幹細胞を浮遊培養できるバッグや、バッグを用いた培養方法の開発が進められている。
　ポリ（エチレンブチレン）ポリスチレンブロック共重合体と、ポリプロピレンの重合体混合物にエチレンアクリル酸エステル共重合体を混合したポリマーアロイとからなる浮遊培養用のバッグは、透明性やガス透過性が優れていることが報告されている（特許文献１）。また、透明性やガス透過性に優れた浮遊培養用のバッグの市販品も知られており、例えば、エチレン酢酸ビニルを材料としたCultiLife［登録商標］ Spinバッグ（TAKARA社製）、ＴＦＥ－ＨＦＰ共重合体（ＦＥＰ）を材料としたVueLife FEP Bag 32-C（American Fluoroseal Corporation社製）、カルチャーバッグＡ－１０００ＮＬ（ニプロ社製）等が市販されている。
　最近、メチルセルロースやジェランガムを含む培養液と、ニプロ社が開発したガス透過性培養バッグとを用いてＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を浮遊培養すると、効率よく細胞を増殖できることが報告されている（非特許文献１）。
特開平３－６５１７７号公報
Otsuji, T.G., et al. Stem Cell Reports. 2: 734-745 (2014).
　本発明の課題は、浮遊性細胞や多能性幹細胞等の高濃度でかつ生細胞の割合が高い細胞含有液を調製することができる細胞培養用バッグを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体フィルムを材料とし、表面粗度のＲａが３．５～６．５ｎｍであり、表面粗度のＲＭＳが４．５～８．０ｎｍであり、かつ表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）の袋状容器内面を備えた細胞培養用バッグを製造し、かかるバッグを用いてヒト末梢血由来単核球（ｈＰＢＭＣ）を培養すると、細胞生存率低下が効果的に抑制されることを見いだした。また、上記バッグを用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ細胞）を培養すると、浮遊状態が向上することにより効率よく多能性幹細胞が誘導されることを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は（１）テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン系共重合体からなる袋状容器を備え、前記袋状容器内面の表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）が３．５～６．５ｎｍであり、前記袋状容器内面の表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）が４．５～８．０ｎｍであり、かつ前記袋状容器内面の表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）であることを特徴とする細胞培養用バッグや、（２）袋状容器の厚みが１０～１００μｍであることを特徴とする上記（１）に記載の細胞培養用バッグや、（３）細胞が間葉系幹細胞又は末梢血由来単核球であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の細胞培養用バッグに関する。
　また、本発明は（４）テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン系共重合体からなる袋状容器を備え、前記袋状容器内面の表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）が３．５～６．５ｎｍであり、前記袋状容器内面の表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）が４．５～８．０ｎｍであり、かつ前記袋状容器内面の表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）である細胞培養用バッグの前記袋状容器内で、細胞を浮遊培養することを特徴とする細胞の培養方法や、（５）袋状容器の厚みが１０～１００μｍであることを特徴とする上記（４）に記載の培養方法や、（６）細胞が間葉系幹細胞又は末梢血由来単核球であることを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の培養方法に関する。
　本発明の細胞培養用バッグを用いて細胞を培養すると、細胞生存率低下を効果的に抑制でき、また浮遊状態が向上することにより効率よく多能性幹細胞を誘導することができるため、高濃度でかつ生細胞の割合が高い細胞懸濁液の調製が可能であり、再生医療における良質な移植用細胞懸濁液を提供することができる。
図１Ａは、測定範囲３μｍ角で測定したときの細胞培養用バッグＡ（市販品；比較例サンプル１）の表面の顕微鏡画像を示す図である。図１Ｂは、測定範囲３μｍ角で測定したときの細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）の表面の顕微鏡画像を示す図である。 ６種類の細胞培養用バッグ（細胞培養用バッグＡ、細胞培養用バッグＢ、細胞培養用バッグＣ～Ｅ［比較例サンプル２～４］、及び細胞培養用バッグＦ［市販品；比較例サンプル５］）を用いて１日間ｈＭＳＣ細胞を培養したときの細胞の顕微鏡画像を示す図である。 上記６種類の細胞培養用バッグＡ～Ｆを用いて７日間ｈＰＢＭＣ細胞を培養したときの細胞の顕微鏡画像を示す図である。
　本発明の細胞培養用バッグは、ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体からなる袋状容器を備えた、細胞培養に用いるためのバッグであり、前記袋状容器内面の表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）が３．５～６．５ｎｍであり、前記袋状容器内面の表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）が４．５～８．０ｎｍであり、かつ前記袋状容器内面の表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）である点に特徴がある。かかる特徴を有する袋状容器中で細胞を培養すると、細胞接着と細胞生存率低下が効果的に抑制されるため、かかる袋状容器を備えた本発明の細胞培養用バッグは、浮遊性細胞の他、接着性細胞の浮遊培養に好適に用いることができる。浮遊培養に用いる場合、上記袋状容器は、マトリゲル、エンタクチン、フィブロネクチン、温度応答性ポリマー（ＰＩＰＡＡｍ）、ポリカチオン（ポリリジン等）、ゼラチン、レクチン、多糖類（ヒアルロン酸等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ε－アミノカプロラクトン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、キトサン、ラミニンなどの細胞接着性物質でその容器内表面がコーティング（又は配置）されていないものが好ましい。
　上記袋状容器の厚みは、耐久性や費用対効果の面から１０～１００μｍの範囲内が好ましく、１５～９５μｍの範囲内がより好ましく、２０～９２μｍの範囲内がさらに好ましく、２５～８９μｍの範囲内がさらにより好ましく、３０～８６μｍの範囲内が特に好ましく、３５～８３μｍの範囲内が特により好ましく、４０～８０μｍの範囲内が最も好ましい。
　本発明において、「ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体」とは、少なくともＴＦＥとＨＦＰとを含む共重合体を意味する。すなわち、「ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体」には、ＴＦＥとＨＦＰとの２元共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ共重合体；ＦＥＰ）の他、ＴＦＥとＨＦＰとビニルフルオライド（ＶＦ）との共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとビニリデンフルオライド（ＶＤＦ）との共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＤＦ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとパーフルオロ（アルキルビニルエーテル）（ＰＡＶＥ）との共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体）等の３元共重合体や、ＴＦＥとＨＦＰとＶＦとＶＤＦとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ／ＶＤＦ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとＶＦとＰＡＶＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ／ＰＡＶＥ共重合体）、ＴＦＥとＨＦＰとＶＤＦとＰＡＶＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＤＦ／ＰＡＶＥ共重合体）等の４元共重合体や、ＴＦＥとＨＦＰとＶＦとＶＤＦとＰＡＶＥとの共重合体（ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＶＦ／ＶＤＦ／ＰＡＶＥ共重合体）等の５元共重合体も含まれる。
　本発明のＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体としては、ＴＦＥ／ＨＦＰ共重合体やＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体が好ましい。かかるＴＦＥ／ＨＦＰ共重合体におけるＴＦＥとＨＦＰとの質量比は、８０～９７／３～２０が好ましく、８４～９２／８～１６がより好ましい。また、上記ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体におけるＴＦＥとＨＦＰとＰＡＶＥとの質量比は、７０～９７／３～２０／０．１～１０が好ましく、８１～９２／５～１６／０．３～５がより好ましい。
　上記浮遊性細胞としては、赤血球、（末梢血由来の）白血球（好中球、単核球［単球、リンパ球］、マクロファージ等）などの浮遊性細胞を挙げることができ、末梢血由来単核球が好ましい。
　上記接着性細胞としては、胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）、生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞；induced pluripotent stem cell）等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞等の複能性幹細胞、心筋前駆細胞、血管内皮前駆細胞、神経前駆細胞、脂肪前駆細胞、皮膚線維芽細胞、骨格筋筋芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞等の単能性幹細胞（前駆細胞）などの幹細胞や、心筋細胞、血管内皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、皮膚線維細胞、骨格筋細胞、骨細胞、ヘパトサイト（肝）細胞、臍帯静脈内皮細胞、皮膚微小リンパ管内皮細胞、表皮角化細胞、気管支上皮細胞、メラノサイト細胞、平滑筋細胞、象牙細胞等の成熟細胞を挙げることができ、間葉系幹細胞が好ましい。間葉系幹細胞の他、上記前駆細胞や上記成熟細胞を浮遊培養すると多能性幹細胞が誘導されるため、本発明の細胞培養用バックは、これら細胞を用いた多能性幹細胞の調製に有利に用いることができる。
　本発明において、「表面粗度のＲａ」とは、ＪＩＳ　Ｂ０６０１で定義されているように基準面（指定面の高さの平均値となるフラット面）から指定面までの偏差の絶対値を平均した値であり、次式で算出される。
Ｒａ＝１／Ｓ0∬｜Ｆ（Ｘ，Ｙ）－Ｚ0｜ｄＸｄＹ
ここで、Ｓ0は基準面の面積、Ｚ0は基準面の高さ、Ｆ（Ｘ，Ｙ）は座標（Ｘ，Ｙ）における指定面の高さを表す。
　本発明の細胞培養用バッグにおける袋状容器内面の表面粗度のＲａは、３．５～６．５ｎｍの範囲内であればよく、例えば、３．５～６．３ｎｍ、３．５～６．１ｎｍ、３．５～５．９ｎｍ、３．５～５．７ｎｍ、３．５～５．５ｎｍ、３．５～５．３ｎｍ、３．７～６．５ｎｍ、３．９～６．５ｎｍ、４．１～６．５ｎｍ、４．３～６．５ｎｍ、４．５～６．５ｎｍ、４．７～６．５ｎｍ、４．９～６．５ｎｍ、３．７～６．３ｎｍ、３．７～６．１ｎｍ、３．７～５．９ｎｍ、３．７～５．７ｎｍ、３．７～５．５ｎｍ、３．７～５．３ｎｍ、３．９～６．３ｎｍ、３．９～６．１ｎｍ、３．９～５．９ｎｍ、３．９～５．７ｎｍ、３．９～５．５ｎｍ、３．９～５．３ｎｍ、４．１～６．３ｎｍ、４．１～６．１ｎｍ、４．１～５．９ｎｍ、４．１～５．７ｎｍ、４．１～５．５ｎｍ、４．１～５．３ｎｍ、４．３～６．３ｎｍ、４．３～６．１ｎｍ、４．３～５．９ｎｍ、４．３～５．７ｎｍ、４．３～５．５ｎｍ、４．３～５．３ｎｍ、４．５～６．３ｎｍ、４．５～６．１ｎｍ、４．５～５．９ｎｍ、４．５～５．７ｎｍ、４．５～５．５ｎｍ、４．５～５．３ｎｍ、４．７～６．３ｎｍ、４．７～６．１ｎｍ、４．７～５．９ｎｍ、４．７～５．７ｎｍ、４．７～５．５ｎｍ、４．７～５．３ｎｍ、４．９～６．３ｎｍ、４．９～６．１ｎｍ、４．９～５．９ｎｍ、４．９～５．７ｎｍ、４．９～５．５ｎｍ、４．９～５．３ｎｍ等であってもよいが、４．９～５．３ｎｍであることが好ましい。
　本発明において、「表面粗度のＲＭＳ」とは、基準面から指定面までの偏差の自乗を平均した値の平方根であり、次式で算出される。
ＲＭＳ＝［１／Ｓ0∬｛Ｆ（Ｘ，Ｙ）－Ｚ0｝2ｄＸｄＹ］1/2
ここで、Ｓ0は基準面の面積、Ｚ0は基準面の高さ、Ｆ（Ｘ，Ｙ）は座標（Ｘ，Ｙ）における指定面の高さを表す。
　本発明の細胞培養用バッグにおける袋状容器内面の表面粗度のＲＭＳは、４．５～８．０ｎｍの範囲内であればよく、例えば、４．５～７．８ｎｍ、４．５～７．６ｎｍ、４．５～７．４ｎｍ、４．５～７．２ｎｍ、４．５～７．０ｎｍ、４．５～６．８ｎｍ、４．５～６．６ｎｍ、４．５～６．４ｎｍ、４．７～８．０ｎｍ、４．９～８．０ｎｍ、５．１～８．０ｎｍ、５．３～８．０ｎｍ、５．５～８．０ｎｍ、５．７～８．０ｎｍ、５．９～８．０ｎｍ、６．１～８．０ｎｍ、４．７～７．８ｎｍ、４．７～７．６ｎｍ、４．７～７．４ｎｍ、４．７～７．２ｎｍ、４．７～７．０ｎｍ、４．７～６．８ｎｍ、４．７～６．６ｎｍ、４．７～６．４ｎｍ、４．９～７．８ｎｍ、４．９～７．６ｎｍ、４．９～７．４ｎｍ、４．９～７．２ｎｍ、４．９～７．０ｎｍ、４．９～６．８ｎｍ、４．９～６．６ｎｍ、４．９～６．４ｎｍ、５．１～７．８ｎｍ、５．１～７．６ｎｍ、５．１～７．４ｎｍ、５．１～７．２ｎｍ、５．１～７．０ｎｍ、５．１～６．８ｎｍ、５．１～６．６ｎｍ、５．１～６．４ｎｍ、５．３～７．８ｎｍ、５．３～７．６ｎｍ、５．３～７．４ｎｍ、５．３～７．２ｎｍ、５．３～７．０ｎｍ、５．３～６．８ｎｍ、５．３～６．６ｎｍ、５．３～６．４ｎｍ、５．５～７．８ｎｍ、５．５～７．６ｎｍ、５．５～７．４ｎｍ、５．５～７．２ｎｍ、５．５～７．０ｎｍ、５．５～６．８ｎｍ、５．５～６．６ｎｍ、５．５～６．４ｎｍ、５．７～７．８ｎｍ、５．７～７．６ｎｍ、５．７～７．４ｎｍ、５．７～７．２ｎｍ、５．７～７．０ｎｍ、５．７～６．８ｎｍ、５．７～６．６ｎｍ、５．７～６．４ｎｍ、５．９～７．８ｎｍ、５．９～７．６ｎｍ、５．９～７．４ｎｍ、５．９～７．２ｎｍ、５．９～７．０ｎｍ、５．９～６．８ｎｍ、５．９～６．６ｎｍ、５．９～６．４ｎｍ、６．１～７．８ｎｍ、６．１～７．６ｎｍ、６．１～７．４ｎｍ、６．１～７．２ｎｍ、６．１～７．０ｎｍ、６．１～６．８ｎｍ、６．１～６．６ｎｍ、６．１～６．４ｎｍ等であってもよいが、６．１～６．４ｎｍであることが好ましい。
　表面粗度のＲａやＲＭＳを算出するために必要な測定値は、例えば、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）として、高精度大型プローブ顕微鏡ユニットＡＦＭ５２００Ｓ（HITACHI High-Tech社製）を使用し、ダイナミックフォースモードで、フィルムの表面を、測定面積３×３μｍ角、走査速度１Ｈｚ、ｘ－ｙ方向２５６×２５６分割、カンチレバーＳＩ－ＤＦ－２０（Ｓｉ、ｆ＝１３４ｋＨｚ、Ｃ＝１６Ｎ／ｍ）の条件で測定したＡＦＭトポグラフィ像について、傾斜自動補正処理を行うことにより求めることができる。
　本発明において、「表面自由エネルギー」とは、Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ理論の水／ｎ－ヘキサデカンの２成分の計算により算出された値をいう。かかる表面自由エネルギー値は、例えば、ＤｒｏｐＭａｔｅｒ７０１（協和界面科学社製）にて、液滴容量２μＬの水及びｎ－ヘキサデカンに対する静的接触角を測定することにより算出することができる。
　本発明の細胞培養用バッグにおける袋状容器内面の表面自由エネルギーは、１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）の範囲内であればよく、例えば、１６．５～１８．３（ｍＪ／ｍ２）、１６．５～１８．１（ｍＪ／ｍ２）、１６．５～１７．９（ｍＪ／ｍ２）、１６．５～１７．７（ｍＪ／ｍ２）、１６．７～１８．５（ｍＪ／ｍ２）、１６．９～１８．５（ｍＪ／ｍ２）、１７．１～１８．５（ｍＪ／ｍ２）、１７．３～１８．５（ｍＪ／ｍ２）、１７．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）、１６．７～１８．３（ｍＪ／ｍ２）、１６．７～１８．１（ｍＪ／ｍ２）、１６．７～１７．９（ｍＪ／ｍ２）、１６．７～１７．７（ｍＪ／ｍ２）、１６．９～１８．３（ｍＪ／ｍ２）、１６．９～１８．１（ｍＪ／ｍ２）、１６．９～１７．９（ｍＪ／ｍ２）、１６．９～１７．７（ｍＪ／ｍ２）、１７．１～１８．３（ｍＪ／ｍ２）、１７．１～１８．１（ｍＪ／ｍ２）、１７．１～１７．９（ｍＪ／ｍ２）、１７．１～１７．７（ｍＪ／ｍ２）、１７．３～１８．３（ｍＪ／ｍ２）、１７．３～１８．１（ｍＪ／ｍ２）、１７．３～１７．９（ｍＪ／ｍ２）、１７．３～１７．７（ｍＪ／ｍ２）、１７．５～１８．３（ｍＪ／ｍ２）、１７．５～１８．１（ｍＪ／ｍ２）、１７．５～１７．９（ｍＪ／ｍ２）、１７．５～１７．７（ｍＪ／ｍ２）等であってもよいが、１７．５～１７．７（ｍＪ／ｍ２）であることが好ましい。
　本発明の細胞培養用バッグにおける袋状容器は、通常、密閉された状態でその内部と外部がＦＥＰを介して隔てられるように、少なくともその一部にＦＥＰの材料を含む。例えば、袋状容器の内部に培養液を充填した際に、かかる培養液が接し得る面の少なくとも３０％、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは実質的に１００％がＦＥＰにより構成される。本願明細書において、「密閉」は、例えば、クランプ等でチューブを閉鎖する方法、熱溶着によりチューブを閉鎖する方法等により実施される。
　上記袋状容器は、可撓性を有するＦＥＰのシート（フィルム）からなることが好ましい。袋状容器の形状としては、正方形、長方形、菱形、円形、楕円形等を挙げることができ、外見や製造の容易性の観点から長方形が好ましい。
　上記袋状容器には、細胞懸濁液や培養液を導入又は導出するための、ＦＥＰ等で作製したポートを気密的に少なくとも１つ設けることができる。かかるポートには、袋状容器を密閉し得るように、閉鎖手段を設けることができる。かかる閉鎖手段としては、クリップ等の狭持体、連通ピース（折れ棒）、コックなどを挙げることができる。
　本発明の細胞培養用バッグにおける袋状容器は、ＴＦＥ－ＨＦＰ系共重合体のフィルム（シート）を重ね合わせた上で、縁部を、インパルスシーラー等を用いてヒートシールすることにより製造することができる。
　本発明の細胞培養用バッグは、必要に応じて、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌等の滅菌処理を施してもよい。
　本発明の細胞の培養方法は、本発明の細胞培養用バッグの袋状容器に保持された培養液中で、上記浮遊性細胞又は接着性細胞を浮遊培養する方法であれば特に制限されず、かかる細胞の培養液としては、細胞が生存・増殖できるものであれば特に制限されず、０．１～３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を含有する動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ［例えばgibco社製］、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９、ＡＩＭ－Ｖ、ＭＳＣＢＭ［例えばLonza社製］等）や、市販のＢ２７サプリメント（－インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）、間葉系幹細胞添加因子セット（Lonza社製）等の血清代替物を適量（例えば、１～３０％）添加した上記動物細胞培養用培養液などを挙げることができる。細胞の浮遊性をさらに向上させるために、上記培養液に、メチルセルロース、ジェランガム、グァーガム、キサンタンガム、デキストラン等の高分子ポリマーを適宜補充してもよいが、本発明の細胞培養用バッグが有する効果により、上記高分子ポリマーの非存在下でも効果的に細胞を浮遊培養することができる。このため、上記培養液としては、上記高分子ポリマーを含有しないものが好ましい。
　細胞の培養温度は、通常約３０～４０℃の範囲内であり、好ましくは３７℃である。培養時のＣＯ２濃度は、通常約１～１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。また、培養時の湿度は、通常約７０～１００％の範囲内であり、好ましくは約９５～１００％の範囲内である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．細胞培養用バッグの製造
　インパルスシーラーを用いて、５ｃｍ×１０ｃｍサイズの３種類のフィルム（ＦＥＰ素材の厚さ５０μｍのフィルム、ＦＥＰ素材の厚さ２５μｍのフィルム、及びテトラフルオロエチレン［ＴＦＥ］－パーフルオロ［アルキルビニルエーテル］［ＰＡＶＥ］共重合体［ＰＦＡ］素材の厚さ５０μｍのフィルム）を、シール温度３７０℃、シール時間５０秒、シール圧力０．２ＭＰａ、シール幅５ｍｍの条件でヒートシールすることにより、４種類の細胞培養用バッグ（細胞培養用バッグＢ［ＦＥＰ素材の厚さ５０μｍのバッグ；実施例サンプル］、細胞培養用バッグＣ［ＦＥＰ素材の厚さ２５μｍのバッグ；比較例サンプル２］、細胞培養用バッグＤ［ＰＦＡ素材の厚さ５０μｍのバッグ；比較例サンプル３］、及び細胞培養用バッグＥ［ＰＦＡ素材の厚さ５０μｍのバッグ；比較例サンプル４］）を製造した。
２．細胞培養用バッグのバッグ内面の表面分析
２－１　表面粗度
　高精度大型プローブ顕微鏡ユニットＡＦＭ５２００Ｓ（HITACHI High-Tech社製）を用いて、実施例１で製造した４種類の細胞培養用バッグに加えて、２種類の市販の細胞培養用バッグ（細胞培養用バッグＡ及びＦ［比較例サンプル１及び５］）のバッグ内面の表面粗度の測定を行った（表１参照）。測定範囲を３μｍ角とした場合、細胞培養用バッグＡ（比較例サンプル１）のバッグ内面のＲａ及びＲＭＳは、それぞれ３．０ｎｍ及び３．８ｎｍ（図１Ａ、表１参照）であり、また、細胞培養用バッグＣ（比較例サンプル２）のバッグ内面のＲａ及びＲＭＳは、それぞれ４．０ｎｍ及び５．１ｎｍ（表１参照）であったのに対して、細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）のバッグ内面のＲａ及びＲＭＳは、それぞれ５．１ｎｍ及び６．３ｎｍ（図１Ｂ、表１参照）であった。これらの結果は、ＦＥＰ素材の細胞培養用バッグＡ及びＣ（比較例サンプル１及び２）よりもＦＥＰ素材の細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）の方がバッグ内面の表面粗度が大きいことを示している。また、ＰＦＡ素材の細胞培養用バッグＤ（比較例サンプル３）のバッグ内面のＲａ及びＲＭＳは、それぞれ５．５ｎｍ及び７．５ｎｍであり、ＰＦＡ素材の細胞培養用バッグＥ（比較例サンプル４）のバッグ内面のＲａ及びＲＭＳは、それぞれ４．５ｎｍ及び５．７ｎｍであり、エチレン－酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）素材の細胞培養用バッグＦ（比較例サンプル５）のバッグ内面のＲａ及びＲＭＳは、それぞれ３．０ｎｍ及び３．７ｎｍであった（表１参照）。
２－２　接触角
　また、液滴法により水及びｎ－ヘキサデカン（ｎ－ＨＤ）を用いたときの細胞培養用バッグＡ～Ｆのバッグ内面の接触角について、全自動接触角計ＤＭ－７０１（KYOWA社製）を用いて測定した（測定回数：各５回）（表１参照）。得られた測定データの平均値を基に表面自由エネルギーを算出した（表１参照）。その結果、細胞培養用バッグＡ及びＣ（比較例サンプル１及び２）のバッグ内面の表面自由エネルギーは、それぞれ１９．５及び２２．６（ｍＪ／ｍ２）であったのに対して、細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）のバッグ内面の表面自由エネルギーは、１７．６（ｍＪ／ｍ２）であった（表１参照）。この結果は、ＦＥＰ素材の細胞培養用バッグＡ及びＣ（比較例サンプル１及び２）よりもＦＥＰ素材の細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）の方がバッグ内面の表面自由エネルギーが小さいことが示された。また、ＰＦＡ素材の細胞培養用バッグＤのバッグ内面の表面自由エネルギーは、１７．５（ｍＪ／ｍ２）であり、ＰＦＡ素材の細胞培養用バッグＥ（比較例サンプル４）のバッグ内面の表面自由エネルギーは、２２．５（ｍＪ／ｍ２）であり、ＥＶＡ素材の細胞培養用バッグＦ（比較例サンプル５）のバッグ内面の表面自由エネルギーは、３０．０（ｍＪ／ｍ２）であった（表１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３．細胞培養用バッグを用いたｈＭＳＣ細胞の培養
　実施例１において、細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）が、同じＦＥＰ素材の細胞培養用バッグＡ及びＣ（比較例サンプル１及び２）よりも表面粗度が高く、表面自由エネルギーが小さいことが示されたので、細胞培養用バッグＢを用いて細胞を培養した場合に、細胞接着が抑制され、浮遊培養できるかどうかについて解析した。
３－１　方法
３－１－１　細胞培養
〔１〕ｈＭＳＣ細胞（Lonza社製、PT-2501）を、間葉系幹細胞添加因子セット（Lonza社製、PT-4105）を加えたＭＳＣＢＭ（Mesenchymal Stem Cell Basal Medium）（Lonza社製、PT-3238）培養液中に１×１０５細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、６種類の細胞培養用バッグＡ～Ｆのバッグ内に４ｍＬ播種した。
〔２〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養後、１日目に細胞を顕微鏡（IX-70、オリンパス社製）下で観察した（図２参照）。
〔３〕さらに６日間培養後、以下の「３－１－２　ｍＲＮＡの発現解析」に記載の方法にしたがって遺伝子発現解析を行った。
３－１－２　ｍＲＮＡの発現解析
〔１〕細胞を１５ｍＬ遠心管に回収し、RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）及びQIA shredder（Qiagen社製）を用いて製品付属のプロトコールにしたがって細胞の全ＲＮＡを抽出した。
〔２〕抽出した全ＲＮＡの濃度は、NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて測定した。
〔３〕全ＲＮＡを２０μｇ／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート（Fast 96 well Reaction plate［Applied Biosystems社製、＃4309169］）に３μＬ／ウェルとなるように分注した。
〔４〕２種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子（Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ３／４）のｍＲＮＡの発現量をＲＴ－ＰＣＲにより検出するために、TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit（Applied Biosystems社製、＃4309169）を用いて以下の１）～６）からなる反応液を調製し、全ＲＮＡを分注した９６ウェルプレートへ滴下した。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。
１）Rnase-free water；０．５μＬ
２）2X Master Mix without UNG；１０μＬ（１×）
３）40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix；０．５μＬ
４）Forward Primer；２．０μＬ（３００ｎＭ）
５）Reverse Primer；２．０μＬ（９００ｎＭ）
６）TaqMan Probe；２．０μＬ（２００ｎＭ）
　上記２種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット（上記「Forward Primer」及び「Reverse Primer」）の塩基配列や、その増幅（ＰＣＲ）産物にハイブリダイズするプローブ（上記「TaqMan Probe」）の塩基配列は、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔５〕工程〔４〕で調製した全ＲＮＡと反応液との混合液を用いて、ABI PRISM 7500FAST Sequence Detection system (Applied　Biosystems社製)によるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを、以下の１）～３）に示した条件で行った。
１）４８℃、３０分を１サイクル（ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応）
２）９５℃、１０分を１サイクル（ポリメラーゼの活性化）
３）９５℃、１５秒と６０℃、１分の往復を４０サイクル（「Forward Primer」及び「Reverse Primer」によるｃＤＮＡの増幅）
〔６〕Baselineソフトウェア(Applied　Biosystems社製)を用いてＰＣＲ産物が一定量になるＰＣＲのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を測定し、比較Ｃｔ法（delta delta Ｃｔ法）によりＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値を基準とした上記２種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物のＣｔ値の相対値を求め、かかるＣｔ値の相対値から、上記２種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｃＤＮＡの相対量、すなわち上記２種類の多能性幹細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡの相対量を算出した（平均値±標準偏差、Ｎ＝３）（表３参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

表中「Before」は、細胞培養用バッグで培養直後（０時間）の細胞サンプルを示す。
３－２　結果
　顕微鏡観察の結果、４種類の細胞培養用バッグＣ～Ｆ（比較例サンプル２～５）を用いてｈＭＳＣ細胞を培養した場合、細胞は接着したのに対して、その他の２種類の細胞培養用バッグＡ（比較例サンプル１）及び細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）を用いてｈＭＳＣ細胞を培養した場合、細胞の接着は抑制され、浮遊した（図２参照）。本発明者らは、ｈＭＳＣ細胞の浮遊状態を向上させると、多能性幹細胞マーカーの発現が増加し、ｈＭＳＣ細胞の多能性獲得効率が高まることを見いだしている。そこで、多能性幹細胞マーカーの発現を解析したところ、細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）を用いてｈＭＳＣ細胞を培養した場合、他の細胞培養用バッグを用いてｈＭＳＣ細胞を培養した場合よりも、多能性幹細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルが増加することが示された（表３参照）。これらの結果は、細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）を用いてｈＭＳＣ細胞を浮遊培養させると、効率よく多能性幹細胞を誘導できることを示している。
４．細胞培養用バッグを用いたｈＰＢＭＣの培養
４－１　方法（細胞培養とトリパンブルー染色）
〔１〕浮遊細胞であるｈＰＢＭＣ細胞（Lonza社製、CC-2702）を、１０％ＦＢＳ（ATCCより入手、30-20202）を含有するＩＭＤＭ（gibco社製、12440-053）培養液中に２×１０５細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、６種類の細胞培養用バッグＡ～Ｆのバッグ内に５ｍＬ播種した。
〔２〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で培養し、１時間後に細胞培養液の一部（１０μＬ）を採取し、１０μＬの０．４％トリパンブルー（Gibco社製）と混合し、細胞計数盤で生細胞数を計測し、細胞生存率を算出した（表４参照）。
〔３〕細胞培養用バッグに播種してから７日間培養後、細胞を顕微鏡（IX-70、オリンパス社製）下で観察し（図３参照）、浮遊した細胞と接着した細胞の両方を含む細胞懸濁液１０μＬを採取し、１０μＬの０．４％トリパンブルー（Gibco社製）と混合し、細胞計数盤で生細胞数を計測し、細胞生存率を算出した（表４参照）。
４－２　結果
　顕微鏡観察の結果、細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）を用いてｈＰＢＭＣ細胞を培養した場合、市販の細胞培養用バッグを用いてｈＰＢＭＣ細胞を培養した場合と同程度、細胞の接着性が抑制された（図３参照）。さらに、細胞の生存率を解析したところ、細胞培養用バッグＢ（実施例サンプル）を用いてｈＰＢＭＣ細胞を培養した場合、市販の細胞培養用バッグＦ（比較例サンプル５）を用いてｈＰＢＭＣ細胞を培養した場合よりも、細胞生存率低下が有意に抑制されることが示された（表４参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明によると、高濃度でかつ大量の浮遊性細胞懸濁液や多能性幹細胞懸濁液の調製が可能となるため、再生医療における良質な移植用細胞懸濁液を提供することができる。

Claims (6)

  1. 　テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン系共重合体からなる袋状容器を備え、前記袋状容器内面の表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）が３．５～６．５ｎｍであり、前記袋状容器内面の表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）が４．５～８．０ｎｍであり、かつ前記袋状容器内面の表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）であることを特徴とする細胞培養用バッグ。
  2. 　袋状容器の厚みが１０～１００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用バッグ。
  3. 　細胞が間葉系幹細胞又は末梢血由来単核球であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養用バッグ。
  4. 　テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン系共重合体からなる袋状容器を備え、前記袋状容器内面の表面粗度の算術平均粗さ（Ｒａ）が３．５～６．５ｎｍであり、前記袋状容器内面の表面粗度の二乗平均粗さ（ＲＭＳ）が４．５～８．０ｎｍであり、かつ前記袋状容器内面の表面自由エネルギーが１６．５～１８．５（ｍＪ／ｍ２）である細胞培養用バッグの前記袋状容器内で、細胞を浮遊培養することを特徴とする細胞の培養方法。
  5. 　袋状容器の厚みが１０～１００μｍであることを特徴とする請求項４に記載の培養方法。
  6. 　細胞が間葉系幹細胞又は末梢血由来単核球であることを特徴とする請求項４又は５に記載の培養方法。
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