WO2016194359A1 - 高純度・高収率な高度不飽和脂肪酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

従来技術の欠点を補う、高純度・高収率な高度不飽和脂肪酸の製造方法が提供される。 （ａ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、第１の油層と第１の水層とが回収される工程；（ｂ）該第１の水層が第２の銀塩水溶液と該物質に分離される工程；および、（ｃ）該第１の油層と該第２の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が得られる工程、包含する高度不飽和脂肪酸および/またはその誘導体の精製方法が提供される。

Description

高純度・高収率な高度不飽和脂肪酸の製造方法

　本発明は、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの新規製造方法に関連する。また本発明は、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの精製法に関連する。

　本発明は特に、魚油、藻類の抽出油、遺伝子組み換え植物からの抽出油などの動植物および微生物油脂由来の高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からの精製技術、特に医薬品グレードの製品を工業的に安価に製造する方法に関する。

　近年、不飽和脂肪酸は必須脂肪酸としてサプリメントで注目されているだけでなく、特にエイコサペンタエン酸エチルエステルがスイッチＯＴＣとして閉塞性動脈硬化症、高脂血症治療薬として認可を受けたため、医薬品グレードのＥＰＡエチルの市場が拡大している。すなわち、高度不飽和脂肪酸は医薬品や健康食品に利用されている。しかし２重結合を多く有するため、化学合成での取得は困難である。

　高度不飽和脂肪酸は魚油などの海洋生物から抽出、精製することによって製造されるが、高度不飽和脂肪酸の含有量は少なく、高収率・高純度の精製技術が求められてきた。

　従来より脂肪酸あるいはモノエステルの混合物から特定の脂肪酸を分離する方法には、主として炭素数の差による分離法として蒸留、分子ふるい、超臨界流体抽出が、また二重結合数による分離法として低温分別、尿素付加、銀錯体形成、溶剤分別、さらに銀イオン処理樹脂やＯＤＳを用いたカラムクロマト法などがある。これらの精製方法は簡便であるものの、分離が不十分であったり、クロマト法のように高度精製は可能なものの工業的な大量処理には不向きであったりなど、それぞれ短所がある。実際の工業生産においては、これらの精製法の複数を組み合わせることにより高純度な脂肪酸が製造されている。しかしながら、その精製方法の煩雑さと、純度・収率において改善すべき点は、多い。

　硝酸銀処理法の原理は、高度不飽和脂肪酸でも、特に２重結合が分子内に多いものは、硝酸銀水溶液と混合することにより、分子内の２重結合と銀イオンとが錯体を形成することにある。この性質を利用して、銀イオンを担持したシリカゲルカラム担体との保持力の差を利用した不飽和脂肪酸の分析が実施されている。高度不飽和脂肪酸の工業的な製造法ではこの錯体が水溶性であることを活用して、飽和脂肪酸または分子内の２重結合数の少ない中・高度不飽和脂肪酸が含まれる脂溶性画分を油層として分別する。水溶性の錯体は溶液を加熱することで、硝酸銀と精製された高度不飽和脂肪酸に分離可能なため、簡易な工程であり、工業規模での高度不飽和脂肪酸の精製を可能としている。

　しかしながら、硝酸銀処理法は製造方法として原料の硝酸銀の価格が高く、価格の変動が大きいという難点があり、また目的とする高度不飽和脂肪酸の全てが錯体を形成するわけではなく、一部油層中に取り残されるため、高収率で得られる製造方法とは言い難く、結果として製造コストを高くするという難点がある。

　また、原理的に硝酸銀処理法は分子内に２重結合数が３つ以上の高度不飽和脂肪酸を夾雑物として完全に除去しづらく、医薬品グレードの高純度に精製する場合に、それらの夾雑物が前段または後段の精製方法での収率を低下させる原因となっている。

　代表的な従来技術の精製法を、以下に例示する。
以下にこれまで不飽和脂肪酸およびその誘導体の精製に用いられてきた技術の課題について記載する。
１）精密蒸留法
特徴：各成分の沸点差を利用して分離する方法。
課題：熱変性が有りうる。高純度品を精製する際に長時間がかかる。
２）分子蒸留法
特徴：蒸留の際に熱的影響が少ない。
課題：分離能が低い。
３）尿素処理法
特徴：溶解した尿素が結晶化する際に直鎖の分子が共存するとそれを取り込みながら、六角柱状の付加物結晶を形成する性質を利用。
課題：選択性が低い。尿素付加物の派生による廃棄物処理。
４）硝酸銀処理法
特徴：脂肪酸の二重結合に対して硝酸銀水溶液が錯体を形成する性質を利用。
課題：銀の価格が不安定。夾雑物を抱き込む。
５）固定層方式クロマト
特徴：熱的影響が少ない。高精度な分離が可能。
課題：溶離液の使用量が多い。工業的な製造には向かない。
６）擬似移動床方式クロマト
特徴：溶離液の使用量が少なく、連続操作のため工業化に向いている。
課題：不飽和脂肪酸の分離によく用いられるＯＤＳ充填剤が高価である。単一溶媒しか使用できないので、グラジエントで分離ができない。

　エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）エチルエステルの精製技術としては例えば特許文献１～４において不飽和脂肪酸およびその誘導体の工業的に優れた精製技術として硝酸銀処理が記載されている。しかしながら、特許１～４の方法では
１）ＥＰＡやドコサペンタエン酸(ＤＨＡ)以外の不飽和脂肪酸も同時に錯体形成してしまい純度の高い高度不飽和脂肪酸を得ることが困難。
２）高度不飽和脂肪酸が一部錯体形成せず、それらを廃棄することにより収率が低下するという問題がある。

　従来技術の欠点を補う、高純度・高収率な高度不飽和脂肪酸の製造方法が求められている。

特許第３００１９５４号公報 特許第２７８６７４８号公報 特許第２９３５５５５号公報 特許第２８９５２５８号公報

　本発明は、高度不飽和脂肪酸およびその誘導体の精製に関する上記問題点を解決するものである。

　本発明の一つの局面では、銀塩水溶液を用いた高度不飽和脂肪酸及びその誘導体の精製方法において副生する油層中の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体と銀塩水溶液との錯体を形成させた溶液に、原料である高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を加えることで、油層中の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を回収し、収率を改善することで製造コストを低減することを特徴とする。

　医薬品グレードの高純度の脂溶性物質を得るために、従来技術による銀塩水溶液による精製だけでは不完全であり、その他精製方法を組み合わせる必要がある。本発明の別の局面では、その精製の際に除去しづらいアラキドン酸、エイコサテトラエン酸及びその誘導体を従来法より低減させることによって、高純度化を達成する。すなわち、本発明の別の局面では、目的の脂溶性物質が高収率で得られることとなる。

　本発明のさらなる局面では、本発明の方法を用いて従来の銀塩水溶液による精製法よりも安価に高度不飽和脂肪酸およびその誘導体を医薬品グレードまで精製することを特徴とする。

　本発明の別の局面では、原料である高度不飽和脂肪酸及びその誘導体の混合物を銀塩水溶液と混合することで、特定の高度不飽和脂肪酸と銀塩との水溶性の錯体を形成させ、この水層から一旦特定の高度不飽和脂肪酸を精製する。本発明の特定の局面では、この精製の際に副生する油層に再度銀塩の溶液を加え、硝酸銀との錯体形成を行ったうえで、原料を更に加えることで、特定の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を高純度・高収率で得ることにより、製造コストダウンを達成する。

　すなわち、本発明は、例えば、
ｉ）副生する油層中の高度不飽和脂肪酸と銀塩の錯体を形成させた状態で、原料と錯体形成させること
ｉｉ）油層と銀塩の錯体を形成させ、下記項目Ａ１の（１）の方法を行うこと
を含む方法を提供する。

　本発明ではまた、以下が提供される。
（項目Ａ１）
脂溶性物質を高純度に精製するにあたり、
（１）銀塩水溶液と原料となる高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を含んだ混合物とで、低温により錯体形成し、水溶液として回収後、加熱ならびに溶媒抽出等により錯体から分離することで精製された高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を得る、かつ、
（２）油層分離後、その際に副生した油層に銀塩水溶液を加え再度錯体を低温により形成し、油層分離後、更に原料を混合し、低温により錯体を形成し、水溶液として回収後、加熱ならびに溶媒抽出等により錯体から分離することで精製された高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を得る、かつ、
（３）上記（２）の際に副生した油層についても上記（２）の工程同様に処理を行う事を次バッチ以降繰り返すことで、油層中の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を回収することでの、高収率化による、脂溶性物質の製造コストを低減させる方法。
（項目Ａ２）
従来の銀塩水溶液を用いた方法よりもアラキドン酸、エイコサテトラエン酸の夾雑を防ぎ、高純度化する、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ３）
脂溶性物質を医薬品グレードの高純度（純度９７％以上）に精製するにあたり、本発明に対し、前処理または後処理として精密蒸留法、分子蒸留法、クロマト法、尿素付加法との組み合わせによる高収率な製造方法としての、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ４）
　前記脂溶性物質が、分子内に２重結合を５つ以上持つ、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールエステルからなる群から選択される、項目Ａ１に記載の方法。

　本発明では、例えば、以下の第１の例示的実施形態が提供される（図１参照）：
（項目１）
　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、以下：
（ａ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、第１の油層と第１の水層とが回収される工程；
（ｂ）該第１の水層が第２の銀塩水溶液と該物質に分離される工程；および、
（ｃ）該第１の油層と該第２の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が得られる工程；
を包含する方法。
（項目２）
　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、以下：
（ａ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、第１の油層と第１の水層とが回収される工程；
（ｂ）該第１の水層が第２の銀塩水溶液と該物質に分離される工程；および、
（ｃ）該第１の油層と該第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が得られる工程；
を包含する方法。
（項目３）
　さらに、
（ｄ）前記第２の水層と前記物質を含む第２の原料とが接触撹拌されて、第２の油層と第３の水層が回収される工程；
であって、ここで、該第２の油層が該物質を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
　さらに、
（ｅ）前記第３の水層が第３の銀塩水溶液と前記物質に分離される工程；
を包含する、項目３に記載の方法。
（項目５）
　さらに、
　（ｆ）前記第２の油層から前記物質が単離される工程；
を包含する、項目３に記載の方法。
（項目６）
　さらに、
　（ｇ）前記第１の銀塩水溶液、前記第２の銀塩水溶液、および前記第３の銀塩水溶液からなる群から選択される銀塩水溶液と前記第２の油層とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて、該物質を含む第４の水層が得られる工程；
を包含する、項目４に記載の方法。
（項目７）
　前記高度不飽和脂肪酸誘導体が高度不飽和脂肪酸エチルエステルである、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
　前記高度不飽和脂肪酸エチルエステルが、分子内に２重結合を５つ以上持つ、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールのエチルエステルからなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
　前記銀塩水溶液が硝酸銀水溶液である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、（ｉ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて回収された第１の油層と、
（ｉｉ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて回収された第１の水層が、第２の銀塩水溶液と該物質とに分離されて得られた該第２の銀塩水溶液、
とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が回収される工程；
を包含する方法。
（項目１１）
　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、（ｉ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて回収された第１の油層と（ｉｉ）該第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が回収される工程；
を包含する方法。
（項目１２）
　さらに、
（ｂ）前記第２の水層と前記物質を含む第２の原料とが接触撹拌されて、第２の油層および第３の水層が回収される工程；
であって、ここで、該第２の油層が該物質を含む、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
　さらに、以下の工程：
（ｃ）前記第３の水層が第３の銀塩水溶液と前記物質に分離される工程；
を包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
　さらに、
　（ｄ）前記第２の油層から前記物質が単離される工程；
を包含する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
　さらに、
　（ｅ）前記第１の銀塩水溶液、前記第２の銀塩水溶液、および前記第３の銀塩水溶液からなる群から選択される銀塩水溶液と前記第２の油層とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて、該物質を含む第４の水層が得られる工程；
を包含する、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１６）
　前記高度不飽和脂肪酸誘導体が高度不飽和脂肪酸エチルエステルである、項目１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
　前記高度不飽和脂肪酸エチルエステルが、分子内に２重結合を５つ以上持つ、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールのエチルエステルからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
　前記銀塩水溶液が硝酸銀水溶液である、項目１０～１７のいずれか一項に記載の方法。
　本発明では、例えば、以下の第２の例示的実施形態が提供される（図２～４参照）：
（項目Ｂ１）
　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、該方法は、２以上ａ以下の精製ロットを含み、該精製ロットは各々２以上ｃ以下の精製バッチを含み、ａおよびｃは独立して２以上の整数であり、ｂは２以上a以下の整数であり、ｄは１以上ｃ－１以下の整数であり、ここで、ｂ番目の精製ロットに含まれるｄ番目の精製バッチは、以下：
　ｂ－１番目の精製ロットのｄ＋１番目の精製バッチで得られた油層を、ｂ番目の精製ロットのｄ番目の銀塩水溶液と混合する工程；
　該混合液を分液して、ｂ番目の精製ロットのｄ番目の油層およびｂ番目の精製ロットのｄ＋１番目の銀塩水溶液を得る工程、
を包含する方法。
上記方法において、各精製バッチは、必ずしも上記のルールに従う必要はなく、例えば、１以上の精製バッチは異なる工程を包含してもよい。
（項目Ｂ２）
　項目Ｂ１に記載の方法であって、ここで、ｂ番目の精製ロットのｃ番目の精製バッチは、以下：
　原料油脂を、ｂ番目の精製ロットのｃ番目の銀塩水溶液と混合する工程；
　該混合液を分液して、ｂ番目の精製ロットのｃ番目の油層およびｂ番目の精製ロットのｃ＋１番目の銀塩水溶液を得る工程、
を包含する方法。
（項目Ｂ３）
　項目Ｂ１に記載の方法であって、さらに以下：
　前記混合液を分液して得られた前記銀塩水溶液に対して、有機溶媒抽出を行い、高度不飽和脂肪酸を含む抽出物を得る工程；
　必要に応じて、該有機溶媒抽出によって得られた該抽出物を濃縮する工程；および、
　該濃縮物について、精密蒸留法、分子蒸留法、尿素処理法、硝酸銀処理法、固定層方式クロマト、または、擬似移動床方式クロマト、あるいは、これらの組み合わせを使用することによってエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）濃度を９６．５％（ｗ／ｗ）以上にする工程、
を包含する、方法。
（項目Ｂ４）
　項目Ｂ３に記載の方法であって、アラキドン酸（ＡＡ）濃度が１．０％（ｗ／ｗ）以下である、方法。
（項目Ｂ５）
　項目Ｂ３に記載の方法であって、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）濃度が１．０％（ｗ／ｗ）以下である、方法。
 

　本発明の製造方法によれば、未精製の高度不飽和脂肪酸およびその誘導体から、工業的に安価な医薬品グレードの製品に精製することができる。

図１は、本発明の第１の例示的実施形態を模式的に示す図面である。 図２は、本発明の第２の例示的実施形態（３つの精製バッチを含む「ｎ」番目の精製ロット）を模式的に示す図面である。 図３は、本発明の第２の例示的実施形態（３つの精製バッチを含む「ｎ＋１」番目の精製ロット）を模式的に示す図面である。 図４は、本発明の第２の例示的実施形態（２つの精製バッチを含む「ｎ」番目の精製ロット）を模式的に示す図面である。

　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。また、本明細書において「ｗｔ％」は、「質量パーセント濃度」と互換可能に使用される。また、本明細書において特に定義しない限り、「％」は「ｗｔ％」を意味する。

　（用語の定義）
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

　本明細書において使用される用語「原料油脂」とは、本発明の精製の原料として使用する油脂をいう。原料油脂は、脱酸処理されていても、されていなくてもよい。好ましくは、本発明の原料油脂は、脱酸処理された原料油脂である。
　本明細書において使用される用語「原料」とは、高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質を含む任意の物質をいう。本発明の「原料」としては、例えば、上記「原料油脂」および本発明の精製過程で発生した「油層」が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の精製過程で発生した「油層」は、高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質を含む場合、廃棄することなく、本発明の精製の原料として利用可能である。

　本明細書において使用される用語「精製」とは、精製の目的となる物質の濃度を高める任意の操作をいう。
　本明細書において使用される用語「精製バッチ」とは、銀塩水溶液において、精製の目的となる物質の濃度を高める操作をいう。それゆえ、代表的には、「精製バッチ」に銀塩水溶液を供した場合、目的物質の濃度が高められた銀塩水溶液が得られる。複数（２以上）の精製バッチを「精製ロット」ということもある。各精製ロットは、必ずしも同数の精製バッチを含む必要はない。

　本明細書において使用される用語「高度不飽和脂肪酸」とは、炭素数が１６以上、かつ分子内に二重結合を２個以上有した不飽和脂肪酸を意味し、例えば、ドコサヘキサエン酸（Ｃ２２：６、ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５、ＥＰＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４、ＡＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５、ＤＰＡ）、ステアリドン酸（Ｃ１８：４）、リノレン酸（Ｃ１８：３）、リノール酸（Ｃ１８：２）等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の取得方法で得られる高度不飽和脂肪酸の誘導体としては、脂肪酸が遊離型でないものおよび遊離型であるものをいい、例えば、高度不飽和脂肪酸、ならびに、高度不飽和脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル等のエステル型誘導体、アミド、メチルアミド等のアミド型誘導体、脂肪アルコール型誘導体、トリグリセライド、ジグリセライド、モノグリセライド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、本発明の精製方法の目的物質は、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールのエチルエステルからなる群から選択されるエチルエステルである。

　本明細書において使用される用語「銀塩」とは、不飽和脂肪酸中の不飽和結合と錯体を形成しうる銀塩をいう。例えば、硝酸銀塩、過塩素酸銀塩、酢酸銀塩、トリクロロ酢酸銀塩、トリフルオロ酢酸銀塩等が挙げられるがこれらに限定されない。これらの銀塩を、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは４０％以上の濃度となるように水に溶解して銀塩水溶液とし、高度不飽和脂肪酸誘導体の精製に使用する。また、銀塩水溶液中の銀塩濃度は、特に限定されないが、好ましくは、飽和濃度を上限とする。

　本明細書において使用される用語「抗酸化剤」とは、生体内、食品、日用品、工業原料において酸素が関与する有害な反応を減弱もしくは除去する物質をいう。代表的には、抗酸化剤としては、ブチルヒドロキシトルエン、トコフェロール、および、トコフェロール誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。トコフェロール誘導体としては、例えば、ｄ－α－トコフェロール、ｄ－β－トコフェロール、ｄ－γ－トコフェロール、ｄ－δ－トコフェロール、ｌ－α－トコフェロール、ｌ－β－トコフェロール、ｌ－γ－トコフェロール、ｌ－δ－トコフェロール、それらの混合物であるｄｌ－α－トコフェロール、ｄｌ－β－トコフェロール、ｄｌ－γ－トコフェロール、ｄｌ－δ－トコフェロール、それらの誘導体である酢酸トコフェロール、コハク酸トコフェロール、リン酸トコフェロール、アスパラギン酸トコフェノール、グルタミン酸トコフェノール、パルミチン酸トコフェロール、ニコチン酸トコフェロール、リノール酸トコフェロール、ポリエトキシル化トコフェノールなどが挙げられるがこれらに限定されない。

　本発明の精製方法において、脂肪酸の誘導体の混合物から、高度不飽和脂肪酸誘導体を選択的に分離する方法は、代表的には、高度不飽和脂肪酸誘導体を含有する上記脂肪酸の誘導体の混合物に、不飽和結合と錯体を形成しうる銀塩の水溶液を加え、好ましくは５分～４時間、より好ましくは１０分～２時間撹拌し、水溶性の銀塩－高度不飽和脂肪酸誘導体の錯体を形成させ、高度不飽和脂肪酸誘導体のみを選択的に銀塩水溶液に溶かすことにより行われるがこれに限定されない。

　また、上記高度不飽和脂肪酸誘導体と、銀塩水溶液との反応温度は、下限は銀塩水溶液が液体でありさえすればよく、上限は１００℃までで行われるが、高度不飽和脂肪酸誘導体の酸化安定性、銀塩の水への溶解性、錯体の生成速度などへの配慮から、１０～３０℃が好ましい。

　上記高度不飽和脂肪酸誘導体と、銀塩水溶液との接触時には、高度不飽和脂肪酸誘導体の酸化安定性、銀塩の安定性を考慮し、不活性ガス、例えば窒素雰囲気下で、遮光して行うのが好ましい。例えば、製造中に窒素雰囲気下とすることで、酸化の原因である酸素の混入を遮断でき、原料の酸化による過酸化物上昇を抑えることができる。また、酸化を促進させる光を遮断することで更に酸化を抑制でき、過酸化物上昇を抑えることができる。

　上記高度不飽和脂肪酸誘導体と、銀塩との錯体から、高度不飽和脂肪酸誘導体を解離する方法は特に限定されないが、例えば、有機溶媒による抽出や、水を加えることにより高度不飽和脂肪酸誘導体を不溶化し、分離する方法等が挙げられるがこれらに限定されない。

　（油層中の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体との銀塩水溶液との錯体形成）
　理論に拘束されることは望まないが、本発明は油層中の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体とで錯体形成した溶液に、原料となる高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を混合することで、高収率・高純度に製造する方法である。以下にその特徴を述べる。
（１：銀塩水溶液との錯体について）
　銀塩水溶液は水中でイオン化し、二重結合を分子内に３つ以上持つ高度不飽和脂肪酸と銀イオンが低温で混合することにより、水溶性である錯体を形成する。錯体の形成しやすさは分子内の２重結合数に依存し、一般的に数が多いほど錯体形成能が高い。この性質は、本発明によって高度な精製が可能になる一因である。
（２：硝酸銀処理法の夾雑物について）
　目的物として分子内に２重結合を５つ以上持つ、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの高度不飽和脂肪酸の医薬品グレードの高純度精製を目的とする場合に、２重結合を４つ持つアラキドン酸、エイコサテトラエン酸は、その分子構造から夾雑物として、硝酸銀処理により精製した画分に含有される。これらの分子は沸点、及び極性などの物性が目的物と近似しているため、各種精製方法で除去する際に大きく収率を低下させる要因となる。そのため、目的物質の収率を低下させることなく、これらの夾雑物の候補となる物質を精製によって除去する方法が安価な医薬品グレードの目的物を得る為に望まれる。
（３：油層との錯体形成について）
　従来法では収率の観点から、過剰の銀塩水溶液を加えていたため、余剰の銀イオンが発生し、夾雑物となる２重結合を４つ持つアラキドン酸、エイコサテトラエン酸とも錯体を形成することにより純度の低下、曳いては収率の低下を招いていた。

　本発明では、一旦油層中の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体と銀塩水溶液を混合し、錯体を形成させることで、余剰の銀イオンを消費するか、あるいは、添加する銀イオン量を制限し、かつ、油層中の高度不飽和脂肪酸及びその誘導体を回収することによって、高純度・高収率で高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質を精製することが可能となる。

　（本発明の各工程）
　例えば、本発明では、高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、以下：
（ａ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、第１の油層と第１の水層とが回収される工程；
（ｂ）該第１の水層が第２の銀塩水溶液と該物質に分離される工程；および、
（ｃ）該第１の銀塩水溶液および該第２の銀塩水溶液からなる群から選択される水溶液と、該第１の油層とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が得られる工程；
を包含する方法が提供される。この方法で使用される原料としては、高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質を含む任意の物質が使用される。本発明の原料としては、例えば、上記原料油脂および本発明の精製過程で発生した油層が挙げられるがこれらに限定されない。

　ここで、上記接触撹拌の条件は、特に限定されることはなく、銀塩水溶液を使用する周知の分離・精製法を使用することができる（例えば、特許文献１～４）。例えば、銀塩の濃度は、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、および、飽和濃度とすることができる。

　接触撹拌された混合物からの油層および水層の分離は、周知の手法を利用することが可能である。例えば、静置、あるいは、遠心分離を用いることができる。水層からの高度不飽和脂肪酸および/またはその誘導体（例えば、高度不飽和脂肪酸エチルエステル）の分離には、周知の方法が利用可能であり、例えば、ｎ－ヘプタンなどを用いることが可能である。

　銀塩と高度不飽和脂肪酸および/またはその誘導体との複合体（錯体）の形成は、周知の手法を用いることができ、例えば、低温が挙げられるが、これに限定されない。複合体（錯体）から高度不飽和脂肪酸および/またはその誘導体の分離には、周知の手法を用いることができ、例えば、加熱および溶媒抽出が挙げられるが、これに限定されない。

　（本発明の第１の例示的実施形態）
　以下、図１を参照して、本発明の一実施形態を説明する：
　第１の銀塩水溶液は原料と混合され、混合液は第１の油層と第１の水層に分液される。第１の水層から目的物質である高度不飽和脂肪酸および/またはその誘導体が抽出され、残りの溶液は第２の銀塩水溶液となる。この第２の銀塩水溶液は第１の油層と混合され、混合液は油層と第２の水層に分液され、油層は目的物質を低濃度でのみ含むため、廃棄される。次に、第２の水層は、第１の銀塩水溶液と原料との混合液と同様にさらに、精製に供され得る。

　（本発明の第２の例示的実施形態）
　以下、図２～４を参照して、精製工程で得られた油層を廃棄することなく原料として再利用する本発明の一実施形態を説明する。
　２またはそれ以上の数の精製バッチを組み合わせた単位を精製ロットとし、複数の精製ロットを連続して行うことによって、連続して高度不飽和脂肪酸および/またはその誘導体を精製することができる。図２は、３つの精製バッチを含む「ｎ」番目のロットを模式的に示す。各溶液（油層、原料油脂）の代表的なＥＰＡ濃度を記載するが、この濃度はあくまで目安である。各精製バッチでは、油層または原料油脂を銀塩水溶液と混合し、分液することによって油層と銀塩水溶液を調製する。得られた銀塩水溶液は、同一ロットの次の精製バッチにおいて油層または原料油脂と混合するために使用されるか、または、当該精製バッチが当該ロットの最終精製バッチである場合には、次のロットの第１の精製バッチにおいて油層と混合するために使用される。例えば、精製ロットが３つの精製バッチを含む場合、第ｎロットの第３の精製バッチで調製された第ｎロットの第４の銀塩水溶液は、第ｎ＋１ロット（すなわち、次のロット）の第１の銀塩水溶液として使用され、第ｎ＋１ロットの第１の精製バッチにおいて油層と混合される。第１の精製バッチで調製される第１の油層は、代表的にはＥＰＡ濃度が低いことから廃棄されるが、ＥＰＡ濃度が高い場合、廃棄されることなく精製原料として再利用され得る。
　図２において模式的に示される第ｎ精製ロットに続いて、図３において模式的に示される第ｎ＋１ロットを実行することができる。第ｎ＋１ロットの第１の精製バッチで使用される油層は、代表的には前のロットに由来する「第ｎロットの第２の油層」である。第ｎ＋１ロットの第２の精製バッチで使用される油層は、代表的には前のロットに由来する「第ｎロットの第３の油層」である。
　各精製ロットは必ずしも３つの精製バッチを含む必要はなく、２以上の任意の精製バッチを含むことができる。図４は、２つの精製バッチを含む精製ロットを模式的に示したものである。精製ロットが２つの精製バッチを含む場合、第２の精製バッチで得られる第ｎロットの第３の銀塩水溶液は、第ｎ＋１ロットの第１の銀塩水溶液として使用することができる。
　（本発明によって得られる精製物）
　本発明によって、得られるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の純度は、例えば、９０％（ｗ／ｗ）以上、６１％（ｗ／ｗ）以上、６２％（ｗ／ｗ）以上、６３％（ｗ／ｗ）以上、６４％（ｗ／ｗ）以上、６５％（ｗ／ｗ）以上、６６％（ｗ／ｗ）以上、６７％（ｗ／ｗ）以上、６８％（ｗ／ｗ）以上、６９％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上である。これら純度のＥＰＡの調製のために使用される出発材料中のＥＰＡの純度は、代表的には４０（ｗ／ｗ）％であるが、これに限定されない。
　本発明によって、得られるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の純度は、さらに周知の方法（例えば、精密蒸留法、分子蒸留法、尿素処理法、硝酸銀処理法、固定層方式クロマト、または、疑似移動層方式クロマト、あるいは、これらの組み合わせ）を使用することによってさらに高くすることができ、そのさらなる精製の結果として得られるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の純度は、例えば、９０％（ｗ／ｗ）以上、９１％（ｗ／ｗ）以上、９２％（ｗ／ｗ）以上、９３％（ｗ／ｗ）以上、９４％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、９６％（ｗ／ｗ）以上、９６．５％（ｗ／ｗ）以上、９７％（ｗ／ｗ）以上、９７．５％（ｗ／ｗ）以上である。
　本発明によって、得られるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含む組成物中のアラキドン酸（ＡＡ）濃度は、０．４％（ｗ／ｗ）以下、０．８％（ｗ／ｗ）以下、１．０％（ｗ／ｗ）以下、１．５％（ｗ／ｗ）以下、３．０％（ｗ／ｗ）以下である。本発明によって、得られるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含む組成物中のエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）濃度は、０．４％（ｗ／ｗ）以下、０．８％（ｗ／ｗ）以下、１．０％（ｗ／ｗ）以下、１．５％（ｗ／ｗ）以下、３．０％（ｗ／ｗ）以下である。

　以下、本発明の高度不飽和脂肪酸誘導体の精製方法について、実施例等に基づき具体的に説明する。なお、本発明は、これらに限定されるものではない。

　以下、エイコサペンタエン酸の精製について実施例及び比較例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。

　比較例として従来法を用いた系について記載する。実施例１は比較例１から副生した油層を用いて試験を行った。

　（比較例１）
　試験条件は、以下のとおりである。
出発原料：ＥＰＡエチルエステル４０％含有油脂
硝酸銀水溶液濃度：５０％
回収溶媒：ｎ－ヘプタン
原料使用量：２０ｇ
硝酸銀水溶液使用量：１００ｇ
回収溶媒使用量：２００ｇ
反応条件：
１．原料と硝酸銀水溶液を混合し、１０℃で３ｈｒ撹拌後に下層（水層）および上層（油層１）を回収した。
２．下層にｎ－ヘプタンを２００ｇ加え、８０℃で２ｈｒ加熱した後に上層（油層２）を回収した。
３．減圧濃縮後、得量から収率及び、ＧＣ（島津２０１０ｐｌｕｓ）分析から純度を評価した。

　（実施例１）
　試験条件
原料：ＥＰＡエチルエステル４０％含有油脂
硝酸銀水溶液濃度：５０％
回収溶媒：ｎ－ヘプタン
原料使用量：２０ｇ
硝酸銀水溶液使用量：１００ｇ
回収溶媒使用量：２００ｇ
反応条件：
１．実施例１で回収した上層（油層１）に硝酸銀水溶液を加え、１０℃で３ｈｒ撹拌後に下層（水層）を回収した。
２．回収した下層に原料を加え、１０℃で３ｈｒ撹拌後に下層（水層）を回収した。
３．下層にｎ－ヘプタンを１００ｇ加え、８０℃で２ｈｒ加熱した後に上層（油層２）を回収した。
４．減圧濃縮後、得量から収率及び、ＧＣ（島津２０１０ｐｌｕｓ）分析から純度を評価した。

　比較例１および実施例１の結果を以下の表に記載する。

表１：比較例１および実施例１の精製物の脂肪酸組成

表２：比較例１および実施例１の精製物の収率

　以上の結果から、油層の有効利用により従来法と比較し、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸といった除去が難しい夾雑物の純度を低減しつつ、エイコサペンタエン酸の純度を従来法より改善している。

　また油層中のエイコサペンタエン酸を回収することで、従来法よりも収率を１０ポイント以上改善することに成功していることが分かる。

　よって従来法よりも高純度・高収率安価でエイコサペンタエン酸を製造できることが示された。

　（実施例２）
　試験条件は、以下のとおりである。

　まず１バッチ目として、硝酸銀５０ｇに蒸留水５０ｇを加え撹拌・溶解した。この５０％硝酸銀水溶液１００ｇに、脂肪酸エチルエステルの混合物（ＥＰＡエチルエステル４０．４％（脂肪酸組成面積％）、ＤＨＡエチルエステル純度１５．０％）２０ｇを混合し、１０℃で３時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層（油層）を保存、下層（水層）を分取し、ｎ－ヘプタン１００ｇを添加して、８０℃で２時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。また、別途硝酸銀を含有する下層及び保存した油層は以降のバッチにおいて高度不飽和脂肪酸エチルエステルの精製に使用した。

　２バッチ目以降は以下に記載する操作を繰り返し実施した。保存した油層に硝酸銀を含有する下層を混合し、１０℃で３時間撹拌した。下層（水層）を分取し、脂肪酸エチルエステルの混合物を２０ｇを混合し、１０℃で３時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層（油層）を保存、下層（水層）を分取し、ｎ－ヘプタン１００ｇを添加して、８０℃で２時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。上記反応は、窒素雰囲気下で実施した。この操作を繰り替えし、上記混合物５バッチまで処理した結果を表３に示す。

表３：実施例の結果一覧表

　実施例１と同様の結果が、処理を繰り返しても安定的に再現していることが分かる。このことから従来法よりも高純度・高収率安価でエイコサペンタエン酸を製造できることが示された。
　次に、本発明の効果をより明確に判断するため、比較例２として従来法を繰り返し実施した結果について以下に記載する。
　（比較例２）
　試験条件は、以下のとおりである。
出発原料：ＥＰＡエチルエステル４０％含有油脂
硝酸銀水溶液濃度：５０％
回収溶媒：ｎ－ヘプタン
原料使用量：２０ｇ
硝酸銀水溶液使用量：１００ｇ
回収溶媒使用量：２００ｇ
反応条件：
１．原料と硝酸銀水溶液を混合し、１０℃で３ｈｒ撹拌後に下層（水層）および上層（油層１）を回収した。
２．下層にｎ－ヘプタンを２００ｇ加え、８０℃で２ｈｒ加熱した後に上層（油層２）を回収した。
３．減圧濃縮後、得量から収率及び、ＧＣ（島津２０１０ｐｌｕｓ）分析から純度を評価した。
４．以上の操作を5バッチ実施した。
　比較例２の結果を以下の表に記載する。
表４：比較例２にて５バッチ実施した精製物の脂肪酸組成と収率

 　比較例１と同様の結果が連続して得られた。実施例２の結果と比較すると本発明が主張するアラキドン酸（ＡＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）含量の低減に伴う品質の改善及び収率の改善が確認できた。
　（実施例３）
　次に、複数回油層を再利用した場合として実施例３に油層を２回再利用した結果について記載する。
　保存した油層に硝酸銀を含有する下層を混合し、１０℃で３時間撹拌し、下層（水層）を分取する過程で副生する上層(油層)からもエイコサペンタエン酸を回収した系について結果を示す。
　試験条件は、以下のとおりである：
　まず１バッチ目として、硝酸銀５０ｇに蒸留水５０ｇを加え撹拌・溶解した。この５０％硝酸銀水溶液１００ｇに、脂肪酸エチルエステルの混合物（ＥＰＡエチルエステル４０．４％（脂肪酸組成面積％）、ＤＨＡエチルエステル純度１５．０％）２０ｇを混合し、１０℃で３時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層（油層）を保存、下層（水層）を分取し、ｎ－ヘプタン１００ｇを添加して、８０℃で２時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。また、別途硝酸銀を含有する下層及び保存した油層は油層２として以降のバッチにおいて高度不飽和脂肪酸エチルエステルの精製に使用した。
　２バッチ目として、保存した油層１に硝酸銀を含有する下層を混合し、１０℃で３時間撹拌した。下層（水層）を分取する際に、上層(油層)を保存し、油層２として以降のバッチにおいて高度不飽和脂肪酸エチルエステルの精製に使用した。分取した下層(水層)に脂肪酸エチルエステルの混合物を２０ｇを混合し、１０℃で３時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層（油層）を保存、下層（水層）を分取し、ｎ－ヘプタン１００ｇを添加して、８０℃で２時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。
　３バッチ目以降は以下に記載する操作を繰り返し実施した。保存した油層２に硝酸銀を含有する下層を混合し、１０℃で３時間撹拌した。下層（水層）を分取し、保存した油層１を混合し、１０℃で３時間攪拌した。この上層（油層）を保存、下層（水層）を分取し、脂肪酸エチルエステルの混合物を２０ｇを混合し、１０℃で３時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層（油層）を保存、下層（水層）を分取し、ｎ－ヘプタン１００ｇを添加して、８０℃で２時間攪拌した。その後、１時間静置し、二層に分離させた。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。この上層を分取し、高度不飽和脂肪酸エチルエステルの濃縮物を得た。
　上記反応は、窒素雰囲気下で実施した。この操作を繰り替えし、上記混合物５バッチまで処理した結果を表５に示す。
表５：実施例の結果一覧表

　２バッチ目以降、実施例２と比較してさらにエイコサペンタエン酸の純度及び収率の改善が安定して継続している。製造工程として実施例３より複雑ではあるが、本件のような原料費が製造コストの大半を締める製品については実施例４の結果はより望ましい。

　本発明の製造方法によれば、未精製の高度不飽和脂肪酸およびその誘導体から、工業的に安価に、医薬品グレードの高度不飽和脂肪酸および/またはその誘導体製品を精製する
ことができる。

Claims (17)

1. 　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、以下：
   （ａ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、第１の油層と第１の水層とが回収される工程；
   （ｂ）該第１の水層が第２の銀塩水溶液と該物質に分離される工程；および、
   （ｃ）該第１の銀塩水溶液および該第２の銀塩水溶液からなる群から選択される水溶液と、該第１の油層とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が得られる工程；
   を包含する方法。
2. 　さらに、
   （ｄ）前記第２の水層と前記物質を含む第２の原料とが接触撹拌されて、第２の油層と第３の水層が回収される工程；
   であって、ここで、該第２の油層が該物質を含む、請求項１に記載の方法。
3. 　さらに、
   （ｅ）前記第３の水層が第３の銀塩水溶液と前記物質に分離される工程；
   を包含する、請求項２に記載の方法。
4. 　さらに、
   　（ｆ）前記第２の油層から前記物質が単離される工程；
   を包含する、請求項２に記載の方法。
5. 　さらに、
   　（ｇ）前記第１の銀塩水溶液、前記第２の銀塩水溶液、および前記第３の銀塩水溶液からなる群から選択される銀塩水溶液と前記第２の油層とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて、該物質を含む第４の水層が得られる工程；
   を包含する、請求項３に記載の方法。
6. 　前記高度不飽和脂肪酸誘導体が高度不飽和脂肪酸エチルエステルであり、該高度不飽和脂肪酸エチルエステルが、分子内に２重結合を５つ以上持つ、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールのエチルエステルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、
   （ａ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて回収された第１の油層と、該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて回収された第１の水層が、第２の銀塩水溶液と該物質とに分離されて得られた該第２の銀塩水溶液と接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が回収される工程；または、
   （ｂ）該物質を含む第１の原料と第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて回収された第１の油層と、該第１の銀塩水溶液とが接触撹拌されて、油層と水層に分離されて該物質を含む第２の水層が回収される工程；
   を包含する方法。
8. 　さらに、
   （ｂ）前記第２の水層と前記物質を含む第２の原料とが接触撹拌されて、第２の油層および第３の水層が回収される工程；
   であって、ここで、該第２の油層が該物質を含む、請求項７に記載の方法。
9. 　さらに、以下の工程：
   （ｃ）前記第３の水層が第３の銀塩水溶液と前記物質に分離される工程；
   を包含する、請求項８に記載の方法。
10. 　さらに、
    　（ｄ）前記第２の油層から前記物質が単離される工程；
    を包含する、請求項７に記載の方法。
11. 　さらに、
    　（ｅ）前記第１の銀塩水溶液、前記第２の銀塩水溶液、および前記第３の銀塩水溶液からなる群から選択される銀塩水溶液と前記第２の油層とが接触撹拌されて、油層と水層に分離され該物質を含む第４の水層が得られる工程；
    を包含する、請求項９に記載の方法。
12. 　前記高度不飽和脂肪酸誘導体が高度不飽和脂肪酸エチルエステルであり、該高度不飽和脂肪酸エチルエステルが、分子内に２重結合を５つ以上持つ、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、および、ドコサヘキサエン酸、ならびに、それらの低級アルコールのエチルエステルからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
13. 　高度不飽和脂肪酸およびその誘導体からなる群から選択される物質の精製法であって、該方法は、２以上ａ以下の精製ロットを含み、該精製ロットは各々２以上ｃ以下の精製バッチを含み、ａおよびｃは独立して２以上の整数であり、ｂは２以上a以下の整数であり、ｄは１以上ｃ－１以下の整数であり、ここで、ｂ番目の精製ロットに含まれるｄ番目の精製バッチは、以下：
    　ｂ－１番目の精製ロットのｄ＋１番目の精製バッチで得られた油層を、ｂ番目の精製ロットのｄ番目の銀塩水溶液と混合する工程；
    　該混合液を分液して、ｂ番目の精製ロットのｄ番目の油層およびｂ番目の精製ロットのｄ＋１番目の銀塩水溶液を得る工程、
    を包含する方法。
14. 　請求項１３に記載の方法であって、ここで、ｂ番目の精製ロットのｃ番目の精製バッチは、以下：
    　原料油脂を、ｂ番目の精製ロットのｃ番目の銀塩水溶液と混合する工程；
    　該混合液を分液して、ｂ番目の精製ロットのｃ番目の油層およびｂ番目の精製ロットのｃ＋１番目の銀塩水溶液を得る工程、
    を包含する方法。
15. 　請求項１３に記載の方法であって、さらに以下：
    　前記混合液を分液して得られた前記銀塩水溶液に対して、有機溶媒抽出を行い、高度不飽和脂肪酸を含む抽出物を得る工程；
    　必要に応じて、該有機溶媒抽出によって得られた該抽出物を濃縮する工程；および、
    　該濃縮物について、精密蒸留法、分子蒸留法、尿素処理法、硝酸銀処理法、固定層方式クロマト、または、擬似移動床方式クロマト、あるいは、これらの組み合わせを使用することによってエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）濃度を９６．５％（ｗ／ｗ）以上にする工程、
    を包含する、方法。
16. 　請求項１５に記載の方法であって、アラキドン酸（ＡＡ）濃度が１．０％（ｗ／ｗ）以下である、方法。
17. 　請求項１５に記載の方法であって、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）濃度が１．０％（ｗ／ｗ）以下である、方法。

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