WO2016189181A1 - Acetilsalicilato de lisina intravítreo como tratamiento de la retinopatía diabética - Google Patents

Acetilsalicilato de lisina intravítreo como tratamiento de la retinopatía diabética Download PDF

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WO2016189181A1
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diabetic retinopathy
lysine acetylsalicylate
retina
concentration
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PCT/ES2016/070396
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José Juan MARTÍNEZ TOLDOS
Cristian FERNANDEZ MARTÍNEZ
José María RUIZ MORENO
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Fundación Para El Fomento De La Investigación Sanitaria Y Biomédica De La Comunitat Valencia (Fisabio)
Universidad De Castilla La Mancha
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to the use of a composition comprising lysine acetylsalicylate for the manufacture of a medicament in a form suitable for intravitreal administration for the treatment of diabetic retinopathy.
  • Diabetic retinopathy is the leading cause of legal blindness in people under 50 in developed countries and one of the leading causes of blindness worldwide. Diabetes mellitus affects between 6 and 18% of the population in Spain, a third have diabetic retinopathy and a third in turn have diabetic macular edema, the main cause of vision loss in diabetic patients. WHO estimates that there are 346 million diabetics worldwide.
  • type 1 diabetes At the beginning of type 1 diabetes only between 0 and 3% have some degree of diabetic retinopathy, but 67, 1% of these patients suffer from it before the 5 years of evolution of their diabetes. In the case of type 2 diabetes between 6 and 30% of patients already have retinopathy at the time of diagnosis and in cases of more than 20 years of evolution the prevalence of diabetic retinopathy is 82%.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Ranibizumab blocks the VEGF-A-induced angiogenesis producing a regression of the neovases and thereby inducing improvements in retinal edema.
  • it does not modify the evolutionary course of the disease as long as it does not resolve the ischemia or modify other circumstances and molecular events that we know today that occur in diabetic retinopathy.
  • aflibercept that acts similarly to ranibizumab but in turn inhibits another molecule besides VEGF-A, such as PIGF (placental growth factor); This drug has effects comparable to ranibizumab and also the same limitations.
  • Another therapeutic option indicated is a spheroid, dexamethasone, which is administered by intravitreal injection in a sustained-release device (Ozurdex®) approved for use as a first-line drug or in case of failure of the previous anti-VEGFs.
  • a sustained-release device Ozurdex®
  • Another system of sustained release of another spheroid is in the process of being commercialized, in this case fluocinolone (lluien®).
  • spheroids Both spheroids have the high rate of side effects they induce, such as increased infraocular pressure and cataracts.
  • bevacizumab (Avastin®) has also been used, which is an inhibitor of all VEGF isoforms; that although there is evidence of non-inferiority with respect to ranibizumab, it lacks official approval for its infraocular use.
  • vastin® an inhibitor of all VEGF isoforms
  • acetylsalicylate is capable of acting on various therapeutic targets involved in inflammation; targets that are present even in very early stages of this pathology. Therefore, acetylsalicylate is presented as a potentially useful drug in early and advanced stages of diabetic retinopathy.
  • the use of oral acetylsalicylic acid has been described in the context of diabetic retinopathy with both a preventive and therapeutic profile (see L Zheng, SJ Howell, DA Hatala, K Huang, TS Kern.
  • Salicylate-based anti-inflammatory drugs inhibit the early lesion of diabetic retinopathy Diabetes 2007; 56: 337-335 W Sun, C Gerhardinger, Z Dagher, T Hoehn, M Lorenzi Aspirin at low-intermediate concentrations protects retinal vessels in experimental diabetic retinopathy through non-platelet-mediated effects Diabetes 2005; 54: 3418-3426. TS Kern, RL Engerman. Pharmacological inhibition of diabetic retinopathy, aminoguanidine and aspirin. Diabetes 2001; 50: 1636-1642.). So it has been shown that there is a beneficial effect of salicylate on the evolutionary course of the disease and no counterproductive effect on it. However, it is based on the oral use of salicylate in both humans and animals, which in many cases involves high and non-tolerable doses with frequent and potentially serious adverse effects.
  • a composition of acetylsalicylic acid (AS) and silicone oil (SiO) for intravitreal use has been described (see, for example, Kralinger M. T et al Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 2001; 239: 208-216).
  • AS acetylsalicylic acid
  • SiO silicone oil
  • SiO is characterized by being a dense, inert and stable element that helps keep the retina correctly applied. It is an immiscible medium for all types of substances, whether they are drugs or inflammatory and angiogenic molecules, preventing them from spreading through the vitreous cavity. It has no chemical action on the retina, is not able to act as a drug reservoir and is not useful as a solvent (Abrams GW, Azen SP, McCuen BW, Flynn H, Lai MY, Ryan SJ, Silicone Study Group: Vitrectomy with silicone oil or long-acting gas in eyes with severe proliferative vitreoretinopathy: Results of additional long-term follow-up (Silicone Study Report # 11). Archives of Ophthalmology 1 15: 335-344, 1997.;.
  • compositions for intravitreal administration of acetylsalicylate intended for the treatment of diabetic retinopathy that can be injected in the presence of vitreous humor, that is, that can be administered in less advanced stages of the disease in order to avoid the progression of the disease and prevent patients from requiring surgery.
  • the present invention relates to the use of a composition comprising lysine acetylsalicylate for the manufacture of a medicament in a form suitable for intravitreal administration.
  • the invention relates to the use of the composition as mentioned above, for the manufacture of a medicament in a form suitable for intravitreal administration for the treatment of a retinal disease.
  • the invention relates to the composition as defined above, for the manufacture of a medicament in a form suitable for intravitreal administration for the treatment of a disease selected from uveitic macular edema, vitritis, non-infectious retinitis, retinocoroiditis. non-infectious, proliferative vitreoretinopathy, chronic Irving-Gass syndrome, chronic central serous chorioretinopathy and diabetic retinopathy; and preferably for the treatment of diabetic retinopathy.
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, where the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition in the vitreous humor.
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, 18 mg / ml of composition or 24 mg / ml of composition.
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, where the pH of the composition is between 6 and 6.2; and preferably where the pH of the composition is 6.
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, where:
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, of 18 mg / ml of composition or of 24 mg / ml composition;
  • the pH of the composition is between 6 and 6.2, and preferably where the pH of the composition is 6.
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, which further comprises physiological saline, and preferably also comprises between 2.6 ml and 5.6 ml of physiological saline.
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, which further comprises water, and preferably also comprises 5 ml of water.
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, of 18 mg / ml of composition or of 24 mg / ml composition;
  • physiological saline which also comprises physiological saline, and preferably that also comprises 2.6 ml, 4.5 ml or 5.6 ml of physiological saline.
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of acetylsalicylate of lysine is 12 mg / ml of composition, 18 mg / ml of composition or 24 mg / ml of composition;
  • the pH of the composition is between 6 and 6.2, and preferably where the pH is 6; and which further comprises physiological saline, and preferably also comprising 2.6 ml, 4.5 ml or 5.6 ml of physiological saline.
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, of 18 mg / ml of composition or of 24 mg / ml composition;
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, of 18 mg / ml of composition or of 24 mg / ml composition;
  • the pH of the composition is between 6 and 6.2, and preferably where the pH of the composition is 6;
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, of 18 mg / ml of composition or of 24 mg / ml composition;
  • physiological saline which further comprises physiological saline, and preferably also comprises 2.6 ml, 4.5 ml or 5.6 ml of physiological saline;
  • Y which also comprises water, and preferably which also comprises 5 ml of water.
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, of 18 mg / ml of composition or of 24 mg / ml composition;
  • the pH of the composition is between 6 and 6.2, and preferably where the pH of the composition is 6;
  • physiological saline which further comprises physiological saline, and preferably also comprises 2.6 ml, 4.5 ml or 5.6 ml of physiological saline; Y
  • the concentration of lysine acetylsalicylate is between 12 mg / ml of composition and 24 mg / ml of composition, and preferably where the concentration of lysine acetylsalicylate is 12 mg / ml of composition, of 18 mg / ml of composition or of 24 mg / ml composition;
  • the pH of the composition is between 6 and 6.2, and preferably where the pH of the composition is 6;
  • physiological saline which further comprises physiological saline, and preferably also comprises 2.6 ml, 4.5 ml or 5.6 ml of physiological saline; Y
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, where the total amount of acetylsalicylic acid injected into the vitreous humor is between 0.6 mg and 1.2 mg. In another embodiment the invention relates to the use of the composition as defined above, where the total amount of acetylsalicylic acid injected into the vitreous humor is 0.6 mg, 0.9 mg or 1.2 mg.
  • composition as defined above, where:
  • the total amount of acetylsalicylic acid injected into the vitreous humor is between 0.6 mg and 1.2 mg;
  • the final volume of the composition is at least 0.05 ml.
  • the invention relates to the use of the composition as defined above, where the total amount of acetylsalicylic acid injected into the vitreous humor is 0.6 mg, 0.9 mg or 1.2 mg; Y
  • the final volume of the composition is at least 0.05 ml.
  • lysine as an ingredient of the composition favors solubility and improves the stability of the active ingredient forming the lysine acetylsalicylate salt.
  • the composition can be used in patients in whom it has not been necessary to extract the vitreous humor.
  • the vitreous humor acts as a reservoir of drugs in a way that favors the persistence and diffusion of the lysine acetylsalicylate of the invention inside the eye.
  • injectable preparations for parenteral administration, comprise sterile solutions, suspensions or emulsions, in an aqueous or non-aqueous solvent such as propylene glycol, polyethylene glycol or vegetable oils.
  • aqueous or non-aqueous solvent such as propylene glycol, polyethylene glycol or vegetable oils.
  • These compositions may also contain adjuvants, such as humectants, emulsifiers, dispersants and preservatives. They could be sterilized by any of the methods known or prepared as sterile solid compositions that will be dissolved in water or any other sterile injectable medium immediately before use. It is also possible to start from sterile raw materials and keep them in these conditions during the entire manufacturing process.
  • the mentioned composition can be prepared by following the procedure detailed below:
  • composition sterile solution.
  • Material 1.5 ml syringes, needles, 0.22 micron filter, sterile bottle.
  • the final preparation will be filtered (0.22 micron filter) before packing it in the 1 ml syringe, which will be loaded with a volume of 0.05 ml and covered with a sterile cap. 6. Packaging and labeling. The label shall indicate the route of administration, the active substance, the final concentration, the date of preparation, the type of preservation and the expiration date.
  • FIG. 1 represents the histological section stained with H&E of the central retina (note the optic nerve in the central part of the image).
  • FIG. 2 represents the histological section stained with peripheral retina H&E.
  • FIG. 3 represents the histological section stained with H&E where the ganglion cell layer (down arrow) and external plexiform layer (up arrow) are indicated.
  • CD18 leukocyte marker leukocyte is the main effector cell of the inflammatory response of tissues, which also happens in the retina. CD18 is a surface molecule that is expressed in leukocyte membranes activated in tissues where there is inflammation such as the diabetic retina. Determining its absolute and relative number helps to know if the injected solution is able to reduce the presence of activated leukocytes in certain layers of the retina as part of its anti-inflammatory action.
  • Endothelial marker ICAM-1 the endothelial cells that cover the blood vessels inside have been shown to be affected in diabetic retinopathy and for this reason have a great relevance in the pathogenesis of the disease. ICAM-1 is a transmembrane protein present in endothelial cells and virtually specific to them. Its immunohistochemical marking makes it possible to quantitatively signal and assess the endothelial cells present in the different layers of tissue studied and gives us information about the vascularization of the tissues studied and the integrity of the vascular wall. 3.
  • Vascular density chronic inflammation caused by diabetic retinopathy leads to obliteration and death of blood vessels. This leaves more or less extensive areas of tissue without receiving any type of blood supply.
  • determining the number of vessels present in each section of tissue can give us information about whether or not the drug is capable of positively or negatively influencing the capillary density of the retina (vessels / tissue portion).
  • Diabetes induction was performed in all animals by intraperitoneal streptozocin injection. - The glycemic indexes were checked 24 and 48 hours after the injection to assess whether the induction had been successful.
  • the animals were divided into two groups consisting of 8 rats each.
  • diabetes was allowed to evolve naturally in both groups during the first 12 weeks. It is in this period that it has been shown that signs of diabetic retinopathy begin to appear.
  • one of the groups is given an intravitreal injection in the two eyes of each acetylsalicylic animal in a dilution with lysine.
  • the volume of vitreous humor existing in the eye of the adult rat is 56.5 + 2 microliters.
  • composition sterile solution.
  • Material 1.5 ml syringes, needles, 0.22 micron filter, sterile bottle.
  • the final preparation will be filtered (0.22 micron filter) before packing it in the Hamilton syringe, which is loaded with a volume of 5 ⁇ and covered with a sterile cap.
  • the label shall indicate the route of administration, the active substance, the final concentration, the date of preparation, the type of preservation and the expiration date.
  • Retinal laminar sections of all animals were made, being subjected to the action of 4% formaldehyde-like preservatives.
  • An anti-ICAM1 monoclonal antibody was used for the endothelial cell mapping, we also used anti-CD18 monoclonal antibodies for leukocyte mapping. After fixing the different sections of stained tissue, the positively labeled molecules were counted as well as the amount of blood vessels present under an optical microscope (Leica® microsystem) in 10X magnification.
  • the Mann-Whitney U contrast test was used for independent samples. To test the correlation between the variables, the Spearman test has been used.
  • tissue samples were included, 56 corresponding to specimens treated with the intravitreal drug and 52 corresponding to untreated animals and in which diabetic retinopathy evolved naturally.
  • Figure 4 Figure 5 and Figure 7 show the correlation and the result of the Spearman test.
  • the relationship between ICAM1 and vessels has also been studied. There is only a relationship in cases for the ganglionic layers (see figure 8 and figure 9)
  • CD18 1.066 + 0.536 * Vessels (p ⁇ 0.001)
  • ICAM-1 transmembrane molecule is expressed almost exclusively in the cell wall of the vascular endothelium, being an element of linkage and communication between the endothelial cell and other cells from the bloodstream and containing specific ligands for this protein.
  • the immunohistochemical labeling of the ICAM-1 shows that there is a significantly higher count of endothelial cells in treated animals compared to those who did not receive any dose of intravitreal salicylate; This would demonstrate a beneficial effect of the treatment on the survival of endothelial cells compared to the control group. This data remains significant in all the retinal sections studied both in those corresponding to the macular area and in the most peripheral retina.
  • Obliteration of the vascular wall is another of the most harmful phenomena of all those that occur in diabetic retinopathy. It leads to a direct obstruction of the arrival of oxygen and nutrients to the retinal microcirculation and therefore to the cells of the retina. This leads to tissue ischemia and cellular necrosis that affects both photoreceptors and Müller cells among others. In addition, ischemia triggers a cascade of cellular events, including the synthesis and release of a greater amount of vascular endothelial growth factor (VEGF) whose main function is the proliferation of new vessels that can supply They don't work anymore.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • leukocytes Several studies have shown an important participation of leukocytes in the pathogenesis of diabetic retinopathy.
  • Acetylsalicylate does not have a direct inhibitory effect on leukocytes, that is, neither destroys them nor modulates their arrival in the tissues. But it can interfere with other processes such as blocking enzymatic cascades that promote the synthesis and release of interleukins that act as chemotactic factors, in addition to reducing the vascular and endothelial damage that occurs in this pathology, which would also reduce the pro-inflammatory environment. existing in the tissue.
  • CD18 is a protein present on the surface of leukocytes and whose main function is to serve as an anchor to the vascular endothelium before migrating from here into the tissues.
  • a selective antibody against CD18 with the purpose of assessing whether salicylate produces any change in the global number of leukocytes that infiltrate the retina.
  • ranibizumab is only indicated for the treatment of macular edema secondary to diabetic retinopathy
  • salicylate has demonstrated a preservation effect on the intraretinal vascular network, which suggests that its application would not only allow to control and improve macular edema but also avoid ischemia of the most peripheral retina having a therapeutic value for all patients with diabetic retinopathy, whether they have macular edema, vascular alterations or retinal ischemia.
  • the tissues were carefully analyzed for signs of drug toxicity such as destructuring of the retinal layers, absence of photoreceptor cells or histological alterations of the optic nerve. No signs were found in any tissue that showed alterations suggestive of toxicity.
  • a solution of lysine actelisalicylate can be made to reach infraocular concentrations in the range of 15 to 30 mg / dl, more preferably seeking a concentration of 25 mg / dl (0.25 mg / ml).
  • D Cmax x Vd
  • a dose of the active substance between 0.6 mg and 1.2 mg can be used, a dose of 0.9 mg being preferable.
  • the concentration of the resulting solution should preferably be between 12 mg / ml and 24 mg / ml and more preferably 18 mg / ml, with a minimum injection volume of 0.05 ml (How to give intravitreal injections. ME Wilson, AW Scott. AAO Eyenet. 2013) and a pH of 6.
  • the described solution can be prepared as follows:
  • composition sterile solution.
  • Material 1.5 ml syringes, needles, 0.22 micron filter, sterile bottle.
  • the label shall indicate the route of administration, the active substance, the final concentration, the date of preparation, the type of preservation and the expiration date.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea para el tratamiento de la retinopatía diabética.

Description

ACETI LSALI C I LATO DE LISINA INTRAVÍTREO COMO TRATAMIENTO DE LA
RETINOPATÍA DIABÉTICA.
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea para el tratamiento de la retinopatía diabética. ESTADO DE LA TÉCNICA
La retinopatía diabética es la principal causa de ceguera legal en personas de edad inferior a 50 años en los países desarrollados y una de las principales causas de ceguera a nivel mundial. La diabetes mellitus afecta entre el 6 y el 18% de la población en España, una tercera parte tienen retinopatía diabética y una tercera parte a su vez tienen edema macular diabético, principal causa de pérdida de visión en los pacientes diabéticos. La OMS estima que existen 346 millones de diabéticos en todo el mundo.
Al inicio de la diabetes tipo 1 sólo entre el 0 y el 3% presenta algún grado de retinopatía diabética, pero el 67, 1 % de estos pacientes la padece antes de los 5 años de evolución de su diabetes. En el caso de la diabetes tipo 2 entre el 6 y el 30% de los pacientes ya presenta retinopatía en el momento del diagnóstico y en los casos de más de 20 años de evolución la prevalencia de la retinopatía diabética es del 82%.
Hasta el momento hay tres fármacos comercializados que se utilizan para el tratamiento del edema macular diabético (EMD) que presentan algunos pacientes con retinopatía diabética. Uno de ellos es ranibizumab (Lucentis®), un fragmento de inmunoglobulina humanizada cuya acción fundamental es el bloqueo de todos los subtipos del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF). La lesión de los pequeños vasos sanguíneos (microangiopatía) que sucede en el transcurso de la retinopatía diabética deja sin flujo sanguíneo a los tejidos dañados produciendo isquemia. Estos tejidos isquémicos expresan moléculas angiogénicas con el objetivo de formar nuevos vasos que aporten nutrientes y solucionen la isquemia. Estos nuevos vasos son de carácter inmaduro y lejos de aportar adecuados flujos sanguíneos que permitan la supervivencia del tejido presentan una alta permeabilidad vascular contribuyendo al edema que se forma en la mácula. Ranibizumab bloquea la angiogénesis inducida por el VEGF-A produciendo una regresión de los neovasos e induciendo con ello mejoras del edema retiniano. No obstante no modifica el curso evolutivo de la patología en tanto en cuanto no resuelve la isquemia ni modifica otras circunstancias y acontecimientos moleculares que hoy conocemos que ocurren en la retinopatía diabética. Otro de los fármacos es el aflibercept (Eylea®) que actúa de manera similar a ranibizumab pero inhibiendo a su vez otra molécula además del VEGF-A, como es el PIGF (factor de crecimiento placentario); este fármaco presenta efectos comparables a ranibizumab y también las mismas limitaciones. Otra opción terapéutica indicada es un esferoide, dexametasona, que se administra en inyección intravítrea en un dispositivo de liberación sostenida (Ozurdex®) aprobado para su uso como fármaco de primera línea o en caso de fracaso de los anti-VEGF anteriores. Está en vías de comercialización otro sistema de liberación sostenida de otro esferoide, en este caso fluocinolona (lluvien®). Ambos esferoides tienen como inconveniente la alta tasa de efectos secundarios que inducen, tales como aumento de la presión infraocular y cataratas. Fuera de indicación se ha utilizado también bevacizumab (Avastin®) que es un inhibidor de todas las isoformas del VEGF; que aunque existen evidencias de no inferioridad respecto a ranibizumab carece de aprobación oficial para su uso infraocular. Existen evidencias científicas que avalan la relevancia de fenómenos celulares inflamatorios en la patogenia de la retinopatía diabética, por ello productos con acción anti-inflamatoria como los esferoides o la invención que nos ocupa adquieren especial utilidad y relevancia especialmente por su eficacia en fases más avanzadas de la enfermedad donde los fenómenos inflamatorios son muy importantes.
Son cada vez más los estudios histoquímicos que demuestran que existe un problema inflamatorio de base que actúa como principal factor desencadenante de la retinopatía diabética atrayendo a las células especializadas en la respuesta inflamatoria, los leucocitos, y conduciendo con el tiempo a un fracaso y pérdida del endotelio vascular, un aumento de la permeabilidad vascular (causante de edema) y aumento de la agregación plaquetaria (contribuyendo a la obliteración de los vasos y a la isquemia retiniana).
Por otro lado, a diferencia del ranibizumab, el acetilsalicilato es capaz de actuar sobre diversas dianas terapéuticas implicadas en la inflamación; dianas que están presentes incluso en fases muy precoces de esta patología. Por tanto, el acetilsalicilato se presenta como un fármaco potencialmente útil en estadios iniciales y avanzados de la retinopatía diabética. Se ha descrito el uso del ácido acetil salicílico vía oral en el contexto de la retinopatía diabética tanto con perfil preventivo como terapéutico (ver L Zheng, SJ Howell, DA Hatala, K Huang, T S Kern. Salicylate-based anti-inflammatory drugs inhibit the early lesión of diabetic retinopathy. Diabetes 2007; 56:337-335. W Sun, C Gerhardinger, Z Dagher, T Hoehn, M Lorenzi. Aspirin at low-intermediate concentrations protects retinal vessels in experimental diabetic retinopathy through non-platelet-mediated effects. Diabetes 2005; 54:3418-3426. TS Kern, RL Engerman. Pharmacological inhibition of diabetic retinopathy, aminoguanidine and aspirin. Diabetes 2001 ; 50: 1636-1642.). De forma que se ha demostrado que existe un efecto beneficioso del salicilato sobre el curso evolutivo de la enfermedad y ningún efecto contraproducente sobre ella. No obstante se basa en el uso por vía oral del salicilato tanto en humanos como en animales lo que supone en muchos casos dosis altas y no tolerables con efectos adversos frecuentes y potencialmente graves.
Se ha descrito una composición de ácido acetil salicílico (AS) y aceite de silicona (SiO) de uso intravítreo (ver, por ejemplo, Kralinger M. T et al Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 2001 ;239:208-216). En casos de retinopatía diabética muy avanzada que genera complicaciones muy graves en la retina como desprendimientos fracciónales, roturas y proliferación fibrovascular se hace preciso la intervención quirúrgica. Esta intervención supone la eliminación del humor vitreo del paciente (vitrectomía), la eliminación de los tejidos fibrovasculares anómalos existentes en la retina de estos pacientes y la colocación de un sustituto del humor vitreo. El aceite de silicona se utiliza para sustituir el vitreo en estos casos. El SiO se caracteriza por ser un elemento denso, inerte y estable que ayuda a mantener la retina correctamente aplicada. Es un medio inmiscible para todo tipo de sustancias bien sean fármacos o moléculas inflamatorias y angiogénicas impidiendo que estas puedan difundir a través de la cavidad vitrea. No tiene ninguna acción química sobre la retina, no es capaz de actuar como reservorio de fármacos y no es útil como solvente (Abrams GW, Azen SP, McCuen BW, Flynn H, Lai MY, Ryan SJ, Silicone Study Group: Vitrectomy with silicone oil or long-acting gas in eyes with severe proliferative vitreoretinopathy: Results of additional long-term follow-up (Silicone Study Report #11). Archives of Ophthalmology 1 15: 335-344, 1997.;.
Así pues sería deseable disponer de una composición para la administración intravítrea de acetil salicilato destinada al tratamiento de la retinopatía diabética que pueda ser inyectada en presencia de humor vitreo, es decir, que pueda administrarse en fases menos avanzadas de la enfermedad con el fin de evitar la progresión de la enfermedad e impedir que los pacientes precisen la cirugía. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha mencionado anteriormente, para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea para el tratamiento de una enfermedad de la retina. En otra realización la invención se refiere a la composición tal y como se ha definido anteriormente, para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de edema macular uveítico, vitritis, retinitis no infecciosa, retinocoroiditis no infecciosa, vitreorretinopatía proliferativa, síndrome de Irving-Gass crónico, coriorretinopatía serosa central crónica y retinopatía diabética; y preferiblemente para el tratamiento de la retinopatía diabética.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición en el humor vitreo.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición. En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde el pH de la composición es de entre 6 y 6,2; y preferiblemente donde el pH de la composición es de 6. En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición; y
el pH de la composición es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composición es de 6.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, que además comprende suero salino fisiológico, y preferiblemente que además comprende entre 2,6 mi y 5,6 mi de suero salino fisiológico.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, que además comprende agua, y preferiblemente que además comprende 5 mi de agua.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición; y
que además comprende suero salino fisiológico, y preferiblemente que además comprende 2,6 mi, 4,5 mi ó 5,6 mi de suero salino fisiológico.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición;
el pH de la composición es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH es de 6; y que además comprende suero salino fisiológico, y preferiblemente que además comprende 2,6 mi, 4,5 mi ó 5,6 mi de suero salino fisiológico.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición; y
que además comprende agua, y preferiblemente que además comprende 5 mi de agua.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición;
el pH de la composición es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composición es de 6; y
que además comprende agua, y preferiblemente que además comprende 5 mi de agua.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición;
que además comprende suero salino fisiológico, y preferiblemente que además comprende 2,6 mi, 4,5 mi ó 5,6 mi de suero salino fisiológico; y que además comprende agua, y preferiblemente que además comprende 5 mi de agua.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición;
el pH de la composición es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composición es de 6;
que además comprende suero salino fisiológico, y preferiblemente que además comprende 2,6 mi, 4,5 mi ó 5,6 mi de suero salino fisiológico; y
que además comprende agua, y preferiblemente que además comprende 5 mi de agua.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición, y preferiblemente donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición;
el pH de la composición es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composición es de 6;
que además comprende suero salino fisiológico, y preferiblemente que además comprende 2,6 mi, 4,5 mi ó 5,6 mi de suero salino fisiológico; y
que además comprende agua, y preferiblemente que además comprende 5 mi de agua,
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de la retina, preferiblemente para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de edema macular uveítico, vitritis, retinitis no infecciosa, retinocoroiditis no infecciosa, vitreorretinopatía proliferativa, síndrome de Irving-Gass crónico, coriorretinopatía serosa central crónica y retinopatía diabética; y más preferiblemente para el tratamiento de la retinopatía diabética. En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde la cantidad total de ácido acetilsalicílico inyectado en el humor vitreo es de entre 0,6 mg y 1 ,2 mg. En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde la cantidad total de ácido acetilsalicílico inyectado en el humor vitreo es de 0,6 mg, 0,9 mg ó 1 ,2 mg.
En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde:
la cantidad total de ácido acetilsalicílico inyectado en el humor vitreo es de entre 0,6 mg y 1 ,2 mg; y
el volumen final de la composición es de al menos 0,05 mi. En otra realización la invención se refiere al uso de la composición tal y como se ha definido anteriormente, donde la cantidad total de ácido acetilsalicílico inyectado en el humor vitreo es de 0,6 mg, 0,9 mg ó 1 ,2 mg; y
el volumen final de la composición es de al menos 0,05 mi. El uso de lisina como ingrediente de la composición favorece la solubilidad y mejora la estabilidad del principio activo formando la sal de acetilsalicilato de lisina.
La composición se puede utilizar en pacientes en los que no ha sido necesario extraer el humor vitreo. El humor vitreo actúa como reservorio de fármacos de forma que favorece la persistencia y la difusión del acetilsalicilato de lisina de la invención en el interior del ojo.
Como se ha mencionado anteriormente, la composición de la invención se administra de forma parenteral intravítrea. Así, las preparaciones inyectables, de acuerdo con la presente invención, para la administración parenteral, comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones estériles, en un solvente acuoso o no acuoso como propilenglicol, polietilenglicol o aceites vegetales. Estas composiciones pueden también contener coadyuvantes, como humectantes, emulsionantes, dispersantes y conservantes. Podrían ser esterilizadas por cualquiera de los métodos conocidos o preparadas como composiciones sólidas estériles que serán disueltas en agua o cualquier otro medio inyectable estéril inmediatamente antes del uso. También es posible partir de materias primas estériles y mantenerlas en estas condiciones durante todo el proceso de fabricación. La composición mencionada se puede preparar siguiendo el procedimiento que se detalla a continuación:
Forma farmacéutica: solución estéril.
Fórmula:
Acetilsalicilato de lisina 900 mg
Agua para inyección 5 mi
Suero salino fisiológico 6 mi
Material: Jeringas 1 ,5 mi, agujas, filtro 0,22 mieras, frasco estéril.
Elaboración: En campana de flujo laminar,
1. Cargar 5 mi de agua estéril para inyección e inyectar en el vial que contiene 900 mg de acetilsalicilato de lisina. Agitar levemente hasta disolución completa. Obteniéndose una concentración de ácido acetilsalicílico de 100 mg/ml de composición = Acetilsalicilato de lisina 180 mg/ml de composición.
2. Para una solución de 12 mg/ml: cargar 0,4 mi (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolución obtenida e introducir en un vial estéril, añadir 5,6 mi de suero salino fisiológico, con un pH resultante de 6. 3. Para una solución de 24 mg/ml: cargar 0,4 mi (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolución obtenida e introducir en un vial estéril, añadir 2,6 mi de suero salino fisiológico, con un pH resultante de 6.
4. Para una solución más preferible de 18 mg/ml: cargar 0,5 mi (90 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolución obtenida e introducir en un vial estéril, añadir 4,5 mi de suero salino fisiológico, con un pH resultante de 6.
5. El preparado final se filtrará (filtro 0,22 mieras) antes de envasarlo en la jeringa de 1 mi, que se cargará con un volumen de 0,05 mi y se tapará con un tapón estéril. 6. Envasar y etiquetar. La etiqueta indicará la vía de administración, el principio activo, la concentración final, la fecha de preparación, el tipo de conservación y la caducidad
Envasado: Jeringa de volumen adecuado.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1 representa el corte histológico teñido con H&E de retina central (obsérvese el nervio óptico en la parte central de la imagen).
FIG. 2 representa el corte histológico teñido con H&E de retina periférica. FIG. 3 representa el corte histológico teñido con H&E donde se señalan la capa de células ganglionares (flecha de abajo) y capa plexiforme externa (flecha de arriba).
FIG. 4 representa la correlación y el resultado del test de Spearman de la retina central plexiforme externa: n=50; r=0,341 ; p=0,015. Lo que significa que la correlación entre ambos es baja (el coeficiente de determinación que sería r2 es 0,1 16; es decir, el 1 1 ,6% de la variabilidad de los datos se explica por la relación entre ambas variables).
FIG. 5 representa la correlación y el resultado del test de Spearman de la retina central ganglionar: n=50; r=0,803; p<0,001. Lo que significa que la correlación entre ambos es alta (el coeficiente de determinación que sería r2 es 0,645; es decir, el 64,5% de la variabilidad de los datos se explica por la relación entre ambas variables).
FIG. 6 representa la correlación y el resultado del test de Spearman de la retina periférica plexiforme externa: n=50; r=0,005; p=0,973. Lo que significa que la correlación entre ambos es baja, casi nula (el coeficiente de determinación que sería r2 es 0,000025; es decir, el 0,0025% de la variabilidad de los datos se explica por la relación entre ambas variables).
FIG. 7 representa la correlación y el resultado del test de Spearman de la retina periférica ganglionar: n=50; r=0,737; p<0,001. Lo que significa que la correlación entre ambos no es muy alta (el coeficiente de determinación que sería r2 es 0,543; es decir, el 54,3% de la variabilidad de los datos se explica por la relación entre ambas variables). FIG. 8 representa la relación entre ICAM1 y vasos de la retina central ganglionar: n=50; r=0,616; p<0,001. Lo que significa que la correlación entre ambos no es muy alta (el coeficiente de determinación que sería r2 es 0,379; es decir, el 37,9% de la variabilidad de los datos se explica por la relación entre ambas variables). FIG. 9 representa la relación entre ICAM1 y vasos de la retina periférica ganglionar: n=50; r=0,341 ; p=0,015. Lo que significa que la correlación entre ambos es baja (el coeficiente de determinación que sería r2 es 0, 116; es decir, el 1 1 ,6% de la variabilidad de los datos se explica por la relación entre ambas variables). EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
EJEMPLO 1
Objetivos
Valorar los efectos de la inyección intravítrea de una solución de acetilsalicilato de lisina en un modelo experimental de retinopatía diabética sobre 3 variables histológicas en la retina de los animales tratados comparándolos con un grupo control. Las variables elegidas que han demostrado en diversos estudios estar afectadas de forma primordial en la retina diabética son:
1. Marcador leucocitario CD18: el leucocito es la célula efectora principal de la respuesta inflamatoria de los tejidos, cosa que también sucede en la retina. El CD18 es una molécula de superficie que se expresa en las membranas de los leucocitos activados en tejidos donde existe inflamación como es el caso de la retina diabética. Determinar su número absoluto y relativo ayuda a conocer si la solución inyectada es capaz de reducir la presencia de leucocitos activados en determinadas capas de la retina como parte de su acción antiinflamatoria.
2. Marcador endotelial ICAM-1 : las células endoteliales que tapizan los vasos sanguíneos en su interior han demostrado estar afectadas en la retinopatía diabética y por esta razón tienen una gran relevancia en la patogenia de la enfermedad. La ICAM- 1 es una proteína transmembrana presente en las células endoteliales y prácticamente específica de ellas. Su mareaje inmunohistoquímico permite señalizar y valorar cuantitativamente a las células endoteliales presentes en las distintas capas de tejido estudiadas y nos da información acerca de la vascularización de los tejidos estudiados y de la integridad de la pared vascular. 3. Densidad vascular: la inflamación crónica causada en la retinopatía diabética conlleva a una obliteración y muerte de los vasos sanguíneos. Esto deja áreas más o menos extensas de tejido sin recibir ningún tipo de aporte sanguíneo. Este escenario es un estadio final del fenómeno conocido como microangiopatía diabética. Por ello determinar el número de vasos presentes en cada sección de tejido nos puede dar información acerca de si el fármaco es capaz o no de influir positiva o negativamente en la densidad capilar de la retina (vasos/porción de tejido).
Metodología 1. Modelo experimental
Con la aprobación del comité de bioética para la investigación de la Universidad Miguel Hernández de Elche y basado en los estándares internacionales para el uso de animales de experimentación, 14 especímenes estabulados de Rata Wistar Macho de unos 200 gramos de peso fueron inducidos a padecer diabetes mediante la inyección de estreptozotocina intraperitoneal (75 mg/kg) en una única dosis. Los animales fueron monitorizados durante todo el estudio en constantes como el peso, la glucemia, pérdida de cabello y formación de catarata. Todos los animales fueron expuestos a los mismos parámetros de luz, oscuridad y disponibilidad de agua y alimento. 2. Técnica de Inyección intravítrea
Para la inyección intravítrea los animales fueron anestesiados con una mezcla a proporción 1 : 1 de xylazina hidrocloruro (4 mg/kg) y ketamina hidrocloruro (10 mg/kg). Bajo midriasis con tropicamida al 0,5% se realizó la inyección intravítrea de la solución de acetilsalicilato de lisina bajo microscopio quirúrgico con jeringa de micro inyección (Hamilton Co., Reno, NV) y aguja de 32 gauge a 1 milímetro del limbo temporal. Sólo la mitad de los animales diabéticos fueron tratados con la solución intravítrea, en el resto de los animales se dejó evolucionar la retinopatía diabética de forma natural. El "proceso de inyección intravítrea se repitió en la misma forma, técnica y dosis en los mismos animales 4 semanas después del tratamiento inicial. Resumen de la organización del ensayo experimental:
- Inicialmente se evaluaron los animales antes de incluirlos en el ensayo experimental para descartar aquellos con taras o alteraciones oculares de base.
- Se realizó la inducción de diabetes en todos los animales mediante la inyección de estreptozocina intraperitoneal. - Se comprobaron los índices glucémicos a las 24 y 48 horas de la inyección para valorar si la inducción había tenido éxito.
- Una vez confirmada la diabetes se dividió a los animales en dos grupos formados por 8 ratas cada uno.
- Siguiendo el modelo de retinopatía diabética en rata se dejó evolucionar la diabetes de modo natural en ambos grupos durante las primeras 12 semanas. Es en este periodo donde se ha demostrado que comienzan a aparecer los signos de retinopatía diabética.
- En este momento a uno de los grupos se realiza una inyección intravítrea en los dos ojos de cada animal de acetilsalicílico en una dilución con lisina.
- A las 4 semanas (semana 16 de la inducción) se repite la inyección intravítrea de salicilato en el mismo grupo de animales. - A las 4 semanas de la última inyección (20 semanas tras inducción) se sacrifican los animales de ambos grupos. 3. Cálculo de dosis y preparación de la solución
No existen referencias ni estudios dosimétricos realizados hasta la fecha para efectuar este cálculo. No obstante podemos realizar la siguiente aproximación:
Rango terapéutico:
Acción analgésica y antipirética 2,5-5,0 mg/dl
Acción antiinflamatoria 15-30 mg/dl
Rango tóxico:
40-50 mg/dl Con una concentración de 25 mg/dl (0,25 μ9/μΙ) en la biofase podríamos cubrir un rango terapéutico adecuado para valorar la existencia de efectos significativos en las variables a estudio.
El volumen de humor vitreo existente en el ojo de la rata adulta es de 56,5 + 2 microlitros. (Oxygen Distribution in the Mouse Retina. Dao-Yi Yu and Stephen J. Cringle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; vol. 47; 1 109-11 12)
Si se plantea un modelo farmacodinámico monocompartimental en el que consideramos Cmax como la concentración buscada en la biofase y Vd (volumen de distribución) como el volumen de humor vitreo en el que el fármaco va a ser inyectado. Con ello se obtiene la dosis necesaria a administrar del fármaco:
Cmax = D/Vd, despejando D = Cmax x Vd
D = 0,25 Mg/μΙ x 57 μΙ = 14,3 μg
Por tanto para alcanzar una concentración terapéutica de acetilsalicilato en el vitreo de la rata tenemos que inyectar unos 15 microgramos de fármaco. No obstante no podemos olvidar que el ojo no sigue un modelo monocompartimental estricto ya que tras la inyección del fármaco existe cierta difusión del mismo a cristalino y humor acuoso de manera que es probable que nos enfrentemos a un volumen de distribución superior a lo considerado inicialmente. Si consideramos que el cristalino de la rata tiene un volumen superior al del vitreo es muy probable que el volumen de distribución real sea más próximo a 100 microlitros en cuyo caso la dosis a emplear para mantenerse en rango terapéutico estaría en 25 microgramos de salicilato que se preparó en 5 μΙ de solución a una concentración de 5 μΙ/ g (o 5 mg/ml). Para evitar que la composición se degrade decidimos inyectar la solución inmediatamente después de su preparación. La solución utilizada en el ensayo experimental puede ser preparada de la siguiente manera:
Forma farmacéutica: solución estéril.
Fórmula:
Acetilsalicilato de lisina 900 mg
Agua para inyección 5 mi
Suero salino fisiológico 9,5 mi
Material: Jeringas 1 ,5 mi, agujas, filtro 0,22 mieras, frasco estéril.
Elaboración: En campana de flujo laminar,
1. Cargar 5 mi de agua estéril para inyección e inyectar en el vial que contiene 900 mg de acetilsalicilato de lisina. Agitar levemente hasta disolución completa. Obteniéndose una concentración de ácido acetilsalicílico de 100 mg/ml de composición = Acetilsalicilato de lisina 180 mg/ml de composición.
2. Cargar 0,5 mi (90 mg de acetilsalicilato de lisina) de la disolución obtenida e introducir en un vial estéril, añadir 17,5 mi de suero salino fisiológico, obteniéndose una concentración de 5 mg/ml de composición (5 μ9/μΙ) con un pH de 6.
3. El preparado final se filtrará (filtro 0,22 mieras) antes de envasarlo en la jeringa tipo Hamilton, que se carga con un volumen de 5 μΙ y se tapa con un tapón estéril.
4. Envasar y etiquetar. La etiqueta indicará la vía de administración, el principio activo, la concentración final, la fecha de preparación, el tipo de conservación y la caducidad
Envasado: Jeringa de volumen adecuado. 4. Estudio Inmunohistoquímico
Se realizaron secciones laminares de la retina de todos los animales, siendo sometidos a la acción de agentes conservantes tipo formaldehído al 4%. Para el mareaje de las células endoteliales se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-ICAM1 , asimismo utilizamos anticuerpos monoclonales anti-CD18 para el mareaje de los leucocitos. Posteriormente a la fijación de las distintas secciones de tejido teñidas se procedió al contaje de las moléculas marcadas positivamente así como de la cantidad de vasos sanguíneos presentes bajo microscopio óptico (Leica® microsystem) en aumento de 10X.
A fin de valorar diferencias significativas entre las distintas regiones de la retina, en todos los tejidos se realizaron por separado los recuentos celulares y vasculares correspondientes a la retina central (comprendida entre nervio óptico y el área macular) y los correspondientes a la retina periférica (por fuera de las arcadas vasculares). Estos recuentos se realizaron de forma concreta sobre dos capas de la retina: la capa plexiforme externa y la capa de células ganglionares. Ambas capas retinianas son las que han demostrado mayor implicación en la etiología inflamatoria y afectación vascular en la retinopatía diabética (ver figura 1 , figura 2 y figura 3).
5. Estudio estadístico
Se utilizó la prueba de contraste U Mann-Whitney para muestras independientes. Para contrastar la correlación entre las variables se ha utilizado el test de Spearman.
Resultados
Para el análisis se incluyeron 108 muestras de tejido, 56 correspondientes a los especímenes tratados con el fármaco intravítreo y 52 correspondientes a los animales no tratados y en los que la retinopatía diabética evolucionaba de forma natural.
Retina central
En la capa plexiforme externa de la retina central existen significativamente mayor recuento de CD18, ICAM-1 y densidad vascular en los animales tratados, igualmente sucede en la capa ganglionar excepto en el caso del CD18 donde existe un mayor recuento en los animales control.
Retina periférica
En la capa plexiforme externa de la retina periférica ocurre también un incremento significativo en el recuento de todas las variables en el grupo tratado respecto al grupo control. En la capa ganglionar existe un mayor recuento de ICAM-1 en el grupo tratado y también una mayor densidad de vasos. De forma similar a lo que sucede en la retina central el recuento de CD18 en la capa ganglionar no es significativo de diferencia entre un grupo y otro (ver resultados en Tabla 1).
Figure imgf000018_0001
* Prueba de U Mann-Whitney para muestras independientes
Tabla 1
Se ha estudiado la posible relación entre CD18 y vasos. En los controles no hay ninguna relación entre ambas variables, pero sí la hay en los tratados.
La figura 4, figura 5, figura 6 y figura 7 muestran la correlación y el resultado del test de Spearman. Se ha estudiado también la relación entre ICAM1 y vasos. Solo hay relación en casos para las capas ganglionares (ver figura 8 y figura 9)
Dado que únicamente parece que puede haber una relación entre CD18 y vasos para las capas plexiforme y ganglionar tanto de retina central como de retina periférica para los animales tratados, se buscó un modelo que intentase explicar dicha relación en estos supuestos. El modelo se hizo mediante una regresión lineal:
- Retina central : CD18 = 0,950 + 0,800*Vasos (p= 0,002)
- Retina periférica : CD18 = 1,066 + 0,536*Vasos (p<0,001)
Discusión
ICAM-1
Uno de los principales problemas de la evolución natural de la retinopatía diabética es la muerte y desaparición de las células del endotelio vascular, lo que conduce a una alteración en la integridad de los vasos y a un incremento de su permeabilidad. La molécula transmembrana ICAM-1 se expresa de forma casi exclusiva en la pared celular del endotelio vascular, siendo elemento de vinculación y comunicación entre la célula endotelial y otras células procedentes del flujo sanguíneo y que contienen ligandos específicos para esta proteína. La marcación inmunohistoquímica de las ICAM-1 que se ha realizado pone de manifiesto que existe un contaje significativamente más alto de células endoteliales en los animales tratados respecto a los que no recibieron ninguna dosis de salicilato intravítreo; esto demostraría un efecto beneficioso del tratamiento sobre la supervivencia de las células endoteliales respecto al grupo control. Este dato se mantiene significativo en todas las secciones de retina estudiadas tanto en los correspondientes al área macular como en la retina más periférica.
Un mayor número de células endoteliales supondría una mayor integridad de la función de barrera del endotelio y por tanto un mayor control de la permeabilidad vascular, esto evoca un efecto beneficioso directo del fármaco sobre el tratamiento del edema macular en la retinopatía diabética. Densidad Vascular
La obliteración de la pared vascular es otro de los fenómenos más dañinos de todos los que acontecen en la retinopatía diabética. Conduce a una obstrucción directa de la llegada de oxígeno y nutrientes a la microcirculación retiniana y por tanto a las células de la retina. Esto conduce a una isquemia del tejido y una necrosis celular que afecta tanto a fotorreceptores como células de Müller entre otras. Además la isquemia desencadena una cascada de eventos celulares entre los que destacan la síntesis y liberación de una mayor cantidad de factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF por sus siglas en inglés) cuya función principal es la proliferación de vasos nuevos que puedan suplir a los que ya no funcionan. El problemas es que por un lado estos neo-vasos que crecen en la superficie interna de la retina no sólo no cumplen con su hipotética función sino que inducen complicaciones serias para la retina tales como sangrados constantes que inundan el humor vitreo así como la llegada de células gliales a su superficie formando grandes "puentes" de proliferación fibrovascular que pueden inducir un desprendimiento de la retina debido a la tracción que ejercen sobre ella. Otro de los efectos de una mayor producción de VEGF es el incremento de la permeabilidad vascular que se ha asociado al mismo y su implicación en la formación del edema macular diabético.
El número de vasos funcionales y con contenido celular en su luz es significativamente superior en cada sección de tejido y en cada capa de retina incluida en el estudio, en el grupo de los animales tratados con salicilato. Esto demuestra una acción vasoprotectora del fármaco lo que podría tener un importante repercusión sobre la evolución natural de la retinopatía diabética, impidiendo no sólo la aparición de la isquemia retiniana tanto periférica como central o macular, sino también con implicaciones sobre el desarrollo del edema macular.
CD18
Diversos trabajos han evidenciado una participación importante de los leucocitos en la patogenia de la retinopatía diabética. La destrucción de las células endoteliales, la aparición de áreas de retina isquémicas, la presencia de un aumento de permeabilidad en los vasos y consecuentemente a ello la aparición de edema y exudados, promueven la síntesis y liberación de citocinas que actúan como factores quimiotácticos llamando a las células implicadas directamente en la inflamación: los leucocitos.
El acetilsalicilato no tiene un efecto inhibitorio directo sobre los leucocitos, es decir, ni los destruye ni modula su llegada a los tejidos. Pero sí puede interferir en otros procesos como el bloqueo de cascadas enzimáticas que promueven la síntesis y liberación de interleucinas que actúan como factores quimiotácticos, además de reducir el daño vascular y endotelial que acontece en esta patología, lo que también reduciría el ambiente pro-inflamatorio existente en el tejido.
El CD18 es una proteína presente en la superficie de los leucocitos y cuya función principal es servirle de anclaje al endotelio vascular antes de migrar desde aquí hacia el interior de los tejidos. En nuestro estudio utilizamos un anticuerpo selectivo frente a CD18 con el propósito de valorar si el salicilato produce algún cambio en el número global de leucocitos que infiltran la retina.
El test de correlación de Spearman encuentra una relación significativa y directamente proporcional entre la densidad vascular y el recuento de CD18. Se puede establecer una relación matemática entre esos dos factores con la siguiente fórmula:
Retina central: CD18 = 0,950 + 0,800*Vasos (p= 0,002)
Retina periférica: CD18 = 1,066 + 0,536*Vasos (p<0,001)
Si atendemos al modelo matemático de correlación, por cada vaso existente en cada sección de tejido de la capa plexiforme de la retina central deberían existir unos 2 leucocitos (1 ,75), sin embargo esto sólo se cumple en los animales control donde observamos un rango de contaje de vasos de entre 1-3 y un rango de contaje de leucocitos CD18 de entre 4-8. En los animales tratados el rango de vasos por sección de tejido oscila entre 3-6 con una media de 5 mientras que el recuento de CD18 oscila entre 3-6 con una media de 5. Por tanto, según la correlación matemática lo esperable es que en la retina central de los animales tratados existieran al menos 10 leucocitos de media por campo (teniendo en cuenta que la relación esperable entre ambas variables es de 2 leucocitos / 1 vaso). Es decir, en términos absolutos existen más leucocitos por campo en el grupo tratado pero en términos correlativos al número de vasos por campo existen la mitad de los leucocitos que cabría esperar si el grupo tratado hubiera evolucionado como el grupo control. Esto indica una inhibición real del número de leucocitos en el grupo tratado con salicilato.
Con todos los datos anteriores parece claro que existe un efecto principal del fármaco sobre el mantenimiento de la integridad endotelial y vascular lo que puede tener implicaciones importantes sobre la evolución natural y el pronóstico de la enfermedad tanto en lo que se refiere al edema macular como a la isquemia retiniana. Además los estudios de correlación ponen de manifiesto que existe una reducción significativa del número de leucocitos CD18 respecto a lo esperable dada la abundante y bien conservada red vascular en los animales tratados.
Según el estudio Wisconsin la prevalencia a 20 años de edema macular en diabéticos tipo 1 es del 29% y en tipo 2 del 28% siendo este porcentaje de pacientes el único susceptible de tratamiento farmacológico con ranibizumab.
Por tanto, mientras que ranibizumab sólo está indicado para el tratamiento del edema macular secundario a la retinopatía diabética el salicilato ha demostrado un efecto de preservación en la red vascular intrarretiniana lo que hace pensar que su aplicación no sólo permitiría controlar y mejorar el edema macular sino también evitar la isquemia de la retina más periférica teniendo un valor terapéutico para la totalidad de los pacientes con retinopatía diabética bien tengan edema macular, alteraciones vasculares o isquemia retiniana.
Por otro lado, se analizaron cuidadosamente los tejidos en busca de signos de toxicidad del fármaco tales como desestructuración de las capas retinianas, ausencia de células fotorreceptoras o alteraciones histológicas del nervio óptico. En ningún tejido se encontraron signos que evidenciaran alteraciones sugestivas de toxicidad.
EJEMPLO 2
Teniendo en cuenta que el volumen de humor vitreo en humanos es de 4 mi (J Sebag. Vitreous anatomy, aging, and anomalous posterior vitreous detachment. Encyclopedia of the Eye. 2010;307-315.) y siguiendo la metodología y las evidencias experimentales descritas en el ejemplo 1 se puede elaborar una solución de actelisalicilato de lisina para alcanzar concentraciones infraoculares en rango de 15 a 30 mg/dl, buscando más preferiblemente una concentración de 25 mg/dl (0,25 mg/ml). D = Cmax x Vd
D = [0,15-0,30] mg/ml x 4 ml
Para preparar la solución de acetilsalicilato de lisina destinada a su inyección en el vitreo humano se puede utilizar una dosis del principio activo de entre 0,6 mg y 1 ,2 mg siendo preferible una dosis de 0,9 mg. La concentración de la solución resultante debe ser preferentemente de entre 12 mg /mi y 24 mg/ml y más preferiblemente de 18 mg/ml, con un volumen mínimo de inyección de 0,05 mi (How to give intravitreal injections. ME Wilson, AW Scott. AAO Eyenet. 2013) y un pH de 6.
La solución descrita puede ser preparada de la siguiente manera:
Forma farmacéutica: solución estéril.
Fórmula:
Acetilsalicilato de lisina 900 mg
Agua para inyección 5 mi
Suero salino fisiológico 6 mi
Material: Jeringas 1 ,5 mi, agujas, filtro 0,22 mieras, frasco estéril.
Elaboración: En campana de flujo laminar,
Cargar 5 mi de agua estéril para inyección e inyectar en el vial que contiene 900 mg de acetilsalicilato de lisina. Agitar levemente hasta disolución completa. Obteniéndose una concentración de ácido acetilsalicílico de 100 mg/ml de composición = Acetilsalicilato de lisina 180 mg/ml de composición.
Para una solución de 12 mg/ml: cargar 0,4 mi (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolución obtenida e introducir en un vial estéril, añadir 5,6 mi de suero salino fisiológico, con un pH resultante de 6.
Para una solución de 24 mg/ml: cargar 0,4 mi (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolución obtenida e introducir en un vial estéril, añadir 2,6 mi de suero salino fisiológico, con un pH resultante de 6.
4. Para una solución más preferible de 18 mg/ml: cargar 0,5 mi (90 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolución obtenida e introducir en un vial estéril, añadir 4,5 mi de suero salino fisiológico, con un pH resultante de 6. 5. El preparado final se filtrará (filtro 0,22 mieras) antes de envasarlo en la jeringa de 1 mi, que se cargará con un volumen de 0,05 mi y se tapará con un tapón estéril.
6. Envasar y etiquetar. La etiqueta indicará la vía de administración, el principio activo, la concentración final, la fecha de preparación, el tipo de conservación y la caducidad
Envasado: Jeringa de volumen adecuado.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Uso de una composición que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea.
2. - El uso de la composición según la reivindicación 1 , para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea para el tratamiento de una enfermedad de la retina.
3.- El uso de la composición según la reivindicación 2, para el tratamiento de la retinopatía diabética.
4. - El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composición y 24 mg/ml de composición.
5. - El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la concentración de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composición, de 18 mg/ml de composición o de 24 mg/ml de composición.
6. - El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el pH de la composición es de entre 6 y 6,2.
7. - El uso de la composición según la reivindicación 6, donde el pH de la composición es de 6.
8.- El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, qué además comprende suero salino fisiológico.
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