CN107708416A - 肽组合物和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了包含肽的组合物、其药物制品以及用其防止光感受器死亡和保护视网膜细胞(包括但不限于光感受器和视网膜色素上皮)免于因Fas或TRAIL介导的细胞凋亡的方法。

Description

肽组合物和使用方法
相关申请
本专利文献根据35U.S.C.§119要求于2015年5月1日提交的第62/155,711号临时美国专利申请的申请日权益，该专利申请通过引用并入本文。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及其它文献参考文献的全部内容通过引用并入本文。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以便更全面地描述本领域技术人员从本文所描述和要求保护的本发明的日期已知的现有技术。
联邦政府赞助的研究或开发
本发明在国立卫生研究院(NIH)授予的资助号R44EY022512的政府资助下完成。政府对本发明有一定的权利。
发明领域
描述了保护细胞、尤其是视网膜细胞(包括但不限于光感受器(photoreceptors)、视网膜色素上皮(RPE)和视网膜神经节细胞，其接收来自光感受器的视觉信息)免于外源通路介导的细胞死亡(诸如，Fas介导的细胞凋亡，TRAIL介导的细胞凋亡，TNF介导的细胞坏死，以及细胞焦亡)，以及使用该组合物的方法。
背景技术
诸如视网膜脱离、青光眼和黄斑变性的视力减退的几个主要原因具有细胞凋亡信号传导的重要组分，这又导致视网膜中某些非常重要的细胞类型的程序性细胞死亡。其中三种细胞类型是视网膜色素上皮细胞(其中减退可见于视网膜漂白、色素性视网膜炎和年龄相关的干性黄斑变性)、视网膜神经节细胞(其中减退可见于青光眼)和光感受器细胞本身(主要视觉信号传导细胞，且其损失是视网膜疾病视力减退的最终原因的)。
视网膜脱离(RD)被定义为神经感觉视网膜与下层RPE的分离，其导致光感受器细胞的凋亡死亡(Cook et al.1995；36(6):990-996；Hisatomi et al.Curr Eye Res.2002；24(3):161-172；Zacks et al.Invest Ophthalmol Vis Sci.2003；44(3):1262-1267.Yanget al.Invest Ophthalmol Vis Sci.2004；45(2):648-654；通过引用整体并入本文)。RD的啮齿动物和猫科动物模型证实了在视网膜与RPE分离后几乎立即激活了促凋亡通路(Cooket al.1995；36(6):990-996；Hisatomi et al.Curr Eye Res.2002；24(3):161-172；Zackset al.Invest Ophthalmol Vis Sci.2003；44(3):1262-1267.Yang et al.InvestOphthalmol Vis Sci.2004；45(2):648-654；通过引用整体并入本文)。细胞凋亡的组织学标志物如末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记(TUNEL)染色在RD后约3天达到峰值，在脱离期间持续存在凋亡活性和进行性细胞死亡。这在人类视网膜脱离中也得到验证(Arroyo etal.Am J Ophthalmol.2005Apr；139(4):605-10)。然而，修复视网膜脱离的临床经验表明，在保留一定视敏度的情况下存在修复机会的窗口，但是随着脱离和修复之间的时间延长，视敏度下降显著(Burton.Trans Am Ophthalmol Soc.1982；80:475-497；Ross etal.Ophthalmology.1998；105(11):2149-2153；Hassan et al.Ophthalmology.2002；109(1):146-152；通过引用整体并入本文)。促凋亡通路的快速激活速率和较慢的视力减退速率表明内在的神经保护因子可能在神经视网膜内被激活，并且可能用来抵消由视网膜RPE分离激活的促凋亡通路作用。
年龄相关的黄斑变性(AMD)是美国永久性视力减退的主要原因(Bourne et al.BrJ Ophthalmol.2014；98:629-638；Klein et al.Arch Ophthalmol.2011；129:75-80；Cruciani et al.Clin Ter.2011；162:e35-42)。外层视网膜(在此定义为视网膜色素上皮(RPE)和光感受器(PR)细胞的复合体)的死亡是AMD视力减退的根本原因并且限制了当前治疗的有效性(Murakami et al.Prog Retin Eye Res.2013；37:114-140；Huckfeldt andVavvas.Int Ophthalmol Clin.2013；53:105-117)。PR-RPE稳态的中断导致PR死亡。与健康对照者相比，Fas在患有被定义为湿性或萎缩性的晚期AMD的人的眼中显著表达，并且最集中于活跃的血管新生和萎缩性损伤周围(Dunaief et al.Arch Ophthalmol.2002；120:1435-1442)。RPE对于在AMD发展期间发生的应激条件(例如炎症或氧化应激)下的Fas-介导的细胞凋亡敏感，并且与年龄匹配的健康对应者相比，在AMD患者中鉴定到更高浓度的可溶性Fas配体(Jiang et al.Invest Ophthalmol Vis Sci.2008；37:114-140)。类似地，在AMD进展期间发生的氧化应激导致RPE中Fas的表达增加(Lin et al.Invest Ophthalmol VisSci.2011；52:6308-6314)，并且在氧化应激条件下发生的RPE的死亡依赖于Fas信号传导(Wang et al.Apoptosis.2012；17:1144-1155)。此外，Fas与Alu RNA积累诱导的RPE细胞死亡直接相关，Alu RNA积累是AMD病理学的另一个公认的因素(Kim et al.Proc Natl AcadSci USA.2014；111:16082-16087)。已经显示出，部分通过相同通路操作的TRAIL-R1受体(DR4)是TRAIL-R1受体(DR4)的遗传风险因子(DR4)，部分通过相同通路操作的TRAIL-R1受体(DR4)是年龄相关的黄斑变性的遗传风险因子。(Miyake et al.Invest Ophthalmol VisSci56,5353(2015))。
Fas也与青光眼相关的视网膜神经节细胞死亡有关(Gregory et al.PLoSOne.2011；6(3):e17659)。此外，眼内压(IOP)是青光眼进展的主要风险因素，并且IOP的动物模型表现出Fas和FasL表达的增加(Ju et al.Brain Res.2006；1122(1):209-221)和通过细胞凋亡的视网膜神经节细胞死亡(Ji et al.Vision Res.2005；45(2):169-179)。尽管控制眼压是青光眼临床治疗的主要原则，但是仍有相当数量的患者即使在适当控制眼压后也会继续经历疾病进展，另外的工作强化了可能需要关注青光眼的其它促成因素的观念(Kamat et al.Semin Ophthalmol.2016；31(1-2):147-154)。
细胞凋亡(程序性细胞死亡)在所有多细胞生物的发育和体内平衡中起着核心作用。凋亡通路的改变已经涉及许多类型的人类病理，包括发育障碍、癌症、自身免疫疾病，以及神经变性障碍和视网膜变性。它是控制个体细胞死亡过程的严格调控的通路，可以是外在或内在地启动。后者是由线粒体触发的细胞内机制，而前者涉及“死亡受体”与其在细胞膜上的相应配体的相互作用。因此，程序性细胞死亡通路已成为开发治疗剂的有吸引力的靶标。具体而言，由于从概念上来讲杀死细胞比维持细胞更容易，所以注意力集中在使用促凋亡剂的抗癌疗法上。然而，有许多疾病在其中不适当激活凋亡通路会导致组织变性，并且必须设计治疗来阻断在这种特定疾病病理学中内源性或外源性凋亡通路被激活。Fas受体是参与视网膜变性疾病的细胞凋亡的死亡受体中最常见的(Chinsky et al.Curr OpinOphthalmol.2014 25(3)；228-233)。Fas是一种典型的细胞因子细胞表面受体，当其与三聚体同源配体FasL结合时，通过三聚化而被激活。RD之后的应激视网膜细胞(例如光感受器)上调节Fas受体。受应激反应引诱的入侵免疫细胞在其表面表达跨膜蛋白Fas配体(FasL)。FasL与视网膜细胞上的Fas受体结合，导致外源性细胞死亡通路的快速激活，且信号通过级联反应传导。最初，“启动子”胱天蛋白酶-8被切割成活性形式，从而激活凋亡细胞死亡通路的下游“执行者”胱天蛋白酶3。然而，在小鼠巨细胞病毒感染的小鼠眼中，已显示Fas以及相关的死亡受体TNFR1和TRAIL被激活，并且该活性可导致眼细胞中的细胞凋亡、细胞坏死和细胞焦亡(Chien and Dix J Virol 86,10961(2012))。
已经显示，培养物中的光感受器细胞对由FasL诱导的细胞凋亡非常敏感，表明FasL诱导的细胞凋亡是视网膜疾病中视力减退的主要促成因素(Burton.Trans AmOphthalmol Soc.1982；80:475-497；Ross et al.Ophthalmology.1998；105(11):2149-2153；Hassan et al.Ophthalmology.2002；109(1):146-152.)。此外，来源于癌蛋白Met的Fas结合胞外域的Fas受体、Met-12、H60HIYLGAVNYIY71(SEQ ID NO：2)的小肽抑制剂Zou etal.Nature Medicine 13,1078(2007))在细胞培养实验中，以及在分离视网膜和视网膜色素上皮和其它眼部状况或疾病的环境中都被证明是光感受器保护性的(Besirli et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.,51(4):2177-84(2010)；U.S.Pat.No.8,343,931；整体通过引用并入本文)。此外，可能使用与Met-12、FasL、TNAα和TRAIL具有同源性的相同结合域的c-Met已被证明在各种肿瘤中阻断TRAIL诱导的细胞凋亡(Du et al.PLoS One 9,e95490(2014))。
Met-12肽本身具有生物药物特性，主要由其极差的水溶性所决定。实验已经清楚地表明Met-12必须作为溶液在体外和体内施用以显示最佳活性，并且已经证明在大量水性介质中生产这样的溶液是非常困难的，尤其是在可接受用于玻璃体内注射的条件下。Met-12的悬浮液或凝胶施用导致效力的极大损失。例如，甚至10mg/mL的Met-12在20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.8)中的明显澄清的溶液在过滤时显示出相当大的材料损失，并且当用于下面描述的体外和体内测定时，导致活性损失至少五倍。尽管进行了大量的开发工作，但是已经发现的Met-12的唯一溶液制剂涉及一些极低pH的溶液注射剂(<pH 2.8)或纯DMSO注射剂，所有这些用于玻璃体内注射都不是最优的。
如此，仍需要满足以下的肽组合物来帮助保持视力：其保护视网膜细胞(包括但不限于光感受器、视网膜神经节细胞和视网膜色素上皮)免于外源性通路的细胞死亡(包括Fas-和TRAIL介导的细胞凋亡)；其易于在溶液或悬浮液中配制，这种溶液或悬浮液可以能够产生足够接触而无需使用可能引起眼部(或其它)毒性的赋形剂的方式递送到眼睛中；并且其易于使用。
发明内容
本文提供了光感受器保护肽的生物活性水性制剂的药物制品，其药物制品，以及用其预防光感受器死亡的方法和治疗方法。
化合物1.His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-酰胺(SEQ IDNO:1).
一些实施方式涉及C-末端酰胺肽(化合物1(如上))或其药物可接受的盐。某些其它实施方式涉及化合物1的聚乙酸盐(polyacetate salt)。某些其它实施方式涉及化合物1的三乙酸盐。所述化合物可用于以下药物制剂中：该药物制剂用于预防眼睛的光感受器中的Fas-或TRAIL介导的细胞凋亡。所述化合物可用于以下药物制剂中：该药物制剂用于预防眼睛的视网膜色素上皮中Fas介导的细胞凋亡。所述化合物可用于以下药物制剂中：该药物制剂用于治疗视网膜脱离。所述化合物可用于以下药物制剂中：所述药物制剂用于治疗视网膜神经节细胞疾病，诸如青光眼。在一些其它实施方式中，所述化合物可用于以下药物制剂中：所述药物制剂用于治疗包括以下的眼部疾病或状况：黄斑病变/视网膜变性，诸如黄斑变性，包括年龄相关的黄斑变性(AMD)，诸如非渗出性的年龄相关的黄斑变性和渗出性的年龄相关的黄斑变性；脉络膜血管新生；视网膜病变，包括糖尿病视网膜病，急性和慢性黄斑视神经视网膜病，中心性浆液性脉络膜视网膜病；和黄斑水肿，包括黄斑囊样水肿，糖尿病黄斑水肿；葡萄膜炎/视网膜炎/脉络膜炎，诸如急性多灶性鳞状色素上皮病，白塞病(Behcet’s disease)，鸟枪子弹样视网膜脉络膜病(birdshot retinochoroidopathy)，传染性(梅毒，莱姆病，结核病，弓形虫病)，葡萄膜炎，诸如中间葡萄膜炎(睫状体扁平部炎)和前葡萄膜炎，多灶性脉络膜炎，多发性一过性白点综合征(MEWDS)，眼结节病，后巩膜炎，匍行性脉络膜炎，视网膜下纤维化，葡萄膜炎综合征和伏格特-小柳-原田(Vogt-Koyanagi-Harada)综合征；血管疾病/渗出性疾病，诸如视网膜动脉阻塞性疾病，视网膜中央静脉阻塞，弥散性血管内凝血病，视网膜分支静脉阻塞，高血压眼底改变，眼缺血综合征，视网膜动脉微动脉瘤，外层渗出性视网膜病变(Coats disease)，旁中心凹毛细血管扩张，半侧视网膜静脉阻塞，视乳头静脉炎，视网膜中央动脉阻塞，视网膜分支动脉阻塞，颈动脉疾病(CAD)，霜样树枝状视网膜血管炎，镰状红细胞性视网膜病和其它血红蛋白病，血管样条纹症，家族性渗出性玻璃体视网膜病，伊尔斯氏病，创伤/外科手术疾病：交感性眼炎，葡萄膜炎视网膜病，视网膜脱离，创伤，激光，PDT，光凝固，手术过程中的低灌注，放射性视网膜病，骨髓移植性视网膜病；增生性疾病，诸如增生性玻璃体视网膜病和视网膜前膜，增生性糖尿病视网膜病。传染病：眼组织胞浆菌病，眼弓蛔虫病，眼组织胞浆菌病综合征(OHS)，眼内炎，弓形虫病，与HIV感染相关的视网膜病，与HIV感染相关的脉络膜病，与HIV感染相关的葡萄膜病，病毒性视网膜炎，急性视网膜坏死，进行性外侧视网膜坏死，真菌性视网膜疾病，眼梅毒，眼结核病，弥漫性单侧亚急性视神经视网膜炎，和蝇蛆病；遗传病，诸如色素性视网膜炎，与视网膜营养不良相关的全身性障碍，先天性静止性夜盲症，视锥营养不良，斯特格病变(Stargardt’s disease)，眼底黄色斑点症，先天性黄斑变性(Best’s disease)，视网膜色素上皮图形状营养不良(pattern dystrophy of the retinal pigment epithelium)，X-连锁视网膜劈裂症，索斯比眼底营养不良(Sorsby’s fundus dystrophy)，良性同心黄斑病，Bietti晶状体营养不良，弹性假黄瘤。视网膜撕裂/裂孔：视网膜脱离，黄斑裂孔，巨大视网膜裂孔，诸如与肿瘤相关的视网膜病，RPE先天性肥大，后葡萄膜黑色素瘤，脉络膜血管瘤，脉络膜骨瘤，脉络膜转移癌，视网膜和视网膜色素上皮的结合错构瘤，成视网膜细胞瘤，眼底血管增生性肿瘤，视网膜星形细胞瘤，眼内淋巴肿瘤；以及其它疾病和状况，诸如点状内层脉络膜病，急性后多灶性鳞状色素上皮病，近视性视网膜变性，急性视网膜色素上皮炎，角膜营养不良或发育异常等。
进一步的实施方式涉及包含化合物1或其药物上可接受的盐(例如聚乙酸盐和三乙酸盐)以及配制用于眼部递送的药物载体的组合物。组合物可以配制用于眼内、玻璃体内或眼周施用。化合物1或其药物上可接受的盐在组合物中保护脱离的视网膜光感受器细胞。化合物1或其药物上可接受的盐在组合物中预防外源性通路的细胞死亡，包括眼睛的视网膜色素上皮中的细胞凋亡。化合物1或其药物上可接受的盐在组合物中预防视网膜神经节细胞的疾病，如青光眼。组合物是无菌的、非热原性的并且对眼睛无毒。所述组合物可进一步包含至少一种非离子表面活性剂。所述至少一种非离子表面活性剂可以是聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆407和泰洛沙泊，但不限于这些实例。所述至少一种非离子表面活性剂可占该组合物的约0.01％-20％w/w；或者占组合物的约0.05％-10％w w；或者占组合物的约0.1％-3％w/w。或者，可使用非离子表面活性剂混合物，其中至少两种上述名称或其它非离子表面活性剂一起以优化制剂的所需药代动力学的比率使用，其中表面活性剂的总量落入上述限制内。组合物可进一步包含有机助溶剂，如丙二醇或二甲亚砜。有机助溶剂可占组合物的约1％-50％w/w；或者约占组合物的1％-20％w/w；或者约占组合物的1％-5％w/w。也可加入等渗剂如海藻糖或甘露醇或山梨醇，或可溶性无机盐如NaCl，以使溶液的渗透压达到250-400mOsm/L的范围。组合物可具有2.5-6.0范围内的pH，并且可通过本领域技术人员已知的方法进行缓冲。
另一个实施方式涉及治疗眼部状况、疾病或者影响眼睛健康的状况或疾病的方法，所述方法包括将组合物施用于患有眼部状况、疾病或者影响眼部健康的状况或疾病的受试者，所述组合物包含化合物1或其药物上可接受的盐和配制用于光学递送的药物载体。眼部状况、疾病或者影响眼睛健康的状况或疾病可以是视网膜脱离，黄斑变性，年龄相关的黄斑变性，非渗出性的年龄相关的黄斑变性，渗出性的年龄相关的黄斑变性，脉络膜血管新生，视网膜病，糖尿病视网膜病，急性和慢性黄斑视神经视网膜病，中心性浆液性脉络膜视网膜病，黄斑水肿，黄斑囊样水肿，糖尿病黄斑水肿，葡萄膜炎/视网膜炎/脉络膜炎，多灶性鳞状色素上皮病，白塞病，视网膜脉络膜病，传染性(梅毒，莱姆病，结核病，弓形虫病)，葡萄膜炎，中间葡萄膜炎(睫状体扁平部炎)，前葡萄膜炎，多灶性脉络膜炎，多发性一过性白点综合征(MEWDS)，眼结节病，后巩膜炎，匍行性脉络膜炎，视网膜下纤维化，葡萄膜炎综合征，伏格特-小柳-原田综合征；视网膜动脉阻塞性疾病，视网膜中央静脉阻塞，弥散性血管内凝血病，视网膜分支静脉阻塞，高血压眼底改变，眼缺血综合征，视网膜动脉微动脉瘤，外层渗出性视网膜病变，旁中心凹毛细血管扩张，半侧视网膜静脉阻塞，视乳头静脉炎，视网膜中央动脉阻塞，视网膜分支动脉阻塞，颈动脉疾病(CAD)，霜样树枝状视网膜血管炎，镰状红细胞性视网膜病和其它血红蛋白病，血管样条纹症，家族性渗出性玻璃体视网膜病，伊尔斯氏病，交感性眼炎，葡萄膜炎视网膜病，视网膜脱离，手术过程中的创伤、激光、PDT，光凝固、低灌注，放射性视网膜病，骨髓移植性视网膜病，增生性玻璃体视网膜病和视网膜前膜，增生性糖尿病视网膜病，眼组织胞浆菌病，眼弓蛔虫病，眼组织胞浆菌病综合征(OHS)，眼内炎，弓形虫病，与HIV感染相关的视网膜病，与HIV感染相关的脉络膜病，与HIV感染相关的葡萄膜病，病毒性视网膜炎，急性视网膜坏死，进行性外侧视网膜坏死，真菌性视网膜疾病，眼梅毒，眼结核病，弥漫性单侧亚急性视神经视网膜炎，蝇蛆病，色素性视网膜炎，与视网膜营养不良相关的全身性障碍，先天性静止性夜盲症，视锥营养不良，斯特格病变(Stargardt’sdisease)，眼底黄色斑点症，先天性黄斑变性，视网膜色素上皮图形状营养不良，X-连锁视网膜劈裂症，索斯比眼底营养不良(Sorsby’s fundus dystrophy)，良性同心黄斑病，Bietti晶状体营养不良，弹性假黄瘤，视网膜脱离，黄斑裂孔，巨大视网膜裂孔，与肿瘤相关的视网膜病，RPE先天性肥大，后葡萄膜黑色素瘤，脉络膜血管瘤，脉络膜骨瘤，脉络膜转移癌，视网膜和视网膜色素上皮的结合错构瘤，成视网膜细胞瘤，眼底血管增生性肿瘤，视网膜星形细胞瘤，眼内淋巴肿瘤，点状内层脉络膜病，急性后多灶性鳞状色素上皮病，近视性视网膜变性，视网膜色素上皮细胞稳态异常，急性视网膜色素上皮炎，青光眼，角膜营养不良或发育异常等。组合物可以足以减弱受试者体内细胞死亡的量施用。组合物以足以增强所述受试者内的光感受器存活的量施用。组合物以足以保护所述受试者内的视网膜色素上皮细胞的量施用。组合物以足以保护所述受试者内的视网膜神经节细胞的量施用。
另一个实施方案涉及预防光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡的方法，所述方法包括向受试者施用包含化合物1或其药物上可接受的盐和无菌的非热原性药物载体的组合物。光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡是Fas介导的光感受器或RPE细胞凋亡。受试者可能有光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡的风险。组合物可以眼内、玻璃体内或眼周施用给受试者。
另一个实施方式涉及增加光感受器、RPE或视网膜神经节细胞存活的方法，所述方法包括施用包含化合物1或其药物上可接受的盐的光感受器、RPE或视网膜神经节保护组合物。光感受器、RPE或视网膜神经节细胞存活增加包括抑制光感受器、RPE或视网膜神经节细胞凋亡。光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡包括Fas介导的光感受器、RPE或视网膜神经节细胞凋亡。光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡包括TRAIL介导的光感受器、RPE或视网膜神经节细胞凋亡。光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡包括TNFR介导的光感受器、RPE或视网膜神经节细胞坏死。光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡包括外源通路介导的光感受器、RPE或视网膜神经节细胞焦亡。组合物可通过静脉内、皮下或肌内注射，或口服或局部，即眼内、玻璃体内、体表(topically)、脉络膜上(suprachoroidally)、结膜下、视网膜下或眼周施用。
附图说明
图1显示了描绘在661W细胞中通过Met 12和化合物1三盐酸盐阻断Fas诱导的胱天蛋白酶8激活的图形。661W细胞用不同量的溶解在DMSO中Met-12或化合物1预处理，两者均为20mg/mL，时间1hr。然后加入FasL(500ng/mL)，并在用FasL处理48小时后测量胱天蛋白酶8的活性。
图2显示了描绘在661W细胞中通过Met-12和化合物1三盐酸盐阻断Fas诱导的胱天蛋白酶8激活的图形。661W细胞用不同量的在DMSO中的Met-12(圆形)、在DMSO(20mg/mL)中的化合物1(菱形)和在2％聚山梨酯(PS)20、2％丙二醇(PG)且pH为4的制剂中的化合物1(三角形)预处理1小时，所有制剂的浓度均为10mg/mL。然后用FasL(500ng/mL)处理细胞，并在用FasL处理48小时后测量胱天蛋白酶8的活性。
图3显示了描绘在661W细胞中通过化合物1三盐酸盐阻断Fas诱导的胱天蛋白酶8激活的图形。661W细胞用不同量的在DMSO(20mg/mL)中(圆形)，在3％聚山梨酯20、3％丙二醇且pH为4的制剂中(三角形)以及在1％聚山梨酯20、3％丙二醇且pH为4的制剂中(菱形)的化合物1预处理1小时，所有制剂的浓度均为10mg/mL。然后用FasL(500ng/mL)处理细胞，并在用FasL处理48小时后测量胱天蛋白酶8的活性。
图4显示了描绘在661W细胞中通过化合物1三盐酸盐阻断Fas诱导的胱天蛋白酶8激活的图形。661W细胞用不同量的在DMSO(20mg/mL)中(圆形)，在0.4％聚山梨酯-20、4.5％甘露醇、10mM乙酸盐且pH为4的制剂中(三角形)的化合物1三盐酸化合物预处理，浓度均为2mg/mL。然后用FasL(500ng/mL)处理细胞，并在用FasL处理48小时后测量胱天蛋白酶8的活性。
图5a描绘了在三种泊洛沙姆制剂中玻璃体内递送的化合物1的兔视网膜浓度的对数图。
图5b描绘玻璃体内递送的化合物1的兔视网膜浓度的对数图，以随时间比较基于泊洛沙姆407的制剂与基于聚山梨酯-20的制剂。
图6a描绘了在不同浓度的表面活性剂(0.4％或0.1％)和不同浓度的化合物1(2mg/mL对0.5mg/mL)下在三种泊洛沙姆制剂中玻璃体内递送的化合物1的兔玻璃体液(VH)浓度随时间的线性图。
图6b描绘了不同选择的表面活性剂(0.4％泊洛沙姆407相对0.4％聚山梨酯20)和不同量的化合物1(2mg/mL对1mg/mL)的兔玻璃体液(VH)浓度随时间的线性图。
图7显示了公称注射在4.5％甘露醇、10mM乙酸、0.4％泊洛沙姆(PX)407且pH为4.5中的300ng化合物1三乙酸盐(5μL，0.06mg/mL)24小时后和72小时后棕色挪威大鼠的玻璃体液中化合物1三乙酸盐的总量(深色)和视网膜中的浓度(浅色)。
图8显示了描绘用Met-12三盐酸盐(浅色条纹)(在5μL DMSO中5μg)，和用化合物1三盐酸盐(深色)(在5μL DMSO中0.5、1.0、5和10μg)或DMSO媒介物(浅色)体内处理大鼠的脱离视网膜72小时后凋亡细胞的数量的条形图。LHS条形图是没有注射的未脱离对照视网膜。
图9显示了描绘用化合物1三盐酸盐(1.0和5μg在5μL F1或F2中)对比相同的物质在DMSO中(5μg在5μL中)或DMSO媒介物(灰色)体内处理大鼠的脱离视网膜72小时后凋亡细胞的数量的条形图。LHS条形图是没有注射的未脱离对照视网膜。F1(5/1μg)为1.0/0.2mg/mL化合物1三盐酸盐在pH为4.0的3％PG/3％PS-20中(黑色)，以及F2(5/1μg)为1.0/0.2mg/mL化合物1三盐酸盐在pH为4.0的2％PG/2％PX-407(垂直条)。
图10显示描绘了体内处理大鼠的脱离视网膜72小时后凋亡细胞百分比的条形图。条形图1是脱离视网膜中的媒介物对照。条形图2为有1μg化合物1三乙酸盐的0.2mg/mLDMSO溶液。条形图3为有1μg化合物1三盐酸盐的0.2mg/mL DMSO溶液。条形图4是未注射的未脱离对照视网膜。
具体实施方式
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及其它文献参考的全部内容通过引用并入本文。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以便更全面地描述本领域技术人员从本文所描述和要求保护的本发明的日期已知的现有技术。
描述了生物活性肽组合物，生物活性肽组合物的药物制剂以及使用该肽组合物的方法。
术语“治疗有效量”是指在特定类别的受试者(例如，婴儿、儿童、青少年、成人)中有效促进期望治疗效果的药物或试剂(例如化合物1)的量。如本文所用，术语“亚治疗性”是指在给予中等和/或典型受试者(例如，中等身材、不服用禁忌药剂，具有对大部分人群类似的剂量反应等)后不足以达到所需和/或预期的治疗结果/成果的药物或药剂的量。美国食品和药物管理局(FDA)推荐的剂量表示治疗剂量。
如本文所用，术语“药物”或“药剂”是指向受试者施用的化合物、肽、大分子或其它实体(例如在药物组合物的上下文中)，以引发期望的生物应答。药剂可以是“药物(drug)”或任何其它物质(例如，肽、多肽)，其局部和/或全身地在人类或其它哺乳动物中具有生物活性。默克索引(Merck Index)和医师手册(Physicians Desk Reference)中公开了药的实例，为了所有目的，其全部公开内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“药物制剂”是指至少一种药剂(例如，化合物1)与一种或多种附加成分的组合，这些附加成分在施用给受试者后有助于使药剂适合于实现期望的效果。药物制剂可包括一种或多种添加剂，例如药物上可接受的赋形剂、载体、渗透促进剂、包衣、稳定剂、缓冲剂、酸、碱或与药剂物理相关的其它物质，以增强剂型的施用、释放(例如，释放的时间)、递送率、生物利用度、效力等。制剂可以是例如液体、悬浮液、固体、纳米颗粒、乳液、胶束、软膏、凝胶、乳液、包衣等。药物制剂可包含单一药剂(例如化合物1)或多种药剂。药物组合物可以含有单一药物制剂或多种药物制剂。在一些实施方式中，针对特定施用模式(例如，眼部施用(例如玻璃体内施用等))配制药剂(例如化合物1)。药物制剂是无菌的，非热原性的并且对眼睛无毒。
如本文所用，术语“药物组合物”是指一种或多种药剂与一种或多种惰性或活性载体的组合，使得组合物特别适合于体外、体内或间接体内的诊断或治疗应用。药物组合物包含施用于受试者的物理实体，并且可以采取固体、半固体或液体剂型的形式，如片剂、胶囊、口腔崩解片剂、丸剂、粉剂、栓剂、溶液剂、酏剂(elixir)、糖浆剂、悬浮剂、霜剂、锭剂(lozenge)、膏剂、喷雾剂等。药物组合物可包含单一药物制剂(例如缓释(extendedrelease)、速释、迟释(delayed release)，纳米颗粒等)或多种制剂(例如速释和迟释，纳米颗粒和非纳米颗粒等)。术语“药物组合物”和“药物制剂”可以互换使用。
如本文所用，术语“药物上可接受的载体”是指任何标准药物载体，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如诸如油/水或水/油乳液)，和各种类型的润湿剂。组合物还可包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，Remington'sPharmaceutical Sciences，15th Ed.，Mack Publ.Co.，Easton，Pa.[1975]；在此其整体通过引入并入。
如本文所用，术语“药物上可接受的盐”是指药剂或活性代谢物或其残基的任何酸或碱。如本领域技术人员已知的，本发明化合物的“盐”可以来自无机或有机酸和碱。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸，苯磺酸等。其它酸，例如草酸虽然本身不是药物上可接受的，但可用于制备用作获得本发明化合物及其药物上可接受的酸加成盐的中间体的盐。
如本文所用，术语“施用”是指将药、前药或其它试剂或治疗性处理(例如本发明的组合物)给予受试者(例如，受试者或体内、体外或间接体内的细胞、组织和器官)的行为。对人体施用的示例性途径可以是经由眼睛(眼)、口(口)、皮肤(经皮)、鼻(鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(口腔)、耳朵、直肠，通过注射(例如，静脉内、皮下、肿瘤内、腹腔内等)等。
如本文所用，术语“共同施用”是指将至少两种试剂(例如化合物1和一种或多种附加治疗剂)或疗法施用于受试者。在一些实施方式中，两种或更多种试剂/疗法的共同施用是同时发生的。在其它实施方式中，两种或更多种试剂/疗法的共同施用是顺序的(例如，第一试剂/疗法在第二试剂/疗法之前施用)。在一些实施方式中，两种或更多种疗法同时施用，但顺序释放(例如，吸收、成为生物可利用的等)。本领域技术人员理解，所使用的各种试剂/疗法的制剂和/或施用途径可以变化。本领域技术人员可以容易地确定合适的共同施用剂量。在一些实施方式中，当共同施用试剂/疗法时，每个试剂/疗法以低于适合其单独施用的剂量施用。
本文提供了光感受器-保护肽的生物活性的、水性制剂的药物制品，其药物制品，以及预防光感受器死亡的方法以及治疗方法。
化合物1.His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-酰胺(SEQ IDNO:1)；式1.
一些实施方式涉及C端酰胺肽，化合物1(如上)或其药物上可接受的盐。某些实施方式涉及化合物1的聚乙酸盐。某些其它实施方式涉及化合物1的三乙酸盐。
这些化合物可用于以下药物制剂中：该药物制剂用于预防眼睛的光感受器中Fas或TRAIL介导的细胞凋亡。在FasL诱导的光感受器毒性模型中，在661W细胞中，通过IC50化合物1预防胱天蛋白酶-8激活的效力比Met-12高10倍，并且比在最大抑制的剂量效力下测量的Met-12高约3倍。在视网膜脱离的体内大鼠模型中，化合物1保护光感受器细胞免于细胞凋亡的效力比Met-12高至少10倍，并且与Met-12不同，可在临床上可接受的制剂中有效递送。
如在实施例中所证明的，通过化合物1的Fas抑制导致光感受器细胞在体内显著保留。在661W细胞中，化合物1处理导致对胱天蛋白酶-8激活的充分抑制。因此，认为对患有眼部状况、疾病或者影响眼部健康的状况或疾病的受试者施用化合物1可以产生改善的视网膜细胞保护，包括但不限于光感受器、视网膜色素上皮细胞和视网膜神经节细胞免于Fas-介导的细胞凋亡，从而导致眼部状况、疾病或者影响眼部健康的状况或疾病的改善和/或治疗。
在临床实践中，患者通常存在已发生的脱离。视网膜-RPE分离的动物模型显示Fas通路激活发生较早并且在脱离的整个过程中保持高水平(Zacks et al.Arch Ophthalmol2007；125:1389-1395,Zacks et al.IOVS 2004；45(12):4563-4569.8.)。视网膜和RPE的分离也在广泛的视网膜疾病中遇到。预期抗Fas疗法在视网膜细胞存活中的临床相关性不限于视网膜脱离。例如，Fas介导的细胞凋亡可能在年龄相关的黄斑变性(AMD)中的光感受器细胞死亡中发挥作用(Dunaief et al.Arch Ophthalmol.2002；120(11):1435-1442；Zackset al.Arch Ophthalmol 2007；Petrukhin K.New therapeutic targets in atrophicage-related macular degeneration.Expert Opin Ther Targets.2007.11:625–639；Miller JW.Treatment of age-related macular degeneration:beyond VEGF.Jpn JOphthalmol.2010.54:523–528；Rogala J,Zangerl B,Assaad N,Fletcher EL,Kalloniatis M,Nivison-Smith L.In Vivo Quantification of Retinal ChangesAssociated with Drusen in Age-Related Macular Degeneration.Invest OphthalmolVis Sci.2015.56:1689–1700，其全部内容通过引用并入本文)。年龄相关的黄斑变性的特征在于RPE的进行性变性，并引起与视网膜脱离后发生的类似的外层视网膜变性和再组织(Jager et al.N Engl J Med.2008；358:2606-17,Johnson et al.Invest OphthalmolVis Sci.2003；44:4481-488，其全部内容通过引用并入本文)。在AMD的血管新生形式中，也存在视网膜下液体的渗出，从而产生该组织与下面的RPE的实际分离(Jager et al.N EnglJ Med.2008；358:2606-17，其全部内容通过引用并入本文)。血管新生性AMD可导致延长的视网膜-RPE分离和Fas通路激活时间。抗Fas治疗的实用性很可能是作为在治疗潜在病症时保护视网膜细胞(例如光感受器和视网膜色素上皮)的辅助物(Brown et al.N Engl JMed.2006Oct.5；355(14):1432-44，其全部内容通过引用并入本文)。
青光眼是以视网膜神经节细胞(RGC)死亡为特征的进行性变性眼部状况，并且先前公开的研究已经证明RGC因细胞凋亡而死亡(Ji et al.Vision Res.2005；45(2):169-179)。眼内压(IOP)是青光眼发展的主要风险因素，并且已经致力于使用前列腺素类似物降低IOP以防止RGC细胞凋亡(Doucette and Walter.Ophthalmic Genet.2016；12:1-9)。Fas也参与了RGC的死亡(Gregory et al.PLoS One.2011；6(3):e17659)，并且IOP的动物模型表现出增加的Fas和FasL的表达((Ju et al.Brain Res.2006；1122(1):209-221)，表明Fas抑制作为保护RGC存活力的手段的潜在实用性并减轻青光眼的变性本质。
在一些实施方式中，所述多肽可通过本领域普通技术人员已知的方法制备。例如，要求保护的化合物1可使用标准固相多肽合成技术(例如Fmoc)合成。或者，可使用过表达肽和合适的酰胺酶来进行C端酰胺化的重组DNA技术(例如使用细菌或真核表达系统)来合成多肽。
具体而言，如实施例1中所述，如本领域技术人员已知的，化合物1可通过以下获得：将Met-12肽序列H60HIYLGATNYIY71(SEQ ID NO：2)构建到氨基树脂上，在脱保护和树脂切割后，产生其C端酰胺H60HIYLGATNYIY71-NH2，化合物1(SEQ ID NO：1)。具体而言，化合物1从概念上讲可由c-Met序列通过残基59和60之间的正常酰胺水解以及肽氮与残基72的α-碳之间(而非残基71的羰基碳处)的肽链的非天然断裂获得。这不是天然发生的切割。Met-12先前已经在第8,343,931号美国专利中描述，其全部内容并入本文。
C-末端酰胺化的肽(即化合物1)的使用基于这样的信念，即该特定的修饰可通过去除游离羧酸(在pH大于3时明显去质子化)提高肽可溶于水中或混溶于胶束中的pH。所得物质在任何生理相关的pH下都不具有C-末端阴离子，或者在任何物理相关的情况下都是两性离子，并且在低于约5的pH下为三价阳离子物质。这种改变可能是通过转化为酰胺或酯(两者在生理条件下都不能去质子化)最容易实现的。酰胺比酯更具生物和化学稳定性，疏水性更弱，所以选择简单的伯酰胺。
在某些实施方式中，化合物1可通过将Met-12转化成其C-末端伯酰胺以形成化合物1来生产，尽管使用本领域技术人员熟悉的氨基树脂从已经胺化的第一个氨基酸残基构建肽通常是更实际。如以下实施例部分所述，化合物1最初是作为三盐酸盐获得和测试的，尽管之后三乙酸盐被认为对制剂更有利。
相比Met-12，使用化合物1有一定的优点。具体而言，如下面的实施例中所示，化合物1可以与表面活性剂一起配制，以产生在眼部制剂的前例的pH值和添加剂量下的胶束溶液。其次，基于体外功效测定，通过IC50确定，化合物1的效力令人惊讶地比Met-12高10倍，并且通过最大抑制浓度测量，其效力高约3倍。具体而言，当在相同制剂中体外测试Met-12和化合物1时，化合物1具有比Met-12更高的剂量效力。这允许用相比于Met-12较少量的化合物1实现相同的生理效应。第三，在视网膜脱离的大鼠模型中的体内测试中，化合物1在防止视网膜的脱离部分中的光感受器细胞的细胞凋亡方面的效力出乎意料地为Met-12的至少五倍。第四，在一些公开的化合物1制剂中，在大鼠视网膜脱离模型中实现的功效比用Met-12低10倍以上。最后，化合物1在玻璃体液和玻璃体内处理的兔视网膜中显示明显延长的半寿期，并且通过使用不同的制剂可以将这些半寿期延长到不同的程度，从而允许通过制剂的选择控制对化合物1的总视网膜暴露。
在一些实施方式中，化合物1在以下一项或多项中有效：预防/抑制/减少Fas介导的光感受器细胞凋亡，防止眼睛的视网膜色素上皮细胞凋亡，增加光感受器存活，预防与年龄相关的黄斑变性(AMD)细胞死亡，预防与视网膜脱离相关的细胞死亡等。在一些另外的实施方式中，化合物1有效保护视网膜神经节细胞，其经过两种中间神经元类型从光感受器接收视觉信息：双极细胞和视网膜无长突细胞。
在一些实施方式中，将治疗有效量的化合物1或其制品(即制剂或组合物)在足以抑制或减弱患者体内的细胞凋亡的位置(例如，在期望的组织内)施用于需要治疗的哺乳动物受试者(例如，针对特定的眼部状况)。优选的受试者是患有眼部状况、疾病或者影响眼睛健康的状况或疾病的人。
施用的量足以产生使视网膜细胞和/或视网膜神经节细胞(包括但不限于光感受器、视网膜色素上皮和视网膜神经节)免于Fas介导的细胞凋亡的改善保护，或预防视网膜细胞死亡，从而得到眼部状况、疾病或者影响眼部健康的状况或疾病的改善和/或治疗。
治疗有效剂量的确定在本领域技术人员的能力范围内。在一些实施方式中，有效人类剂量将在5-10,000μg/眼、50-5,000μg/眼或100-2,000μg/眼范围内。计划重复剂量以维持有效水平(例如，每周、每隔一周、每月、每季度、每半年等)。
在一些实施方式中，药物制剂是无菌非热原性的液体，并且包括至少0.1mg/ml(例如，>0.1、>0.2、>0.5、>0.6、>0.7、>0.8和>0.9)，至少1mg/ml(例如，>1mg/ml、>2mg/ml、>5mg/ml、>10mg/ml等)的本文所述的肽/多肽(例如，1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml或更多的肽/多肽(例如，化合物1))。
在一些实施方式中，治疗剂量包括至少0.01ml(例如，0.01ml...0.02ml...0.05ml...0.1ml...0.2ml...0.5ml...1ml...2ml...3ml...4ml，以及其间的体积和范围)的液态药物制剂，后者包括光感受器-或RPE-保护的肽/多肽(例如，化合物1)。在一些实施方式中，将10至500μl的液体体积注入人眼中(例如，10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl，以及其间的体积和范围)。在一些实施方式中，将50至600μl的体积注入人眼中(例如，50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl，以及其间的体积和范围)。在一些实施方式中，当术中注射时，可使用毫升级体积(例如，高达到玻璃体腔的总体积(例如约4ml))。在一些实施方式中，可以将化合物并入用于在玻璃体切除术期间维持内部眼压的灌注液。
在一些实施方式中，提供单次剂量(例如，以治疗急性状况(例如，视网膜脱离))。在一些实施方式中，提供多次剂量(例如每日、每周、每月等)用于治疗慢性状况。根据所治疗状况所需的暴露持续时间，制剂可能不同。
在一些实施方式中，治疗剂量从低水平向上滴定以优化安全性和功效。在用于玻璃体内注射的一些实施方式中，剂量包括0.01至5mg的肽(例如0.1和2.0mg)。
在一些实施方式中，药物制品(即制剂和/或组合物)包含一种或多种赋形剂。适用于眼部应用的赋形剂包括但不限于张度剂、防腐剂、螯合剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂和抗氧化剂。合适的张度调节剂包括甘露醇、氯化钠、甘油，山梨糖醇等。合适的防腐剂包括对羟基苯甲酸酯、苯扎氯铵、苯度溴铵、聚季铵盐-1等。合适的螯合剂包括依地酸钠等。合适的缓冲剂包括磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、氨基丁三醇等。合适的表面活性剂包括离子型和非离子型表面活性剂，但优选非离子型表面活性剂，例如聚山梨酯、聚乙氧基化蓖麻油衍生物、聚乙氧基化脂肪酸、聚乙氧基醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆)和氧乙基化叔辛基酚甲醛聚合物(泰洛沙泊)。也可包括其它合适的表面活性剂。合适的抗氧化剂包括亚硫酸盐、硫代硫酸盐、抗坏血酸盐、BHA、BHT、生育酚等。
本发明的组合物任选地包含附加的活性剂。这些附加的活性剂可包括抗TNF抗体，例如阿达木单抗(Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina 45,332(2014),Curr EyeRes 39,1106(2014))或依那西普(PLoS One,7,e40065)或显示保持视网膜结构的激酶抑制剂，诸如ROCK抑制剂Y-27632(Molecular Medicine Reports 12,3655(2015))、腺苷激酶抑制剂ABT-702(Life Sci 93,78(2013))或JNK抑制肽D-JNK-1(Diabetes 50,77(2001),AdvExptl Med Biol854,677(2016))或二十二碳六烯酸(J Lipid Res,54,2236(2013))或RXR泛激动剂PA024(同上)或necrostatin或RIP激酶抑制剂如达拉菲尼(Dabrafenib)(CellDeath Dis 5,1278(2014))。
在一些示例性实施方式中，可向药物制品加入以下的至少一种：赋形剂如聚山梨酯20(例如至多3％)、泊洛沙姆407(例如至多2％)、泰洛沙泊(例如至多3％)、克列莫佛(例如至多1％)；和/或助溶剂(例如0.5至50％)，例如N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、PEG-400、丙二醇、二甲亚砜(DMSO)；油或环糊精。
在进一步的示例性实施方式中，药物组合物中可包含至少一种非离子表面活性剂(例如，组合物的0.1％-20％w/w)，例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆或泰洛沙泊。另外，药物组合物中可包含约1-50％量的有机助溶剂，例如丙二醇或二甲亚砜。或者，药物组合物中可包含约1-20％量的有机助溶剂，例如N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、PEG-400、丙二醇、DMSO。或者，药物组合物中可包含约1-5％量的有机助溶剂，例如丙二醇或二甲亚砜。或者，药物组合物中可包含等渗剂如甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖或海藻糖或无机盐如氯化钠，其所需量可以使组合物的渗透压达到250-400mOsm/L的范围。
组合物的pH可在2.5-6.0的范围。pH可通过合适的缓冲液控制，并在3.0-5.0的范围或3.5-4.5的范围内。
在另一个示例性实施方式中，药物组合物中可包含至少一种非离子表面活性剂(例如，组合物的0.5％-10％w/w)，诸如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆或泰洛沙泊。另外，药物组合物中可包含约1-50％量的有机助溶剂，诸如丙二醇或二甲亚砜。或者，药物组合物中可包含约1-20％量的有机助溶剂，诸如丙二醇或二甲亚砜。或者，药物组合物中可包含约1-5％量的有机助溶剂，诸如N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、PEG-400、丙二醇、DMSO。或者，药物组合物中可包含等渗剂诸如甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖或海藻糖或无机盐如氯化钠，其所需量可以使组合物的渗透压达到250-400mOsm/L的范围。组合物的pH可在2.5-6.0的范围。pH可通过合适的缓冲液控制并在3.0-5.0的范围或3.5-4.5的范围。
在又一个示例性实施方式中，药物组合物中可包含至少一种非离子表面活性剂(例如，组合物的1％-3％w/w)，诸如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆或泰洛沙泊。另外，药物组合物中可包含约1-50％量的有机助溶剂，诸如丙二醇或二甲亚砜。或者，药物组合物中可包含约1-20％量的有机助溶剂，诸如N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、PEG-400、丙二醇、DMSO。或者，药物组合物中可包含约1-5％量的有机助溶剂，诸如丙二醇或二甲亚砜。或者，药物组合物中可包含等渗剂诸如甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖或海藻糖或无机盐如氯化钠，其所需量可以使组合物的渗透压达到250-400mOsm/L的范围。组合物的pH可在2.5-6.0的范围。pH可通过合适的缓冲液控制并在3.0-5.0的范围或3.5-4.5的范围。
在一些实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和泊洛沙姆407(例如，组合物的0.1-2％w/w)，在pH值为3.0-6.0范围的含水介质中。
在一些实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和泊洛沙姆407(例如，组合物的0.1-2％w/w)，在pH值为4.0-5.0范围的丙酸钠/丙酸或乙酸钠/乙酸缓冲的含水介质中。
在一些实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和泊洛沙姆407(例如，组合物的0.1-2％w/w)，在pH值为4.0-5.0范围、由3-5％甘露醇制成等渗的丙酸钠/丙酸或乙酸钠/乙酸缓冲的含水介质中。
在一些进一步的实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和聚山梨酯-20(例如，组合物的0.1-3％w/w)、丙二醇(例如，组合物的3％w/w)在pH值为3.0-6.0范围的含水介质中。
在某些进一步的实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和聚山梨酯-20(例如，组合物的0.1-3％w/w)、丙二醇(例如，组合物的3％w/w)，在pH值为4.0-5.0范围的乙酸钠/乙酸缓冲的含水介质中。
在一些进一步的实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和聚山梨酯-20(例如，组合物的0.1-3％w/w)和甘露醇(例如，组合物的3-5％w/w)，在pH值为3.0-6.0范围的含水介质中。
在某些进一步的实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和聚山梨酯-20(例如，组合物的0.1-3％w/w)和甘露醇(例如，组合物的3-5％w/w)，在pH值为4.0-5.0范围的乙酸钠/乙酸缓冲的含水介质中。
在一些实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和泊洛沙姆407(例如，组合物的0.1-2％w/w)以及聚山梨酯20(例如，组合物的0.1-2％w/w)，在pH值为3.0-6.0范围的含水介质中。
在一些实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和泊洛沙姆407(例如，组合物的0.1-2％w/w)以及聚山梨酯20(例如，组合物的0.1-2％w/w)，在pH值为4.0-5.0范围的丙酸钠/丙酸或乙酸钠/乙酸缓冲的含水介质中。
在一些实施方式中，药物组合物可包含化合物1或其药物上可接受的盐和泊洛沙姆407(例如，组合物的0.1-2％w/w)以及聚山梨酯20(例如，组合物的0.1-2％w/w)，在pH值为4.0-5.0范围、由3-5％甘露醇制成等渗的丙酸钠/丙酸或乙酸钠/乙酸缓冲的含水介质中。
在一些实施方案中，如上所述的药物组合物可包含化合物1，但不包括氯化物作为抗衡离子，其中乙酸盐是优选的替代物。这样的组合物可以显示出优于含有氯离子的那些的性能。
在一些实施方案中，肽/多肽(例如化合物1)的重量比相对于药物制剂中的非水性赋形剂的重量为1％-25％，后者反之为赋形剂的0.1-20％，诸如泊洛沙姆、聚山梨酯20、丙二醇和甘露醇。
肽/多肽(例如化合物1)的重量比相对于药物制剂的重量可以是至少约0.1％、至少0.5％、至少1％、至少约2％、至少约3％。
以下两种示例性组合物(其每种成分的量在所示范围内)将提供可用于治疗或预防各种眼部疾病或状况(例如视网膜)或预防由眼部疾病或状况或类似导致的受试者的视网膜细胞死亡的几种组合物中的两种：
示例性制剂I：
化合物1三乙酸盐 0.1-2mg/mL
泊洛沙姆407 0.01-0.5％
添加剂(例如，甘露醇) 2.5-5％
乙酸 10mM
NaOH 直到pH>3
水(WFI) 直到100％
示例性制剂II：
化合物1三乙酸盐 0.1-2mg/mL
聚山梨酯20 0.1-1.0％
添加剂(例如，甘露醇) 2.5-5％
乙酸 10mM
NaOH 直到pH>3
水(WFI) 直到100％
在一些实施方案中，本发明的组合物例如使用本文所述的技术和/或本领域技术人员已知的其它技术(例如，注射、体表施用等)眼部施用(参见例如，Janoria et al.,Expert Opin Drug Deliv.,4(4):371-388(July 2007)；Ghate&Edelhauser,Expert OpinDrug Deliv.,3(2):275-87(2006)；Bourges et al.,Adv Drug Deliv Rev.,58(11):1182-202(2006),Epub 2006Sep.22；Gomes Dos Santos et al.,Curr Pharm Biotechnol.,6(1):7-15(2005)；通过引用整体并入本文)。组合物可使用本领域普通技术人员已知的任何方法施用。非限制性的实例包括体表、结膜下、眼球筋膜下、玻璃体内、视网膜下、或注入受试者眼睛的前房内。其它施用方式包括全身施用，包括静脉内施用以及口服施用。在某些实施方式中，组合物玻璃体内施用。
某些实施方式涉及包含化合物1多肽和药物上可接受的载体的药物组合物。可以提供多肽而不破坏载体内媒介(vector)的任何载体都是合适的载体，并且这样的载体在本领域是公知的。
可以将组合物配制和包装成适用于胃肠外、口服或体表施用。例如，胃肠外制剂可以是无菌的、非热原性的产品，并且可以由速释或迟释液体制品、干粉、乳液、悬浮液或任何其它标准制剂组成。药物组合物的口服制剂可以是例如液体溶液，诸如溶于稀释剂(例如水、盐水、果汁等)中的有效量的组合物、在合适的液体中的悬浮液或合适的乳液。口服制剂也可以片剂形式递送，并且可包括赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药理学相容的赋形剂。体表制剂可包括增强活性成分通过皮肤或其它受影响的区域的吸收或渗透的化合物，诸如二甲亚砜和相关类似物。药物组合物还可使用经皮装置体表递送，例如贴剂，其可将组合物包含在具有粘合剂体系的合适溶剂体系中，如丙烯酸乳液和聚酯贴剂。无菌组合物可经由滴眼剂或其它体表眼部递送方法递送。无菌的、非热原性的组合物可在眼内任何地方眼内递送，包括例如玻璃体腔、前房等。无菌的、非热原性的组合物可以玻璃体内递送，正如通常完成的，如玻璃体内注射Lucentis(雷珠单抗(ranabizumab))、Avastin(贝伐单抗(bevazizumab))、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、抗生素等的注射。组合物可经眼周(例如，到眼球(球体)周围、但在骨性眶内的组织)递送。组合物可经由眼内植入物(例如，丙氧鸟苷植入物、氟轻松植入物等)递送。在眼内植入物递送中，将含有本发明组合物的装置手术植入(例如在玻璃体腔内)，并将药物释放到眼中(例如以预定速率)。组合物可使用胶囊化细胞技术(例如来自Neurotech)施用，其中基因修饰的细胞被工程化以产生和分泌包含化合物1多肽的组合物。可使用缝合或放置在球体旁边的装置，经巩膜药输送来递送组合物，其将缓慢洗脱药，然后将药扩散到眼中。
一些实施方案涉及预防、抑制、阻断和/或减少光感受器、RPE细胞或视网膜神经节细胞死亡的组合物、试剂盒、系统和/或方法。一些实施方式涉及抑制光感受器的细胞凋亡。一些实施方式涉及抑制眼睛的视网膜色素上皮的细胞中的凋亡。一些实施方式涉及抑制眼睛视网膜神经节细胞中的凋亡。在一些实施方式中，光感受器死亡和/或凋亡和/或视网膜色素上皮细胞凋亡和/或凋亡和/或视网膜神经节细胞凋亡和/或死亡由视网膜脱离、年龄相关的黄斑变性、青光眼、创伤、癌症、肿瘤、炎症、葡萄膜炎、糖尿病、遗传性视网膜变性和/或影响光感受器细胞的疾病、异常的视网膜色素上皮或视网膜神经节导致。
在一些实施方式中，本发明增强光感受器、RPE或视网膜神经节细胞活力和/或抑制光感受器死亡(例如，在视网膜脱离过程中和/或是不涉及视网膜脱离的眼部状况。
在一些实施方式中，本发明可用于增强的光感受器、RPE或视网膜神经节细胞活力和/或抑制多种病症和/或疾病中的光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡，所述多种病症和/或疾病包括，但不限于黄斑变性(例如，干、湿、非渗出性或渗出性/血管新生)，眼部肿瘤，青光眼，遗传性视网膜变性(例如，色素性视网膜炎、斯特格病变、乌谢尔综合征(Ushersyndrome)等)，眼部炎症性疾病(例如，葡萄膜炎)，眼部感染(例如，细菌、真菌、病毒)，自身免疫性视网膜炎(例如，由感染触发)，创伤，糖尿病视网膜病，脉络膜新血管，视网膜缺血，视网膜血管阻塞性疾病(例如，视网膜分支静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支动脉阻塞、视网膜中央动脉阻塞等)，病理性近视，血管样条纹，黄斑水肿(例如，任何病因的)，中心性浆液性脉络膜视网膜病变。
一些实施方式涉及施用组合物以抑制光感受器、RPE或视网膜神经节细胞死亡(例如，凋亡)。在一些实施方式中，组合物包含药物、小分子、肽、核酸、分子复合物等。在一些实施方式中，本发明提供了光感受器、RPE或视网膜神经节细胞保护性多肽的施用以抑制光感受器或RPE或视网膜神经节细胞凋亡。
一些实施方案涉及使用多肽减弱TNFR超家族的一个或多个成员(期望在光感受器和/或视网膜中的Fas或TRAIL)的激活的方法。在一些实施方式中，这种方法被用于例如抑制细胞和组织中的细胞死亡(例如，细胞凋亡)，并且可在体内、间接体内或体外使用。因此，根据这样的方法，化合物1可用于减弱细胞死亡(例如，视网膜细胞死亡)。对于体外应用，化合物1可以足以抑制细胞内细胞凋亡和抑制发炎的量和时间过程提供给细胞，典型地为细胞种群(例如，在合适的制品诸如缓冲溶液内)。如果需要，可以观察未用本发明的多肽处理的对照种群来证实本发明的多肽在类似细胞种群中降低细胞死亡或炎症的抑制作用。
在一些实施方式中，本文提供了治疗多种眼部疾病或状况(例如，视网膜的)或预防免于眼部疾病或状况导致的视网膜细胞死亡的方法，所述眼部疾病或状况包括：青光眼，黄斑病变/视网膜变性，诸如黄斑变性，包括年龄相关的黄斑变性(AMD)，诸如非渗出性的年龄相关的黄斑变性和渗出性的年龄相关的黄斑变性；脉络膜血管新生；视网膜病变，包括糖尿病视网膜病、急性和慢性黄斑视神经视网膜病、中心性浆液性脉络膜视网膜病；和黄斑水肿，包括黄斑囊样水肿、糖尿病黄斑水肿；葡萄膜炎/视网膜炎/脉络膜炎，诸如急性多灶性鳞状色素上皮病、白塞病(Behcet’s disease)、视网膜脉络膜病、传染性(梅毒、莱姆病、结核病、弓形虫病)、葡萄膜炎、包括中间葡萄膜炎(睫状体扁平部炎)和前葡萄膜炎、多灶性脉络膜炎、多发性一过性白点综合征(MEWDS)、眼结节病、后巩膜炎、匍行性脉络膜炎、视网膜下纤维化、葡萄膜炎综合征和伏格特-小柳-原田综合征；血管疾病/渗出性疾病，诸如视网膜动脉阻塞性疾病、视网膜中央静脉阻塞、弥散性血管内凝血病、视网膜分支静脉阻塞、高血压眼底改变、眼缺血综合征、视网膜动脉微动脉瘤、外层渗出性视网膜病变、旁中心凹毛细血管扩张、半侧视网膜静脉阻塞、视乳头静脉炎、视网膜中央动脉阻塞、视网膜分支动脉阻塞、颈动脉疾病(CAD)、霜样树枝状视网膜血管炎、镰状红细胞性视网膜病和其它血红蛋白病、血管样条纹症、家族性渗出性玻璃体视网膜病、伊尔斯氏病、创伤性/外科手术疾病(交感性眼炎、葡萄膜炎视网膜病、视网膜脱离、创伤、激光、PDT、光凝固、手术过程中的低灌注)、放射性视网膜病、骨髓移植性视网膜病；增生性疾病，诸如增生性玻璃体视网膜病和视网膜前膜，增生性糖尿病视网膜病。传染病：眼组织胞浆菌病，眼弓蛔虫病，眼组织胞浆菌病综合征(OHS)，眼内炎，弓形虫病，与HIV感染相关的视网膜病，与HIV感染相关的脉络膜病，与HIV感染相关的葡萄膜病，病毒性视网膜炎，急性视网膜坏死，进行性外侧视网膜坏死，真菌性视网膜疾病，眼梅毒，眼结核病，弥漫性单侧亚急性视神经视网膜炎，和蝇蛆病；遗传病，诸如色素性视网膜炎、与视网膜营养不良相关的全身性障碍、先天性静止性夜盲症、视锥营养不良、斯特格病变、眼底黄色斑点症、先天性黄斑变性、视网膜色素上皮图形状营养不良(pattern dystrophy of the retinal pigment epithelium)、X-连锁视网膜劈裂症、索斯比眼底营养不良(Sorsby’s fundus dystrophy)、良性同心黄斑病、Bietti晶状体营养不良、弹性假黄瘤。视网膜撕裂/裂孔：视网膜脱离，黄斑裂孔，巨大视网膜裂孔；肿瘤，诸如与肿瘤相关的视网膜病、RPE先天性肥大、后葡萄膜黑色素瘤、脉络膜血管瘤、脉络膜骨瘤、脉络膜转移癌、视网膜和视网膜色素上皮的结合错构瘤、成视网膜细胞瘤、眼底血管增生性肿瘤、视网膜星形细胞瘤、眼内淋巴肿瘤；以及其它疾病和状况，诸如点状内层脉络膜病、急性后多灶性鳞状色素上皮病、近视性视网膜变性、急性视网膜色素上皮炎、角膜营养不良或发育异常等。
某些实施方式提供了用于增加光感受器、RPE或视网膜神经节存活的方法，其包括施用包含化合物1或其药物上可接受的盐的药物组合物。根据良好的药物实践，药物化合物可以与药物上可接受的载体和任选的赋形剂、佐剂等配制的组合物形式施用。组合物可以是固体、半固体或液体剂型的形式：如粉剂、溶液剂、酏剂、糖浆剂、悬浮剂、霜剂、滴剂、膏剂和喷雾剂。如本领域技术人员将认识到的，取决于所选的施用途径(例如滴眼剂、注射等)，确定组合物形式。一般而言，优选使用本发明抑制剂的无菌单位剂量形式，以实现活性药物化合物的简单且准确的施用。通常，治疗有效的药物化合物以这样的剂量形式存在，其浓度范围为总组合物重量的约0.01％至约1.0％，即以足以提供所需单位剂量的量存在。
在一些实施方式中，药物组合物可以单剂量或多剂量施用。具体的施用途径，产品要求和剂量方案将由技术人员根据待治疗个体的状况和所述个体对治疗的反应来确定。在一些实施方式中，用于向受试者施用的单位剂量形式的组合物，其包含药物化合物和一种或多种无毒的药物上可接受的载体、佐剂或媒介物。如上所述，可以与这些材料组合以产生单次剂量形式的活性成分的量将根据各种因素而变化。如药物领域中可获得的，各种材料可以用作本发明组合物中的载体、佐剂和媒介物。可注射制品如油质溶液、悬浮液或乳液可以根据需要使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制，如本领域已知的。无菌注射制品可使用无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂，诸如无菌非热原水或1,3-丁二醇。可使用的其它可接受的媒介物和溶剂可以是5％右旋糖注射液、林格注射液和等渗氯化钠注射液(如USP/NF中所述)。此外，无菌的固定油可以常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯。脂肪酸如油酸也可用于制备可注射组合物。
药递送到眼组织中有几种可能的途径。施用途径取决于目标组织。在某些实施方式中，施用途径可以是常规施用途径，例如体表或全身施用。主要以滴眼剂形式的体表施用可用于治疗影响眼前段的病症。也可经由直接注射施用，例如玻璃体内注射，其涉及使用例如30G针将药溶液直接注入玻璃体液(VH)中。其它施用途径，例如使用药载体也可能是合适的。
在一些实施方式中，药物组合物可以眼部(即，至眼睛)施用，例如，使用本文描述的技术，和/或本领域已知的其它技术(例如，注射、体表施用等)(参见，Janoria etal.Expert Opinion on Drug Delivery.July 2007,Vol.4,No.4,Pages 371-388；Ghate&Edelhauser.Expert Opin Drug Deliv.2006March；3(2):275-87；Bourges et al.AdvDrug Deliv Rev.2006Nov.15；58(11):1182-202.Epub 2006Sep.22；Gomes Dos Santos etal.Curr Pharm Biotechnol.2005February；6(1):7-15；其全部内容通过引用并入本文)。
在一些实施方式中，组合物可以与一种或多种其它试剂共同施用以有效保护光感受器和/或抑制细胞凋亡。
在一些实施方式中，提供了包含化合物1或其药物制品的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒还提供装置、材料、缓冲液、对照、说明书、容器(例如，小瓶、注射器)等(例如，用于施用)。例如，可以包装上述组合物和/或制剂中的任何一种。任何上述组合物和制剂可以分布在预填充注射器中。组合物和加工产生无菌的非热原性产物。包装的功能是保持产品的无菌性。
实施例
在描述的实施方式的开发期间进行实验以开发化合物1的生物活性药物制剂(例如，用于玻璃体内施用)。根据肽溶液在DMSO中的剂量，在体外和体内检验化合物1的光感受器保护特性。化合物1在pH约3以上具有差的水溶性，并且非常倾向于在含水环境中形成凝胶或沉淀物。根据物种内玻璃体体积，从大鼠到人的有效剂量的比例调整，确定了作为初始目标的10-20mg/mL的目标浓度，鉴于测试所证实的所述实施方式的令人惊讶的优异的效力和暴露，更期望得到较低浓度(0.5-2.0mg/mL)(实施例1-6)。
实施例1：化合物1制品和测试
在经由Fmoc化学合成的Fmoc-酰胺-AMS树脂(由多个供应商)上合成化合物1肽(肽His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-NH2；SEQ ID NO:1)。Fmoc保护的氨基酸购自GL Biochem。用于偶联和切割的试剂购自Aldrich。溶剂购自Fisher Scientific。
通过反复去除Fmoc保护基和偶联保护的氨基酸，将肽链组装在树脂上。DIC和HOBt作为偶联剂，以NMM为基底；使用DMF中含20％哌啶作为去Fmoc-试剂。每次偶联后进行茚三酮试验以检查偶联效率。
最后一次偶联后，洗涤并干燥树脂，通过用切割混合物(TFA/Tis/H2O/DOTA：95/3/2/2)进行处理将肽从树脂上切下。从冷醚中沉淀出肽并过滤收集，得到13g纯度为46％的粗品(产率：127％)。
对于两个制备纯化操作中的每一个，将约4.4g的粗品肽通过含有TFA缓冲液(缓冲液A，0.1％TFA的水溶液；缓冲液B，100％乙腈)的2英寸聚合物柱纯化，得到纯度>85％的馏分用含有TFA缓冲液的2英寸C18柱进一步纯化。将纯度>95％的收集馏分冻干干燥，从8.8g粗品获得3.68g纯度>95％的TFA盐物质。向1.5g肽(TFA作为抗衡离子)中加入足够的HCl水溶液以溶解肽。将在HCl水溶液中的肽冻干干燥。获得1.4g纯度为97.0％的HCl盐的最终肽。HPLC，15％CAN，在水中，0.1％TFA，Venusil XBP-C18 4.6×250mm 1.0mL/分钟；RT 17.79分钟。质谱APCI MH+1461.5。
微量分析。实测值：C,52.21；H,6.49；N,15.42；Cl,6.73.KF,3.75％。C71H100N18O16·3HCl·3.4H2O的计算值：C,52.24；H,6.59；N,15.45；Cl,6.52.KF,3.75％.％活性＝89.55％.
仍然合成作为三氟乙酸盐的肽的后期样品，但用乙酸盐进行阴离子交换，得到化合物1的三乙酸盐。
实施例2：化合物1的pH–溶解度曲线
如实施例1中所述，以三盐酸盐的形式获得化合物1，并通过根据以下方案进行pH滴定，在不同的pH下筛选水溶性。在一些情况下，Met-12通过相同的实验程序运行以确定其在相同条件下的pH溶解度曲线。先前的多个实验没有发现任何其中Met-12可在高于2.7的任何pH下在基本含水介质中令人满意地配制的条件。
将化合物1(10mg)溶解在带有涡旋的2mL透明塑料离心管中的水(270-900μL)中，产生pH约为2.4的溶液。在所有情况下，肽形成澄清的溶液，表明在低pH下溶解度至少为40mg/mL。然后用适量的助溶剂或其它赋形剂(糖\表面活性剂等)稀释该溶液，在室温(22-23℃)下，产生10mg化合物1在900μL测试溶液中的澄清酸性溶液。使用微量注射器添加少量的碱性溶液(通常是1.0M或0.1M的氢氧化钠，但有时在研究缓冲液时使用其它碱)。在添加之间，通过涡旋混合溶液，并且目视检查溶液中各种类型的沉淀物，浑浊物(作为微沉淀物的可能迹象)和粘度来检测凝胶形成。在所有这些观察点进行pH测量。一些实验从内源性低pH值滴定到pH 10，但是后来的滴定没有进行到远高于pH 7，或者有时甚至更低。
用氢氧化钠滴定含水化合物1溶液表明，与Met-12相比，略好的pH限制溶解度，其中澄清的流动溶液的pH值约为3.3，而对于Met-12pH值为3.0。然而，当使用五种缓冲碱，Tris、组氨酸、柠檬酸钠、硼酸钠和磷酸钠代替氢氧化钠进行滴定，一般在pH为2.6-2.9范围内观察到粘度和凝聚迹象。在一到两种情况中，还在低于pH 3时观察到原纤维形成。从这些实验看来，化合物1不具有比Met-12更好的水溶性-pH曲线。
实施例3：在助溶剂混合物中的化合物1的pH依赖性溶解度
使用助溶剂和添加剂检查化合物1的pH依赖性溶解度，并在相同条件下与Met-12溶解度进行比较。
70％DMSO实验类似于在pH 5.5附近形成凝胶的Met-12滴定，但是在这种情况下，可能是因为C-末端不能被离子化，凝胶不再溶解于更高的pH值。
与Met-12相比，70％的丙二醇(PG)改善了化合物1的溶解度，与Met-12的pH 3.2相比，直到pH 4.7左右才发生胶凝，然后保持为凝胶至pH 10。用较低量的PG(35％，10％)重复该滴定，但似乎没有发现比在纯水中改善的溶解度。
70％的PEG400和70％的甘油溶液似乎没有用，两种糖添加剂、10％甘露醇或10％海藻糖也是如此。
从这些实验可以得出结论，丙二醇在一些限制条件下可能是对化合物1有用的助溶剂，但对于Met-12不是。
实施例4：在非离子表面活性剂混合物中的化合物1的pH依赖性溶解度
令人惊讶的是，所检查的一些表面活性剂提供了显著改善的化合物1的pH-溶解度曲线，而所测试的表面活性剂都没有改善的Met-12的pH-溶解度曲线。在10％泰洛沙泊存在下的化合物1保持澄清，并具有可接受的粘度，直到pH高于5.87。为10％聚山梨酯80时，澄清溶液直到pH值6.36以上才变得明显粘稠。为10％聚山梨酯20时，在pH 3.2时观察到原纤维，但没有浑浊或凝胶化的迹象，直到pH 7.14。10％泊洛沙姆407对于不溶性开始可能发生的位置有些模棱两可，因为第二相清楚地存在于pH 5-9范围内，尽管溶液似乎是可流动的。这似乎是由溶液中形成的非常大的透明球体组成的。这被认为是高泊洛沙姆浓度的假象，因为15％的泊洛沙姆溶液在27℃完全凝胶化，而10％的泊洛沙姆在25℃凝胶不明显，但各种添加剂可以提高或降低溶胶-凝胶临界温度，通常的凝胶粘度测量不会有效地得到分离凝胶相的初始显现。因此，认为在混合物中没有肽的溶解度损失，但大量泊洛沙姆形成两个泊洛沙姆相，溶胶相和凝胶相。聚维酮K30在pH 3.60产生粘稠溶液，其在pH 4.0以上凝胶化。
然后相对于添加的表面活性剂的量，滴定一些表面活性剂。当聚山梨酯20滴定至3％和1％浓度时，在pH 2.5以下观察到原纤维形成，但是在两种情况下都没有看到其它的沉淀迹象，直到pH分别为4.14和3.76。4％的泊洛沙姆407在滴定开始时产生少量和明显无增加的原纤维数量，但直到pH值高于6.2没有其它的沉淀迹象，并且2％的泊洛沙姆407产生澄清的溶液直到pH高于5.6。一旦开始滴定，在溶液中看到0.5％原纤维，但直到pH高于4.5没有看到进一步的沉淀迹象。
在大多数所检查的表面活性剂中，化合物1明显优于Met-12，特别是聚山梨酯80、泊洛沙姆407和泰洛沙泊，其中由于观察到的初始原纤维形成，聚山梨酯20的数据有些不明确，虽然它比大多数的化合物澄清，其在pH 3-6为溶液，与Met-12在相同媒介物中的相反。因此，在助溶剂-表面活性剂混合物中观察化合物1的溶解度，从高添加剂浓度下开始，然后在稀疏种群的基质实验设计中的一种或两种添加剂的较低浓度下。
实施例5：化合物1的混合的非离子表面活性剂/助溶剂溶解度研究
70％PG和10％聚山梨酯80的组合产生了澄清的溶液，其在pH 3.4时变粘稠，并在pH 5.25时凝胶化，使其不优于70％PG，并且差于10％PS-80。
对于70％PG、3％PS，粘稠开始于pH 4.6，但是该材料在pH 5.25时仍然是凝胶。
对于35％PG和3％PS-80，在pH低至2.66时原纤维在溶液中出现，并且在pH 3.48时在溶液中看到聚集体。
35％PG、10％PS-80显示没有原纤维或聚集体的迹象，并且在pH 4.05时观察到明显的粘稠，在pH 5.71时凝胶化(低于10％PS-80本身)。
10％PG和10％PS-80直到pH 4.94时产生具有低粘度的澄清溶液，并且高于pH5.13时开始沉淀材料。
10％PG和3％PS-80产生澄清的溶液直到pH 3.16，但是在pH 3.4时发生一些沉淀。
如前所述，含有10％聚山梨酯20的溶液似乎给出清澈的流动溶液直到pH 7，但是即使在低pH下可见到一些原纤维，并且随着pH的增加，这些原纤维趋于增加。
令人惊讶的是，10％PG和10％聚山梨酯20的组合导致良好的溶解性，且可观粘稠的出现仅在pH 7以上重复地发生，并且没有任何可见沉淀的可见指示。然而，静置过夜后，溶液凝胶化，pH降低约0.2个单位。温和地搅拌使凝胶转化为可注射的液体。
3％聚山梨酯20和10％PG产生澄清的流动溶液直至pH 5.3，但是使PS-20降至1％在pH 3以下产生原纤维。
将10％PG添加到4％、2％和0.5％泊洛沙姆制剂中。使用4％泊洛沙姆制剂，看起来有轻微的改善，在低pH下看不到原纤维，并且直到至少pH 5.36时是澄清溶液。2％泊洛沙姆和10％PG直到pH 5.74与澄清流动溶液一样好。滴定开始时，0.5％泊洛沙姆制剂显示原纤维，并且在pH 3.45时显示出一些浊度，但保持低粘度直至pH 6。
在2％、1％和0.5％泊洛沙姆制剂中加入3％、1％或不加PG，并且在室温放置3天后，在pH 4.5、pH 5.5和pH 7.0下测量稳定性，使用目视和过滤(见下面的实施例)分析。可见，在新制样品中观察到原纤维的频率较低，在更少的赋形剂存在下和更高的pH下它们更可能被观察到，而所有的pH 7.0样品最初是混浊的，并且一些具有明显的沉淀。所有pH 4.0样品最初都不是混浊的，只有0.5％PX、0％PG在静置后显示轻微的浊度。对于pH 5.5的样品，在所有的0％PG样品和1％PG、0.5％PX样品中都观察到初始的轻微混浊，但在静置后仅仅最低的赋形剂样品(0.5％PX、0％PG)显示轻微的浊度。这些样品中的一些在搅拌下变得稍微浑浊。过滤分析描诉了一个截然不同的情况。使用2％泊洛沙姆制剂，所有三种pH 4制剂在过滤后具有>98％的回收率，并且在pH 5.5下回收率>96％，并且在pH 7.0时回收率仍然为86-93％。在pH为4的1％PX制剂中，过滤后回收率为97-98％，pH为5.5时为87-93％，但在pH 7时仅为1-13％。在0.5％的PX制剂中，在pH 4时过滤后回收率为73-88％，pH 5.5时为12-43％，并且在pH 7时，过滤后在三个样品中的任何一个中没有回收。
从这些实验可以得出结论，作为助溶剂的相对低量的PG可以对一些表面活性剂适度地有帮助，但是高浓度是有害的，并且这些制剂效果的预测性不高。在PX制剂中，PX存在量和制剂pH值都比PG水平更重要。此外，视觉读数不一定与更可靠的过滤测定一致，并且原纤维的观察尤其似乎与可过滤药的存在量不相关。
实施例6：化合物1的较低浓度的非离子表面活性剂的溶解度研究
体外和随后的体内功效实验证明化合物1在阻断光感受器细胞中FasL(或视网膜脱离)诱导的凋亡方面效力是3->10-倍。这些令人惊讶的结果允许计划人体剂量降至25-200μg/眼的范围，这将配制的药的最大所需浓度降低至2.0mg/mL。进行进一步的实验以找到在该浓度下的最佳制剂条件，一些实验考虑甚至更低的药浓度。这项工作都考虑了泊洛沙姆407或聚山梨酯20作为表面活性剂。可见的浊度和肉眼估计的粘度都是有用的筛选观察，但是如上所述，发现它们并不总是指示存在聚集的肽，并且大部分后来的工作经由测量在通过0.2微米PVDF膜或PALL 25mm 0.2μm Ultipor尼龙6,6过滤器之前和之后的样品中存在的药量来评估溶解度。浑浊或高度粘稠的溶液通常难以或不可能过滤，并且当它们可以被过滤时，往往给出非常低的药物回收率。令人惊讶的是，一些流动的、澄清的溶液在过滤时也表现出大量的损失，所以令人满意的制剂被定义为那些在过滤后使药物回收率>90％的制剂。应该指出，所有形成原纤维的如化合物1的化合物的溶解度测量只能测量动力学溶解度。在许多条件下原纤维形成可能非常缓慢，并且可以是测量亚稳溶液的溶解度，其中相对于最稳定可能的原纤维形式而言真正的热力学溶解度可能需要几天到几年才能完全实现。然而，在过滤之前，制剂通常静置24-72小时，以避免至少配制后的快速沉淀。
初始实验观察化合物1在pH4的3％PS-20/3％PG和2％PX/2％PG中的1mg/mL的溶液。全部产生澄清溶液，过滤时没有API的损失。接下来的实验观察在pH～3、pH 4、pH 5.5和pH 7的2％PG和0.1％、0.25％和0.5％PX以及0.5％PG和PX中的2mg/mL。除pH值为7、0.1％的PX样品略微浑浊和外观上可流动外，其它样品均是澄清和可流动，但过滤时没有产生回收。pH 5.5的回收率仅为78％，pH为4.0时92％。较高的PX量导致在pH 3和4.0时完全回收，在pH5.3时为93-97％，在pH 7.0时为88-92％。高和低含量PG、0.5％PX是基本相同，这表明PG在制剂复制(formulation manifold)这个区域中并不是非常重要。
因为在这些实验中，偶尔在延长放置时观察到相当大的pH变化，用2.0mg/mL化合物1和0.25％PX进行类似实验。2％PG在pH 3、4、5.5和7下运行，同时通过过滤测定分析，比较自缓冲材料(用NaOH滴定的盐酸盐)和10mM组氨酸、乙酸盐和柠檬酸盐缓冲液。乙酸盐缓冲液在所有pH下至少与自缓冲材料同样好，组氨酸缓冲液略微差，并且柠檬酸盐缓冲液在所有三种较高pH下明显差，在pH 4下仅回收75％，相比而言，而对于组氨酸缓冲液为91％，无缓冲液为92％，乙酸盐缓冲液97％。然后标准化醋酸盐缓冲液。
为了检查等渗剂的作用，用0.5％和2％PG、4.5％甘露醇、2％甘油和0.8％含水氯化钠检查含有2mg/mL化合物I和0.25％PX的pH 4和pH5.5的10mM乙酸盐缓冲溶液。除了氯化钠样品外，所有样品在pH 4.0下回收率为98-99％，在pH 5.5下回收率为90-94％，而氯化钠样品在两个pH下回收率分别为89％和79％。除0.5％PG为相当低渗的外，其余均在230-310mOsm/L范围内。使用10mM乙酸盐缓冲液和4.5％甘露醇作为等渗剂，观察2mg/mL化合物1和pH 4.0和5.5、五种表面活性剂条件。它们是无表面活性剂、0.1％PS-20、0.1％PS-20和0.25％PX、0.25％PX以及0.4％PX。无表面活性剂在高pH下过滤0％，且在pH 4.0下过滤23％，以及0.4％PX和0.25％PX/0.1％PS-20混合物在pH 4.5下完全回收，在pH 5.5下分别回收95％和91％。在pH 4和5.5下，0.25％PX分别以96％和91％分别较差，0.1％PS以90％和65％的回收率相当差。
由于等渗性实验已经表明盐酸盐的溶解度可能差，所以使用2mg/mL的化合物1的三乙酸盐进行实验。尽管样品溶于10mM乙酸、4.5％甘露醇和0.4％、0.5％、0.6％、0.8％和1.0％PX或0.4％、0.5％、0.75％、1.0％和1.5％PS-20，并将pH调节至4.0或5.5，由于乙酸的弱酸性，该盐以2mg/mL在水中的固有pH为3.4-3.6。所有未调节pH(3.4-3.6)的样品在过滤后显示出>97％的回收率，并且在pH 4时>98％。在pH 5.5下，0.4和0.5％的PX具有96％的回收率，并且更高的PX浓度产生98-99％，而PS-20制剂在该pH下均回收92-94％。从这些实验中，优化的制剂可以含有比类似的基于PS-20的制剂更少的PX，但是PS-20仍然是可接受的，并且可以避免一些PX的潜在问题，即使在较高浓度下给予。
实施例7：化合物1的体外功效
细胞培养。661W感光细胞系由Muayyad Al-Ubaidi(Department of CellBiology,University of Oklahoma Health Sciences Center,Oklahoma City,OK)慷慨提供。661W细胞系是光感受器系，其已经在人光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)启动子控制下通过SV40-T抗原的表达永生化(AI-Ubaidi et al.,J Cell BioI.,119(6):1681-1687(1992)，在此通过引用整体并入)。661W细胞表达锥光感受器标记物，包括蓝色和绿色的视锥细胞色素(cone pigments)，转导蛋白和锥抑制蛋白(Tan et al.,Invest OphthalmolVis Sci.,(3):764-768(2004)，在此通过引用整体并入)，并且可经历胱天蛋白酶介导的细胞死亡(Kanan et al.,Invest Ophthalmol Vis Sci.,48(1):40-51(2007)，在此通过引用整体并入)。
将661W细胞系维持在含有10％胎牛血清、300mg/L谷氨酰胺、32mg/L腐胺、40μL/Lβ-巯基乙醇、40μg/L氢化可的松21-半琥珀酸酯和40μg/L黄体酮的达尔伯克改良伊格尔培养基。培养基还含有青霉素(90U/mL)和链霉素(0.09mg/mL)。细胞在37℃，5％CO2和95％空气的潮湿气氛下生长。
活性测定。按照制造商的说明书(BioVision，Mountain View，Calif)，用比色四肽切割测定试剂盒测量胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的活性。根据先前公开的方案(Zacks et al.,IOVS,44(3):1262-1267(2003)，通过引用整体并入本文)提取总共(661W/视网膜)蛋白质。将一百微克总(661W/视网膜)蛋白在200μM最终浓度的胱天蛋白酶3(DEVD-pNA)、胱天蛋白酶8(IETD-pNA)或胱天蛋白酶9底物(LEHD-pNA)培养60分钟。在酶标仪(Spectra-MAX 190,Molecular Devices,Sunnyvale,Calif)中在405nm处测量吸光度。作为阴性对照，(661W/视网膜)蛋白质用不含四肽的测定缓冲液培养。使用第二个阴性对照，其中单独的测定缓冲液用四肽培养。作为阳性对照，将纯化的胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8或胱天蛋白酶9用四肽单独培养。
在本发明的开发过程中进行的先前实验表明，Fas信号传导在体内胱天蛋白酶8激活和光感受器细胞凋亡中起关键作用。
用FasL处理661W细胞。FasL的添加导致细胞死亡。在661W细胞裂解物中测量的胱天蛋白酶8的活性随着FasL浓度的增加而增加，以500ng/ml剂量达到峰值。用500ng/mlFasL处理661W细胞，并在各个时间点测量活性水平。在661W细胞暴露于FasL48小时，胱天蛋白酶8活性显著增加。在不同的运行中，胱天蛋白酶8活性可靠地以剂量依赖性方式增加20-30％。
上述测定系统被用作体外筛选系统以发现Fas-诱导胱天蛋白酶8激活通路的潜在抑制剂。当在该661W细胞测定中测试Met-12(三盐酸盐)时，其显示了FasL诱导胱天蛋白酶8激活中剂量依赖性减少，最大值为10μM，其中取决于测定，胱天蛋白酶8激活被降低至基线的0-25％。该活性非常依赖于递送Met-12肽的制剂。Met-12的最终制剂被稀释1000倍用于该测定，并达到通常为100μM的剂量曲线的顶部，使用较少的稀释度。在这些情况下，用纯二甲亚砜溶液观察到最大剂量效力，所述二甲亚砜溶液以澄清、流动的液体递送Met-12肽，其中表观pH远低于3.0。当试验水性基配方时，即使在将材料加入测试孔之前没有沉淀或聚集的视觉证据的情况下，配方显示出相当小的剂量效力，直到50-100μM剂量才达到最大抑制。
这强烈提示，无论测试孔中的最终物理形式如何，即使在这些细胞测定中，在剂量溶液中的聚集导致具有比被稀释到完全相同的条件的真正溶液少得多的可用药的物质，其中假定它们具有相同的内在潜在溶解度。迄今为止对此最可能的解释是非溶液中的预形成的聚集体是动力学和热力学足够稳定的以致无法在测试期间以最佳速率解聚成溶液，而当稀释到测试孔中时溶液不形成聚集体，或者更可能形成更容易溶解的不同的聚集体。聚集体不同的主要原因是，当肽从其pH或助溶剂增强的可溶形式转移到pH 7.4的99％含水环境时，肽的浓度至少稍低。然而，由于在测试孔中不可能有效混合，并且在眼睛中不可能，并且如下文所讨论的，受质子(低pH)和小分子溶剂将比疏水且庞大的肽更快地在水中扩散，这些肽极有可能在剂量后立即迅速聚集在测试孔或玻璃体液中。因此，虽然溶液剂量明显优于悬浮液/凝胶剂量，但不能保证不会将大量的肽作为不溶性聚集体螯合，并且在施用时随机地减少药的有效浓度。
意想不到的是，如图1所示，当在该测定中将化合物1三盐酸盐作为在DMSO中的非缓冲溶液测试时，与Met-12(也是三盐酸盐在DMSO中)相比，IC50测定证明其比Met-12的效力强10倍，通过产生对FasL诱导的胱天蛋白酶8激活的最大抑制的浓度测量，其效力强约3倍。EC50为0.4μM，而对于Met-12本身为4μM，在3μM时观察到最大抑制。然而，高于3μM时，化合物1显示出U形曲线，并且高于30μM，似乎几乎不活跃。相反，以相同方式剂量的Met-12在10μM时达到其(稍微更大的)最大功效，然后100μM之外仅有轻微的回跳损失效力。(见图1；在用Met-12和化合物1预处理后用人重组FasL处理48小时后胱天蛋白酶8活性)。0％是未处理对照的胱天蛋白酶8活性水平。100％设定为仅用FasL处理的对照的胱天蛋白酶8活性。
由于FasL的作用机理涉及Fas受体的三价配体三聚作用，非常难以看出单价Met-12衍生物可能具有混合的激动剂-拮抗剂剂量曲线，并且认为效力的丧失是测定的溶解度伪像。然而，化合物1的剂量效力的意外增加应允许给予比Met-12本身所需量更低量的药，这又降低了肽制剂对玻璃体内注射的溶解度要求。
图2中所示的数据与上面的解释是一致的。它再一次显示化合物1三盐酸盐在DMSO(20mg/mL)中比Met-12稍微更有剂量效力，但是它在较高浓度下再次失活。相反，当在pH 4的2％聚山梨酯20和2％PG的透明的、可过滤的可能胶束溶液中以10mg/mL的浓度配制时，化合物1三盐酸盐的剂量效力显著更高，但是也比Met-12或化合物1在DMSO中更有效。此外，在该测定中测试的最高剂量30μM处最大效力的损失很少。这个令人惊讶的结果表明，在表面活性剂中配制化合物1的能力可以导致药物功效的大幅提高。
图3比较了20mg/mL DMSO溶液与含有1％和3％PS-20和3％PG的化合物1三盐酸盐的两种聚山梨酯制剂(pH 4)，全部浓度均为10mg/mL。在这种情况下，所有3种在较低浓度下显示出相似的效力，但是1％PS-20仅显示出从其最有效的3μM浓度的微弱活性损失，一直到30μM，而3％PS显示活性持续增加直到30μM，测试的最高剂量。
在图4中，化合物1三盐酸盐的优化制剂(深色三角)：浓度为2mg/mL，在pH 4，10mM乙酸盐缓冲液、4.5％甘露醇和0.4％PS-20中，与20mg/mL的化合物1三盐酸盐在DMSO(浅色圆圈)在661W细胞中进行比较。三盐酸盐在DMSO中显示出通常的U型曲线，在3μM时具有最大效应，且在较高浓度下具有相当大的反弹。由于其浓度低，该制剂仅能被测试至10μM，但显示与DMSO溶液相似的功效。
使用胶束制剂观察到的更高功效的可能解释是肽溶解度通过表面活性剂的自组倾向而保持更长的时间，这仅通过稀释和分散缓慢地受到影响，而与pH梯度或小分子助溶剂形成鲜明对比。因此，胶束和肽在肽被释放到含水介质中之前被更广泛地分散到含水介质中，因为胶束仅缓慢分开，而在助溶剂或高酸性溶液中，增溶因子(氢离子、小分子)在肽具有任何真正的机会分散到注射剂直接放置的区域外之前非常迅速地稀释到含水介质中。这将导致肽从溶液制剂中分散的效率较低，并且相比其形成胶束制剂，形成更多的失活聚集体。
实施例8：用化合物1进行的兔玻璃体内眼部药代动力学研究
进行该研究以确定雄性荷兰带兔的玻璃体内注射后玻璃体液(VH)和视网膜组织中化合物1的浓度。在50μL双侧玻璃体内(IVT)剂量施用后24、72、168和240小时，确定在组织中浓度。
研究设计总结在表1中。
表1.研究设计
测试系统包括以下：
物种/株/性别：雄性荷兰黑带兔(Dutch Belted Rabbits)
供应商：Covance Research Products,Inc.
年龄范围：4至5个月
接收时重量(重量范围)：1.51-1.85kg
施用途径：玻璃体内(IVT)注射
治疗时间：每只眼睛单次剂量
制剂浓度：2.0、1.0和0.5mg/mL化合物1三乙酸盐
剂量体积：50μL每只眼睛
向每只荷兰黑带兔眼的球体施用50μL玻璃体内(IVT)注射眼部剂量。
在相应的时间点，通过静脉注射巴比妥过量使兔子安乐死，并且眼睛被去核并快速冷冻。从所有动物收集玻璃体液和视网膜，并通过LC-MS/MS分析化合物1
计算：
变差系数百分比：用作精度的估计。.
变差系数百分比(％CV)＝(标准差/平均值)*100
二次最小二乘分析：使用具有1/x2权重的二次方程来确定标准曲线拟合：
y＝ax2+bx+c
其中：y＝校准标准品与内标准的峰值面积比
x＝校准标准品的浓度
a＝x2的二次方程系数
b＝x的二次方程系数
c＝该常数为校准曲线的y轴截距
二次方程的分析物浓度：使用上面计算的校准曲线参数计算分析物浓度，然后求解x的值。
结果
视网膜和VH浓度在下面的表2和表3中找到，并且在图1和2中以图形表示。适当地计算药代动力学参数，并总结在下表4和5中。
表1.荷兰黑带兔视网膜中的化合物1浓度
LLOQ＝20.0ng/mL或100ng/g
值<LLOQ使用0进行统计确定
ISD＝数据不足以确定
下划线：超出定量的上限
以及异常值，排除的数据
表3.荷兰黑带兔玻璃体液中的化合物1浓度
LLOQ＝50.0ng/mL
*假设密度1.00g/mL
下划线：疑似异常值，数据未包括在统计中
ISD＝数据不足以确定
在图5(A+B)和图6(A+B)中分别示出了该研究在视网膜和玻璃体液中的结果。对所有组研究的时间进程中化合物1的视网膜浓度是可变的，变差系数(％CV)在52％至156％范围内。在三种泊洛沙姆制剂施用后72(3天)或168(7天)小时后记录视网膜Tmax，但不是剂量依赖性的，而聚山梨酯制剂的视网膜Tmax是在施用后24小时。视网膜AUC0-last遵循与Cmax类似的可变模式。对于化合物1的视网膜T1/2只能对2mg/mL泊洛沙姆(168小时)和1mg/mL聚山梨酯(199小时)视网膜数据计算。
对化合物1的玻璃体液的分析表明在泊洛沙姆制剂的每个时间点内浓度相对一致。当通过收集的VH的重量标准化时，计算化合物1的理论总量。注入每只兔眼的化合物1的总量为泊洛沙姆100μg(2mg/mL*50μL)或25μg(0.5mg/mL*50μL)和聚山梨酯组50μg(1mg/mL*50μL)。所有组的最低平均浓度是在10天。在IVT施用后24小时至10天，组1(100μg)的VH中剩余的平均化合物1在84.2μg至106μg范围内。在IVT施用后24小时至10天，组2(25μg)的VH中剩余的平均化合物1在19.5μg至23.0μg范围内。在IVT施用后24小时至10天，组3(25μg)的VH中剩余的平均化合物1在26.0μg至20.4μg范围内。在IVT施用后，聚山梨酯组4(50μg)的VH中剩余的平均化合物1在24小时的46.8μg的高度至10天的19.4μg范围内。聚山梨酯组是唯一实现以下的制剂：化合物1的浓度随时间显著下降。然而，在所有组中，在施用后10天检测到大量完整的药。
在VH中化合物1的药代动力学参数的计算表明IVT施用后24或72小时的Tmax，其Cmax与每组施用的总量(表4)紧密匹配。在泊洛沙姆组之间AUC0-last大致成剂量比例：组1(2mg/mL)与组2和3(均为0.5mg/mL)相比具有大约四倍的AUC。聚山梨酯组(1mg/mL)相对于泊洛沙姆组，小于剂量比例，但可以容易地解释，因为它是唯一在研究进程中化合物1VH浓度显著降低的组。聚山梨酯组的T1/2为183小时，线性拟合良好，而对于泊洛沙姆组的t1/2>900小时，线性拟合不太理想。
表4.玻璃体液中化合物1的药代动力学参数
*R2<0.7
表5.视网膜中化合物1的药代动力学参数
NC–未计算
总之，当在泊洛沙姆或聚山梨酯制剂中施用IVT时，化合物1在10天的研究进程中没有表现出刺激或耐受性问题的迹象。当以泊洛沙姆制剂IVT施用时，化合物1在视网膜或VH中浓度不会在长达10天、并且可能更长的期间轻易降低。当以聚山梨酸酯制剂施用时，化合物1在10天的研究进程中表现出尽管缓慢但明确的浓度降低，表明通过仔细选择所使用的非离子表面活性剂，玻璃体内药代动力学在某些参数内可以是可控的。
实施例9：用化合物1的大鼠眼部药代动力学研究
进行该研究以确定玻璃体内注射棕色挪威大鼠后玻璃体液和视网膜组织中化合物1三盐酸盐的浓度。确定在5μL双侧玻璃体内(IVT)剂量的给量后24(组1)和72小时(组1和2)的组织中浓度。
研究设计总结在表6中。
表6.研究设计
测试系统包括以下：
物种/株/性别：挪威棕色大鼠(Norway Brown Rats)
供应商：Charles River,Inc.
年龄范围：1至2个月
接收时重量(重量范围)：165.9–181.2g
施用途径：玻璃体内(IVT)注射
治疗时间：每只眼睛单次剂量
制剂浓度：0.06mg/mL ONL-1204三乙酸盐
剂量体积：50μL每只眼睛
眼部组织的获得
通过静脉内巴比妥酸盐过量使大鼠安乐死，并将眼睛摘除并急冻。从所有动物收集玻璃体液(VH)和视网膜，并通过LC-MS/MS分析化合物1。
结果
眼部组织浓度
化合物1三盐酸盐在棕色挪威大鼠视网膜和玻璃体液未知物中浓度。
表7.棕色挪威大鼠视网膜中的化合物1浓度
LLOQ＝20.0ng/mL or 100ng/g
值<LLOQ使用0进行统计学确定
脚注1：对于大鼠视网膜组织假设为1.00g/mL
表8.棕色挪威大鼠玻璃体液内化合物1的浓度
LLOQ＝50.0
ng/mL
*假设密度为1.00g/mL
组织均质化
用于玻璃体液(VH)未知物均质化的说明
对于每个VH未知物或对照空白：将VH称重到均质管中。添加4倍VH重量(mg)的ACN：水：1M盐酸(70:20:10，v/v/v)(μL)至均质管。加入氧化锆珠，尺寸为2.8和1.4毫米。使用在以下条件下均质化所有样品：5500rpm，3×30秒循环和循环之间20秒，温度在-10℃至0℃之间。
用于视网膜眼部组织标准品均质化的说明
对于每个视网膜标准品：
将空白视网膜组织称重到均质管中。
添加0.5倍组织重量(mg)的视网膜工作校准标准品(μL)至均质管。
添加3.5倍组织重量(mg)的ACN：水：1M盐酸(70:20:10，v/v/v)(μL)
至均质管。
加入氧化锆珠，尺寸为1.4毫米。
使用在以下条件下均质化所有样品：5500rpm，3×30秒循环和循环之间20秒，温度在-10℃至0℃之间。
用于视网膜组织空白对照和未知物均质化的说明
对于每个未知视网膜或对照空白：
将视网膜组织称重到均质管中。
添加4倍组织重量(mg)的ACN：水：1M盐酸(70:20:10，v/v/v)(μL)至均质管。
加入氧化锆珠，尺寸为1.4毫米。
使用在以下条件下均质化所有样品：5500rpm，3×30秒循环和循环之间20秒，温度在-10℃至0℃之间。
标准品、样品和空白的制备
校准原液和工作标准品的制备
在二甲亚砜(DMSO)中制备ONL-1204浓度为500μg/mL的原液校准标准品。
在500ng/mL至200,000ng/mL的ONL-1204范围内通过用ACN：w水：1M盐酸(70:20:10，v/v/v)连续稀释工作原液溶液来制备用于玻璃体液的工作校准标准品。
在100ng/mL至200,000ng/mL的ONL-1204范围内通过用乙腈：水:1M盐酸(70:20:10)连续稀释工作原液溶液来制备用于视网膜的工作校准标准品。
用于玻璃体液分析的标准品、未知物、空白和带有内标准的空白的制备
在聚丙烯管中，向90μL(80μL STD 11)对照空白玻璃体液中加入十(10μL)(20μLSTD 11)工作校准标准品或原液。对于空白和带有内标准的空白，加入100μL对照空白牛玻璃体液。向每个标准品或空白中加入400μL ACN：水：1M盐酸(70:20:10，v/v/v)。
然后将一百(100μL)含有ACN：甲酸(1000：1，v/v)的每个玻璃体液样品等分。向每个玻璃体样品中加入一百(100μL)DMSO：水：甲酸(50:40:10)。将样品涡旋混合，然后以14,000rpm(4℃)离心10分钟。向50.0μL上清液中加入100μL工作内标准(50,000ng/mL APi1887在水中)(用作无内标准的空白的水)和150μL水。然后将样品涡旋混合并转移至自动进样器板进行分析。
用于视网膜分析的标准品、未知物、空白和带有内标准的空白的制备
在聚丙烯管中，加入50μL棕色挪威大鼠未知匀浆、牛对照空白或校准标准牛匀浆。将五十(50)μL DMSO：水：甲酸(50:40:10)加入到每个样品中。然后将样品涡旋混合并以14,000rpm(4℃)离心10分钟。然后将八十(80)μL各样品上清液等分到96孔自动进样器板中。加入四十(40)μL工作内标准(5,000ng/mL APi1887在水中)(用作无内标准的空白的水)和120μL水。然后将样品与多通道移液管混合并分析。
计算
变差系数百分比：用作精度的估计。.
变差系数百分比(％CV)＝(标准差/平均值)*100
二次最小二乘分析：使用具有1/x2权重的二次方程来确定标准曲线拟合：
y＝ax2+bx+c
其中：y＝校准标准品与内标准的峰值面积比
x＝校准标准品的浓度
a＝x2的二次方程系数
b＝x的二次方程系数
c＝该常数为校准曲线的y轴截距
二次方程的分析物浓度：使用上面计算的校准曲线参数计算分析物浓度，然后求解x的值。
分析
总平均结果在图7中示出。对于组1，将来自每只动物的双眼组合以进行单一分析。在组2中，来自4只动物的双眼组合制备样品。组2的合并视网膜的浓度对于AD和EH样品分别为462和1310ng/g。使用来自组1和2的每只动物的每只眼睛的组合样品进行化合物1的玻璃体液分析。当用收集的VH重量标准化，计算化合物1的理论总量。注入每只大鼠眼中的化合物1的总量为0.3μg(0.06mg/mL*5μL)。由于方式不同，收集72小时数据，没有计算标准误差。深色条框代表每只眼玻璃体液中化合物1三乙酸的量，其中t＝0的条框代表300ng的预期剂量，浅色条框代表在视网膜中化合物1的浓度，以ng/g表示。在前24个小时内，大约一半的药清除了VH，但是最终半寿期显然是几天左右。同时，24小时的视网膜浓度超过1μg/g，72小时仅有约40％。这表明大鼠视网膜将以易于检测的量暴露于药至少一周。
化合物1的视网膜浓度在组1 24小时样品中为146至3670ng/g，在组1 72小时样品中为409至804ng/g。组1的VH中剩余的平均化合物1在24小时和72小时的时间点分别为0.157和0.0994μg/样品。在72小时，组2样品的VH中剩余的平均化合物1为0.127μg/样品。数据表明大量的完整药在施用后72小时仍然存在。
实施例10：化合物1的体内功效
简而言之，用氯胺酮(100mg/mL)和甲苯噻嗪(20mg/mL)的50:50混合物麻醉啮齿类动物，并用体表苯肾上腺素(2.5％)和托吡卡胺(1％)扩张瞳孔。使用20号微型玻璃体视网膜片刀(Walcott Scientific，Marmora，NJ)在角膜缘后2mm处形成巩膜切口，小心避免晶状体损伤。
在通过手术显微镜的直接观察下，通过巩膜切开术将视网膜下注射器(Glaser，32-gauge tip；BD Ophthalmic Systems，Sarasota，FL)引入玻璃体腔内，然后通过周边视网膜切开术进入视网膜下腔。慢慢地注射透明质酸钠(10mg/mL)以将神经感觉视网膜从下面的视网膜色素上皮脱离。
在所有实验中，超声纳米神经感觉视网膜(superonasal neurosensory retina)的约三分之一至二分之一被脱离。在所有动物中，在相同位置产生脱离物以允许直接比较视网膜细胞计数。在左眼产生脱离，右眼作为对照。
在一些眼中，野生型Met-12(HHIYLGAVNYIY，5μg在DMSO中)作为其三盐酸盐作为阳性对照给出，而在另一些眼中，化合物1(0.5、1.0、5.0或10μg在DMSO中)作为其三盐酸盐或媒介物(二甲亚砜[DMSO])使用Hamilton注射器(Hamilton Company，Reno，NV)在产生脱离后立即以5μL体积注入脱离区域的视网膜下腔中。
三天后，使大鼠安乐死，将视网膜切割、固定、切片并染色以进行TUNEL测定。计数脱离的视网膜的区域用于凋亡细胞的数量。每个实验涉及从每个剂量组的5或6个视网膜获得的4个切片中的每一个的4个视野。结果显示在图8中。
如图8所示，对照附着的视网膜未显示凋亡细胞，而DMSO对照视网膜具有约4％的细胞染色用于TUNEL，而阳性对照Met-12(5μg)有略超过1％阳性用于TUNEL。化合物1三盐酸盐处理导致在0.5μg下的0.58％、在1μg下的1.14％、在5μg下的0.82％和在10μg下的0.9％。基于用模型的相当丰富的经验，化合物1的结果被认为彼此大致相同，并与Met-12 5μg阳性对照大致相同。因此，出乎意料地，化合物1三盐酸盐在此体内模型中比Met-12三盐酸盐更有效。
实施例11：功效研究
使用与实施例10中相同的啮齿动物视网膜脱离模型，将高效的5μg剂量化合物1在DMSO中与相同剂量和1μg剂量化合物1在两种不同制剂进行比较。
第一种制剂是1.0或0.2mg/mL化合物1三盐酸盐溶液在3％丙二醇和3％PS-20中，第二种制剂是相同浓度的化合物1在pH值同样为4.0的2％丙二醇2％泊洛沙姆407溶液中。结果在图9中示出。
附着的对照视网膜未显示凋亡细胞，而未处理的脱离物显示在此时间点测量的约6.5％凋亡细胞。
化合物1在DMSO中将其降低至2.5％，并且5μgPG/PS-20具有将凋亡细胞降低至2.9％的相似效力。然而，PG/PX制剂在5μg下将凋亡细胞减少至0.3％的浓度是相当好的。在1μg时，PG/PX制剂将凋亡细胞减少至0.4％，但PG/PS-20 1μg剂量产生更大的降低至0.01％。数据表明，不仅胶束形成物可以起作用，而且化合物1三盐酸盐在其中可以比配制在DMSO中时更有效。
实施例12：功效研究
使用与实施例10相同的啮齿动物视网膜脱离模型，使用化合物1三盐酸盐在DMSO(1μg)中作为阳性对照。阴性对照是正在评价的测试媒介物(0.4％泊洛沙姆、4.5％甘露醇、10mM乙酸，pH 4.5)。将化合物1三乙酸盐在DMSO(1μg)中与相同剂量的三盐酸盐进行比较。
附着的视网膜(条框4)没有凋亡细胞，而媒介物处理的脱离视网膜(条框1)显示4.2％的凋亡细胞，这表明无活性，因为其在未经处理的视网膜脱离物的历史范围内(参见实施例10)。化合物1三盐酸盐(DMSO)产生2.4％的凋亡细胞，而三乙酸盐(DMSO)仅产生1.2％，证明从盐酸盐转换为乙酸盐不具有负面影响，并且可能对功效有积极作用。
本申请中提及的和/或下面列出的所有出版物和专利均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和组合物的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方式描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应当不适当地限于这些具体实施方式。实际上，所描述的用于实施本发明的方式的各种修改对于相关领域的技术人员来说是显而易见的，都意图处于以下权利要求范围内。
尽管已经参照本发明的某些实施方式相当详细地描述了本发明，但是在不脱离本发明的情况下，其它实施方式也是可能的。因此，所附权利要求的精神和范围不应被限制在这里所包含的优选实施方式的描述中。所有落在权利要求的意义范围内的实施方式，无论从字面上还是通过等同物，均旨在被包含其中。
此外，上述优点不一定是本发明的唯一优点，并且不一定期望所有描述的优点将由本发明的每个实施方式来实现。
序列表
<110> ONL治疗有限公司.
密歇根大学董事会
<120> 肽组合物和使用方法
<130> 15428-9
<150> US 62/155,711
<151> 2015-05-01
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工肽；Met-12的C-末端酰胺
<400> 1
His His Ile Tyr Leu Gly Ala Val Asn Tyr Ile Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工肽；小分子肽抑制剂，Met-12
<400> 2
His His Ile Tyr Leu Gly Ala Val Asn Tyr Ile Tyr
1 5 10

Claims (36)

1.式1的化合物，
或其药物上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物的聚乙酸盐。
3.如权利要求1所述的化合物的三乙酸盐。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物用于以下药物制剂中：所述药物制剂用于预防眼睛的光感受器中Fas-或TRAIL介导的细胞凋亡。
5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物用于以下药物制剂中：所述药物制剂用于预防眼睛的视网膜色素上皮的细胞中的凋亡或坏死。
6.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物用于以下药物制剂中：所述药物制剂用于治疗视网膜脱离。
7.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物用于以下药物制剂中：所述药物制剂用于预防视网膜神经节细胞的疾病或状况。
8.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，以及配置用于眼部递送的药物载体。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物被配制用于眼内、玻璃体内或眼周施用。
10.如权利要求8-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物内的化合物保护脱离的视网膜光感受器细胞。
11.如权利要求8-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的化合物预防眼睛的视网膜色素上皮的细胞中的凋亡或坏死。
12.如权利要求8-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的化合物预防眼睛的视网膜神经节的细胞中的凋亡或坏死。
13.如权利要求10-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物对眼睛无毒。
14.如权利要求10-13中任一项所述的组合物，进一步包括至少一种非离子表面活性剂。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述至少一种非离子表面活性剂选自聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆407和泰洛沙泊。
16.如权利要求14-15中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非离子表面活性剂占组合物的约0.01％-20％w/w。
17.如权利要求14-15中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非离子表面活性剂占组合物的约0.05％-10％w/w。
18.如权利要求14-15中任一项所述的组合物，其中所述至少一种非离子表面活性剂占组合物的约0.25％-3％w/w。
19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中以如下比率使用两种或更多种非离子表面活性剂：该比率优化诸如玻璃体或视网膜药代动力学的参数以适应所治疗的适应症，无论其是急性的还是慢性的，使得所添加的非离子表面活性剂的总量为组合物的0.01-20％w/w。
20.如权利要求9-19中任一项所述的组合物，进一步包括有机助溶剂。
21.如权利要求9-20中任一项所述的组合物，进一步包括丙二醇和二甲亚砜的至少一种。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述有机助溶剂占组合物的约1％-50％w/w。
23.如权利要求21所述的组合物，其中所述有机助溶剂占组合物的约1％-20％w/w。
24.如权利要求21所述的组合物，其中所述有机助溶剂占组合物的约1％-5％w/w。
25.如权利要求7-24中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有在2.5-6.0范围内的pH。
26.一种治疗眼部状况、疾病或者影响眼部健康的状况或疾病的方法，包括将权利要求9-25中任一项所述的组合物施用于患有所述眼部状况、疾病或者影响眼部健康的状况或疾病的受试者。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述眼部状况、疾病或者影响眼部健康的状况或疾病选自：视网膜脱离、黄斑变性、年龄相关的黄斑变性、非渗出性的年龄相关的黄斑变性、渗出性的年龄相关的黄斑变性、脉络膜血管新生、视网膜病、糖尿病视网膜病、急性和慢性黄斑视神经视网膜病、中心性浆液性脉络膜视网膜病、黄斑水肿、黄斑囊样水肿、糖尿病黄斑水肿、葡萄膜炎/视网膜炎/脉络膜炎、多灶性鳞状色素上皮病、白塞病、鸟枪子弹样视网膜脉络膜病、传染性(梅毒、莱姆病、结核病、弓形虫病)、葡萄膜炎、中间葡萄膜炎(睫状体扁平部炎)、前葡萄膜炎、多灶性脉络膜炎、多发性一过性白点综合征(MEWDS)、眼结节病、后巩膜炎、匍行性脉络膜炎、视网膜下纤维化、葡萄膜炎综合征、伏格特-小柳-原田综合征；视网膜动脉阻塞性疾病、视网膜中央静脉阻塞、弥散性血管内凝血病、视网膜分支静脉阻塞、高血压眼底改变、眼缺血综合征、视网膜动脉微动脉瘤、外层渗出性视网膜病变、旁中心凹毛细血管扩张、半侧视网膜静脉阻塞、视乳头静脉炎、视网膜中央动脉阻塞、视网膜分支动脉阻塞、颈动脉疾病(CAD)、霜样树枝状视网膜血管炎、镰状红细胞性视网膜病和其它血红蛋白病、血管样条纹症、家族性渗出性玻璃体视网膜病、伊尔斯氏病、交感性眼炎、葡萄膜炎视网膜病、视网膜脱离、创伤、激光、PDT、光凝固、手术过程中的低灌注、放射性视网膜病、骨髓移植性视网膜病、增生性玻璃体视网膜病和视网膜前膜、增生性糖尿病视网膜病、眼组织胞浆菌病、眼弓蛔虫病、眼组织胞浆菌病综合征(OHS)、眼内炎、弓形虫病、与HIV感染相关的视网膜病、与HIV感染相关的脉络膜病、与HIV感染相关的葡萄膜病、病毒性视网膜炎、急性视网膜坏死、进行性外侧视网膜坏死、真菌性视网膜疾病、眼梅毒、眼结核病、弥漫性单侧亚急性视神经视网膜炎、蝇蛆病、色素性视网膜炎、与视网膜营养不良相关的全身性障碍、先天性静止性夜盲症、视锥营养不良、斯特格病变、眼底黄色斑点症、先天性黄斑变性、视网膜色素上皮图形状营养不良、X-连锁视网膜劈裂症、索斯比眼底营养不良、良性同心黄斑病、Bietti晶状体营养不良、弹性假黄瘤、视网膜脱离、黄斑裂孔、巨大视网膜裂孔、与肿瘤相关的视网膜病、RPE先天性肥大、后葡萄膜黑色素瘤、脉络膜血管瘤、脉络膜骨瘤、脉络膜转移癌、视网膜和视网膜色素上皮的结合错构瘤、成视网膜细胞瘤、眼底血管增生性肿瘤、视网膜星形细胞瘤、眼内淋巴肿瘤、点状内层脉络膜病、急性后多灶性鳞状色素上皮病、近视性视网膜变性、视网膜色素上皮细胞稳态异常、急性视网膜色素上皮炎、青光眼、角膜营养不良或发育异常等。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有视网膜脱离。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有黄斑变性。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者患有视网膜-RPE(视网膜色素上皮)稳态异常。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述组合物以足以减少受试者的细胞死亡的量施用。
32.如权利要求26所述的方法，其中所述组合物以足以增加所述受试者的光感受器存活的量施用。
33.一种预防光感受器细胞死亡的方法，包括向受试者施用权利要求9-25中任一项所述的组合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述光感受器细胞死亡是Fas-或TRAIL介导的光感受器凋亡。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述受试者处于光感受器细胞死亡的风险中。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述组合物经眼内、玻璃体内或眼周施用于受试者。
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