KR20170140383A

KR20170140383A - 펩티드 조성물 및 사용 방법

Info

Publication number: KR20170140383A
Application number: KR1020177034366A
Authority: KR
Inventors: 캐그리 지. 베실리; 알렉산더 제이. 브리지스; 존 케이. 프레슬리; 윌리암 에이. 헝케; 린다 엘. 존슨; 프란시스 엑스. 스미스; 에단 실베인; 데이비드 엔. 잭스
Original assignee: 오엔엘 테라퓨틱스, 인크.; 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간
Priority date: 2015-05-01
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2017-12-20
Also published as: EP3288379B1; BR112017023479A2; DK3288379T3; EP3288379A1; AU2016258837B2; US20210094985A1; US20230287052A1; RS62866B1; LT3288379T; HK1251979A1; US20180291062A1; ES2906173T3; EA201792399A1; US20200123201A1; AU2016258837A1; US10508134B2; CN107708416B; CA2984154A1; EA035293B1; US10829518B2

Abstract

펩티드를 포함하는 조성물, 그의 제약 제제, 및 그를 이용하여 광수용체 사멸을 예방하는 방법, 및 광수용체 및 망막 색소 상피를 비제한적으로 포함한 망막 세포를 Fas- 또는 TRAIL-매개된 아폽토시스로부터 보호하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

펩티드 조성물 및 사용 방법

관련 출원

본 특허 문헌은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2015년 5월 1일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/155,711의 출원일의 이익을 주장하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개와 다른 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이들 공개물의 개시내용은 본원에 기재되고 청구된 발명 당시의 그 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 최신 기술을 보다 자세히 기재하기 위해 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.

연방 후원 연구 또는 개발

본 발명은 미국 국립 보건원 (NIH)에 의해 부여된 승인 번호 R44EY022512 하에 미국 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.

배경기술

세포, 특히 광수용체, 망막 색소 상피 (RPE), 및 광수용체로부터의 시각 정보를 수용하는 망막 신경절 세포를 비제한적으로 포함한 망막 세포를 외인성 경로-매개된 세포 사멸, 예컨대 Fas-매개된 아폽토시스, TRAIL-매개된 아폽토시스, TNF-매개된 네크롭토시스, 및 파이롭토시스로부터 보호하는 펩티드 조성물, 및 상기 조성물을 사용하는 방법이 기재된다.

시각 상실의 여러 주요 원인, 예컨대 망막 박리, 녹내장 및 황반 변성은 아폽토시스 신호전달의 중요한 구성요소를 가지며, 이는 결국 망막에서 특정한 매우 중요한 세포 유형의 프로그램화된 세포 사멸을 유도한다. 이들 세포 유형 중 3가지는 손실이 망막 백화, 색소성 망막염 및 건성 형태의 연령-관련 황반 변성으로 제시되는 망막 색소 상피 세포, 손실이 녹내장으로 제시되는 망막 신경절 세포, 및 주요 시각 신호전달 세포로서, 손실이 망막 질환으로 인한 시각 상실의 궁극적인 원인이 되는 광수용체 세포 자체이다.

아래에 있는 RPE로부터의 감각신경 망막의 분리로서 정의되는, 망막 박리 (RD)는 광수용체 세포의 아폽토시스 사멸을 유발한다 (Cook et al. 1995; 36(6):990-996; Hisatomi et al. Curr Eye Res. 2002; 24(3):161-172; Zacks et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3):1262-1267. Yang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). RD의 설치류 및 고양이 모델에 의해 망막이 RPE로부터 분리된 거의 직후의 아폽토시스촉진 경로의 활성화가 입증된 바 있다 (Cook et al. 1995; 36(6):990-996; Hisatomi et al. Curr Eye Res. 2002; 24(3):161-172; Zacks et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(3):1262-1267. Yang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45(2):648-654; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 아폽토시스의 조직학적 마커 예컨대 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 닉 말단 표지 (TUNEL) 염색은 박리 기간 동안 내내 아폽토시스 활성 및 진행성 세포 사멸이 지속되면서, RD 후 대략 3일에 피크에 도달한다. 이는 또한 인간 망막 박리에서도 검증된 바 있다 (Arroyo et al. Am J Ophthalmol. 2005 Apr;139(4):605-10). 그러나, 망막 박리 복구에서의 임상 경험으로 어느 정도의 시력을 보호하면서 복구하기 위한 기회의 창이 있지만, 박리와 복구 사이의 시간이 연장될수록 시력이 상당히 저하되는 것으로 입증된 바 있다 (Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497; Ross et al. Ophthalmology. 1998; 105(11):2149-2153; Hassan et al. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 아폽토시스촉진 경로 활성화의 급속한 속도와 보다 느린 시각 상실 속도는 내인성 신경보호 인자가 신경 망막 내에서 활성화될 수 있으며, 망막-RPE 분리에 의해 활성화된 아폽토시스촉진 경로의 효과를 상쇄시키는 기능을 할 수 있음을 시사한다.

미국에서 연령-관련 황반 변성 (AMD)은 영구적인 시각 상실의 주요 원인이다 (Bourne et al. Br J Ophthalmol. 2014; 98:629-638; Klein et al. Arch Ophthalmol. 2011; 129:75-80; Cruciani et al. Clin Ter. 2011; 162:e35-42). 외망막 (여기서 망막 색소 상피 (RPE) 및 광수용체 (PR) 세포의 복합체로서 정의됨)의 사멸이 AMD에서의 시각 상실의 근본 원인이며, 현행 치료의 유효성을 제한한다 (Murakami et al. Prog Retin Eye Res. 2013; 37:114-140; Huckfeldt and Vavvas. Int Ophthalmol Clin. 2013; 53:105-117). PR-RPE 항상성의 붕괴는 PR 사멸을 유발한다. Fas는 건강한 대조군과 비교하여 습성 또는 위축성으로서 정의되는, 진행성 AMD가 있는 사람들의 눈에서 유의하게 발현되며, 활동성 신생혈관성 및 위축성 병변 주위에 가장 집중되어 있다 (Dunaief et al. Arch Ophthalmol. 2002; 120:1435-1442). RPE는 AMD 진행 동안 발생하는 스트레스 상황, 예컨대 염증 또는 산화성 스트레스 하에 Fas-매개된 아폽토시스에 민감하고, 연령-매칭되는 건강한 대응체와 비교하였을 때 AMD 환자에게서 보다 고농도의 가용성 Fas 리간드가 확인되었다 (Jiang et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 37:114-140). 유사하게, AMD 진행 동안 발생하는, 산화성 스트레스는 RPE에서의 Fas의 증가된 발현을 유발하고 (Lin et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011; 52:6308-6314), 산화성 스트레스의 상황에서 발생하는 RPE의 사멸은 Fas 신호전달에 좌우된다 (Wang et al. Apoptosis. 2012; 17:1144-1155). 추가적으로, Fas는 AMD 병리상태의 또 다른 인식된 인자인, Alu RNA 축적에 의해 유도되는 RPE 세포 사멸과 직접적으로 연관있다 (Kim et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111:16082-16087). 부분적으로 동일한 경로를 통해 작동하는, TRAIL-R1 수용체 (DR4)는 연령-관련 황반 변성에 대한 유전적 위험 인자인 것으로 제시된 바 있다. (Miyake et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 56, 5353 (2015)).

Fas는 또한 녹내장-연관 망막 신경절 세포 사멸에 연루되어 왔다 (Gregory et al. PLoS One. 2011; 6(3):e17659). 게다가, 안내압 (IOP)은 녹내장 진행에 있어서 주요한 위험 인자이고, IOP의 동물 모델은 증가된 Fas 및 FasL 발현 (Ju et al. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221) 및 아폽토시스에 의한 망막 신경절 세포 사멸 (Ji et al. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179)을 나타낸다. IOP의 제어가 녹내장의 임상 치료의 주요 원리이지만, 심지어 IOP의 적절한 제어 후에도 계속해서 질환 진행을 경험하는 환자가 상당수 있고, 추가의 연구로 녹내장에 대한 추가의 기여 인자가 해결될 필요가 있을 수 있다는 개념이 강화된 바 있다 (Kamat et al. Semin Ophthalmol. 2016; 31(1-2):147-154).

아폽토시스 (프로그램화된 세포 사멸)는 모든 다세포 유기체의 발달 및 항상성에 있어서 중추적 역할을 한다. 아폽토시스 경로에서의 변경은 발달 장애, 암, 자가면역 질환, 뿐만 아니라 신경변성 장애 및 망막 열화를 포함한, 많은 유형의 인간 병리상태에 연루되어 왔다. 이는 개별 세포의 사멸 과정을 통제하는 엄격히 조절되는 경로이며, 외인성으로 또는 내인성으로 개시될 수 있다. 후자는 미토콘드리아에 의해 촉발되는 세포내 메카니즘이고, 반면에 전자는 '사멸 수용체'와 세포 막에 있는 그의 상응하는 리간드의 상호작용을 수반한다. 따라서, 프로그램화된 세포 사멸 경로는 치료제의 개발을 위한 매력적인 표적이 되어 왔다. 특히, 개념적으로 세포의 생존보다 세포의 사멸이 더 용이하므로, 아폽토시스촉진제를 사용하는 항암 요법에 주목해 왔다. 그러나, 아폽토시스 경로의 부적절한 활성화가 조직의 변성으로 이어지는 많은 질환이 존재하고, 치료법은 내인성이든 또는 외인성이든, 아폽토시스 경로가 이 특정한 질환 병리상태에서 활성화된 것을 차단하도록 고안되어야 한다.

Fas 수용체는 망막의 변성 질환에서 아폽토시스에 수반되는 사멸 수용체 중에서 가장 일반적이다. (Chinsky et al. Curr Opin Ophthalmol. 2014 25(3); 228-233) Fas는 전형적인 시토카인 세포 표면 수용체이며, 이것이 삼량체 동족 리간드 FasL과 결합될 때 삼량체화에 의해 활성화된다. 스트레스 하의 망막 세포, 예를 들어 RD 후의 광수용체는 Fas 수용체를 상향조절한다. 스트레스 반응에 의해 유인된, 침습 면역 세포는 그의 표면 상에서 막횡단 단백질 Fas 리간드 (FasL)를 발현한다. FasL은 망막 세포의 Fas 수용체와 결합하여, 카스파제 캐스케이드를 통한 신호전달로 외인성 세포 사멸 경로의 급속한 활성화를 유도한다. 초기에, "개시인자" 카스파제-8이 활성 형태로 절단되고, 이는 결국 아폽토시스 세포 사멸 경로의 하류 "실행인자"인 카스파제 3을 활성화한다. 그러나, 뮤린 시토메갈로바이러스에 감염된 마우스의 눈에서, Fas, 뿐만 아니라 관련된 사멸 수용체 TNFR1 및 TRAIL도 활성화되는 것으로 제시된 바 있으며, 이러한 활성은 눈의 세포에서 아폽토시스, 네크롭토시스 및 파이롭토시스를 유도할 수 있다. (Chien and Dix J Virol 86, 10961 (2012))

배양물 내 광수용체 세포는 FasL에 의해 유도된 아폽토시스에 매우 민감한 것으로 제시된 바 있으며, 이는 FasL-유도된 아폽토시스가 망막 질환에서의 시각 상실에 대한 주요한 기여인자임을 시사한다. (Burton. Trans Am Ophthalmol Soc. 1982; 80:475-497; Ross et al. Ophthalmology. 1998; 105(11):2149-2153; Hassan et al. Ophthalmology. 2002; 109(1):146-152.) 게다가, Fas 수용체의 소형 펩티드 억제제로서, 종양단백질 Met의 Fas-결합 세포외 도메인으로부터 유래된 Met-12, H⁶⁰HIYLGAVNYIY⁷¹ (서열식별번호: 2) (Zou et al. Nature Medicine 13, 1078 (2007))은 세포 배양 실험, 및 망막과 망막 색소 상피의 분리 및 다른 안구 병태 또는 질환의 설정 둘 다에서 광수용체를 보호하는 것으로 제시된 바 있다. (Besirli et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 51(4):2177-84 (2010); 미국 특허 번호 8,343,931; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 게다가, 아마도 Met-12와 상동성을 갖는 동일한 결합 도메인을 사용하는 c-Met, FasL, TNAα 및 TRAIL은 다양한 종양에서 TRAIL-유도된 아폽토시스를 차단한다는 것으로 제시된 바 있다. (Du et al. PLoS One 9, e95490 (2014))

Met-12 펩티드 자체는 그의 극도로 불량한 수용해도에 의해 지배되는, 생물제약 특성을 갖는다. 실험에 의해 Met-12가 시험관내 및 생체내 둘 다에서 최적의 활성을 제시하기 위해서는 용액으로서 투여되어야 하는 것으로 분명히 제시된 바 있으며, 거의 수성 매질 중의 이러한 용액을 제조하는 것은, 특히 유리체내 주사를 위해 허용되는 조건 하에서 매우 어려운 것으로 입증된 바 있다. Met-12의 현탁액 또는 겔의 투여는 효력의 대부분의 손실을 유도한다. 예를 들어, 심지어 pH 2.8의 20 mM 시트레이트 완충제 중 Met-12의 겉보기에 투명한 10 mg/mL 용액은 여과 시 물질의 상당한 손실을 제시하였고, 하기에 기재된 시험관내 및 생체내 검정 둘 다에서 사용될 때, 활성의 적어도 5배 손실을 유도하였다. 광범위한 개발 연구에도 불구하고, 밝혀진 바 있는 Met-12의 유일한 용액 제형은 매우 낮은 pH 용액 주사액 (≤pH 2.8) 또는 순수 DMSO 주사액 일부만을 수반하며, 이들은 모두 유리체내 주사에 있어서는 준최적이다.

그러므로, 광수용체, 망막 신경절 세포 및 망막 색소 상피를 비제한적으로 포함한 망막 세포를 Fas- 및 TRAIL-매개된 아폽토시스를 포함한 외인성 경로 세포 사멸로부터 보호하고, 안구 (또는 다른) 독성을 초래할 수 있는 부형제의 사용 없이, 충분한 노출을 유발하는 방식으로 눈에 전달될 수 있는 용액 또는 현탁액으로 제형화하기가 용이하며, 사용하기에 용이한 펩티드 조성물이 시각 보호를 돕기 위해 여전히 필요하다.

광수용체-보호 펩티드의 생물학적 활성 수성 제형의 제약 제제, 그의 제약 제제, 및 그를 이용하여 광수용체 사멸을 예방하는 방법 뿐만 아니라 치료 방법이 본원에 제공된다.

화합물 1. His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-아미드 (서열식별번호: 1).

일부 실시양태는 C-말단 아미드 펩티드인, 화합물 1 (상기) 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 특정의 다른 실시양태는 화합물 1의 폴리아세테이트 염에 관한 것이다. 특정의 추가 실시양태는 화합물 1의 트리아세테이트 염에 관한 것이다. 화합물은 눈의 광수용체에서의 Fas- 또는 TRAIL 매개된 아폽토시스 예방용 제약 제형에 사용하기 위한 것일 수 있다. 화합물은 눈의 망막 색소 상피 세포에서의 Fas-매개된 아폽토시스 예방용 제약 제형에 사용하기 위한 것일 수 있다. 화합물은 망막 박리 치료용 제약 제형에 사용하기 위한 것일 수 있다. 화합물은 망막 신경절 세포의 질환, 예컨대 녹내장 치료용 제약 제형에 사용하기 위한 것일 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 화합물은 하기를 포함한, 안구 질환 또는 병태 치료용 제약 제형에 사용하기 위한 것일 수 있다: 황반병증/망막 변성, 예컨대: 연령-관련 황반 변성 (AMD), 예컨대 비-삼출성 연령-관련 황반 변성 및 삼출성 연령-관련 황반 변성을 포함한 황반 변성; 맥락막 신생혈관화; 당뇨병성 망막병증, 급성 및 만성 황반 시신경망막병증, 중심성 장액 맥락망막병증을 포함한 망막병증; 및 낭포양 황반 부종 및 당뇨병성 황반 부종을 포함한 황반 부종; 포도막염/망막염/맥락막염, 예컨대 급성 다초점성 판상 색소 상피병증, 베체트병, 산탄 망막맥락막병증, 감염증 (매독, 라임병, 결핵, 톡소플라스마증), 중간 포도막염 (주변부 포도막염) 및 전방 포도막염을 포함한 포도막염, 다초점성 맥락막염, 다발성 소실성 백반 증후군 (MEWDS), 안구 사르코이드증, 후공막염, 포행성 맥락막염, 망막하 섬유증, 포도막염 증후군 및 보그트-코야나기-하라다 증후군; 혈관 질환/삼출성 질환, 예컨대: 망막 동맥 폐쇄성 질환, 중심성 망막 정맥 폐쇄, 파종성 혈관내 응고병증, 분지 망막 정맥 폐쇄, 고혈압성 안저 변화, 안구 허혈 증후군, 망막 동맥 미세동맥류, 코우츠병, 중심와부근 모세혈관확장증, 반망막 정맥 폐쇄, 유두정맥염, 중심성 망막 동맥 폐쇄, 분지 망막 동맥 폐쇄, 경동맥 질환 (CAD), 서리 분지 혈관염, 겸상 적혈구 망막병증 및 다른 혈색소병증, 혈관양 선조, 가족성 삼출성 유리체망막병증, 일스병, 외상성/외과적 질환: 교감신경성 안염, 포도막염 망막 질환, 망막 박리, 외상, 레이저, PDT, 광응고, 수술 중 저관류, 방사선 망막병증, 골수 이식 망막병증; 증식성 장애, 예컨대: 증식성 유리체 망막병증 및 망막전막, 증식성 당뇨병성 망막병증. 감염성 장애: 안구 히스토플라스마증, 안구 톡소카라증, 안구 히스토플라스마증 증후군 (OHS), 안내염, 톡소플라스마증, HIV 감염과 연관된 망막 질환, HIV 감염과 연관된 맥락막 질환, HIV 감염과 연관된 포도막염 질환, 바이러스성 망막염, 급성 망막 괴사, 진행성 외망막 괴사, 진균성 망막 질환, 안매독, 안결핵, 미만성 단안 아급성 시신경망막염 및 구더기증; 유전 장애, 예컨대: 색소성 망막염, 연관된 망막 이영양증을 갖는 전신 장애, 선천성 비진행성 야맹증, 추체 이영양증, 스타르가르트병 및 황색반 안저, 베스트병, 망막 색소 상피의 무늬 이영양증, X-연관 망막층간분리, 소르스비 안저 이영양증, 양성 동심성 황반병증, 비에티 결정성 이영양증, 탄성섬유 가성황색종. 망막 열공/원공: 망막 박리, 황반 원공, 거대 망막 열공; 종양, 예컨대: 종양과 연관된 망막 질환, RPE의 선천성 비대증, 후포도막 흑색종, 맥락막 혈관종, 맥락막 골종, 맥락막 전이, 망막 및 망막 색소 상피의 복합 과오종, 망막모세포종, 안저의 혈관증식성 종양, 망막 성상세포종, 안내 림프성 종양; 및 다른 질환 및 병태 예컨대: 점상 내층 맥락막병증, 급성 후방 다초점성 판상 색소 상피병증, 근시성 망막 변성, 급성 망막 색소 상피염, 각막 이영양증 또는 이형성증 등.

추가 실시양태는 안구 전달을 위해 구성된 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예를 들어, 폴리아세테이트 염 및 트리아세테이트 염), 및 제약 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 안구내, 유리체내 또는 안구주위 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물 내의 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염은 박리된 망막 광수용체 세포를 보호한다. 조성물 내의 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염은 눈의 망막 색소 상피 세포에서의 아폽토시스를 포함한, 외인성-경로 세포 사멸을 예방한다. 조성물 내의 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염은 망막 신경절 세포의 질환, 예컨대 녹내장을 예방한다. 조성물은 멸균성, 비-발열성 및 눈에 비-독성이다. 조성물은 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 또는 틸록사폴일 수 있지만, 이들 예로 제한되지는 않는다. 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제는 조성물의 대략 0.01%-20% w/w; 대안적으로 조성물의 대략 0.05%-10% w/w; 및 대안적으로 조성물의 대략 0.1%-3% w/w를 구성할 수 있다. 대안적으로, 비-이온성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있으며, 여기서 상기 명명된, 또는 다른 비-이온성 계면활성제 중 적어도 2종이 제형의 목적하는 약동학을 최적화하는 비로 함께 사용되고, 여기서 계면활성제의 총량은 상기 기재된 한계치 내에 포함된다. 조성물은 유기 공용매, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 디메틸술폭시드를 추가로 포함할 수 있다. 유기 공용매는 조성물의 대략 1%-50% w/w; 대안적으로 조성물의 대략 1%-20% w/w; 및 대안적으로 조성물의 대략 1%-5% w/w를 구성할 수 있다. 등장성 작용제, 예컨대 트레할로스 또는 만니톨 또는 소르비톨, 또는 가용성 무기 염, 예컨대 NaCl이 또한 용액의 장성을 250-400 mOsm/L 범위가 되도록 하기 위해 첨가될 수 있다. 조성물은 2.5-6.0 범위의 pH를 가질 수 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 수단에 의해 완충될 수 있다.

또 다른 실시양태는 눈 전달을 위해 구성된 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약 담체를 포함하는 조성물을, 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환은 망막 박리, 황반 변성, 연령-관련 황반 변성, 비-삼출성 연령-관련 황반 변성, 삼출성 연령-관련 황반 변성, 맥락막 신생혈관화, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 급성 및 만성 황반 시신경망막병증, 중심성 장액 맥락망막병증, 황반 부종, 낭포양 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종, 포도막염/망막염/맥락막염, 다초점성 판상 색소 상피병증, 베체트병, 산탄 망막맥락막병증, 감염증 (매독, 라임병, 결핵, 톡소플라스마증), 포도막염, 중간 포도막염 (주변부 포도막염), 전방 포도막염, 다초점성 맥락막염, 다발성 소실성 백반 증후군 (MEWDS), 안구 사르코이드증, 후공막염, 포행성 맥락막염, 망막하 섬유증, 포도막염 증후군, 보그트-코야나기-하라다 증후군; 망막 동맥 폐쇄성 질환, 중심성 망막 정맥 폐쇄, 파종성 혈관내 응고병증, 분지 망막 정맥 폐쇄, 고혈압성 안저 변화, 안구 허혈 증후군, 망막 동맥 미세동맥류, 코우츠병, 중심와부근 모세혈관확장증, 반망막 정맥 폐쇄, 유두정맥염, 중심성 망막 동맥 폐쇄, 분지 망막 동맥 폐쇄, 경동맥 질환 (CAD), 서리 분지 혈관염, 겸상 적혈구 망막병증 및 다른 혈색소병증, 혈관양 선조, 가족성 삼출성 유리체망막병증, 일스병, 교감신경성 안염, 포도막염 망막 질환, 망막 박리, 외상, 레이저, PDT, 광응고, 수술 중 저관류, 방사선 망막병증, 골수 이식 망막병증, 증식성 유리체 망막병증 및 망막전막, 증식성 당뇨병성 망막병증, 안구 히스토플라스마증, 안구 톡소카라증, 안구 히스토플라스마증 증후군 (OHS), 안내염, 톡소플라스마증, HIV 감염과 연관된 망막 질환, HIV 감염과 연관된 맥락막 질환, HIV 감염과 연관된 포도막염 질환, 바이러스성 망막염, 급성 망막 괴사, 진행성 외망막 괴사, 진균성 망막 질환, 안매독, 안결핵, 미만성 단안 아급성 시신경망막염, 구더기증, 색소성 망막염, 연관된 망막 이영양증을 갖는 전신 장애, 선천성 비진행성 야맹증, 추체 이영양증, 스타르가르트병, 황색반 안저, 베스트병, 망막 색소 상피의 무늬 이영양증, X-연관 망막층간분리, 소르스비 안저 이영양증, 양성 동심성 황반병증, 비에티 결정성 이영양증, 탄성섬유 가성황색종, 망막 박리, 황반 원공, 거대 망막 열공, 종양과 연관된 망막 질환, RPE의 선천성 비대증, 후포도막 흑색종, 맥락막 혈관종, 맥락막 골종, 맥락막 전이, 망막 및 망막 색소 상피의 복합 과오종, 망막모세포종, 안저의 혈관증식성 종양, 망막 성상세포종, 안내 림프성 종양, 점상 내층 맥락막병증, 급성 후방 다초점성 판상 색소 상피병증, 근시성 망막 변성, 비정상적인 망막 색소 상피 항상성, 급성 망막 색소 상피염, 녹내장, 각막 이영양증 또는 이형성증 등일 수 있다. 조성물은 대상체 내에서 세포 사멸을 감쇠시키는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 조성물은 상기 대상체 내에서 광수용체 생존을 증진시키는데 충분한 양으로 투여된다. 조성물은 상기 대상체 내에서 망막 색소 상피 세포를 보호하는데 충분한 양으로 투여된다. 조성물은 상기 대상체 내에서 망막 신경절 세포를 보호하는데 충분한 양으로 투여된다.

또 다른 실시양태는 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 멸균성 비-발열성 제약 담체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸을 예방하는 방법에 관한 것이다. 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸은 Fas-매개된 광수용체 또는 RPE 세포 아폽토시스이다. 대상체는 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸의 위험이 있을 수 있다. 조성물은 대상체에게 안구내로, 유리체내로 또는 안구주위로 투여될 수 있다.

또 다른 실시양태는 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 보호 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 생존을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 증가하는 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 생존은 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 아폽토시스를 억제하는 것을 포함한다. 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸은 Fas-매개된 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 아폽토시스를 포함한다. 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸은 TRAIL-매개된 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 아폽토시스를 포함한다. 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸은 TNFR-매개된 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 네크롭토시스를 포함한다. 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸은 외인성 경로-매개된 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 파이롭토시스를 포함한다. 조성물은 대상체에게 정맥내, 피하 또는 근육내 주사를 통해 전신성으로, 또는 경구로, 또는 국부로, 즉 안구내로, 유리체내로, 국소로, 맥락막상으로, 결막하로, 망막하로 또는 안구주위로 투여될 수 있다.

도 1은 661W 세포에서의 Met-12 및 화합물 1 트리히드로클로라이드에 의한 Fas-유도된 카스파제 8 활성화의 차단을 도시하는 그래프를 제시한다. 661W 세포는 둘 다 20 mg/mL의, DMSO에 용해된 Met-12 또는 화합물 1의 다양한 양으로 1시간 동안 예비-처리하였다. 이어서 FasL (500 ng/mL)을 첨가하고, 카스파제 8 활성을 FasL로의 처리 후 제48시간에 측정하였다.
도 2는 661W 세포에서의 Met-12 및 화합물 1 트리히드로클로라이드에 의한 Fas-유도된 카스파제 8 활성화의 차단을 도시하는 그래프를 제시한다. 661W 세포는 DMSO 중 Met-12 (동그라미), DMSO 중 화합물 1 (20 mg/mL 다이아몬드) 및 2% 폴리소르베이트 (PS) 20, 2% 프로필렌 글리콜 (PG), pH 4 제형 중 화합물 1 (삼각형)의 다양한 양으로 1시간 동안 예비처리하였고, 이들 제형은 모두 10 mg/mL의 농도였다. 이어서 세포를 FasL (500 ng/mL)로 처리하고, 카스파제 8 활성을 FasL로의 처리 후 제48시간에 측정하였다.
도 3은 661W 세포에서의 화합물 1 트리히드로클로라이드에 의한 Fas-유도된 카스파제 8 활성화의 차단을 도시하는 그래프를 제시한다. 661W 세포는 DMSO (20 mg/mL) (동그라미), 및 3% 폴리소르베이트 20, 3% 프로필렌 글리콜, pH 4 제형 (삼각형), 및 1% 폴리소르베이트 20, 3% 프로필렌 글리콜, pH 4 제형 (다이아몬드) 중 화합물 1의 다양한 양으로 1시간 동안 예비처리하였고, 이들 제형은 모두 10 mg/mL의 농도였다. 이어서 세포를 FasL (500 ng/mL)로 처리하고, 카스파제 8 활성을 FasL로의 처리 후 제48시간에 측정하였다.
도 4는 661W 세포에서의 화합물 1 트리히드로클로라이드에 의한 Fas-유도된 카스파제 8 활성화의 차단을 도시하는 그래프를 제시한다. 661W 세포는 DMSO (20 mg/mL) (동그라미), 및 2 mg/mL 농도의 0.4% 폴리소르베이트-20, 4.5% 만니톨, 10 mM 아세테이트, pH 4 제형 (삼각형) 중 화합물 1 트리히드로클로라이드의 다양한 양으로 예비처리하였다. 이어서 세포를 FasL (500 ng/mL)로 처리하고, 카스파제 8 활성을 FasL로의 처리 후 제48시간에 측정하였다.
도 5a는 3가지 폴록사머 제형 중에 유리체내로 전달된 화합물 1의 토끼 망막 농도의 로그 그래프를 도시한다.
도 5b는 시간 경과에 따라 폴록사머 407-기재 제형을 폴리소르베이트-20 기재 제형과 비교하는, 유리체내로 전달된 화합물 1의 토끼 망막 농도의 로그 그래프를 도시한다.
도 6a는 다양한 농도의 계면활성제 (0.4% 또는 0.1%) 및 다양한 농도의 화합물 1 (2 mg/mL vs 0.5 mg/mL)을 갖는 3가지 폴록사머 제형 중에 유리체내로 전달된 화합물 1의 시간 경과에 따른 토끼 유리체액 (VH) 농도의 선 그래프를 도시한다.
도 6b는 상이한 선택의 계면활성제 (0.4% 폴록사머 407 vs. 0.4% 폴리소르베이트 20) 및 다양한 양의 화합물 1 (2 mg/mL vs 1 mg/mL)로 시간 경과에 따른 토끼 VH 농도의 선 그래프를 도시한다.
도 7은 4.5% 만니톨, 10 mM 아세트산, 0.4% 폴록사머 (PX) 407, pH 4.5 중 300 ng의 화합물 1 트리아세테이트 (5 μL, 0.06 mg/mL)의 공칭 주사 후 제24시간 및 제72시간에 브라운 노르웨이 래트의 유리체액에서의 화합물 1 트리아세테이트의 총량 (진한 색) 및 망막에서의 농도 (연한 색)를 제시한다.
도 8은 Met-12 트리히드로클로라이드 (연한 색 줄무늬) (5 μL DMSO 중 5 μg), 및 화합물 1 트리히드로클로라이드 (진한 색) (5 μL DMSO 중 0.5, 1.0, 5 및 10 μg), 또는 DMSO 비히클 (연한 색)로 래트의 박리 망막을 생체내 처리한 지 72시간 후의 아폽토시스 세포 수를 도시하는 막대 그래프를 제시한다. LHS 막대는 주사하지 않은 미박리 대조군 망막이다.
도 9는 화합물 1 트리히드로클로라이드 (5 μL의 F1 또는 F2 중 1.0 및 5 μg)로 래트의 박리 망막을 생체내 처리한 지 72시간 후의 아폽토시스 세포 수를, DMSO 중 동일물 (5 μL 중 5 μg) 또는 DMSO 비히클 (회색)과 비교하여 도시하는 막대 그래프를 제시한다. LHS 막대는 주사하지 않은 미박리 대조군 망막이다. F1 (5/1 μg)은 pH 4.0의 3% PG/3% PS-20 중 1.0/0.2 mg/mL의 화합물 1 트리히드로클로라이드 (흑색)이고, F2 (5/1 μg)는 pH 4.0의 2% PG/2% PX-407 중 1.0/0.2 mg/mL의 화합물 1 트리히드로클로라이드 (세로 줄무늬)이다.
도 10은 래트의 박리 망막을 생체내 처리한 지 72시간 후의 아폽토시스 세포의 퍼센트를 도시하는 막대 그래프를 제시한다. 막대 1은 박리 망막의 비히클 대조군이다. 막대 2는 0.2 mg/mL의 DMSO 용액으로서 1 μg의 화합물 1 트리아세테이트이다. 막대 3은 0.2 mg/mL의 DMSO 용액으로서 1 μg의 화합물 1 트리히드로클로라이드이다. 막대 4는 주사하지 않은 미박리 대조군 망막이다.

생물학적 활성 펩티드 조성물, 생물학적 활성 펩티드 조성물의 제약 제제 및 펩티드 조성물을 사용하는 방법이 기재된다.

용어 "치료 유효량"은 특정한 클래스의 대상체 (예를 들어, 영아, 소아, 청소년, 성인)에서 목적하는 치료 효과를 가능하게 하는 효과적인 약물 또는 작용제 (예를 들어, 화합물 1을)의 양을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "치료량 미만"은 평균적 및/또는 전형적 대상체 (예를 들어, 평균 치수, 금기된 제약 작용제를 복용하지 않음, 용량에 대해 집단 대부분과 유사한 반응을 가짐 등)에게 투여 시 목적하고/거나 기대되는 치료 결과/성과를 달성하기에 불충분한 제약 약물 또는 작용제의 양을 지칭한다. 미국 식품 의약품국 (FDA)의 권장 투여량이 치료 용량을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "제약 약물" 또는 "제약 작용제"는 목적하는 생물학적 반응을 도출하기 위해 대상체에게 투여되는 (예를 들어, 제약 조성물의 맥락 내에서) 화합물, 펩티드, 거대분자 또는 다른 개체를 지칭한다. 제약 작용제는 인간 또는 다른 포유동물에서 국부적으로 및/또는 전신성으로 생물학적으로 활성인 "약물" 또는 임의의 다른 물질 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드)일 수 있다. 약물의 예는 문헌 [the Merck Index] 및 [the Physicians Desk Reference]에 개시되어 있으며, 이들의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 용어 "제약 제형"은 제약 작용제(들)를 대상체에게 투여 시 목적하는 효과를 달성하는데 적합하게 만드는데 도움이 되는 1종 이상의 추가의 성분과 조합된 적어도 1종의 제약 작용제 (예를 들어, 화합물 1)를 지칭한다. 제약 제형은 1종 이상의 첨가제, 예를 들어 제약상 허용되는 부형제, 담체, 침투 증진제, 코팅물, 안정화제, 완충제, 산, 염기, 또는 제약 작용제와 물리적으로 회합되어 투여 형태의 투여, 방출 (예를 들어, 방출 시기), 전달능, 생체이용률, 유효성 등을 증진시키는 다른 물질을 포함할 수 있다. 제형은, 예를 들어, 액체, 현탁액, 고체, 나노입자, 에멀젼, 미셀, 연고, 겔, 에멀젼, 코팅물 등일 수 있다. 제약 제형은 단일 제약 작용제 (예를 들어, 화합물 1) 또는 다중 제약 작용제를 함유할 수 있다. 제약 조성물은 단일 제약 제형 또는 다중 제약 제형을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 작용제 (예를 들어, 화합물 1)는 특정한 투여 방식 (예를 들어, 안구 투여 (예를 들어, 유리체내 투여 등) 등)을 위해 제형화된다. 제약 제형은 멸균성, 비-발열성 및 눈에 비-독성이다.

본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 조성물을 특히 시험관내, 생체내 또는 생체외에서의 진단 또는 치료 용도에 적합하게 하는, 불활성 또는 활성의 1종 이상의 담체와 1종 이상의 제약 작용제의 조합을 지칭한다. 제약 조성물은 대상체에게 투여되는 물리적 개체를 포함하며, 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 경구-붕해 정제, 환제, 분말, 좌제, 용액, 엘릭시르, 시럽, 현탁액, 크림, 로젠지, 페이스트, 스프레이 등의 형태를 취할 수 있다. 제약 조성물은 단일 제약 제형 (예를 들어, 연장 방출, 즉시 방출, 지연 방출, 나노미립자 등) 또는 다중 제형 (예를 들어, 즉시 방출 및 지연 방출, 나노미립자 및 비-나노미립자 등)을 포함할 수 있다. 용어 "제약 조성물"과 "제약 제형"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀젼), 및 다양한 유형의 습윤제를 지칭한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아주반트의 예에 대해서는 예를 들어, 문헌 [Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. [1975]]을 참조하며; 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 염"은 제약 작용제 또는 그의 활성 대사물 또는 잔류물의 임의의 산 또는 염기를 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 본 발명의 화합물의 "염"은 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유래될 수 있다. 산의 예는 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-술폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-술폰산, 벤젠술폰산 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 산, 예컨대 옥살산은, 본래는 제약상 허용되지 않지만, 본 발명의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 산 부가염을 수득하는데 있어서 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "투여"는 약물, 전구약물, 또는 다른 작용제, 또는 치유적 치료 (예를 들어, 본 발명의 조성물)를 대상체 (예를 들어, 대상체 또는 생체내, 시험관내, 또는 생체외 세포, 조직 및 기관)에게 제공하는 행위를 지칭한다. 인간 신체에 대한 예시적인 투여 경로는 눈 (안부), 구강 (경구), 피부 (경피), 코 (비강), 폐 (흡입제), 구강 점막 (협측), 귀, 직장을 통해, 주사 (예를 들어, 정맥내, 피하, 종양내, 복강내 등)에 의해 등일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "공-투여"는 적어도 2종의 작용제(들) (예를 들어, 화합물 1 및 1종 이상의 추가의 치료제) 또는 요법을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 작용제/요법의 공-투여는 동시적이다. 다른 실시양태에서, 2종 이상의 작용제/요법의 공-투여는 순차적이다 (예를 들어, 제1 작용제/요법이 제2 작용제/요법 전에 투여됨). 일부 실시양태에서, 2종 이상의 요법은 동시에 투여되지만, 순차적으로 방출된다 (예를 들어, 흡수되는 것, 생체이용가능하게 되는 것 등). 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 사용되는 다양한 작용제/요법의 제형 및/또는 투여 경로가 다양할 수 있을 것이라 이해한다. 공-투여를 위한 적절한 투여량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제/요법이 공-투여될 때, 각각의 작용제/요법은 그의 단독 투여를 위해 적절한 것보다 적은 투여량으로 투여된다.

화합물 1. His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-아미드 (서열식별번호: 1); 화학식 1.

일부 실시양태는 C-말단 아미드 펩티드인, 화합물 1 (상기) 또는 그의 제약상 허용되는 염에 관한 것이다. 특정 실시양태는 화합물 1의 폴리아세테이트 염에 관한 것이다. 특정의 추가 실시양태는 화합물 1의 트리아세테이트 염에 관한 것이다.

화합물은 눈의 광수용체에서의 Fas- 또는 TRAIL 매개된 아폽토시스 예방용 제약 제형에 사용하기 위한 것일 수 있다. 광수용체 독성의 FasL-유도된 모델에서의 661W 세포에서, 화합물 1은 카스파제 8 활성화의 방지에 있어서 IC₅₀에 의해 Met-12보다 10배 더 강력하고, 최대 억제에서의 용량 효력에 의해 측정 시 Met-12보다 대략 3배 더 강력하다. 망막 박리의 생체내 래트 모델에서, 화합물 1은 아폽토시스로부터 광수용체 세포를 보호하는데 있어서 Met-12보다 적어도 10배 더 강력하고, Met-12와 달리 임상적으로 허용되는 제형으로 효과적으로 전달될 수 있다.

실시예에서 입증된 바와 같이, 화합물 1에 의한 Fas 억제는 생체내에서 광수용체 세포의 상당한 보호를 유발한다. 661W 세포에서, 화합물 1 처리는 카스파제 8 활성화의 상당한 억제를 유발한다. 그러므로, 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환을 갖는 대상체에게 화합물 1의 투여는 광수용체, 망막 색소 상피 세포 및 망막 신경절 세포를 비제한적으로 포함한 망막 세포의 Fas-매개된 아폽토시스로부터의 개선된 보호를 제공하여, 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환의 개선 및/또는 치료를 유발할 수 있는 것으로 생각된다.

임상적 실시에서, 환자는 일반적으로 이미 발생한 바 있는 박리를 겪고 있다. 망막-RPE 분리의 동물 모델은 Fas-경로 활성화가 초기에 발생하여, 박리의 지속기간에 걸쳐 상승 유지되는 것으로 제시한다 (Zacks et al. Arch Ophthalmol 2007; 125:1389-1395, Zacks et al. IOVS 2004; 45(12):4563-4569.8.). 망막과 RPE의 분리는 또한 광범위한 스펙트럼의 망막 질환에서 직면하게 된다. 망막 세포 생존에서의 항-Fas 요법의 임상적 관련성이 망막 박리로만 제한되는 것은 아닌 것으로 고려된다. 예를 들어, Fas-매개된 아폽토시스는 연령-관련 황반 변성 (AMD)에서의 광수용체 세포 사멸에서도 어떤 역할을 할 수 있다 (Dunaief et al. Arch Ophthalmol. 2002; 120(11):1435-1442; Zacks et al. Arch Ophthalmol 2007; Petrukhin K. New therapeutic targets in atrophic age-related macular degeneration. Expert Opin Ther Targets. 2007. 11:625 - 639; Miller JW. Treatment of age-related macular degeneration: beyond VEGF. Jpn J Ophthalmol. 2010. 54:523 - 528; Rogala J, Zangerl B, Assaad N, Fletcher EL, Kalloniatis M, Nivison-Smith L. In Vivo Quantification of Retinal Changes Associated with Drusen in Age-Related Macular Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015. 56:1689 - 1700, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 연령-관련 황반 변성은 RPE의 진행성 변성을 특징으로 하며, 망막 박리 후에 발생하는 것과 유사한 외망막 변성 및 재-조직화를 유발한다 (Jager et al. N Engl J Med. 2008; 358:2606-17, Johnson et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44:4481-488, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 신생혈관성 형태의 AMD에서는 또한 망막 아래에 삼출액이 있어, 이 조직을 기저 RPE로부터 실제로 분리시킨다 (Jager et al. N Engl J Med. 2008; 358:2606-17, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 신생혈관성 AMD는 장기간의 망막-RPE 분리 및 Fas-경로 활성화를 유발할 수 있다. 항-Fas 치료의 유용성은 아마 기저 장애를 치료하는 동안에, 망막 세포 (예컨대 광수용체 및 망막 색소 상피)를 보호하는 것을 목표로 하는 부가물일 것이다 (Brown et al. N Engl J Med. 2006 Oct. 5; 355(14):1432-44, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

녹내장은 망막 신경절 세포 (RGC)의 사멸을 특징으로 하는 진행성 변성 안구 병태이고, 이미 공개된 연구를 통해 RGC가 아폽토시스에 의해 사멸하는 것으로 입증된 바 있다 (Ji et al. Vision Res. 2005; 45(2): 169-179). 안내압 (IOP)은 녹내장 발병에 있어서 주요한 위험 인자이고, RGC 아폽토시스를 예방하기 위해 프로스타글란딘 유사체를 사용하여 IOP를 감소시키는데 상당한 노력을 기울여 왔다 (Doucette and Walter. Ophthalmic Genet. 2016; 12:1-9). Fas가 또한 RGC 사멸에 연루되어 왔고 (Gregory et al. PLoS One. 2011; 6(3):e17659), IOP의 동물 모델은 증가된 Fas 및 FasL 발현을 나타내는데 (Ju et al. Brain Res. 2006; 1122(1): 209-221), 이는 RGC 생존가능성을 보호하고 녹내장의 변성 특성을 완화시키는 수단으로서의 Fas 억제의 잠재적 유용성을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 기재된 폴리펩티드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 청구된 화합물 1은 표준 고체 상 폴리펩티드 합성 기술 (예를 들어, Fmoc)을 사용하여 합성될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 C-말단 아미드화를 수행하기 위해 펩티드 및 적절한 아미다제 효소를 둘 다 과발현하는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 (예를 들어, 박테리아 또는 진핵 발현 시스템을 사용하여) 합성될 수 있다.

구체적으로, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 화합물 1은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, Met-12 펩티드 서열, H⁶⁰HIYLGATNYIY⁷¹ (서열식별번호: 2)을 아미노 수지 상에 구축하여, 탈보호 및 수지 절단 후에 그의 C-말단 아미드 H⁶⁰HIYLGATNYIY⁷¹-NH₂, 즉 화합물 1 (서열식별번호: 1)을 생성함으로써 수득될 수 있다. 구체적으로, 화합물 1은 개념적으로 c-Met 서열로부터 잔기 59와 60 사이에서의 정상적인 아미드 가수분해, 및 잔기 71의 카르보닐 탄소보다는, 잔기 72의 α-탄소와 펩티드 질소 사이의 펩티드 쇄의 비자연적인 파괴에 의해 수득될 수 있다. 이는 자연 발생적인 절단이 아니다. Met-12는 미국 특허 번호 8,343,931에 이미 기재된 바 있으며, 이는 그 전문이 본원에 포함된다.

C-말단 아미드화 펩티드, 즉 화합물 1의 사용은 이러한 특정한 개질이, pH 3 초과에서 유의하게 탈양성자화되는 유리 카르복실산의 제거에 의해 펩티드가 물에 가용성이거나 또는 미셀에 혼화성이 되는 pH를 상승시킬 수 있을 것이라는 생각에 기초한다. 생성된 종은 임의의 생리학상 관련된 pH에서 C-말단 음이온을 갖지 않거나, 또는 임의의 물리적으로 관련된 상황 하에서 쯔비터이온일 것이고, 약 pH 5 미만에서 3가 양이온성 종일 것이다. 이러한 변경은, 이들 중 어느 것도 생리학적 조건 하에 탈양성자화될 수 없는, 아미드 또는 에스테르로의 전환에 의해 가장 용이하게 달성될 수 있다. 아미드가 에스테르보다 더 생물학적 및 화학적으로 안정하고, 또한 덜 소수성이므로, 단순 1급 아미드가 선택된다.

특정 실시양태에서, 화합물 1은 Met-12를 그의 C-말단 1급 아미드로 전환시켜 화합물 1을 형성함으로써 제조될 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙한, 아미노 수지의 사용에 의해, 이미 아미노화된 제1 아미노산 잔기로부터 펩티드를 구축하는 것이 일반적으로 보다 더 실용적이다. 하기 실시예 섹션에 언급된 바와 같이, 화합물 1은 본래 트리히드로클로라이드로서 수득되며 시험되지만, 이후에 제형화를 위해서는 트리아세테이트 염이 보다 더 유리한 것으로 간주되었다.

Met-12보다 화합물 1을 사용하는 것의 특정 이점이 있다. 구체적으로, 하기 실시예에 제시된 바와 같이, 화합물 1은 안구 제형에서 전례가 있는 pH 및 첨가제 양에서 계면활성제와 함께 제형화되어 미셀 용액을 생성할 수 있다. 둘째, 시험관내 효능 검정에 기초하여, 화합물 1은 놀랍게도 IC₅₀ 결정에 의해 Met-12보다 10배 더 강력하고, 최대 억제 농도에 의해 측정 시 대략 3배 더 강력하다. 구체적으로, Met-12 및 화합물 1이 동일한 제형으로 시험관내에서 시험될 때, 화합물 1은 Met-12보다 더 큰 용량 효력을 갖는다. 이는 동일한 생리학적 효과가 Met-12보다 더 적은 양의 화합물 1로 달성되도록 한다. 셋째, 망막 박리의 래트 모델에 대한 생체내 시험에서, 화합물 1은 놀랍게도 망막의 박리된 부분에서의 광수용체 세포의 아폽토시스를 예방하는데 있어서 Met-12보다 적어도 5배 더 강력하다. 넷째, 화합물 1의 개시된 일부 제형의 경우, 래트 망막 박리 모델에서의 효능이 Met-12로 제시되는 것보다 10배 넘게 더 낮은 수준에서 달성된다. 최종적으로, 화합물 1은 유리체내로 처리된 토끼의 유리체액 및 망막 둘 다에서 매우 연장된 반감기를 제시하고, 이들 반감기는 상이한 제형을 사용함으로써 상이한 정도로 연장되어, 화합물 1에 대한 전체 망막 노출이 선택된 제형에 의해 제어되도록 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 화합물 1은 하기 중 하나 이상에서 효과적이다: Fas-매개된 광수용체 아폽토시스의 예방/억제/감소, 눈의 망막 색소 상피 세포에서의 아폽토시스의 예방, 광수용체 생존의 증가, 연령-관련 황반 변성 (AMD)과 관련된 세포 사멸의 예방, 망막 박리와 관련된 세포 사멸의 예방 등. 일부 추가의 실시양태에서, 화합물 1은 2가지 중간 뉴런 유형을 통해 광수용체로부터의 시각 정보를 수용하는 망막 신경절 세포를 보호하는데 있어서 효과적이다: 양극 세포 및 망막 무축삭 세포.

일부 실시양태에서, 치료 활성량의 화합물 1 또는 그의 제제 (즉, 제형 또는 조성물)는 치료 (예를 들어, 특정한 안구 병태에 대한 치료)를 필요로 하는 포유동물 대상체에게, 환자 내에서의 (예를 들어, 목적하는 조직 내에서의) 아폽토시스를 억제하거나 또는 감쇠시키는데 충분한 위치로 투여된다. 바람직한 대상체는 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환을 갖는 인간이다.

투여되는 양은 광수용체, 망막 색소 상피 및 망막 신경절을 비제한적으로 포함한, 망막 세포 및/또는 망막 신경절 세포의 Fas-매개된 아폽토시스로부터의 개선된 보호를 제공하거나, 또는 망막 세포 사멸을 예방하여, 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환의 개선 및/또는 치료를 유발하는데 충분하다.

치료 유효 용량의 결정은 본 기술분야의 진료의의 능력 내에 있다. 일부 실시양태에서, 유효한 인간 용량은 5-10,000 μg/눈, 50-5,000 μg/눈, 또는 100-2,000 μg/눈의 범위일 것이다. 유효 수준을 유지하기 위해 반복 용량 (예를 들어, 매주, 격주, 매월, 분기마다, 반년마다 등)이 고려된다.

일부 실시양태에서, 제약 제형은 멸균성 비-발열성 액체이며, 적어도 0.1 mg/ml (예를 들어, >0.1, > 0.2, >0.5, >0.6, >0.7, >0.8 및 >0.9), 적어도 1 mg/ml (예를 들어, >1 mg/ml, >2 mg/ml, >5 mg/ml, >10 mg/ml 등)의 본원에 기재된 펩티드/폴리펩티드, 예를 들어 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 또는 그 초과의 펩티드/폴리펩티드 (예를 들어, 화합물 1)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 치료 용량은 적어도 0.01 ml (예를 들어, 0.01 ml... 0.02 ml... 0.05 ml... 0.1 ml... 0.2 ml... 0.5 ml... 1 ml... 2 ml... 3 ml... 4 ml, 및 이들 내의 부피 및 범위)의, 광수용체- 또는 RPE-보호 펩티드/폴리펩티드 (예를 들어, 화합물 1)를 포함하는 액체 제약 제형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 10 내지 500 μl의 액체 부피 (예를 들어, 10 μl, 20 μl, 30 μl, 40 μl, 50 μl, 75 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 및 이들 내의 부피 및 범위)가 인간 눈에 주사된다. 일부 실시양태에서, 50 내지 600 μl의 부피 (예를 들어, 50 μl, 75 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 600 μl, 및 이들 내의 부피 및 범위)가 인간 눈에 주사된다. 일부 실시양태에서, 수술 중에 주사될 때는 밀리리터 범위의 부피가 사용될 수 있다 (예를 들어, 유리체강의 총 부피 이하 (예를 들어, 약 4 ml)). 일부 실시양태에서, 화합물은 유리체절제 동안에 내부 안압을 유지하기 위해 사용되는 관류액에 혼입될 수 있다.

일부 실시양태에서, 단일 용량은, 예를 들어 급성 병태 (예를 들어, 망막 박리)를 치료하기 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 다중 용량 (예를 들어, 매일, 매주, 매월 등)은 만성 병태의 치료를 위해 제공된다. 제형은 치료될 병태에 대해 필요한 노출 지속기간에 따라 상이할 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 낮은 수준에서부터 상향 적정된다. 일부 실시양태에서, 유리체내 주사를 위한 용량은 0.01 내지 5 mg의 펩티드 (예를 들어, 0.1 및 2.0 mg)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제약 제제 (즉, 제형 및/또는 조성물)는 1종 이상의 부형제를 포함한다. 안구 적용에 적합한 부형제는 장성 작용제, 보존제, 킬레이트화제, 완충제, 계면활성제, 공용매 및 항산화제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 장성-조정제는 만니톨, 염화나트륨, 글리세린, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 보존제는 p-히드록시벤조산 에스테르, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조도데시늄 브로마이드, 폴리쿼터늄-1 등을 포함한다. 적합한 킬레이트화제는 에데트산나트륨 등을 포함한다. 적합한 완충제는 포스페이트, 보레이트, 시트레이트, 아세테이트, 트로메타민 등을 포함한다. 적합한 계면활성제는 이온성 및 비이온성 계면활성제를 포함하나, 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트, 폴리에톡실화 피마자 오일 유도체, 폴리에톡실화 지방산, 폴리에톡실화 알콜, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 (폴록사머) 및 옥시에틸화 3급 옥틸페놀 포름알데히드 중합체 (틸록사폴)가 바람직하다. 다른 적합한 계면활성제가 또한 포함될 수 있다. 적합한 항산화제는 술파이트, 티오술페이트, 아스코르베이트, BHA, BHT, 토코페롤 등을 포함한다.

본 발명의 조성물은 임의로 추가의 활성제를 포함한다. 이러한 추가의 활성제는 항-TNF 항체, 예컨대 아달리무맙 (Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina 45, 332 (2014), Curr Eye Res 39, 1106 (2014)) 또는 에타네르셉트 (PLoS One, 7, e40065), 또는 망막 구조를 보호하는 것으로 제시된 키나제 억제제, 예컨대 ROCK 억제제 Y-27632 (Molecular Medicine Reports 12, 3655 (2015)), 아데노신 키나제 억제제 ABT-702 (Life Sci 93, 78 (2013)), 또는 JNK 억제 펩티드 D-JNK-1 (Diabetes 50, 77 (2001), Adv Exptl Med Biol 854, 677 (2016)), 또는 도코사헥사엔산 (J Lipid Res, 54,2236 (2013)) 또는 RXR 범-효능제 PA024 (상기 동일 문헌) 또는 네크로스타틴, 또는 RIP 키나제 억제제 예컨대 다브라페닙 (Cell Death Dis 5, 1278 (2014))을 포함할 수 있다.

일부 예시적 실시양태에서, 부형제, 예컨대 폴리소르베이트 20 (예를 들어, 3% 이하), 폴록사머 407 (예를 들어, 2% 이하), 틸록사폴 (예를 들어, 3% 이하), 크레모포르 (예를 들어, 1% 이하); 및/또는 공용매 (예를 들어, 0.5 내지 50%), 예컨대 N,N-디메틸아세트아미드, 에탄올, PEG-400, 프로필렌 글리콜, 디메틸술폭시드 (DMSO); 오일 또는 시클로덱스트린 중 적어도 1종이 제약 제제에 첨가될 수 있다.

추가의 예시적 실시양태에서, 적어도 1종의 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 조성물의 0.1%-20% w/w/), 예컨대 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 또는 틸록사폴이 제약 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 유기 공용매, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 디메틸술폭시드가 대략 1-50%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 유기 공용매, 예컨대 N,N-디메틸아세트아미드, 에탄올, PEG-400, 프로필렌 글리콜, DMSO가 대략 1-20%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 유기 공용매, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 디메틸술폭시드가 대략 1-5%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 등장성 작용제 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글루코스 또는 트레할로스, 또는 무기 염 예컨대 염화나트륨이 조성물의 장성을 250-400 mOsm/L 범위가 되도록 하기 위해 필요한 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다.

조성물의 pH는 2.5-6.0의 범위일 수 있다. pH는 적절한 완충제에 의해 제어되며, 3.0-5.0의 범위 또는 3.5-4.5의 범위일 수 있다.

또 다른 예시적 실시양태에서, 적어도 1종의 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 조성물의 0.5%-10% w/w/), 예컨대 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 또는 틸록사폴이 제약 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 유기 공용매, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 디메틸술폭시드가 대략 1-50%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 유기 공용매, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 디메틸술폭시드가 대략 1-20%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 유기 공용매, 예컨대 N,N-디메틸아세트아미드, 에탄올, PEG-400, 프로필렌 글리콜, DMSO가 대략 1-5%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 등장성 작용제 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글루코스 또는 트레할로스, 또는 무기 염 예컨대 염화나트륨이 조성물의 장성을 250-400 mOsm/L 범위가 되도록 하기 위해 필요한 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 조성물의 pH는 2.5-6.0의 범위일 수 있다. pH는 적절한 완충제에 의해 제어되며, 3.0-5.0의 범위 또는 3.5-4.5의 범위일 수 있다.

또 다른 추가의 예시적 실시양태에서, 적어도 1종의 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 조성물의 1%-3% w/w/), 예컨대 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 또는 틸록사폴이 제약 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 유기 공용매, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 디메틸술폭시드가 대략 1-50%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 유기 공용매, 예컨대 N,N-디메틸아세트아미드, 에탄올, PEG-400, 프로필렌 글리콜, DMSO가 대략 1-20%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 유기 공용매, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 디메틸술폭시드가 대략 1-5%의 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 대안적으로, 등장성 작용제 예컨대 만니톨, 소르비톨, 글루코스 또는 트레할로스, 또는 무기 염 예컨대 염화나트륨이 조성물의 장성을 250-400 mOsm 범위가 되도록 하기 위해 필요한 양으로 제약 조성물에 포함될 수 있다. 조성물의 pH는 2.5-6.0의 범위일 수 있다. pH는 적절한 완충제에 의해 제어되며, 3.0-5.0의 범위 또는 3.5-4.5의 범위일 수 있다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 3.0-6.0 범위의 pH를 갖는 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 폴록사머 407 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 4.0-5.0 범위의 pH를 갖는 프로판산나트륨/프로판산 또는 아세트산나트륨/아세트산에 의해 완충된 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 폴록사머 407 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 4.0-5.0 범위의 pH를 갖는 프로판산나트륨/프로판산 또는 아세트산나트륨/아세트산에 의해 완충되며, 3-5% 만니톨에 의해 등장성이 된 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 폴록사머 407 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 추가 실시양태에서, 제약 조성물은 3.0-6.0의 pH 범위의 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 폴리소르베이트-20 (예를 들어, 조성물의 0.1-3% w/w/) 및 프로필렌 글리콜 (예를 들어, 조성물의 3% w/w/)을 포함할 수 있다.

특정의 추가 실시양태에서, 제약 조성물은 4.0-5.0의 pH 범위의 아세트산나트륨/아세트산에 의해 완충된 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 폴리소르베이트-20 (예를 들어, 조성물의 0.1-3% w/w/) 및 프로필렌 글리콜 (예를 들어, 조성물의 3% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 추가 실시양태에서, 제약 조성물은 3.0-6.0의 pH 범위의 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 폴리소르베이트-20 (예를 들어, 조성물의 0.1-3% w/w/) 및 만니톨 (예를 들어, 조성물의 3-5% w/w/)을 포함할 수 있다.

특정의 추가 실시양태에서, 제약 조성물은 4.0-5.0의 pH 범위의 아세트산나트륨/아세트산에 의해 완충된 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 폴리소르베이트-20 (예를 들어, 조성물의 0.1-3% w/w/) 및 만니톨 (예를 들어, 조성물의 3-5% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 3.0-6.0 범위의 pH를 갖는 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 폴록사머 407 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/) 및 폴리소르베이트 20 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 4.0-5.0 범위의 pH를 갖는 프로판산나트륨/프로판산 또는 아세트산나트륨/아세트산에 의해 완충된 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 폴록사머 407 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/) 및 폴리소르베이트 20 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 4.0-5.0 범위의 pH를 갖는 프로판산나트륨/프로판산 또는 아세트산나트륨/아세트산에 의해 완충되며, 3-5% 만니톨에 의해 등장성이 된 수성 매질 중에 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 폴록사머 407 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/) 및 폴리소르베이트 20 (예를 들어, 조성물의 0.1-2% w/w/)을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기에 기재된 바와 같은 제약 조성물은 화합물 1을 포함하나, 반대이온이 클로라이드가 아닐 수 있으며, 아세테이트가 바람직한 대안이다. 이러한 조성물은 클로라이드 이온을 함유하는 것들보다 우월한 특성을 제시할 수 있다.

일부 실시양태에서, 펩티드/폴리펩티드 (예를 들어, 화합물 1)의 중량비는 제약 제형 중의 비-수성 부형제의 중량에 대해 1%-25%이며, 반대로 0.1-20%의 부형제, 예컨대 폴록사머, 폴리소르베이트 20, 프로필렌 글리콜 및 만니톨이 존재한다.

제약 제형의 중량에 대한 펩티드/폴리펩티드 (예를 들어, 화합물 1)의 중량비는 적어도 약 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%일 수 있다.

나타낸 범위의 각각의 성분의 양을 갖는, 하기 2가지 예시적인 조성물은 대상체에서 다양한 안구 (예를 들어, 망막) 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하거나, 또는 안구 질환 또는 병태 등으로부터 유발되는 망막 세포 사멸을 예방하는데 사용될 수 있는 여러 조성물 중 2가지를 제공할 것이다:

예시적인 제형 I:

예시적인 제형 II:

일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 본원에 기재된 기술 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술 (예를 들어 주사, 국소 투여 등)을 사용하여 안구로 투여된다 (예를 들어, 문헌 [Janoria et al., Expert Opin Drug Deliv., 4(4): 371-388 (July 2007); Ghate & Edelhauser, Expert Opin Drug Deliv., 3(2):275-87 (2006); Bourges et al., Adv Drug Deliv Rev., 58(11):1182-202 (2006), Epub 2006 Sep. 22; Gomes Dos Santos et al., Curr Pharm Biotechnol., 6(1):7-15 (2005)] 참조; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 조성물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 비제한적 예는 국소, 결막하, 테논낭하, 유리체내, 망막하, 또는 대상체의 전안방으로의 주사이다. 다른 투여 방식은 정맥내 투여 뿐만 아니라 경구 투여를 포함한 전신 투여를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 유리체내로 투여된다.

특정 실시양태는 화합물 1 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 담체 내의 벡터를 파괴하지 않으면서 폴리펩티드를 공급할 수 있는 임의의 담체가 적합한 담체이며, 이러한 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

조성물은 비경구, 경구 또는 국소 투여를 위해 적합하게 제형화되고 포장될 수 있다. 예를 들어, 비경구 제형은 멸균성 비-발열성 생성물일 것이고, 신속 또는 지속 방출 액체 제제, 건조 분말, 에멀젼, 현탁액, 또는 임의의 다른 표준 제형으로 이루어질 수 있다. 제약 조성물의 경구 제형은, 예를 들어, 액체 용액, 예컨대 희석제 (예를 들어, 물, 염수, 주스 등)에 용해된 유효량의 조성물, 적절한 액체 중의 현탁액 또는 적합한 에멀젼일 수 있다. 경구 제형은 또한 정제 형태로 전달될 수 있으며, 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 향미제 및 약리학상 상용성인 부형제를 포함할 수 있다. 국소 제형은 피부 또는 다른 이환 부위를 통해 활성 성분의 흡수 또는 침투를 증진시키는 화합물, 예컨대 디메틸술폭시드 및 관련 유사체를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 또한 경피 장치, 예컨대 적합한 용매 시스템 중의 조성물을 접착제 시스템, 예컨대 아크릴 에멀젼 및 폴리에스테르 패치와 함께 포함할 수 있는 패치를 사용하여 국소로 전달될 수 있다. 멸균성 조성물은 점안제 또는 다른 국소 눈 전달 방법을 통해 전달될 수 있다. 멸균성 비발열성 조성물은 안구내로, 예를 들어 유리체강, 전안방 등을 포함한 눈의 어느 곳이든지 전달될 수 있다. 멸균성 비발열성 조성물은 루센티스 (라나비주맙), 아바스틴 (베바지주맙), 트리암시놀론 아세토니드, 항생제 등의 유리체내 주사로 통상적으로 수행되는 바와 같이 유리체내로 전달될 수 있다. 조성물은 안구주위로 (예를 들어 안와 내 눈알 (안구) 주위의 조직으로) 전달될 수 있다. 조성물은 안구내 이식물 (예를 들어 간시클로비르 이식물, 플루오시놀론 이식물 등)을 통해 전달될 수 있다. 안구내 이식물 전달에서, 본 발명의 조성물을 함유하는 장치는 외과적으로 이식되고 (예를 들어 유리체강 내에), 약물이 눈으로 방출된다 (예를 들어 미리 결정된 속도로). 조성물은 유전자 변형된 세포가 화합물 1 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 생성하고 분비하도록 조작되는, 캡슐화 세포 기술 (예를 들어 뉴로테크(Neurotech))을 사용하여 투여될 수 있다. 조성물은 경공막 약물 전달을 통해, 안구 옆에 봉합되거나 또는 위치되어 약물을 서서히 용리시킬 장치를 사용하여 전달될 수 있으며, 이어서 약물이 눈으로 확산될 것이다.

일부 실시양태는 광수용체, RPE 세포 또는 망막 신경절 세포 사멸을 예방, 억제, 차단 및/또는 감소시키는 조성물, 키트, 시스템 및/또는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 광수용체의 아폽토시스 억제에 관한 것이다. 일부 실시양태는 눈의 망막 색소 상피 세포에서의 아폽토시스 억제에 관한 것이다. 일부 실시양태는 눈의 망막 신경절 세포에서의 아폽토시스 억제에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 광수용체 사멸 및/또는 아폽토시스 및/또는 망막 색소 상피 세포 아폽토시스 및/또는 아폽토시스 및/또는 망막 신경절 세포 아폽토시스 및/또는 사멸은 망막 박리, 연령-관련 황반 변성, 녹내장, 외상, 암, 종양, 염증, 포도막염, 당뇨병, 유전성 망막 변성, 및/또는 광수용체 세포, 비정상적인 망막 색소 상피 또는 망막 신경절에 영향을 미치는 질환에 의해 유발된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 생존율을 증진시키고/거나 광수용체 사멸을 억제한다 (예를 들어 망막 박리 동안 및/또는 망막 박리를 수반하지 않는 안구 병태에서).

일부 실시양태에서, 본 발명은 황반 변성 (예를 들어 건성, 습성, 비-삼출성 또는 삼출성/신생혈관성), 안구 종양, 녹내장, 유전성 망막 변성 (예를 들어 색소성 망막염, 스타르가르트병, 어셔 증후군 등), 안구 염증성 질환 (예를 들어 포도막염), 안구 감염 (예를 들어 박테리아성, 진균성, 바이러스성), 자가면역 망막염 (예를 들어 감염에 의해 촉발됨), 외상, 당뇨병성 망막병증, 맥락막 신생혈관화, 망막 허혈, 망막 혈관 폐쇄성 질환 (예를 들어 분지 망막 정맥 폐쇄, 중심성 망막 정맥 폐쇄, 분지 망막 동맥 폐쇄, 중심성 망막 동맥 폐쇄 등), 병리학적 근시, 혈관양 선조, 황반 부종 (예를 들어 임의의 병인을 가짐), 중심성 장액 맥락망막병증을 비제한적으로 포함한, 다양한 병태 및/또는 질환에서 증진된 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 생존율에서의 유용성을 발견하고/거나 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸을 억제한다.

일부 실시양태는 조성물을 투여하여 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 사멸 (예를 들어 아폽토시스)을 억제하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약, 소분자, 펩티드, 핵산, 분자 착물 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 세포 보호 폴리펩티드를 투여하여 광수용체 또는 RPE 또는 망막 신경절 세포 아폽토시스를 억제하는 것을 제공한다.

일부 실시양태는 폴리펩티드를 사용하여 광수용체 및/또는 망막에서의 TNFR 슈퍼패밀리의 1종 이상의 구성원, 바람직하게는 Fas 또는 TRAIL의 활성화를 감쇠시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은, 예를 들어, 세포 및 조직에서의 세포 사멸 (예를 들어, 아폽토시스)을 억제하는데 사용되고, 이는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 따라서, 화합물 1은 이러한 방법에 따라 세포 사멸 (예를 들어 망막 세포 사멸)을 감쇠시키기 위해 사용될 수 있다. 시험관내 적용의 경우에, 화합물 1은 세포 내에서 아폽토시스를 억제하거나 또는 염증을 억제하는데 충분한 양으로 그러한 시간 경과 동안 세포, 전형적으로는 세포 집단에 제공될 수 있다 (예를 들어, 적합한 제제, 예컨대 완충 용액으로). 원하는 경우에, 유사 세포 집단 내에서 세포 사멸 또는 염증의 억제를 감소시키는데 있어서 본 발명의 폴리펩티드의 효과를 확인하기 위해 본 발명의 폴리펩티드로 비처리된 대조 집단이 관찰될 수 있다.

일부 실시양태에서, 하기를 포함한, 다양한 안구 (예를 들어, 망막) 질환 또는 병태를 치료하거나 또는 안구 질환 또는 병태로부터 유발된 망막 세포 사멸을 예방하는 방법이 본원에 제공된다: 녹내장, 황반병증/망막 변성, 예컨대: 연령-관련 황반 변성 (AMD), 예컨대 비-삼출성 연령-관련 황반 변성 및 삼출성 연령-관련 황반 변성을 포함한 황반 변성; 맥락막 신생혈관화; 당뇨병성 망막병증, 급성 및 만성 황반 시신경망막병증, 중심성 장액 맥락망막병증을 포함한 망막병증; 및 낭포양 황반 부종 및 당뇨병성 황반 부종을 포함한 황반 부종; 포도막염/망막염/맥락막염, 예컨대 급성 다초점성 판상 색소 상피병증, 베체트병, 산탄 망막맥락막병증, 감염증 (매독, 라임병, 결핵, 톡소플라스마증), 중간 포도막염 (주변부 포도막염) 및 전방 포도막염을 포함한 포도막염, 다초점성 맥락막염, 다발성 소실성 백반 증후군 (MEWDS), 안구 사르코이드증, 후공막염, 포행성 맥락막염, 망막하 섬유증, 포도막염 증후군 및 보그트-코야나기-하라다 증후군; 혈관 질환/삼출성 질환, 예컨대: 망막 동맥 폐쇄성 질환, 중심성 망막 정맥 폐쇄, 파종성 혈관내 응고병증, 분지 망막 정맥 폐쇄, 고혈압성 안저 변화, 안구 허혈 증후군, 망막 동맥 미세동맥류, 코우츠병, 중심와부근 모세혈관확장증, 반망막 정맥 폐쇄, 유두정맥염, 중심성 망막 동맥 폐쇄, 분지 망막 동맥 폐쇄, 경동맥 질환 (CAD), 서리 분지 혈관염, 겸상 적혈구 망막병증 및 다른 혈색소병증, 혈관양 선조, 가족성 삼출성 유리체망막병증, 일스병, 외상성/외과적 질환: 교감신경성 안염, 포도막염 망막 질환, 망막 박리, 외상, 레이저, PDT, 광응고, 수술 중 저관류, 방사선 망막병증, 골수 이식 망막병증; 증식성 장애, 예컨대: 증식성 유리체 망막병증 및 망막전막, 증식성 당뇨병성 망막병증. 감염성 장애: 안구 히스토플라스마증, 안구 톡소카라증, 안구 히스토플라스마증 증후군 (OHS), 안내염, 톡소플라스마증, HIV 감염과 연관된 망막 질환, HIV 감염과 연관된 맥락막 질환, HIV 감염과 연관된 포도막염 질환, 바이러스성 망막염, 급성 망막 괴사, 진행성 외망막 괴사, 진균성 망막 질환, 안매독, 안결핵, 미만성 단안 아급성 시신경망막염 및 구더기증; 유전 장애, 예컨대: 색소성 망막염, 연관된 망막 이영양증을 갖는 전신 장애, 선천성 비진행성 야맹증, 추체 이영양증, 스타르가르트병 및 황색반 안저, 베스트병, 망막 색소 상피의 무늬 이영양증, X-연관 망막층간분리, 소르스비 안저 이영양증, 양성 동심성 황반병증, 비에티 결정성 이영양증, 탄성섬유 가성황색종. 망막 열공/원공: 망막 박리, 황반 원공, 거대 망막 열공; 종양, 예컨대: 종양과 연관된 망막 질환, RPE의 선천성 비대증, 후포도막 흑색종, 맥락막 혈관종, 맥락막 골종, 맥락막 전이, 망막 및 망막 색소 상피의 복합 과오종, 망막모세포종, 안저의 혈관증식성 종양, 망막 성상세포종, 안내 림프성 종양; 및 다른 질환 및 병태 예컨대: 점상 내층 맥락막병증, 급성 후방 다초점성 판상 색소 상피병증, 근시성 망막 변성, 급성 망막 색소 상피염, 각막 이영양증 또는 이형성증 등.

특정 실시양태는 화합물 1 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 광수용체, RPE 또는 망막 신경절 생존을 증가시키는 방법을 제공한다. 제약 화합물은 우수한 제약 실시에 따라 제약상 허용되는 담체 및 임의적 부형제, 아주반트 등과 함께 제형화된 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 투여 형태: 예컨대 분말, 용액, 엘릭시르, 시럽, 현탁액, 크림, 점적제, 페이스트 및 스프레이의 형태일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 선택된 투여 경로 (예를 들어 점안제, 주사 등)에 따라 조성물 형태가 결정된다. 일반적으로, 활성 제약 화합물의 용이하고 정확한 투여를 달성하기 위해 본 발명의 억제제의 멸균성 단위 투여 형태를 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 치료상 유효한 제약 화합물은 전체 조성물의 약 0.01 중량% 내지 약 1.0 중량% 범위의 농도 수준으로, 즉 목적하는 단위 용량을 제공하는데 충분한 양으로 이러한 투여 형태에 존재한다.

일부 실시양태에서, 제약 조성물은 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 특정한 투여 경로, 생성물 요건 및 투여 요법은 치료될 개체의 병태 및 상기 개체의 치료에 대한 반응에 따라 통상의 기술자에 의해 결정될 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여하기 위한 단위 투여 형태의 조성물은 제약 화합물 및 1종 이상의 비독성의 제약상 허용되는 담체, 아주반트 또는 비히클을 포함한다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 이러한 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 상기에 나타낸 바와 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 제약 기술분야에서 이용가능한 바와 같이, 다양한 물질이 본 발명의 조성물에 담체, 아주반트 및 비히클로서 사용될 수 있다. 주사가능한 제제, 예컨대 유질 용액, 현탁액 또는 에멀젼은 필요에 따라 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 제형화될 수 있다. 멸균성의 주사가능한 제제는 비독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 예컨대 멸균성 비발열성 물 또는 1,3-부탄디올을 사용할 수 있다. 사용가능한 다른 허용되는 비히클 및 용매는 5% 덱스트로스 주사액, 링거 주사액 및 등장성 염화나트륨 주사액 (USP/NF에 기재된 바와 같음)이다. 또한, 멸균성 고정 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노-, 디- 또는 트리글리세리드를 포함한, 임의의 무자극 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산 예컨대 올레산이 또한 주사가능한 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

안구 조직으로의 가능한 약물 전달 경로는 다수 존재한다. 투여 경로는 표적 조직에 좌우된다. 특정 실시양태에서, 투여 경로는 통상적인 투여 경로, 예컨대 국소 또는 전신성일 수 있다. 국소 투여는, 대부분 점안제의 형태로 전안부에 영향을 미치는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 투여는 또한 직접 주사, 예를 들어 약물 용액을 직접적으로, 예를 들어 30 G 바늘을 사용하여 유리체액 (VH) 내로 주사하는 것을 수반하는 유리체내 주사를 통해서일 수 있다. 다른 투여 경로, 예를 들어 약물 캐리어를 사용하는 것이 또한 적합할 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 안구로 (즉, 눈에), 예를 들어 본원에 기재된 기술 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 기술 (예를 들어 주사, 국소 투여 등)을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Janoria et al. Expert Opinion on Drug Delivery. July 2007, Vol. 4, No. 4, Pages 371-388; Ghate & Edelhauser. Expert Opin Drug Deliv. 2006 March; 3(2):275-87; Bourges et al. Adv Drug Deliv Rev. 2006 Nov. 15; 58(11):1182-202. Epub 2006 Sep. 22; Gomes Dos Santos et al. Curr Pharm Biotechnol. 2005 February; 6(1):7-15] 참조; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

일부 실시양태에서, 조성물은 효과적인 광수용체의 보호 및/또는 아폽토시스의 억제를 위한 1종 이상의 다른 작용제와 공-투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 화합물 1 또는 그의 제약 제제를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 장치, 물질, 완충제, 제어제, 지침서, 용기 (예를 들어, 바이알, 시린지) 등 (예를 들어, 투여용)을 추가로 제공한다. 예를 들어, 임의의 상기 언급된 조성물 및/또는 제형은 포장될 수 있다. 임의의 상기 언급된 조성물 및 제형은 미리 충전된 시린지로 유통될 수 있다. 조성물 및 가공은 멸균성 비-발열성 생성물을 생성한다. 포장은 생성물의 멸균성을 유지하는 기능을 한다.

실시예

화합물 1의 생물학적 활성 제약 제형 (예를 들어, 유리체내 투여용)을 개발하기 위해 기재된 실시양태를 개발하는 동안에 실험을 수행하였다. 화합물 1의 광수용체 보호 특성을 DMSO 중의 펩티드 용액의 투여 후에 시험관내 및 생체내에서 검사하였다. 화합물 1은 pH~3 초과에서 불량한 수용해도를 가지며, 수성 환경에서 겔 또는 침전물을 형성하는 경향이 크다. 종내 유리체 부피에 따른 래트에서 효과적인 용량의 인간에 대한 비례적 조정으로부터 10-20 mg/mL의 표적 농도가 초기 목표로서 한정되었고, 시험을 통해 놀랍게도 기재된 실시양태의 우월한 효력 및 노출이 입증되었으므로 (실시예 1-6), 보다 저농도 (0.5-2.0 mg/mL)가 보다 바람직하다.

실시예 1: 화합물 1 제조 및 시험.

화합물 1 펩티드 (펩티드 His-His-Ile-Tyr-Leu-Gly-Ala-Val-Asn-Tyr-Ile-Tyr-NH₂; 서열식별번호: 1)는 복수의 공급업체에 의해, Fmoc 화학을 통해 Fmoc-아미드-AMS 수지 상에서 합성되었다. Fmoc 보호된 아미노산을 GL 바이오켐(GL Biochem)으로부터 구입하였다. 커플링 및 절단 시약은 알드리치(Aldrich)로부터 구입하였다. 용매는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)으로부터 구입하였다.

펩티드 쇄를 Fmoc 보호기의 반복적 제거 및 보호된 아미노산의 커플링에 의해 수지 상에 조립하였다. DIC 및 HOBt를 커플링 시약으로서 사용하고, NMM을 염기로서 사용하며; DMF 중의 20% 피페리딘을 탈-Fmoc-시약으로서 사용하였다. 커플링 효율을 조사하기 위해 각각의 커플링 후에 닌히드린 시험을 수행하였다.

최종 커플링 후에, 수지를 세척 및 건조시키고, 펩티드를 절단 칵테일 (TFA/Tis/H₂O/DOTA: 95/3/2/2)로 처리함으로써 수지로부터 절단하였다. 펩티드를 냉 에테르로부터 침전시키고, 여과에 의해 수집하여, 순도 46%의 조 물질 13 g을 수득하였다 (수율: 127%).

2회의 정제용 정제 각각의 실행을 위해, 약 4.4 g의 조 펩티드를 TFA 완충제 (완충제 A, 물 중의 0.1% TFA; 완충제 B, 100% 아세토니트릴)과 함께 2-인치 중합체 칼럼에 의해 정제하고, >85%의 순도를 갖는 생성된 분획을 추가로 TFA 완충제와 함께 2-인치 C18 칼럼에 의해 정제하였다. >95%의 순도를 갖는 수집된 분획을 건조를 위해 동결건조시키고, 8.8 g의 조 물질로부터 >95%의 순도를 갖는 TFA 염으로서 3.68 g의 물질을 수득하였다. 1.5 g의 펩티드 (반대 이온으로서의 TFA)에, 충분한 HCl 수용액을 첨가하여 펩티드를 용해시켰다. HCl 수용액 중의 펩티드를 건조를 위해 동결건조시켰다. HCl 염으로서 1.4 g의 최종 펩티드가 97.0%의 순도로 수득되었다. HPLC 물 중 15% ACN 0.1% TFA, 베누실(Venusil) XBP-C18 4.6x250 mm 1.0 mL/분; RT 17.79분. 질량 스펙트럼 APCI MH⁺ 1461.5.

미량분석. 실측치: C, 52.21; H, 6.49; N, 15.42; Cl, 6.73. KF, 3.75%. C₇₁H₁₀₀N₁₈O₁₆·3HCl·3.4 H₂O에 대한 계산치: C, 52.24; H, 6.59; N, 15.45; Cl, 6.52. KF, 3.75%. %활성 = 89.55%.

이후의 펩티드 샘플은 여전히 트리플루오로아세테이트 염으로서 합성되지만, 아세테이트에 의한 음이온 교환을 수행하여 화합물 1을 그의 트리아세테이트 염으로서 제공하였다.

실시예 2: 화합물 1 pH-용해도 프로파일

실시예 1에 기재된 바와 같이, 트리히드로클로라이드 염으로서 수득된 화합물 1을 하기 프로토콜에 따라 pH 적정을 수행함으로써, 상이한 pH에서의 수용해도에 대해 스크리닝하였다. 일부 경우에 Met-12를 동일한 실험 절차를 통해 실행하여 동일한 조건 하에서의 그의 용해도 pH 프로파일을 결정하였다. 복수의 이전 실험은 Met-12가 2.7 초과의 임의의 pH에서 거의 수성 매질 중에 만족스럽게 제형화될 수 있는 임의의 조건을 밝혀내지 못했다.

화합물 1 (10 mg)을 2 mL 투명 플라스틱 원심분리 튜브에서 볼텍싱하면서 물 (270-900 μL)에 용해시켜 pH ~2.4 용액을 제공하였다. 모든 경우에 펩티드는 투명 용액을 형성하였고, 이는 낮은 pH에서 적어도 40 mg/mL의 용해도를 시사한다. 이어서 이 용액을 적절한 양의 공용매 또는 다른 부형제 (당, 계면활성제 등)로 희석하여, 실온 (22-23℃)에서 900 μL의 시험 용액 중 10 mg의 화합물 1의 투명 산성 용액을 생성하였다. 적은 분취량의 염기성 용액 (통상적으로는 수산화나트륨 1.0 M 또는 0.1 M, 그러나 때때로 완충제 조사 시에는 다른 염기)을 마이크로리터 시린지를 사용하여 첨가하였다. 첨가 사이에 용액을 볼텍싱에 의해 혼합하고, 용액을 다양한 유형의 침전물, 미세침전물의 가능한 징후로서의 탁도, 및 겔 형성을 검출하는 점성에 대해 시각적으로 검사하였다. pH 측정을 모든 이들 관찰 시점에서 실시하였다. 일부 실험은 내재성의 낮은 pH에서부터 pH 10까지 적정하였지만, 이후의 적정은 pH 7을 훨씬 초과하여서, 또는 때때로 심지어 더 낮게 수행하지 않았다.

화합물 1 수용액의 수산화나트륨으로의 적정은 Met-12의 pH 3.0과는 대조적으로, 약 pH 3.3까지 투명한 유동성 용액을 나타내면서, Met-12보다 약간 더 우수한 pH-제한 용해도를 시사하였다. 그러나, 적정을 수산화나트륨 대신에 5종의 완충 염기, 즉 트리스, 히스티딘, 시트르산나트륨, 붕산나트륨 및 인산나트륨을 사용하여 수행하였을 때는, 점성 및 응집의 징후가 일반적으로 pH 2.6-2.9의 범위에서 제시되었다. 피브릴 형성이 또한 1 또는 2가지 경우에 pH 3 미만에서 제시되었다. 이들 실험으로부터 화합물 1이 Met-12보다 더 우수한 수용해도-pH 프로파일을 갖는 것으로는 보이지 않는다.

실시예 3: 공용매 혼합물 중 화합물 1의 pH-의존성 용해도.

화합물 1의 pH-의존성 용해도를 공용매 및 첨가제를 사용하여 검사하고, 동일한 조건 하에서의 Met-12 용해도와 비교하였다.

70% DMSO 실험은 약 pH 5.5에서 겔이 형성되면서 Met-12 적정과 유사하지만, 이러한 경우에 겔은 아마도 C-말단이 이온화될 수 없기 때문에 보다 높은 pH에서 재-용해되지 않았다.

70% 프로필렌 글리콜 (PG)은 Met-12와 비교하여 화합물 1의 용해도를 개선시키는데, Met-12의 pH 3.2와 비교하여 약 pH 4.7까지 겔화가 발생하지 않았고, 이어서 pH 10까지 겔이 유지되었다. 이러한 적정을 보다 적은 양의 PG (35%, 10%)로 반복하였지만, 어느 것도 단독의 물보다 용해도 프로파일을 개선시키는 것으로는 보이지 않았다.

70% PEG400 및 70% 글리세롤 용액은 유용해 보이지 않았고, 2종의 당 첨가제, 즉 10% 만니톨 또는 10% 트레할로스도 마찬가지였다.

이들 실험으로부터 프로필렌 글리콜이 화합물 1의 경우에는 일부 제한된 환경 하에서 유용한 공용매일 수 있지만, Met-12의 경우에는 그렇지 않은 것으로 결론지었다.

실시예 4: 비-이온성 계면활성제 혼합물 중 화합물 1의 pH-의존성 용해도.

놀랍게도, 검사된 계면활성제 중 일부는 화합물 1의 pH-용해도 프로파일에서 상당한 개선을 제공하였고, 반면에 Met-12의 pH-용해도 프로파일은 시험된 계면활성제 중 어느 것으로도 개선되지 않았다. 10% 틸록사폴의 존재 하에 화합물 1은 pH가 5.87을 초과할 때까지 투명하게, 허용되는 점성을 유지하였다. 10% 폴리소르베이트 80으로, 투명 용액은 pH 6.36을 초과할 때까지 인지가능하게 점성이 되지 않았다. 10% 폴리소르베이트 20으로, 피브릴이 pH 3.2에서 관찰되었으나, pH 7.14까지 탁도 또는 겔화의 징후는 관찰되지 않았다. 10% 폴록사머 407은, pH 5-9의 범위에서 제2 상이 분명히 존재하나, 용액이 유동성으로 보이므로, 불용성의 개시가 발생할 수 있는 시점에 관해 다소 모호하였다. 이는 용액 중에 형성된 매우 거대한 투명 구상체로 이루어진 것으로 보였다. 15% 폴록사머 용액은 27℃에서 완전히 겔화되고, 반면에 10% 폴록사머는 25℃에서 인지가능하게 겔화되지 않기 때문에 높은 폴록사머 농도의 산물인 것으로 생각되나, 다양한 첨가제가 졸-겔 임계 온도를 상승시키거나 또는 낮출 수 있고, 겔화에 대한 통상적인 점성 측정은 개별 겔 상의 초기 출현을 효율적으로 채택하지 않을 것이다. 따라서, 혼합물에서의 펩티드의 용해도는 손실이 없었지만, 다량의 폴록사머가 2개의 폴록사머 상, 즉 졸 상 및 겔 상을 형성하고 있는 것으로 생각된다. 포비돈 K30은 pH 3.60에서 점성 용액을 생성하였고, 이는 pH 4.0 초과에서 겔화되었다.

이어서 계면활성제 중 일부를 첨가된 계면활성제의 양에 대해 하향 적정하였다. 폴리소르베이트 20을 3% 및 1% 농도로 하향 적정하였을 때, 피브릴 형성이 pH 2.5 미만에서 제시되었지만, 이들 경우 둘 다에서 침전의 다른 징후는 각각 pH 4.14 및 3.76까지 제시되지 않았다. 폴록사머 407은 4%에서는 적정을 개시할 때 작고 겉보기에 증가하지 않는 수의 피브릴을 생성하였지만, pH 6.2를 초과할 때까지 침전의 다른 징후가 없었고, 2%에서는 pH 5.6을 초과할 때까지 투명 용액을 생성하였다. 0.5%에서 적정이 시작되자마자 피브릴이 용액 중에 제시되었지만, pH 4.5를 초과할 때까지 침전의 추가의 징후는 제시되지 않았다.

화합물 1은 검사된 대부분의 계면활성제, 특히 폴리소르베이트 80, 폴록사머 407 및 틸록사폴에서 Met-12보다 분명히 우월하며, 폴리소르베이트 20 데이터는 관찰된 초기 피브릴 형성 때문에 다소 모호하긴 하나, 대부분의 화합물이 동일한 비히클 중의 Met-12와 달리, pH 3-6에 용액으로 존재하는 것이 분명하였다. 따라서, 화합물 1 용해도를 밀도가 낮은 매트릭스 실험 설계에서 높은 첨가제 농도에서 시작하여, 이어서 첨가제 중 1 또는 2종의 보다 저농도로 공용매-계면활성제 혼합물에서 검토하였다.

실시예 5: 화합물 1의 혼합된 비-이온성 계면활성제/공용매-용해도 연구.

70% PG 및 10% 폴리소르베이트 80의 조합은 pH 3.4가 될 때 점성이 되고 pH 5.25에서 겔화되는 투명 용액을 생성하였으며, 이는 70% PG보다 우수하지 않으며, 10% PS-80보다 불량하였다.

70% PG, 3% PS는, pH 4.6에서 점성이 시작되나, 물질은 여전히 pH 5.25까지 겔이었다.

35% PG 및 3% PS-80은, 피브릴이 pH 2.66 정도로 낮을 때 용액 중에 나타났고, 응집체가 pH 3.48에서 용액 중에 제시되었다.

35% PG, 10% PS-80은 피브릴 또는 응집체의 징후를 제시하지 않았으며, 인지가능한 점성은 pH 4.05에서 제시되었고, 겔화는 pH 5.71에서 제시되었다 (10% PS-80 자체보다 열등함).

10% PG 및 10% PS-80은 pH 4.94까지 낮은 점성을 갖는 투명 용액을 생성하였고, pH 5.13 초과에서 물질의 침전이 시작되었다.

10% PG 및 3% PS-80은 pH 3.16까지 투명 용액을 생성하였으나, pH 3.4가 될 때 약간의 침전이 발생하였다.

상기에 언급된 바와 같이, 10% 폴리소르베이트 20 중의 용액은 pH 7까지 투명한 유동성 용액을 제공하는 것으로 보였으나, 심지어 낮은 pH에서 약간의 피브릴이 제시되었고, 이들은 pH가 증가할수록 그 수가 증가하는 경향이 있었다.

놀랍게도, 10% PG 및 10% 폴리소르베이트 20의 조합은 우수한 용해도를 유발하였는데, 인지가능한 점성의 개시가 pH 7을 초과할 때만 재현가능하게 발생하였고, 침전의 시각적 지표는 제시되지 않았다. 그러나, 밤새 정치 시, 용액이 겔화되었고, pH는 약 0.2 단위가 떨어졌다. 온화한 교반이 겔을, 주사될 수 있는 액체로 재전환시켰다.

3% 폴리소르베이트 20은 10% PG와 함께 pH 5.3까지 투명한 유동성 용액을 생성하였지만, PS-20이 1%로 약해지면 pH 3 미만에서 피브릴을 생성하였다.

10% PG를 4%, 2% 및 0.5% 폴록사머 제형에 첨가하였다. 4% 폴록사머 제형은, 피브릴이 낮은 pH에서 제시되지 않았고 적어도 pH 5.36까지 투명 용액을 나타내면서, 약간의 개선을 보였다. 2% 폴록사머 10% PG는 pH 5.74까지 투명한 유동성 용액을 나타내면서 마찬가지로 우수하였다. 0.5% 폴록사머 제형은 적정이 개시되자 피브릴을 제시하였고, pH 3.45에서 약간의 탁도를 제시하였지만, pH 6까지 낮은 점성을 유지하였다.

3%, 1% 또는 무 PG를 2%, 1% 및 0.5% 폴록사머 제형에 첨가하였고, RT에서 3일 동안 정치 후에 안정성을 시각적 및 여과 (다음 실시예 참조) 검정 둘 다를 사용하여 pH 4.0, pH 5.5 및 pH 7.0에서 측정하였다. 시각적으로, 피브릴은 새로 구성된 샘플에서 덜 빈번하게 관찰되었으며, 존재하는 부형제가 적을수록, 그리고 보다 높은 pH에서 관찰될 가능성이 더 높았고, 반면에 pH 7.0 샘플은 모두 초기에 혼탁하였고, 일부는 명백한 침전이 있었다. pH 4.0 샘플은 모두 초기에 혼탁하지 않았으며, 단지 0.5% PX, 0% PG만이 보류 후에 약간의 탁도를 제시하였다. pH 5.5 샘플은, 0% PG 샘플 및 1% PG 0.5%PX 샘플 모두에서 초기에 약간의 탁도가 제시되었지만, 보류 후에 단지 최저 부형제 샘플 (0.5% PX 0% PG)만이 약간의 탁도를 제시하였다. 이들 샘플 중 몇몇은 교반 시 약간 혼탁해졌다. 여과 검정은 다소 다른 이야기를 알려주었다. 2% 폴록사머 제형은, 3개의 pH 4 제형 모두에서 여과 후에 >98%의 회수율을 가지며, pH 5.5에서는 회수율이 >96%이고, pH 7.0에서는 회수율이 여전히 86-93%였다. 1% PX 제형은, 여과 후에 회수율이 pH 4에서는 97-98%이고, pH 5.5에서는 87-93%이나, pH 7에서는 단지 1-13%였다. 0.5% PX 제형은, 여과 후에 회수율이 pH 4에서는 73-88%이고, pH 5.5에서는 12-43%이며, pH 7에서는 3개의 샘플 중 어느 것도 여과 후에 회수되지 않았다.

이들 실험으로부터, 공용매로서의 상대적으로 적은 양의 PG는 일부 계면활성제에 적절하게 도움이 될 수 있지만, 고농도는 유해하고, 이들 제형 효과의 예측성이 높지 않는 것으로 결론지을 수 있다. PX 제형에서, 존재하는 PX의 양 및 제형 pH는 둘 다 PG 수준보다 더 중요하다. 게다가, 시각적 해석이 보다 신뢰할 수 있는 여과 검정과 반드시 일치하는 것은 아니며, 피브릴의 관찰은 특히 존재하는 여과성 약물의 양과 무관해 보였다.

실시예 6: 화합물 1의 보다 저농도의 비-이온성 계면활성제-용해도 연구.

시험관내 및 이후의 생체내 효능 실험은 화합물 1이 광수용체 세포에서의 FasL (또는 망막 박리) -유도된 아폽토시스를 차단하는데 있어서 3- >10배의 범위로 더 강력한 것으로 입증하였다. 이러한 놀라운 결과는 계획된 인간 용량을 25-200 μg/눈의 범위로 떨어트리고, 이는 제형화된 약물의 최대 요구 농도를 2.0 mg/mL로 감소시켰다. 상기 농도에서의 최적의 제형 조건을 밝혀내기 위해 추가의 일련의 실험을 수행하였으며, 일부 실험은 훨씬 더 낮은 약물 농도를 검토하였다. 이러한 연구는 모두 계면활성제로서 폴록사머 407 또는 폴리소르베이트 20을 검토하였다. 가시적 탁도 및 점성의 시각적 평가는 둘 다 유용한 스크리닝 관찰이지만, 상기에 논의된 바와 같이, 이들이 항상 응집된 펩티드의 존재를 나타내지는 않는 것으로 밝혀졌고, 많은 이후의 연구는 0.2 마이크로미터 PVDF 막 또는 PALL 25 mm 0.2 μM 울티포어 나일론 6,6 필터를 통과하기 전후의 샘플에 존재하는 약물의 양을 측정함으로써 용해도를 평가하였다. 혼탁하거나 또는 고점성인 용액은 일반적으로 여과하기가 어렵거나 또는 불가능하고, 이들이 여과될 수 있을 때는 종종 매우 낮은 약물 회수율을 제공하였다. 놀랍게도 일부 유동성 투명 용액이 또한 여과 시 큰 손실을 제시하였으므로, 만족스러운 제형은 여과 후에 >90%의 약물 회수율을 제공하는 것으로서 한정되었다. 피브릴을 형성하는, 화합물 1과 같은 화합물의 모든 용해도 측정은 단지 동역학적 용해도를 측정할 수 있음을 주목하여야 한다. 피브릴 형성은 많은 일련의 조건 하에 매우 느릴 수 있고, 가장 안정한 가능한 피브릴 형태와 관련하여, 진정한 열역학적 용해도가 완전히 달성되기까지 수일 내지 수년이 걸릴 수 있는, 준안정성 용액의 용해도가 측정될 수 있다. 그러나, 제형은 제형화 후의 적어도 급속한 침전을 회피하기 위해, 여과 전에 24-72시간 동안 상용적으로 보류되었다.

초기 실험은 pH 4에서 3% PS-20/3% PG 및 2% PX/2% PG 중의 화합물 1의 1 mg/mL 용액을 검토하였다. 모두 투명 용액을 생성하였고, 여과 시 API의 손실은 없었다. 다음 실험은 pH ~3, pH 4, pH 5.5 및 pH 7에서 2% PG 및 0.1%, 0.25% 및 0.5% PX, 뿐만 아니라 0.5% PG 및 PX 중의 2 mg/mL를 검토하였다. 약간 혼탁하고 겉보기에 유동성으로 보이지만, 여과 시 회수되지 못하는 pH 7, 0.1% PX 샘플을 제외하고는, 모두 투명하고 유동성으로 보였다. pH 5.5에서 회수율은 단지 78%였고, pH 4.0에서는 92%였다. 보다 다량의 PX는 pH 3 및 4.0에서 완전한 회수를 유도하였고, pH 5.3에서 93-97% 및 pH 7.0에서 88-92%의 회수율을 유도하였다. 많고 적은 PG 0.5% PX는 본질적으로 동일하였고, 이는 PG가 제형 매니폴드의 이러한 분야에서 그다지 중요하지 않음을 시사한다.

이들 실험 동안에 장기간의 정치 시 상당히 큰 pH 변화가 때때로 제시되었으므로, 2.0 mg/mL 화합물 1, 및 0.25% PX. 2% PG로의 유사한 실험을 여과 검정에 의한 분석으로, 자가-완충 물질 (HCl 염이 NaOH로 적정됨)을 10 mM 히스티딘, 아세테이트 및 시트레이트 완충제와 비교하면서 pH 3, 4, 5.5 및 7에서 실행하였다. 아세테이트 완충제는 모든 pH에서 적어도 자가-완충 물질만큼 우수하였고, 히스티딘 완충제는 미미하게 불량하였으며, 시트레이트 완충제는 보다 높은 pH의 3가지 경우에서 모두 현저히 열등하였는데, pH 4에서의 회수율이 히스티딘 완충제는 91%, 비완충물은 92%, 및 아세테이트 완충제는 97%인데 반해 단지 75%였다. 아세테이트 완충제는 이어서 표준화되었다.

등장성 작용제의 효과를 검사하기 위해, 0.25% PX와 함께, 2 mg mL 화합물 1의 pH 4 및 pH 5.5의 10 mM 아세테이트 완충 용액을 0.5% 및 2% PG, 4.5% 만니톨, 2% 글리세린 및 0.8% 수성 염화나트륨으로 검사하였다. 모두 pH 4.0에서 98-99%의 회수율 및 pH 5.5에서 90-94%의 회수율을 제공하나, 이들 두 pH에서 89% 및 79%의 회수율을 갖는 염화나트륨 샘플은 예외이다. 다소 저장성인 0.5% PG를 제외하고는, 모두 230-310 mOsm/L의 범위였다. 10 mM 아세테이트 완충제 및 등장성 작용제로서의 4.5% 만니톨, 2 mg/mL의 화합물 1, 및 pH 4.0 및 5.5를 사용하여, 5가지 계면활성제 조건을 검토하였다. 이들은 무 계면활성제, 0.1% PS-20, 0.1% PS-20과 0.25% PX, 0.25% PX 및 0.4% PX였다. 무 계면활성제는 높은 pH에서 0%, pH 4.0에서 23% 여과를 제공하였고, 0.4% PX 및 0.25% PX/0.1% PS-20 혼합물은 pH 4.0에서 완전한 회수 및 pH 5.5에서 각각 95% 및 91%의 회수율을 제공하였다. 0.25% PX는 pH 4 및 5.5에서의 회수율이 각각 96% 및 91%로 다소 열등하였고, 0.1% PS는 궁극적으로 각각 90% 및 65%로 상당히 열등하였다.

등장성 실험이 용해도에 있어서 히드로클로라이드가 불량할 수 있음을 시사하였으므로, 2 mg/mL의 화합물 1의 트리아세테이트 염을 사용하여 실험을 하였다. 아세트산의 약한 산도 때문에, 물 중 2 mg/mL의 이 염의 고유 pH는 3.4-3.6이지만, 샘플이 10 mM 아세트산, 4.5% 만니톨, 및 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.8% 및 1.0% PX 또는 0.4%, 0.5%, 0.75%, 1.0% 및 1.5% PS-20에 용해되고, pH가 4.0 또는 5.5로 조정되었다. 미조정 pH (3.4-3.6)를 갖는 모든 샘플은 여과 후에 >97%, 및 pH 4에서 >98%의 회수율을 제시하였다. pH 5.5에서, 0.4 및 0.5% PX는 96%의 회수율을 가지며, 보다 높은 PX 농도는 98-99%의 회수율을 발생시켰고, 반면에 PS-20 제형은 상기 pH에서 모두 92-94%의 회수율을 가졌다. 이들 실험으로부터, 최적화된 제형은 유사한 PS-20 기재 제형보다 PX를 덜 함유할 수 있지만, PS-20은 여전히 허용되며, 심지어 보다 고농도로 주어질 때도 PX의 일부 잠재적인 문제를 회피할 수 있다.

실시예 7: 화합물 1의 시험관내 효능.

세포 배양. 661W 광수용체 세포주를 무아야드 알-우바이디(Muayyad Al-Ubaidi) (미국 오클라호마주 오클라호마 시티 소재 오클라호마 대학교 보건 과학 센터 세포 생물학과)에 의해 풍부하게 제공받았다. 661W 세포주는 인간 광수용체간 레티놀-결합 단백질 (IRBP) 프로모터의 제어 하에 SV40-T 항원의 발현에 의해 불멸화된 광수용체 세포주이다 (Al-Ubaidi et al., J Cell Biol., 119(6):1681-1687 (1992), 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 661W 세포는 청색 및 녹색 추체 색소, 트랜스듀신, 및 추체 아레스틴을 포함한 추체 광수용체 마커를 발현하고 (Tan et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., (3):764-768 (2004), 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 카스파제-매개된 세포 사멸을 겪을 수 있다 (Kanan et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 48(1):40-51 (2007), 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

661W 세포주를 10% 태아 소 혈청, 300 mg/L 글루타민, 32 mg/L 푸트레신, 40 μL/L β-메르캅토에탄올, 40 μg/L 히드로코르티손 21-헤미숙시네이트 및 40 μg/L 프로게스테론을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지에 유지하였다. 배지는 또한 페니실린 (90 U/mL) 및 스트렙토마이신 (0.09 mg/mL)을 함유하였다. 세포를 5% CO2 및 95% 공기의 가습 분위기에서 37℃에서 성장시켰다.

활성 검정. 카스파제 3, 카스파제 8 및 카스파제 9 활성을 제조업체의 지침에 따라, 비색 테트라펩티드 절단 검정 키트로 측정하였다 (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재 바이오비전(BioVision)). 전체 (661W/망막) 단백질을 이미 공개된 프로토콜에 따라 추출하였다 (Zacks et al., IOVS, 44(3):1262-1267 (2003), 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 100 마이크로그램의 전체 (661W/망막) 단백질을 60분 동안 200 μM 최종 농도에서 카스파제 3 (DEVD-pNA), 카스파제 8 (IETD-pNA) 또는 카스파제 9 기질 (LEHD-pNA)과 함께 인큐베이션하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (스펙트라-맥스(Spectra-MAX) 190, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))로 405 nm에서 측정하였다. 음성 대조군으로서, (661W/망막) 단백질을 테트라펩티드 없이 검정 완충제와 함께 인큐베이션하였다. 검정 완충제 단독으로 테트라펩티드와 함께 인큐베이션된 제2 음성 대조군을 사용하였다. 양성 대조군으로서, 정제된 카스파제 3, 카스파제 8 또는 카스파제 9를 단독의 테트라펩티드와 함께 인큐베이션하였다.

본 발명의 개발 동안 수행된 사전 실험으로, Fas 신호전달이 생체내 카스파제 8 활성화 및 광수용체 아폽토시스에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었다.

661W 세포를 FasL로 처리하였다. FasL의 첨가는 세포 사멸을 유발하였다. 661W 세포 용해물에서 측정된 카스파제 8의 활성은 FasL의 농도가 증가할수록 증가하여, 500 ng/ml의 용량에서 피크를 이루었다. 661W 세포를 500 ng/ml의 FasL로 처리하고, 다양한 시점에서 활성 수준을 측정하였다. 카스파제 8 활성은 FasL에 노출된 661W 세포에서 제48시간에 상당히 증가되었다. 카스파제 8 활성은 상이한 실행에서 용량-의존성 방식으로 신뢰할 수 있게 20-30% 증가되었다.

상기에 기재된 검정 시스템은 Fas-유도된 카스파제 8 활성화 경로의 잠재적 억제제를 밝혀내기 위한 시험관내 스크리닝 시스템으로서 사용되었다. Met-12 (트리히드로클로라이드 염)가 이러한 661W 세포 검정에서 시험되었을 때, FasL-유도된 카스파제 8 활성화의 용량 의존성 감소가 제시되는데, 10 μM에서 최대이고, 여기서 검정에 따라 카스파제 8 활성화는 기준선의 0-25% 내로 감소되었다. 이러한 활성은 Met-12 펩티드가 전달되는 제형에 크게 좌우된다. 본 검정을 위해 Met-12의 최종 제형을 1000배 희석하고, 보통 100 μM인 용량 곡선의 최고점에 도달하기 위해 보다 약한 희석이 사용된다. 이들 환경 하에, 최대 용량 효력은 투명한 유동성 액체로서 Met-12 펩티드를 전달하는 순수 DMSO 용액으로 제시되었고, 여기서 겉보기 pH는 3.0보다 훨씬 낮다. 수성계 제형이 시도되었을 때, 심지어 물질이 시험 웰에 첨가되기 전에 침전 또는 응집의 시각적 증거가 없는 경우에도, 제형은 상당히 낮은 용량 효력을 제시하였는데, 최대 억제가 50-100 μM 용량까지 달성되지 않았다.

이는 시험 웰에서의 최종 물리적 형태에 상관없이, 투여 용액에서의 응집이, 심지어 이들 세포 검정에서도, 아마도 이들이 동일한 고유 잠재적 용해도를 가질 정확히 동일한 조건으로 진정한 용액이 희석되는 경우보다 이용가능한 약물이 훨씬 적은 종을 유도함을 강력히 시사한다. 지금까지 이에 대한 가장 가능성 있는 설명은 비-용액에서 미리 형성된 응집체는 시험 지속기간 동안 최적의 속도로 용액 중으로 분해되지 않을 정도로 충분히 동역학적 및 열역학적으로 안정하고, 반면에 용액은 시험 웰로 희석될 때 응집체를 형성하지 않거나, 또는 보다 용이하게 용해되는 상이한 응집체를 형성할 가능성이 더 크다는 것이다. 응집체가 상이한 주요 이유는 펩티드가 그의 pH로부터 달라질 때 최소한 다소 덜 농축된 형태 또는 pH 7.4의 99% 수성 환경에 대해 공용매-부스팅된 가용성 형태이기 때문일 것이다. 그러나, 시험 웰에서의 효율적인 혼합의 가능성이 낮고, 눈에서는 불가능하며, 또한 하기에 논의된 바와 같이 용매화 양성자 (낮은 pH) 및 소분자 용매가 소수성 및 벌키 펩티드보다 훨씬 빠르게 물에서 확산될 것이기 때문에, 이들 펩티드는 시험 웰에서 또는 투여 직후에 유리체액에서 급속히 응집될 가능성이 높다. 따라서, 용액 투여가 분명히 현탁액/겔 투여보다 우월하더라도, 많은 펩티드가 불용성 응집체로서 격리되지 않을 것이며, 투여되었을 때 확률적 방식으로 약물의 유효 농도가 감소되지 않을 것이라는 보장은 여전히 없다.

예상외로, 도 1에 제시된 바와 같이, 화합물 1 트리히드로클로라이드가 DMSO 중의 비완충 용액으로서 본 검정에서 시험되었을 때, Met-12 (이 또한 DMSO 중의 트리히드로클로라이드)와 비교하여, 이는 IC₅₀ 결정에 의해 Met-12보다 10배 더 강력하고, FasL-유도된 카스파제 8 활성화의 최대 억제를 발생시키는 농도에 의해 측정 시 대략 3배 더 강력한 것으로 입증되었다. EC₅₀은 0.4 μM이었고, 반면에 Met-12 자체의 경우에는 4 μM이었으며, 최대 억제는 3 μM에서 제시되었다. 그러나, 3 μM을 초과하면 화합물 1은 U-형상의 곡선을 제시하였고, 30 μM을 초과하면 거의 불활성인 것으로 보였다. 대조적으로, 동일한 방식으로 투여된 Met-12는 10 μM에서 그의 (약간 더 큰) 최대 효능에 도달하였고, 이어서 100 μM까지 효력의 단지 약간의 반등 손실이 있었다. (도 1 참조; Met-12 및 화합물 1로의 예비-처리 후에, 인간 재조합 FasL로 처리한 지 48시간 후의 카스파제 8 활성.) 0%는 비처리 대조군의 카스파제 8 활성 수준이다. 100%는 단지 FasL로 처리된 대조군의 카스파제 8 활성으로 설정된다.

FasL의 작용 메카니즘은 Fas 수용체의 3가 리간드 삼량체화를 수반하므로, 1가 Met-12 유도체가 어떻게 혼합된 효능제-길항제 용량 곡선을 가질 수 있는지를 제시하기가 매우 어렵고, 효력의 손실은 검정의 용해도의 산물인 것으로 생각된다. 그러나, 화합물 1의 용량 효력에 있어서의 예상외의 증가는 Met-12 자체에 대해 요구되는 것보다 적은 양의 약물이 제공되도록 할 것이며, 이는 결국 유리체내 주사를 위한 펩티드 제형에 대한 용해도 요건을 감소시킨다.

도 2에 제시된 데이터는 상기 설명과 일치한다. 이는 DMSO 중의 화합물 1 트리히드로클로라이드 (20 mg/mL)가 Met-12보다 다소 더 강력한 용량 효력을 갖지만, 보다 고농도에서 이는 다시 불활성이 됨을 다시 한번 제시한다. 대조적으로, pH 4의 2% 폴리소르베이트 20 및 2% PG의 투명하고 여과가능한, 아마도 미셀 용액으로 10 mg/mL의 농도로 구성되었을 때, 화합물 1 트리히드로클로라이드는 Met-12 또는 DMSO 중의 화합물 1보다 상당히 더 강력한 용량 효력을 가질 뿐만 아니라, 또한 보다 더 효과적이었다. 게다가, 본 검정에서 시험된 30 μM의 최고 용량에서 최대 효능의 손실이 거의 없었다. 이러한 놀라운 결과는 계면활성제 중에 화합물 1을 제형화하는 능력이 약물 효능을 크게 부스팅할 수 있음을 제시한다.

도 3은 20 mg/mL DMSO 용액을, pH 4에서 모두 10 mg/mL 농도로 1% 및 3% PS-20 및 3% PG를 함유하는 화합물 1 트리히드로클로라이드의 2가지 폴리소르베이트 제형과 비교한다. 이들 3가지는 모두 이러한 경우에 보다 저농도에서 유사한 효능을 제시하지만, 1% PS-20만이 단지 그의 가장 강력한 3 μM 농도에서부터 30 μM까지 활성의 약한 손실을 제시하고, 반면에 3% PS는 시험된 최고 용량인 30 μM까지 활성의 계속된 증가를 제시하였다.

도 4에서는, 661W 세포에서 2 mg/mL의 pH 4, 10 mM 아세테이트 완충제, 4.5% 만니톨 및 0.4% PS-20의 화합물 1 트리히드로클로라이드의 최적화된 제형 (진한 색 삼각형)을 DMSO 중 20 mg/mL의 화합물 1 트리히드로클로라이드 (연한 색 동그라미)와 비교한다. DMSO 중의 트리히드로클로라이드는 3 μM에서 최대 효과를 가지며, 보다 고농도에서 상당한 반등을 갖는 통상적인 U-형상의 곡선을 제시하였다. 제형은 그의 저농도 때문에 단지 10 μM까지만 시험될 수 있었지만, DMSO 용액과 유사한 효능을 제시하였다.

미셀 제형으로 제시되는 보다 큰 효능에 대한 가능성 있는 설명은, pH 구배 또는 소분자 공용매와 극명하게 대비되는, 희석 및 분산에 의해 단지 서서히 영향을 받는 계면활성제의 자가-조립 성향에 의해 펩티드 용해도가 보다 장기간 동안 유지된다는 것이다. 따라서, 미셀은 단지 서서히 분리되기 때문에, 펩티드가 수성 매질 내로 방출되기 전에, 미셀 및 펩티드는 수성 매질 내에 보다 광범위하게 분산되어 있고, 반면에 공용매 또는 고도로 산성인 용액에서는, 펩티드가 직접 주사를 놓은 부위를 벗어나 분산될 임의의 실제 기회를 갖기 전에, 가용화 인자 (수소 이온, 소분자)가 수성 매질 내로 매우 급속히 희석된다. 이는 펩티드가 미셀 제형보다 용액 제형으로부터 덜 효율적으로 분산되고 보다 많은 불활성 응집체를 형성하도록 할 것이다.

실시예 8: 화합물 1의 토끼 유리체내 안구 약동학적 연구

본 연구는 수컷 더치 벨티드 토끼의 유리체내 주사 후에 유리체액 (VH) 및 망막 조직에서의 화합물 1의 농도를 결정하기 위해 수행하였다. 농도는 50 μL 양측 유리체내 (IVT) 용량의 투여후 제24시간, 제72시간, 제168시간 및 제240시간에 조직에서 결정하였다.

연구 설계는 표 1에 요약되어 있다.

표 1. 연구 설계.

시험 시스템은 하기를 포함하였다:

50 μL의 유리체내 (IVT) 주사 안구 용량을 더치 벨티드 토끼 눈 각각의 안구에 투여하였다.

각각의 시점에서 정맥내 바르비투레이트 과용량에 의해 토끼를 안락사시키고, 눈을 적출하여 순간 동결시켰다. 유리체액 및 망막을 모든 동물로부터 수집하여, LC-MS/MS에 의해 화합물 1에 대해 분석하였다.

계산:

퍼센트 변동 계수: 정밀도의 추정치로서 사용된다.

퍼센트 변동 계수 (%CV) = (표준 편차/ 평균값) * 100

2차 최소 제곱 분석: 표준 곡선 맞춤은 1/x² 가중치를 두어 2차 방정식을 사용하여 결정하였다:

y = ax² + bx + c

여기서: y = 보정 표준물 대 내부 표준물의 피크 면적 비

x = 보정 표준물의 농도

a = x²의 2차 계수

b = x의 2차 계수

c = 보정 곡선의 y-절편으로서의 상수

2차 분석물 농도: 분석물의 농도는 상기에서 계산된 보정 곡선 파라미터를 사용하고, 이어서 x의 값을 풀어서 계산한다.

결과

망막 및 VH 농도는 하기 표 2 및 3에서 찾아볼 수 있으며, 도 1 및 2에 그래프로 나타나 있다. 적절한 경우에 약동학적 파라미터를 계산하였고, 이는 하기 표 4 및 5에 요약되어 있다.

표 2. 더치 벨티드 망막에서의 화합물 1의 농도.

표 3. 더치 벨티드 유리체액에서의 화합물 1의 농도.

망막 및 유리체액 둘 다에서의 본 연구의 결과는 각각 도 5 (A+B) 및 도 6 (A+B)에 제시되어 있다. 화합물 1의 망막 농도는 모든 그룹에서 연구의 시간-경과에 따라 52 내지 156 퍼센트 범위의 변동 계수 (%CV)로 다양하였다. 망막 T_max는 3가지 폴록사머 제형에 대해 투여후 제72시간 (제3일) 또는 제168시간 (제7일)에 기록되었지만, 용량 의존성은 아니었고, 반면에 폴리소르베이트 제형에 대해 망막 T_max는 투여후 제24시간이었다. 망막 AUC_0-최종은 C_max와 유사한 변동 패턴을 따랐다. 화합물 1에 대해 망막 T_1/2은 단지 2 mg/mL 폴록사머 (제168시간) 및 1 mg/mL 폴리소르베이트 (제199시간) 망막 데이터의 경우에만 계산될 수 있었다.

화합물 1에 대한 유리체액의 분석은 폴록사머 제형의 경우에 농도가 각 시점 내에서 상대적으로 일관적임을 나타냈다. 수집된 VH의 중량에 의해 정규화된, 화합물 1의 이론적 합계를 계산하였다. 각각의 토끼 눈에 주사된 화합물 1의 총량은 폴록사머의 경우에는 100 μg (2 mg/mL * 50 μL) 또는 25 μg (0.5 mg/mL * 50 μL)이고, 폴리소르베이트 그룹의 경우에는 50 μg (1 mg/mL * 50 μL)이었다. 모든 그룹에서 최저 평균 농도는 제10일이었다. 그룹 1 (100 μg)에서 VH에 잔류하는 평균 화합물 1은 IVT 투여후 제24시간부터 제10일까지 84.2 μg 내지 106 μg의 범위였다. 그룹 2 (25 μg)에서 VH에 잔류하는 평균 화합물 1은 IVT 투여후 제24시간부터 제10일까지 19.5 μg 내지 23.0 μg의 범위였다. 그룹 3 (25 μg)에서 VH에 잔류하는 평균 화합물 1은 IVT 투여후 제24시간부터 제10일까지 26.0 μg 내지 20.4 μg이었다. 폴리소르베이트 그룹 4 (50 μg)에서 VH에 잔류하는 평균 화합물 1은 IVT 투여후 제24시간에 최고치인 46.8 μg 내지 제10일의 19.4 μg의 범위였다. 폴리소르베이트 그룹이 시간에 따라 화합물 1 농도의 주목할 만한 감소를 나타내는 유일한 제형이었다. 그러나, 모든 그룹에서 실질적인 양의 무손상 약물이 투여후 10일에 검출되었다.

VH에서의 화합물 1에 대한 약동학적 파라미터의 계산은 IVT 투여후 제24시간 또는 제72시간의 T_max를 나타내며, C_max는 각각의 그룹에서 투여된 약물의 총량과 근접하게 매칭되었다 (표 4). AUC_0-최종은 폴록사머 그룹 사이에 거의 용량 비례적이며, 그룹 1 (2 mg/mL)이 그룹 2 및 3 (둘 다 0.5 mg/mL)보다 대략 4배 더 큰 AUC를 가졌다. 폴리소르베이트 그룹 (1 mg/mL)은 폴록사머 그룹에 비해 덜 용량 비례적이었지만, 연구 과정 동안 화합물 1 VH 농도의 주목할 만한 감소를 갖는 유일한 그룹이기 때문에 용이하게 설명될 수 있다. 폴리소르베이트 그룹의 t_1/2은 우수한 선형 맞춤으로 제183시간이었고, 반면에 폴록사머 그룹의 t_1/2은 보다 덜 최적의 선형 맞춤으로 >900시간이었다.

표 4. 유리체액에서의 화합물 1에 대한 약동학적 파라미터.

표 5. 망막에서의 화합물 1에 대한 약동학적 파라미터.

요약하면, 화합물 1은 폴록사머 또는 폴리소르베이트 제형으로 IVT 투여되었을 때 연구의 10일 과정 동안 자극 또는 내약성 문제의 징후를 제시하지 않았다. 화합물 1은 폴록사머 제형으로서 IVT 투여되었을 때 망막 또는 VH에서 최대 10일의 기간 동안, 및 아마도 그 초과의 기간 동안 농도가 쉽게 감소하지 않았다. 화합물 1은 폴리소르베이트 제형으로서 투여되었을 때 10일의 연구 시간 경과 동안 느리긴 하지만, 농도의 분명한 감소를 입증하였고, 이는 유리체내 약동학이 사용되는 비-이온성 계면활성제의 신중한 선택에 의해 특정 파라미터 내에서 제어가능할 수 있음을 시사한다.

실시예 9: 화합물 1의 래트 안구 약동학적 연구

본 연구는 브라운 노르웨이 래트의 유리체내 주사 후에 유리체액 및 망막 조직에서의 화합물 1 트리히드로클로라이드의 농도를 결정하기 위해 수행하였다. 농도는 5 μL 양측 유리체내 (IVT) 용량의 투여후 제24시간 (그룹 1) 및 제72시간 (그룹 1 및 2)에 조직에서 결정하였다.

연구 설계는 표 6에 요약되어 있다.

표 6. 연구 설계.

시험 시스템은 하기를 포함하였다:

안구 조직의 수거

정맥내 바르비투레이트 과용량에 의해 래트를 안락사시키고, 눈을 적출하여 순간 동결시켰다. 유리체액 (VH) 및 망막을 모든 동물로부터 수집하여, LC-MS/MS에 의해 화합물 1에 대해 분석하였다.

결과

안구 조직 농도

미지의 브라운 노르웨이 래트 망막 및 유리체액에서의 화합물 1 트리히드로클로라이드 농도

표 7. 브라운 노르웨이 래트 망막에서의 화합물 1의 농도.

표 8. 브라운 노르웨이 래트 유리체액에서의 화합물 1의 농도.

조직 균질화

미지의 유리체액 (VH)의 균질화 지침

미지의 VH 또는 대조군 블랭크 각각에 대해: 균질화 튜브에 VH를 칭량하여 넣는다. VH 중량 (mg)의 4배의 ACN:물:1 M 염산 (70:20:10, v/v/v) (μL)을 균질화 튜브에 첨가한다. 2.8 및 1.4 mm 크기의 산화지르코늄 비드를 첨가한다. 프리셀리스(Precellys)®에서 모든 샘플을 균질화한다: 5500 rpm, 3 X 30초 사이클, 및 사이클 사이에 20초, -10 내지 0℃의 온도.

망막 안구 조직 표준물의 균질화 지침

망막 표준물 각각에 대해:

균질화 튜브에 블랭크 망막 조직을 칭량하여 넣는다.

조직 중량 (mg)의 0.5배의 망막 작업 보정 표준물 (μL)을 균질화 튜브에 첨가한다.

조직 중량 (mg)의 3.5배의 ACN:물:1 M 염산 (70:20:10, v/v/v) (μL)을 균질화 튜브에 첨가한다.

1.4 mm 크기의 산화지르코늄 비드를 첨가한다.

프리셀리스®에서 모든 샘플을 균질화한다: 5500 rpm, 3 X 30초 사이클, 및 사이클 사이에 20초, -10 내지 0℃의 온도.

망막 조직 블랭크 대조군 및 미지물의 균질화 지침

미지의 망막 또는 대조군 블랭크 각각에 대해:

균질화 튜브에 망막 조직을 칭량하여 넣는다.

조직 중량 (mg)의 4배의 ACN:물:1 M 염산 (70:20:10, v/v/v) (μL)을 균질화 튜브에 첨가한다.

1.4 mm 크기의 산화지르코늄 비드를 첨가한다.

표준물, 샘플 및 블랭크의 제조

보정 스톡 및 작업 표준물의 제조

ONL-1204에 대해 500 μg/mL의 농도로 디메틸술폭시드 (DMSO) 중의 스톡 보정 표준물을 제조하였다.

유리체액을 위한 작업 보정 표준물은 ONL-1204의 500 ng/mL 내지 200,000 ng/mL의 범위에 걸쳐 작업 스톡 용액을 ACN:물:1 M 염산 (70:20:10, v/v/v)으로 연속 희석함으로써 제조하였다.

망막을 위한 작업 보정 표준물은 ONL-1204의 100 ng/mL 내지 200,000 ng/mL의 범위에 걸쳐 작업 스톡 용액을 아세토니트릴:물:1 M 염산 (70:20:10)으로 연속 희석함으로써 제조하였다.

유리체액 분석을 위한 표준물, 미지물, 블랭크 및 내부 표준물을 갖는 블랭크의 제조

폴리프로필렌 튜브에서, 십 (10) μL (20 μL STD 11)의 작업 보정 표준물 또는 스톡을 90 μL (80 μL STD 11)의 대조군 블랭크 유리체액에 첨가하였다. 블랭크 및 내부 표준물을 갖는 블랭크의 경우에는, 100 μL의 대조군 블랭크 소 유리체액을 첨가하였다. 사백 (400) μL의 ACN:물:1 M 염산 (70:20:10, v/v/v)을 각각의 표준물 또는 블랭크에 첨가하였다.

ACN:포름산 (1000:1, v/v)이 함유된, 백 (100) μL의 각각의 유리체액 샘플을 이어서 분취하였다. 백 (100) μL의 DMSO:물:포름산 (50:40:10)을 각각의 유리체액 샘플에 첨가하였다. 샘플을 볼텍스 혼합한 다음, 10분 동안 14,000 rpm (4℃)에서 원심분리하였다. 50.0 μL의 상청액에, 100 μL의 작업 내부 표준물 (물 중 50,000 ng/mL의 APi1887) (내부 표준물이 없는 블랭크의 경우에는 물), 및 150 μL의 물을 첨가하였다. 이어서 샘플을 볼텍스 혼합하고, 분석을 위해 오토샘플러 플레이트로 옮겼다.

망막 분석을 위한 표준물, 미지물, 블랭크 및 내부 표준물을 갖는 블랭크의 제조

폴리프로필렌 튜브에, 50 μL의 브라운 노르웨이 래트의 미지의 균질물, 소 대조군 블랭크 또는 보정 표준물 소 균질물을 첨가하였다. 오십 (50) μL의 DMSO:물:포름산 (50:40:10)을 각각의 샘플에 첨가하였다. 이어서 샘플을 볼텍스 혼합하고, 10분 동안 14,000 rpm (4℃)에서 원심분리하였다. 이어서 팔십 (80) μL의 각각의 샘플 상청액을 96-웰 오토샘플러 플레이트에 분취하였다. 사십 (40) μL의 작업 내부 표준물 (물 중 5,000 ng/mL의 APi1887) (내부 표준물이 없는 블랭크의 경우에는 물), 및 120 μL의 물을 첨가하였다. 이어서 샘플을 다중채널 피펫으로 혼합하고 분석하였다.

계산

퍼센트 변동 계수: 정밀도의 추정치로서 사용된다.

퍼센트 변동 계수 (%CV) = (표준 편차/ 평균값) * 100

y = ax² + bx + c

여기서: y = 보정 표준물 대 내부 표준물의 피크 면적 비

x = 보정 표준물의 농도

a = x²의 2차 계수

b = x의 2차 계수

c = 보정 곡선의 y-절편으로서의 상수

분석

종합적으로 평균 낸 결과가 도 7에 제시되어 있다. 그룹 1은, 각각의 동물로부터의 양안이 둘 다 단일 분석을 위해 조합되었다. 그룹 2는, 4마리의 동물로부터 양안이 둘 다 조합되어 샘플을 이루었다. 그룹 2의 풀링된 망막에서의 농도는 A-D 및 E-H 샘플 각각에서 462 및 1310 ng/g이었다. 화합물 1에 대한 유리체액의 분석을 그룹 1 및 2의 각각의 동물의 각각의 눈으로부터 조합된 샘플을 사용하여 수행하였다. 수집된 VH의 중량에 의해 정규화된, 화합물 1의 이론적 합계를 계산하였다. 각각의 래트 눈에 주사된 화합물 1의 총량은 0.3 μg (0.06 mg/mL * 5 μL)이었다. 제72시간 데이터가 수집되는 상이한 방식 때문에, 표준 오차는 계산되지 않았다. t = 0 막대는 300 ng의 의도된 용량을 나타내면서, 진한 색 막대는 각각의 눈의 유리체액에서의 화합물 1 트리아세테이트의 양을 나타내고, 연한 색 막대는 ng/g 단위로 나타낸 망막에서의 화합물 1의 농도를 나타낸다. 처음 24시간에, 약물의 약 절반이 VH에서 소거되었지만, 최종 반감기는 분명히 대략 수일이었다. 한편, 망막 농도는 제24시간에 1 μg/g 초과이며, 제72시간이 될 때 단지 약 40%만을 가졌다. 이는 래트 망막이 적어도 1주일 동안 용이하게 검출가능한 양으로 약물에 노출될 것임을 시사한다.

화합물 1의 망막 농도는 그룹 1 제24시간 샘플에서 146 내지 3670 ng/g의 범위이고, 그룹 1 제72시간 샘플에서 409 내지 804 ng/g의 범위였다. 그룹 1에서 VH에 잔류하는 평균 화합물 1은 제24시간 및 제72시간 시점에서 각각 0.157 및 0.0994 μg/ 샘플이었다. 제72시간에 그룹 2 샘플에서 VH에 잔류하는 평균 화합물 1은 0.127 μg/ 샘플이었다. 데이터는 실질적인 양의 무손상 약물이 투여후 72시간에 잔류함을 나타낸다.

실시예 10: 화합물 1의 생체내 효능.

간략하게 설명하면, 설치류를 케타민 (100 mg/mL) 및 크실라진 (20 mg/mL)의 50:50 혼합물로 마취시키고, 동공을 국소 페닐에프린 (2.5%) 및 트로픽아미드 (1%)로 확장시켰다. 20-게이지 미세유리체망막도 (미국 뉴저지주 마모라 소재 월코트 사이언티픽(Walcott Scientific))를 사용하여, 조심스럽게 수정체 손상을 회피하면서 윤부의 후방 2 mm에서 공막절개하였다.

의료용 현미경을 통한 직접적인 가시화 하에, 망막하 주사기 (글레이저(Glaser), 32-게이지 팁; 미국 플로리다주 사라소타 소재 BD 오프탈믹 시스템즈(BD Ophthalmic Systems))를 공막절개부를 통해 유리체강으로 도입한 다음, 주변 망막절개부를 통해 망막하 공간으로 도입하였다. 히알루론산나트륨 (10 mg/mL)을 서서히 주사하여, 기저 망막 색소 상피로부터 감각신경 망막을 박리시켰다.

모든 실험에서, 상비측 감각신경 망막의 대략 1/3 내지 1/2을 박리시켰다. 모든 동물에서, 박리가 동일한 위치에서 이루어져, 망막 세포 계수의 직접 비교를 가능하게 하였다. 박리는 좌안에서 이루어지고, 우안은 대조군으로서 남겨두었다.

일부 눈에서는 야생형 Met-12 (HHIYLGAVNYIY, DMSO 중 5 μg)가 그의 트리히드로클로라이드 염으로서 양성 대조군으로 주어졌고, 다른 눈에서는 화합물 1 (DMSO 중 0.5, 1.0, 5.0 또는 10 μg)이 그의 트리히드로클로라이드 염으로서 또는 비히클 (디메틸 술폭시드 [DMSO])이 박리 직후에 해밀턴 시린지 (미국 네바다주 리노 소재 해밀턴 캄파니(Hamilton Company))를 사용하여 5-μL 부피로 박리 부위의 망막하 공간에 주사되었다.

3일 후에 래트를 안락사시키고, 망막을 절제하고, 고정하고, 절편화하고, TUNEL 검정을 위해 염색하였다. 박리된 망막 부위에서 아폽토시스 세포 수를 계수하였다. 각각의 실험은 각각의 투여 그룹에서 5 또는 6개의 망막으로부터 수득된 4개의 절편 각각으로부터의 4개의 필드를 수반하였다. 결과는 도 8에 제시되어 있다.

도 8에 제시된 바와 같이, 망막이 부착되어 있는 대조군은 아폽토시스 세포를 제시하지 않았고, 반면에 DMSO 대조군 망막은 대략 4%의 세포가 TUNEL 염색되고, 양성 대조군 Met-12 (5 μg)는 TUNEL에서 1%를 겨우 초과하는 양성을 나타냈다. 화합물 1 트리히드로클로라이드 염 처리는 0.5 μg에서는 0.58%, 1 μg에서는 1.14%, 5 μg에서는 0.82%, 및 10 μg에서는 0.9%를 유도하였다. 모델에 대한 상당한 경험에 기초하여, 화합물 1에 대한 결과는 서로, 또한 Met-12 5 μg 양성 대조군과 대략 동등한 것으로 간주된다. 따라서, 예상외로, 화합물 1 트리히드로클로라이드 염은 이러한 생체내 모델에서 Met-12 트리히드로클로라이드 염보다 훨씬 더 효과적이다.

실시예 11: 효능 연구

실시예 10과 동일한 설치류 망막 박리 모델을 사용하여, DMSO 중 화합물 1의 고도로 효과적인 5 μg 용량을 2가지 상이한 제형 중 화합물 1의 동일한 용량 및 1 μg 용량과 비교하였다.

제1 제형은 pH 4.0의 3% 프로필렌 글리콜 및 3% PS-20 중 화합물 1 트리히드로클로라이드의 1.0 또는 0.2 mg/mL 용액이고, 제2 제형 또한 pH 4의 2% 프로필렌 글리콜, 2% 폴록사머 407 중 화합물 1의 동일한 농도의 용액이었다. 결과는 도 9에 제시되어 있다.

부착된 대조군 망막은 아폽토시스 세포를 제시하지 않았고, 반면에 비처리된 박리는 이러한 시점에 측정 시 대략 6.5%의 아폽토시스 세포를 제시하였다.

DMSO 중의 화합물 1은 아폽토시스 세포를 2.5%로 감소시켰고, 5 μg PG/PS-20은 아폽토시스 세포를 2.9%로 감소시키면서, 유사한 효력을 나타냈다. 그러나 PG/PX 제형은 5 μg에서 아폽토시스 세포를 0.3%로 감소시키키면서, 상기 농도에서 상당히 더 우수하였다. 1 μg에서 PG/PX 제형은 아폽토시스 세포를 0.4%로 감소시켰지만, PG/PS-20 1 μg 용량은 0.01%로의 훨씬 더 큰 감소를 발생시켰다. 데이터는 미셀 형성이 작용할 수 있을 뿐만 아니라, 화합물 1 트리히드로클로라이드 염이 DMSO 중에 제형화될 때보다 이들 중에서 훨씬 더 강력할 수 있는 것으로 입증한다.

실시예 12: 효능 연구

실시예 10과 동일한 설치류 망막 박리 모델을 사용하여, DMSO 중의 화합물 1 트리히드로클로라이드 염 (1 μg)을 양성 대조군으로서 사용하였다. 음성 대조군은 평가 하의 시험 비히클 (0.4% 폴록사머, 4.5% 만니톨, 10 mM 아세트산, pH 4.5)이었다. DMSO 중의 화합물 1 트리아세테이트 염 (1 μg)을 동일한 용량으로 트리히드로클로라이드 염과 비교하였다.

부착된 망막 (막대 4)은 아폽토시스 세포를 갖지 않았고, 반면에 비히클 처리된 박리 망막 (막대 1)은 4.2%의 아폽토시스 세포를 제시하나, 이는 비처리된 망막 박리에 대한 이력 범위 내에 포함되므로 무 활성을 시사한다 (실시예 10 참조). 화합물 1 트리히드로클로라이드 염 (DMSO)은 2.4%의 아폽토시스 세포를 제공하였고, 반면에 트리아세테이트 염 (DMSO)은 단지 1.2%를 제공하였는데, 이는 히드로클로라이드로부터 아세테이트 염으로의 전환이 효능에 대해 부정적 영향을 갖지 않으며, 아마도 상당한 긍정적 효과를 갖는 것으로 입증한다.

본 출원에서 언급되고/거나 하기에 열거된 모든 공개 및 특허는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범주 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명이 구체적 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 구체적 실시양태로 지나치게 제한되어서는 안되는 것으로 이해하여야 한다. 사실상, 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백한 본 발명의 기재된 수행 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도된다.

본 발명이 그의 특정 실시양태와 관련하여 상당히 상세히 기재되었지만, 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다른 실시양태도 가능하다. 따라서 첨부된 청구범위의 취지 및 범주는 본원에 포함된 바람직한 실시양태의 설명으로 제한되어서는 안된다. 청구범위의 의미 내에 포함되는 모든 실시양태가 문자 그대로 또는 균등론에 의해 그에 포함되도록 의도된다.

게다가, 상기에 기재된 이점이 반드시 본 발명의 유일한 이점인 것은 아니며, 기재된 모든 이점이 본 발명의 모든 실시양태로 달성될 것이라고 반드시 예상되는 것은 아니다.

SEQUENCE LISTING <110> ONL Therapeutics, Inc. The Regents of the University of Michigan <120> PEPTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> 15428-9 <150> US 62/155,711 <151> 2015-05-01 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificail peptide; C-terminal amide of Met-12 <400> 1 His His Ile Tyr Leu Gly Ala Val Asn Tyr Ile Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide; a small peptide inhibitor, Met-12 <400> 2 His His Ile Tyr Leu Gly Ala Val Asn Tyr Ile Tyr 1 5 10

Claims

화학식 1의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항의 화합물의 폴리아세테이트 염.
제1항의 화합물의 트리아세테이트 염.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 광수용체에서의 Fas- 또는 TRAIL 매개된 아폽토시스 예방용 제약 제형에 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 망막 색소 상피 세포에서의 아폽토시스 또는 네크롭토시스 예방용 제약 제형에 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 박리 치료용 제약 제형에 사용하기 위한 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 신경절 세포의 질환 또는 병태 예방용 제약 제형에 사용하기 위한 화합물.
안구 전달을 위해 구성된 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 및 제약 담체.
제8항에 있어서, 안구내, 유리체내 또는 안구주위 투여를 위해 제형화된 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 조성물 내의 화합물이 박리된 망막 광수용체 세포를 보호하는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 조성물 내의 화합물이 눈의 망막 색소 상피 세포에서의 아폽토시스 또는 네크롭토시스를 예방하는 것인 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 조성물 내의 화합물이 눈의 망막 신경절 세포에서의 아폽토시스 또는 네크롭토시스를 예방하는 것인 조성물.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 눈에 비-독성인 조성물.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제를 추가로 포함하는 조성물.
제14항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 407 및 틸록사폴로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 조성물의 대략 0.01%-20% w/w를 구성하는 것인 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 조성물의 대략 0.05%-10% w/w를 구성하는 것인 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 적어도 1종의 비-이온성 계면활성제가 조성물의 대략 0.25%-3% w/w를 구성하는 것인 조성물.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 첨가된 비-이온성 계면활성제의 총량이 조성물의 0.01-20% w/w이도록 하여, 2종 이상의 비-이온성 계면활성제가 유리체 또는 망막 약동학과 같은 파라미터를, 급성이든지 또는 만성이든지, 치료되는 적응증에 적합하게 최적화하는 비로 사용되는 것인 조성물.
제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 공용매를 추가로 포함하는 조성물.
제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 프로필렌 글리콜 및 디메틸술폭시드 중 적어도 1종을 추가로 포함하는 조성물.
제21항에 있어서, 유기 공용매가 조성물의 대략 1%-50% w/w를 구성하는 것인 조성물.
제21항에 있어서, 유기 공용매가 조성물의 대략 1%-20% w/w를 구성하는 것인 조성물.
제21항에 있어서, 유기 공용매가 조성물의 대략 1%-5% w/w를 구성하는 것인 조성물.
제7항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 2.5-6.0 범위의 pH를 갖는 조성물.
제9항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조성물을 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환을 치료하는 방법.
제26항에 있어서, 안구 병태, 질환, 또는 안구 건강에 영향을 미치는 병태 또는 질환이 망막 박리, 황반 변성, 연령-관련 황반 변성, 비-삼출성 연령-관련 황반 변성, 삼출성 연령-관련 황반 변성, 맥락막 신생혈관화, 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 급성 및 만성 황반 시신경망막병증, 중심성 장액 맥락망막병증, 황반 부종, 낭포양 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종, 포도막염/망막염/맥락막염, 다초점성 판상 색소 상피병증, 베체트병, 산탄 망막맥락막병증, 감염증 (매독, 라임병, 결핵, 톡소플라스마증), 포도막염, 중간 포도막염 (주변부 포도막염), 전방 포도막염, 다초점성 맥락막염, 다발성 소실성 백반 증후군 (MEWDS), 안구 사르코이드증, 후공막염, 포행성 맥락막염, 망막하 섬유증, 포도막염 증후군, 보그트-코야나기-하라다 증후군; 망막 동맥 폐쇄성 질환, 중심성 망막 정맥 폐쇄, 파종성 혈관내 응고병증, 분지 망막 정맥 폐쇄, 고혈압성 안저 변화, 안구 허혈 증후군, 망막 동맥 미세동맥류, 코우츠병, 중심와부근 모세혈관확장증, 반망막 정맥 폐쇄, 유두정맥염, 중심성 망막 동맥 폐쇄, 분지 망막 동맥 폐쇄, 경동맥 질환 (CAD), 서리 분지 혈관염, 겸상 적혈구 망막병증 및 다른 혈색소병증, 혈관양 선조, 가족성 삼출성 유리체망막병증, 일스병, 교감신경성 안염, 포도막염 망막 질환, 망막 박리, 외상, 레이저, PDT, 광응고, 수술 중 저관류, 방사선 망막병증, 골수 이식 망막병증, 증식성 유리체 망막병증 및 망막전막, 증식성 당뇨병성 망막병증, 안구 히스토플라스마증, 안구 톡소카라증, 안구 히스토플라스마증 증후군 (OHS), 안내염, 톡소플라스마증, HIV 감염과 연관된 망막 질환, HIV 감염과 연관된 맥락막 질환, HIV 감염과 연관된 포도막염 질환, 바이러스성 망막염, 급성 망막 괴사, 진행성 외망막 괴사, 진균성 망막 질환, 안매독, 안결핵, 미만성 단안 아급성 시신경망막염, 구더기증, 색소성 망막염, 연관된 망막 이영양증을 갖는 전신 장애, 선천성 비진행성 야맹증, 추체 이영양증, 스타르가르트병, 황색반 안저, 베스트병, 망막 색소 상피의 무늬 이영양증, X-연관 망막층간분리, 소르스비 안저 이영양증, 양성 동심성 황반병증, 비에티 결정성 이영양증, 탄성섬유 가성황색종, 망막 박리, 황반 원공, 거대 망막 열공, 종양과 연관된 망막 질환, RPE의 선천성 비대증, 후포도막 흑색종, 맥락막 혈관종, 맥락막 골종, 맥락막 전이, 망막 및 망막 색소 상피의 복합 과오종, 망막모세포종, 안저의 혈관증식성 종양, 망막 성상세포종, 안내 림프성 종양, 점상 내층 맥락막병증, 급성 후방 다초점성 판상 색소 상피병증, 근시성 망막 변성, 비정상적인 망막 색소 상피 항상성, 급성 망막 색소 상피염, 녹내장, 각막 이영양증 또는 이형성증 등으로 이루어진 목록으로부터 선택된 것인 방법.
제26항에 있어서, 대상체가 망막 박리를 앓고 있는 것인 방법.
제26항에 있어서, 대상체가 황반 변성을 앓고 있는 것인 방법.
제26항에 있어서, 대상체가 비정상적인 망막-RPE (망막 색소 상피) 항상성을 앓고 있는 것인 방법.
제26항에 있어서, 조성물이 대상체 내에서 세포 사멸을 감쇠시키는데 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 조성물이 상기 대상체 내에서 광수용체 생존을 증진시키는데 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
제9항 내지 제25항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 광수용체 세포 사멸을 예방하는 방법.
제33항에 있어서, 광수용체 세포 사멸이 Fas- 또는 TRAIL 매개된 광수용체 아폽토시스인 방법.
제34항에 있어서, 대상체가 광수용체 세포 사멸의 위험이 있는 것인 방법.
제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 대상체에게 안구내로, 유리체내로 또는 안구주위로 투여되는 것인 방법.