ES2595092B1 - Acetilsalicilato de lisina intravítreo como tratamiento de la retinopatía diabética - Google Patents
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Abstract
Acetilsalicilato de lisina intravítreo como tratamiento de la retinopatía diabética.#La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabricación de un medicamento en forma adecuada para su administración intravítrea para el tratamiento de la retinopatía diabética.
Description
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Acetilsalicilato de lisina intravitreo como tratamiento de la retinopatia diabetica.
DESCRIPCION
La presente invencion se refiere al uso de una composition que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabrication de un medicamento en forma adecuada para su administration intravrtrea para el tratamiento de la retinopatia diabetica.
ESTADO DE LA TECNICA
La retinopatia diabetica es la principal causa de ceguera legal en personas de edad inferior a 50 anos en los paises desarrollados y una de las principales causas de ceguera a nivel mundial. La diabetes mellitus afecta entre el 6 y el 18% de la poblacion en Espana, una tercera parte tienen retinopatia diabetica y una tercera parte a su vez tienen edema macular diabetico, principal causa de perdida de vision en los pacientes diabeticos. La OMS estima que existen 346 millones de diabeticos en todo el mundo.
Al inicio de la diabetes tipo 1 solo entre el 0 y el 3% presenta algun grado de retinopatia diabetica, pero el 67,1% de estos pacientes la padece antes de los 5 anos de evolution de su diabetes. En el caso de la diabetes tipo 2 entre el 6 y el 30% de los pacientes ya presenta retinopatia en el momento del diagnostico y en los casos de mas de 20 anos de evolucion la prevalencia de la retinopatia diabetica es del 82%.
Hasta el momento hay tres farmacos comercializados que se utilizan para el tratamiento del edema macular diabetico (EMD) que presentan algunos pacientes con retinopatia diabetica. Uno de ellos es ranibizumab (Lucentis®), un fragmento de inmunoglobulina humanizada cuya accion fundamental es el bloqueo de todos los subtipos del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF). La lesion de los pequenos vasos sangumeos (microangiopatia) que sucede en el transcurso de la retinopatia diabetica deja sin flujo sangumeo a los tejidos danados produciendo isquemia. Estos tejidos isquemicos expresan moleculas angiogenicas con el objetivo de formar nuevos vasos que aporten nutrientes y solucionen la isquemia. Estos nuevos vasos son de caracter inmaduro y lejos de aportar adecuados flujos sangumeos que permitan la supervivencia del tejido presentan una alta permeabilidad vascular contribuyendo al edema que se forma en la macula. Ranibizumab bloquea la angiogenesis inducida por el VEGF-A produciendo una regresion de los neovasos e
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induciendo con ello mejoras del edema retiniano. No obstante no modifica el curso evolutivo de la patologia en tanto en cuanto no resuelve la isquemia ni modifica otras circunstancias y acontecimientos moleculares que hoy conocemos que ocurren en la retinopatia diabetica. Otro de los farmacos es el aflibercept (Eylea®) que actua de manera similar a ranibizumab pero inhibiendo a su vez otra molecula ademas del VEGF-A, como es el PIGF (factor de crecimiento placentario); este farmaco presenta efectos comparables a ranibizumab y tambien las mismas limitaciones. Otra opcion terapeutica indicada es un esteroide, dexametasona, que se administra en inyeccion intravrtrea en un dispositivo de liberation sostenida (Ozurdex®) aprobado para su uso como farmaco de primera lmea o en caso de fracaso de los anti-VEGF anteriores. Esta en vias de comercializacion otro sistema de liberacion sostenida de otro esteroide, en este caso fluocinolona (Iluvien®). Ambos esteroides tienen como inconveniente la alta tasa de efectos secundarios que inducen, tales como aumento de la presion intraocular y cataratas. Fuera de indication se ha utilizado tambien bevacizumab (Avastin®) que es un inhibidor de todas las isoformas del VEGF; que aunque existen evidencias de no inferioridad respecto a ranibizumab carece de aprobacion oficial para su uso intraocular.
Existen evidencias cientificas que avalan la relevancia de fenomenos celulares inflamatorios en la patogenia de la retinopatia diabetica, por ello productos con action anti-inflamatoria como los esteroides o la invention que nos ocupa adquieren especial utilidad y relevancia especialmente por su eficacia en fases mas avanzadas de la enfermedad donde los fenomenos inflamatorios son muy importantes.
Son cada vez mas los estudios histoquimicos que demuestran que existe un problema inflamatorio de base que actua como principal factor desencadenante de la retinopatia diabetica atrayendo a las celulas especializadas en la respuesta inflamatoria, los leucocitos, y conduciendo con el tiempo a un fracaso y perdida del endotelio vascular, un aumento de la permeabilidad vascular (causante de edema) y aumento de la agregacion plaquetaria (contribuyendo a la obliteracion de los vasos y a la isquemia retiniana).
Por otro lado, a diferencia del ranibizumab, el acetilsalicilato es capaz de actuar sobre diversas dianas terapeuticas implicadas en la inflamacion; dianas que estan presentes incluso en fases muy precoces de esta patologia. Por tanto, el acetilsalicilato se
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presenta como un farmaco potencialmente util en estadfos iniciales y avanzados de la retinopatia diabetica.
Se ha descrito el uso del acido acetil salidlico v^a oral en el contexto de la retinopatia diabetica tanto con perfil preventivo como terapeutico (ver L Zheng, SJ Howell, DA Hatala, K Huang, T S Kern. Salicylate-based anti-inflammatory drugs inhibit the early lesion of diabetic retinopathy. Diabetes 2007; 56:337-335. W Sun, C Gerhardinger, Z Dagher, T Hoehn, M Lorenzi. Aspirin at low-intermediate concentrations protects retinal vessels in experimental diabetic retinopathy through non-platelet-mediated effects. Diabetes 2005; 54:3418-3426. TS Kern, RL Engerman. Pharmacological inhibition of diabetic retinopathy, aminoguanidine and aspirin. Diabetes 2001; 50:16361642.). De forma que se ha demostrado que existe un efecto beneficioso del salicilato sobre el curso evolutivo de la enfermedad y ningun efecto contraproducente sobre ella. No obstante se basa en el uso por via oral del salicilato tanto en humanos como en animales lo que supone en muchos casos dosis altas y no tolerables con efectos adversos frecuentes y potencialmente graves.
Se ha descrito una composition de acido acetil salicflico (AS) y aceite de silicona (SiO) de uso intravrtreo (ver, por ejemplo, Kralinger M. T et al Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol 2001;239:208-216). En casos de retinopatia diabetica muy avanzada que genera complicaciones muy graves en la retina como desprendimientos traccionales, roturas y proliferation fibrovascular se hace preciso la intervencion quirurgica. Esta intervencion supone la elimination del humor vrtreo del paciente (vitrectomia), la eliminacion de los tejidos fibrovasculares anomalos existentes en la retina de estos pacientes y la colocacion de un sustituto del humor vrtreo. El aceite de silicona se utiliza para sustituir el vrtreo en estos casos. El SiO se caracteriza por ser un elemento denso, inerte y estable que ayuda a mantener la retina correctamente aplicada. Es un medio inmiscible para todo tipo de sustancias bien sean farmacos o moleculas inflamatorias y angiogenicas impidiendo que estas puedan difundir a traves de la cavidad vrtrea. No tiene ninguna accion qtimica sobre la retina, no es capaz de actuar como reservorio de farmacos y no es util como solvente (Abrams GW, Azen SP, McCuen BW, Flynn H, Lai MY, Ryan SJ, Silicone Study Group: Vitrectomy with silicone oil or long-acting gas in eyes with severe proliferative vitreoretinopathy: Results of additional long-term follow-up (Silicone Study Report #11). Archives of Ophthalmology 115: 335-344, 1997.;.
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Asi pues seria deseable disponer de una composition para la administration intravrtrea de acetil salicilato destinada al tratamiento de la retinopatia diabetica que pueda ser inyectada en presencia de humor vrtreo, es decir, que pueda administrate en fases menos avanzadas de la enfermedad con el fin de evitar la progresion de la enfermedad e impedir que los pacientes precisen la cirugia.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
En un primer aspecto, la presente invention se refiere al uso de una composicion que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabrication de un medicamento en forma adecuada para su administracion intravrtrea.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha mencionado anteriormente, para la fabricacion de un medicamento en forma adecuada para su administracion intravrtrea para el tratamiento de una enfermedad de la retina.
En otra realization la invencion se refiere a la composicion tal y como se ha definido anteriormente, para la fabricacion de un medicamento en forma adecuada para su administracion intravrtrea para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de edema macular uvertico, vitritis, retinitis no infecciosa, retinocoroiditis no infecciosa, vitreorretinopatia proliferativa, smdrome de Irving-Gass cronico, coriorretinopatia serosa central cronica y retinopatia diabetica; y preferiblemente para el tratamiento de la retinopatia diabetica.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, donde la concentration de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion en el humor vrtreo.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, donde el pH de la composicion es de entre 6 y 6,2; y preferiblemente donde el pH de la composicion es de 6.
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En otra realization la invention se refiere al uso de la composition tal y como se ha definido anteriormente, donde:
la concentration de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion; y
el pH de la composicion es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composicion es de 6.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, que ademas comprende suero salino fisiologico, y preferiblemente que ademas comprende entre 2,6 ml y 5,6 ml de suero salino fisiologico.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, que ademas comprende agua, y preferiblemente que ademas comprende 5 ml de agua.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion; y
que ademas comprende suero salino fisiologico, y preferiblemente que ademas comprende 2,6 ml, 4,5 ml o 5,6 ml de suero salino fisiologico.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion;
el pH de la composicion es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH es de 6; y
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que ademas comprende suero salino fisiologico, y preferiblemente que ademas comprende 2,6 ml, 4,5 ml o 5,6 ml de suero salino fisiologico.
En otra realization la invention se refiere al uso de la composition tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentration de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion; y
que ademas comprende agua, y preferiblemente que ademas comprende 5 ml de agua.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion;
el pH de la composicion es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composicion es de 6; y
que ademas comprende agua, y preferiblemente que ademas comprende 5 ml de agua.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion;
que ademas comprende suero salino fisiologico, y preferiblemente que ademas
comprende 2,6 ml, 4,5 ml o 5,6 ml de suero salino fisiologico; y
que ademas comprende agua, y preferiblemente que ademas comprende 5 ml de
agua.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente donde:
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la concentration de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composition y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion;
el pH de la composicion es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composicion es de 6;
que ademas comprende suero salino fisiologico, y preferiblemente que ademas
comprende 2,6 ml, 4,5 ml o 5,6 ml de suero salino fisiologico; y
que ademas comprende agua, y preferiblemente que ademas comprende 5 ml de
agua.
En otra realization la invention se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente donde:
la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion, y preferiblemente donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion;
el pH de la composicion es de entre 6 y 6,2, y preferiblemente donde el pH de la composicion es de 6;
que ademas comprende suero salino fisiologico, y preferiblemente que ademas
comprende 2,6 ml, 4,5 ml o 5,6 ml de suero salino fisiologico; y
que ademas comprende agua, y preferiblemente que ademas comprende 5 ml de
agua,
para la fabrication de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de la retina, preferiblemente para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de edema macular uvertico, vitritis, retinitis no infecciosa, retinocoroiditis no infecciosa, vitreorretinopatia proliferativa, smdrome de Irving-Gass cronico, coriorretinopatia serosa central cronica y retinopatia diabetica; y mas preferiblemente para el tratamiento de la retinopatia diabetica.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, donde la cantidad total de acido acetilsalicflico inyectado en el humor vrtreo es de entre 0,6 mg y 1,2 mg.
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En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, donde la cantidad total de acido acetilsalidlico inyectado en el humor vrtreo es de 0,6 mg, 0,9 mg o 1,2 mg.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, donde:
la cantidad total de acido acetilsalidlico inyectado en el humor vrtreo es de entre 0,6 mg y 1,2 mg; y
el volumen final de la composicion es de al menos 0,05 ml.
En otra realizacion la invencion se refiere al uso de la composicion tal y como se ha definido anteriormente, donde la cantidad total de acido acetilsalidlico inyectado en el humor vrtreo es de 0,6 mg, 0,9 mg o 1,2 mg; y el volumen final de la composicion es de al menos 0,05 ml.
El uso de lisina como ingrediente de la composicion favorece la solubilidad y mejora la estabilidad del principio activo formando la sal de acetilsalicilato de lisina.
La composicion se puede utilizar en pacientes en los que no ha sido necesario extraer el humor vrtreo. El humor vrtreo actua como reservorio de farmacos de forma que favorece la persistencia y la difusion del acetilsalicilato de lisina de la invencion en el interior del ojo.
Como se ha mencionado anteriormente, la composicion de la invencion se administra de forma parenteral intravrtrea. Asi, las preparaciones inyectables, de acuerdo con la presente invencion, para la administracion parenteral, comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones esteriles, en un solvente acuoso o no acuoso como propilenglicol, polietilenglicol o aceites vegetales. Estas composiciones pueden tambien contener coadyuvantes, como humectantes, emulsionantes, dispersantes y conservantes. Podrian ser esterilizadas por cualquiera de los metodos conocidos o preparadas como composiciones solidas esteriles que seran disueltas en agua o cualquier otro medio inyectable esteril inmediatamente antes del uso. Tambien es posible partir de materias primas esteriles y mantenerlas en estas condiciones durante todo el proceso de fabricacion.
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La composition mencionada se puede preparar siguiendo el procedimiento que se
detalla a continuation:
Forma farmaceutica: solution esteril.
Formula:
Acetilsalicilato de lisina Agua para inyeccion Suero salino fisiologico
Material: Jeringas 1,5 ml, agujas, filtro 0,22
Elaboration: En campana de flujo laminar,
1. Cargar 5 ml de agua esteril para inyeccion e inyectar en el vial que contiene 900 mg de acetilsalicilato de lisina. Agitar levemente hasta disolucion completa. Obteniendose una concentration de acido acetilsalitilico de 100 mg/ml de composicion = Acetilsalicilato de lisina 180 mg/ml de composicion.
2. Para una solucion de 12 mg/ml: cargar 0,4 ml (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolucion obtenida e introducir en un vial esteril, anadir 5,6 ml de suero salino fisiologico, con un pH resultante de 6.
3. Para una solucion de 24 mg/ml: cargar 0,4 ml (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolucion obtenida e introducir en un vial esteril, anadir 2,6 ml de suero salino fisiologico, con un pH resultante de 6.
4. Para una solucion mas preferible de 18 mg/ml: cargar 0,5 ml (90 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolucion obtenida e introducir en un vial esteril, anadir 4,5 ml de suero salino fisiologico, con un pH resultante de 6.
5. El preparado final se filtrara (filtro 0,22 micras) antes de envasarlo en la jeringa de 1 ml, que se cargara con un volumen de 0,05 ml y se tapara con un tapon esteril.
6. Envasar y etiquetar. La etiqueta indicara la via de administration, el principio activo, la concentracion final, la fecha de preparation, el tipo de conservation y la caducidad
Envasado: Jeringa de volumen adecuado.
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micras, frasco esteril.
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A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invention se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invention. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1 representa el corte histologico tenido con H&E de retina central (observese el nervio optico en la parte central de la imagen).
FIG. 2 representa el corte histologico tenido con H&E de retina periferica.
FIG. 3 representa el corte histologico tenido con H&E donde se senalan la capa de celulas ganglionares (flecha de abajo) y capa plexiforme externa (flecha de arriba).
FIG. 4 representa la correlation y el resultado del test de Spearman de la retina central plexiforme externa: n=50; r=0,341; p=0,015. Lo que significa que la correlacion entre ambos es baja (el coeficiente de determination que seria r2 es 0,116; es decir, el 11,6% de la variabilidad de los datos se explica por la relation entre ambas variables).
FIG. 5 representa la correlacion y el resultado del test de Spearman de la retina central ganglionar: n=50; r=0,803; p<0,001. Lo que significa que la correlacion entre ambos es alta (el coeficiente de determinacion que seria r2 es 0,645; es decir, el 64,5% de la variabilidad de los datos se explica por la relacion entre ambas variables).
FIG. 6 representa la correlacion y el resultado del test de Spearman de la retina periferica plexiforme externa: n=50; r=0,005; p=0,973. Lo que significa que la correlacion entre ambos es baja, casi nula (el coeficiente de determinacion que seria r2 es 0,000025; es decir, el 0,0025% de la variabilidad de los datos se explica por la relacion entre ambas variables).
FIG. 7 representa la correlacion y el resultado del test de Spearman de la retina periferica ganglionar: n=50; r=0,737; p<0,001. Lo que significa que la correlacion entre
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ambos no es muy alta (el coeficiente de determination que seria r2 es 0,543; es dedr, el 54,3% de la variabilidad de los datos se explica por la relation entre ambas variables).
FIG. 8 representa la relacion entre ICAM1 y vasos de la retina central ganglionar: n=50; r=0,616; p<0,001. Lo que significa que la correlation entre ambos no es muy alta (el coeficiente de determinacion que seria r2 es 0,379; es decir, el 37,9% de la variabilidad de los datos se explica por la relacion entre ambas variables).
FIG. 9 representa la relacion entre ICAM1 y vasos de la retina periferica ganglionar: n=50; r=0,341; p=0,015. Lo que significa que la correlacion entre ambos es baja (el coeficiente de determinacion que seria r2 es 0,116; es decir, el 11,6% de la variabilidad de los datos se explica por la relacion entre ambas variables).
EJEMPLOS
A continuation se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.
EJEMPLO 1 Objetivos
Valorar los efectos de la inyeccion intravrtrea de una solution de acetilsalicilato de lisina en un modelo experimental de retinoparia diabetica sobre 3 variables histologicas en la retina de los animales tratados comparandolos con un grupo control. Las variables elegidas que han demostrado en diversos estudios estar afectadas de forma primordial en la retina diabetica son:
1. Marcador leucocitario CD18: el leucocito es la celula efectora principal de la respuesta inflamatoria de los tejidos, cosa que tambien sucede en la retina. El CD18 es una molecula de superficie que se expresa en las membranas de los leucocitos activados en tejidos donde existe inflamacion como es el caso de la retina diabetica. Determinar su numero absoluto y relativo ayuda a conocer si la solucion inyectada es capaz de reducir la presencia de leucocitos activados en determinadas capas de la retina como parte de su action antiinflamatoria.
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2. Marcador endotelial ICAM-1: las celulas endoteliales que tapizan los vasos sangumeos en su interior han demostrado estar afectadas en la retinopatia diabetica y por esta razon tienen una gran relevancia en la patogenia de la enfermedad. La ICAM- 1 es una protema transmembrana presente en las celulas endoteliales y practicamente espedfica de ellas. Su marcaje inmunohistoqdmico permite senalizar y valorar cuantitativamente a las celulas endoteliales presentes en las distintas capas de tejido estudiadas y nos da informacion acerca de la vascularizacion de los tejidos estudiados y de la integridad de la pared vascular.
3. Densidad vascular: la inflamacion cronica causada en la retinopatia diabetica conlleva a una obliteracion y muerte de los vasos sangumeos. Esto deja areas mas o menos extensas de tejido sin recibir ningun tipo de aporte sangumeo. Este escenario es un estadio final del fenomeno conocido como microangiopatia diabetica. Por ello determinar el numero de vasos presentes en cada seccion de tejido nos puede dar informacion acerca de si el farmaco es capaz o no de influir positiva o negativamente en la densidad capilar de la retina (vasos/porcion de tejido).
Metodolog'ia
1. Modelo experimental
Con la aprobacion del comite de bioetica para la investigacion de la Universidad Miguel Hernandez de Elche y basado en los estandares internacionales para el uso de animales de experimentacion, 14 espedmenes estabulados de Rata Wistar Macho de unos 200 gramos de peso fueron inducidos a padecer diabetes mediante la inyeccion de estreptozotocina intraperitoneal (75 mg/kg) en una unica dosis. Los animales fueron monitorizados durante todo el estudio en constantes como el peso, la glucemia, perdida de cabello y formacion de catarata. Todos los animales fueron expuestos a los mismos parametros de luz, oscuridad y disponibilidad de agua y alimento.
2. Tecnica de Inyeccion intravrtrea
Para la inyeccion intravrtrea los animales fueron anestesiados con una mezcla a proporcion 1:1 de xylazina hidrocloruro (4 mg/kg) y ketamina hidrocloruro (10 mg/kg). Bajo midriasis con tropicamida al 0,5% se realizo la inyeccion intravrtrea de la solucion de acetilsalicilato de lisina bajo microscopio quirurgico con jeringa de micro inyeccion
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(Hamilton Co., Reno, NV) y aguja de 32 gauge a 1 miKmetro del limbo temporal. Solo la mitad de los animales diabeticos fueron tratados con la solucion intravrtrea, en el resto de los animales se dejo evolucionar la retinopatia diabetica de forma natural. El ‘’proceso de inyeccion intravrtrea se repitio en la misma forma, tecnica y dosis en los mismos animales 4 semanas despues del tratamiento inicial. Resumen de la organization del ensayo experimental:
- Inicialmente se evaluaron los animales antes de incluirlos en el ensayo experimental para descartar aquellos con taras o alteraciones oculares de base.
- Se realizo la induction de diabetes en todos los animales mediante la inyeccion de estreptozocina intraperitoneal.
- Se comprobaron los indices glucemicos a las 24 y 48 horas de la inyeccion para valorar si la induccion habia tenido exito.
- Una vez confirmada la diabetes se dividio a los animales en dos grupos formados por 8 ratas cada uno.
- Siguiendo el modelo de retinopatia diabetica en rata se dejo evolucionar la diabetes de modo natural en ambos grupos durante las primeras 12 semanas. Es en este periodo donde se ha demostrado que comienzan a aparecer los signos de retinopatia diabetica.
- En este momento a uno de los grupos se realiza una inyeccion intravrtrea en los dos ojos de cada animal de acetilsalicflico en una dilution con lisina.
-A las 4 semanas (semana 16 de la induccion) se repite la inyeccion intravrtrea de salicilato en el mismo grupo de animales.
-A las 4 semanas de la ultima inyeccion (20 semanas tras induccion) se sacrifican los animales de ambos grupos.
3. Calculo de dosis y preparation de la solucion
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No existen referencias ni estudios dosimetricos realizados hasta la fecha para efectuar este calculo. No obstante podemos realizar la siguiente aproximacion:
Rango terapeutico:
Accion analgesica y antipiretica 2,5-5,0 mg/dl Accion antiinflamatoria 15-30 mg/dl Rango toxico:
40-50 mg/dl
Con una concentration de 25 mg/dl (0,25 ^g/^l) en la biofase podriamos cubrir un rango terapeutico adecuado para valorar la existencia de efectos significativos en las variables a estudio.
El volumen de humor vrtreo existente en el ojo de la rata adulta es de 56,5 + 2 microlitros. (Oxygen Distribution in the Mouse Retina. Dao-Yi Yu and Stephen J. Cringle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; vol. 47; 1109-1112)
Si se plantea un modelo farmacodinamico monocompartimental en el que consideramos Cmax como la concentracion buscada en la biofase y Vd (volumen de distribution) como el volumen de humor vrtreo en el que el farmaco va a ser inyectado. Con ello se obtiene la dosis necesaria a administrar del farmaco:
Cmax = D/Vd, despejando D = Cmax x Vd D = 0,25 ^g/^l x 57 ^l = 14,3 ^g
Por tanto para alcanzar una concentracion terapeutica de acetilsalicilato en el vrtreo de la rata tenemos que inyectar unos 15 microgramos de farmaco.
No obstante no podemos olvidar que el ojo no sigue un modelo monocompartimental estricto ya que tras la inyeccion del farmaco existe cierta difusion del mismo a cristalino y humor acuoso de manera que es probable que nos enfrentemos a un volumen de distribucion superior a lo considerado inicialmente. Si consideramos que el cristalino de la rata tiene un volumen superior al del vrtreo es muy probable que el volumen de distribucion real sea mas proximo a 100 microlitros en cuyo caso la dosis
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a emplear para mantenerse en rango terapeutico estaria en 25 microgramos de salicilato que se preparo en 5 ^l de solucion a una concentration de 5 ^l/^g (o 5 mg/ml).
Para evitar que la composition se degrade decidimos inyectar la solucion inmediatamente despues de su preparation. La solucion utilizada en el ensayo experimental puede ser preparada de la siguiente manera:
Forma farmaceutica: solucion esteril.
Formula:
Material: Jeringas 1,5 ml, agujas, filtro 0,22 micras, frasco esteril.
Elaboration: En campana de flujo laminar,
1. Cargar 5 ml de agua esteril para inyeccion e inyectar en el vial que contiene 900 mg de acetilsalicilato de lisina. Agitar levemente hasta disolucion completa. Obteniendose una concentracion de acido acetilsalicflico de 100 mg/ml de composicion = Acetilsalicilato de lisina 180 mg/ml de composicion.
2. Cargar 0,5 ml (90 mg de acetilsalicilato de lisina) de la disolucion obtenida e introducir en un vial esteril, anadir 17,5 ml de suero salino fisiologico, obteniendose una concentracion de 5 mg/ml de composicion (5 ^g/^l) con un pH de 6.
3. El preparado final se filtrara (filtro 0,22 micras) antes de envasarlo en la jeringa tipo Hamilton, que se carga con un volumen de 5 ^l y se tapa con un tapon esteril.
4. Envasar y etiquetar. La etiqueta indicara la via de administration, el principio activo, la concentracion final, la fecha de preparacion, el tipo de conservation y la caducidad
Envasado: Jeringa de volumen adecuado.
4. Estudio Inmunohistoquimico
Se realizaron secciones laminares de la retina de todos los animales, siendo
sometidos a la action de agentes conservantes tipo formaldehido al 4%. Para el
marcaje de las celulas endoteliales se utilizo un anticuerpo monoclonal anti-ICAM1,
asimismo utilizamos anticuerpos monoclonales anti-CD18 para el marcaje de los
Acetilsalicilato de lisina Agua para inyeccion Suero salino fisiologico
900 mg 5 ml 9,5 ml
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leucocitos. Posteriormente a la fijacion de las distintas secciones de tejido tenidas se procedio al contaje de las moleculas marcadas positivamente as^ como de la cantidad de vasos sangumeos presentes bajo microscopio optico (Leica® microsystem) en aumento de 10X.
A fin de valorar diferencias significativas entre las distintas regiones de la retina, en todos los tejidos se realizaron por separado los recuentos celulares y vasculares correspondientes a la retina central (comprendida entre nervio optico y el area macular) y los correspondientes a la retina periferica (por fuera de las arcadas vasculares). Estos recuentos se realizaron de forma concreta sobre dos capas de la retina: la capa plexiforme externa y la capa de celulas ganglionares. Ambas capas retinianas son las que han demostrado mayor implication en la etiologia inflamatoria y afectacion vascular en la retinopatia diabetica (ver figura 1, figura 2 y figura 3).
5. Estudio estadistico
Se utilizo la prueba de contraste U Mann-Whitney para muestras independientes. Para contrastar la correlation entre las variables se ha utilizado el test de Spearman.
Resultados
Para el analisis se incluyeron 108 muestras de tejido, 56 correspondientes a los espedmenes tratados con el farmaco intravrtreo y 52 correspondientes a los animales no tratados y en los que la retinopatia diabetica evolucionaba de forma natural.
Retina central
En la capa plexiforme externa de la retina central existen significativamente mayor recuento de CD18, ICAM-1 y densidad vascular en los animales tratados, igualmente sucede en la capa ganglionar excepto en el caso del CD18 donde existe un mayor recuento en los animales control.
Retina periferica
En la capa plexiforme externa de la retina periferica ocurre tambien un incremento significativo en el recuento de todas las variables en el grupo tratado respecto al grupo
control. En la capa ganglionar existe un mayor recuento de ICAM-1 en el grupo tratado y tambien una mayor densidad de vasos. De forma similar a lo que sucede en la retina central el recuento de CD18 en la capa ganglionar no es significativo de diferencia
entre un grupo y otro (ver resultados en Tabla 1).
- VARIABLE
- CASO CONTROL p valor*
- Retina central
- Plexiforme externa
- CD18
- 16,5 (14,0-18,0) 12,0 (9,3-15,0) <0,001
- ICAM1
- 15,0 (14,0-17,5) 4,0 (2,0-5,0) <0,001
- VASOS
- 9,0 (7,0-11,0) 3,0 (2,0-4,0) <0,001
- Ganglionar
- CD18
- 5,0 (3,0-6,0) 7,0 (4,3-8,0) <0,001
- ICAM1
- 4,0 (3,0-5,0) 2,0 (1,3-4,0) <0,001
- VASOS
- 5,0 (2,8-6,0) 2,0 (1,0-3,0) <0,001
- Retina periferica
- Plexiforme externa
- CD18
- 8,0 (6,0-9,0) 4,0 (3,0-5,0) <0,001
- ICAM1
- 9,0 (7,0-11,0) 3,0 (2,0-4,8) <0,001
- VASOS
- 6,0 (5,0-7,0) 1,0 (1,0-2,0) <0,001
- Ganglionar
- CD18
- 3,0 (2,0-4,0) 3,0 (2,0-4,0) 0,972
- ICAM1
- 2,0 (1,3-3,0) 1,0 (1,0-2,0) <0,001
- VASOS
- 3,0 (1,8-4,0) 1,0 (1,0-2,0) <0,001
5 * Prueba de U Mann-Whitney para muestras independientes
Tabla 1
Se ha estudiado la posible relacion entre CD18 y vasos. En los controles no hay 10 ninguna relacion entre ambas variables, pero si la hay en los tratados.
La figura 4, figura 5, figura 6 y figura 7 muestran la correlation y el resultado del test de Spearman.
15 Se ha estudiado tambien la relacion entre ICAM1 y vasos. Solo hay relacion en casos para las capas ganglionares (ver figura 8 y figura 9)
Dado que unicamente parece que puede haber una relacion entre CD18 y vasos para las capas plexiforme y ganglionar tanto de retina central como de retina periferica para 20 los animales tratados, se busco un modelo que intentase explicar dicha relacion en estos supuestos. El modelo se hizo mediante una regresion lineal:
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- Retina central : CD18 = 0,950 + 0,800*Vasos (p= 0,002)
- Retina periferica : CD18 = 1,066 + 0,536*Vasos (p<0,001)
Discusion
ICAM-1
Uno de los principales problemas de la evolucion natural de la retinopatia diabetica es la muerte y desaparicion de las celulas del endotelio vascular, lo que conduce a una alteracion en la integridad de los vasos y a un incremento de su permeabilidad. La molecula transmembrana ICAM-1 se expresa de forma casi exclusiva en la pared celular del endotelio vascular, siendo elemento de vinculacion y comunicacion entre la celula endotelial y otras celulas procedentes del flujo sangumeo y que contienen ligandos espedficos para esta protema. La marcacion inmunohistoqdmica de las ICAM-1 que se ha realizado pone de manifiesto que existe un contaje significativamente mas alto de celulas endoteliales en los animales tratados respecto a los que no recibieron ninguna dosis de salicilato intravrtreo; esto demostraria un efecto beneficioso del tratamiento sobre la supervivencia de las celulas endoteliales respecto al grupo control. Este dato se mantiene significativo en todas las secciones de retina estudiadas tanto en los correspondientes al area macular como en la retina mas periferica.
Un mayor numero de celulas endoteliales supondria una mayor integridad de la funcion de barrera del endotelio y por tanto un mayor control de la permeabilidad vascular, esto evoca un efecto beneficioso directo del farmaco sobre el tratamiento del edema macular en la retinopatia diabetica.
Densidad Vascular
La obliteration de la pared vascular es otro de los fenomenos mas daninos de todos los que acontecen en la retinopatia diabetica. Conduce a una obstruction directa de la llegada de oxigeno y nutrientes a la microcirculation retiniana y por tanto a las celulas de la retina. Esto conduce a una isquemia del tejido y una necrosis celular que afecta tanto a fotorreceptores como celulas de Muller entre otras. Ademas la isquemia desencadena una cascada de eventos celulares entre los que destacan la smtesis y
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liberation de una mayor cantidad de factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF por sus siglas en ingles) cuya funcion principal es la proliferation de vasos nuevos que puedan suplir a los que ya no funcionan. El problemas es que por un lado estos neo-vasos que crecen en la superficie interna de la retina no solo no cumplen con su hipotetica funcion sino que inducen complicaciones serias para la retina tales como sangrados constantes que inundan el humor vrtreo asi como la llegada de celulas gliales a su superficie formando grandes "puentes” de proliferacion fibrovascular que pueden inducir un desprendimiento de la retina debido a la traction que ejercen sobre ella. Otro de los efectos de una mayor production de VEGF es el incremento de la permeabilidad vascular que se ha asociado al mismo y su implication en la formation del edema macular diabetico.
El numero de vasos funcionales y con contenido celular en su luz es significativamente superior en cada section de tejido y en cada capa de retina incluida en el estudio, en el grupo de los animales tratados con salicilato. Esto demuestra una action vasoprotectora del farmaco lo que podria tener un importante repercusion sobre la evolution natural de la retinopatia diabetica, impidiendo no solo la aparicion de la isquemia retiniana tanto periferica como central o macular, sino tambien con implicaciones sobre el desarrollo del edema macular.
CD18
Diversos trabajos han evidenciado una participation importante de los leucocitos en la patogenia de la retinopatia diabetica. La destruction de las celulas endoteliales, la aparicion de areas de retina isquemicas, la presencia de un aumento de permeabilidad en los vasos y consecuentemente a ello la aparicion de edema y exudados, promueven la smtesis y liberacion de citocinas que actuan como factores quimiotacticos llamando a las celulas implicadas directamente en la inflamacion: los leucocitos.
El acetilsalicilato no tiene un efecto inhibitorio directo sobre los leucocitos, es decir, ni los destruye ni modula su llegada a los tejidos. Pero si puede interferir en otros procesos como el bloqueo de cascadas enzimaticas que promueven la smtesis y liberacion de interleucinas que actuan como factores quimiotacticos, ademas de reducir el dano vascular y endotelial que acontece en esta patologia, lo que tambien reduciria el ambiente pro-inflamatorio existente en el tejido.
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El CD18 es una protema presente en la superficie de los leucocitos y cuya funcion principal es servirle de anclaje al endotelio vascular antes de migrar desde aqu hacia el interior de los tejidos. En nuestro estudio utilizamos un anticuerpo selectivo frente a CD18 con el proposito de valorar si el salicilato produce algun cambio en el numero global de leucocitos que infiltran la retina.
El test de correlation de Spearman encuentra una relation significativa y directamente proporcional entre la densidad vascular y el recuento de CD18. Se puede establecer una relacion matematica entre esos dos factores con la siguiente formula:
Retina central: CD18 = 0,950 + 0,800*Vasos (p= 0,002)
Retina periferica: CD18 = 1,066 + 0,536*Vasos (p<0,001)
Si atendemos al modelo matematico de correlacion, por cada vaso existente en cada section de tejido de la capa plexiforme de la retina central deberian existir unos 2 leucocitos (1,75), sin embargo esto solo se cumple en los animales control donde observamos un rango de contaje de vasos de entre 1-3 y un rango de contaje de leucocitos CD18 de entre 4-8. En los animales tratados el rango de vasos por seccion de tejido oscila entre 3-6 con una media de 5 mientras que el recuento de CD18 oscila entre 3-6 con una media de 5. Por tanto, segun la correlacion matematica lo esperable es que en la retina central de los animales tratados existieran al menos 10 leucocitos de media por campo (teniendo en cuenta que la relacion esperable entre ambas variables es de 2 leucocitos / 1 vaso). Es decir, en terminos absolutos existen mas leucocitos por campo en el grupo tratado pero en terminos correlativos al numero de vasos por campo existen la mitad de los leucocitos que cabria esperar si el grupo tratado hubiera evolucionado como el grupo control. Esto indica una inhibition real del numero de leucocitos en el grupo tratado con salicilato.
Con todos los datos anteriores parece claro que existe un efecto principal del farmaco sobre el mantenimiento de la integridad endotelial y vascular lo que puede tener implicaciones importantes sobre la evolution natural y el pronostico de la enfermedad tanto en lo que se refiere al edema macular como a la isquemia retiniana. Ademas los estudios de correlacion ponen de manifiesto que existe una reduction significativa del numero de leucocitos CD18 respecto a lo esperable dada la abundante y bien conservada red vascular en los animales tratados.
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Segun el estudio Wisconsin la prevalencia a 20 anos de edema macular en diabeticos tipo 1 es del 29% y en tipo 2 del 28% siendo este porcentaje de pacientes el unico susceptible de tratamiento farmacologico con ranibizumab.
Por tanto, mientras que ranibizumab solo esta indicado para el tratamiento del edema macular secundario a la retinopatia diabetica el salicilato ha demostrado un efecto de preservation en la red vascular intrarretiniana lo que hace pensar que su aplicacion no solo permitiria controlar y mejorar el edema macular sino tambien evitar la isquemia de la retina mas periferica teniendo un valor terapeutico para la totalidad de los pacientes con retinopatia diabetica bien tengan edema macular, alteraciones vasculares o isquemia retiniana.
Por otro lado, se analizaron cuidadosamente los tejidos en busca de signos de toxicidad del farmaco tales como desestructuracion de las capas retinianas, ausencia de celulas fotorreceptoras o alteraciones histologicas del nervio optico. En ningun tejido se encontraron signos que evidenciaran alteraciones sugestivas de toxicidad.
EJEMPLO 2
Teniendo en cuenta que el volumen de humor vrtreo en humanos es de 4 ml (J Sebag. Vitreous anatomy, aging, and anomalous posterior vitreous detachment. Encyclopedia of the Eye. 2010;307-315.) y siguiendo la metodologia y las evidencias experimentales descritas en el ejemplo 1 se puede elaborar una solution de actelisalicilato de lisina para alcanzar concentraciones intraoculares en rango de 15 a 30 mg/dl, buscando mas preferiblemente una concentration de 25 mg/dl (0,25 mg/ml).
D = Cmax x Vd D = [0,15-0,30] mg/ml x 4 ml
Para preparar la solucion de acetilsalicilato de lisina destinada a su inyeccion en el vrtreo humano se puede utilizar una dosis del principio activo de entre 0,6 mg y 1,2 mg siendo preferible una dosis de 0,9 mg. La concentracion de la solucion resultante debe ser preferentemente de entre 12 mg /ml y 24 mg/ml y mas preferiblemente de 18 mg/ml, con un volumen mmimo de inyeccion de 0,05 ml (How to give intravitreal injections. ME Wilson, AW Scott. AAO Eyenet. 2013) y un pH de 6.
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La solucion descrita puede ser preparada de la siguiente manera: Forma farmaceutica: solucion esteril.
Formula:
Acetilsalicilato de lisina Agua para inyeccion Suero salino fisiologico
900 mg
5 ml
6 ml
Material: Jeringas 1,5 ml, agujas, filtro 0,22 micras, frasco esteril.
Elaboration: En campana de flujo laminar,
1. Cargar 5 ml de agua esteril para inyeccion e inyectar en el vial que contiene 900 mg de acetilsalicilato de lisina. Agitar levemente hasta disolucion completa. Obteniendose una concentration de acido acetilsalicflico de 100 mg/ml de composition = Acetilsalicilato de lisina 180 mg/ml de composition.
2. Para una solucion de 12 mg/ml: cargar 0,4 ml (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolucion obtenida e introducir en un vial esteril, anadir 5,6 ml de suero salino fisiologico, con un pH resultante de 6.
3. Para una solucion de 24 mg/ml: cargar 0,4 ml (72 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolucion obtenida e introducir en un vial esteril, anadir 2,6 ml de suero salino fisiologico, con un pH resultante de 6.
4. Para una solucion mas preferible de 18 mg/ml: cargar 0,5 ml (90 mg de Acetilsalicilato de lisina) de la disolucion obtenida e introducir en un vial esteril, anadir 4,5 ml de suero salino fisiologico, con un pH resultante de 6.
5. El preparado final se filtrara (filtro 0,22 micras) antes de envasarlo en la jeringa de 1 ml, que se cargara con un volumen de 0,05 ml y se tapara con un tapon esteril.
6. Envasar y etiquetar. La etiqueta indicara la via de administration, el principio activo, la concentracion final, la fecha de preparation, el tipo de conservation y la caducidad
Envasado: Jeringa de volumen adecuado.
Claims (8)
- 510152025ES 2 595 092 A1REIVINDICACIONES1. - Uso de una composition que comprende acetilsalicilato de lisina para la fabrication de un medicamento en forma adecuada para su administration intravrtrea.
- 2. - El uso de la composicion segun la reivindicacion 1, para la fabricacion de un medicamento en forma adecuada para su administracion intravrtrea para el tratamiento de una enfermedad de la retina.
- 3. - El uso de la composicion segun la reivindicacion 2, para el tratamiento de la retinopatia diabetica.
- 4. - El uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la concentration de acetilsalicilato de lisina es de entre 12 mg/ml de composicion y 24 mg/ml de composicion.
- 5. - El uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la concentracion de acetilsalicilato de lisina es de 12 mg/ml de composicion, de 18 mg/ml de composicion o de 24 mg/ml de composicion.
- 6. - El uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el pH de la composicion es de entre 6 y 6,2.
- 7. - El uso de la composicion segun la reivindicacion 6, donde el pH de la composicion es de 6.
- 8. - El uso de la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que ademas comprende suero salino fisiologico.
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| FG2A | Definitive protection |
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| PC2A | Transfer of patent |
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