WO2016159287A1 - 微生物製剤の製造方法及び微生物製剤 - Google Patents

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洋介 中村
英二 新田
朝子　弘之
文美 岡▲崎▼
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a microorganism preparation and a microorganism preparation.
  • a combustion treatment method or a biological treatment method using a target compound-decomposing microorganism is used as a method for removing the target compound from the wastewater.
  • a method for obtaining a target compound-degrading microorganism a method (isolation culture method) is known in which microorganisms that degrade the target compound are accumulated and cultured, and the decomposing microorganisms are identified, isolated, and purely cultured.
  • acclimatization that gives the target compound as a nutrient source at a low concentration and gradually adjusts the concentration to make the activated sludge acclimatize with the target compound and increases the resolution ( Habituation method) is known.
  • the isolation and culturing method has a problem that it takes a long time to isolate the decomposing microorganism, the microorganism can be artificially cultivated and the manufacturing cost for pure culture is high.
  • the acclimatization method is inexpensive and can cultivate degrading microorganisms in large quantities, but has a problem that it takes a long time to acclimate.
  • nitrifying bacteria are densified, and fine particles and microorganisms having excellent physical properties are aggregated and granulated.
  • a method for producing a microbial preparation is disclosed. This microorganism preparation can be efficiently produced by continuous culture and can be stored, so that it is useful for the efficient treatment of waste water.
  • Patent Document 1 can increase the density of nitrifying bacteria using nitrogen treatment capacity as an index, the type and abundance of nitrifying bacteria during and after granulation Can not grasp.
  • the concentration and ratio of the target compound-degrading microorganisms cannot be grasped, so the concentration of the target compound added in the granulation step is too high. Therefore, it is difficult to predict growth inhibition of the target compound-decomposing microorganism group, and inhibition of growth of the target compound-decomposing microorganism due to accumulation of decomposition intermediates of the target compound.
  • the present invention provides a method for stably and efficiently producing a microbial preparation that carries a target compound-degrading microorganism at a desired density by monitoring the abundance ratio of the target compound-degrading microorganism.
  • Another object of the present invention is to provide a microbial preparation produced by the above production method, a compound decomposition method using the microbial preparation, and a method for evaluating the microbial preparation.
  • the present inventors effectively monitor microbial preparations by monitoring target compound-degrading microorganisms carried on microbial preparations based on gene analysis information that comprehensively analyzes microorganisms carried on microbial preparations during manufacture. A new manufacturing method was established and the present invention was completed.
  • the present invention relates to the following [1] to [6], for example.
  • a method for producing a microorganism preparation carrying a target compound-degrading microorganism comprising adding a biomass containing the target compound-degrading microorganism and an inorganic particulate carrier in a medium containing the target compound, and being contained in the biomass
  • the microorganisms are supported on the inorganic fine particles, and the culturing process and the target compound-decomposable microorganisms existing ratio reached a predetermined value while monitoring the ratio of the target compound-degradable microorganisms in the microorganisms supported on the inorganic particle carrier.
  • Amplifying a predetermined region to obtain an amplified product analyzing the base sequence data of the amplified product, and obtaining the obtained base sequence data for each base sequence data Divided into multiple groups based on the homology between the groups, and the microorganisms having the base sequence data of each group are of a single type, and based on the representative base sequence data of each group, the types of target compound-degrading microorganisms And a step of calculating the abundance ratio of the target compound-degrading microorganisms in all the microorganisms based on the number of base sequence data determined and obtained.
  • the method for evaluating a microbial preparation according to [4], comprising a step of evaluating the microbial preparation using as an index the presence ratio of the target compound-degrading microorganism in the microorganism contained in the microorganism preparation, Amplifying a predetermined region of the 16S rRNA gene of the microorganism contained in the microorganism preparation to obtain an amplified product, analyzing the base sequence data of the amplified product, and obtaining the obtained base sequence data for each base sequence Divide into multiple groups based on the homology between the data, make the microorganisms with the base sequence data of each group a single type, and based on the representative base sequence data of each group, select the type of target compound-degrading microbe A step of calculating the existence ratio of the target compound-degrading microorganisms in all microorganisms based on the number of base sequence data determined and The evaluation method obtained by the method of including.
  • the target compound-degrading microorganisms are brought to a desired density by detecting the types of microorganisms carried on the microorganism preparation and monitoring the target compound-degrading microorganisms based on the result of calculating the existence ratio. It is possible to provide a method for stably and efficiently producing a supported microbial preparation.
  • the present invention can also provide a microbial preparation produced by the above production method, a compound decomposition method using the microbial preparation, and a method for evaluating the microbial preparation.
  • the present embodiment a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be described in detail.
  • this invention is not limited to the following embodiment.
  • the method for producing a microorganism preparation supporting a target compound-degrading microorganism comprises adding a biomass containing the target compound-degrading microorganism and an inorganic fine particle carrier in a medium containing the target compound, and And the step of culturing while monitoring the abundance ratio of the target compound-degrading microorganisms in the microorganisms carried on the inorganic particulate carrier, and after the abundance ratio of the target compound-degrading microorganisms reaches a predetermined value Recovering the inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganism and obtaining a microbial preparation.
  • the target compound according to this embodiment is not particularly limited as long as it is a compound that is decomposed by microorganisms, but is preferably contained in waste water.
  • examples of such compounds include ammonia, nitrous acid, benzene, toluene, styrene, xylene, catechol, protocatechuic acid, protocatechualdehyde, 2-phenylbutyric acid, 2-isopropylphenylbutyric acid, (S) -2- ( 4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid, benzoic acid, benzaldehyde and the like.
  • ammonia or (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid which is desired to be removed from waste water, is preferable.
  • the medium containing the target compound is not particularly limited as long as it contains the target compound and can culture the target compound-degrading microorganism.
  • a medium may be a medium in which each salt, pH and the like are artificially prepared, or sewage or waste water.
  • the concentration of the target compound contained in the medium is preferably set to a low initial level and gradually increased during the culture process. The initial concentration can be appropriately set for each target compound.
  • the target compound-degrading microorganism is a microorganism that can be decomposed and used as a nutrient source.
  • the target compound degrading microorganism according to the present embodiment is appropriately selected depending on the selection of the target compound.
  • ammonia is selected as the target compound
  • nitrifying bacteria ammonia oxidizing bacteria such as Nitrosomonas genus, nitrite oxidizing bacteria such as Nitrobacter genus, Nitrospira genus, etc.
  • (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid is selected as the target compound, for example, bacteria belonging to the family Sphingomomonaceae and the like can be mentioned.
  • biomass containing the target compound-degrading microorganism examples include activated sludge, microflora such as soil and biofilm, and the like, and activated sludge is preferred from the viewpoint of being widely used in the industry for purification of sewage.
  • activated sludge examples include sewage sludge, industrial wastewater treatment plant activated sludge, human waste treatment plant sludge, and the like.
  • the material may be a metal and an inorganic salt or oxide thereof, may contain carbon, or may be chemically classified as an inorganic substance, or organic carbon It may be a pure substance or a mixture having a content of less than about 1%.
  • inorganic fine particle carriers include incineration of organic waste such as industrial products such as alumina (aluminum oxide) and hydroxyapatite (calcium phosphate hydroxide) (including non-standard products, by-products and waste products), and activated sludge.
  • industrial products such as alumina (aluminum oxide) and hydroxyapatite (calcium phosphate hydroxide) (including non-standard products, by-products and waste products)
  • activated sludge examples include ash and coal incineration ash, which is a burner of thermal power generation or coke ovens.
  • coal incineration ash is preferable from the viewpoints that it is inexpensive, can be obtained by a simple operation, and that the activity of microorganisms is generated in a short period of time.
  • clinker ash or fly ash is preferable, and fly ash is more preferable because the center particle diameter is 100 ⁇ m or less without performing sieving or the like.
  • clinker ash is also pulverized to adjust the center particle diameter, and can be used in the same manner as fly ash.
  • the composition of clinker ash or fly ash is not particularly limited.
  • the center particle diameter of the inorganic fine particle carrier is preferably 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, more preferably 4 ⁇ m to 75 ⁇ m, and still more preferably 13 ⁇ m to 25 ⁇ m.
  • the central particle size is in such a range, when the biomass containing the target compound-decomposing microorganism and the inorganic fine particle carrier are mixed, both of them tend to aggregate, and the biomass containing a suitable amount of the target compound-decomposing microorganism is inorganic. It tends to be carried on the fine particle carrier.
  • the specific gravity of the inorganic fine particle carrier is not particularly limited, but is preferably 1.2 to 3.5.
  • the inorganic fine particle carrier may be agglomerated using various aggregating agents as necessary for the purpose of improving the yield in the initial stage of culture.
  • the flocculant include nonionic, cationic, and anionic polymer flocculants.
  • any of batch, semi-batch, fed-batch, and continuous methods may be used.
  • a culture method for example, from the viewpoint of efficiently preparing a microorganism having a slow growth and a low cell yield, as described in JP-A-9-187272, a container for culturing a microorganism (hereinafter referred to as a reaction)
  • a continuous culture method may be used in which the concentration of the target compound supplied to the tank is increased logarithmically as the culture time elapses.
  • the specifications of the reaction tank are not particularly limited, and conventionally used culture tanks and activated sludge treatment tanks can be used.
  • the target compound-degrading microorganism is an aerobic microorganism, for example, from the viewpoint that the target compound-degrading microorganism can be efficiently accumulated by concentrating the target compound-degrading microorganisms at a high concentration with a simple operation management.
  • a reaction vessel as shown in FIG. 1 A reaction vessel as shown in FIG.
  • the 1 is composed of a split-type bubble column reactor.
  • This reactor has a structure in which a partition wall 3 and a current plate 4 are incorporated in a culture tank 1, and is divided into an aeration part 2 and a sedimentation part 5 by the partition wall 3.
  • the bottom part of the sedimentation part 5 has a tapered slope 6, and the aeration part 2 is caused by the upward flow of air or high oxygen partial pressure gas 8 in which the solids descending along the slope flow in from the diffuser 7 at the bottom part.
  • the one side part divided by the inner flow straightening plate 4 is raised, and in contact with the inflowing water 9 above the aeration part 2 and mixed, and the other outer side divided by the current regulating plate 4 is lowered to the bottom slope 6. A circulation flow is reached.
  • inflow water 9 flowing from above the water surface of the aeration part 2 a synthetic medium or waste water containing the target compound is supplied and cultured.
  • the supply of inflow water 9 may be either continuous or intermittent.
  • an inorganic fine particle carrier is caused to flow in the reaction tank, and microorganisms contained in the biomass are accumulated and supported on this to be cultured.
  • the medium is supplied to the reaction tank, air or a high oxygen partial pressure gas 8 is supplied from the aeration device 7, and the medium containing the inorganic fine particle carrier is circulated in the aeration part 2 while flowing the inorganic fine particle carrier. And accumulate microorganisms on the inorganic fine particle carrier.
  • the type of target compound-degrading microorganisms supported on the inorganic fine particle carrier and the abundance ratio with respect to the microorganisms supported on the inorganic fine particle carrier can be confirmed by the method described later. Therefore, in the process of culturing the inorganic fine particle carrier carrying the target compound degrading microorganism, the change can be examined by periodically checking the existence ratio of the target compound degrading microorganism.
  • the presence ratio of the target compound-degrading microorganisms in the inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganisms reaches a predetermined value, it can be determined that it has a predetermined function as a microbial preparation that decomposes the target compound.
  • the inorganic microparticle carrier carrying the target compound-degrading microorganism can be recovered to obtain the microbial preparation of the present embodiment.
  • the existence ratio of the target compound-degrading microorganisms for determining that the microorganism preparation has a predetermined function can be appropriately set depending on the target compound.
  • the proportion of nitrifying bacteria present is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and even more preferably 15% or more.
  • the presence ratio of (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid degrading microorganisms is It is preferably 5% or more, more preferably 6% or more, and even more preferably 7% or more.
  • the inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganisms cultured until the abundance ratio of the target compound-degrading microorganisms reaches a predetermined value is collected, and this is used as the microorganism preparation of this embodiment.
  • only the inorganic fine particle carrier carrying the target compound degrading microorganism may be collected and used as a microbial preparation, or a medium containing the inorganic fine particle carrier carrying the target compound degrading microorganism may be used as the microbial preparation.
  • a microorganism preparation obtained by removing water by concentration or drying from a medium containing an inorganic fine particle carrier supporting a target compound-degrading microorganism may be used.
  • the supported microorganism if the supported microorganism is an aerobic microorganism, it may be treated in advance with a high oxygen partial pressure gas.
  • the presence ratio of the target compound-degrading microorganisms contained in the microorganism preparation (inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganisms) being manufactured by monitoring the target compound-degrading microorganisms during the culturing process.
  • the microorganism preparation inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganisms
  • the growth of the target compound-degrading microorganism can be appropriately controlled by taking measures such as adjusting the amount of the target compound to be added. .
  • the existence ratio of the target compound-degrading microorganism was obtained by amplifying a predetermined region of the 16S rRNA gene of the microorganism supported on the inorganic fine particle carrier to obtain an amplification product, and analyzing the base sequence data of the amplification product.
  • DNA directly prepared from an inorganic fine particle carrier supporting the target compound-degrading microorganism can be used.
  • a method for preparing DNA a method well known to those skilled in the art can be used.
  • a commercially available DNA extraction kit or the like can be used.
  • a predetermined region of the 16S rRNA gene contained in the prepared DNA is amplified, and the obtained amplification product is used for subsequent analysis.
  • the 16S rRNA gene has a conserved region containing a sequence common between species on the gene and a variable region (V1-V9) containing a sequence that differs depending on the species / genus.
  • the region to be amplified is preferably a variable region sandwiched between conserved regions because 16S rRNA genes derived from a plurality of types of microorganisms can be obtained in a single amplification step and a plurality of types of microorganisms can be identified.
  • Examples of the region to be amplified include a range including the V3-V4 region.
  • the number of base sequences in the region to be amplified is preferably 100 to 1500 bases, more preferably 300 to 800 bases, still more preferably 400 to 600 bases. If the region to be amplified has such a length, there is a tendency that sufficient reliability can be obtained to classify a plurality of types of microorganisms during analysis.
  • the method for amplifying a predetermined region of the 16S rRNA gene is not particularly limited, and methods well known to those skilled in the art can be used. Examples of such a method include a polymerase chain reaction method (PCR method).
  • PCR method polymerase chain reaction method
  • both the forward primer and the reverse primer are used as the variable region of the 16S rRNA gene. It is preferably a universal primer designed to hybridize under stringent conditions to a conserved region sandwiching.
  • the forward primer and the reverse primer have a universal primer sequence that is a base sequence that hybridizes under stringent conditions to the conserved region of the 16S rRNA gene.
  • the length of the universal primer sequence is preferably 15 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases, and even more preferably 15 to 25 bases.
  • stringent conditions means that a complementary strand of a nucleotide strand having homology to a target sequence preferentially hybridizes to the target sequence, and complementation of a nucleotide strand having no homology. It means conditions under which the strands do not substantially hybridize. Stringent conditions are sequence-dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting temperature (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature at which 50% of the nucleotides complementary to the target sequence hybridize to the target sequence in equilibrium under a defined ionic strength, pH, and DNA concentration.
  • Tm thermal melting temperature
  • the next-generation sequencer is a next-generation sequencer from the viewpoint that a plurality of types of microorganisms can be analyzed simultaneously and comprehensively without separating an amplification product (amplicon) obtained by amplifying a predetermined region of the 16S rRNA gene.
  • amplification product amplicon
  • GS FLX + System manufactured by Roche
  • MiSeq manufactured by Illumina
  • the universal primer may have a specific sequence in addition to the universal primer sequence.
  • the forward primer is designed from the 5 ′ end to be an adapter sequence necessary for sequencing by sequence analysis, a barcode sequence unique to each specimen, a universal primer sequence, and the reverse primer from the 5 ′ end. It is designed to be an adapter sequence and a universal primer sequence necessary for sequencing in sequence analysis.
  • the barcode sequence is used for identification between samples, and is an arbitrarily designed base sequence corresponding to the number of samples to be used for the sequencer at the same time. By using a primer having such a barcode sequence, a large number of specimens can be analyzed by one sequence analysis.
  • the adapter sequence and the barcode sequence those specified by the manufacturer can be used.
  • the length of the barcode sequence can be designed according to the number of samples used for the base sequence analysis, and can be, for example, 8 to 15 bases.
  • the base sequence data obtained by the sequence analysis can be divided into individual samples based on the barcode sequence specific to the sample included in the base sequence data.
  • the divided base sequence data is further sorted by the sequence length of the base sequence data, the number of bases mismatched with the universal primer sequence, the average quality value of the base sequence data determined by the quality program attached to the sequencer, etc.
  • the base sequence data is highly accurate.
  • the obtained high-accuracy base sequence data is divided into a plurality of groups based on the homology between base sequence data by OTU (Operational Taxonomic Unit) analysis.
  • the homology between the base sequence data for dividing into the same group can be set according to the required reliability, and may be 95% or more, 97% or more, 99% or more It may be.
  • Examples of software for performing OTU analysis include Uclust (http://drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html), UPARSE (http://drive5.com/usearch/manual/uparse_pipeline.html), USEARCH (http://www.drive5.com/usearch) and the like.
  • microorganisms having the same group of base sequence data are a single type of microorganism.
  • the “kind” here includes taxonomic departments, genera, and species.
  • the representative base sequence data of each group is subjected to a homology search using a database such as DDBJ, GenBank, RDP, Greengenes, etc., and a microorganism having the base sequence data with the highest homology is identified as a microorganism having the representative base sequence data.
  • a database such as DDBJ, GenBank, RDP, Greengenes, etc.
  • the representative base sequence data refers to base sequence data that exhibits homology equal to or higher than a threshold with any base sequence data belonging to each group.
  • the number of groups can be considered to be the same as the number of types of microorganisms constituting the microflora in a detectable range. From the number of base sequence data divided into each group, the ratio in the total number of base sequence data obtained, that is, the existence ratio of the microbial species of that group in the entire microbiota can be obtained. By determining the group of target compound-degrading microorganisms from the representative base sequence data by the above method, the abundance ratio can be calculated.
  • the microorganism preparation of the present embodiment can be used for decomposing target compounds.
  • Examples of the method for decomposing the target compound include a method in which the microbial preparation of the present embodiment is added to a waste liquid containing the target compound and stirred. At this time, the amount of the microbial preparation to be added can be appropriately set according to the type of the target compound, the capacity of the reaction tank, the abundance ratio of the target compound-degrading microorganisms supported on the microbial preparation, and the like.
  • the method for evaluating a microbial preparation of the present embodiment includes a step of evaluating a microbial preparation using an abundance ratio of a target compound-degrading microorganism as an index.
  • the method described above can be used for the presence ratio of the target compound-degrading microorganism.
  • Examples of the microbial preparation used in the evaluation method of the present embodiment include a microbial preparation stored after production.
  • Evaluation of the microbial preparation is performed by calculating the presence ratio of the target compound-degrading microorganism in the microorganism contained in the microbial preparation.
  • an evaluation method for example, the existence ratio of the target compound degrading microorganisms contained in the microbial preparation immediately after production and the microbial preparation during storage is compared, and the existence ratio of the target compound degrading microorganism contained in the microbial preparation during storage is compared. When it is decreasing, it can be determined that the degradation activity of the microbial preparation during storage is decreased.
  • Example 1 (material) A concentrated solution of components used for the production of the medium was prepared by the following method. 35.4 g of (NH 4 ) 2 SO 4 and 7.7 g of Na 2 HPO 4 were dissolved in 500 mL of pure water to obtain a nitrogen phosphorus solution of 15,000 mg / L of ammonia nitrogen. Inorganic salt solution 1 was prepared by dissolving 110 g of KCl, 50 g of CaCl 2 .2H 2 O, and 1 mg of CoCl 2 in 1000 mL of pure water. An inorganic salt solution 2 was prepared by dissolving 5 mg of NaMoO 4 .2H 2 O in 1000 mL of pure water.
  • the medium to be supplied during the culture is 0.2 g of (NH 4 ) 2 SO 4 and 1.54 g of Na 2 HPO 4 dissolved in 1000 mL of pure water, 1 ml of inorganic salt solution 1, 1 ml of inorganic salt solution 2, and inorganic salt solution 3 Prepared by adding 1 mL. Since the medium was continuously supplied during the culture period, the necessary amount was appropriately produced.
  • the activated sludge suspension was prepared using pure water so that the activated sludge was collected from the aeration tank of the chemical factory and the activated sludge concentration was 5000 mg-MLSS / L.
  • MLSS is a floating solid suspended solid (Mixed liquid Volatile Suspended Solid). MLSS was measured according to the method described in the Japan Sewerage Association by the Sewerage Society of Japan.
  • the inorganic fine particle carrier dispersion was prepared by mixing a suspension obtained by adding 500 g of fly ash to 800 ml of pure water and mixing a solution obtained by dissolving 60 g of Sumifloc FA-40H (manufactured by MT Aqua Polymer) in 600 ml of pure water. .
  • a microbial preparation was produced using an airlift type continuous reaction tank equipped with an aeration section and a sedimentation section for performing solid-liquid separation. Add 10 L of activated sludge suspension, 10 mL of nitrogen phosphorus solution, 10 mL of inorganic salt solution 1, 10 mL of inorganic salt solution 2, 10 mL of inorganic salt solution 3 and 1.4 L of inorganic fine particle carrier dispersion to the reaction tank, and stir by air lift to culture Went. The medium in which these were mixed was controlled around pH 7.5 using a 10% by mass H 3 PO 4 solution and a 10% by mass Na 2 CO 3 solution. The water temperature was controlled at 25 ° C.
  • the medium in the reaction vessel is referred to as a culture solution.
  • the concentration of ammonia nitrogen in the culture broth was measured. When the ammonia nitrogen disappeared, supply of the supply medium was started.
  • the concentration of ammonia nitrogen in the culture solution and the flow rate of the culture medium should not inhibit the growth of nitrifying bacteria according to the measurement results of the ammonia concentration, nitrite concentration, nitric acid concentration, and nitrifying bacteria existing ratio in the culture solution.
  • the ammonia nitrogen concentration in the culture solution was gradually increased.
  • the culture solution on the 36th day after the culture was collected from the aeration part of the reaction tank, and this was used as a microbial preparation in which nitrifying bacteria were densified.
  • the ammonia nitrogen removal rate is calculated from the ammonia nitrogen concentration contained in the culture solution and the ammonia nitrogen concentration contained in the supply medium at the time of collecting the culture solution from which the activated sludge was settled and separated from the settling part of the reaction tank. Calculated.
  • the nitrogen treatment capacity was calculated from the culture volume of the aerated part.
  • the medium 1.5 mL containing the inorganic fine particle carrier carrying the target compound degrading microorganisms was collected and centrifuged at room temperature (13,000 rpm, 5 minutes). After removing the supernatant, 1 mL of sterilized physiological saline was added, mixed by inverting for about 5 seconds, and centrifuged at room temperature (13000 rpm, 5 minutes). After removing the supernatant, 300 ⁇ L of Lysis buffer (manufactured by AMR) was added and mixed well. This suspension was added to a tube containing beads (Easy Extract for DNA (manufactured by AMR)), and then crushed by stirring with a vortex mixer for 2 minutes.
  • Lysis buffer manufactured by AMR
  • TE solution 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0
  • TE solution 300 ⁇ L of TE solution (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)
  • TE solution 300 ⁇ L of TE solution (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)
  • TE solution 300 ⁇ L of TE solution (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)
  • 450 ⁇ L of the supernatant was put into a new tube, and 600 ⁇ L of a phenol mixed solution (attached to Easy Extract for DNA (manufactured by AMR)) was added thereto, and the mixture was stirred with a vortex mixer for 4 minutes. And centrifuged (13,000 rpm, 5 minutes).
  • 16S rRNA gene Measure the double-stranded DNA concentration in the prepared DNA solution, and use a universal primer set (forward primer and reverse primer) with 50 ng of DNA calculated based on the measured value as a template, The V3-V4 region of the 16S rRNA gene was PCR amplified.
  • 50 ⁇ L of a reaction solution containing 50 pmol of each primer was prepared using “Premix Ex Taq Hot Start Version” (registered trademark) manufactured by Takara Bio Inc., followed by preheating at 94 ° C. for 2 minutes, followed by denaturation. , Annealing, and extension were performed at 98 ° C. ⁇ 10 seconds, 50 ° C. ⁇ 30 seconds, and 72 ° C.
  • DNA fragments (about 570 bp) of various microorganisms contained in the inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganisms were amplified by PCR using the universal primer set.
  • the forward primer has an adapter A sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 from the 5 ′ end side, a barcode sequence consisting of 10 bases, and a universal primer sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a reverse primer having an adapter B sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a universal primer sequence consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 from the 5 'end side was used.
  • the amplified PCR product was treated with a DNA cleaner (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to purify the DNA.
  • the purified DNA was eluted and collected with 200 ⁇ L of TE solution.
  • the recovered purified DNA solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and a band detected at a position of about 570 bp was cut out together with the gel.
  • DNA was extracted from the cut out gel using MinElute Gel Extraction Kit (manufactured by Qiagen), and this was used as a sequence sample for use in a sequencer.
  • each base sequence data was classified into each unique sample based on the barcode sequence unique to the sample included in each base sequence data. Thereafter, the sequence length of the base sequence data is less than 200 bases, 1000 bases or more, 1 base or more mismatches with the universal primer sequence (forward primer), and the determined base sequence data determined using the quality program attached to the sequencer High-precision base sequence data was extracted by removing sequence data having an average quality value of 25 or less.
  • the high-accuracy base sequence data was subjected to OTU analysis.
  • OTU analysis sequence data having a homology of 95% or more are classified into the same group to form a plurality of groups.
  • OTU analysis was performed using Uclust. From the information obtained by the OTU analysis, the types of microorganisms contained in the inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganisms were determined and the existence ratio of each microorganism was calculated.
  • Ammonia-nitrogen removal rate, nitrogen treatment capacity and nitrifying bacteria (ammonia-oxidizing bacteria (Nitrosomonas) contained in the inorganic particulate carrier carrying the target compound-degrading microorganisms)
  • Table 1 shows a summary of the abundance ratios of genus) and nitrite oxidizing bacteria (Nitrobacter genus, Nitrospira genus). Changes in the proportion of nitrifying bacteria contained in the inorganic particulate carrier carrying the target compound-degrading microorganisms over time based on the genetic analysis information of the microorganisms contained in the inorganic particulate carrier carrying the target compound-degrading microorganisms in culture It was possible to measure. It was also shown that with the increase of various nitrifying bacteria, the nitrogen treatment capacity of the inorganic fine particle carrier carrying the target compound-degrading microorganism was increased.
  • Example 2 (material) A concentrated solution of components used for the production of the medium was prepared by the following method. 100 g of MgSO 4 ⁇ 7H 2 O was dissolved in 1000 mL of pure water to obtain an inorganic salt solution A. An inorganic salt solution B was prepared by dissolving 4.152 g of Na 2 HPO 4, 2.244 g of NaH 2 PO 4 and 1.2 g of (NH 4 ) 2 SO 4 in 300 mL of pure water.
  • (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid solution in which 1.18 g of (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid (purity about 85% by mass) was dissolved in 100 mL of pure water (10 g / L) was used.
  • the inorganic fine particle carrier dispersion was prepared by adding 50 g of activated sludge incineration ash to 250 ml of pure water, mixing and suspending.
  • the activated sludge suspension was obtained by collecting activated sludge from an aeration tank of a chemical factory.
  • a microbial preparation was produced using an airlift type continuous reaction tank equipped with an aeration part (capacity 1 L) and a sedimentation part (capacity 0.4 L).
  • a solution was prepared by adding 9.876 mL of the solution, inorganic fine particle carrier dispersion and 250 mL, and 70 mL of pure water. This medium was agitated by airlift and cultured. The medium was controlled around pH 6.9 using a 10% by mass Na 2 CO 3 solution. The water temperature was controlled at 25 ° C.
  • the medium in the reaction vessel is referred to as a culture solution.
  • DNA extraction of microorganisms contained in the inorganic particulate carrier carrying the subject compound-degrading microorganisms in culture is performed as needed. It was.
  • Example 3 The same inorganic salt solution 1, inorganic salt solution 2, and inorganic salt solution 3 as those used in Example 1 were used as the inorganic salt solution used for the production of the medium.
  • the influent water was 1 mL of (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid solution, 1 g of (NH4) 2 SO 4 , 1.298 g of Na 2 HPO 4 and 0.912 g of NaH 2 PO 4.
  • the activated sludge suspension was obtained by collecting activated sludge from an aeration tank of a chemical factory.
  • S) -2- (4-Chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid removal reaction was performed using an airlift type continuous reaction tank equipped with an aeration part (capacity 3 L) and a sedimentation part (capacity 1 L).
  • (S) -2- (4-Chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid removal reaction is performed under conditions where there is no (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid-degrading microbial preparation (series A). The test was performed under two conditions (B series).
  • Influent water was added to the reaction tank, and activated sludge suspension was added to adjust the activated sludge concentration to 2408 mg-MLSS / L to obtain a culture solution.
  • MLSS is a floating solid suspended solid (Mixed liquid Volatile Suspended Solid).
  • 459 mL of the (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid-degrading microbial preparation 54 days after culture produced in Example 2 in which the supernatant was further removed by centrifugation.
  • a culture solution was obtained.
  • the A-series and B-series culture solutions were agitated to initiate the reaction. Influent was added at a rate of 1 mL / min.
  • the influent water was controlled around pH 7 using a 10% by mass Na 2 CO 3 solution.
  • the water temperature was controlled at 25 ° C.
  • Information on gene analysis of microorganisms in the microorganism preparation was obtained in the same manner as in Example 1.
  • the (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid removal rate and the (S) -2- (4-chlorophenyl) -3-methylbutanoic acid degrading microorganism were measured by the method described in Example 2. The same was done.

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Abstract

　本発明に係る微生物製剤の製造方法は、対象化合物を含む培地中で、対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、バイオマスに含まれる微生物を無機微粒子に担持させ、無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、を備え、対象化合物分解性微生物の存在割合が、無機微粒子担体に担持された微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる。

Description

微生物製剤の製造方法及び微生物製剤
　本発明は、微生物製剤の製造方法及び微生物製剤に関する。
　排水処理において、対象化合物を排水から除く方法としては、燃焼処理方法又は対象化合物分解性微生物を利用した生物学的処理方法等が用いられる。対象化合物分解性微生物を得る方法としては、対象化合物を分解する微生物を集積培養して、その分解微生物を特定、単離して純粋培養する方法（単離培養方法）が知られている。また、活性汚泥の様な混合微生物系の場合、対象化合物を低濃度で栄養源として与え、徐々に濃度を高めていくことにより活性汚泥を対象化合物に馴れさせ、分解能を高める馴養と呼ばれる方法（馴養方法）が知られている。
　しかしながら、単離培養方法では、分解微生物の単離に長時間を要し、適した微生物も人工的に培養できるものに限られ、更に純粋培養するための製造コストが高いといった課題がある。一方、馴養方法は、安価で大量に分解微生物を培養できるものの、馴養に長時間を要するといった課題がある。
　その他に対象化合物分解微生物を高密度化する方法としては、例えば、特許文献１に記載されているように、硝化細菌を高密度化し、優れた物性を有する、微粒子個体と微生物を凝集造粒化することによる微生物製剤の製造方法が開示されている。この微生物製剤は、連続培養することで効率的に製造することができ、保存もできるため、排水の効率的な処理に有用である。
特開２００３－２７４９３７号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の方法は、窒素処理能力を指標にして硝化細菌を高密度化することが可能であるが、造粒化中及び造粒化後の硝化細菌群の種類、存在量が把握できない。窒素以外の対象化合物の処理においても同様のことが考えられる。このような方法では、対象化合物の分解性のみを指標とした場合、対象化合物分解性微生物の存在量及び存在割合は把握できていないため、造粒化工程で添加する対象化合物の濃度が高過ぎることによる対象化合物分解微生物群の増殖阻害、また対象化合物の分解中間物の蓄積による対象化合物分解微生物の増殖阻害等を予測することが困難である。一方、近年の遺伝子解析技術の進歩により、活性汚泥等の複合微生物系から、微生物を単離することなく存在する微生物の種類及び存在量を把握することが可能となってきた。しかし、その技術の活用は、現状では単なる測定の域を脱しておらず限定的であることから、遺伝子解析技術を微生物製剤の製造方法に適応させるための技術確立が望まれていた。
　本発明は、上記事情に鑑み、対象化合物分解性微生物の存在割合を監視することで、対象化合物分解性微生物を所望の密度に担持する微生物製剤を安定的且つ効率的に製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、上記製造方法により製造された微生物製剤、該微生物製剤を用いた化合物分解方法、及び該微生物製剤の評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、製造中の微生物製剤に担持される微生物を網羅的に解析した遺伝子解析情報に基づき、微生物製剤に担持される対象化合物分解性微生物を監視することで、微生物製剤を効果的に製造する方法を新たに確立し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、例えば以下の［１］～［６］に関する。
［１］対象化合物分解性微生物を担持する微生物製剤の製造方法であって、対象化合物を含む培地中で、対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、バイオマスに含まれる微生物を無機微粒子に担持させ、無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、を備え、対象化合物分解性微生物の存在割合が、無機微粒子担体に担持された微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる、製造方法。
［２］対象化合物が（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸である、［１］に記載の製造方法。
［３］対象化合物がアンモニアである、［１］に記載の製造方法。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法により製造された、微生物製剤。
［５］［４］に記載の微生物製剤を用いた、化合物分解方法。
［６］［４］に記載の微生物製剤の評価方法であって、微生物製剤に含まれる微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を指標として微生物製剤を評価する工程を備え、対象化合物分解性微生物の存在割合が、微生物製剤に含まれる微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる、評価方法。
　本発明によれば、微生物製剤に担持される微生物の種類を検出し、その存在割合を算出した結果に基づき、対象化合物分解性微生物を監視することで、対象化合物分解性微生物を所望の密度に担持する微生物製剤を安定的且つ効率的に製造する方法を提供することができる。また、本発明は、上記製造方法により製造された微生物製剤、この微生物製剤を用いた化合物分解方法、及びこの微生物製剤の評価方法を提供することができる。
本実施形態の微生物製剤を製造する反応槽の概略縦断面図である。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
＜微生物製剤の製造方法＞
　本実施形態の対象化合物分解性微生物を担持する微生物製剤の製造方法は、対象化合物を含む培地中で、対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、バイオマスに含まれる微生物を無機微粒子に担持させ、無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、を備える。
　本実施形態に係る対象化合物としては、微生物により分解される化合物であれば特に制限されるものではないが、排水中に含まれるものが好ましい。このような化合物としては、例えば、アンモニア、亜硝酸、ベンゼン、トルエン、スチレン、キシレン、カテコール、プロトカテキュ酸、プロトカテキュアルデヒド、２－フェニル酪酸、２－イソプロピルフェニル酪酸、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸、安息香酸、ベンズアルデヒド等が挙げられる。これらの中でも、排水からの除去が望まれているアンモニア又は（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸が好ましい。
　対象化合物を含む培地としては、対象化合物を含み、且つ対象化合物分解性微生物を培養できるものであれば、特に制限されるものではない。このような培地としては、各塩類、ｐＨ等を人工的に調製した培地であってもよく、下水又は廃水であってもよい。培地に含まれる対象化合物の濃度は、対象化合物分解性微生物を馴養する観点から、初期濃度は低く設定し、培養過程で次第に高くしていくことが好ましい。初期濃度は、対象化合物ごとに、適宜設定することができる。
　対象化合物分解性微生物とは、対象化合物を栄養源として分解し、利用することができる微生物である。本実施形態に係る対象化合物分解性微生物は、対象化合物の選択により、適宜選択される。対象化合物にアンモニアを選択した場合は、例えば、硝化細菌（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属等のアンモニア酸化細菌、Ｎｉｔｏｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ属等の亜硝酸酸化細菌等）が挙げられる。対象化合物に（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸を選択した場合は、例えば、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌等が挙げられる。
　対象化合物分解性微生物を含むバイオマスとしては、例えば、活性汚泥、土壌、バイオフィルム等のミクロフローラ等が挙げられ、汚水の浄化のため産業上広く利用されているという観点から、活性汚泥が好ましい。活性汚泥としては、下水汚泥、産業排水処理場活性汚泥、し尿処理場汚泥等が挙げられる。
　無機微粒子担体としては、材質が金属及びその無機塩類又は酸化物であってもよく、炭素を含有するものであっても化学的に無機物に分類されるものであってもよく、又は有機態炭素の含有量が１％程度未満の純物質又は混合物であってもよい。無機微粒子担体としては、例えば、アルミナ（酸化アルミニウム）、ヒドロキシアパタイト（カルシウムリン酸ヒドロキシド）等の工業製品（規格外品、副産物、廃品等を含む）、活性汚泥等の有機性廃棄物の焼却灰並びに火力発電又はコークス炉の燃えかすである石炭焼却灰等が挙げられる。
　無機微粒子担体としては、中でも、安価であり、簡便な操作で得ることができ、また微生物の活性発現が短期間で生じるといった観点から、石炭焼却灰が好ましい。石炭焼却灰の中でも、クリンカアッシュ又はフライアッシュが好ましく、ふるい分け等を行わなくても中心粒子径が１００μｍ以下であることから、フライアッシュがより好ましい。無機微粒子担体としては、クリンカアッシュも粉砕して中心粒子径を調整することで、フライアッシュと同様に用いることができる。クリンカアッシュ又はフライアッシュの組成は、特に制限されるものではない。
　無機微粒子担体の中心粒子径は、１μｍ～１００μｍが好ましく、４μｍ～７５μｍがより好ましく、１３μｍ～２５μｍが更に好ましい。中心粒子径がこのような範囲の場合、対象化合物分解性微生物を含むバイオマス及び無機微粒子担体を混合した際に、両者が凝集しやすくなり、好適な量の対象化合物分解性微生物を含むバイオマスが無機微粒子担体に担持されやすくなる傾向にある。
　無機微粒子担体の比重は、特に制限されないが、１．２～３．５が好ましい。
　無機微粒子担体は、培養初期の歩留まりを向上させることを目的として、必要に応じて、各種凝集剤を用いて凝集させてもよい。凝集剤としては、例えば、ノニオン性、カチオン性、アニオン性の高分子凝集剤等が挙げられる。
　本実施形態に係る培養方法としては、回分、半回分、流加、連続のいずれの方式を用いてもよい。培養方法としては、例えば、増殖が遅く菌体収率の低い微生物を効率的に調製するという観点から、特開平９－１８７２７２号公報に記載されるように、微生物を培養する容器（以下、反応槽という）へ供給する対象化合物の濃度を培養時間の経過に伴い、対数増加させる連続培養方式を用いてもよい。
　本実施形態において、反応槽の仕様については特に制限されるものではなく、従来用いられてきた培養タンク及び活性汚泥処理槽等を利用することができる。対象化合物分解性微生物が好気性微生物である場合、運転経費を抑え、簡便な運転管理で、対象化合物分解性微生物を高濃度に集積して効率よく培養することができるといった観点から、例えば、図１に示されるような反応槽を用いてもよい。
　図１に示す反応槽１００はスプリット形の気泡塔反応器で構成される。この反応器は、培養槽１内に隔壁３及び整流板４を組み込んだ構造になっており、隔壁３によって曝気部分２と、沈降部分５に仕切られている。沈降部分５の底部はテーパー状のスロープ６となっており、ここを伝って下降してきた固形物が底部の散気装置７から流入した空気又は高酸素分圧ガス８による上昇流によって曝気部分２内の整流板４で区切られた片側部分を上昇し、曝気部分２の上方で流入水９と接触、混合され、整流板４で区切られたもう一方の外側を下降して底部のスロープ６に到達するという循環流を形成する。
　沈降部分５では固形物と清澄水が重力により分離され、固形物はスロープ６を伝って曝気部分２に戻り、清澄水は排出口１０から処理水１１として排出される。曝気部分２の水面上方から流入する流入水９として、対象化合物を含む合成培地又は排水等を供給し、培養を行う。流入水９の供給は連続的又は断続的のいずれでも良い。
　図１に示す反応槽では、反応槽内に無機微粒子担体を流動させ、これにバイオマスに含まれる微生物を集積、担持させて培養する。培養にあたっては、反応槽に培地を供給し、散気装置７から空気又は高酸素分圧ガス８を供給し、曝気部分２内で無機微粒子担体を含む培地を循環させながら、無機微粒子担体を流動させ、無機微粒子担体上に微生物を集積させる。このような方法によれば、運転経費を抑え、簡便な運転管理で、対象化合物分解性微生物を高濃度に集積した微生物製剤を効率よく培養することができる傾向にあり、また槽内へ供給された酸素の利用効率が高いため、高負荷運転をすることもできる。
　本実施形態において、後述する方法により、無機微粒子担体に担持された対象化合物分解性微生物の種類及び無機微粒子担体に担持された微生物に対する存在割合を確認することができる。そのため、対象化合物分解性微生物を担持する無機微粒子担体を培養する過程で、定期的に対象化合物分解性微生物の存在割合を調べることにより、その変化を調べることができる。
　対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体における対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に達したときには、対象化合物を分解する微生物製剤として所定の機能を有すると判定することができるため、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収して、本実施形態の微生物製剤を得ることができる。微生物製剤として所定の機能を有すると判定するための対象化合物分解性微生物の存在割合は、対象化合物によって適宜設定することができる。対象化合物にアンモニアを選択した場合は、例えば、硝化細菌の存在割合は、５％以上であることが好ましく、１０％以上であることがより好ましく、１５％以上であることが更に好ましい。対象化合物に（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸を選択した場合は、例えば、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物の存在割合は、５％以上であることが好ましく、６％以上であることがより好ましく、７％以上であることが更に好ましい。
　対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達するまで培養した対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、これを本実施形態の微生物製剤とする。本実施形態において、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体のみを回収してこれを微生物製剤としてもよいし、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を含む培地を微生物製剤としてもよいし、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を含む培地から濃縮又は乾燥により水分を除いたものを微生物製剤としてもよい。本実施形態の微生物製剤の保存及び貯蔵の際には、担持される微生物が好気性微生物である場合、事前に高酸素分圧ガスで処理してもよい。
　本実施形態の製造方法は、培養過程で、対象化合物分解性微生物の監視によって、製造中の微生物製剤（対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体）に含まれる対象化合物分解性微生物の存在割合の変化を調べることにより、増殖阻害等の問題を迅速に検出し、対応することができるため、微生物製剤を安定且つ効率的に製造することができる。例えば、対象化合物分解性微生物の増殖阻害が予測された場合には、添加する対象化合物の量を調整する等の対応をとることにより、対象化合物分解性微生物の増殖を適切に制御することができる。
＜対象化合物分解性微生物の存在割合の算出＞
　対象化合物分解性微生物の存在割合は、無機微粒子担体に担持された微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、を含む方法によって得られる。
　対象化合物分解性微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子は、例えば、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体から直接調製したＤＮＡを用いることができる。ＤＮＡの調製方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、市販されているＤＮＡ抽出キット等を用いることができる。
　調製したＤＮＡに含まれる１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅し、得られる増幅産物を続く解析に用いる。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子には、遺伝子上に種間に共通な配列を含む保存領域、及び種・属等によって異なる配列を含む可変領域（Ｖ１－Ｖ９）が存在する。増幅させる領域は、複数の種類の微生物由来の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を一度の増幅工程で得られること、及び、複数の種類の微生物が判別できることから、保存領域に挟まれた可変領域であることが好ましい。増幅させる領域としては、例えば、Ｖ３－Ｖ４領域を含む範囲が挙げられる。増幅させる領域の塩基配列数としては、１００～１５００塩基が好ましく、３００～８００塩基がより好ましく、４００～６００塩基が更に好ましい。増幅させる領域がこのような長さであれば、解析の際に、複数の種類の微生物を分類するのに、十分な信頼性を得られる傾向にある。
　１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅させる方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が挙げられる。
　ＰＣＲ法を用いて増幅する場合、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる複数の微生物を検出するという観点から、用いるプライマーは、フォワードプライマー及びリバースプライマー共に、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の可変領域を挟む保存領域に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするように設計されたユニバーサルプライマーであることが好ましい。
　フォワードプライマー及びリバースプライマーは、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の保存領域に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であるユニバーサルプライマー配列を有する。ユニバーサルプライマー配列の長さとしては、１５～４０塩基が好ましく、１５～３０塩基がより好ましく、１５～２５塩基が更に好ましい。
　本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、及びＤＮＡ濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
　増幅産物の塩基配列を解析する方法としては、例えば、シークエンサーによるシークエンス解析が挙げられる。シークエンサーとしては、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅させた増幅産物（アンプリコン）を分離することなく、複数種の微生物を同時に、且つ、網羅的に解析できるという観点から、次世代型シークエンサーが好ましく、例えば、ＧＳ　ＦＬＸ＋　Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）等が挙げられる。
　シークエンサーにＧＳ　ＦＬＸ＋　Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）を用いる場合、ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー配列の他に、特定の配列を有していてもよい。例えば、フォワードプライマーは、５’末端から、シークエンス解析での配列決定に必要なアダプター配列、各検体に固有のバーコード配列、ユニバーサルプライマー配列となるように設計され、リバースプライマーは、５’末端から、シークエンス解析での配列決定に必要なアダプター配列、ユニバーサルプライマー配列となるように設計される。バーコード配列とは、検体間の識別に利用するもので、同時にシークエンサーに供する検体数に対応した任意に設計した塩基配列である。このようなバーコード配列を有するプライマーを用いることで、１回のシークエンス解析で多数の検体を解析することができる。アダプター配列及びバーコード配列は、メーカー指定のものを用いることができる。バーコード配列の長さは、塩基配列解析に用いる検体数に応じて設計することができ、例えば、８～１５塩基とすることができる。
　以下、ＧＳ　ＦＬＸ＋　Ｓｙｓｔｅｍにより得られた塩基配列データの解析方法を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
　シークエンス解析により得られた塩基配列データは、塩基配列データに含まれる検体固有のバーコード配列に基づき、各配列をそれぞれの固有の検体に分けられる。分けられた塩基配列データを、更に、塩基配列データの配列長、ユニバーサルプライマー配列とミスマッチする塩基数、シークエンサーに付属するクオリティプログラムにより算出される配列決定した塩基配列データの平均クオリティ値等により選別し、高精度な塩基配列データとする。
　得られた高精度な塩基配列データを、ＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｕｎｉｔ）解析により、塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分ける。同じグループに分けるための塩基配列データ間の相同性は、要求される信頼性に応じて設定することができ、９５％以上であってもよく、９７％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。ＯＴＵ解析を行うためのソフトウェアとしては、例えば、Ｕｃｌｕｓｔ（http://drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html）、ＵＰＡＲＳＥ（http://drive5.com/usearch/manual/uparse_pipeline.html）、ＵＳＥＡＲＣＨ（http://www.drive5.com/usearch）等が挙げられる。
　ＯＴＵ解析の結果において、同じグループの塩基配列データを有する微生物は単一の種類の微生物である。ここでいう「種類」とは、分類学上の科、属、種を含むものである。それぞれのグループの代表塩基配列データをＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲＤＰ、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ等のデータベースで相同性検索し、最も相同性の高い塩基配列データを有する微生物を、代表塩基配列データを有する微生物だと特定する。これにより、決定された代表塩基配列データが含まれるグループの微生物の種類を特定することができる。それぞれのグループの微生物の種類を特定したら、データベース等の情報に基づき、どのグループの微生物が対象化合物分解性微生物であるかを決定することができる。本明細書において、代表塩基配列データとは、各グループに属するいずれの塩基配列データとも閾値以上の相同性を示す塩基配列データのことを示す。
　ＯＴＵ解析の結果において、グループの数は、検出可能な範囲において、その微生物叢を構成する微生物の種類の数と同じと考えることができる。各グループに分けられた塩基配列データの数からは、得られた塩基配列データ数全体における割合、つまり微生物叢全体に占めるそのグループの微生物種の存在割合を求めることができる。上記の方法により、代表塩基配列データから対象化合物分解性微生物のグループを決定することで、その存在割合を算出することができる。
＜化合物分解方法＞
　本実施形態の微生物製剤は、対象化合物の分解に利用することができる。対象化合物の分解方法としては、例えば、対象化合物を含む廃液等に対し、本実施形態の微生物製剤を添加し、攪拌する方法が挙げられる。このとき、添加する微生物製剤の量は、対象化合物の種類、反応槽の容量、微生物製剤に担持されている対象化合物分解性微生物の存在割合等により、適宜設定することができる。
＜微生物製剤の評価方法＞
　本実施形態の微生物製剤の評価方法は、対象化合物分解性微生物の存在割合を指標として微生物製剤を評価する工程を備える。対象化合物分解性微生物の存在割合は、上述した方法を用いることができる。
　本実施形態の評価方法に用いられる微生物製剤としては、例えば、製造後保存されている微生物製剤が挙げられる。
　微生物製剤の評価は、微生物製剤に含まれる微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出することで行われる。評価方法としては、例えば、製造直後の微生物製剤及び保存中の微生物製剤に含まれる対象化合物分解性微生物の存在割合を比較し、保存中の微生物製剤に含まれる対象化合物分解性微生物の存在割合が減少している場合、保存中の微生物製剤の分解活性が低下していると判定することができる。
［実施例１］
（材料）
　培地の製造に用いる成分の濃縮液を以下に示す方法で調製した。（ＮＨ４）２ＳＯ４　３５．４ｇとＮａ２ＨＰＯ４　７．７ｇを純水　５００ｍＬに溶解して、アンモニア態窒素１５０００ｍｇ／Ｌの窒素リン溶液とした。ＫＣｌ　１１０ｇとＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　５０ｇとＣｏＣｌ２　１ｍｇを純水　１０００ｍＬに溶解して、無機塩溶液１とした。ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　５ｍｇを純水　１０００ｍＬに溶解して無機塩溶液２とした。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　８５ｇとＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　８．５ｇとＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　２ｇとＺｎＳＯ４　１００ｍｇとＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　１００ｍｇを純水　１０００ｍＬに溶解して無機塩溶液３とした。培養中に供給する培地は、（ＮＨ４）２ＳＯ４　０．２ｇとＮａ２ＨＰＯ４　１．５４ｇを純水　１０００ｍＬに溶解し、無機塩溶液１　１ｍｌ、無機塩溶液２　１ｍｌ、無機塩溶液３　１ｍＬを加えることにより製造した。培地は、培養期間中に継続して供給するため、適宜、必要量を製造した。活性汚泥懸濁液は、化学工場の曝気槽から活性汚泥を採取して、活性汚泥濃度が５０００ｍｇ－ＭＬＳＳ／Ｌとなるように純水を用いて調整した。ＭＬＳＳとは、浮遊固形物（Ｍｉｘｅｄ　ｌｉｑｕｏｒＶｏｌａｔｉｌｅ　Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ　Ｓｏｌｉｄ）のことである。ＭＬＳＳは、下水試験方法　上巻　―２０１２年度版―　公益社団法人日本下水道協会著に記載の方法に従って測定した。無機微粒子担体分散液は、純水８００ｍｌにフライアッシュ５００ｇを加えて混合した懸濁液と、スミフロックＦＡ－４０Ｈ（ＭＴアクアポリマー社製）６０ｇを純水６００ｍｌに溶解した液を混合して製造した。
（微生物製剤の製造）
　曝気部と固液分離を行うための沈降部とを備えるエアリフト型連続反応槽を用いて、微生物製剤の製造を行った。反応槽に活性汚泥懸濁液１０Ｌ、窒素リン溶液１０ｍＬ、無機塩溶液１　１０ｍｌ、無機塩溶液２　１０ｍｌ、無機塩溶液３　１０ｍＬ、無機微粒子担体分散液１．４Ｌを加え、エアリフトにより攪拌し、培養を行った。これらを混合した培地は、１０質量％Ｈ３ＰＯ４溶液及び１０質量％Ｎａ２ＣＯ３溶液を用いて、ｐＨ７．５付近に制御した。水温は２５℃に制御した。以下、反応槽中の培地を培養液という。
　培養開始後、培養液中のアンモニア態窒素の濃度を測定し、アンモニア態窒素がなくなったら、供給用培地の供給を開始した。培養液中のアンモニア態窒素濃度及び培地の流速は、培養液中のアンモニア濃度、亜硝酸濃度、硝酸濃度、及び硝化細菌の存在割合の測定結果に応じて、硝化細菌の増殖阻害が起こらないように調整し、培養液中のアンモニア態窒素濃度が徐々に高くなるようにした。
　培養後３６日目の培養液を、反応槽の曝気部から回収し、これを硝化細菌が高密度化された微生物製剤とした。
（アンモニア態窒素の測定）
　反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収し、これを孔径０．４５μｍ、直径２５ｍｍのシリンジフィルター（アドバンテック社製）でろ過し、アンモニア態窒素検出キット及び分光光度計スペクトロクワントＮＯＶＡ６０（メルクミリポア社製）を用いて測定した。
（アンモニア態窒素除去率の算出）
　反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点における、培養液中に含まれるアンモニア態窒素濃度及び供給用培地に含まれるアンモニア態窒素濃度から、アンモニア態窒素除去率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
（窒素処理能力の算出）
　反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点における、培地中に含まれるアンモニア態窒素濃度、供給用培地に含まれるアンモニア態窒素濃度、供給用培地の流量及び反応槽曝気部の培養液容量から、窒素処理能力を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
（微生物の種類の決定及びそれぞれの微生物の存在割合の算出）
・ＤＮＡの調製
　硝化細菌の検出及びその存在割合の算出は、培養中の無機微粒子担体に活性汚泥が固着した対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、そこに含まれる微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を用いた塩基配列データに基づいて求めた。対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体中の微生物のＤＮＡは以下の方法で調製した。
　対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を含む培地１．５ｍＬを回収し、室温で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）した。上清を除いた後、滅菌生理食塩水を１ｍＬ加えて、５秒間ほど転倒混合し、室温で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）した。上清を除いた後、Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ(エイエムアール社製）を３００μＬ加え、よく混合した。この懸濁液をビーズの入ったチューブ（イージーエクストラクト　ｆｏｒ　ＤＮＡ（エイエムアール社製））に添加後、ボルテックスミキサーで２分間撹拌破砕した。破砕液に３００μＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ溶液という。）を添加し、４℃で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）した。その後、上清液４５０μＬを新しいチューブに入れ、これに６００μＬのフェノール混溶液（イージーエクストラクト　ｆｏｒ　ＤＮＡに付属のもの（エイエムアール社製））を加え、１分間ボルテックスミキサーで攪拌した後、４℃で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）した。上清３００μＬを回収して新しいチューブ（１．５ｍＬ）に移し、これに１２００μＬのエタノール（９９．５％）を加えて、４℃で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）した。上清を除いた後、チューブに１０００μＬの冷エタノール（７０％）を加えて、４℃で遠心分離（１３０００ｒｐｍ、５分間）し、得られたＤＮＡペレットを真空乾燥した。乾燥したＤＮＡペレットに１５０μＬのＴＥ溶液を加えたものを、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体中の微生物のＤＮＡ溶液とした。
・１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の増幅
　調製したＤＮＡ溶液中の二本鎖ＤＮＡ濃度を測定し、その測定値に基づいて計算した５０ｎｇのＤＮＡを鋳型として、ユニバーサルプライマーセット（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を用いて、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲはタカラバイオ社製の「Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ」（登録商標）を用いて、各プライマーを５０ｐｍｏｌ含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で２分間のプレヒーティングを行った後、変性、アニーリング、伸長をそれぞれ９８℃×１０秒間、５０℃×３０秒間、７２℃×８０秒間で行い、これを２５サイクル繰り返した。ユニバーサルプライマーセットを用いたＰＣＲにより、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる各種微生物のＤＮＡ断片（約５７０ｂｐ）を増幅した。
　フォワードプライマーには、５’末端側から、配列番号１に記載の塩基配列からなるアダプターＡ配列、１０塩基からなるバーコード配列、配列番号２に記載の塩基配列からなるユニバーサルプライマー配列を有するものを用いた。リバースプライマーには、５’末端側から、配列番号３に記載の塩基配列からなるアダプターＢ配列、配列番号４に記載の塩基配列からなるユニバーサルプライマー配列を有するものを用いた。
・シークエンス解析
　増幅したＰＣＲ産物を、ＤＮＡクリーナー（和光純薬社製）で処理し、ＤＮＡを精製した。精製ＤＮＡは２００μＬのＴＥ溶液で溶出・回収した。回収した精製ＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約５７０ｂｐの位置に検出されるバンドをゲルごと切り出した。切り出したゲルからＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ(キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出し、これをシークエンサーに供するシークエンス用サンプルとした。
　上記シークエンス用サンプルを、ＧＳ　ＦＬＸ＋　Ｓｙｓｔｅｍシークエンサー（ロシュ社製）に供し、シークエンス解析を行った。シークエンスの条件・工程等はメーカー所定のプロトコールに従った。得られた各塩基配列のデータについては、各塩基配列データに含まれるサンプル固有のバーコード配列に基づき、各塩基配列データをそれぞれの固有のサンプルに分類した。その後、塩基配列データの配列長２００塩基未満、１０００塩基以上、ユニバーサルプライマー配列(フォワードプライマー)とのミスマッチ１塩基以上、及びシークエンサーに付属のクオリティプログラムを用いて決定される配列決定した塩基配列データの平均クオリティ値が２５以下の配列データを除去することにより、高精度塩基配列データを抽出した。
・ＯＴＵ解析
　上記高精度塩基配列データを、ＯＴＵ解析に供した。ＯＴＵ解析では、９５％以上の相同性を有する各配列データ同士を同じグループに分類し、複数のグループを形成した。ＯＴＵ解析は、Ｕｃｌｕｓｔを用いて行った。ＯＴＵ解析により得られた情報から、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物の種類の決定及びそれぞれの微生物の存在割合の算出を行った。
（結果）
　対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を各日数培養した後のアンモニア態窒素除去率、窒素処理能力及び対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる硝化細菌（アンモニア酸化細菌（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属）、亜硝酸酸化細菌（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ属））の存在割合をまとめたものを表１に示す。培養中の対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物の遺伝子解析情報によって、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体中に含まれる硝化細菌の存在割合の変化を経時的に測定することができた。また、各種硝化細菌の増加に伴い、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体の窒素処理能力が増加していることも示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２］
（材料）
　培地の製造に用いる成分の濃縮液を以下に示す方法で調製した。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１００ｇを純水　１０００ｍＬに溶解して、無機塩溶液Ａとした。Ｎａ２ＨＰＯ４　４．１５２ｇとＮａＨ２ＰＯ４　２．２４４ｇと（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．２ｇを純水　３００ｍＬに溶解して、無機塩溶液Ｂとした。（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸（純度約８５質量％）１．１８ｇを純水　１００ｍＬに溶解した（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸溶液（１０ｇ／Ｌ）を用いた。無機微粒子担体分散液は、純水２５０ｍｌに活性汚泥焼却灰５０ｇを加えて混合、懸濁させて製造した。活性汚泥懸濁液は、化学工場の曝気槽から活性汚泥を採取したものをそのまま用いた。培養中に供給する培地は、（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．０ｇとＮａ２ＨＰＯ４　１．３ｇとＮａＨ２ＰＯ４　０．９ｇを純水　１０００ｍＬに溶解し、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸溶液　４．０ｍＬ、及び無機塩溶液１　１ｍｌ、無機塩溶液２　１ｍｌ、無機塩溶液３　１ｍＬを加えることにより製造した。培地は、培養期間中に継続して供給するため、適宜、必要量を製造した。その他、培養開始時に用いる炭素源として、メタノールと水を７：３（ｖ／ｖ）程度の割合で含む工場由来副生油を用いた。
（微生物製剤の製造）
　曝気部（容量１Ｌ）及び沈降部（容量０．４Ｌ）を備えるエアリフト型連続反応槽を用いて、微生物製剤の製造を行った。反応槽に、活性汚泥懸濁液５７０ｍＬと無機塩溶液Ａ　４．９ｍＬと無機塩溶液Ｂ　３００ｍＬと工場由来副生油　１３．２μＬと（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸溶液　９．８７６ｍＬと無機微粒子担体分散液と２５０ｍＬ、純水　７０ｍＬを加え、培地を調製した。この培地をエアリフトにより攪拌し、培養を行った。培地は、１０質量％Ｎａ２ＣＯ３溶液を用いて、ｐＨ６．９付近に制御した。水温は２５℃に制御した。以下、反応槽中の培地を培養液という。
　培養開始後、培養液中の（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸濃度を測定し、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸の濃度の顕著な減少が認められたら、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸を所定の濃度含有する培地を連続的に供給して連続培養を行った。追加する培地に含まれる塩類は（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸添加量に応じて増加させた。培養中の対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物の変遷を把握するため、随時、培養中の対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物のＤＮＡ抽出を行った。
（（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸濃度の測定）
　培地中の（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸濃度は、培地を下記の条件でＨＰＬＣに供することで算出した。
・装置：ＬＣ－１０Ａ（島津製作所社製）
・カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ　ＯＤＳ　Ａ－２１１　４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μ（住化分析センター社製）
溶媒：Ａ液　０．０１％　ＴＦＡ水溶液、Ｂ液　アセトニトリル、Ａ液：Ｂ液＝４：６
流速：１．０ｍＬ／分
オーブン温度：４０℃
検出器：ＵＶ　２２０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ
（（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去率の算出）
　反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点での、培養液中に含まれる（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸濃度、供給用培地に含まれる（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸濃度から、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
（（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸処理能力の算出）
　反応槽の沈降部から活性汚泥が沈降分離された培養液を回収した時点での、培地中に含まれる（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸濃度、供給用培地に含まれる（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸濃度、供給用培地の流量、反応槽曝気部の培養液容量から、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸処理能力を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
（微生物の種類の決定及びそれぞれの微生物の存在割合の算出）
　（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解菌の検出及びその存在割合の算出は、培養中の無機微粒子担体に活性汚泥が固着した対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、そのＤＮＡを用いた遺伝子解析情報に基づいて求めた。対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体中の微生物の遺伝子解析情報は実施例１と同様の方法で得た。
（結果）
　対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を各日数培養した後の（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去率、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸処理能力及び対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科）の存在割合をまとめたものを表２に示す。培養中の対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体に含まれる微生物の遺伝子解析情報によって、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性菌の存在割合の変化を経時的に測定することができた。また、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の増加に伴い、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体の（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸処理能力が増加していることも示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例３］
　培地の製造に用いる無機塩溶液は、実施例１と同じ、無機塩溶液１、無機塩溶液２、無機塩溶液３とした。（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸溶液は、実施例２と同じものを用いた。流入水は、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸溶液１ｍＬ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４　１．２９８ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４　０．９１２ｇを純水　１０００ｍＬに溶解し、無機塩溶液１　１ｍｌ、無機塩溶液２　１ｍｌ、無機塩溶液３　１ｍＬを加えることにより製造した。流入水は、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去反応期間中に継続して供給するため、適宜、必要量を製造した。活性汚泥懸濁液は、化学工場の曝気槽から活性汚泥を採取したものをそのまま用いた。
（（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去反応）
　曝気部（容量３Ｌ）及び沈降部（容量１Ｌ）を備えるエアリフト型連続反応槽を用いて、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去反応を行った。（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去反応は、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物製剤が無い条件（Ａ系列）と有る条件（Ｂ系列）の２種類の条件で行った。反応槽に流入水を加え、活性汚泥懸濁液を加え、活性汚泥濃度が２４０８ｍｇ－ＭＬＳＳ／Ｌとなるように調整し、培養液とした。ＭＬＳＳとは、浮遊固形物（Ｍｉｘｅｄ　ｌｉｑｕｏｒＶｏｌａｔｉｌｅ　Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ　Ｓｏｌｉｄ）のことである。Ｂ系列にのみ、更に上清を遠心分離により取り除いた実施例２で製造した、培養後５４日目の（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物製剤を４５９ｍＬ分加え、培養液とした。Ａ系列及びＢ系列の培養液を攪拌し、反応を開始した。流入水は１ｍＬ／分の速度で加えた。流入水は、１０質量％Ｎａ２ＣＯ３溶液を用いて、ｐＨ７付近に制御した。水温は２５℃に制御した。微生物製剤中の微生物の遺伝子解析情報は実施例１と同様の方法で得た。
（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去率及び（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物の測定は、実施例２に記載の方法と同様にして行った。
（結果）
　Ａ系列及びＢ系列における、流入水の（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去率及び（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物の割合をまとめたものを、表３に示す。Ｂ系列では、反応開始時から（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物製剤を加えているため、４．６日目の時点から（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物の割合が高く、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去率も高かった。一方、Ａ系列ではＢ系列に比べ、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸分解性微生物の割合の上昇が遅く、（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸除去率も低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
１…培養槽、２…曝気部分、３…隔壁、４…整流板、５…沈降部分、６…スロープ、７…散気装置、８…空気又は高酸素分圧ガス、９…流入水、１０…排出口、１１…処理水、１００…反応槽

Claims (6)

  1. 　対象化合物分解性微生物を担持する微生物製剤の製造方法であって、
    　対象化合物を含む培地中で、前記対象化合物分解性微生物を含むバイオマスと、無機微粒子担体とを添加し、前記バイオマスに含まれる微生物を前記無機微粒子に担持させ、前記無機微粒子担体に担持された微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を監視しながら、培養する工程と、
    　対象化合物分解性微生物の存在割合が所定の値に到達した後、対象化合物分解性微生物を担持した無機微粒子担体を回収し、微生物製剤を得る工程と、
    を備え、
    　前記対象化合物分解性微生物の存在割合が、
    　前記無機微粒子担体に担持された微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、
    　前記増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、
    を含む方法によって得られる、製造方法。
  2. 　前記対象化合物が（Ｓ）－２－（４－クロロフェニル）－３－メチルブタン酸である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記対象化合物がアンモニアである、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、微生物製剤。
  5. 　請求項４に記載の微生物製剤を用いた、化合物分解方法。
  6. 　請求項４に記載の微生物製剤の評価方法であって、
    　前記微生物製剤に含まれる微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を指標として前記微生物製剤を評価する工程を備え、
    　前記対象化合物分解性微生物の存在割合が、
    　前記微生物製剤に含まれる微生物の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の所定の領域を増幅して増幅産物を得る工程と、
    　前記増幅産物の塩基配列データを解析し、得られた塩基配列データを各塩基配列データ間の相同性に基づいて複数のグループに分け、それぞれのグループの塩基配列データを有する微生物を単一の種類とし、それぞれのグループの代表塩基配列データに基づき、対象化合物分解性微生物の種類を決定し、得られた塩基配列データの数に基づき、すべての微生物における対象化合物分解性微生物の存在割合を算出する工程と、
    を含む方法によって得られる、評価方法。
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