WO2016157250A1 - 動物種鑑別方法及び装置 - Google Patents

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直哉 波多野
尚 的崎
友香理 井土
恒男 高嶋
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国立大学法人神戸大学
一般財団法人カケンテストセンター
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/44—Resins; Plastics; Rubber; Leather
    • G01N33/447—Leather
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides

Definitions

  • the present invention relates to a technique for an objective discrimination method for animal species, and more particularly to a method for specifying the type of leather.
  • Non-Patent Document 1 a method for identifying natural leather fragments by pyrolysis gas chromatography / mass spectrometry that detects a pyrolysis product corresponding to a collagen-derived dipeptide is known (see Non-Patent Document 1).
  • pyrolytic products corresponding to dipeptides derived from Hyp which are not easily inhibited by degradation due to contamination, can be detected as identifiable indicator substances of natural leather.
  • these pyrolytic products are different depending on the species of animals. There is no significant difference and it is difficult to distinguish animal species.
  • an object of the present invention is to provide a discrimination method and a discrimination device that can easily and accurately discriminate animal species for animal skin samples and the like.
  • the animal species discrimination method of the present invention comprises the steps of cleaving an animal fibrous protein group extracted from a sample to be differentiated with a proteolytic enzyme (protease) into peptide fragments, and then the amino acids of the peptide fragments. From the step of analyzing the sequence and from all the analyzed peptide fragments, remove peptide fragments that are commonly detected in all animal species to be distinguished, and select peptide fragments that are specifically detected in at least one animal species And a step of distinguishing the animal species of the sample using the selected peptide fragment.
  • proteolytic enzyme proteolytic enzyme
  • Specimens to be identified include leather of six animal species such as cows, horses, pigs, sheep, goats and deer, leathers such as ostrich, salmon, salmon and crocodiles, and furs such as fox, raccoon and mink.
  • Fibrous proteins are less likely to denature than globular proteins and are known to produce connective tissue, tendons, bones, skeletal muscles, and the like. Examples of fibrillar proteins include collagen, keratin, and elastin.
  • a fibrous protein group is cleaved with a proteolytic enzyme to form a peptide fragment, and then the amino acid sequence of the peptide fragment is analyzed.
  • trypsin can be preferably used, but is not limited thereto.
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • a peptide sequencer detection with a sequence-specific peptide antibody, or the like can be preferably used.
  • the animal species of the sample is differentiated using a peptide fragment that is specifically detected by one specific animal species,
  • the animal species may be identified using a peptide fragment that is specifically detected in at least two or more animal species.
  • LC-MS liquid chromatograph
  • MS mass-to-charge ratio
  • the animal species discrimination method of the present invention is a method for distinguishing animal skins derived from at least one animal selected from 6 kinds of animals such as cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer, it is extracted from a sample to be differentiated.
  • the obtained collagen is digested with trypsin, and the presence or absence of at least one of the peptide fragments of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 38 is discriminated to discriminate the animal species.
  • Collagen I ⁇ 1, Collagen I ⁇ 2, Collagen III ⁇ 1 (hereinafter abbreviated as COL1A1, COL1A2, and COL3A1, respectively), GEPGPAGLPGPPGER (SEQ ID NO: 1), GEPGPTGLPGPPGER (SEQ ID NO: 2), GFPGADGVAGPK (sequence) No.
  • GFPGSDGVAGPK SEQ ID NO: 4
  • GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR SEQ ID NO: 5
  • GLTGPIGPPGPAGAPGDKGETGPSGPAGPTGAR SEQ ID NO: 6
  • GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK SEQ ID NO: 7
  • GETGPAGRPGEAGPPGPPGPAGEK PP No.
  • GP GP
  • 10 SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR
  • SEQ ID NO: 11 SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR
  • GIPGPVGAAGATGAR SEQ ID NO: 13
  • GIPGPAGAAGATGAR SEQ ID NO: 14
  • EGPVGLPGIDGRPGPIGPAGAR SEQ ID NO: 15
  • EGPAGLPGIDGRPGPIGPAGAR PG NO.
  • the peptide fragments of SEQ ID NOs: 1 to 38 are not partial sequences common to all six animal species of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer for COL1A1, COL1A2 and COL3A1, but to at least one animal species It is a partial sequence that exists specifically.
  • the amino acid sequences of the peptide fragments of SEQ ID NOs: 1 to 38 are highly conserved among the six animal species because of the stability of the collagen molecule.
  • the animal species distinguishing method of the present invention is a method for distinguishing animal skins derived from at least one animal selected from 6 kinds of animals of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer, which is extracted from a sample to be differentiated.
  • the presence or absence of at least one of the peptide fragments of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5 to 14, SEQ ID NOs: 19 to 22, and SEQ ID NOs: 25 to 33 is determined with respect to the digested collagen digested with trypsin It is more preferable to discriminate animal species.
  • the peptide fragments having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5 to 14, SEQ ID NOs: 19 to 22, and SEQ ID NOs: 25 to 33 can be stably detected regardless of mass spectrometry equipment.
  • the identification target is a bovine
  • at least one of the peptide fragments of the amino acid sequence of GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR (SEQ ID NO: 5) and IGQPGAVGPAGIR (SEQ ID NO: 31) It is also possible to discriminate the animal species by determining the presence or absence.
  • Peptide fragments of SEQ ID NOs: 5 and 31 are peptide fragments that are specifically found only in cattle among the six kinds of animals of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer. Can be identified.
  • GEPGPAGLPGPPGER SEQ ID NO: 2
  • SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR SEQ ID NO: 11
  • GDGGPPGVTGFPGAAGR SEQ ID NO: 24
  • GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR SEQ ID NO: 26
  • the peptide fragments of SEQ ID NOs: 2, 11, 24, 26, 28, 32, and 37 are peptide fragments that are specific to only horses among 6 kinds of animals of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer. Yes, horses can be identified only with these peptide fragments.
  • the identification target is a pig
  • GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK SEQ ID NO: 8
  • SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR SEQ ID NO: 12
  • GIPGEFGLPGPAGPR SEQ ID NO: 20
  • GEPGPAGSVGPAGAVGPR SEQ ID NO: 29
  • GEMGPAGIPGAPGLMGAR 35 the presence or absence of at least one of the peptide fragments may be determined to identify the pig.
  • Peptide fragments of SEQ ID NOs: 8, 12, 20, 29, 35 and 38 are peptide fragments which are specifically present only in pigs among 6 species of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer. Pigs can be identified only with the peptide fragments.
  • the identification target is a sheep
  • the presence or absence of a peptide fragment of the amino acid sequence of AGEVGPPGPPGPAGEK may be determined to identify the sheep.
  • the peptide fragment of SEQ ID NO: 9 is a peptide fragment that is specific to sheep only among 6 kinds of animals of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer, and sheep are identified only by these peptide fragments. it can.
  • the presence or absence of peptide fragments having the amino acid sequence of GEPGPAGVGPAGAVGPR is discriminated, and the object of differentiation is narrowed down to bovine or deer. It may be a discrimination.
  • the peptide fragment of SEQ ID NO: 27 is a peptide fragment specifically present only in cattle and deer among the six animals of bovine, horse, pig, sheep, goat and deer. You can narrow it down to deer or deer, or you can identify it as cow or deer.
  • the animal species identification method of the present invention when narrowing down the animal species to be identified, at least one of the peptide fragments of the amino acid sequence of GEPGPVGAVGPAGAVGPR (SEQ ID NO: 30) and GFPGSDGVAGPK (SEQ ID NO: 4) It is also possible to discriminate the animal species by discriminating the presence or absence of the animal, narrowing down the object of discrimination to sheep or goats.
  • the peptide fragments of SEQ ID NOs: 4 and 30 are peptide fragments that are specific to only sheep and goats among six animals, bovine, horse, pig, sheep, goat and deer. You can narrow down to sheep or goats or identify them as sheep or goats.
  • the animal species identification method of the present invention when narrowing down the animal species to be differentiated, at least one of the peptide fragments of the amino acid sequence of GIPGPAGAAGATGAR (SEQ ID NO: 14) and GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER (SEQ ID NO: 18) It is also possible to discriminate the animal species by discriminating the presence or absence of the animal, narrowing down the subject of discrimination to horses or pigs.
  • the peptide fragments of SEQ ID NOs: 14 and 18 are peptide fragments that are specific to only horses and pigs among the six species of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer. You can narrow down to a horse or pig, or you can identify a horse or pig.
  • a method for determining the presence or absence of peptide fragments for example, the mass of precursor ions and product ions of peptide fragments by tandem mass (MS / MS) analysis using a liquid chromatograph-mass spectrometer (LC-MS).
  • the charge ratio (m / z) can be measured to determine the presence or absence of peptide fragments.
  • animal species can be easily identified by paying attention only to a total of 5 peaks of 3 peaks of COL1A1 and 2 peaks of COL1A2 in the measurement result of mass to charge ratio (m / z). Is possible.
  • the animal species discrimination device of the present invention is an animal skin discrimination device derived from at least one animal selected from six kinds of animals of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer, which is extracted from a sample to be differentiated. Characterized in that it comprises means for discriminating the presence or absence of at least any of the peptide fragments of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 38 from the digested collagen digested with trypsin, and distinguishing animal species It is an animal species discrimination device.
  • the animal species discrimination device of the present invention is an animal skin discrimination device derived from at least one animal selected from six species of cattle, horses, pigs, sheep, goats and deer, and is a sample to be differentiated. Presence or absence of at least one of the peptide fragments of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5 to 14, SEQ ID NOs: 19 to 22, and SEQ ID NOs: 25 to 33 with respect to collagen extracted from trypsin It is an animal species discrimination device characterized by comprising means for discriminating and distinguishing animal species.
  • the means for determining the presence or absence of peptide fragments is the mass-to-charge ratio of precursor ions and product ions of peptide fragments by tandem mass (MS / MS) analysis using a liquid chromatograph-mass spectrometer (LC-MS). It is preferable to measure (m / z) and determine the presence or absence of peptide fragments.
  • the discrimination method or the discrimination apparatus of the present invention it becomes possible to analyze a fibrous protein group extracted from an animal leather sample, etc., and to easily and accurately discriminate animal species, and to display the quality display of leather products. It has the effect of being able to do exactly.
  • the discrimination method of the present invention can be used as an international standard in a situation in which miscellaneous goods including clothing are traded globally, as well as complementing the conventional microscopy. .
  • Flow chart of the animal species discrimination method of the present invention Flow chart of animal species discrimination method of Example 1 (1) Flow chart of animal species identification method of Example 1 (2) Six animal species identification process flow chart Cattle identification process flow chart Horse identification process flow chart Pig identification process flow chart Sheep identification process flow diagram Horse or deer identification process flow chart Sheep or goat identification process flow diagram Horse or pig identification process flow diagram
  • an animal fibrous protein group is extracted from a sample to be differentiated (step S101), and the fibrous protein group is cleaved with a proteolytic enzyme (protease) to form a peptide fragment.
  • a proteolytic enzyme proteease
  • Decompose step S102
  • analyze the amino acid sequence of the peptide fragment step S103.
  • peptide fragments that are detected in common for all animal species to be identified are excluded from all analyzed peptide fragments (step S104). Therefore, peptide fragments that are specifically detected in at least one animal species are selected (step S105), and the animal species of the sample is differentiated using the selected peptide fragments (step S106).
  • animal species are identified with respect to natural leather of six kinds of animals such as cows, horses, pigs, sheep, goats and deer.
  • collagen which is a skin tissue and main fibers.
  • Animal skin consists of the epidermis layer, the dermis layer, and the underlying subcutaneous connective tissue.
  • the skin layer is composed of four layers such as a stratum corneum and a granule layer, and is an unnecessary layer for leather and is removed.
  • elastin fibers in the nipple layer and subcutaneous tissue are also almost removed by mechanical operations and chemical treatments during the manufacturing process.
  • the dermis layer is divided into a nipple layer (silver surface layer) and a mesh layer.
  • the uppermost layer of the dermis layer is a silver surface layer called leather, and in this layer, fibers that are much finer than the mesh layer are entangled densely, and most of the fibers run in the horizontal direction. Therefore, the leather silver surface layer is denser than the network layer, and the elongation and moisture permeability are poor.
  • the amino acid sequence of collagen is specific compared to other proteins.
  • the primary structure is characterized by repeating Gly-XY, and glycine exists every 3 residues.
  • X and Y are arbitrary amino acids, but the frequency of occupying X and Y differs depending on the type.
  • Collagen molecules are formed by combining three polypeptide chains ( ⁇ chains) of about 1000 amino acids (molecular weight of about 100,000) consisting of such three sets of repeats. The triple-stranded structure is very strong and is not degraded by enzymes.
  • type I collagen is the most in quantity, reaching 80 to 90% of the total collagen.
  • the discrimination target sample used in the experiment will be described.
  • the specimens to be identified are mainly chrome leather with a large circulation volume for 6 types of animals (cow, horses, pigs, sheep, goats, deer) that are subject to display of clothing. The colors were dark and light.
  • tanned leather was added, and dark-dyed products and samples with finishing agents that were difficult to extract by the DNA method were used for processing, and clear leather with a clear history was selected.
  • FIG.2 and FIG.3 the flow of the 6 types of animal species discrimination method with respect to said discrimination target sample is demonstrated in detail.
  • Step S01 Leather degreasing process>
  • the sample was immersed in diethyl ether (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and washed for 2 hours so that it circulated 6 times or more per hour.
  • the sample was allowed to stand so that diethyl ether evaporated, and then immersed in pure water for 1 hour.
  • the bath ratio used in this case is 100: 1 and is occasionally mixed. After removing excess water from the sample, the sample was allowed to stand and air dried.
  • Step S02 leather crushing process> Using a freeze pulverizer (manufactured by Nihon Analytical Industries; JFC-300), the washed fiber was frozen with liquid nitrogen and pulverized for 15 minutes.
  • ⁇ Step S03 Enzymatic digestion process of leather> The sample is weighed to about 0.5 mg, transferred to a tube, 500 mM of 25 mM ammonium hydrogen carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to each tube, treated at 1250 rpm for 1 hour at 60 ° C. using an incubator, and 10 minutes. Allowed to stand at room temperature. 20 ⁇ g trypsin (for protein sequencing manufactured by Promega) was dissolved in 50 ⁇ L of 25 mM ammonium bicarbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and added to each tube. The enzyme reaction was performed at 37 ° C. and 250 rpm for 18 hours using an incubator.
  • ⁇ Step S04 Purification / concentration step of digested peptide>
  • a sample (about 550 ⁇ L) was filtered for 10 minutes at 4900 ⁇ g at 4 ° C. using a 0.22 ⁇ m filter (manufactured by Takara Bio; SUPRECTM-01). Thereafter, the sample was frozen at ⁇ 80 ° C. for 10 minutes and vacuum freeze-dried at ⁇ 50 ° C. overnight using a freeze dryer (manufactured by Tokyo Science Instruments; EYELAFDU-1200). Next, the sample was dissolved in 0.1% formic acid, vortexed, and then centrifuged a little and sonicated for 5 minutes.
  • the sonicated sample was filtered again at 4900 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. using a 0.22 ⁇ m filter, and 2 ⁇ L of the collected sample was used for LC-MS / MS analysis. Formic acid was used for LCMS.
  • Step S05 Mass Spectrometry Process>
  • a high performance liquid chromatograph ion trap-time-of-flight mass spectrometer manufactured by Shimadzu Corp .; LCMS-IT-TOF
  • a triple quadrupole LCMS / MS system manufactured by Agilent Technologies; G6460 QQQ LC-MS
  • Step S06 Step of searching for peptide fragments> Peptide fragments characteristic of animal species were searched using Error Tolerant Search (search allowing for mass difference of precursor ions) in LCMS-IT-TOF protein identification software (Mascot).
  • cysteine modification (alkylation) is removed as a parameter for protein post-translational modification, and not only Oxidation (M) generally used but also Oxidation (P) And Oxidation (K).
  • item AA in the following table indicates the amino acid sequence number corresponding to the bovine amino acid sequence
  • item Ox indicates the total number of amino acids to be oxidatively modified
  • item m / z is mainly detected.
  • the mass-to-charge ratio of ions is shown, and the item Mr (calc) shows the theoretical molecular weight (monoisotopic mass).
  • amino acid sequence of the detected peptide fragment was highly conserved among animal species, indicating the stability of the collagen molecule.
  • partial amino acid sequence analysis showed slight differences such as single residues (A) and (V).
  • Pigs are identified by focusing on specific m / z 654.7 or m / z 774.8.
  • Sheep and goats are identified by focusing on the difference that sheep show specific m / z 724.9 and goats show specific m / z 739.3.
  • keratin is extracted from fur such as fox, raccoon, mink (step S101).
  • the extracted keratin is degraded with a keratin-degrading enzyme (step S102). Trypsin can be used as the keratin degrading enzyme.
  • the amino acid sequence of the peptide fragment is analyzed (step S103), the peptide fragment that is commonly detected in all the animal species to be identified is excluded (step S104), and the peptide species is specifically detected.
  • a peptide fragment to be detected is selected (step S105).
  • the animal species of the sample is differentiated using the selected peptide fragment (step S106).
  • the presence or absence of a peptide fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 38 It can be identified and identified as a pig.
  • the object of discrimination is a sheep, as shown in FIG. 8, the presence or absence of a peptide fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 can be discriminated to identify a sheep.
  • the presence or absence of the peptide fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 can be determined to narrow down the identification target to cows or deer.
  • the present invention is useful for distinguishing animal species of natural leather.

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Abstract

【課題】ペプチド分析による動物種同定により、動物種についての客観的な鑑別方法および鑑別装置を提供する。 【解決手段】鑑別対象試料から抽出した動物の線維状タンパク質群（コラーゲンなど）を、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップと、解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除き、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出するステップと、選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別するステップを備える。選出されたペプチド断片の中で、先ず、特定の１種の動物種に特異的に検出されるペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別し、次に、鑑別できなかった試料に対して、少なくとも２種以上の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を用いて動物種を鑑別する。

Description

動物種鑑別方法及び装置
　本発明は、動物種についての客観的な鑑別方法の技術に関するものであり、特に、皮革の種類を特定する方法に関する。
　革製の鞄，衣料，手袋，家具については、家庭用品品質表示法により雑貨工業品品質表示規定が定められている。そのうち、革または合成皮革を製品の全部または一部に使用して製造した衣料については、表示対象となる動物６種（ウシ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウマ，シカ）の鑑別が必須となっている。
　昨今は、品質表示を適正に行うために、製品の流通段階で確実な畜種の判定を求められることが増えている。しかし、現状のところ鑑別の公定法は無い。これら雑貨工業品に係る表示に関して、試験や検査で一般的に用いられる鑑別方法としては、外観観察（厚さ，大きさ，色や柄，毛並み，艶，感触など）、顕微鏡観察（毛穴配列，断面構造，毛小皮紋理，毛髄質など）、機器分析（元素，成分，染料，薬剤分析など）、ＤＮＡ鑑別が挙げられる（例えば特許文献１）。
　ここで、外観観察は、長年の経験を必要とし、また客観的，科学的根拠に乏しく説得力に欠けるという問題がある。また、顕微鏡観察は、現在の主流であるが、繊維構造や銀面模様の差がわかりにくい場合などは判別を迷うケースも多く問題がある。また、機器分析は、あくまでも補助的な方法であり、単独での判別は困難である。そして、ＤＮＡ鑑別については、食肉や穀物等では精度が高く再現性もあるため広く利用されているものの、皮革でのＤＮＡ鑑別は実用化に至っていない。その理由としては、皮革の製造工程にある石灰脱毛や再石灰漬けで皮繊維をほぐす作業中にＤＮＡが損傷し、抽出が困難となり、ＤＮＡが検出されないことがあるからである。また、例えばクロムなめし革については、酵素分解促進のために脱クロム処理をすることが、却ってＤＮＡを損傷してしまうこともある。このようにＤＮＡの検出は容易ではなく、ＤＮＡ鑑別による方法は、通常業務で使用するまでには至っていないのが現状である。
　機器分析による方法として、コラーゲン由来のジペプチド相当の熱分解生成物を検出する熱分解ガスクロマトグラフィー／質量分析法による天然皮革片の同定方法が知られている（非特許文献１を参照）。この同定方法では、天然皮革の同定可能な指標物質として、汚染による分解の阻害は受けにくいＨｙｐ由来のジペプチド相当の熱分解生成物が検出できるが、それらの熱分解生成物は動物種の違いにより顕著な差はなく、動物種の鑑別は困難である。
特開２００３－１２５７８１号公報
倉田正治，"熱分解ガスクロマトグラフィー／質量分析法による天然皮革微小片の同定方法"，BUNSEKI KAGAKU Vol.57, No.7, pp.563-569 (2008)
　上記状況に鑑みて、本発明は、動物の皮革試料などについて、簡便に精度よく動物種を鑑別できる鑑別方法および鑑別装置を提供することを目的とする。
　上記目的を達成すべく、本発明の動物種鑑別方法は、鑑別対象試料から抽出した動物の線維状タンパク質群を、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップと、解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除き、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出するステップと、選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別するステップを備えることを特徴とする。
　鑑別対象試料は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカの６種の動物種の皮革や、オーストリッチ、サーモン、鯉、ワニ等の皮革、フォックス、ラクーン、ミンク等の毛皮などである。線維状タンパク質は、球状タンパク質に比べて変性し難く、結合組織、腱、骨、骨格筋などを作ることが知られている。線維状タンパク質の例としては、コラーゲン、ケラチン、エラスチンなどがある。線維状タンパク質群を、タンパク質分解酵素で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析する。タンパク質分解酵素としては、トリプシンを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。ペプチド断片のアミノ酸配列を解析する方法として、質量分析法（mass spectrometry）、ペプチドシーケンサー、配列特異的なペプチド抗体による検出などが好適に用いることができる。
　本発明の動物種鑑別方法において、選出されたペプチド断片の中で、先ず、特定の１種の動物種に特異的に検出されるペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別し、次に、鑑別できなかった試料に対して、少なくとも２種以上の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を用いて動物種を鑑別することでもよい。
　最初に、特定の１種の動物種に特異的に検出されるペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別することにより、効率よく、鑑別対象試料の動物種を鑑別することが可能になる。すなわち、特定の１種の動物種にのみ、特異的に検出されるペプチド断片があるならば、そのペプチド断片の有無を判別し、そのペプチド断片が見つかれば特定の１種の動物種に同定できるのである。
　上記のアミノ酸配列を解析するステップにおいて、質量分析法により解析する場合、具体的には、液体クロマトグラフ（liquid chromatograph；ＬＣ）－質量分析計（mass spectrometer；ＭＳ）（ＬＣ－ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、アミノ酸配列を解析してペプチド断片を同定する。
　本発明の動物種鑑別方法では、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法である場合、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号１～３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別する。
　すなわち、Ｃｏｌｌａｇｅｎ I α１，Ｃｏｌｌａｇｅｎ I α２，Ｃｏｌｌａｇｅｎ III α１（以下、それぞれ、ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＣＯＬ３Ａ１と略する）の部分配列である、GEPGPAGLPGPPGER（配列番号１）、GEPGPTGLPGPPGER（配列番号２）、GFPGADGVAGPK（配列番号３）、GFPGSDGVAGPK（配列番号４）、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR（配列番号５）、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGETGPSGPAGPTGAR（配列番号６）、GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号７）、GETGPAGRPGEAGPPGPPGPAGEK（配列番号８）、AGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号９）、SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１０）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１１）、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR（配列番号１２）、GIPGPVGAAGATGAR（配列番号１３）、GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）、EGPVGLPGIDGRPGPIGPAGAR（配列番号１５）、EGPAGLPGIDGRPGPIGPAGAR（配列番号１６）、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGKPGER（配列番号１７）、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）、GIPGEFGLPGPAGAR（配列番号１９）、GIPGEFGLPGPAGPR（配列番号２０）、GPPGESGAAGPTGPIGSR（配列番号２１）、GPPGESGAAGPAGPIGSR（配列番号２２）、GDGGPPGATGFPGAAGR（配列番号２３）、GDGGPPGVTGFPGAAGR（配列番号２４）、GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２５）、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２６）、GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）、GEPGPVGSVGPVGAVGPR（配列番号２８）、GEPGPAGSVGPAGAVGPR（配列番号２９）、GEPGPVGAVGPAGAVGPR（配列番号３０）、IGQPGAVGPAGIR（配列番号３１）、SGQPGTVGPAGVR（配列番号３２）、TGQPGAVGPAGIR（配列番号３３）、GEMGPAGIPGAPGLIGAR（配列番号３４）、GEMGPAGIPGAPGLMGAR（配列番号３５）、GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR（配列番号３６）、GSPGPQGPPGVPGPSGLIGITGAR（配列番号３７）、及び、GSPGPQGPPGAPGPGGISGITGAR（配列番号３８）のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物種を鑑別する。
　配列番号１～３８のペプチド断片は、ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２及びＣＯＬ３Ａ１について、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物種全てに共通する部分配列ではなく、少なくとも１種の動物種に特異的に存在する部分配列である。配列番号１～３８のペプチド断片のアミノ酸配列は、コラーゲン分子の安定性から、６種の動物種間において保存性が高いものである。
　本発明の動物種鑑別方法では、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号５～１４、配列番号１９～２２、及び配列番号２５～３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することがより好ましい。
　配列番号５～１４、配列番号１９～２２、及び配列番号２５～３３のアミノ酸配列のペプチド断片によれば、質量分析機器によらず、安定的に検出できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がウシである場合は、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR（配列番号５）、及び、IGQPGAVGPAGIR（配列番号３１）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し動物種を鑑別することでもよい。
　配列番号５及び３１のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウシのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウシを同定できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がウマである場合は、GEPGPAGLPGPPGER（配列番号２）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１１）、GDGGPPGVTGFPGAAGR（配列番号２４）、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２６）、GEPGPVGSVGPVGAVGPR（配列番号２８）、SGQPGTVGPAGVR（配列番号３２）、及び、GSPGPQGPPGVPGPSGILGLTGAR（配列番号３７）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別することでもよい。
　配列番号２，１１，２４，２６，２８，３２及び３７のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウマのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウマを同定できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がブタである場合は、GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号８）、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR（配列番号１２）、GIPGEFGLPGPAGPR（配列番号２０）、GEPGPAGSVGPAGAVGPR（配列番号２９）、GEMGPAGIPGAPGLMGAR（配列番号３５）、及び、GSPGPQGPPGAPGPGGISGITGAR（配列番号３８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別することでもよい。
　配列番号８，１２，２０，２９，３５及び３８のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの動物６種の中で、ブタのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ブタを同定できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がヒツジである場合は、AGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号９）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別することでもよい。
　配列番号９のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ヒツジのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ヒツジを同定できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別することでもよい。
　配列番号２７のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウシとシカだけに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウシかシカに絞り込むか、或は、ウシかシカに同定できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPVGAVGPAGAVGPR（配列番号３０）、及び、GFPGSDGVAGPK（配列番号４）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込み、動物種を鑑別することでもよい。
　配列番号４及び３０のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ヒツジとヤギだけに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ヒツジかヤギに絞り込むか、或は、ヒツジかヤギに同定できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）、及び、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別することでもよい。
　配列番号１４及び１８のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウマとブタだけに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウマかブタに絞り込むか、或は、ウマかブタに同定できる。
　本発明の動物種鑑別方法において、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、下記１）～５）のステップを行うことが好ましい。
１）配列番号５、配列番号２７及び配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウシを同定するステップ
２）配列番号２７及び配列番号３３のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してシカを同定するステップ
３）配列番号１１又は配列番号２８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウマを同定するステップ
４）配列番号１２又は配列番号２９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してブタを同定するステップ
５）上記１～４のステップを行っても、未だ同定されていない残りの試料に対して、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヒツジを同定し、配列番号７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヤギを同定するステップ
　ここで、ペプチド断片の有無を判別する方法として、例えば、液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、ペプチド断片の有無を判別できる。
　上記１）～５）のステップでは、質量電荷比（ｍ／ｚ）の測定結果で、ＣＯＬ１Ａ１の３つのピークとＣＯＬ１Ａ２の２つのピークの計５ピークのみに着目することにより簡便に動物種の同定が可能になる。
　次に、本発明の動物種鑑別装置について説明する。
　本発明の動物種鑑別装置は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号１～３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置である。
　また、本発明の動物種鑑別装置は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号５～１４、配列番号１９～２２、及び配列番号２５～３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置である。
　ここで、ペプチド断片の有無を判別する手段は、液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、ペプチド断片の有無を判別するのが好ましい。
　本発明の鑑別方法もしくは鑑別装置によれば、動物の皮革試料などから抽出した線維状タンパク質群を分析して、簡便に精度よく動物種を鑑別することが可能になり、皮革製品の品質表示を的確に行えるといった効果を有する。本発明の鑑別方法は、従来から主流となっている顕微鏡法を補完するに留まらず、衣料を含む雑貨工業品等がグローバルに取引される状況下で、国際標準として利用することが可能である。
本発明の動物種鑑別方法のフロー図 実施例１の動物種鑑別方法のフロー図（１） 実施例１の動物種鑑別方法のフロー図（２） ６種の動物種の鑑別処理フロー図 ウシの同定処理フロー図 ウマの同定処理フロー図 ブタの同定処理フロー図 ヒツジの同定処理フロー図 ウマ又はシカの同定処理フロー図 ヒツジ又はヤギの同定処理フロー図 ウマ又はブタの同定処理フロー図
　以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
　本発明の動物種鑑別方法のフローを図１に示す。
　上述したように、本発明の動物種鑑別方法では、鑑別対象試料から動物の線維状タンパク質群を抽出し（ステップＳ１０１）、線維状タンパク質群をタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片に分解し（ステップＳ１０２）、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析する（ステップＳ１０３）。次に、解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を除外する（ステップＳ１０４）。
　そこで、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出し（ステップＳ１０５）、その選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別する（ステップＳ１０６）。
　本実施例では、ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカの６種の動物の天然皮革に関して、動物種を鑑別する例について説明する。
　先ず、天然皮革の動物種に関して、皮の組織および主要な繊維であるコラーゲンについて説明する。動物皮は、表皮層，真皮層並びにその下の皮下結合組織からなっている。表皮層は角質層、顆粒層など４層からなっており、革としては不用な層であり除去される。また、乳頭層中および皮下組織中のエラスチン繊維も、製造工程中の機械的操作や薬品処理でほとんど除去される。さらに、毛を構成するケラチンは、毛皮の場合を除き革の製造には不用で、石灰付け処理で分解除去される。よって、革を構成する繊維は、コラーゲン線維が大部分を占める。真皮層は乳頭層（銀面層）と網状層に分かれる。真皮層の最上層は革でいう銀面層に当たり、この層は網状層より遥かに細かい繊維が緻密に交絡し、繊維の多くは水平方向に走行している。そのため、革の銀面層は網状層に比べ組織が緻密であり、伸びや水分透過性は悪くなる。
　コラーゲンのアミノ酸配列は、他のタンパク質に比べて特異的である。アミノ酸配列について、１次構造の特徴がＧｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返しで、３残基ごとにグリシンが存在する。Ｘ，Ｙは任意のアミノ酸であるが、その種類によりＸ，Ｙを占める頻度は異なっている。このような３つの組の繰り返しからなるアミノ酸約１０００残基（分子量約１０万）のポリペプチド鎖（α鎖）が３本より合わさってできているのが、コラーゲン分子である。３本鎖構造は非常に強固であり酵素においても分解されない。
　コラーゲン構造を作っている分子種は、少なくとも６種類（Ｉ～Ｖ型とＩ型トリマー）ある。コラーゲン分子を構成しているポリペプチド鎖は８種類知られており、この中で量的に最も多いものはＩ型コラーゲンであり、全コラーゲンの８０～９０％の量に達する。
　次に、実験で使用した鑑別対象試料について説明する。鑑別対象試料は、家庭用品品質表示法雑貨工業品規定により、衣料品の表示対象となる動物６種（ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカ）について、流通量の多いクロムなめし革を主とし、色は濃色と淡色でおこなった。なお、タンニンなめし革も加え、加工ではＤＮＡ法で抽出困難とされる濃色染色品や仕上げ剤の施された試料も用いることとし、履歴が曖昧でなく明確な革を選定した。
　以下では、図２及び図３を参照して、上記の鑑別対象試料に対する６種の動物種鑑別方法のフローについて詳細に説明する。
＜ステップＳ０１：皮革の脱脂工程＞
　ジエチルエーテル（和光純薬製）中に試料を浸漬し、１時間に６回以上循環するようにして２時間洗浄した。ジエチルエーテルが蒸発するよう試料を静置した後、純水に１時間浸漬した。この場合に使用する浴比は１００：１とし、時々かき混ぜる。試料から余分な水を除去した後、試料を静置し自然乾燥した。
＜ステップＳ０２：皮革の粉砕工程＞
　冷凍粉砕機（日本分析工業製；ＪＦＣ－３００）を使用して、洗浄した繊維を液体窒素で凍結させ１５分間粉砕した。
＜ステップＳ０３：皮革の酵素消化工程＞
　試料を約０．５ｍｇに秤量しチューブに移し、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム（和光純薬製）を各チューブに対して５００μＬずつ加え、６０℃でインキュベーターを用い１２５０ｒｐｍにて１時間処理を行い、１０分間室温にて静置した。２０μｇトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ製タンパク質配列決定用）を５０μＬの２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム（和光純薬製）で溶かし、各チューブに加えた。インキュベーターを用い３７℃，２５０ｒｐｍにて１８時間酵素反応を行った。
＜ステップＳ０４：消化ペプチドの精製・濃縮工程＞
　試料（約５５０μＬ）を０．２２μｍフィルター（タカラバイオ製；ＳＵＰＲＥＣＴＭ－０１）を用いて４℃下４９００ｘｇで１０分間フィルトレーションした。その後、試料を－８０℃で１０分間凍結し、凍結乾燥機（東京理科器械製；ＥＹＥＬＡＦＤＵ－１２００）を用いて、－５０℃で真空凍結乾燥をオーバーナイトで行った。
　次に、試料を０．１％ギ酸で溶解し、ボルテックスした後、少々遠心して５分間ソニケーションをおこなった。ソニケーションした試料は、再び０．２２μｍフィルターを用いて４℃下４９００ｘｇで１０分間フィルトレーションし、採取した試料のうち２μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析に用いた。ギ酸はＬＣＭＳ用を用いた。
＜ステップＳ０５：質量分析工程＞
　質量分析には、高速液体クロマトグラフイオントラップ型－飛行時間型質量分析計（島津製作所製；ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ）ならびにトリプル四重極ＬＣＭＳ／ＭＳシステム（アジレント・テクノロジー製；Ｇ６４６０　ＱＱＱ　ＬＣ－ＭＳ）を使用した。
＜ステップＳ０６：ペプチド断片の探索工程＞
　ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦタンパク質同定ソフト（Ｍａｓｃｏｔ）にあるＥｒｒｏｒ　Ｔｏｌｅｒａｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ（プレカーサーイオンの質量の違いを許容する検索）を用い、動物種に特徴的なペプチド断片を探索した。なお、ヒドロキシプロリン，ヒドロキシリジンを含むペプチドを検索可能にするため、タンパク質翻訳後修飾のパラメーターで、システイン修飾（アルキル化）を外し、一般的に用いるＯｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）のみならず、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｐ）およびＯｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｋ）を加えた。
　６種（ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカ）について、特異的なペプチド断片が有るかについての結果は以下の通りである。
（Ａ）ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ
　ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦで分析後おこなったＭａｓｃｏｔサーチで、主にコラーゲン３種（ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＣＯＬ３Ａ１）が検出された。そこで各コラーゲンについて、６種の動物種でアミノ酸配列が異なる部分を選出した。ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＣＯＬ３Ａ１それぞれの結果を、表１，２，３に示す。なお、下記表中の項目ＡＡの表記はウシのアミノ酸配列に相当するアミノ配列の番号を示し、項目Ｏｘは酸化修飾されるアミノ酸の数の総和を示し、項目ｍ／ｚは主に検出されるイオンの質量電荷比を示し、項目Ｍｒ(calc)は 理論分子量（モノアイソトピック質量)を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　検出されたペプチド断片のアミノ酸配列は動物種間において保存性が高く、コラーゲン分子の安定性を示していた。しかし、部分アミノ酸シークエンス分析により、一残基（Ａ）と（Ｖ）など僅かな違いが認められた。
　なお、配列番号１９と同じ質量電荷比、同じ理論分子量のアミノ酸配列が、既存のデータベースに存在する。すなわち、GIPGEFGLPGPAGAR（配列番号１９）とは異なるアミノ酸配列のGLPGEFGLPGPAGAR（配列番号３９）が存在する。これは、ロイシン（Ｌ）とイソロイシン（Ｉ）は同じ分子量で、質量としては差異がないからである。同様に、配列番号３４と同じ質量電荷比、同じ理論分子量のアミノ酸配列が、既存のデータベースに存在する。GEMGPAGIPGAPGLIGAR（配列番号３４）とは異なるアミノ酸配列のGEMGPAGIPGAPGLLGAR（配列番号４０）が存在する。
（Ｂ）ＱＱＱ　ＬＣ－ＭＳ
　ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ分析結果より明らかとなった動物種同定が可能なペプチド断片のうち、ＱＱＱ　ＬＣ－ＭＳ分析で安定して検出されたペプチド断片を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＱＱＱ　ＬＣ－ＭＳにて皮革動物種鑑別試験をルーチンでおこなう場合、表４に示した特異的なペプチド断片をさらに絞り込むことで動物種の同定が簡便化できる。ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカの６種の動物の皮革であれば、ＣＯＬ１Ａ１の３ピークならびにＣＯＬ１Ａ２の２ピークの計５ピークのみに着目することで簡便に動物種の同定が可能となる。　
　ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカの６種の動物の皮革の同定の手順の一例を説明する。
（１）先ず、最も流通量の多いウシに特異的に検出されるｍ／ｚ９５１．８，６０４．８，７６７に着目し、ウシを同定する。
（２）この時、ｍ／ｚ７６７はシカにも共通に検出されるが、シカはｍ／ｚ５９０．８も特異的であるから、これらの検出有無によりシカを同定する。
（３）ウマは、特異的ｍ／ｚ６４９．３あるいはｍ／ｚ８０２．９に着目し同定する。なお、確認のために、ｍ／ｚ５９１．８の有無を確認しても良い。
（４）ブタは、特異的ｍ／ｚ６５４．７あるいはｍ／ｚ７７４．８に着目し、同定する。
（５）ヒツジとヤギは、ヒツジが特異的ｍ／ｚ７２４．９を示し、ヤギが特異的ｍ／ｚ７３９．３を示すという違いに着目して、これらを同定する。
　動物６種（ウシ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウマ，シカ）の天然皮革について、上記（１）～（５）の同定の手順を用いて動物種を鑑別した結果と、ＬＣＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦを用いて鑑別した結果を比較した。試料は各動物種につき３～５タイプ準備し、解析精度を評価したところ、ほぼ１００％と高い割合で解析できることがわかった。
　ＤＮＡ鑑別法やＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳを用いた分析では、皮革の加工段階での薬剤による損傷や染料、なめし剤等の來雑物が原因で鑑別が困難であるが、本発明の動物種鑑別方法では、いずれの課題も解決されており実用の可能性がある。
　本実施例では、フォックス，ラクーン，ミンク等の毛皮に関して、動物種を鑑別する例について説明する。フォックス，ラクーン，ミンク等の毛皮に対する動物種鑑別方法のフローについても、実施例１と同様に図１のフローに従う。
　先ず、フォックス，ラクーン，ミンク等の毛皮からケラチンを抽出する（ステップＳ１０１）。抽出したケラチンをケラチン分解酵素で分解する（ステップＳ１０２）。ケラチン分解酵素としては、トリプシンを用いることができる。
　そして、実施例１と同様に、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析し（ステップＳ１０３）、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を除外し（ステップＳ１０４）、動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出する（ステップＳ１０５）。そして、選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別する（ステップＳ１０６）。
（その他の実施例）
（１）鑑別対象がウシである場合、図５に示すように、配列番号５又は配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しウシであることを鑑別できる。
（２）鑑別対象がウマである場合、図６に示すように、配列番号２、配列番号１１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２又は配列番号３７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別できる。
（３）鑑別対象がブタである場合、図７に示すように、配列番号８、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３５又は配列番号３８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別できる。
（４）鑑別対象がヒツジである場合、図８に示すように、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別できる。
（５）鑑別対象の動物種を絞り込む際、図９に示すように、配列番号２７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込むことができる。
（６）鑑別対象の動物種を絞り込む際に、図１０に示すように、配列番号４又は配列番号３０のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込むことができる。
（７）鑑別対象の動物種を絞り込む際、図１１に示すように、配列番号１４又は配列番号１８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込むことができる。
　本発明は、天然皮革の動物種の鑑別に有用である。

Claims (21)

  1. 　鑑別対象試料から抽出した動物の線維状タンパク質群を、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップと、
    　解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除き、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出するステップと、
    　選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別するステップ、
    を備える動物種鑑別方法。
  2. 　選出された前記ペプチド断片について、特定の１種の動物種にのみ特異的に検出されるペプチド断片に基づき試料の動物種を鑑別することを特徴とする請求項１に記載の動物鑑別方法。
  3. 　選出された前記ペプチド断片について、特定の１種の動物種にのみ特異的に検出されるペプチド断片に基づき試料の動物種を鑑別した後、未だ鑑別できない試料に対して、少なくとも２種以上の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を用いて動物種を鑑別することを特徴とする請求項１に記載の動物種鑑別方法。
  4. 　前記線維状タンパク質群がコラーゲンであることを特徴とする請求項１～３の何れかに記載の動物種鑑別方法。
  5. 　タンパク質分解酵素がトリプシンであることを特徴とする請求項１～４の何れかに記載の動物種鑑別方法。
  6. 　上記のペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップにおいて、質量分析法により解析することを特徴とする請求項１～５の何れかに記載の動物種鑑別方法。
  7. 　前記質量分析は、液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、アミノ酸配列を解析してペプチド断片を同定することを特徴とする請求項６に記載の動物種鑑別方法。
  8. 　前記鑑別対象試料が、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮であることを特徴とする請求項１～７の何れかに記載の動物種鑑別方法。
  9. 　ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
    　鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
    　配列番号１～３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別方法。
  10. 　配列番号５～１４、配列番号１９～２２、及び配列番号２５～３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９に記載の動物種鑑別方法。
  11. 　鑑別対象がウシである場合、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR（配列番号５）、及び、IGQPGAVGPAGIR（配列番号３１）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し動物種を鑑別することを特徴とする請求項８又は９に記載の動物種鑑別方法。
  12. 　鑑別対象がウマである場合において、GEPGPAGLPGPPGER（配列番号２）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１１）、GDGGPPGVTGFPGAAGR（配列番号２４）、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２６）、GEPGPVGSVGPVGAVGPR（配列番号２８）、SGQPGTVGPAGVR（配列番号３２）、及び、GSPGPQGPPGVPGPSGILGLTGAR（配列番号３７）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
  13. 　鑑別対象がブタである場合において、GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号８）、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR（配列番号１２）、GIPGEFGLPGPAGPR（配列番号２０）、GEPGPAGSVGPAGAVGPR（配列番号２９）、GEMGPAGIPGAPGLMGAR（配列番号３５）、及び、GSPGPQGPPGAPGPGGISGLTGAR（配列番号３８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
  14. 　鑑別対象がヒツジである場合において、AGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号９）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
  15. 　鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
  16. 　鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPVGAVGPAGAVGPR（配列番号３０）、及び、GFPGSDGVAGPK（配列番号４）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
  17. 　鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）、及び、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
  18. 　ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
    　鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
    １）配列番号５、配列番号２７及び配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウシを同定するステップと、
    ２）配列番号２７及び配列番号３３のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してシカを同定するステップと、
    ３）配列番号１１又は配列番号２８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウマを同定するステップと、
    ４）配列番号１２又は配列番号２９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してブタを同定するステップと、
    ５）未だ同定されていない残りの試料に対して、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヒツジを同定し、配列番号７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヤギを同定するステップ、
    を行うことを特徴とする動物種鑑別方法。
  19. 　上記のペプチド断片の有無の判別において、液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定してペプチド断片の有無を判別することを特徴とする請求項９～１８の何れかに記載の動物種鑑別方法。
  20. 　ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、
    　鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
    　配列番号１～３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置。
  21. 　ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、
    　鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
    　配列番号５～１４、配列番号１９～２２、及び配列番号２５～３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置。
     
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