WO2016082054A9 - Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos - Google Patents

Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos Download PDF

Info

Publication number
WO2016082054A9
WO2016082054A9 PCT/CL2015/050046 CL2015050046W WO2016082054A9 WO 2016082054 A9 WO2016082054 A9 WO 2016082054A9 CL 2015050046 W CL2015050046 W CL 2015050046W WO 2016082054 A9 WO2016082054 A9 WO 2016082054A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vaccine
membrane
sediment
mastitis
fragments
Prior art date
Application number
PCT/CL2015/050046
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2016082054A1 (es
Inventor
Lisette Nicole LAPIERRE ACEVEDO
Leonardo Enrique Sáenz Iturriaga
Original Assignee
Universidad De Chile
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Chile filed Critical Universidad De Chile
Priority to BR112017011292-2A priority Critical patent/BR112017011292B1/pt
Priority to MX2017006892A priority patent/MX2017006892A/es
Publication of WO2016082054A1 publication Critical patent/WO2016082054A1/es
Publication of WO2016082054A9 publication Critical patent/WO2016082054A9/es
Priority to CONC2017/0005389A priority patent/CO2017005389A2/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a subunit, polyvalent, highly immunogenic vaccine against mastitis in mammals, which consists of a formulation comprising a mixture of cell wall and small membrane fragments and small liposorn originating from the cell membrane of selected pathogens of Staphylococcus aureus, Escherichia cabbage! and Streptococcus uberis, where said cell wall fragments and membranes release at least one of membrane proteins, lipopolysaccharide, peptidoglycan, exopolysaccharides, DNA, between.
  • the invention also teaches a method for preparing said vaccine and which allows obtaining the aforementioned immunoestimulant.es intracellular elements are obtained without denaturation.
  • Bovine mastitis is one of the most common health problems with the greatest economic impact for the dairy industry. This is caused by an inflammatory reaction of the mammary gland, mainly of bacterial origin. In general, mastitis causes a 40 to 50% decrease in net economic margins per cow. According to studies in the United States, the costs for the dairy producer due to mastitis amount to $ 200 per cow per year, which translates into annual losses for the dairy industry over $ 2 trillion. In Chile, Moraga et al., In 1988, estimated that between 162 and 204 million liters of milk are lost annually at the national level due to this pathology.
  • mastitis the inflammation of the mammary gland characterized by pathological alterations of the mammary glandular epithelium, which generate physical and chemical changes of the milk.
  • the magnitude of the lesions and the loss of milk productivity, as well as the clarity of the symptoms of inflammation, constitute the basis for the clinical diagnosis, allowing to distinguish between clinical and subclinical conditions.
  • Mastitis can be caused by physical or infectious agents. There are at least 140 microorganisms that cause mastitis, most of which are difficult to eradicate. These are: bacteria, mycoplasmas, fungi, algae and viruses, the bacteria being the. most important group, acting as the causative agent of 95% of clinical and subclinical mastitis, specifically a small group of bacteria, among which Staphyl ococcus aureus (S. aureus), Staphyl ococcus coa.gul.asa negatives, Streptococcus uberis (St. uberis), Streptococcus agalactiae (St. agalactiae), Mycoplasma spp. and Escherichia coli (E. coli).
  • S. aureus Staphyl ococcus aureus
  • Staphyl ococcus coa.gul.asa negatives Streptococcus uberis (St. uber
  • the severity of the glandular lesion is directly related to the productive decrease and the somatic cell count in milk. Hoblet et al. , in 1991, they calculated that the losses due to discarded milk and the expenditure on medicines can vary between US $ 1 and 27 per episode of mastitis, depending on the severity of the cases.
  • EP0038265 specifically describes a vaccine directed to Streptococcus Group B infections, both in infants and in dairy animals.
  • the vaccine is based on specific polysaccharides.
  • US4762712 describes the generation of a polyvalent vaccine, where the last of the milk obtained from an animal with clinical mastitis in order to proliferate the microorganisms present, inactivate said microorganisms and use them as a vaccine.
  • US5198214 is very similar to US4762712, but incorporates the indication that there are at least 3 different species of microorganisms, which are not identified.
  • W09635793 describes a method of gene therapy, where cells that incorporate specific sequences of DNA / constructs into an animal are implanted.
  • different sequence options are indicated that could be included in the constructs, for example, see claims 10 and 11.
  • the method would serve to treat one. wide variety of infections, particularly mastitis, see summary.
  • EP0887410 describes particular sequences of plasminogen activator proteins (PauA) from St. uberis, which can finally be used as a vaccine in. mastitis protection
  • W09916892 describes gene therapy based on a. bovine herpesvirus vector (bhv-2) for use in one or as a vaccine, specifically against bovine mastitis.
  • the vector is complemented with another sequence such as cytokines, for example, see claims 1, 2, 3.
  • WO9927109 describes S. aureus extracellular matrix binding proteins (ClfB, SdrC, SdrD, SdrE). A specific mention is made for mastitis in claim 38. The indication that there is a conserved domain between matrix binding proteins (TYTFTDYVD) is also highlighted.
  • WO0012131 describes muitocomponent vaccines, where it is indicated that it includes (similar to WO9927109) some fragments of dumping Factor A or B (ClfA or ClfB).
  • the claims indicate that the purpose is to fight infections of origin. Staphylococcus or Streptococcus, see claims 13 and 14.
  • WO0012689 describes Staphylococcus coagulase negative polypeptides and polynucleotides [Staphylococcus epiolermicli s). The same consensus sequence (TY FTDYVD) is mentioned as in WO9927109. The descriptive report indicates a wide variety of infectious conditions that could be diagnosed using antibodies against the identified proteins that maintain the consensus sequence. Among the many alternatives of infectious conditions, mastitis is mentioned.
  • WO02074324 describes adhesion proteins of Stavhylococcus epidermidis ⁇ S. epidermidis) that bind to collagen. In particular, said protein is a lipase, and it is postulated that it can be used in the prevention or treatment of Staphylococcus infections. The specification indicates that this protein could be used in the diagnosis of a wide variety of infections, including mastitis in cattle, see paragraph 35, and it is also indicated that these proteins or fragments thereof, or antibodies against them , could be used as vaccines.
  • WO2008019162 describes Staphylococcus proteins that can be used to stimulate the immune response. Mention virulence factors: EsxA, EsxB, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB SdrC, Spa, IsdC, CIfA, CIfB, SasF.
  • EsxA and EsxB as a vaccine is mentioned, and the use of mastitis and other infections is mentioned in the specification.
  • US2010113349 describes extracellular matrix binding proteins, in particular SdrE, from S. aureus Indicates the use of said proteins or fragments in the treatment, prevention, inhibition or diagnosis of S. aureus infections. In paragraph 106, it is mentioned that it can be used against mastitis in ruminants or humans.
  • US2010150956 specifically describes multi-component vaccines. Infections are particularly mentioned of S. aureus origin, and the components correspond to domain A of a protein (ClfA9), and a capsular polysaccharide of type 5, type 8, and combination of these components.
  • a mouse mastitis model is mentioned, and in paragraph 237, it is indicated that vaccines can be used in ruminant or human infections, pa.rti.cularm.ente, mastitis caused by S. aureus.
  • WO2010079464 describes antigens for use as vaccines against Gram positive bacteria ⁇ St. agalactiae, St. pyogenes, St pneumoniae, S, aureus, St. suis and St. equi).
  • the antigen corresponds to a domain B of Cna.
  • paragraphs 209 and 210 it is indicated that one of the diseases that can be treated is mastitis in. won, although it appears limited to. mastitis produced by St. uberis and St. dysgalactiae.
  • WO2011138636 describes compositions comprising capsular polysaccharide type 5 and type 8 of S. aureus, for use as a vaccine against a variety of diseases caused by S. aureus, within which mastitis is mentioned,
  • WO2012138570 describes compositions for preventing or inhibiting bacterial infections caused by bacteria expressing an MAM polypeptide. It is mentioned within the bacteria, Gram negative bacteria, where the bacteria can be Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholera, Yersinia pseutotuberculosls, E. coll enteropathogenic. In particular, mastitis is mentioned among several other infections caused by E. coll.
  • the method consists of administering a non-pathogenic microorganism that expresses a native or heterologous MAM polypeptide, and where the microorganism is added to food products (milk, yogurt, etc.)
  • WO2012140417 describes immunogenic compositions with two or more polypeptides from a Staphylococcus strain.
  • Staphylococcus strain a wide variety of Staphylococcus is mentioned. At least S. epidermidis, S, aureus ⁇ S. hominis, S. haemolyticus, S. warneri, S. capitis, S. saccharolyticus, S. auricularis, S. simulans, S. saprophytics, S. cohnii, S, xylosus , S.
  • WO2013066733 and WO2013066731 are similar in that they describe compositions for inducing immune response against S. aureus.
  • the difference is that the first uses a S. aureus sa2074 protein, and the second, WO2013066731 a S. aureus sa2451 protein.
  • the indicated proteins can be used as vaccines in various diseases and, among them, mastitis is mentioned in cattle.
  • This invention does not alter antigens, since they are not treated with. denaturing agents, improving the immunogenicity of the vaccine. Furthermore, the present invention allows obtaining cell wall and membrane fragments and liposomes originating from the cell membrane, and thus uses all the surface antigens of the pathogen, and also uses membrane proteins, lipopolysaccharides, peptidoglycans, exopolysaccharides, DNA, among other immunostimulatory intracellular molecular elements, which enhance the irimunological response and increase the chances of protection induced by vaccination.
  • the present invention relates to a highly immunogenic polyvalent subunit vaccine against mastitis consisting of a formulation comprising a mixture of bacterial wall fragments and membranes and small liposomes originating from the pathogen cell membrane, physicochemically stable (by measuring average size of vesicle and Z potential, protein concentration, DMA concentration, capsular exopolysaccharide quantification, LPS quantification, capsular exopolysaccharide quantification and protein pattern visualization in.
  • the formulation process prevents antigens from being destroyed or denatured, which is very common when vaccines are used based on dead microorganisms, since the process of inactivation of the pathogen by heat or chemical agents alters the immunogenic properties of these antigens , with the consequent decrease in effectiveness, which is observed in most of the inactivated vaccines currently marketed.
  • the present invention relates to a highly immunogenic polyvalent subunit vaccine against mastitis consisting of a formulation comprising a mixture of bacterial wall and membrane fragments and small liposomes originating from the pathogen's cell membrane, smaller than 1 ⁇ in size, which release large amount of antigens and immunostimulant.es molecules (such as membrane proteins, lipopolysaccharide, peptidoglycan, exopolysaccharides, DNA, among others) to the animal's immune system, and thus, comprises antigens against 3 pathogenic microorganisms selected from the group consisting of S, aureus, E. coli and St, uberis, improving the effectiveness and duration of the immune response in the animal.
  • a highly immunogenic polyvalent subunit vaccine against mastitis consisting of a formulation comprising a mixture of bacterial wall and membrane fragments and small liposomes originating from the pathogen's cell membrane, smaller than 1 ⁇ in size, which release large amount of antigens and immunostimulant.
  • the vaccine also provides the ability to stimulate local immunity in mucous membranes, favoring the protection of the vaccinated individual against the most common path of pathogens entering the body, and the main one in the case of mastitis. Immunity is mediated by the secretion of highly specific immunoglobulins capable of protecting, preventing the invasion and proliferation of microorganisms that cause inflammation of the mammary gland.
  • the present vaccine can preferably be used in breeding mammals for the production of meat or its derivatives, milk or products used in human food such as cattle, pigs, sheep, goats, camelids, horses, among others.
  • FIG. 1A-C Transmission electron microscopy (TEM) of proteoliposomes and cell wall and membrane fragments, formulated from field strains of E. coli (A), S. aureus (B) and St. uberis (C). 43,000X
  • FIG. 1 Electrophoresis in 15% polyacrylamide denaturing gels (SDS-PAGE). Samples correspond to proteoliposome formulation and cell wall and membrane fragments of bacterial origin, displaying the protein pattern of each of them.
  • Figure 4 Average bacterial count (Logium CFU / mL) in mammary glands of mice treated with placebo v / s vaccine and then experimentally infected intra-mammary, according to inoculated microorganism / mammary gland.
  • Figure 5 Average total bacterial count (Logium CFU / mL) in mammary glands of mice treated with placebo v / s vaccine and then experimentally infected intramammary, according to treatment.
  • Figure 6A-B Levels (absorbance at 450 nm) of specific immunoglobulins (IgG) against (A) E, coli, (B) St. uberis and (C) S. aureus in cows immunized subcutaneously, according to days after vaccination.
  • IgG immunoglobulins
  • Figure 7A-B Percentage of primiparous and multiparous cows, healthy and with intramammary infections, 30 days after second immunization, according to health status and treatment.
  • the Applicant has developed a process that improves the immunogenicity of different vaccines, using a formulation comprising a mixture of bacterial wall fragments and membranes and small liposornas originating from the pathogen's cell membrane, smaller than 1 ⁇ in size, from S. aureus , E. coli and St. uberis (see Figure 1), which are considered the most important antigens and molecular patterns associated with pathogens for the generation of protective immunity against an infectious agent.
  • the product is membrane and cell wall sphs and small liposomes, smaller than 1 ⁇ in size, that transport antigens to the animal's immune system.
  • the present invention has been validated at the level of preclinical tests in laboratory animals (see Figures 4 and 5), and in phase I and II clinical trials in dairy cattle (see Figures 6 and 7).
  • the proposed solution is a subunit, polyvalent and highly immunogenic vaccine against mastitis based on the pathogens most frequently involved in the development of bovine meLstitis in Chile and the world, such as S. aureus, E, coli and St. uberis.
  • the developed subunit vaccine is of a polyvalent type, which, unlike what currently exists in. the market includes the causative agents of both environmental mastitis ⁇ E. coli and St. uberis) as infectious (S. aureus) responsible for most clinical and subclinical mastitis that affect dairy cattle.
  • the present invention has been evaluated at the preclinical level in vaccinated and then challenged laboratory mice. intramammary with the different pathogens in. individually, with reductions in the bacterial count at glandular level exceeding 2 logarithmic units, with respect to animals injected with a placebo (see figures 4 and 5).
  • the safety of the formulation and the ability to raise specific immunity against the 3 pathogens included in the formulation have been evaluated, after subcutaneous administration in primiparous and multiparous bovine females (see figures 6 and 7), observing a double the titre of specific antibodies (IgG) against the pathogens of interest 30 days post immunization, and a reduction in the percentage of females with intramammary infections of 40% (primiparous) and 14% (multiparous), compared to unvaccinated females.
  • IgG specific antibodies
  • the present invention relates to a polyvalent subunit vaccine consisting of a formulation comprising a mixture of bacterial wall and membrane fragments and small liposomes originating from the pathogen cell membrane, physicochemically stable (by measuring average vesicle size and Z potential, protein concentration, DNA conce- ration, LPS quantification, capsular exopolysaccharide quantification and protein pattern visualization in SDS-PAGE), smaller than 1; im in size, which release a large number of antimicrobial and immunostimulatory molecules (such as membrane proteins, lipopolysaccharide, peptidoglycan, exopolysaccharides, DNA, among others) to the animal's immune system.
  • antimicrobial and immunostimulatory molecules such as membrane proteins, lipopolysaccharide, peptidoglycan, exopolysaccharides, DNA, among others
  • the formulation process prevents antigens from being destroyed or denatured, which is very common when vaccines are used based on dead microorganisms, since the process of inactivation of the pathogen by heat or chemical agents alters the immunogenic properties of these antigens , with the consequent decrease in effectiveness, which is observed in. the majority of inactivated vaccines that are currently marketed.
  • Liposomes of bacterial membranes were formulated as follows:
  • the growth was carried out at pH 7.0 for 20 hours, with a temperature of 37 ° C, dissolved oxygen ⁇ 45% and variable agitation between 200 and 500 rpm to maintain the oxygen value. After the growth time the bacteria were harvested by centrifuging at 4,000 rpm (2,811 g) for 20 minutes at 4 ° C, storing the sediment at -80 ° C
  • the S. aureus strains selected for the vaccine were grown in a New Brunswick Scientific Bioreactor BioFlo 415 Fermentor in Todd-Hewitt commercial medium (Bacto, Catalog No. 249240) composed of:
  • the growth was carried out at pH 7.8 for 24 hours with a temperature of 37 ° C, dissolved oxygen> 30% and variable agitation between 200 and 500 rpm to maintain the oxygen value. After the growth time the bacteria were harvested by centrifuging at 4,000 rpm (2,811 g) for 20 minutes at 4 ° C, storing the sediment at -80 ° C.
  • strains of St. uberis selected for the vaccine were grown in a New Brunswick Scientific BioFlo 415 Fermentor Bioreactor in. Commercial MI 7 medium (Bacto, Catalog No. 218561) composed of:
  • the growth was carried out at pH 6.9 for 24 hours with a temperature of 37 ° C, dissolved oxygen> 30% and variable agitation between 200 and 500 rpm to maintain the oxygen value.
  • the Bacteria when centrifuged at 4,000 rpm (2,811 g) for 20 minutes at 4 ° C, storing the sediment at -80 ° C.
  • Steps 4 through 5 were repeated, until 6 sonication steps were completed. After 6 or soniceL Terms, plated in duplicate 100 ⁇ iL sonicated P ⁇ ate Count Agar.
  • the sediment was resuspended in a buffer solution for membrane solubilization (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 25 mM KC1; 15 mM Sodium Deoxycholate; sterilized by filtration), at the rate of 1 g of sediment in. 20 ml of membrane solubilization buffer.
  • a buffer solution for membrane solubilization (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 25 mM KC1; 15 mM Sodium Deoxycholate; sterilized by filtration
  • Bio-Beads ® BioRad, catalog number 152-3920 were added, previously resuspended in a minimum volume of 20 mM Tris-HCl solution + 25 mM KC1, pH 7.5; and sterilized by autoclaving, at a rate of 50 mg of Bio-Beads in. 1 mL of solution.
  • Bio-Beads ® were allowed to decant and the supernatant was transferred to a sterile tube.
  • TEM Transmission Electron Microscopy
  • LPS lipopolysaccharide
  • calves 21 days after the second immunization, calves (2 vaccinated and 2 placebos) were challenged intramammary with 50 yL / gland of a bacterial suspension of E, col! (2 or pair of glands), St. uberis (4 or pair of glands) and S. aureus (5 or pair of glands), at a concentration in the range of 10 b CFU./mL.
  • the I or pair of mammary glands served as a negative control of intramammary infection).
  • mice were separated from their offspring 2 hours prior to the procedure and then lightly anesthetized with isoflurane. Each nipple and the surrounding area was disinfected with a torch embedded in 70% ethanol. Each nipple was taken and gently extended with an anatomical forceps, injected through its center with one. 30G needle inserted, up to 2/3 of the length of the extended nipple and gently depositing 50 ⁇ L of the inoculum. At 24 hours post bacterial challenge, the mice were sacrificed
  • each mammary gland under study was extracted individually; they were deposited individually in petri dishes. sterile and were disintegrated and suspended in phosphate peptonated water (APF) at a rate of 10 mL / g of breast tissue.
  • APF phosphate peptonated water
  • mice 1, 918 2, 688 6, 248 2, 932 2,303 4,590 where A, B, C and D refers to the group of animal studied.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos, de una formulación que comprende mezcla de fragmentos de pared y membranas celular y pequeños liposomas originados desde la membrana celular de los patógenos seleccionados de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Streptococcus uberis, donde dichos fragmentos de pared celular y membranas liberan elementos intracelulares inmunoestimulantes tales como proteínas de membrana, lipopolisacárido, peptidoglicano, exo.

Description

VACUNA SUBU I TARTA , POLIVALENTE ALTAMENTE INMU OGÉNICA CONTRA MASTI TIS EN MAMÍFEROS .
CAMPO DEL INVENTO
La invención se refiere a una vacuna subunitaria, polivalente, altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos, que consiste en una formulación que comprende una mezcla de fragmentos de pared y membranas celular y pequeños liposornas originados desde la membrana celular de patógenos seleccionados de Staphylococcus aureus, Escherichia col! y Streptococcus uberis, donde dichos fragmentos de pared celular y membranas liberan al menos uno de proteínas de membrana, lipopolisacárido, peptidoglicano, exopolisacáridos, DNA, entre. La invención también enseña un procedimiento para preparar dicha vacuna y que permite obtener los elementos intracelulares inmunoestimulant.es antes mencionados se obtienen sin desnaturar .
ARTE PREVIO
El consumo y la producción mundial de leche en los últimos 10 años han crecido sobre el 20% y se proyecta que la demanda crecerá por sobre la oferta a una tasa superior al 2% anual. Más de 6.000 millones de personas en el mundo consumen leche y productos lácteos, con tasas que van desde los 150 Kg per cápita anual, hasta 30 Kg en los países con menos desarrollo. Se espera que la producción del leche al 2014 alcance los 747 millones de toneladas.
La mastitis bovina es uno de los problemas sanitarios más comunes y de mayor impacto económico para la industria lechera. Esta se ocasiona por una reacción inflamatoria de la glándula mamaria, principalmente de origen bacteriano. En general, las mastitis causan entre un 40 a 50% de disminución en los márgenes económicos netos por vaca. Según estudios realizados en los Estados Unidos los costos para el productor lechero por causa de la mastitis ascienden a 200 dólares por vaca al año, lo cual, se traduce en pérdidas anuales para la industria lechera por sobre los 2 billones de dólares. En Chile, Moraga et al., en 1988, estimaron que se pierden anualmente entre 162 a 204 millones de litros de leche a nivel nacional por concepto de esta patología.
Se entiende por mastitis, la inflamación de la glándula mamaria caracterizada por alteraciones patológicas del epitelio glandular mamario, que generan cambios físicos y químicos de la leche. La magnitud de las lesiones y de la pérdida de productividad láctea, así como la claridad de los síntomas de inflamación, constituyen las bases para el diagnóstico clínico, permitiendo distinguir entre cuadros clínicos y subclínicos.
La mastitis puede ser causada por agentes físicos o infecciosos. Existen al menos 140 microorganismos que causan mastitis, la mayoría de los cuales son de difícil erradicación. Estos son: bacterias, micoplasmas, hongos, algas y virus, siendo las bacterias el. grupo de mayor importancia, actuando como agente causal del 95% de los cuadros de mastitis clínica y subclínica, específicamente un pequeño grupo de bacterias, entre las que destacan Staphyl ococcus aureus (S. aureus) , Staphyl ococcus coa.gul.asa negativos, Streptococcus uberis (St. uberis) , Streptococcus agalactiae (St. agalactiae) , Mycoplasma spp . y Escherichia coli (E . coli ) .
La mastitis subclínica, que pasa fácilmente desapercibida para el productor, es la causante de la mayor parte de las pérdidas. Según la mayoría de los autores, por lo menos un 70% de las pérdidas económicas relacionadas con. la mastitis se expresan en mermas en la producción de leche y eliminación de la leche procedente de animales enfermos.
La severidad de la lesión glandular está directamente relacionada con la disminución productiva y con el recuento de células somáticas en la leche. Hoblet et al . , en 1991, calcularon que las pérdidas por leche descartada y el gasto en medicamentos pueden variar entre US$ 1 y 27 por episodio de mastitis, dependiendo de la severidad de los casos.
En particular, en el arte previo, el problema de tratar o prevenir la mastitis en animales o humanos, se ha resuelto de la siguiente forma en base a las publicaciones indicadas a. continuación, relacionadas con diferentes solicitudes de patentes :
EP0038265 describe específicamente una vacuna dirigida a infecciones de Streptococcus Grupo B, tanto en infantes como en animales lecheros. La vacuna se basa en polisacáridos específicos.
US4762712 describe la generación de una vacuna polivalente, donde ultivo de la leche obtenida de un animal con mastitis clínica de manera de hacer proliferar los microorganismos presentes, inactivar dichos microorganismos y usarlos como vacuna.
US5198214 es muy similar a US4762712, pero incorpora la indicación de que son al menos 3 especies distintas de microorganismos, los que no son identificados.
W09635793 describe un método de terapia génica, donde se implantan células que incorporan secuencias especificas de ADN/constructos a un animal. En la descripción, se indican distintas opciones de secuencias que podrían incluirse en los constructos, por ejemplo, ver reivindicaciones 10 y 11. Además, se indica que el método serviría para tratar una. amplia variedad de infecciones, en particular mastitis, ver resumen .
EP0887410 describe secuencias particulares de proteínas activadores de plasminógeno (PauA) de St. uberis, que finalmente pueden usarse como vacuna en. la protección de mastitis .
W09916892 describe terapia génica basada en un. vector de herpesvirus bovino (bhv-2) para usarse en una o como una vacuna, específicamente contra mastitis en bovinos. El vector se complementa con otra secuencia como por ejemplo de citoquinas, por ejemplo, ver reivindicaciones 1, 2, 3.
WO9927109 describe proteínas de unión a matriz extracelular de S. aureus (ClfB, SdrC, SdrD, SdrE) . Se realiza una mención específica para mastitis en la reivindicación 38. Se destaca, además la indicación de que existe un dominio conservado entre las proteínas de unión a matriz (TYTFTDYVD) .
WO0012131 describe vacunas muíticomponentes, donde se indica que incluye (similar a WO9927109) algunos fragmentos de dumping Factor A o B (ClfA o ClfB) . En las reivindicaciones se indica que el fin es combatir infecciones de origen. Staphylococcus o Streptococcus, ver reivindicaciones 13 y 14.
WO0012689 describe polipéptidos y polinucleótidos de Staphylococcus coagulasa negativos [Staphylococcus epiolermicli s) . Se menciona la misma secuencia consenso (TY FTDYVD) que en el documento WO9927109. En la memoria descriptiva se indica una amplia variedad de condiciones infecciosas que podrían diagnosticarse usando anticuerpos contra las proteínas identificadas que mantienen la secuencia consenso. Entre las muchas alternativas de condiciones infecciosas, se menciona mastitis. WO02074324 describe proteínas de adhesión de Stavhylococcus epidermidis {S. epidermidis) que se unen a colágeno. En particular, dicha proteína es una lipasa, y se postula que puede usarse en la prevención o tratamiento de infecciones por Staphylococcus . En la memoria descriptiva se indiceL que esta proteína podría usarse en el diagnóstico de una gran variedad de infecciones, entre las cuales se menciona mastitis en bovinos, ver párrafo 35, y también se indica que estas proteínas o fragmentos de ellas, o anticuerpos contra ellas, podrían usarse como vacunas.
US2005019345 de manera similar a WO02074324, este documento describe proteínas de adhesión a colágeno, pero provenientes de Streptococcus pyogenes . Así mismo, indica métodos de diagnóstico de infecciones. También menciona, entre muchas otras, mastitis en bovinos como una de las enfermedades a diagnosticar o tratar, ver párrafo 47 y su uso como vacuna, ver párrafo 57.
WO2008019162 describe proteínas de Staphylococcus que se pueden usar para estimular la respuesta inmune. Menciona factores de virulencia: EsxA, EsxB, SdrD, SdrE, IsdA, IsdB SdrC, Spa, IsdC, CIfA, CIfB, SasF. En la reivindicación 47, se menciona el uso de EsxA y EsxB como vacuna, y en la memoria descriptiva se menciona el uso contra mastitis y otras infecciones. US2010113349 describe proteínas de unión a matriz extracelular , en particular SdrE, provenientes de S. aureus Indica el uso de dichas proteínas o fragmentos en el tratamiento, prevención, inhibición o diagnóstico de infecciones por S. aureus. En el párrafo 106, se menciona que puede usarse contra mastitis en rumiantes o humanos.
US2010150956 describe específicamente vacunas multicomponentes . Se menciona particularmente infecciones de origen S. aureus, y los componentes corresponden al dominio A de una proteína (ClfA9) , y un polisacárido capsular del tipo 5, tipo 8, y combinación de estos componentes. En el párrafo 21, se menciona un modelo de mastitis en ratón, y en el párrafo 237, se indica que las vacunas pueden usarse en infecciones en rumiantes o humanos, pa.rti.cularm.ente, mastitis causada por S. aureus.
WO2010079464 describe antígenos para usar como vacunas en contra de bacterias Gram positivas {St. agalactiae, St. pyogenes , St pneumoniae, S, aureus, St. suis y St. equi) . El antígeno corresponde a un dominio B de Cna . En el párrafo 209 y 210, se indica que una de las enfermedades que pueden tratarse es mastitis en. ganado, aunque aparece limitado a. mastitis producida por St. uberis y St. dysgalactiae .
WO2011138636 describe composiciones que comprenden polisacárido capsular tipo 5 y tipo 8 de S. aureus, para usarlos como vacuna en contra de una variedad de enfermedades causadas por S. aureus, dentro de las cuales se menciona mastitis,
WO2012138570 describe composiciones para prevenir o inhibir infecciones bacterianas causadas por bacterias que expresan un polipéptido MAM. Se menciona dentro de las bacterias, bacterias Gram negativas, donde las bacterias pueden ser Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholera, Yersinia pseutotuberculosls, E. coll enteropatógena . En particular, se menciona mastitis entre varias otras infecciones causadas por E. coll. El método consiste en administrar un microorganismo no patogénico que expresa un polipéptido MAM nativo o heterólogo, y donde el microorganismo se agrega a productos alimenticios (leche, yogurt, etc.) WO2012140417 describe composiciones inmunogénicas con dos o más polipéptidos provenientes de una cepa de Staphylococcus . En la memoria descriptiva, se menciona una amplia variedad de Staphylococcus . Al menos, S. epidermidis , S, aureus ^ S. hominis , S. haemolyticus , S. warneri , S. capitis, S. saccharolyticus , S. auricularis, S. simulans, S. saprophytics , S. cohnii, S, xylosus, S. hyicusr S, caprae, S. gallinarum, S. intermedius , S. aureus, S. epidermidis, que podrían causar distintas infecciones, dentro de las cuales se menciona mastitis en bovinos. No hay una. indicación clara sobre cuáles son los polipéptidos específicos que se usan en la composición de vacuna, pero si se entregan las secuencias asociadas. En la sección titulada "Materiales y Métodos", en el documento, se mencionan las siguientes proteínas que darían origen a los polipéptidos considerados en la vacuna: PheP, YdiE, DivlB, DivIC y FtsL.
WO2013066733 y WO2013066731 son similares en cuanto a que describen composiciones para inducir respuesta inmune frente a S. aureus. En particular, la diferencia se basa en que el primero utiliza una proteína de S. aureus sa2074, y el segundo, WO2013066731 una proteína S. aureus sa2451. En la memoria descriptiva, se señala que las proteínas indicadas pueden usarse como vacunas en varias enfermedades y, entre ellas, se menciona mastitis en bovinos.
Luego, los documentos antes mencionados aunque refieren vacunas contra mastitis, no enseñan o sugieren vacunas basadas en fragmentos de pared y membrana celular y liposomas originados desde la membrana celular bacteriana o vacunas polivalentes que presenten o describan específicamente los microorganismos de la presente invención. Esto aunque US5198214 describe una vacuna que se produce con al menos 3 especies distintas, pero falla en indicar tales especies.
Por otra parte, la aplicación de vacunas ha emergido como una herramienta interesante para el control y la prevención de la mastitis. Sin embargo, las vacunas actuales de naturaleza inactivada o vacunas muertas, son poco efectivas y débiles inmunogénicamente, ya que en el proceso de inactivación por calor o un agente químico, se van desnaturando los antigenos proteicos, lo que impacta negativamente en la correcta presentación antigénica y, por lo tanto, en una adecuada eficacia protectora. Por otro lado, el uso de únicamente algunos de los factores de virulencia de la bacteria como antigenos recombi.nant.es en la formulación. de una vacuna, limita la respuesta protectora únicamente a aquellos microorganismos patógenos que expresen el gen y deja abierta la posibilidad a infecciones por agentes oportunistas, por lo que la elección de cuales antigenos deben estar incorporados en la vacuna es sumamente crítico.
Este invención no altera los antigenos, ya que no son tratados con. agentes desnaturantes, mejorando la inmunogenicidad de la vacuna. Además, la presente invención permite la obtención de fragmentos de pared y membranas celular y liposomas originados desde la membrana celular, y así utiliza todos los antigenos de superficie del patógeno, y además utiliza proteínas de membrana, lipopolisacáridos , peptidoglicanos, exopolisacáridos , ADN, entre otros elementos moleculares intracelulares inmunoestimulantes , que potencian la respuesta irimunológica y aumentan las posibilidades de protección que induce la vacunación.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una vacuna subunitaria polivalente altamente inmunogénica contra mastitis que consiste de una formulación que comprende una mezcla de fragmentos de pared y membranas bacterianas y pequeños liposomas originados desde la membrana celular del patógeno, fisicoquimicamente estables (mediante medición de tamaño promedio de vesícula y potencial Z, concentración de proteínas, concentración de DMA, cuantificación de exopolisacárido capsular, cuantificación de LPS, cuantificación de exopolisacárido capsular y visualización de patrón proteico en. SDS-PAGE) , menores a 1 um de tamaño, que liberan gran cantidad de antigenos y moléculas inmunoestimulantes (tales como proteínas de membrana, lipopolisacárido, peptidoglicano, exopolisacáridos , DNA, entre otras) al sistema inmune del animal . Además, el proceso de formulación evita que los antigenos sean destruidos o desnaturados, lo que es muy frecuente cuando se utilizan vacunas en base a microorganismos muertos, ya que el proceso de inactivación del patógeno mediante calor o agentes químicos altera las propiedades inmunogénicas de estos antígenos, con la consecuente disminución en la efectividad, la cual se observa en la mayoría de las vacunas inactivadas que se comercializan en la actualidad.
La presente invención se refiere a una vacuna subunitaria polivalente altamente inmunogénica contra mastitis que consiste de una formulación que comprende una mezcla de fragmentos de pared y membranas bacterianas y pequeños liposomas originados desde la membrana celular del patógeno, menores a 1 μπι de tamaño, que liberan gran cantidad de antígenos y moléculas inmunoestimulant.es (tales como proteínas de membrana, lipopolisacárido, peptidoglicano, exopolisacáridos, DNA, entre otras) al sistema inmune del animal, y así, comprende antígenos contra 3 microorganismos patógenos seleccionados del grupo consistente de S, aureus, E. coli y St, uberis, mejorando la efectividad y duración de la respuesta inmune en el animal. La vacuna entrega, además, la capacidad de estimular la inmunidad local en mucosas, favoreciendo la protección del individuo vacunado frente a la ruta más común de ingreso de patógenos al organismo, y la principal en el caso de mastitis. La inmunidad es mediada por la secreción de inmunoglobulinas altamente especificas capaces de proteger, evitando la invasión y proliferación de microorganismos que producen la inflamación de la glándula mamaria .
La presente vacuna preferentemente, puede ser usada en mamíferos de crianza para la producción de carne o sus derivados, leche o productos utilizados en alimentación humana tales como bovinos, porcinos, ovejas, caprinos, camélidos, equinos, entre otros.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1A-C Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de proteoliposomas y fragmentos de pared y membrana celular, formulados a partir de cepas de campo de E. coli (A), S. aureus (B) y St. uberis (C) . 43.000X
Figura 2 Electroforesis en geles desnaturantes de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 15%. Muestras corresponden a formulación de proteoliposomas y fragmentos de pared y membrana celular de origen bacteriano, visualizándose el patrón proteico de cada una de ellas.
Figura 3 Electroforesis en gel de agarosa-TAE 1,5%.
Muestras corresponden a formulación de proteoliposomas y fragmentos de pared y membrana celular de origen bacteriano, visualizándose la presencia de fragmentos de DNA genómico en cada una de ellas.
Figura 4 Recuento bacteriano promedio (Logio UFC/mL) en glándulas mamarias de ratonas tratadas con vacuna v/s placebo y luego infectadas experimentalmente por via intramamaria, según microorganismo inoculado/glándula mamaria .
Figura 5 Recuento bacteriano total promedio (Logio UFC/mL) en glándulas mamarias de ratonas tratadas con vacuna v/s placebo y luego infectadas experimentalmente por via intramamaria, según tratamiento .
Figura 6A-B Niveles (absorbancia a 450 nm) de inmunoglobulinas (IgG) especificas contra (A) E, coli, (B) St. uberis y (C) S. aureus en vacas inmunizadas por via subcutánea, según dias post vacunación .
Figura 7A-B Porcentaje de vacas primíparas y multíparas, sanas y con infecciones intramamarias , 30 días post segunda inmunización, según estatus sanitario y tratamiento.
DESCRIPCION DETALLADA DE IA INVENCION
La Solicitante ha desarrollado un proceso que mejora la inmunogenicidad de diferentes vacunas, utilizando una formulación que comprende una mezcla de fragmentos de pared y membranas bacterianas y pequeños liposornas originados desde la membrana celular del patógeno, menores a 1 μπι de tamaño, de S. aureus, E. coli y St. uberis (ver Figura 1), los cuales son considerados los antigenos y patrones moleculares asociados a patógenos más importantes para la generación de inmunidad protectora contra un agente infeccioso. El producto son fra s de membrana y pared celular y pequeños liposomas, menores a 1 μια de tamaño, que trasportan los antigenos al sistema inmune del animal. La presente invención ha sido validada a nivel de ensayos preclinicos en animales de laboratorio (ver figuras 4 y 5) , y en ensayos clínicos fase I y II en ganado lechero (ver figuras 6 y 7) .
Asi, la solución propuesta es una vacuna subunitaria, polivalente y altamente inmunogénica contra mastitis basada en los patógenos más frecuentemente involucrados en el desarrollo de la meLstitis bovina en Chile y el mundo, como S. aureus, E, coli y St. uberis. La vacuna subunitaria desarrollada es de tipo polivalente, que a diferencia de lo que actualmente existe en. el mercado, incluye los agentes causantes de mastitis tanto ambientales {E. coli y St. uberis) como infecciosos (S. aureus) responsables de la mayoría de las mastitis clínicas y subclinicas que eLfectan al ganado lechero.
La presente invención ha sido evaluada a nivel preclínico en ratones de laboratorio vacunados y luego desafiados por vía. intramamaria con los diferentes patógenos en. forma individual, observándose reducciones en el recuento bacteriano a nivel glandular superiores a 2 unidades logarítmicas, respecto a animales inyectados con un placebo (ver figuras 4 y 5) . A nivel clínico, se ha evaluado la seguridad de la formulación y la capacidad de elevar inmunidad específica contra los 3 patógenos incluidos en la formulación, tras su administración por vía subcutánea en hembras bovinas primíparas y multíparas (ver figuras 6 y 7), observándose un aumento del doble en el título de anticuerpos específicos (IgG) contra los patógenos de interés 30 días post inmunización, y una reducción en el porcentaje de hembras con infecciones intramamarias del 40% (primíparas) y 14% (multíparas), respecto a hembras no vacunadas .
Así, la presente invención se refiere a una vacuna subunitaria polivalente que consiste de una formulación que comprende una mezcla de fragmentos de pared y membranas bacterianas y pequeños liposomas originados desde la membrana celular del patógeno, fisicoquímicamente estables (mediante medición de tamaño promedio de vesícula y potencial Z, concentración de proteínas, conce tración de DNA, cuantificación de LPS, cuantificación de exopolisacárido capsular y visuali zación de patrón proteico en SDS-PAGE) , menores a 1 ;im de tamaño, que liberan gran cantidad de antígenos y moléculas inmunoestimulantes (tales como proteínas de membrana, lipopolisacárido, peptidoglicano, exopolisacáridos , DNA, entre otras) al sistema inmune del animal. Además, el proceso de formulación evita que los antigenos sean destruidos o desnaturados, lo que es muy frecuente cuando se utilizan vacunas en base a microorganismos muertos, ya que el proceso de inactivación del patógeno mediante calor o agentes químicos altera las propiedades inmunogénicas de estos antígenos, con la consecuente disminución en la efectividad, la cual se observa en. la mayoría, de las vacunas inactivadas que se comercializan en la actualidad.
A continuación, se proporciona a modo de ejemplo, una descripción de desarrollo experimental realizado conforme a la invención aplicada en ganado bovino, particularmente, vacas .
Los liposomas de membranas bacterianas, se formularon de la siguiente manera:
Crecimiento de patógenos de interés : Las cepas de E. col! seleccionadas para la vacuna, se hicieron crecer en un Biorreactor New Brunswick Scientific BioFlo 415 Fermentor en un medio químicamente definido compuesto por:
- Triptona 1,2% (p/v)
- Extracto de Levadura 2,4% (p/v)
- Fosfato de Magnesio 0,12% (p/v)
- Cloruro de Sodio 0,12% (p/v)
- Cloruro de Potasio 0,02% (p/v)
- Sulfato de Amonio 0,7% (p/v)
- Glucosa 1,5% (p/v)
- Fosfato de Potasio Monobásico 0,4% ( p/v)
- Fosfato de Potasio Bibásico 1,2% (p/v)
- Micronutrientes 0, 1% (v/v)
- Sulfato de Nickel 0,1% (p/v)
- Cloruro de Manganeso 1,5%( p/v)
- Cloruro de Cobre 0,2% (p/v)
- Ácido Bórico 0,3% (p/v)
- Molibdato de Sodio 0,1% (p/v)
- Cloruro de Zinc 0, 8% ( p/v)
- Cloruro de Hierro 1,4% (p/v)
- Sulfato de Aluminio 0,1% (p/v)
- Cloruro de Calcio 0,1% (p/v)
El crecimiento se realizó a pH 7,0 por 20 horas, con una temperatura de 37 °C, oxígeno disuelto ≥45% y agitación variable entre 200 y 500 rpm para mantener el valor del oxígeno. Pasado el tiempo de crecimiento se cosecharon las bacterias al centrifugar a 4.000 rpm (2.811 g) por 20 minutos a 4°C, almacenando el sedimento a -80°C
Las cepas de S. aureus seleccionadas para la vacuna, se hicieron crecer en un Biorreactor New Brunswick Scientific BioFlo 415 Fermentor en medio Todd-Hewitt comercial (Bacto, N° catalogo 249240) compuesto por:
- Triptona 2% (p/v)
- Infusión de corazón 0,31% (p/v)
- Glucosa 0,2% (p/v)
- Cloruro de Sodio 0,2% (p/v)
- Fosfato Di Sódico 0,045% (p/v)
- Carbonato de Sodio 0,25% (p/v)
El. crecimiento se realizó a pH 7,8 por 24 horas con una temperatura de 37 °C, oxigeno disuelto >30% y agitación variable entre 200 y 500 rpm pareL mantener el valor del oxigeno. Pasado el tiempo de crecimiento se cosecharon las bacterias al centrifugar a 4.000 rpm (2.811 g) por 20 minutos a 4°C, almacenando el sedimento a -80°C.
Las cepas de St. uberis seleccionadas para la vacuna, se hicieron crecer en un Biorreactor New Brunswick Scientific BioFlo 415 Fermentor en. medio MI 7 comercial (Bacto, N° catalogo 218561) compuesto por:
- Triptona 0,5% (p/v)
- Peptona de Soya 0,5% (p/v)
- Extracto de carne 0,5% (p/v)
- Extracto de levadura 0,25% (p/v)
- Ácido ascórbico 0,05% (p/v)
- Sulfato de Magnesio 0,025% (p/v)
- Glicerolfosfato de Sodio 1,9% (p/v)
- Lact.osa 0 , 5% (p/ v )
El. crecimiento se realizó a pH 6,9 por 24 horas con una temperatura de 37 °C, oxigeno disuelto >30% y agitación variable entre 200 y 500 rpm pareL mantener el valor del oxigeno. Pasado el tiempo de crecimiento se cosecharon las bacterias al centrifugar a 4.000 rpm (2.811 g) por 20 minutos a 4°C, almacenando el sedimento a -80°C.
Purificación de Membranas y fragmentos de pared celular :
Para la purificación de las membranas, se aplicó el siguiente protocolo:
1. El sedimento congelado de cada microorga ismo se descongeló a 40-50°C.
2. Se resuspendió en solución tampón de lisis estéril (Imidazol 20 mM; Fosfato Disódico 20 mM; Cloruro de Sodio 500 mM; pH 7,4; esterilizado mediante filtración), a razón de 1 g de sedimento en 10 mL de tampón de lisis. Además, se agregaron perlas de Zirconia/Silica 0,1 mm (BioSpec Products, N° catálogo 11079101Z), a razón de 1 g de perlas en 10 mL de tampón de lisis.
3. Luego se congeló a -80UC por 2 horas.
4. Se descongeló con sonicación al 100% de capacidad del sonicador Hielscher Ultrasonic Processor UP400S (250 V) por 6 minutos continuos.
5. Luego se congeló a -80°C por 2 horas.
6. Se repitieron los pasos del 4 al 5, hasta completar 6 pasos de sonicación. Tras la 6o soniceLción, se sembraron en duplicado 100 \iL del sonicado en Agar Píate Count.
7. Una vez verificada la ausencia de microorganismos viables conforme a lo expuesto en el punto inmediatamente anterior se centrifugó a 2.811g por 20 minutos a 4 °C, reservando el sobrenadante y descartando el sedimento.
8. El sobrenadante se volvió a centrifugar a 17.319g por 30 minutos a 4 °C, reservando el sedimento {pellet de membranas) y descartando el sobrenadante
Preparación de los Uposomas de membranas y fragmentos de pared y membrana celular: Para la preparación, se siguió el protocolo a continuación:
1. El sedimento se resuspendió en solución tampón para solubilización de membrana (Tris-HCl 20 mM pH 7,5; KC1 25 mM; Deoxicolato de Sodio 15 mM; esterilizado mediante filtración) , a razón de 1 g de sedimento en. 20 mi de tampón de solubilización de membranas.
2. Se incubó a 17 °C con agitación de 270 rpm por 18 horas.
3. Se centrifugó a 15°C por 30 minutos a 4.500 rpm.
4. Se agregaron Bio-Beads® (BioRad, número catalogo 152- 3920), previamente resuspendidos en un volumen mínimo de solución Tris-HCl 20 mM + KC1 25 mM, pH 7,5; y esterilizados mediante autoclavado, a razón de 50 mg de Bio-Beads en. 1 mL de solución.
5. Se incubó a 20 °C por 90 minutos con agitación de 50 rpm.
6. Se agregaron Bio-Beads® estériles, a razón de 450 mg de Bio-Beads® en 1 mL de solución.
7. Se incubó a 20°C por 90 minutos con agitación de 50 rpm.
8. Se dejaron decantar los Bio-Beads® y el sobrenadante se traspasó a un tubo estéril.
9. Se agregaron 9 "uL/mL de Alcohol Bencílico, esterilizado mediante filtración, y 100 pL/mL de EDTA 100 mM esterilizado mediante filtración .
Caracterización de formulación vacunal:
La formulación de liposomas y fragmentos de pared y membrana celular fueron caracterizados a través de las siguientes técnicas:
- Visualización de liposomas y fragmentos de pared y membrana celular a través de Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) . - Medición de tamaño promedio de vesículas y fragmentos mediante NanoBrook ZetaPlus Zeta Potential Analyzer, Broohaven Instruments Corp.
- Medición de potencial Z de vesículas y fragmentos mediante NanoBrook ZetaPlus Zeta Potential Analyzer, Broohaven Instruments Corp.
- Medición de concentración total de proteínas, mediante BCA Protein Assay Kit, Novagen .
- Extracción y cuantificación de exopolisacárido capsular, según método descrito por Haskell y Hanessian (1964) y Elson y Morgan (1933), modificado por Rondle y Morgan (1955) .
- Medición de lipopolisacárido (LPS), mediante Purpald Assay.
- Extracción y cuantificación de DNA, mediante AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit, AXYGEN y espectrofotometría a 260-280 nm.
- Visualización de perfil proteico mediante Electroforesis en Geles Desnaturantes de Poliacrilamida ( SDS-PAGE) .
- Visualización de fragmentos de DNxA mediante Electroforesis en Geles de Agarosa-TAE.
Ensayo pre clínico :
- 12 hembras y 4 machos de la cepa BALB/c, de 12 semanas de edad, fueron incluidos en el ensayo. Se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos, de 2-4 hembras y 1 macho por j aula .
- 48 horas post inicio de reproducción, 6 hembras seleccionadas aleatoriamente fueron vacunadas subcutáneamente en la zona de la nuca con 1 dosis de la vacuna, conteniendo 15 μg de proteoliposomas , medido como proteína total mediante BCA Protein Assay, Novagen, de St. uberis, S. aureus y E. coli (45 ]ig totales) más 0,55 mg de hidróxido de aluminio, contenidos en. un volumen total de 110 μη . Las 6 hembras restantes sirvieron como grupo placebo, siendo inyectadas con 0,55 mg de hidróxido de aluminio más NaCl 0,9% en un volumen total de 110 μη .
Luego de 14 días, las hembras fueron revacunadas utilizando la misma. formulación y bajo el mismo protocolo aplicado en la primera inmunización.
21 días posteriores a la segunda inmunización, las ratonas paridas (2 vacunadas y 2 placebos) fueron desafiadas por vía intramamaria con 50 yL/glándula de una suspensión bacteriana de E, col! (2 o par de glándulas), St. uberis (4o par de glándulas) y S. aureus (5o par de glándulas), a una concentración en el rango de 10b UFC./mL. El Io par de glándulas mamarias sirvió como control negativo de infección intramamaria) .
Para ello, las ratonas fueron separadas de sus crias 2 horas previas al procedimiento y luego anestesiadas ligeramente con isoflurano . Cada pezón y la zona circundante fue desinfectado con una tórula embebida en etanol 70%. Cada pezón fue tomado y extendido suavemente con una pinza anatómica, inyectándose a través de su centro con una. aguja de 30G ingresada, hasta 2/3 de la longitud del pezón extendido y depositando suavemente los 50 μL del inoculo. A las 24 horas post desafio bacteriano, las ratonas fueron sacrificadas
Bajo condiciones asépticas (bajo campana de flujo laminar y previa desinfección de la linea media ventral con etanol 70%) se extrajo individualmente cada glándula mamaria en estudio; se depositaron individualmente en placas de Petri. estériles y fueron disgregadas y suspendidas en agua peptonada fosfatada (APF) a razón de 10 mL/g de tejido mamario.
A partir de esta suspe sión se realizaron diluciones al décimo en APF y fueron sembradas en placas de agar tripticasa soya (St. uberis) , agar manitol salado (S. aureus) y agar McConkey [E. coli) . Las placas fueron incubadas a 37 °C durante 24-72 hrs, tras las cuales se realizó el recuento bacteriano y su expresión en UFC/mL. Tabla 1:
Aislamiento y recuento (LoglO UFC/mL) de E. coli r St. uberis y S. aureus desde glándulas mamarias de ratonas vacunadas y luego infectadas experimentalmente por vía intramamaria, según microorganismo inoculado/glándula mamaria.
Ratonas
Vacunadas Placebo
Promedio Promedio
Glándula vacunadas placebo
Tratamiento A B C D
mamaria
Sin
1 Derecha 3, 301 1, 477 5, 623 1, 699 2, 389 3, 661 tratamiento
2 Derecha E. coli 0 4, 738 7, 006 4,743 2,369 5, 874
4 Derecha St. uberis 0 4, 905 6, 324 0 2, 452 3, 162
5 Derecha S. aureus 4,785 2, 301 7, 000 5, 640 3,543 6, 320
1 Sin
3, 477 0 5, 431 1, 477 1, 739 3, 454
Izquierda tratamiento
2
E. coli 0 2, 176 6, 629 3, 729 1, 088 5, 179
Izquierda
4
St. uberis 0 2, 415 5, 531 0 1, 207 2,766
Izquierda
5
S. aureus 3, 778 3, 490 6, 439 6, 167 3, 634 6, 303
Izquierda
Promedio ratonas 1, 918 2, 688 6, 248 2, 932 2,303 4,590 donde A, B, C y D se refiere al grupo de animal estudiado.
Se observa en la Tabla 1 y Figuras 4 y 5, que en todos los casos y para todos los patógenos inoculados, en las hembras que fueron vacunadas con la vacuna experimental polivalente el recuento bacteriano disminuyó en aproximadamente 2,5 unidades logarítmicas (2,5 logio) UFC en comparación con el grupo control inyectado con placebo. Esta disminución en el recuento bacteriano, significa inhibición de la proliferación de bacterias inoculadas directamente en la glándula mamaria, producto de la respuesta inmune que estimula a vacunación.
Estudio de eficacia en terreno de vacas inmunizadas versus placebo :
Treinta hembras bovinas (10 primíparas y 20 multíparas) fueron mantenidas bajo condiciones productivas e inmunizadas tres veces (45 días preparto, 15 días preparto y 45 días postparto) con una formulación vacunal conteniendo 500 \iq de proteoliposomas (medido como proteína total mediante BCA Protein Assay, Novagen) de St. uberis, S. aureus y E. coli (1.500 \ig totales) más 8 mg de hidróxido de aluminio, contenidos en un volumen total de 2 mL . Un grupo control de 30 animales (10 primíparas y 20 multíparas) fue mantenido bajo las mismas condiciones productivas e inyectadas solamente con placebo (8 mg de hidróxido de aluminio, contenidos en un volumen total de 2 mL) . Posterior al parto, se extrajeron periódicamente muestras de leche, las cuales fueron sometidas a recuento de células somáticas y recuento microbiológico total, para determinar la presencia de mastitis clínicas y subclínicas en ambos grupos experimentales.
En la figuras 6 y 7 se observa una marcada alza en los niveles de inmunoglobulinas (IgG) específicas contra los patógenos E. coli, St. uberis y S. aureus, a partir de los 15-30 días post inmunización. Además, se observa una marcada disminución (40% primíparas y 14% multíparas) en el porcentaje de hembras que presentaron infecciones intramamarias dentro de los 30 días post parto en las hembras vacunadas, respecto al grupo placebo.

Claims

RE IVINDICACIONES
1. Vacuna subunitaria, polivalente, altamente inmunogénica contra mastitis, en mamíferos CARACTERIZADA porque consiste que en una formulación que comprende una mezcla de fragmentos de pared y membranas celular y liposomas de tamaño menor a 1 "um originados desde la membrana celular de patógenos seleccionados de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Streptococcus uberiSf donde dichos fragmentos de pared celular y membranas liberan al menos uno elemento molecular intracelular seleccionado de proteínas de membrana, lipopolisacárido, peptidoglicano, exopolisacáridos , DNA, entre otros elementos moleculares intracelulares inmunoestimularit.es provenientes de la pared y membrana celular del patógeno o una mezclas de los mismos.
2. La vacuna de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque sirve en mamíferos de crianza para la producción de carne o sus derivados, leche o productos utilizados en alimentación humana .
3. La vacuna de la reivindicación 2 CARACTERIZADA porque dicho meLmífero se selecciona del grupo consistente de bovino, porcino, oveja, caprino, camélido o equino.
4. La. vacuna de la reivindicación 3 CARACTERIZADA porque dicho mamífero es una vaca.
5. La vacuna de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque es una vacuna subcutánea.
6. La vacuna de la reivindicación 1, CARACTERIZADA porque comprende proteoliposomas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Streptococcus uberis.
7. Procedimiento para preparar la vacuna subunitaria polivalente altamente inmunogénica contra mastitis de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO porque comprende: a) Purificar sin desnaturar, membranas y fragmentos de pared celular de Staphylococcus aureus, Escherichla coli y Streptococcus uberis, descongelando a una. temperatura dentro del rango de 40-50°C (sedimento congelado obtenido de una cosecha centrifugada de dichas bacterias patogénicas, las que previamente se hicieron crecer, en forma separada) , y luego re-suspender el sedimento descongelado en solución tampón de lisis, a razón de 1 g de sedimento en 10 mL de tampón de lisis, agregando perleLS de Zirconia-Silica a razón de 1 g de perlas en 10 mL de tampón de lisis, subsecuentemente congelar a. aproximadamente -80 °C, y luego, descongelar por sonicación, repitiendo este ciclo de congelación -descongelación al menos 6 veces, y luego sembrar, para luego de verificar la ausencia de microorganismos viables, centrifugar a 4°C, reservando el sobrenadante y descartando el sedimento, donde el sobrenadante se centrifuga nuevamente a 4°C, reservándose nuevamente el sedimento, y descartándose el sobrenadante, y b) Preparar los liposomas de membranas y fragmentos de pared y membrana celular a partir de sedimento obtenido en la etapa a) , suspendiéndolo en solución tampón para solubilización de membrana a razón de 1 g de sedimento en 20 mL de tampón de solubilización de membranas, para luego incubar a aproxim.adam.ente 17 °C con agitación, y luego centrifugar, agregar Bio-beads previamente resuspendidos en solución y esterilizadas mediante autoclavado, a razón de 50 mg de perlas en 1 mL de solución, e incubar a aproximadamente 20 °C con agitación, agregar nuevamente perlas e incubar nuevamente manteniendo las mismas condiciones de la última incubación, dej antar las perlas y retirar el sobrenadante para agregar en el mismo al que luego se le agrega alcohol bencílico y EDTA.
11. Método para inmunogenizar un mamífero CARACTERZADO porque comprende administrar una vacuna de cualquiera de las rei indicaciones 1 a 9.
12. El método de la reivindicación 11 CARACTERIZANDO porque comprenden administrar dicha vacuna subcutáneamente.
13. método de la reivindicación 12 CARACTERIZADO porque dicha, administración subcutánea se realiza en la nuca del animal .
14. El método de la reivindicación 11 CARACTERIZADO porque comprende administrar la vacuna en un mamífero de crianza para la producción de carne o sus derivados, leche o productos utilizados en alimentación humana.
15. El. método de la reivindicación 14 CARACTERIZADO porque comprende administrar la vacuna en mamífero seleccionado del grupo consistente de bovino, porcino, oveja, caprino, camélidos o equino.
16. El método de la reivindicación 15 CARACTERIZADO porque dicho mamífero es una vaca.
PCT/CL2015/050046 2014-11-28 2015-11-25 Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos WO2016082054A1 (es)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112017011292-2A BR112017011292B1 (pt) 2014-11-28 2015-11-25 Vacina subunidade, polivalente, altamente imunogênica contra a mastite em mamíferos, processo para a preparação da dita vacina e usos da mesma
MX2017006892A MX2017006892A (es) 2014-11-28 2015-11-25 Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogenica contra mastitis en mamiferos.
CONC2017/0005389A CO2017005389A2 (es) 2014-11-28 2017-05-26 Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CL3247-2014 2014-11-28
CL2014003247A CL2014003247A1 (es) 2014-11-28 2014-11-28 Vacuna subunitaria, polivalente contra mastitis en mamíferos, que comprende fragmentos de pared y membrana celular de patógenos seleccionados de staphylococcus aureus, escherichia coli y streptococcus uberis; procedimiento de preparación; y uso para inmunogenizar un mamífero.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2016082054A1 WO2016082054A1 (es) 2016-06-02
WO2016082054A9 true WO2016082054A9 (es) 2016-06-23

Family

ID=56073267

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CL2015/050046 WO2016082054A1 (es) 2014-11-28 2015-11-25 Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos

Country Status (5)

Country Link
BR (1) BR112017011292B1 (es)
CL (1) CL2014003247A1 (es)
CO (1) CO2017005389A2 (es)
MX (1) MX2017006892A (es)
WO (1) WO2016082054A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024072985A1 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 University Of Tennessee Research Foundation Polyvalent vaccines for staphylococcal & streptococcal infection

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011018858A1 (ja) * 2009-08-14 2011-02-17 エヌエーアイ株式会社 新規乳房炎ワクチン

Also Published As

Publication number Publication date
BR112017011292A2 (pt) 2017-12-26
WO2016082054A1 (es) 2016-06-02
CL2014003247A1 (es) 2015-07-10
CO2017005389A2 (es) 2017-07-19
MX2017006892A (es) 2018-01-23
BR112017011292B1 (pt) 2024-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2560262T3 (es) Bacteriófago o proteína lítica derivados del bacteriófago que es eficaz para el tratamiento de la biopelícula de Staphylococcus aureus
ES2392053T3 (es) Método para la vacunación de aves de corral mediante un lisado bacteriófago
ES2724298T3 (es) Nuevo bacteriófago y composición antibacteriana que lo comprende
EP3140391B1 (en) Vaccine against acinetobacter baumannii based on cellular components deficient in lipopolysaccharide
ES2737599T3 (es) Un nuevo bacteriófago y una composición antibacteriana que comprende el mismo
CN103071151B (zh) 猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂及其制备方法
JP6772065B2 (ja) 免疫賦活プラスミド
Kaikabo et al. Evaluation of the efficacy of chitosan nanoparticles loaded ΦKAZ14 bacteriophage in the biological control of colibacillosis in chickens
Kitiyodom et al. The potential of mucoadhesive polymer in enhancing efficacy of direct immersion vaccination against Flavobacterium columnare infection in tilapia
ES2443073T3 (es) Vacuna para la protección contra bacterias Streptococcus suis de varios serotipos
ES2753142T3 (es) Vacuna y métodos para reducir una infección por Campylobacter
ES2724729T3 (es) Cepas avirulentas modificadas de Salmonella Gallinarum y composición farmacéutica usando las mismas
ES2243064T3 (es) Vacuna para aves.
Kunert Filho et al. Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC)-an update on the control
CA3170184A1 (en) Adjuvant and vaccine compositions
BR112015020712A2 (pt) novo bacteriófago e composição antibacteriana compreendendo o mesmo
BR112015020706A2 (pt) novo bacteriófago e composição antibacteriana compreendendo o mesmo
ES2307402B1 (es) Vacuna profilactica contra la tuberculosis.
JP6204930B2 (ja) 多価ワクチンによる黄色ブドウ球菌感染症からの保護
Marouf et al. Inactivated pentavalent vaccine against mycoplasmosis and salmonellosis for chickens
JP2004505096A (ja) Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する温度感受性の生ワクチン
CN1798574B (zh) 无荚膜的多杀巴斯德氏菌hyaE缺失型突变株
KR101183095B1 (ko) 어류의 연쇄구균증 예방용 혼합 불활성화 백신 및 그 제조방법
Shahidi et al. The design and application of a bacterial ghost vaccine to evaluate immune response and defense against avian pathogenic Escherichia coli O2: K1 serotype
WO2016082054A1 (es) Vacuna subunitaria, polivalente altamente inmunogénica contra mastitis en mamíferos

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15862405

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2017/006892

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: NC2017/0005389

Country of ref document: CO

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112017011292

Country of ref document: BR

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15862405

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112017011292

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20170529