ES2243064T3 - Vacuna para aves. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un derivado vivo no virulento de una bacteria enteropatogénica para la fabricación de un medicamento para su uso como vacuna en aves domésticas, siendo administrada dicha vacuna en forma de pulverización corporal total.
Description
Vacuna para aves.
La presente invención hace referencia a las
vacunas para la avicultura y en particular a un procedimiento
novedoso para vacunar aves de corral que implica pulverizar con un
derivado vivo no virulento de una bacteria enteropatógena. La
invención se refiere al uso de un derivado vivo no virulento de una
bacteria enteropatógena para la fabricación de un medicamento tal
como se define en las reivindicaciones.
La contaminación de la carne de ave de corral y
de los huevos con enterobacterias patógenas para el hombre, como
Salmonella spp. es una causa bien conocida de enfermedad en
el hombre tras haber consumido productos contaminados. La
contaminación ocurre predominantemente durante el procesado de las
carcasas después de la evisceración, por contacto con los
contenidos intestinales que presentan niveles elevados de dichas
enterobacterias. Las enterobacterias colonizan normalmente el tracto
intestinal pero no causan enfermedad en las aves de corral. Con el
fin de reducir la contaminación con enteropatógenos, sería deseable
disminuir la cantidad de bacterias enterobacterias presentes en el
tracto intestinal de los pollos para comercialización. Los intentos
para reducir esta contaminación se han centrado en la mejora de la
higiene durante la producción y el procesado (Bailey, J. S.,
Poult. Sci., 72:1169-1173, 1993), pero estos
procedimientos requieren tiempo, son caros y no totalmente efectivos
para evitar la contaminación esporádica (Véase, p.ej., Food
Borne Disease Outlok Annual Summary, 1982; and Salmonella
Suveillance Annual Survey, 1992; ambos disponibles en el Centro
de Control para las Enfermedades, U.S. Departamento de Salud y
Servicios Humanos, en Atlanta, GA). Los procedimientos que dependen
de la higiene durante el procesado, deben repetirse frecuentemente
para evitar que el equipo de procesado y el personal puedan
recontaminarse con cada nueva ave contaminada que se procese. Los
procedimientos que dependen de la higiene durante la producción,
requieren una vigilancia constante debido al alto potencial de
contaminación en el entorno donde se realiza la producción. Por
tanto, un procedimiento simple y barato que permitiera el control
de los microbios enteropatogénicos durante el crecimiento de las
aves de corral, podría ser la clave de una mayor reducción de la
contaminación de las carcasas durante el procesado.
Según Promosopone y col., J. Food Protect.,
61(2): 176-180, 1998, la colonización de
los tractos intestinales de las aves de corral por S.
typhimurium puede reducirse mediante la administación de un
probiótico específico para aves combinado con anticuerpos
específicos contra S. typhimurium. Los anticuerpos
específicos contra Lactobacillus acidophilus,
Streptococcus faecium y S. typhimurium, se
administran por pulverización a los polluelos de un día de edad,
seguido por la administración oral en el agua de bebida desde el
día 1 al 3. Los pollos se sometieron a una prueba de administración
oral de S. typhimurium el día 1 y después del tratamiento
probiótico, en los días 31, 38 y 43, se obtuvieron cantidades
significativamente menores de S. typhimurium en el ciego y
el colon. La administración del probiótico y de los anticuerpos a
una edad tan temprana como es el día 1, puede ser importante en la
reducción de la colonización del intestino por S.
typhimurium, sin embargo no está claro, en dicho trabajo, si es
la administración inicial por pulverización del probiótico y los
anticuerpos o la administración oral por introducción en el agua de
bebida, en los días 1 y 3, la responsable de la disminución de la
colonización por S. typhimurium.
Se han descrito vacunas para su uso en la
prevención de las enfermedades de las aves de corral y algunas de
esas vacunas son específicas para Salmonella (véase, p.ej.,
las patentes americanas U.S. 5.294.441, 5.389.368, 5.468.485 y
5387.744). Los procedimientos para la administración de vacunas en
las aves de corral varían, sin embargo, en función de la diana
contra la que actúa el agente activo. De hecho, se cree que, de
manera general, la vía de vacunación debería tener en cuenta el
lugar preferente de localización y replicación del microorganismo.
Por ello, para la enfermedad de Newcastle y los virus de la
bronquitis infecciosa que se multiplican en las vías respiratorias,
los procedimientos de elección de vacunación serían administración
de gotas oculares, por vía nasal y por el sistema respiratorio del
pollo o por pulverización (Giambrone, World Poultry Misset
13:19-23, 1997). Puesto que muchas de las
enfermedades más importantes del pollo tienen lugar en las vías
respiratorias, muchos de los estudios que describen la
administración de vacunas por pulverización para estas enfermedades
han utilizado este sistema de administración, debido a que el
pulverizado o aerosol es fácilmente inhalado por el ave y por esa
razón entra en contacto con la superficie de la mucosa de las vías
respiratorias superiores. La administración de vacunas para
enfermedades no respiratorias, como son las de diversos tejidos,
sistema circulatorio o intestino, se realiza generalmente por
inyección subcutánea o por administración oral mediante inoculación
o inclusión en el agua de bebida.
Las referencias que describen el uso de
pulverización en la administración de vacunas se han referido casi
exclusivamente a la inmunización contra agentes virales que invaden
las vías respiratorias como por ejemplo en la prevención de la
enfermedad de Newcastle, la encefalomielitis aviar, la enfermedad de
Marek, la laringotraqueitis, la bronquitis infecciosa y otras
semejantes.
Las vacunas bacterianas, en particular de
mutantes vivos atenuados derivados de cepas bacterianas parentales
altamente virulentas, también se han utilizado en las aves de
corral (Roland, K. et al., Efficacy of Salmonella
typhimurium vaccine strains expressing Escherichia coli 078
lipopolysaccharide to protect against E. coli challenge in
chickens, Resumen de la presentación en la Conf. Of. Res.,
Workers in Animal Diseases, Chicago, IL, No. 10, 1997). La
derivación de cepas mutantes atenuadas a partir de las parentales
altamente virulentas aumenta la probabilidad de que el mutante
atenuado no tan solo colonice el tracto intestinal, sino también el
tejido linfoide asociado al intestino (GALT) y se induzca una
inmunidad protectora (Véase, I., Curtiss III et al., en
Colinization Control of Human Bacterial Enteropathogens in
Poultry, Blankenship y col., eds, Academic Press, Inc., New
York, 1991, 169-198). En contraposición, la bacteria
que colonice el intestino pero que no invada y colonice el GALT, no
provocará una reacción inmune. Por ejemplo, en estudios con
ratones, se ha descrito que las repeticiones del
antígeno-0 del lipopolisacárido (LPS) en la
superficie de S. typhimurium son importante no únicamente
para la resistencia a mecanismos de defensa inespecíficos por parte
del huésped (Microbial Toxins, Vol. V, Roantree y col.,
eds., Academic Press, New York, 1971), sino también para que su
invasión sea efectiva a través de la mucina y el glicocalix que
recubren el tracto intestinal. En consecuencia, los mutantes
rugosos que carecen de los antígenos-O del LPS,
cuando se administran oralmente, son incapaces de invadir y
colonizar el GALT (Véase, p. ej. Curtiss y col., 1991,
supra).
En algunas referencias, se ha descrito la
administración de vacunas bacterianas a aves de corral por vía oral
o inyección subcutánea. Por ejemplo, una vacuna disponible
comercialmente para prevenir el paratifus en las palomas contiene
S. thyphimurium muerto y se administra por inyección
subcutánea (Vetafarm Paratyphoid Vaccine, Vetafarm Pty. Ld. Wagga,
Australia). Además, Curtiss y col., 1991, supra, han
descrito el uso de un derivado no virulento de un patógeno
Salmonella como vacuna de administración oral en pollos.
La vacunación por pulverización ha sido también
descrita en vacunas de bacterias que causan enfermedades
respiratorias. Hertamn y col., describieron una administración oral
o en aerosol de una vacuna de Pasteurella multocida en pollos
y en pavos para prevenir el cólera aviar, que es una enfermedad de
las vías respiratorias (patente americana U.S. 4. 169. 886). Ley y
col., han descrito la administración de gotas oculares y aerosol de
una vacuna que contiene Mycoplasma gallisepticum vivo que
produce una enfermedad de las vías respiratorias (Ley y
col., Avian Dieseases 41:187-194, 1997). Por
otro lado, la existencia de una vacuna disponible comercialmente que
contiene una cepa no virulenta de E. coli de serotipo 078
hace recomendable su utilización para la inmunización contra una
enfermedad respiratoria causada por una cepa parental de tipo
salvaje (véase Product Bulletin para GARAVAX®-T,
Schering-Plough Animal Health Corp., Omaha, NE). En
todas estas vacunas, se ha seleccionado la administración en aerosol
debido a que la enfermedad contra la que se deseaba vacunar a los
pollos implicaba una infección de las vías respiratorias.
En otra referencia se hace mención a que también
podría administrarse como aerosol, una vacuna que contenga una cepa
de E. coli K-12 no patogénica carente del
antígeno-O (patente americana U.S. 4.404.186). Sin
embargo, a cepa K-12 es una cepa adaptada al
laboratorio, y no es un enteropatógeno, por lo que dicho microbio no
tiene capacidad para invadir y colonizar el tejido linfoide
asociado al intestino. Ello significa que cualquier inmunización
provocada por esta vacuna debe ser consecuencia de la inmunización a
través de las vía respiratorias.
En algunas referencias, se sugiere la
pulverización local, nasal u ocular, de vacunas bacterianas (por
ejemplo, véase la patente americana U. S. 5.294.441.
Además, se ha descrito un procedimiento de
vacunación en los pollos que comprende la administración tanto oral
como por pulverización gruesa de una vacuna de Salmonella
typhimurium viva y no virulenta. La vacuna de S.
typhimurium atenuada puede modificarse genéticamente para
expresar antígenos foráneos determinados por genes clonados a
partir de otros patógenos (CURTISS R. y col.,: "Non recombinant
and recombinant avirulent Salmonella vaccines for poultry",
VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY, NL, AMSTERDAM, vol. 54,
01.11.1996.pp. 365-372, ISSN:
0165-2427). Sin embargo, ninguno de los anteriores
trabajos ha sugerido el uso de la pulverización corporal total
respecto a la administración de vacunas bacterianas
enteropatogénicas.
Por tanto, mientras que la administración por
pulverización de vacunas se ha descrito como adecuada en el control
de enfermedades respiratorias en las aves, la administración por
pulverización corporal total no se ha sugerido en las vacunas de
pollos para el control de patógenos humanos que a menudo se
encuentran en las aves o son transmitidos por éstas, pero que no
son agentes causantes de enfermedades respiratorias en las aves de
corral.
De acuerdo con ello, sería deseable disponer de
un procedimiento que redujera la contaminación de las aves de
corral por microbios enteropatógenos, especialmente Salmonella
spp., que pudiera utilizarse de forma simple y barata según las
condiciones normales de producción de aves de corral; que pudiera
así mismo utilizarse en los polluelos recién salidos del cascarón
sin manipulación individual; y que pudiera reducir o prevenir la
infección de vísceras y tejido linfático y del tracto intestinal de
las aves por microbios enteropatogénicos.
De acuerdo con la presente invención, se ha
descubierto que las vacunas pueden ser administradas a las aves
domésticas por pulverización corporal total. Las vacunas se
pulverizan en una cantidad efectiva para la estimulación de una
respuesta inmune, es decir anticuerpos y/o inmunidad celular.
Mientras que virtualmente cualquier vacuna puede ser administrada
por este procedimiento, la administración por pulverización
corporal total es sorprendentemente efectiva para vacunas que
contienen un derivado no virulento vivo de una bacteria
enteropatogénica. Tales bacterias enteropatogénicas son
preferentemente especies de Salmonella. Esta administración
de bacterias enteropatogénicas evita algunas de las desventajas de
las otras vías de administración, al no requerir manejo individual
de los polluelos, puede administrase así en el día de la eclosión y
es fácil de usar en las condiciones que normalmente se pueden
encontrar en los sistemas de producción comercial de pollos.
Las dosis efectivas, que estimulan una respuesta
inmune, son inesperadamente bajas y comparables con las dosis
efectivas en la administración por vía oral, como cuando se
incluyen en el agua de bebida. Normalmente las dosis de
administración de las vacunas vivas de la presente invención son
aproximadamente 10^{5} a 10^{8} unidades formadoras de
colonias.
La administración por pulverización de las
vacunas es aplicable para la vacunación de las aves de corral,
entre ellas de los pollos, a cualquier edad susceptible de recibir
efectos beneficiosos con la vacuna, pero es especialmente aplicable
para aves de 3 o menos semanas edad y preferentemente para aves de
menos de 1 día de edad.
En algunas realizaciones, la administración por
pulverización puede proseguirse con la administración de al menos
una dosis de refuerzo. Preferentemente, la dosis de recuerdo puede
administrase por vía oral en el agua de bebida o por pulverización
a los 14 días después de la administración.
El pulverizado suele estar formado por gotas cuyo
diámetro se halle en el intervalo de 50 y 150 micras.
La presente invención también permite reducir la
contaminación microbiana de las aves de corral por inmunización de
éstas contra un contaminante microbiano mediante la administración
mediante pulverización corporal total de un compuesto inmunogénico.
El contaminante microbiano puede ser o no ser patogénico para las
aves de corral, sin embargo, cuando se halle en el ave puede
producir síntomas de la enfermedad en el hombre que la consume su
carne u otros productos alimentarios derivados de ésta. El
contaminante puede ser cualquier contaminante de los referidos, en
particular microbios que colonizan el tracto intestinas de las
aves.
La composición inmunogénica se administra en una
cantidad efectiva que provoque una respuesta inmune, es decir
anticuerpos y/o inmunidad celular, contra el microbio contaminante.
Preferentemente, la composición inmonogéncia comprende un derivado
virulento vivo de una bacteria enteropatógena.
La composición inmunogénica se administra en
dosis que provocan una respuesta inmune efectiva. Tales dosis son
aproximadamente comparables a las que resultan efectivas por
administración oral. Normalmente las dosis para la administración de
vacunas vivas de la presente invención, son aproximadamente de
10^{5} a 10^{8} unidades formadoras de colonias.
La administración por pulverización de una
composición inmunogénica de lapresente invención, es aplicable para
la vacunación de aves a cualquier edad susceptible de beneficiarse
de la vacuna, pero, es especialmente adecuada en pollos de 3 o
menos semanas de edad y, preferentemente en aves de menos de 1
día.
En algunas realizaciones, la administración por
pulverización puede continuarse con la administración de la
composición inmunogénica en al menos una dosis de recuerdo
administrada oralmente en el agua de bebida, preferentemente 14 días
después de la administración por pulverización.
El pulverizado grueso suele estar formado por
gotas de diámetros de aproximadamente 50 a 150 micras.
Entre algunas de las ventajas presentadas por la
presente invención, se puede citar que proporciona un procedimiento
nuevo para la vacunación de aves domésticas mediante una bacteria
enteropatógenica; proporciona un procedimiento de reducción de la
colonización del tracto intestinal, tejido linfático y visceral por
enteropatógenos microbianos; proporciona un procedimiento para
reducir la contaminación microbiana en las aves de corral
destinadas al consumo humano; proporciona un procedimiento que
resulta fácil y barato de administrar en las condiciones normales de
producción comercial de aves de corral y proporciona un
procedimiento que permite la administración a las aves jóvenes,
especialmente a los polluelos recién eclosionados, sin manipulación
individual.
En la figura 1, se muestra la recuperación de la
cepa de vacuna de S. typhimurium \chi3985 de los tejidos
del bazo y la bolsa de Fabricio, de las heces y contenidos fecales
de polluelos leghorn blancos después de 7 días de recibir
(a) 10^{5} CFU, (b) 10^{7} CFU o (c) 10^{9} CFU de \chi3985
por pulverización gruesa o por procedimientos orales de liberación
el día de la eclosión del huevo.
En la figura 2, se muestra la recuperación de la
cepa de vacuna de S. typhimurium \chi3985 de los tejidos
del bazo y la bolsa de Fabricio, de las heces y contenidos fecales
de polluelos leghorn blancos después de 20 días de recibir
(a) 10^{5} CFU, (b) 10^{7} CFU o (c) 10^{9} CFU de \chi3985
mediante pulverización gruesa o por procedimientos orales de
liberación en los días del 1 al 14.
En la figura 3, se muestran las respuestas en el
suero de IgM, IgA y IgG detectadas mediante LPS de S.
typhimurium purificado en polluelos leghorn blancos de
20 días de edad, inmunizados y reforzados con: (a) 10^{5} CFU, (b)
10^{7} CFU o (c) 10^{9} CFU de S. typhimurium \chi3985
por pulverización gruesa o por procedimientos orales de liberación
en los días del 1 al 14.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la administración por pulverización corporal
total puede utilizarse para la liberación de vacunas o compuestos
inmunogénicos de derivados vivos y no virulentos de bacterias
enteropatogénicas en aves domésticas, y además puede provocar una
respuesta inmune efectiva.
La administración por pulverización corporal
total de la presente invención, permite la liberación de la vacuna
o composiciones inmunogénicas en el tracto gastrointestinal de las
aves. La administración por pulverización o la vacunación por
pulverización, tal como se utiliza aquí, pretende liberar gotas de
un líquido que contiene la vacuna o una composición inmunogénica.
La administración por pulverización corporal total pretende la
liberación de tales gotas de vacuna o composición inmunogénica a una
gran proporción de la superficie corporal del ave. Se diferencia
así, de la liberación mediante pulverización localizada, como puede
ser la intranasal en humanos que supone la administración en sólo
un área diana específica, pequeña y localizada. La administración de
una pulverización corporal total para la administración de
bacterias enteropatogénicas de la presente invención, libera de
manera indiscriminada el microbio de la vacuna a una gran
proporción de la superficie corporal de las aves de corral,
precisamente a en la zona de la superficie corporal accesible al
dispositivo (véase por ejemplo, las patentes americanas U.S.
4.316.464 y 4.449.968, incorporadas en las referencias). La
administración de vacunas o de composiciones inmunogénicas por
pulverización corporal total de la presente invención es aplicable
especialmente para la administración a un gran número de aves de
corral al mismo tiempo.
En la presente invención, la administración por
pulverización, supone preferentemente, la liberación de un
pulverizado grueso, que contiene la vacuna o el compuesto
inmunogénico. Sin abrazar ninguna teoría en particular, se cree, sin
embargo, que la administración de una vacuna o composición
inmunogénica como un pulverizado grueso permite que las gotas de
éste entren en contacto con la superficie del cuerpo al mismo
tiempo que se minimiza la cantidad de vacuna que es inhalada hacia
las zonas inferiores de las vías respiratorias. Se diferencia así
de un pulverizado de gotitas finas o niebla, tal como comúnmente se
denomina el aerosol con gotitas de un diámetro inferior a 40
micras. Al contrario que el pulverizado de tipo aerosol, el
pulverizado grueso de la presente invención seguramente no se
inhala tan profundamente, y así se favorece evitar el desarrollo de
infecciones respiratorias observadas en algunas vacunaciones por
pulverización (véase por ejemplo la patente americana U.S.
4.449.968, Clarke y col., Austr. Vet. J.
56:424-428, 1980). Un pulverizado grueso, tal como
se utiliza aquí, significa un pulverizado compuesto de gotitas de
líquido con un diámetro suficiente para evitar la inhalación de las
gotitas hacia la zona inferior del sistema respiratorio de las
aves, pero permitiendo el contacto del pulverizado con la superficie
corporal. A la consistencia del pulverizado grueso se la ha
denominado "lluvia de pulverización" y es preferible que el
pulverizado tenga menos de un 1% de gotitas con un tamaño inferior a
12 micras. El pulverizado grueso se compone de gotitas que tienen
el mismo diámetro de aproximadamente 40 a 200 micras,
preferentemente de 40 a aproximadamente 200 micras, más
preferentemente de 50 a 150 y todavía más preferentemente de 50 a
100 micras. Alternativamente, el pulverizado grueso puede tener
aproximadamente el 80% de gotitas de 90 a 190 micras.
El tipo de equipo para la administración de la
vacuna por pulverización no es crítico y puede utilizarse casi
cualquier equipo capaz de dispersar una pulverizado grueso (véase
por ejemplo las patentes americanas U.S. 4.316.464, 4.449.968,
4.674 y 5,312.353).
La administración del pulverizado de la presente
invención libera la vacuna que contiene un derivado vivo no
virulento de una bacteria enteropatogénica. El microbio de la
vacuna es una enterobacteria capaz de colonizar el tracto intestinal
y el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) de las aves de
corral. Estos microbios sirven como un componente inmunogénico de
la vacuna o compuesto inmunogénico e incluye miembros de la familia
de las Enterobacteriáceas como Escherichia, Klebsiela, Proteus,
Yersinia y Erwinia. En particular, Salmonella,
Escherichia y los híbridos de
Salmonella-Escherichia son útiles en la
presente invención, incluyendo de manera preferente E. coli
y Salmonella, así como S. typhimurium, S. typhi, S.
paratyphi, S. entertidis, S. dublin, S. gallinarum, S. pullorum ,
S. areizona y S. cholenaesulis.
El derivado no virulento de una bacteria
enteropatogénica también puede servir como una bacteria portadora
para distribuir al GALT, antígenos seleccionados. Estas bacterias
portadoras contienen y expresan un gen recombinante de un organismo
patogénico de manera que estimulan la inmunidad celular y/o a través
de anticuerpos como normalmente ocurriría con el producto del gen
antigénico, producido normalmente por el organismo patógeno. Es
posible por tanto utilizar un derivado no virulento de una bacteria
enteropatogénica administrada por pulverización para distribuir una
amplia variedad de microbios y estimular una respuesta inmune en
las aves de corral contra microbios que no necesariamente sean
capaces de colonizar el tracto gastrointestinal (GI).
Además, en las aves de corral, los microbios no
virulentos, pueden utilizarse como vectores para la síntesis de
varias proteínas. Ya que los microbios no virulentos de la presente
invención son capaces de atravesar el GALT después de la
administración por pulverización y entrar en el tracto
gastrointestinal de las aves de corral, los microbios pueden
utilizarse para producir y liberar productos génicos, como por
ejemplo, factores de crecimiento o productos inmunoreguladores o
substancias que estimulen o supriman funciones fisiológicas. Estos
microbios contienen y expresan un gen recombinante que codifica la
proteína que se desea.
El término bacteria enteropatogénica significa
microbio que es capaz de colonizar el tracto intestinal y el
sistema linfoide asociado al intestino de las aves de corral. Tal
como se utiliza aquí, patógeno significa microbio capaz de causar
síntomas de enfermedad o dañar las funciones fisiológicas normales.
Las vacunas de la presente invención contienen derivados no
virulentos de una cepa de bacterias enteropatogénicas. Por derivado
o cepa derivada se entiende que proviene de una cepa emparentada
modificada genéticamente de la descienden. Patogénico significa que
el microbio es capaz de causar enfermedad o dañar las funciones
filológicas normales. Cuando se refiere a la no virulencia
significa que una cepa microbiana particular no es capaz de inducir
todo el conjunto de síntomas que supone un estado de enfermedad, y
que se asocia normalmente con el microbio correspondiente. Por
tanto la no virulencia incluye un estado de virulencia disminuida o
una capacidad reducida para producir las condiciones de enfermedad,
sin que el microorganismo no virulento sea necesariamente incapaz
de completamente de dañar las funciones fisiológicas normales del
huésped. Además, un microbio no virulento, no es necesariamente
incapaz de funcionar como patógeno, pero es utilizado como no
virulento en comparación con el microbio virulento correspondiente.
Preferentemente, la bacteria enteropatogénica de la que se ha
derivado el microbio no virulento es patogénica al menos en el día
de la salida del cascarón de los polluelos.
En una realización preferente de la presente
invención, el derivado vivo no virulento de una bacteria
enteropatogénica es un S. typhimurium como el \chi3985 que
tiene las mutaciones \Deltacya-12/\Deltacrp-11. La
construcción de esta o de otras cepas se describe en detalle en la
patente americana U.S. 5.294.441.
La respuesta inmunógena a un compuesto o vacuna
es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune mediada por
células o/y anticuerpos contra el compuesto o la vacuna de interés.
Normalmente, esta respuesta consiste en la producción por el
individuo de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T
supresoras y/o células T citotóxicas dirigidas específicamente
contra un antígeno o antígenos incluidos en el compuesto o la
vacuna de interés.
Por vacuna se entiende un agente que estimula el
sistema inmune de un individuo de manera que se le proporciona una
protección contra un antígeno no reconocido como
auto-antígeno por su sistema inmune. La inmunización
se refiere al proceso de inducción de un nivel alto y continuado de
anticuerpo y/o respuesta celular en la que los linfocitos T pueden
destruir al microbio invasor y/o activar otras células (p.ej.,
fagocitos) en un individuo que ha sido previamente expuesto al
microbio o al antígeno. El término sistema inmune hace referencia a
las características anatómicas y los mecanismos por los que un
individuo produce anticuerpos contra un material con capacidad
antigénica que invade sus células o fluidos
extra-celulares y que también incluye la respuesta
celular inmune. En el caso de la producción de anticuerpos, el
anticuerpo que se produce puede pertenecer a cualquier tipo
inmunológico como son las inmunoglobulinas, A, D, E, G o M. De
particular interés resultan las vacunas con producción estimulada de
inmunoglobulina A (IgA), puesto que ésta es la primera
inmunoglobulina producida por el sistema secretor de los animales
de sangre caliente, aunque las vacunas de la invención no están
limitadas a aquellas que estimulan la vía de producción de IgA.
Así, las vacunas naturales descritas aquí, producen un amplio rango
de otras respuestas inmunes además de la formación de IgA, por
ejemplo la inmunidad celular y humoral. Por cuanto la respuesta
inmune a los antígenos se ha estudiado ampliamente y así mismo
existen abundantes publicaciones al respecto, se incluye aquí una
referencia a modo de revisión de inmunología en Elgert, Klaus D.,
Immunology Willey Liss, Inc., (1996) Stite y col., Basic
& Clinical Immunology. 7^{th}. Ed., Appleton & Lange,
(1991).
En la presente invención, un individuo tratado
con una vacuna hace referencia a una especie de ave, incluyéndose
aves domésticas, particularmente aquellas de importancia en
agricultura. Tal como se utiliza aquí, las aves domésticas o de
corral, incluyen cualquier variedad de ave doméstica o individuos
de estas especies, como pollos, pavos, patos, ocas, palomas,
avestruces, emús y en particular aquellas aves domésticas o
individuos para la producción de huevos o carne.
La vacuna puede prepararse mediante el
crecimiento de la cepa de la vacuna en un medio adecuado y después
utilizarse como tal o formando parte de una determinada composición
de vacuna por combinación con los medios de cultivo, o de las
células que en él crecen, en un diluyente de elección. Los
diluyentes adecuados son preferentemente líquidos que no tengan
efectos adversos en la estabilidad y vitalidad del cultivo de
vacuna y con una viscosidad similar a la del agua para que se formen
fácilmente las gotitas del pulverizado grueso. El diluyente,
preferentemente está exento de cloro, antibióticos, agentes
antimicrobianos, o cualquier otro agente que pueda ser dañino para
los organismos vivos de la vacuna. La vacuna debe dispersarse en el
diluyente de manera que no se presenten masas o trozos sólidos en
el diluyente y debe permanecer a una temperatura que tampoco
resulte dañina para los microbios de la vacuna. Ejemplos de
diluyentes adecuados son el agua, el agua destilada, el agua
desionizada, la leche desnatada, el agua con estabilizante de
vacunas de Marek, tampón salino con gelatina y componentes similares
que son bien conocidos para las personas que trabajan en este
campo. La vacuna se introduce preferentemente en el diluyente a una
temperatura similar a la temperatura ambiente o se enfría desde
34ºC hasta 15ºC.
En una realización, la vacuna se preparó a partir
de S. typhimurium UK-1 \Deltacya
\Deltacrp \chi3985. Tal como se utiliza aquí, esta
vacune puede referirse como \chi3985, o \chi3985, o \chi3985,
código de Producción 19C1.01. La cepa bacteriana de la vacuna puede
prepararse fresca, tal como se ha descrito arriba, o puede
recuperarse de un cultivo guardado por ejemplo, como cultivo
congelado en seco, o simplemente congelado (por ejemplo a -70ºC,
como reservorio para siembra) o de cualquier otra manera. U inóculo
de dicho cultivo se crece hasta alcanzar la fase tardía de una curva
de crecimiento logarítmico en un caldo de Luria a 37ºC. A modo de
ejemplo, un reservorio para siembra a -70ºC puede utilizarse para
inocular 50 ml de caldo de Luria en una matraz estéril de 250 ml.
El matraz se incuba como un cultivo estático a 37ºC durante toda la
noche. Después de 12-24 h, 50 ml del cultivo
estático de una noche se pipetean en 450 ml de caldo de Luria
precalentado en un matraz sin deflector de 1 l a 37ºC, colocándose
en un incubador New Brunswick con agitación a 150 rpm. Cuando el
cultivo alcanza una OD_{600} \geq 1.0, las células se
precipitan por centrifugación (4400 rpm, 15 min en una centrífuga
Centra MP4, IEC con un rotor basculante 3224) a temperatura
ambiente. Las células se resuspenden en 40 ml a temperatura
ambiente con tampón salino y gelatina (BSG). El título de
composición de la vacuna puede determinarse mediante diluciones
seriadas del orden de diez veces la suspensión celular en BSG, y
sembrar 100 \mul de las diluciones de 10^{-8} y 10^{-7} en
agar de MacConkey + 1% maltosa para plaqueo. El título de la cepa
de la vacuna se determina mediante contaje de las colonias que se
desarrollan tras incubación de las placas. El título se expresa en
término de unidades formadoras de colonias del microbio de la
vacuna (CFU) por unidad de volumen de la vacuna.
Para su aplicación a las aves de corral, la
vacuna se preparó tal como se ha descrito arriba y el cultivo se
diluyó a la dosis deseada de densidad o título, en el diluyente de
elección. El tampón del diluyente se ajustó hasta el pH y la fuerza
iónica necesarios para mantener la estabilidad y la vitalidad de la
cepa de la vacuna. Después de ello, la vacuna ya está lista para
ser cargada en un pulverizador y para administrarse a las aves de
corral.
La administración por pulverización puede
realizarse también de forma que se administre sólo una dosis
concreta por ave. Una técnica que puede servir para distribuir y
fijar la dosis de la vacuna es pulverizar las aves en un espacio
cerrado durante un período de tiempo calculado a una tasa de
liberación volumétrica conocida. Sabiendo el número de aves que se
han de vacunar, la dosis deseada de vacuna por ave, el título de la
vacuna y la tasa de liberación del equipo de pulverización, una
persona con experta en la materia puede fácilmente calcular el
tiempo de pulverizado para distribuir la dosis requerida por ave.
Además, algunos modelos de equipos disponibles comercialmente
permiten preseleccionar el volumen de líquido a distribuir a un
número conocido de aves.
La vacuna o la composición inmunogénica de la
presente invención se administra a una dosis o cantidad que resulte
efectiva. Tal como se utiliza aquí, una cantidad de vacuna o
composición inmunogénica efectiva, es aquella cantidad suficiente
para provocar una respuesta inmune contra una diana microbiana o
antígeno contra el que se vacunan las aves de corral. Esta
respuesta inmune, implica la producción de anticuerpos y/o a la
inmunidad celular. Un aspecto significativo de la presente invención
es que la vacuna o la composición inmunogénica puede administrase a
una dosis aproximadamente igual a la dosis efectiva tras
administración oral, por ejemplo por inclusión en el agua de la
bebida.
Preferentemente, el pulverizado se administra a
las aves cuando son menores de 1 día de edad, p.ej., en el día de
la salida del cascarón. También es preferible administrar una o más
aplicaciones de recuerdo de la vacuna un tiempo después de la
administración inicial. Las aplicaciones de recuerdo se administran
en cualquier momento de la vida de las aves mientras éstas son
susceptibles de recibir efectos beneficiosos con la vacunación.
Preferentemente, estas aplicaciones de recuerdo se realizan entre
los 5 y 21 días de edad, mejor entre los 6 y 15 y aún más a los 7
o a los 14 días de edad o ambos dos.
La dosis de recuerdo se administra normalmente en
el agua de bebida aunque puede administrarse por cualquier vía,
incluida la administración por pulverización. La administración de
la vacuna en el agua de la bebida se realiza mediante cualquiera de
los procedimientos conocidos en la materia. A modo de ejemplo
únicamente, la administración en el agua de bebida puede realizarse
utilizando el siguiente procedimiento. En primer lugar, se eliminan
del agua de bebida todos los desinfectantes, esterilizantes y
antimicrobianos 24 horas antes de la administración de la vacuna.
Esta agua sin desinfectantes, eterilizantes y antimicrobianos se
suministra durante las 24 horas siguientes a la vacunación. La
vacuna puede así mezclarse con el agua limpia que no contiene ya
ningún agente esterelizante ni antimicrobiano. Cincuenta litros de
agua conteniendo la vacuna pueden utilizarse para 500 aves, por
ejemplo pollos, y además debe proporcionarse un espacio amplio para
que las aves puedan beber fácilmente. El agua conteniendo la vacuna
debe ser consumida en 2 o menos horas. Para asegurar que las aves
beban, el agua debe retirarse una o dos horas antes de la
administración del agua de bebida con la vacuna.
Debido a que la cantidad de dosificación para la
administración por pulverización de la vacuna o del compuesto
inmunogénico calculada es aproximadamente la misma que la cantidad
de dosificación oral en el agua de bebida, ambas cantidades son de
preferencia casi iguales. Por ejemplo para pulverización se calcula
una dosis de 10^{7}unidades formadoras de colonias para las aves
y normalmente alrededor de 10^{7} unidades formadoras de colonias
se administran a las aves en el agua de la bebida. La administración
inicial por pulverización y las subsiguientes dosis de recuerdo
administradas en el agua de la bebida difieren menos de 100 veces,
mejor que difieran menos de 10 veces e incluso menos de tres veces
y aún mejor menos del 10%.
Es preferible que las aves de corral que vayan a
ser vacunadas sean de una edad susceptible de recibir efectos
inmunogénicos beneficiosos de la vacuna. Mientras esto puede variar
según las especies, en las aves de corral se ha encontrado que los
efectos beneficiosos se obtienen desde el momento de la eclosión del
huevo hasta alrededor de las 104 semanas de edad. Se prefiere que
éstas sean tengan de 1 día a 52 semanas, mejor de 1 día a 3 semanas
e incluso de 1 día a 2 semanas, y aún mejor de 1 día a 1 semana,
pero lo más adecuado es que sean de 1 día después de la eclosión del
huevo. Tal como se ha utilizado aquí, el término "día de la
eclosión del huevo" se puede utilizar de modo intercambiable por
el término "menos de 1 día de edad".
Una ventaja del procedimiento presente, es que
puede modificarse según las condiciones que normalmente concurren en
los criaderos comerciales de aves de corral. Normalmente, los
productores comerciales importante de pollos o pavos se
caracterizan por tener granjas grandes de corral con más o menos
automatización en los sistemas de agua y alimentación y albergan
1000 aves por edificio; a menudo 5.000 aves e incluso 20.000.
El procedimiento presente puede utilizarse en las
incubadoras o granjas de cría de los nuevos polluelos recién salidos
del cascarón, pulverizando los polluelos en compartimentos
especiales para polluelos o otros, bandejas o cajas antes de
dejarlos en la granja para polluelos o en el criadero de aves. De
forma alternativa, tanto los polluelos jóvenes como los mayores
pueden pulverizarse después (véase p.ej., Grieve, Poultry Times, p.
18, Septiembre 22, 1997; y Giambrone, 1997, supra).
Debido a la realización de este procedimiento, el
coste de la vacunación de las aves de corral puede ser muy bajo. El
alto coste de la manipulación individual de los polluelos, se evita
así por la capacidad de vacunar a docenas de polluelos al mismo
tiempo y en unos pocos segundos. La administración correcta de la
dosis de vacuna a cada uno de los polluelos minimiza la
sobredosificación y la aplicación ineficiente de la vacuna.
Los siguientes ejemplos describen las
aplicaciones preferentes de la invención. Otras aplicaciones dentro
del ámbito de las reivindicaciones de la presente invención serán
evidentes para un experto en la materia tras considerar la
especificación o práctica de la invención, tal como se describe
aquí. Se pretende, que la especificación, junto con los ejemplos,
se considere un ejemplo de la realización, mientras que el ámbito
de la invención está indicado por las reivindicaciones incluidas a
continuación de los ejemplos.
Este ejemplo muestra que la vacunación por
pulverización de polluelos jóvenes con una vacuna de S.
typhimurium fue tan efectiva como la administración oral
directade la vacuna en inducir la inmunidad sérica y en reducir la
colonización del tracto intestinal y los tejidos viscerales por el
microbio de la vacuna.
Para determinar la eficiencia de la colonización
y la inducción de la inmunidad por la vacuna del mutante
\Deltacya\Deltacrp vivo y no virulento de S.
thyphimurium, el presente estudio investigó el uso de una
pulverización gruesa como sistema de liberación de las vacunaciones
primarias o de refuerzo en polluelos de un día de edad. A dos
grupos de aves, se les administró la vacuna por vía oral. Además a
dos grupos más pequeños de aves se les administró el tipo salvaje
de S. typhimurium, UK-1
MGN-054s, mediante procedimientos de pulverización e
inoculación oral y se determinó la Dosis Letal_{50}. La
colonización del bazo, la bolsa de Fabricio, el tracto intestinal y
el ciego por la cepa de la vacuna a los 7 y 20 días de edad se
determinó para los grupos de aves que recibieron la cepa de la
vacuna por vía de pulverización gruesa y por el procedimiento de
liberación directa oral. Las respuestas de anticuerpo sérico se
cuantificaron por ELISA en el suero recogido de los vacunados de 20
días.
Los objetivos de este estudio fueron: 1)
determinar si los polluelos jóvenes vacunados por el procedimiento
de la pulverización gruesa son colonizados tan eficientemente por la
cepa de la vacuna en comparación con los polluelos vacunados por la
ruta directa de vacunación oral y, 2) evaluar la inmunidad en el
suero provocada por dosis escaladas de vacuna administrada por
pulverización gruesa o por administración oral. Puesto que existe
un punto de no retorno, letal, que puede determinarse en polluelos
de un día de edad (pero no en polluelos de 3 días de edad), la cepa
emparentada con el tipo salvaje de S. typhimurium se incluyó
para ver si ambos procedimientos de liberación podrían
eficientemente y de manera comparable causar la enfermedad.
S. typhimurium UK-1
\Deltacya-12 \Deltacrp-11\chi3985 es una cepa atenuada de la vacuna (véase Curtiss
III, y col., en Colonization Control of Human Bacterial
Enteropathogens in Poultry, Blankenship y col., eds. Academic
Press, New York, 1991, pp- 169-198). Esta cepa se
creció como un cultivo fresco hasta la fase tardía de la curva
logarítmica de crecimiento, en caldo de cultivo de Luria y
subsiguientemente se diluyó en tampón salino con gelatina hasta la
dosis de densidad deseada. La vacuna se preparó para su liberación
en dosis escaladas de 10^{5}, 10^{7}y 10^{9} CFU (unidades
formadoras de colonias) en grupos de polluelos leghorn
blancos de 4 días de edad. Los polluelos se trataron con
pulverizado grueso (gotitas de alrededor de 140 micras de diámetro)
con un dispositivo de vacunación por pulverización (Preval Power
Unit, Precision Valve Corporation, Yonkers, NY, 10703) o
directamente por vacunación oral administrada con una jeringa de
18x7,5 mm con una bola de 3 mm unida al extremo de la aguja. Las
aves se mantuvieron en Purina Start y Grow sin coccidiostáticos o
antibióticos.
Dosis escaladas de una cepa emparentada con S.
typhimurium salvaje, MGN-054s, se prepararon en
tampón salino con gelatina de un cultivo fresco de la fase tardíade
la curva de crecimiento logarítmica en caldo de cultivo de Luria y
se administraron a los grupos de polluelos leghorn blancos de
3 días de edad mediante pulverización gruesa o por administración
oral directa.
Todos los grupos de aves recibieron la cepa de la
vacuna en el día de la eclosión del huevo y se administró una
inoculación de recuerdo en el día 14 mediante la misma ruta y dosis
utilizada en la primera inoculación. A los 7 y 20 días de edad se
practicó la eutanasia en los grupos de aves por asfixia con CO_{2}
y se realizaron las necropsias de manera aséptica para recoger
muestras del bazo y de la bolsa de Fabricio, material fecal y
contenido del ciego para la enumeración de la cepa de la
vacuna.
El suero se separó de la sangre recogida durante
el día 20 en la necropsia y se diluyó 1:200 para el ensayo de ELISA.
Brevemente, LPS purificado de S. typhimurium se utilizó para
la comprobación del antígeno. Se utilizaron anticuerpos de cabra
policlonales purificados por afinidad anti-IgA, -IgM
e -IgG de pollo: EC2-001, EC2-005 y
EC2-0011, respectivamente (de Immunovision,
Springdale, AR) a una dilución de 1/5000 para probar IgM, IgA o IgG
de pollo unidas al antígeno LPS purificiado en las placas de ELISA
(Dynatech Laboratories Inc, Alexandra, VA). Se utilizó un
anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra (toda la
molécula) conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma, St. Louis, MO) a
una dilución de 1/3000 con P-nitrofenil fosfato
(Sigma, St. Louis, NO) (1 mg/ml) en tampón de dietilamina a pH 9,8
como substrato. La reacción se paró al cabo de 30 minutos de
incubación con 50 \mul de hidróxido de sodio 3M. Las absorbancias
se leyeron a 405 nm mediante un lector de microplacas automático
(Bio-Tek, Winooski, VT). Los resultados del ELISA se
expresaron como media de las absorbencias (405 nm) de cuatro pollos
en un grupo de tratamiento. El punto de corte se tomó como 2X la
media de la absorbancia del suero de los pollos no infectados que
sirvieron como línea de base para la detección de los isotipos de
inmunoglobulinas de pollo por ELISA.
No se observó mortalidad en los grupos de aves
que recibieron dosis de la vacuna hasta 10^{9} CFU administradas
los días 1 al 14. Las DL_{50} observadas en los grupos de
polluelos de un día de edad que recibieron dosis escaladas de la
cepa emparentada con el tipo salvaje virulento por pulverización
gruesa o por el procedimiento oral fueron de 10^{3} CFU, la misma
determinada previamente por inoculación oral de polluelos de un día
de edad.
La figura 1(a, b y c) muestra la
recuperación de la cepa de vacuna del bazo, bolsa de Fabricio,
contenido fecal y ciego de aves 7 días después de recibir la cepa
de la vacuna el día 1 después de la eclosión del huevo. La figura 2
(a, b y c) muestra la recogida de cepa de vacuna del bazo, bolsa de
Fabricio, contenido fecal y ciego de aves de 20 días después de
recibir la cepa de la vacuna en los días 1 al 14. La cepa de la
vacuna colonizó los tejidos viscerales y linfáticos así como el
tracto intestinal eficientemente en el 100% de las aves del
muestreo. En otro estudio, comparando estos dos procedimientos de
liberación de la vacunación, se observaron resultados similares con
pollos para carne alimentados con Purina Start and Grow
suplementada con los niveles recomendados de bacitracina
(BMD-50) y un coccidiostático
(Coban-100). En general, para todos los niveles de
dosis comparados, no se detectaron diferencias significativas
utilizando la pulverización gruesa o la inoculación oral directa de
la vacuna de S. typhimurium \chi3985 a aves
leg-horn o para producción de carne. Los
niveles de IgM, IgA e IgG específicos para Salmonella
detectados por ELISA contra pollos el LPS de S. typhimurium a
los que se había administrado la vacuna \chi3985 se han
representan en la Figura 3. Dosis entre 10^{5} y 10^{9} CFU
indujeron significativamente respuesta humoral mediante cualquier
procedimiento de liberación empleado. La dosis mayor, de
10^{9}CFU, indujo la mayor respuesta de anticuerpos en
comparación con las dosis menores. Las IgM fueron las
inmunoglobulinas predominantes a los 20 días de edad, en todas las
aves analizadas para todos los grupos de dosis. Se ha descrito que
las IgM son el isotipo predominante a las 3 semanas de
postvacunación por vía oral (Hassan and Curtis, Res.
Microbiol., 141:839-850,1990). El aumento de
las respuestas de anticuerpos que se reflejaron por una mayor
OD_{405}, se detectaron en el presente estudio, en aves que
recibieron 10^{7} o 10^{9} CFU por pulverización en comparación
con aves que recibieron 10^{7} o 10^{9}CFU por liberación oral
directa.
Este ejemplo muestra la eficacia de la vacunación
por pulverización de una vacuna de S. typhimurium viva y no
virulenta, en la prevención de la colonización del tracto GI y de
los órganos intestinales por S. typhimurium de tipo
salvaje.
Se inmovilizaron las alas de cincuenta y cinco
polluelos leghorn blancos SPF de un día de edad para
utilizarlos en este ensayo. Treinta aves, con un día de edad, se
vacunaron mediante pulverización gruesa con 1 X 10^{7} CFU por
dosis de vacuna S. typhimurium, en aproximadamente 0,3
ml/por ave, con un dispositivo de pulverización de Preval Power de
Precision Valve Corp., Yonkers, NY 10703. La vacuna fue \chi3985,
Product Code 19C1 (Maine Biological Laboratories, Inc., Waterville,
ME). Veinte aves que recibieron 0.3 ml/por ave de agua destilada
por pulverización gruesa, sirvieron como controles. Cinco aves
adicionales se reservaron como controles contemporáneos. Las aves
vacunadas y los controles se alojaron separadamente en unidades de
aislamiento Horsfal. A las dos semanas de edad, las vacunadas fueron
reforzadas en el agua de la bebida con 1 X 10^{7} CFU por dosis
de la misma vacuna. A las seis semanas de edad, todas las aves en
ambos grupos de tratamiento fueron estimuladas individualmente con
una dosis oral de 1 X 10^{6} CFU en 0,1 ml S. typhimurium
de tipo salvaje.
En ambos grupos de tratamiento, se recogieron
hisopos cloacales de cada ave antes de estimular y en el momento del
sacrificio para poder hacer un seguimiento de Salmonella sp.
Los hisopos se colocaron en 5 ml de caldo TBGH y se incubaron
durante 24-36 horas a 42ºC. Después de 36 horas, el
caldo se dispersó en agar verde brillante +
35 \mug /ml de novobiocina (BGAN) y se incubó a 42ºC.
35 \mug /ml de novobiocina (BGAN) y se incubó a 42ºC.
A las siete semanas de edad, todas las aves
sufrieron eutanasia y los tejidos se recogieron y se cultivaron
para el tipo salvaje de S. typhimurium tal como sigue:
Aproximadamente 5 mg del bazo, hígado, riñón y cualquier órgano
presentando lesiones visibles se extrajo asépticamente de cada una
de las aves. El bazo, el hígado y el riñón obtenidos de la misma
ave, se reservaron. Cualquier órgano que presentara lesiones
visibles se recogió y procesó separadamente. Además una muestra de
10 mm del duodeno, íleon e intestino grueso con contenido fue
asépticamente obtenida de cada ave y se procesó individualmente.
También, 1 gramo de ciego con contenidos se recogió de cada ave y
se procesó de forma similar.
Para el cultivo de Salmonella sp., los
tejidos se depositaron en una bolsa estéril Whirl®pak y maceraron
en una trituradora Stomacher y se añadieron 5 ml de caldo Hajna
verde brillante tetrationato (TBGH) a cada bolsa. Las bolsas de
tejidos se incubaron durante 24-36 horas a 42ºC,
posteriormente, de cada cultivo se tomó una muestra con el asa de
siembra y se cultivó en agar BGAN. Al cabo de 36 h a 42ºC, se
examinaron las placas para confirmar el crecimiento característico
de las CFU en agar BGAN. Después de 48 h de incubación, 1 ml de
TBGH del cultivo de la bolsa se transfirió a un tubo de 4 ml de
caldo TBGH fresco, el tubo se incubó durante 5 días y después se
sembró en agar BGAN. Las placas se examinaron al cabo de 36 horas de
incubación a 42ºC. Se realizó un ensayo de aglutinación con el suero
del grupo B de Salmonella sp. en al menos una colonia por
placa de todas las placas para confirmar la presencia de la cepa
agresiva F98 de S. typhimurium de tipo salvaje.
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No se observaron reacciones clínicas a la vacuna
después de la vacunación. La cepa de la vacuna se aisló de una de
las 30 aves 8 días después de la vacunación; pero no se recogió de
ninguna ave después del día del estímulo. No hubo muertes en el
curso del ensayo.
Los resultados de los cultivos de todos los
hisopos cloacales pre- y post-estímulo se presentan
en la Tabla 2, de más adelante. El organismo de la vacuna se aisló
el día 8 de post-vacunación de una de las 30 aves;
en todas las aves vacunadas el cultivo fue negativo cuando se
retomaron muestras el día 42 post-vacunación
primaria. Siete días después del estímulo, se obtuvo cultivo de
S. typhimurium de tipo salvaje se cultivó del hisopo cloacal
en el 13% de las aves vacunadas, comparado con el 40% en las aves
sin vacunar que recibieron únicamente agua destilada.
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Las aves vacunadas y sin vacunar también
presentaron diferencias en el grado de colonización del tracto GI y
por otro lado, en el bazo, hígado y riñón (véase la Tabla 3). S.
typhimurium de tipo salvaje se cultivó a partir de tejido de
órganos reservados en el 85% de los controles de las aves sin
vacunar en comparación con el 13% de aves vacunadas (P\leq0,05).
Una reducción significativa en el número de cultivos positivos del
ileon e intestino grueso se encontró entre las aves vacunadas y sin
vacunar (P\leq0.5). Una reducción significativa se encontró en el
número de cultivos positivos en muestras de ciego entre aves
vacunadas y sin vacunar (P\leq0,05). No se pudieron determinar
diferencias entre el número de cultivos positivos en muestras de
duodeno de aves vacunadas y sin vacunar.
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La vacuna de S. typhimurium vivo
modificado proporciona protección a las aves vacunadas contra el
estímulo artificial con S. typhimurium de tipo salvaje
invasivo. Este ensayo de estímulo mostró que las aves vacunadas a
una edad de 1 a 14 de días con la vacuna viva de S.
typhimurium tenían una ventaja estadísticamente significativa
respecto a las aves control. Se detectó una reducción significativa
en el número de pollos para carne en edad de sacrificio en los dos
grupos de tratamiento respecto a la colonización de los órganos
internos por el tipo salvaje de S. typhimurium
(P\leq0,05). A nivel del intestino se observó protección en unas
pocas vacunadas, ya que en el ensayo se encontraron cultivos
positivos de muestras de ileon, intestino grueso y ciego de aves sin
vacunar (P\leq0,05). El duodeno no parece ser un tejido diana para
S. typhimurium ya que sólo 10% de los controles de aves sin
vacunar fueron colonizadas por el tipo salvaje. Además, se detectó
una reducción significativa en el número de aves vacunadas que
presentaron cultivo positivo para el organismo de tipo salvaje,
obtenido a partir de los hisopos cloacales, si se comparan con las
aves no tratadas.
Los resultados de este estudio demuestran que la
vacuna de S. typhimurium administrada a los pollos en el día
uno como pulverizado grueso y en el agua de la bebida en el día 14,
reduce significantemente la colonización del tracto GI y la invasión
y colonización visceral de los órganos por el tipo salvaje S.
typhimurium en pollos para carne en edad de sacrificio.
Este ejemplo ilustra la eficacia de la
administración por pulverización de una vacuna de S.
typhimurium vivo y no virulentopara prevenir la colonización de
los órganos internos después del estímulo oral con el tipo salvaje
de S. enteritidis o S. heidelberg.
La Tabla 4 muestra el diseño experimental del
estudio de vacunación por pulverización en los que se realiza un
estímulo con S. heidelberg o S. enteritidis en
pollos.
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Se inmovilizaron las alas de sesenta y tres
polluelos leghorn blancos SPF de 1 día de edad (SPAFAS Inc.,
Storrs, CT) para utilizarlos en este estudio. Treinta y tres aves de
un día de edad (Grupo 1) se vacunaron con pulverizado grueso de 1 X
10^{7} CFU por dosis de vacuna \chi3985, Producto Código 19C1.01
liberado en un volumen aproximadamente de 0,35 ml/ave con un
dispositivo de pulverización Preval Power Unit (Precision Valve
Corp., Yonkers, NY). Veinte aves (Grupo 2) recibieron 0,3 ml/ave de
agua destilada por pulverización gruesa y como controles, diez aves
(Grupo 3) se reservaron como controles no vacunados y no
estimulados. Vacunados y controles se alojaron separadamente en
unidades de aislamiento Horsfal.
A las dos semanas de edad, los pollos vacunados
fueron reforzados con 9,6 X 10^{6} CFU por dosis de la misma
vacuna en el agua de bebida; con un consumo de 5,1 ml de agua por
cada ave. Las muestras de suero se recogieron antes del estímulo, a
las seis semanas de edad, en los Grupos 1 y 2 para determinación de
anticuerpos contra Salmonella por ELISA. De cada ave, se
recogieron hisopos cloacales para cultivo y determinación de la
presencia de Salmonella sp. A las seis semanas de edad, todas
las aves de los Grupos 1 y 2, se estimularon de manera individual
con una dosis oral de 1,6 X 10^{8} CFU en 1,0 ml de S.
heidelberg de tipo salvaje resistente al ácido nalidíxico.
Cuatro días más tarde, en todas las aves se recogió muestra con un
hisopo y se sacrificaron las aves y los tejidos se recogieron y
cultivaron para la cepa de tipo salvaje de S.heidelberg tal
como sigue a continuación. Aproximadamente se extrajeron 10 g de
bazo, hígado, riñón y de cualquier órgano presentando lesiones, de
forma aséptica de cada ave. El bazo, hígado y riñón obtenidos de la
misma ave se reservaron. Cualquier órgano mostrando lesiones
visibles se recogió y procesó separadamente. Además, una muestra de
duodeno, íleon e intestino grueso de 10 mm se obtuvo asépticamente
de cada ave y se procesaron de manera similar. También, una muestra
de 10 mm del ciego, con contenido, se recogió de cada ave y se
procesó de manera similar.
Para cultivar para Salmonella sp. de los
tejidos, éstos se colocaron en una bolsa estéril y se añadió caldo
de Hajna verde brillante tetrationato (TBGH) a cada bolsa y la
muestra se maceró en una trituradora Stomacher. Las bolsas de
tejido se incubaron durante 40 horas a 42ºC y se tomó una muestra de
cada cultivo con asa de siembra de 10 \mul, después se dispersó en
agar verde brillante + 35 \mug/ml novobiocina (BGAN) y
xilosa-lisina-tergitol 4 agar
+
100 \mug/ml de ácido nalidíxico (XLT4-NaI). Las placas se examinaron después de 24 horas de incubación a 42ºC para la colonias características en XLT4-NaI y agar BGAN. El caldo de cultivo enriquecido se incubó adicionalmente durante 24 horas más. Los cultivos correspondientes a las placas negativas se dispersaron nuevamente en XLT4-NaI y BGAN, se incubaron a 42ºC durante 24 horas examinándose la presencia de colonias características. Se realizó un ensayo de aglutinación con antisuero (Grupo B) del grupo 0 de Salmonella, en al menos una colonia por placa de todas las placas para confirmar la presencia de la cepa, utilizada en el estímulo, S. heildelberg de tipo salvaje.
100 \mug/ml de ácido nalidíxico (XLT4-NaI). Las placas se examinaron después de 24 horas de incubación a 42ºC para la colonias características en XLT4-NaI y agar BGAN. El caldo de cultivo enriquecido se incubó adicionalmente durante 24 horas más. Los cultivos correspondientes a las placas negativas se dispersaron nuevamente en XLT4-NaI y BGAN, se incubaron a 42ºC durante 24 horas examinándose la presencia de colonias características. Se realizó un ensayo de aglutinación con antisuero (Grupo B) del grupo 0 de Salmonella, en al menos una colonia por placa de todas las placas para confirmar la presencia de la cepa, utilizada en el estímulo, S. heildelberg de tipo salvaje.
Los hisopos cloacales se recogieron de cada ave y
en todos los grupos de tratamiento antes del estímulo y en el
momento del sacrificio para hacer el seguimiento para Salmonella
sp. Los hisopos se colocaron en 5 ml de caldo TBGH y se
incubaron durante 24-40 horas a 42ºC. Después de
unas 40 horas, el caldo se dispersó en BGAN y se incubó durante
42ºC. Con el anticuerpo (Grupo B) específico del grupo o de
Salmonella, se realizó un test de aglutinación en al menos una
colonia por placa en todas las placas para confirmar la presencia de
la cepa, utilizada en el estímulo, S. heildelberg de tipo
salvaje.
Después de la vacunación, no se observaron en
ningún caso reacciones adversas a la vacuna. No hubo muertes
atribuibles a la vacuna ocurridas durante el curso del ensayo. Un
ave en el grupode las vacunadas murió por herida en el día 49 del
ensayo. No se observaron cultivos cloacales positivos de ninguna ave
del Grupo 1 cuando se tomaron muestras en el día 42 de
post-vacunación.
Los resultados de los cultivos de hisopos
cloacales para todos los pre- y post- estímulos se presentan en la
Tabla 5. El organismo presente en la vacuna, no se recuperó de
ninguna ave del Grupo 1 antes del estímulo. Cuatro días después de
recibir el organismo de tipo salvaje del estímulo, el 50% de las
aves vacunadas presentaron cultivos cloacales positivos del
organismo de tipo salvaje mientras un 70% de las aves control sin
vacunar resultaron con cultivo positivo. Estos resultados no
mostraron diferencias estadísticamente significativas respecto a los
resultados de los cultivos cloacales positivos para el organismo de
tipo salvaje.
| Número de cultivos cloacales positivos de muestras de hisopos de aves tratadas o no tratadas pre y post | ||
| estímulo con el tipo salvaje S. heidelberg. | ||
| Tratamiento | Pre estímulo^{1} (Día 42) | Post estímulo^{2} (Día 46) |
| Grupo 1: vacuna | 0/33 (0%) | 16/32(50%)^{3} |
| S. typhimurium | ||
| Grupo 2: Controles no-tratados, | 0/20 (0%) | 14/20 (70%)^{3} |
| con estímulo. | ||
| Grupo 3: Controles no tratados, | 0/10 (0%) | 0/10 (0%) |
| no estimulados | ||
| ^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} Número de pollos con cultivo positivo para la cepa de la vacuna de S. typimurium/número total de pollos. \end{minipage} | ||
| ^{2} \begin{minipage}[t]{150mm} Número de pollos con cultivo positivo para la cepa de tipo salvaje de S. heidelberg/número total de pollos. \end{minipage} | ||
| ^{3} \begin{minipage}[t]{150mm} Diferentes significativamente del grupo de aves sin vacunar y no estimuladas según el test de la Ji-cuadrado (P\leq0,05). \end{minipage} |
Grupos de aves vacunadas y sin vacunar con 6
semanas de edad se estimularon con una dosis oral de S.
heidelberg de tipo salvaje vivo para determinar la protección
contra la invasión de órganos internos y la colonización del tracto
digestivo (Véase Tabla 6). Se encontró una diferencia significativa
entre los grupos vacunados y no vacunados estimulados con S.
heidelberg de tipo salvaje, con un veinte por ciento de las aves
vacunadas estimuladas con el tipo salvaje presentando cultivo
positivo en los órganos agrupados en comparación con el 70% de los
controles de aves sin vacunar (P\leq0,05). Una reducción
significativa en el número de muestras de tracto digestivo con
cultivo positivo se encontró en aves vacunadas en comparación con
los no vacunados (P\leq0,05). No se observaron diferencias en el
número de cultivos positivos de muestras fecales entre aves
vacunadas y sin vacunar. Todas las aves de control no tratadas y no
estimuladas resultaron libres de Salmonella sp.
| Protección de aves para carne en edad de sacrificio vacunadas con S. typhimurium vivo no virulento y | ||||
| estimuladas con S. heildelberg de tipo salvaje. | ||||
| Grupo | Tratamiento | Órganos | Tracto | Ciego |
| reservados | digestivo | |||
| 1 | Vacuna + Estímulo | 8/32 (25%) | 10/32 (31%) | 21/32 (66%) |
| 2 | Controles no vacunados | 14/20 (70%) | 17/20 (85%) | 17/20 (85%) |
| y estimulados | ||||
| 3 | Controles no vacunados | 0/10 (0%) | 0/10 (0%) | 0/10 (0%) |
| no estimulados | ||||
| ^{1} \begin{minipage}[t]{145mm} Diferente significativamente del grupo no vacunado respecto al grupo estimulado según el test de la Ji-cuadrado (P\leq0,05). \end{minipage} |
La Tabla 4 muestra el diseño experimental del
estudio de eficacia de S. enteritidi. Se vendaron las alas de
sesenta y tres polluelos leghorn blancos SPF de un día de
edad (SPAFAS Inc., Strors, CT) para utilizarlos en este ensayo.
Treinta y tres aves de un día de edad (Grupo 4) se vacunaron
mediante pulverización gruesa con 1 X 10^{7} CFU por dosis de
\chi3985, Código del Producto 19C1.01. La vacuna se administró en
aproximadamente 0,35 ml de volumen/ave mediante un dispositivo de
pulverización Preval Power Unit (precisión Valve Corp., Yonkers,
NY). Veinte aves (Grupo 5) recibieron 0,3 ml/ave de agua destilada
por pulverización gruesa, y como controles, diez aves adicionales
(Grupo 6) se reservaron como controles no vacunados y no
estimulados. Los controles y los vacunados se alojaron separadamente
en unidades de aislamiento Horsfal.
A las dos semanas de edad, las vacunadas se
reforzaron con la misma vacuna en el agua de bebida con 9,6 X
10^{6} CFU por dosis de consumo de cada ave en 5,1 ml de agua. Las
muestras de suero se recogieron antes del estímulo de las aves con 6
semanas de edad en los grupos 4, 5 y 6 para determinar anticuerpos
contra Salmonella por ELISA. En ese momento se cultivaron
muestras de los hisopos para determinar la presencia de
Salmonella sp. A las seis semanas de edad, todas las aves en
los Grupos 4 y 5 se estimularon individualmente con una dosis oral
de 4.5 X 10^{7} CFU en 1 ml de S. enteritidis de tipo
salvaje resistente al ácido nalidíxico. Siete días más tarde, se
tomaron muestras, se sacrificaron las aves y se cultivaron las
muestras para el crecimiento de la cepa de S. enteritidis de
tipo salvaje por el procedimiento descrito arriba en el estudio de
eficacia con S. heidelberg, excepto los ensayos de
aglutinación que se realizaron con el antisuero del grupo específico
Salmonella O (Grupo D) en vez de con el antisuero del Grupo
B.
No se observaron reacciones clínicas a la vacuna
tras ninguna vacunación. No se observaron muertes atribuibles a la
vacuna durante el curso del ensayo. Un ave en el grupo de las
tratadas con la vacuna murió, presuntamente por una herida sufrida
como consecuencia de la punción en el intento de recoger sangre y
suero para la evaluación de anticuerpos.
Los resultados del cultivo de las muestras de
hisopos cloacales en pre y post estímulo se muestran en la Tabla 7.
El organismo de la vacuna no se recuperó de ninguna ave en el Grupo
4 antes del estímulo. Siete días después de recibir el organismo de
tipo salvaje del estímulo, el 41% de las aves vacunadas mostraron
cultivo positivo cloacal para el organismo de tipo salvaje y
mientras que el 63% de las aves control sin vacunar fueron positivas
para el cultivo. Estos datos muestran diferencias que no son
estadísticamente significativas entre los dos grupos para los
cultivos cloacales positivos del organismo salvaje.
| Número de cultivos positivos de muestras de hisopos cloacales de aves vacunadas y sin vacunar pre y post | |||
| estímulo con S. enteritidis de tipo salvaje. | |||
| Grupo | Tratamiento | Pre-estímulo^{1} (Día-42) | Post-estímulo^{2} (Día-49) |
| 4 | Vacuna + estímulo | 0/33 (0%) | 13/32 (41%)^{3} |
| 5 | Controles sin vacunar, | 0/20 (0%) | 12/19 (63%) |
| con estímulo | |||
| 6 | Controles sin vacunas, | 0/10 (0%) | 0/10 (0%) |
| sin estímulo | |||
| ^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} Número de pollos con cultivo positivo para la cepa de la vacuna de S. typhimurium/número total de pollos. \end{minipage} | |||
| ^{2} \begin{minipage}[t]{150mm} Número de pollos con cultivo positivo para el estímulo con S. typhimurium de tipo salvaje/número total de pollos. \end{minipage} | |||
| ^{3} \begin{minipage}[t]{150mm} Diferencias significativas respecto a los controles no vacunados, no estimulados según el test de la Ji-cuadrado (P<0,05). \end{minipage} |
Las aves vacunadas y sin vacunar difirieron
también de forma colectiva en el grado de colonización del tracto
GI, del bazo, hígado y riñón, como se muestra en la Tabla 8. Una
diferencia significativa se encontró entre los grupos vacunados y no
vacunados estimulados con S. enteritides de tipo salvaje, el
9% de las aves vacunadas estimuladas con el tipo salvaje fueron
positivas par el cultivo en el conjunto de tejidos de órganos
internos en comparación con el 58% de las aves control sin vacunar
(P\leq0,05). En las aves vacunadas y sin vacunar se observó una
reducción significativa en el número de cultivos positivos de
muestras del tracto digestivo (P\leq0,05). No se encontraron
diferencias en el número de muestras fecales positivas para el
cultivo en aves vacunadas y sin vacunar. Las aves control sin tratar
ni vacunar se no presentaron Salmonella sp.
\vskip1.000000\baselineskip
| Protección de aves para carne en edad de sacrificio vacunadas con una vacuna de S. typhimurium vivo | ||||
| modificado después de una estimulación oral con S. enteritidis de tipo salvaje. | ||||
| Grupo | Tratamiento | Conjunto de órganos | Tracto digestivo | Ciego |
| 4 | Vacuna + estímulo | 03/33 (9%) | 4/32 (13%)^{1} | 16/32 (50%) |
| 5 | Controles sin vacunar, | 11/19 (58%) | 7/19 (37%) | 11/19 (58%) |
| con estímulo | ||||
| 6 | Controles sin vacunas, | 0/10 (0%) | 0/10 (0%) | 0/10 (0%) |
| sin estímulo | ||||
| ^{1} \begin{minipage}[t]{145mm} Diferentes significativamente de los controles no vacunados estimulados según el test de la Ji-cuadrado (P \leq 0,05). \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de suero se estudiaron para
anticuerpos de tipo IgG contra el lipopolisacárido (LPS) de S.
typhimurium por ELISA. Las muestras se diluyeron 1:100 y se
añadieron en duplicado a pocillos con un preparado comercial de LPS
de S. typhimurium. Para la detección se utilizó IgG de conejo
anti-pollo conjugada con HRP a 1:30.000. De las
aves vacunadas con la vacuna de S. typhimurium, el 52%
desarrollaron una fuerte respuesta a la vacuna con valores de
OD_{490} superiores a 0,3; el 9% respondieron positivamente en la
franja media de 0,2-0,3 y el 39% dieron unas
lecturas en la franja baja de 0,05-0,1. El suero de
las aves control presentó unas lecturas medias en OD_{490} de
0,005 \pm 0,009, muy por debajo de todos los valores obtenidos en
el suero de aves vacunadas.
El día de la eclosión del huevo, la vacunación
por pulverización con la vacuna viva no virulenta de S.
typhimurium, \chi3985, Código del Producto 19C1.01, seguida de
la administración oral de la vacuna en el agua de la bebida el día
14, no produce ninguna reacción adversa en los pollos. La cepa
bacteriana no se recuperó de los hisopos cloacales de aves vacunadas
por pulverización en las muestras recogidas a las 6 semanas de edad
o justo antes de la estimulación con los organismos S.
enteritidis o S. heidelberg de tipo salvaje. Todas las
aves vacunadas que se analizaron mostraron una respuesta serológica
cuando se expusieron a la vacuna de S. typhimurium en
comparación con las no
vacunadas.
vacunadas.
Los resultados generados en este ensayo
demuestran que la vacuna de S. typhimurium proporciona una
protección significativa para la reducción del nivel de colonización
de los órganos internos, tanto para Salmonella
heidelberg como para S. enteritidis. Aunque no se
observaron diferencias significativas en el nivel de colonización
por las cepas del estímulo de tipo salvaje en el ciego comparando
las aves vacunadas con las no vacunadas. La vacunación confirió una
protección significativa a la colonización por S. heidelberg
o S. enteritidis del tracto diges-
tivo.
tivo.
Se muestra la eficacia de la vacunación por
pulverización con la vacuna viva no virulenta de S.
thphimurium en la protecciónde los pollos para carne en edad de
sacrificio contra la colonización de los órganos internos después de
la estimulación con S. enteritidis de tipo salvaje.
Se vendaron las alas a cincuenta y cinco
polluelos leghorn blancos SPF (HyVac, Adel, IA) para su uso
en este ensayo. En el día de edad, 30 aves (Grupo 1) se vacunaron
con pulverización gruesa con aproximadamente una dosis de vacuna 1 X
10^{7} de \chi3985, Código de Producto 19C1.01 (producido por
Maine Biological Laboratories, Inc., Waterville, ME), en 0,3 ml de
volumen por ave mediante un mecanismo de pulverización Preval Power
Unit (Precision Valve Corp., Yonkeres, NY). Veinte aves (Grupo 2)
recibieron 0,3 ml por ave de agua destilada por pulverización gruesa
y se utilizaron como controles, cinco aves adicionales (Grupo 3) se
reservaron como controles contemporáneos. Los vacunados y los
controles se alojaron separadamente en unidades de aislamiento
Horsfal.
\vskip1.000000\baselineskip
| Diseño experimental para la vacunación con la vacuna de S. typhimurium y estimulación con Salmonella | |||||
| enteritidis. | |||||
| Grupo | Vacuna | Edad de vacunación | Estimulación | Edad de la estimulación | Nº de aves |
| 1 | \chi3985, Producto | Días 1 \textamp 14 | S. enteriditis | 6 semanas | 30 |
| Código 19C1.01 | |||||
| 2 | Ninguna | Ninguna | S. enteritidis | 6 semanas | 20 |
| 3 | Ninguna | Ninguna | Ninguna | N/A | 5 |
A las dos semanas de edad, se administró un
refuerzo de lavacuna en el agua de la bebida con una dosis de 1 X
10^{7} CFU de la misma vacuna (una dosis de 15 ml en el agua por
ave). A las seis semanas de edad, todas las aves en los grupos
tratados con la vacuna y los controles se estimularon de manera
individual con una dosis oral de 4 X 10^{7} CFU de S.
enteritidis de tipo salvaje en 0,5 ml. Los hisopos cloacales se
recogieron 5 días después de la estimulación de cada ave para
valorar cuantos contenían el de tipo salvaje. Todas las aves se
sacrificaron a los 5 días después de la estimulación, se realizó la
necropsia y las muestras de tejido se cultivaron para S.
enteritidis de tipo salvaje tal como se ha descrito en el
Ejemplo 2.
No se observaron reacciones clínicas durante el
período de vacunación. No se observaron muertes en ninguno de los
grupos de tratamiento durante el desarrollo del ensayo.
Los grupos de aves vacunadas y no vacunadas se
estimularon a las seis semanas de edad con una dosis oral de S.
enteritidis de tipo salvaje para determinar la protección contra
la invasión de los tejidos de órganos internos y la colonización del
tracto GI (Véase Tabla 10). Una diferencia significativa se halló
entre los grupos vacunados y no vacunados, estimulados con S.
enteritidis de tipo salvaje; el 90% de las aves control no
vacunadas con y estimuladas con de el tipo salvaje fueron positivas
para el cultivo en el conjunto de tejidos después del estímulo en
comparación con sólo el 20% en aves vacunadas (P \leq 0,01). Una
reducción significativa en el número de cultivos positivos en las
muestras duodenales se encontró entre el grupo tratado con vacuna y
el grupo control (P 0.01). No se encontraron diferencias entre el
número de cultivos positivos de S. enteritidis en muestras de
íleon, intestino grueso y ciego entre aves vacunadas y sin
vacunar.
\vskip1.000000\baselineskip
El ocho por ciento de las aves tratadas con la
vacuna fueron positivas para el cultivo cloacal para los organismos
de tipo salvaje del estímulo en comparación con el 100% de las aves
en el grupo de control sin vacunar.
La vacunación por pulverización el día de la
eclosión del huevo con la vacuna \chi3985, con Código de Producto
19C1.01, seguida por administración oral de la vacuna en el agua de
bebida el día 14, no produjo ninguna reacción adversa en los
pollos.
Aunque la protección de la colonización por el
microbio de tipo salvaje no fue aparente en las muestras del tracto
digestivo nidel ciego de las aves vacunadas, la protección
significativa contra la colonización de los órganos internos por
S. enteritidis de tipo salvaje se demostró en los órganos
internos de los tratados con la vacuna, las aves vacunadas y
estimuladas comparadas con las aves no vacunadas y estimuladas.
Este ejemplo ilustra que la vacunación por
pulverización de polluelos con S. typhimurium modificado y
vivo es segura y eficaz en la reducción de la contaminación por
Salmonella en las condiciones comerciales de producción a gran
escala.
El propósito de este ensayo fue evaluar la
seguridad y el potencial de la vacuna \chi3985 con Código de
Producto 19C1.01, para reducir la contaminación por Salmonella
encondiciones comerciales normales de producción de aves de corral
a gran escala. La seguridad de la vacuna se siguió valorando por la
capacidad del producto para propagarse y la supervivencia de los
pollos durante su período de crecimiento. La eficacia del producto
se siguió por el análisis bacteriológico en los lavados
post-enfriamiento de las carcasas, el peso medio y
el porcentaje de pollos descartados (o descartes) en el
procesado.
Se escogieron tres granjas geográficamente
diferenciadas,con características similares, en base a que
acomodaban un mínimo de 16000 aves. Esto permitió un ensayo con
replicados triples utilizando más de 115000 que consistieron en aves
control y aves tratadas con la vacuna de S. typhimurium
modificado y vivo. Se realizó un esfuerzo en el ensayo para
identificar las granjas que tenían una historia conocida de
contaminación persistente por Salmonella. La tabla 11
identifica las localizaciones y los parámetros de estudio de estos
tres ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Descripción de los ensayos | ||||||
| Localidad | Serie de | Nº de pollos | Tiempo de vacunación | Duración del | ||
| del | vacuna | (Días después de la | ensayo | |||
| ensayo | utilizada | eclosión del hueto) | ||||
| Vacunados | Controles | Primera | Recuerdo | (Días) | ||
| 1 | 7002 | 21,000 | 21,000 | 1 | 14 | 48 |
| 2 | 7003 | 20,500 | 20,500 | 1 | 27 | 42 |
| 3 | 7004 | 16,000 | 16,000 | 1 | 15 | 64 |
\vskip1.000000\baselineskip
La vacuna \chi3985 con Código de Producto
19C1.01, se manufacturó siguiendo el Manual de Producción escrito y
aprobado en Marzo 20, 1995.
Se siguieron en todos los lugares de la granja,
la vacunación comercial normal, y los regímenes de alimentación y
bebida del establecimiento para aves de corral. Los polluelos
recibieron la vacuna de Marek tanto in ovo como en el día de
su eclosión y la vacuna de Newcastle/vacuna contra la bronquitis,
por pulverización en el día de la eclosión. Se administró una
vacunación para la bronquitis de recuerdo en los dos recintos de
cada granja en el día 16-18 del estudio.
Un aparato pulverizador portátil (suministrado y
operado por Merial Select, Atlanta, GA) se colocó en la incubadora
de polluelos para que las cajas entrantes de aves se vacunaran antes
de colocar a los polluelos en el suelo del recinto. La vacuna se
suministró como una formulación liofilizada en un vial de vidrio y
se mezcló en agua no clorada según las instrucciones del embalaje.
El equipo de pulverización se pre-calibró
manualmente para distribuir aproximadamente de 700 ml a 1 litro
sobre 10000 polluelos a una presión de 1 bar (15psi) mediante una
surtidor para pulverización con bigornia de pulverizado grueso 4
para liberar para liberar gotas de 50-100 micras de
diámetro. Se distribuyeron aproximadamente 0,07-0,1
ml por polluelo.
Los polluelos de dos semanas de vida se
deprivaron de agua de bebida durante un período de cuatro horas
antes de permitir a las aves acceder de nuevo al agua que contenía
la vacuna en el recinto tratado de cada granja. Se implementó el
sistema Merial Select Bag Boost para calibrar la liberación de la
vacuna. La cantidad requerida de vacuna S typhimurium se
mezcló de acuerdo con las instrucciones del embalaje hasta un
volumen suficiente de diluyente para administrar una dosis por ave
durante dos horas a través de todas las líneas de agua del recinto.
Esta agua de la vacuna fue la única fuente de agua para las aves
durante este período de tiempo de dos horas, para asegurarse que
todas las aves tuvieran oportunidad de beber suficiente vacuna. El
pozo de agua utilizado en los recintos de todas las granjas se
controló antes de la vacunación, el agua y se halló negativo para
residuos de cloro con un pH dentro del intervalo 6,0 -7,0.
Para monitorizar la presencia de Salmonella
spp. De tipo salvaje indígena en el ambiente y en el polluelo,
se recogieron muestras para determinar el nivel basal de meconio del
pollo en papeles de las cajas de pollos nursería, mientras que con
pequeños hisopos, se recogieron muestras de barrido de los lechos,
de alimentos y del agua para análisis bacteriológico, tal como se
describe más abajo. Periódicamente se recogieron muestras durante
los ensayos en cada lugar de realización de éstos.
Una muestra al azar de 12-18
papeles de las cajas de lo polluelos e hisopos representativa de
cada grupo se recogió de las cajas de transporte individuales antes
de administrarse la vacuna. Cada papel seleccionado que contenía
meconio se colocó en una bolsa de plástico individual que fue
cerrada y marcada. Gasas estériles mojadas con leche desnatada se
utilizaron como material adicional para los hisopos, colocándose en
una bolsa de plástico Whin® Pak, se sellaron y marcaron. Todas las
muestras se transportaron inmediatamente en paquetes con hielo al
laboratorio de análisis de Salmonella spp. Para determinar el
nivel basal de contaminación de los polluelos entrantes.
Antes de empezar el estudio, una muestra de 40 g
de alimento se tomó mediante sondeo de la entrada de la cadena
alimentadora de cada caja de cada granja. Estas muestras se
colocaron el bolsas Whin® Pak, se sellaron y marcaron. Además, se
recogieron 100 ml de agua de una fuente después del filtro y 100 ml
de agua del grifo de bebida de cada recinto. El agua recogida se
analizó inmediatamente para los residuos de cloro y el intervalo de
pH. Las muestras de alimento y agua se recogieron cada dos semanas
durante el tiempo que duró el ensayo de cada granja, se marcaron y
transportaron en paquetes con hielo al laboratorio para el análisis
bacteriológico.
Antes de empezar cada ensayo, se recogieron
muestras con un hisopo de barrido de cada lecho del recinto en cada
granja para determinar el nivel basal de contaminación por
Salmonella. Se recogieron además hisopos extras de cada
recinto en cada granja cada dos semanas durante el período de
duración del ensayo. Se siguió el Plan Nacional de Explotación de
Aves de Corral y Medidas Auxiliares (National Poultry Improvement
Plant and Auxiliary Provisions manual. United States Department of
Agriculture, Animal and Plant Health inspection Service (APHIS
92-55-017, Abril 1993). Las bolsas
selladas, y marcadas se transportaron en paquetes con hielo al
laboratorio para el análisis bacteriológico.
Se utilizó agua tamponada de peptona
(international Bioproduct Inc., Redman, Wa; Difco Inc., Detroit MI).
para el pre-enriquecimiento de la toma de muestras
de alimentos, agua, papeles de las cajas de polluelos y escobillones
de barrido, y también como lavado para determinar la carga
bacteriana en las carcasas. Como medio selectivo para el
enriquecimiento en Salmonella sp. o en la vacuna, se utilizó
el caldo de Hajna verde brillante tetrationato (Northeast
Laboratories Inc. Waterville, ME). El agar de tetrationato verde
brillante suplementado con 35 \mug de novobiocina/ml (Sigma, St.
Louis, MO) se utilizó para identificar el crecimiento característico
de Salmonella sp. o de la vacuna. La confirmación de
Salmonella se realizó siguiendo los procedimientos reseñados
en el FSIS Directrices de Recolección de Muestras y Procedimientos
de Aislamiento e Identificación de Salmonella de la carne
cruda y de productos de las aves de corral. Todos los cultivos
positivos se enviaron a los Laboratorios de los Servicios Nacionales
de Veterinaria para su serotipado (Ames, IA).
Se seleccionaron al azar cincuenta de las
carcasas después del procesado en cada recinto. Para la recogida de
las carcasas lavadas y para determinar la presencia o ausencia de
Salmonella sp. y/o la vacuna, se siguieron las Directrices
FSIS de Recolección de Muestras y Procedimientos de Aislamiento e
Identificación de Salmonella de la carne cruda y de productos
de las aves de corral (Food Safety Inspection Service Sample
Collection Guidelines and Procedure for Isolation and Identification
of Salmonella from Raw Met and Poultry Products, Federal
Registrer Vol. 61, No. 144. 7/25/96, página 38923). Además, se
utilizó la PCR (BACS System, Qaulicom, Wilmington, DE) para la
verificación de muestras que resultaron positivas para la
aglutinación por antisuero específico contra grupos del
antígeno-O de Salmonella (Difco Inc.,
Detroit, MI) pero donde no se había podido obtener cultivos
puros.
El test de la \chi-cuadrado se
utilizó para comparar los resultados paramétricos entre las casas
tratadas con la vacuna y los controles.
Ensayo en el sitio
#1
Los análisis de muestras basales de papeles de
polluelos, agua, alimento es hisopos de barrido obtenidos de los
recintos de las cajas de las crías, recogidos antes de empezar el
ensayo, revelaron que el alimento del recinto control, fue positivo
para Salmonella mbandaka y los polluelos de dos de los tres
grupos, mostraron cultivos cloacales positivos para Salmonella
heidelbrg. Los polluelos de uno de las cabanas reproductoras,
mostraron cultivos cloacales positivos para organismos sospechosos
de ser del grupo antígenico-O, grupo C_{3} sin
embargo no pudo obtenerse un cultivo puro aislado. Ni Salmonella
sp. ni otros organismos de vacuna pudieron recogerse en el
alimento, agua o hisopos de barrido de cada recinto o granja durante
el período restante de seis semanas de duración del ensayo.
Los datos sobre el bienestar animal se recogieron
semanalmente por el operario de cada recinto de la granja. La Tabla
12 muestra el número de aves que expiraron durante el período de
realización del ensayo. No se observaron diferencias en la pérdida
de aves entre los controles y los recintos tratados, siendo el
porcentaje total de pérdidas en ambos recintos del 2,8%. El
porcentaje medio de mortalidad fue de 4,4-4,7%, para
un período coincidente con el ensayo correspondiente para cada zona
de la región en donde se localizó el sitio#1 (The Poultry Informed
Profesional, Department of Avian Medicine, University of Georgia,
Athens GA, Enero de 1998).
| Mortalidad de aves durante el período de crecimiento en sitio#1 del ensayo. | ||||
| Control | Tratadas | |||
| 1ª Semana | 205 | 210 \, | ||
| 2ª Semana | 117 | 87 \, | ||
| 3ª Semana | 57 | 55 \, | ||
| 4ª Semana | 62 | 63 \, | ||
| 5ª Semana | 74 | 81 \, | ||
| 6ª Semana | 81 | 87 \, | ||
| Total de mortalidad | 596 | 583^{1} | ||
| Porcentaje Total | \hskip0,3cm 2.8% | \hskip0,3cm 2.8% | ||
| ^{1} No se observaron diferencias significativas según el test de la Ji-Cuadrado (P\leq0,05). |
El percentil del historial del bienestar animal
para el sitio#1 fue de 95,5 a 99,6 en 1996-1997. El
bienestar animal alcanzó el percentil 97,2 para ambos, control y
aves tratadas. Según estos datos, la vacuna no tuvo efectos
adversos sobre el bienestar de las aves.
El informe de los inspectores USDA sobre los
descartes para cada recinto se presenta en la Tabla 13. El informe
indica que existe un aumento de saculitis aérea y procesos
inflamatorios (IP) en las carcasas de los recintos tratadas respecto
a los recintos control. Los valores medios de la región se
obtuvieron de The Poultry Informed Informed Professional - para una
semana del ensayo.
| Porcentaje de descartes en el procesado para el ensayo del sitio#1 | |||
| Causa de descarte | Controles | Tratamiento | % media de la región |
| Leucosis | 0,02 | 0,02 | 0,03 |
| Septicemia/Toxemia | 0,25 | 0,28 | 0,35 |
| Tumores | 0,28 | 0,15 | N/A^{1} |
| Saculitis aérea | 0,14 | 0,51 | 0,17 |
| Sinovitis | 0 | 0 | N/A |
| Proceso inflamatorio | 0,64 | 2,06 | 0,14 |
| Escaldaduras | 0 | 0 | N/A |
| Hematomas | <0,01 | <0,01 | 0,02 |
| Tuberculosis | 0 | 0 | N/A |
| Cadáveres | <0,01 | <0,01 | N/A |
| Contaminación | <0,01 | <0,01 | N/A |
| Muertes en la llegada | 0,3 | 0,24 | N/A |
| Total de descartes | 1,33 | 3,02^{2} | |
| ^{1} N/A, datos no disponibles. | |||
| ^{2} Significativamente diferente del grupo de controles según el test de la Ji-Cuadrado (P\leq0,05). |
Los resultados del historial de la granja
proporcionados por el colaborador, muestran que esta granja presentó
episodios cíclicos de enfermedad respiratoria durante los dos
últimos años, con percentiles de sacculitis área aumentados durante
los meses de invierno. El grupo que estuvo en la granja antes del
ensayo de vacunación mostró saculitis aérea con percentiles de 1,71
en comparación con el 0,51 de las aves del recinto tratado en este
ensayo. No existieron casos documentados de Salmonella spp.
Que causaran sacculitis aérea o proceso inflamatorio. Además, el
proceso de inspección de las carcasas no pudo realizarse a ciegas,
ya que el inspector USDA al cargo requirió la identificación de cada
una de las aves tratadas. La saculitis aérea y los percentiles IP no
fueron diferentes entre controles y tratados con la vacuna en dos
ensayos subsiguientes descritos en este informe. En consecuencia, no
puede asumirse que la causa de estas condiciones sea atribuible al
uso del producto de la vacuna.
El peso medio del ave en el procesado es un
indicador del rendimiento del ave durante el período de crecimiento.
Un examen de ocho ciclos de crecimiento en el sitio#1 mostró pesos
medios de las aves en el intervalo de 4,36 y 4,79 lbs para las aves
mayores de 49 días de edad; los pesos de las aves tratadas
estuvieron en el las 4.84 lbs de media en comparación con las 4,85
lbs para las aves control de 48 días de edad. Basándonos en este
valor de peso medio, la vacuna no afectó la capacidad de las aves
para mantener el nivel de rendimiento esperado por el productor.
Los resultados de la evaluación del lavado de las
carcasas se muestran en la Tabla 14. El número de muestras positivas
para Salmonella tal como se identifica por PCR y aglutinación
para el antisuero antígeno-O a partir de lavados de
las carcasas fue significativamente menor en el grupo tratado que en
el grupo control (p\leq0.05. No se identificaron organismos N.
typhimurium ni Salmonella sp. indígenas en las 50
muestras de lavados de carcasas del grupo analizado en el
laboratorio. Sin embargo, el 8% de las muestras lavadas tomadas de
las 50 carcasas del grupo control resultaron positivas para el Grupo
C de Salmonella indicando que la vacuna fue eficaz en
eliminar la Salmonella indígena del producto cárnico.
| Evaluación de los lavados de las carcasas en el sitio#1 | |
| Grupo | Número de muestras positivas |
| Control | 4/50 (8%) |
| Tratado | 0/50 (0%)^{1} |
| ^{1} Diferentes significativamente del grupo control según el test de la Ji-Cuadrado (P\leq0,05) |
Ensayo en el sitio
#2
El análisis de las muestras basales recogidas
demostró que la comida del reciente control y el meconio de los
papeles de las cajas de polluelos, contenía organismos sospechosos
de ser del grupo antígenico-O grupo C_{3},sin
embargo no se obtuvieron aislados puros. Tampoco se identificaron
otros organismos o vacunas de Salmonell sp. en el alimento,
el agua o los hisopos de barrido de los polluelos tanto del recinto
como de la granja durante el período de 6 semanas restante.
Los resultados sobre el bienestar animal se
recogieron de forma periódica de cada recinto de la granja. La tabla
15 muestra los datos de mortalidad durante el período de crecimiento
del ensayo. Pocas aves expiraron en el recinto control en relación
con el reciente tratado durante la primera semana del ensayo. No se
encontraron diferencias en el número de aves que expiraron entre los
grupos observados después de la primera semana del ensayo. El
porcentaje de mortalidad media de una semana durante el período del
ensayo fue de 5,0-6,2 para la zona de la región
donde se realizó el ensayo (The Poultry Informed profesional,
Febrero de 1998). La mortalidad en cada recinto estuvo por debajo de
la media regional para ese período.
| Mortalidad de las aves durante el período de crecimiento para el ensayo del sitio#2 | ||||
| Controles | Tratados | |||
| Día 7 | 236 | 363 \, | ||
| Día 14 | 88 | 73 \, | ||
| Día 30 | 281 | 306 \, | ||
| Día 35 | 64 | 60 \, | ||
| Día 42 | 82 | 78 \, | ||
| Mortalidad total | 751 | 880^{1} | ||
| (recuento de cabezas) | ||||
| Porcentaje total | \hskip0,3cm 3.7 | 4.3 | ||
| ^{1} Diferentes significativamente del grupo control según el test de la Ji-Cuadrado (P\leq0,05). |
La diferencia del 0,6% en la mortalidad entre las
aves tratadas y los controles durante la primera semana se halla
dentro de la desviación esperada observada para las incubadoras. No
existieron diferencias en los números de mortalidad después de la
primera semana hasta el final del ensayo. Esta diferencia en la
mortalidad de la primera semana no se observó en dos de los tres
ensayos conducidos con el producto de la vacuna. Los factores que
pueden afectar la supervivencia de los polluelos recién salidos del
cascarón pueden inducir variaciones de en la edad de las crías, la
calidad y la organización de la incubadora y criadora y la
exposición prolongada a temperaturas menores que 85ºF. Los
percentiles de supervivencia para aves viejas de
40-42 días, nacidas antes del ensayo en la granja
durante el mismo año del ensayo llegaron a
94,7-97,5. El percentil de supervivencia para el
control y las aves tratadas se halló dentro del mismo intervalo,
96,3% y 95,7%, respectivamente.
El informe de los inspectores de USDA sobre los
descartes para cada recinto se representa en la Tabla 16. Los
resultados de la media en % de la misma zona de la región para el
sitio#2 se obtuvieron de la Poultry Informed Professional, febrero
del 1998. No se encontraron diferencias en el número de aves
descartadas en los grupos control y tratado en este ensayo.
| Porcentaje de descartes del ensayo en el sitio#2 | |||
| Causa de descarte | Control | Tratado | media % para la misma |
| región en el sitio#2 | |||
| Leucosis | <0,01 | <0,01 | 0,01 |
| Septicemia/Toxemia | 0,21 | 0,13 | 0,41 |
| Tumores | 0,07 | 0,02 | N/A |
| Sacculitis aérea | 0,25 | 0,18 | 0,39 |
| Ascites | 0,11 | 0,15 | N/A |
| Proceso inflamatorio | 0,43 | 0,58 | 0,45 |
| Escaldaduras | 0,05 | 0,01 | N/A |
| Hematomas | 0,03 | 0,04 | 0,08 |
| Tuberculosis | 0 | 0 | N/A |
| Cadáveres | 0,03 | 0,04 | N/A |
| Contaminados | 0,05 | 0,05 | N/A |
| Muertes a la llegada | 0,21 | 0,21 | N/A |
| Total de descartes | 1,44 | 1,41^{2} | |
| ^{2} Diferencias no significativas del grupo control según el test de la Ji-Cuadrada con una P\leq0,05 |
El peso medio de las aves durante los nueve
ciclos de crecimiento en el sitio#2 se halló en el intervalo de 3,35
a 3,93 lbs; los pesos medios de las aves tratadas fue de 3,7 lbs a
los 42 días de edad. El peso de las aves de del recinto tratado fue
de 6,1% inferior al peso medio de las aves control en el procesado.
Sin embargo el peso de las aves tratadas no pudo compararse con el
grupo control ya que dos de las cuatro líneas de agua en el recinto
tratado se habían bloqueado durante la cuarta semana del ensayo. La
opinión del Responsable, fue que la diferencia en el peso se debió
total o parcialmente a ese problema.
La Tabla 17 representa las muestras positivas
para Salmonella procedentes de los lavados de las carcasas
en el grupo de tratados. No se identificaron organismos de la
vacuna o Salmonella sp. de tipo salvaje en ninguna de los 100
muestras de lavados de cada grupo.
\vskip1.000000\baselineskip
| Evaluación de los lavados de las carcasas en el sitio#2 | |
| Grupo | Número de muestras positivas |
| Controles | 0/50 |
| Tratados | 0/50 |
Ensayo en el sitio
#3
El análisis de las muestras basales recogidas
puso en evidencia que los hisopos de barrido de los lechos tomados
del recinto control contenían organismos sospechosos de ser
positivos para el antígeno-O del Grupo C_{3}, sin
embargo no pudo obtenerse ningún aislado puro. Los polluelos
originarios de los criaderos de cabanas fueron negativos para el
cultivo de Salmonella spp. indígena. No pudo identificarse
ningún otro organismo de Salmonella spp. o de vacuna en la
comida, agua, o hisopos de barrido de ningún otro recinto en las
granjas durante los 64 días del período de crecimiento del
ensayo.
Se recogieron datos sobre el bienestar animal
semanalmente de cada recinto. La Tabla 18, muestra los resultados
sobre la mortalidad recogidos durante el período de crecimiento del
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
| Mortalidad de las aves durante el período de crecimiento para el ensayo del sitio#3 | ||||
| Controles | Tratadas | |||
| 1ª Semana | 293 | 328 | ||
| 2ª Semana | 151 | 176 | ||
| 3ª Semana | 76 | 114 | ||
| 4ª Semana | 60 | 70 | ||
| 5ª Semana | 86 | 68 | ||
| 6ª Semana | 103 | 97 | ||
| 7ª Semana | 109 | 84 | ||
| 8ª Semana | 97 | 118 | ||
| 9ª Semana | 105 | 119 | ||
| Mortalidad Total | 1080 | 1174 | ||
| (recuento de cabezas) | ||||
| Porcentaje total | 6,8 | 7,3 | ||
| ^{1} Diferentes significativamente del grupo control según el test de la Chi-cuadrado (P\leq0,05). |
Se debe remarcar que las diferencias en la
mortalidad entre grupos, control y tratados, fueron debidas sólo a
una desviación de cinco aves. Pensamos que la desviación estándar
podría deberse a un número significativo de errores en los gráficos
de registro diarios de la mortalidad. Dada la incerteza del recuento
del número de cabezas, se podría esperar que un margen de error del
0,03% contribuiría de forma importante a las diferencias
estadísticas finales. Sin embargo, cuando se compararon los valores
del bienestar animal con los ciclos de crecimiento de los seis meses
anteriores para ese sitio durante el año del ensayo, los percentiles
variaron en un intervalo de 90 a 95. Los percentiles de bienestar
animal para las aves control y las tratadas de este ensayo fueron
93,2 y 92,7, respectivamente, y se hallaron dentro de este
intervalo.
El número de descartes para los dos grupos de
tratamiento de las carcasas del sitio#3 fueron combinados
inadvertidamente por los inspectores USDA. El informe sobre el
número de condenas de los inspectores para las granjas se presenta
en la Tabla 19. Los promedios para la región, incluyendo el
sitio#3, se basan en un pollo para carne de 6 semanas para el mismo
período que el ensayo (The Poultry Informed Professional, abril,
1998). Las tasas de condenas para el presente ensayo en las cinco
categorías especificadas en la Tabla 19 son las mismas o inferiores
a las de la región del país en donde se localiza el Sitio#3, según
se cuantificó durante una semana durante el período de ensayo. El
tratamiento de las aves con la vacuna no afectó los percentiles de
los descartes en ninguna categoría inspeccionada.
| Porcentaje de descartes en el procesado del Sitio#3 | ||
| Causa del descarte | Resultados combinados | Promedio (%) para la |
| (%) para aves control | misma región | |
| y tratadas | ||
| Leucosis | <0,01 | 0,04 |
| Septicemia/toxemia | 0,26 | 0,26 |
| Tumores | 0,01 | N/A^{1} |
| Saculitis de vías aéreas | 0,16 | 0,3 |
| Ascitas | 0,05 | N/A |
| Procesos inflamatorios | 0,1 | 0,3 |
| Escaldaduras | 0 | N/A |
| Hematomas | 0 | 0,01 |
| Tuberculosis | 0 | N/A |
| Cadáveres | 0,04 | N/A |
| Contaminados | <0,01 | N/A |
| Muerto a la llegada | 0,3 | N/A |
| Total de descartes | 0,92 | |
| N/A, datos no disponibles. |
Un examen de los tres ciclos de crecimiento
previos para el Sitio#3 mostró que los pesos de las aves variaban
entre 6,67 a 7,2 libras. Par este estudio, el peso promedio de las
aves en el procesado fue de 7,33 libras. Se debería remarcar que
aunque este productor ha experimentado un descenso durante el año
pasado en la calidad de los pollos recibidos del criador
(demostrado por la elevada mortalidad durante las dos primeras
semanas del ensayo), fue inesperado el excelente rendimiento y el
peso final de las aves en el procesado para este ensayo. Según
estos resultados sobre el peso medio, la vacuna no afecta la
capacidad de los pollos para mantener el nivel de rendimiento
esperado por el productor.
La Tabla 20 muestra los resultados de los
análisis de muestras de lavado de carcasas para cada grupo. No se
recuperó ningún organismos S. Typhimurium vivo y modificado
ni tampoco Salmonella sp. indígena de las 50 muestras de
lavado de carcasas. Sin embargo, el 12% de las muestras de lavado
tomadas de las 50 carcasas del grupo control fueron positivas para
la PCR y el cultivo de S. heidelberg y S. hadar.
| Evaluación del lavado de carcasas del Sitio#3 | |
| Grupo | Número de muestras positivas |
| Control | 6/50 (12%)^{1} |
| Tratado | 0/50 (0%)^{2} |
| ^{1} Los cultivos se identificaron como S. heidelberg y S. hadar. | |
| ^{2} Diferentes significativamente del grupo control según el test de la Ji-Cuadrado (P\leq0,05). |
La vacunación por pulverización con la vacuna de
S. typhimurium, \chi3985, Código de producto 19C1.01,
demostró que era segura para su utilización con pollos comerciales
para carne. Las aves mantuvieron el nivel de salud y rendimiento
esperados por el productor después de la exposición a la vacuna. El
entorno del ensayo inmediato estaba libre de residuos de la vacuna.
La vacuna fue eficaz ya que su utilización resultó en la
eliminación completa de Salmonella sp. indígena en las
carcasas de los grupos tratados comparados con grupos control en
los dos ensayos. Estos resultados confirman que la vacuna fue
segura y eficaz en los ensayos conducidos en cooperación con las
tres operaciones de aves de corral comerciales.
Todas las referencias citadas en esta
especificación se han incorporado aquí. La discusión de las
referencias pretende meramente resumir las afirmaciones realizadas
por sus autores, sin que se admita en ningún momento que las
referencias constituyan los antecedentes de la materia. Los
solicitantes se reservan el derecho para probar la exactitud y
adecuación de las referencias citadas.
En vista de lo anterior, serán evidentes las
ventajas de la presente invención y la posibilidad de lograr otros
resultados ventajosos.
Dado que se pueden realizar diversos cambios en
los anteriores procedimientos y composiciones a partir de la
invención, se pretende que todas las materias contenidas en la
descripción anterior y mostradas en las figuras acompañantes puedan
ser interpretadas como un ejemplo y no como una limitación.
Claims (25)
1. Utilización de un derivado vivo no virulento
de una bacteria enteropatogénica para la fabricación de un
medicamento para su uso como vacuna en aves domésticas, siendo
administrada dicha vacuna en forma de pulverización corporal
total.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la bacteria enteropatogénica es una
Salmonella.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación
2, en donde la pulverización se administra en una dosis de
aproximadamente 10^{5} a 10^{8} unidades formadoras de colonias
del derivado vivo no virulento de una bacteria patogé-
nica.
nica.
4. Utilización de acuerdo con la reivindicación
3, en donde Salmonella es S. typhimurium.
5. Utilización de acuerdo con la reivindicación
4, en donde S. typhimurium es \chi3985.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
3, en donde el ave tiene una edad igual o inferior a 3 semanas.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
6, en donde el ave tiene menos de un día de edad.
8. Utilización de acuerdo con la reivindicación
7, en donde el ave es un pollo.
9. Utilización de acuerdo con la reivindicación
7, en donde la administración por pulverización se prosigue por la
administración de al menos una dosis de vacuna de refuerzo.
10. Utilización de acuerdo con la reivindicación
9, en donde la dosis de refuerzo de la vacuna se administra en el
agua de bebida.
11. Utilización de acuerdo con la reivindicación
10, en donde se administra una dosis de refuerzo 14 días después de
la administración por pulverización.
12. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la pulverización es una pulverización gruesa de gotitas
de diámetros entre 50 y 150 micras.
13. Utilización de un derivado no virulento vivo
de una bacteria enteropatogénica para la fabricación de un
medicamento para su uso como vacuna en aves de corral, siendo
administrada dicha vacuna en forma de pulverización corporal
total.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación
13, en donde la bacteria enteropatogénica es Salmonella.
15. Utilización de acuerdo con la reivindicación
14, en donde la pulverización se administra en una dosis de
aproximadamente 10^{5} a 10^{8} unidades formadoras de colonias
de un derivado vivo no virulento de una bacteria patogé-
nica.
nica.
16. Utilización de acuerdo con la reivindicación
15, en donde Salmonella es S. typhimurium.
17. Utilización de acuerdo con la reivindicación
16, en donde de S. typhimurium es \chi3985.
18. Utilización de acuerdo con la reivindicación
16, en donde las aves de corral tienen una edad inferior a 104
semanas.
19. Utilización de acuerdo con la reivindicación
16, en donde las aves de corral tienen una edad igual o inferior a
3 semanas.
20. Utilización de acuerdo con la reivindicación
19, en donde las aves de corral tienen 1 día de edad.
21. Utilización de acuerdo con la reivindicación
20, en donde las aves de corral son pollos.
22. Utilización de acuerdo con la reivindicación
18, en donde la administración por pulverización se prosigue por la
administración de al menos una dosis de refuerzo de la vacuna en el
agua de la bebida.
23. Utilización de acuerdo con la reivindicación
22, en donde se administra una dosis de refuerzo 14 días después de
la administración por pulverización.
24. Utilización de acuerdo con la reivindicación
13, en donde la administración por pulverización comprende gotitas
dispersas con diámetros de 50 a 150 micras.
25. Utilización de un derivado vivo no virulento
de una bacteria enteropatogénica, comprendiendo dicha bacteria un
gen recombinante que codifica la expresión de una proteína, para la
fabricación de medicamentos para su utilización como sistema de
liberación de dicha proteína a un ave doméstica, siendo administrado
dicho derivado mediante pulverización corporal total.
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