ES2829824T3 - Suministro en el huevo de cultivos probióticos - Google Patents
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Abstract
Una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y una vacuna de aves de corral para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dicha cepa y dicha vacuna se administran juntas a un huevo de ave de corral embrionado, en forma de una preparación combinada; en donde dicha vacuna es para la enfermedad de Marek; y en donde dicha vacuna comprende una cepa de virus del herpes de pavo o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas.
Description
DESCRIPCIÓN
Suministro en el huevo de cultivos probióticos
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a suministrar células microbianas viables en forma de bacterias probióticas, también denominadas “ microorganismos de alimentación directa” , o probióticos, a aves de corral en el huevo. En la presente también se describen composiciones compatibles adecuadas para su suministro junto con productos de vacuna.
Antecedentes de la invención
En la bibliografía se han publicado varios documentos que describen la base científica para el uso de probióticos, o DFM (microorganismos de alimentación directa, por sus siglas en inglés), como inóculos intestinales para animales de producción. Desde las primeras publicaciones de Metchnikoff; varios estudios han demostrado la capacidad de los lactobacilos, por ejemplo, para suprimir el crecimiento de coliformes. Se demostró que la alimentación de células viables de Lactobacillus acidophilus a terneras lecheras jóvenes reduce la incidencia de diarrea y aumenta el número de lactobacilos y reduce los recuentos de coliformes en la materia fecal.
Los probióticos para animales son preparaciones bacterianas o de levadura que se administran por vía oral o se añaden a los piensos. Los probióticos animales más habitualmente utilizados son cepas de las especies de bacterias acidolácticas (BAL), en particular aquellas clasificadas en los siguientes géneros: Lactobacillus, Lactococcus y Enterococcus. Entre éstos se incluyen las siguientes especies: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulqaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactococcus lactis, Lactococcus termophilus, Lactococcus diacetilactis y Enterococcus faecium. Además de estas BAL, se usan algunas especies de Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus toyoi) y levaduras y hongos (Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae y Torulopsis sp.).
En general, se sostiene que durante períodos de baja resistencia a la enfermedad, tales como el estrés, los microorganismos no deseados son capaces de proliferar en el tracto GI de animales, incluyendo los seres humanos. Se considera crítico mantener un equilibrio normal y saludable de microorganismos durante, por ejemplo, dichos períodos estresantes. Por lo tanto, el concepto que subyace al uso de probióticos es que si se introducen cantidades suficientes de un microorganismo o microorganismos adecuados en el tracto intestinal (i) en momentos de estrés y/o enfermedad, (ii) en el nacimiento o (iii) después de un tratamiento con antibióticos (cuando hay presentes cantidades mínimas de BAL), las consecuencias negativas de los desequilibrios microbianos pueden minimizarse o resolverse. La utilización de dichas preparaciones de microorganismos vivos de origen natural ayuda a restablecer y mantener el equilibrio adecuado de microbios beneficiosos en el tracto GI durante los momentos de estrés, enfermedad y después de una terapia con antibióticos. Algunos de los principales problemas o limitaciones que se encuentran en la aplicación a escala comercial de probióticos a animales son
(i) el uso de la cepa probiótica correcta y documentada para el fin, y
(ii) la disponibilidad de sistemas de suministro adecuados, y
(iii) la capacidad de proporcionar las preparaciones probióticas a los animales lo más rápido posible después del nacimiento. Esto es especialmente cierto en la producción de animales cuando se usan piensos granulados, como es el caso en la industria avícola. El proceso de granulación generalmente incluye una o más etapas de calentamiento que implican temperaturas suficientemente altas para pasteurizar o esterilizar los componentes del pienso, descartando de este modo la incorporación de microorganismos viables en estos piensos antes de la granulación.
El documento WO 92/12638 describe cepas de Lactobacillus reuteri para la inyección en el huevo en huevos de aves de corral.
El documento US 2007/243212 describe métodos para vacunar aves, incluyendo métodos que implican la administración en el huevo.
La invención de la presente resuelve los problemas mencionados anteriormente con los microorganismos no deseados como se describe a continuación.
Resumen de la invención
Las realizaciones de la invención se exponen en el conjunto de reivindicaciones anexas.
En particular, la presente invención proporciona una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y una vacuna de aves de corral para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dicha cepa y
dicha vacuna se administran juntas a un huevo de ave de corral embrionado, en forma de una preparación combinada;
en donde dicha vacuna es para la enfermedad de Marek; y
en donde dicha vacuna comprende una cepa de virus del herpes de pavo o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas.
La presente descripción tiene como objetivo proporcionar un suministro de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri a aves de corral en el huevo para conseguir una eclosabilidad alta y una mortalidad baja de los pollos.
Un objeto de la presente descripción es proporcionar la administración de cepas de bacterias Lactobacillus reuteri y una vacuna de aves de corral para la enfermedad de Marek junto con un diluyente de vacuna a aves de corral en el huevo. La utilización del mismo diluyente que para las vacunas utilizadas, aumenta la compatibilidad y reduce el riesgo de interferencia negativa entre las bacterias probióticas y la vacuna. Esto permite una manera eficaz de suministro de las bacterias probióticas ya que se puede realizar sin reducir el efecto de una vacuna utilizada o las bacterias probióticas utilizadas.
Otro objeto de la presente descripción es proporcionar el uso de una composición que comprende determinadas cepas de Lactobacillus reuteri y vacunas para la enfermedad de Marek y un diluyente de vacuna adecuado. Más específicamente, la descripción es para proporcionar el uso de una composición que comprende cepa T-1, ATCC 55149 (aislada de pavo) y cepa 11284 a Tc C 55148 (aislada de pollo) de Lactobacillus reuteri y diluyente de vacuna adecuado para la vacuna utilizada en la presente.
Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas de la misma
La presente descripción describe métodos y procesos novedosos para suministrar probióticos viables en el huevo. El probiótico utilizado para desarrollar estos métodos es Lactobacillus reuteri. Se eligió esta especie porque ha demostrado una eficacia buena y fiable como un DFM en aves de corral.
Lactobacillus reuteri es una especie de bacterias acidolácticas reconocida desde principios de siglo. Habiendo recibido originariamente diferentes nombres de especie (por ejemplo, Lactobacillus fermentum biotipo II), obtuvo el estatus de especie distinta en 1980 y se registró en el manual de Bergey edición de 1988. Se encuentra en alimentos, especialmente productos lácteos y carnes, pero existe principalmente en el tracto Gl de animales sanos, incluyendo los seres humanos.
La producción avícola es una fuente importante de proteína animal para muchas personas alrededor del mundo. Los productos avícolas incluyen huevos, pollos y pavos. Diferentes tipos de aves de corral son adecuados para fines específicos tales como las aves ponedoras que se usan para la producción de huevos, mientras que las aves de engorde se han desarrollado y cultivado para un crecimiento óptimo y rápido. La producción avícola moderna muchas veces tiene lugar en edificios cerrados para proteger a las aves de las condiciones meteorológicas y las especies depredadoras, pero también para minimizar el riesgo de enfermedades que se propagan de aves silvestres. En la producción de aves de engorde es importante garantizar un entorno libre de enfermedades y encontrar métodos adecuados para preparar las aves ponedoras para una vida saludable. Como ejemplo, patógenos enterobacterianos humanos, tales como Salmonella spp. podrían contaminar la carne y los huevos de las aves de corral. Las bacterias colonizan el tracto intestinal pero normalmente no provocan enfermedad en las aves de corral, pero una infección podría ser devastadora para los seres humanos. Se han realizado esfuerzos para reducir este problema y se ha puesto atención en las acciones sanitarias durante la producción y el procesamiento de la carne y el huevo, pero dichos métodos consumen mucho tiempo, son caros y no garantiza la erradicación total de las bacterias y esto sigue siendo un problema.
Otro intento de combatir estos patógenos enterobacterianos es vacunar las aves de corral para protegerlas de la enfermedad. Otra forma consiste en usar probióticos adecuados tales como Lactobacillus reuteri, especialmente las cepas ATCC55148 y 55149 para reducir el número de patógenos.
La vacunación tiene como objetivo imitar el desarrollo de inmunidad natural adquirida mediante la inoculación de componentes no patógenos, pero aún inmunogénicos, del patógeno en cuestión. Los criterios para vacunas satisfactorias para animales y veterinarias pueden ser muy diferentes de aquellos para las vacunas humanas y tienen por objeto, por ejemplo, mejorar la producción, reducir o eliminar el riesgo de que los consumidores adquieran infecciones transmitidas por alimentos. El mercado veterinario de vacunas está creciendo debido a nuevas tecnologías disponibles y, además, al uso restringido de antibióticos. Además de la Salmonella, otras dos enfermedades comunes en las aves de corral para las que existen vacunas son el virus de la enfermedad de Marek (MDV) y el virus de la enfermedad de Newcastle. La enfermedad de Marek es una enfermedad vírica muy contagiosa, fundamentalmente en pollos. Está provocada por un herpersvirus y se caracteriza por la presencia de linfoma de linfocitos T así como infiltración de nervios y órganos por linfocitos. Se pueden usar virus relacionados con el MDV como cepas de vacuna, por ejemplo, Herpesvirus de Pavos (HVT, por sus siglas en inglés), que no provoca ninguna enfermedad aparente en pavos. El virus de la enfermedad de Newcastle es un paramixovirus. El virus también puede penetrar las cáscaras de
huevo y, por lo tanto, infectar el embrión. Existen muchas vacunas para la enfermedad de Newcastle adecuadas para su uso en pollos comerciales.
Se puede preparar una vacuna de diferentes maneras, un ejemplo es cultivar la cepa de vacuna y después utilizarla tal cual o conformarla en una composición de vacuna combinando el cultivo en crecimiento con un diluyente adecuado. Un diluyente no debe afectar a la estabilidad y la vitalidad del cultivo de vacuna de manera negativa. El diluyente está preferentemente exento de cloro, antibióticos, antimicrobianos o cualquier otro agente que pueda ser perjudicial para los organismos de vacuna vivos.
Existen diferentes formas de administración de vacunas y una técnica que se utiliza frecuentemente es la inyección en el huevo. La vacunación en el huevo se introdujo en los EE. UU. hace más de 20 años y es una tecnología muy eficaz con el fin de obtener una inmunidad precoz. También es una forma eficaz de vacunación en masa, lo que hace que sea un método adecuado para su uso en la producción avícola, tal como la producción de aves de engorde. Permite la inyección individual de cada huevo, lo que significa que se vacuna cada ave.
La cepa y la vacuna para el uso de la presente invención proporcionan un medio para suministrar Lactobacillus reuteri dentro de huevos de especies de aves, de manera que estos microorganismos se puedan establecer bien en el sistema gastrointestinal de las aves en el momento de la eclosión.
La cepa y la vacuna para el uso de la presente invención proporcionan el suministro de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri especialmente adecuadas a aves de corral en el huevo para conseguir una eclosabilidad alta y una mortalidad baja de los pollos. Esto se hace a través del uso de la especie Lactobacillus reuteri y preferentemente se aíslan de aves de corral.
La cepa y la vacuna para el uso de la presente invención también proporcionan el uso de cultivos de Lactobacillus reuteri inyectados en huevos mediante la perforación del huevo asépticamente encima de la célula de aire con una aguja.
La cepa y la vacuna para el uso de la presente invención también proporcionan el uso de cultivos de Lactobacillus reuteri inyectados en el líquido amniótico de los huevos mediante la perforación del huevo asépticamente con una aguja.
La cepa y la vacuna para el uso de la presente invención proporcionan el uso de una composición que comprende determinadas cepas de Lactobacillus reuteri junto con un diluyente de vacuna a aves de corral en el huevo. La utilización del mismo diluyente que para las vacunas utilizadas, aumenta la compatibilidad y reduce la interferencia negativa por las bacterias probióticas y la vacuna. Esto permite una manera eficaz de suministro de las bacterias probióticas ya que se puede realizar sin reducir el efecto de una vacuna utilizada o las bacterias probióticas utilizadas.
La cepa y la vacuna para el uso de la presente invención también proporcionan el uso de una composición que comprende determinadas cepas de Lactobacillus reuteri y un diluyente de vacuna adecuado. Más específicamente, la cepa y la vacuna para el uso de la presente invención proporcionan el uso de una composición que comprende cepa T-1, ATCC 55149 (aislada de pavo) y cepa 11284 At Cc 55148 (aislada de pollo) de Lactobacillus reuteri y diluyente de vacuna adecuado para la vacuna utilizada en la presente para la enfermedad de Marek, por ejemplo, de Merial Inc.
Por lo tanto, la cepa y la vacuna para el uso de la presente invención se basan en la provisión de condiciones que permiten la compatibilidad de una bacteria probiótica y una vacuna de aves de corral. Los inventores han descubierto que esto se puede hacer a través del uso del mismo diluyente para el probiótico ya que es adecuado para la vacuna de aves de corral. La capacidad de usar el mismo diluyente para el probiótico que para la vacuna aumenta la compatibilidad y reduce la interferencia negativa entre las bacterias probióticas y la vacuna, de manera que el probiótico puede todavía funcionar eficazmente como probiótico y la vacuna puede todavía actuar eficazmente como vacuna.
Es bien sabido y reconocido en la técnica que las vacunas requieren diluyentes adecuados y específicos y que en la mayoría de los casos los diluyentes no son intercambiables. Los diluyentes de vacuna son líquidos que generalmente se proporcionan por separado de la vacuna y se usan para diluir una vacuna hasta la concentración adecuada antes de la administración. Por ejemplo, se puede usar un diluyente para reconstituir una vacuna liofilizada o criodesecada o simplemente para diluir una vacuna que ya está en forma líquida. Sin embargo, los diluyentes son no solo para disolver vacunas o diluir vacunas; se diseñan para satisfacer los requisitos específicos de una vacuna individual, por ejemplo, en términos de volumen, esterilidad, pH y equilibrio químico. Por lo tanto, las vacunas generalmente son muy sensibles al diluyente al que están expuestas, y un diluyente incorrecto puede dar como resultado un efecto adverso sobre la funcionalidad de una vacuna o que la vacuna no actúe eficazmente. Por esta razón, en la mayoría de los casos, los diluyentes no son intercambiables y son específicos para la vacuna en cuestión. Si se usa el diluyente equivocado, siempre será necesario repetir la vacunación.
Sorprendentemente, dadas las sensibilidades anteriores, los presentes inventores han descubierto que las bacterias probióticas que puede tener efectos beneficiosos en aves de corral se podrían diluir en el mismo diluyente que una vacuna de aves de corral y se podrían combinar con una vacuna de aves de corral sin interferir significativamente con la actividad
de la vacuna. La utilización del mismo diluyente para el probiótico que para la vacuna, aumenta la compatibilidad y reduce la interferencia negativa entre las bacterias probióticas y la vacuna. Esto permite una forma eficaz de suministrar las bacterias probióticas (y la vacuna) ya que se puede realizar mientras se mantiene un efecto beneficioso de una vacuna y un efecto beneficioso de las bacterias probióticas que se utilizan. De esta manera, se proporcionan terapias de combinación en las que se administran vacunas y probióticos. En particular, los inventores han demostrado que se pueden diluir cepas de Lactobacillus reuteri en un diluyente de vacuna desarrollado para la enfermedad de Marek y se pueden combinar con una vacuna atenuada para la enfermedad de Marek completada con el mismo diluyente, sin eliminar la capacidad de la vacuna para replicarse. En otras palabras, la actividad de la vacuna se mantuvo en un grado útil en presencia del probiótico.
Además, los inventores han demostrado que cuando las cepas probióticas se diluyen en un diluyente de vacuna y se administran a aves de corral en el huevo tienen efectos beneficiosos sobre las aves de corral. En otras palabras, la actividad probiótica de las cepas se mantuvo en un grado útil en presencia del diluyente de vacuna.
También se describe en la presente una composición adecuada para su uso en un protocolo de vacunación en el huevo para aves de corral que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna que es adecuado para la vacuna de aves de corral que se ha de usar en dicho protocolo de vacunación.
También se describe en la presente una composición que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna adecuado para una vacuna de aves de corral en el huevo.
Como se utiliza en la presente, la expresión “bacterias probióticas” se refiere a microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud en el hospedador, en este caso un tipo de ave de corral.
Las aves de corral se pueden beneficiar de las bacterias probióticas a través de una multitud de formas. Por ejemplo, la presencia de las bacterias probióticas en el tracto GI de aves de corral puede prevenir o inhibir la proliferación de patógenos, suprimir la producción de factores de virulencia por patógenos o modular la respuesta inmunitaria de una manera proinflamatoria o antiinflamatoria.
Un objetivo principal de la presente invención es preparar un embrión de ave de corral para una vida fuera del huevo después de eclosionar, por ejemplo, proporcionar a las aves de corral bacterias probióticas útiles que, por ejemplo, prevendrán o reducirán las afecciones asociadas a la flora intestinal no óptima o a patógenos enterobacterianos en las aves de corral, o mejorarán la eclosabilidad de las aves de corral o reducirán la mortalidad de las aves de corral, junto con la provisión de vacunas de aves de corral que prevendrán o reducirán determinadas enfermedades que tienen un efecto perjudicial sobre las aves de corral. Convenientemente, dichas bacterias probióticas y vacunas de aves de corral se administran en el huevo, lo que permite que estos agentes pasen al tracto gastrointestinal de las aves y, de ese modo, ejerzan sus efectos positivos sobre las aves de corral mediante el mecanismo adecuado.
Las bacterias probióticas para su uso en la presente invención son cepas de bacterias Lactobacillus reuteri. Se puede usar cualquier bacteria probiótica Lactobacillus reuteri adecuada en las composiciones, métodos y usos, etc., de la presente invención, siempre que dichas bacterias sean capaces de colonizar el tracto gastrointestinal de las aves de corral que se vacunan y siempre que su capacidad para funcionar como probiótico y proporcionar un beneficio para la salud en las aves de corral se conserve en un grado útil.
Generalmente se prefiere que se utilicen cepas y cultivos puros conocidos de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri en la presente invención, en lugar de mezclas y preparaciones desconocidas de bacterias probióticas. Sin embargo, en la presente invención se puede utilizar más de un tipo de cepa o mezclas de cepas conocidas o puras de bacterias probióticas. De hecho, en algunas realizaciones se prefieren dichas mezclas. Dichas mezclas o combinaciones de bacterias probióticas se pueden administrar juntas en una sola composición o por separado.
La vacuna (y el diluyente correspondiente) utilizada en la invención es una vacuna (y diluyente) adecuada para la enfermedad de Marek (por ejemplo, una vacuna para el virus de la enfermedad de Marek producida comercialmente y su diluyente), en particular una vacuna que comprende una cepa de virus del herpes de pavo o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas. Son bacterias probióticas preferidas para su uso la cepa de L. reuteri T1 (ATCC 55149) o la cepa de L. reuteri 11284 (ATCC 55148), o mezclas de las mismas. Sin embargo, se prevé que se pueden seleccionar otras cepas de L. reuteri que sean compatibles con estas y, de hecho, otras vacunas y diluyentes. De hecho, se pueden seleccionar otras cepas de bacterias probióticas L. reuteri probióticas por su compatibilidad con vacunas de aves de corral particulares y sus diluyentes.
Por lo tanto, en general, son cepas de L. reuteri preferidas para su uso en la presente invención cepa T1 de L. reuteri (ATCC 55149) o cepa 11284 de L. reuteri (ATCC 55148), o mezclas de las mismas que se pueden administrar juntas o por separado. La cepa T1 de Lactobacillus reuteri (ATCC 55149) y la cepa 11284 de L. reuteri (ATCC 55148) se depositaron en la American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE. UU.) el 29 de enero 1991.
En realizaciones de la cepa y la vacuna para el uso de la presente invención en donde se usa más de una cepa de bacterias probióticas en una sola composición, o cuando se usa más de una cepa de bacterias probióticas, pero se administran por separado, entonces se puede usar cualquier relación adecuada de las bacterias, siempre que la función probiótica de las cepas se mantenga en un grado útil. Dichas relaciones se pueden determinar fácilmente por un experto en la materia. Por ejemplo, una combinación de este tipo de dos cepas se podría usar en una relación de 1:10, 1:5, 1:1,5:1 o 10:1.
Las vacunas (y diluyentes) para su uso en la presente invención son adecuadas para la administración en el huevo. Debido a las normativas necesarias respecto a vacunas de aves de corral dichas vacunas para su uso en la presente invención generalmente habrán sido aprobadas por los organismos reguladores necesarios (por ejemplo, serán aprobadas por USDA) para el uso veterinario/uso de aves de corral y se suministrarán generalmente en el mercado junto con un diluyente de vacuna adecuado que se ha seleccionado o desarrollado para dicha vacuna. Existen muchas vacunas disponibles para aves de corral que se pueden utilizar para vacunar contra muchas enfermedades diferentes. Como ya se ha mencionado en otra parte en la presente, las vacunas (y diluyentes asociados) para su uso en la presente invención son vacunas (y diluyentes) para la enfermedad de Marek.
En algunas realizaciones, se pueden administrar dos o más vacunas de aves de corral diferentes (una vacuna para la enfermedad de Marek y, por ejemplo, una vacuna para la enfermedad de Newcastle) en el mismo protocolo de vacunación, ya sea juntas en combinación o por separado. Es probable que esta opción sea especialmente adecuada cuando el mismo diluyente de vacuna sea adecuado para las diferentes vacunas. Por ejemplo, los diluyentes preferidos que se describen en la presente, por ejemplo, el diluyente del Ejemplo 1 y los diluyentes relacionados, se cree que son adecuados para su uso con ambas vacunas autólogas para la enfermedad de Marek y vacunas para la enfermedad de Newcastle.
Las vacunas para la enfermedad de Marek para los usos de la invención comprenden una cepa de virus del herpes de pavo (HVT), que es similar antigénicamente al virus de la enfermedad de Marek (MDV), o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas. Dichas vacunas (y diluyentes adecuados) son bien conocidas en la técnica y se encuentran disponibles en el mercado, por ejemplo, en Merial Select, Inc. Rispens CVI 988 es una cepa de ejemplo de virus del herpes de pollo.
Una cepa especialmente preferida de virus del herpes de pavo para su uso en la presente invención es una cepa FC126. Una cepa especialmente preferida de virus del herpes de pollo es una cepa SB1. También se pueden usar combinaciones de dichas cepas.
Hay disponibles muchas vacunas de aves de corral (por ejemplo, disponibles en el mercado) para la enfermedad de Newcastle. En las diversas vacunas se usan muchas cepas alternativas de virus de la enfermedad de Newcastle. Por ejemplo, las cepas de ejemplo incluyen las cepas V4, V4-HR, I-2, F, B-1 o La Sota del virus de la enfermedad de Newcastle, o combinaciones de las mismas. En algunos ejemplos, se prefieren vacunas basadas en las cepas F o B-1, por ejemplo, basadas en la cepa F para protocolos de vacunación en el huevo.
Como se ha mencionado anteriormente, las vacunas para su uso en la presente invención deberían ser adecuadas para la administración en el huevo y también deberían ser compatibles con bacterias probióticas Lactobacillus reuteri de manera que las bacterias probióticas se puedan diluir con el diluyente de vacuna específico para la vacuna en cuestión y se puedan utilizar juntos en una terapia combinada (protocolo de vacunación) de manera que la bacteria probiótica todavía funcione como un probiótico en un grado útil y la capacidad de vacunación de la vacuna se conserve en un grado eficaz.
El experto tendrá disponibles diluyentes adecuados para su uso con vacunas de aves de corral particulares, ya que generalmente se suministra un diluyente con una composición adecuada con la vacuna en cuestión. De esta manera, el diluyente de vacuna se adapta a la vacuna en cuestión de manera que la estabilidad y eficacia de la vacuna no se vean afectadas. Por lo tanto, un diluyente adecuado no debe afectar a la estabilidad o la vitalidad (por ejemplo, título) del cultivo de vacuna de manera negativa. El diluyente está preferentemente exento de cloro, antibióticos, antimicrobianos o cualquier otro agente que pueda ser perjudicial para los organismos de vacuna y está a un pH adecuado para que no sea perjudicial para los organismos de vacuna vivos. En realizaciones preferidas, el diluyente de vacuna tiene un pH de entre 6,9 y 7,3. (El diluyente tampoco debe ser perjudicial, por supuesto, para la función del probiótico seleccionado).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el diluyente de vacuna no es solución salina o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En otras realizaciones, el diluyente de vacuna no es un medio de fermentación de bacterias probióticas o medio de crecimiento. En otras realizaciones de la invención, el diluyente de vacuna no es agua, por ejemplo, no es agua estéril o agua destilada.
En realizaciones preferidas de la invención, dicho diluyente de vacuna comprende uno o más de los componentes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, NZ Amina AS, fosfato de potasio dibásico y fosfato de potasio monobásico. Más preferentemente, dicho diluyente de vacuna comprende dos o más, tres o más, o todos estos componentes. Opcionalmente, dicho diluyente de vacuna también puede comprender rojo fenol o algún otro indicador de pH. En realizaciones preferidas, el diluyente de vacuna tiene un pH de entre 6,9 y 7,3. En algunas
realizaciones, el diluyente de vacuna tiene un contenido de sólidos de entre el 6,0 % y el 8,0 %, por ejemplo, en o aproximadamente el 6,8 % o el 7,0 %.
Una receta de diluyente de vacuna especialmente preferida para su uso en la presente invención se proporciona en el Ejemplo 1.
Otros diluyentes de vacuna preferidos para su uso en la presente invención tienen sacarosa como componente principal, por ejemplo, comprenden un contenido de sacarosa del 2 % al 10 %, por ejemplo, del 3 % al 7 %, por ejemplo, de aproximadamente el 5 %.
Otros diluyentes de vacuna preferidos tienen N.Z. Amina AS como componente, preferentemente un segundo componente, por ejemplo, comprende un contenido de N.Z. Amina AS del 0,25 % al 2,75 %, por ejemplo, del 1,0 % al 2,0 %, por ejemplo, de aproximadamente el 1,5 %.
Otros diluyentes de vacuna preferidos tienen fosfato de potasio como componente, preferentemente como segundo o tercer componente, por ejemplo, comprenden un contenido total de fosfato de potasio del 0,08 % al 0,26 %, por ejemplo, del 0,1 % al 0,2 %, por ejemplo, de aproximadamente el 0,17 %. El fosfato de potasio puede estar compuesto por fosfato de potasio dibásico o monobásico, o una mezcla de los dos. El contenido preferido de fosfato de potasio dibásico es, por ejemplo, del 0,06 % al 0,20 %, por ejemplo, del 0,10 % al 0,17 %, por ejemplo, aproximadamente el 0,125 %. El contenido preferido de fosfato de potasio monobásico es, por ejemplo, del 0,02 % al 0,07 %, por ejemplo, del 0,03 al 0,06 %, por ejemplo, aproximadamente el 0,05 %.
Por tanto, en la presente invención, una composición para el uso de la presente invención que comprende las bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y el diluyente de vacuna comprenderá además la vacuna de aves de corral para su uso en dicho protocolo de vacunación. En dichas realizaciones, para que todos los componentes sean compatibles con, y no afecten negativamente a, la función de los demás en un grado problemático, la vacuna de aves de corral y las bacterias probióticas Lactobacillus reuteri se proporcionan o combinan entre sí en el mismo diluyente de vacuna. En otras palabras, las bacterias probióticas están presentes en el mismo diluyente de vacuna que la vacuna de aves de corral y las bacterias probióticas se seleccionan para que sean adecuadas para y compatibles con dicha vacuna de aves de corral y el diluyente asociado.
Como se describe en otra parte en la presente, la administración en el huevo, convenientemente mediante inyección, es una forma preferida y ventajosa de administración de vacunas y la presente invención se refiere a una cepa y vacuna para su uso en protocolos de vacunación en el huevo para aves de corral. Dichos protocolos y medios y métodos de vacunación en el huevo son bien conocidos y se describen en la técnica. Uno de los objetivos de la vacunación en el huevo es que la administración en el huevo de una entidad activa (por ejemplo, una bacteria probiótica y una vacuna en el presente caso) da como resultado que esta entidad activa (y de hecho cualquier entidad administrada) se transfiere a través del embrión de ave de corral al tracto gastrointestinal (GI) de las aves de corral cuando eclosiona.
Por lo tanto, las composiciones que comprenden las bacterias probióticas y las vacunas (ya sea juntas o por separado) como se describe en la presente se administran a huevos embrionados o fertilizados a la dosis adecuada y en el punto temporal adecuado para permitir que las bacterias probióticas y las vacunas estén presentes en una cantidad adecuada y funcional en el tracto GI de las aves de corral tras la eclosión. En particular, para las bacterias probióticas, las dosis y el momento de administración al huevo se seleccionan de manera que las bacterias probióticas pueden dar como resultado la colonización del tracto GI tras la eclosión de las aves de corral o poco después (por ejemplo, hasta siete días después de la eclosión). Esto es importante para garantizar que el beneficio para la salud de las bacterias probióticas se pueda conseguir en las aves de corral.
Se puede utilizar cualquier sitio adecuado de administración o inyección al huevo embrionado para obtener el suministro satisfactorio en el huevo y el paso al tracto GI de las aves de corral eclosionadas resultantes. Sin embargo, los sitios de administración especialmente preferidos son la administración en la célula de aire o el líquido amniótico del huevo. Dicha administración es generalmente a modo de inyección. Dicha administración se puede realizar de cualquier manera adecuada, por ejemplo, hay disponibles máquinas comerciales para la administración en el huevo automatizadas a gran escala, o la administración puede realizarse manualmente.
Los puntos temporales adecuados para la administración variarán dependiendo del tipo de huevo de ave de corral en cuestión. Sin embargo, un punto temporal preferido es de aproximadamente 2 días antes de la eclosión y un experto en la materia puede determinar fácilmente los momentos adecuados para conseguir esto. Por ejemplo, para huevos de gallina, la administración puede tener lugar cuando los huevos embrionados tienen 18-19 días de edad.
Un experto en la materia puede determinar fácilmente las dosificaciones adecuadas de las bacterias probióticas y las vacunas que han de utilizarse en la invención.
Por ejemplo, se elige un régimen de dosificación y administración de manera que las bacterias probióticas para el uso de la presente invención administradas al huevo embrionado se puedan transferir a las aves de corral en una cantidad adecuada para colonizar el tracto GI y dar lugar a los efectos terapéuticos o beneficios para la salud deseados. Por lo tanto, preferentemente, dicha dosificación es una dosificación terapéuticamente eficaz que es adecuada para el tipo de ave de corral que se está tratando. Por ejemplo, se pueden utilizar dosis de 105 a 108 UFC totales de bacterias por huevo embrionado. Son dosis preferidas de 5 x 105 a 7 x 106 UFC, más preferentemente de 2 x 106 a 7 x 106 o 5 x 106 UFC por huevo, con máxima preferencia a o aproximadamente de 2 x 106 UFC por huevo. Puede utilizarse cualquier volumen adecuado para la administración en el huevo pero los volúmenes típicos son de 50-100 pl por huevo embrionado.
De forma similar, se elige un régimen de dosificación y administración para el componente de vacuna, de manera que la vacuna de aves de corral para el uso de la presente invención administrada al huevo embrionado pueda transferirse a las aves de corral eclosionadas en una cantidad adecuada para dar lugar a los efectos deseados de vacunación/protección para la enfermedad y la vacuna en cuestión. Las dosis adecuadas para la administración en el huevo de vacunas de aves de corral son bien conocidas y se describen en la técnica, por ejemplo, se indicarán en las instrucciones suministradas con o asociadas de cualquier otra forma a la vacuna suministrada comercialmente. Alternativamente, el experto puede determinar fácilmente las dosis adecuadas para la administración en el huevo.
Por lo tanto, con el fin de obtener los beneficios de la invención, después de la administración en el huevo, los huevos se incuban generalmente hasta el punto de eclosión, después de lo cual loa aves de corral se dejan crecer a adultos (o cualquier otra etapa adecuada), pero con los beneficios para la salud de las bacterias probióticas, junto con la vacuna seleccionada, que se ha administrado en el huevo. Por lo tanto, las aves de corral que se desarrollan a partir de estos huevos no solo reciben el beneficio de las bacterias probióticas que se han administrado en el huevo, sino que también reciben los beneficios del protocolo de vacunación, es decir, la vacunación contra las enfermedades seleccionadas.
En la presente se describe un huevo embrionado de ave de corral que comprende un cultivo de bacterias probióticas (preferentemente bacterias Lactobacillus), en donde la composición que contiene probióticos (por ejemplo, una composición que comprende una cepa de bacterias probióticas y un diluyente de vacuna, que comprende opcionalmente además una vacuna de aves de corral), se administra o se ha administrado a dicho huevo embrionado.
Como se describe en otra parte en la presente, dicha composición se administra, preferentemente, en la célula de aire o el líquido amniótico del huevo.
Las vacunas de aves de corral preferidas, los diluyentes y las bacterias probióticas preferidas y alternativas para su uso en dichos ejemplos son como se describen en otra parte de la presente.
Como puede observarse a partir del análisis anterior, la presente invención se refiere a protocolos de vacunación en el huevo para aves de corral y, en particular, terapias combinadas usando bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y vacunas de aves de corral para la enfermedad de Marek en las que ambos agentes activos pueden ejercer sus efectos biológicos o fisiológicos.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención proporciona una cepa (una o más) de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y una vacuna de aves de corral para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dicha cepa y dicha vacuna se administran juntas a un huevo de ave de corral embrionado, en forma de una preparación combinada;
en donde dicha vacuna es para la enfermedad de Marek; y
en donde dicha vacuna comprende una cepa de virus del herpes de pavo o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas.
Las bacterias probióticas y la vacuna de aves de corral se seleccionan para que sean compatibles entre sí (por ejemplo, las bacterias probióticas se seleccionan para que sean compatibles con la vacuna de elección) de manera que la interferencia negativa entre las bacterias probióticas y la vacuna se reduzcan o se minimicen. Como se analiza en otra parte en la presente, este hallazgo de que la administración de una vacuna y el tratamiento probiótico pueden combinarse en aves de corral, dadas las sensibilidades de los agentes activos implicados, fue sorprendente. Una manera clave por la que los inventores descubrieron que esto se puede conseguir es por las bacterias probióticas que están presentes o diluidas en el mismo diluyente que el diluyente de vacuna para la vacuna en cuestión o elegida particular.
Por lo tanto, vista de forma alternativa, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y un diluyente de vacuna para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dicha composición se administra a un huevo de ave de corral embrionado, en donde dicho uso además comprende la administración de una vacuna de aves de corral que comprende el mismo diluyente de vacuna conjuntamente, en forma de una preparación combinada;
en donde dicha vacuna es para la enfermedad de Marek; y
en donde dicha vacuna comprende una cepa de virus del herpes de pavo o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas.
Visto de forma alternativa, la presente invención proporciona una cepa (una o más) de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y un diluyente de vacuna, y una vacuna de aves de corral que comprende el mismo diluyente de vacuna, para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dichas bacterias probióticas y dicha vacuna se administran juntas a un huevo de ave de corral embrionado, en forma de una preparación combinada; en donde dicha vacuna es para la enfermedad de Marek; y
en donde dicha vacuna comprende una cepa de virus del herpes de pavo o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas.
En la presente también se describe un producto que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus, una vacuna de aves de corral y un diluyente de vacuna (para la vacuna de aves de corral) en forma de una preparación combinada para un uso separado, simultáneo o secuencial en la vacunación en el huevo de aves de corral.
Se describe el uso de una cepa (o más) de bacterias probióticas Lactobacillus y una vacuna de aves de corral en la fabricación de un medicamento para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dicha cepa y dicha vacuna se administran a un huevo de ave de corral embrionado.
Se describe el uso de una composición que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna en la fabricación de un medicamento para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dicha composición se administra a un huevo de ave de corral embrionado, en donde dicho uso además comprende la administración de una vacuna de aves de corral que comprende el mismo diluyente de vacuna.
Se describe una cepa (una o más) de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna, y una vacuna de aves de corral que comprende el mismo diluyente de vacuna, en la fabricación de un medicamento para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dichas bacterias probióticas y dicha vacuna se administran a un huevo de ave de corral embrionado.
Se describe una composición que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna en la fabricación de un medicamento para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral mediante la administración combinada, secuencial o por separado con una vacuna de aves de corral que comprenda el mismo diluyente de vacuna, en donde dicha composición se administra a un huevo de ave de corral embrionado.
Se describe un método de vacunación en el huevo de aves de corral, que comprende la etapa de administrar una (o más) cepas de bacterias probióticas Lactobacillus y una vacuna de aves de corral a un huevo de ave de corral embrionado.
Se describe un método de vacunación en el huevo de aves de corral, que comprende la etapa de administrar una composición que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna a un huevo de ave de corral embrionado, en donde dicho método además comprende la administración de una vacuna de aves de corral que comprende el mismo diluyente de vacuna.
Se describe un método de vacunación en el huevo de aves de corral, que comprende la etapa de administrar una (una o más) cepas de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna, y administrar una vacuna de aves de corral que comprende el mismo diluyente de vacuna, a un huevo de ave de corral embrionado.
Se describe un método de vacunación en el huevo de aves de corral mediante la administración combinada, secuencial o por separado de (i) una composición que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus y un diluyente de vacuna, y (ii) una vacuna de aves de corral que comprende el mismo diluyente de vacuna, en donde dicha composición y vacuna se administran a un huevo de ave de corral embrionado.
Se describe un producto que comprende una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus, una vacuna de aves de corral y un diluyente de vacuna (para la vacuna de aves de corral) en forma de una preparación combinada para un uso separado, simultáneo o secuencial en un método para la vacunación en el huevo de aves de corral.
La administración de ingredientes activos (por ejemplo, bacterias probióticas y vacunas) en dichos métodos de tratamiento descritos y la cepa y la vacuna para el uso de la presente invención se realiza en cantidades farmacéuticamente eficaces, a aves de corral que necesitan tratamiento.
El objetivo de la cepa y la vacuna para el uso de la presente invención es que los efectos beneficiosos del probiótico se observen en las aves de corral que eclosionan de los embriones dentro del huevo y, además, que la vacunación con la vacuna de aves de corral sea eficaz.
Las vacunas de aves de corral preferidas, los diluyentes y las bacterias probióticas preferidas y alternativas para el uso son como se describen en otra parte de la presente para otros aspectos de la invención. Por lo tanto, en dichas realizaciones se puede usar más de una cepa de bacterias probióticas para el uso.
La terapia combinada de la presente invención y el hecho de que el componente de bacterias probióticas y los componentes de vacuna para el uso de la presente invención sean compatibles entre sí significa que los tres componentes para el uso de la presente invención, es decir, las bacterias probióticas, la vacuna y el diluyente de vacuna (en donde preferentemente el mismo diluyente de vacuna se utiliza tanto para las bacterias probióticas como para la vacuna) pueden coadministrarse en combinación en la misma composición.
Como se describe en otra parte en la presente, el componente de bacterias probióticas debe ser compatible con el componente de vacuna de aves de corral. Esto se consigue preferentemente y de forma ventajosa utilizando el mismo diluyente para ambos componentes. Ya que el componente de vacuna es especialmente sensible al diluyente que se usa, en realizaciones preferidas, las bacterias probióticas se administrarán en el mismo diluyente que el diluyente de vacuna. Por razones prácticas y de ahorro de tiempo y costes, y no menos importante, por razones de riesgo de contaminación, generalmente deben evitarse múltiples inyecciones en el huevo. Sin embargo, si las bacterias probióticas están presentes en un diluyente alternativo (medio líquido) que no es incompatible con la vacuna o diluyente de vacuna, entonces no es necesario que las bacterias probióticas se administren en el mismo diluyente que el diluyente de vacuna y pueden administrarse en su propio medio en combinación con la vacuna y el diluyente de vacuna (por ejemplo, después de mezclar).
Un experto podrá determinar fácilmente si una vacuna y su diluyente son compatibles con una bacteria probiótica en un grado adecuado para ser útiles en la presente invención. Por ejemplo, en última instancia, tanto el componente probiótico como el componente de vacuna deben ser capaces de conservar suficiente función en presencia uno de otro para ejercer un efecto útil en las aves de corral a las que se administran de acuerdo con la presente invención.
Preferentemente, para que sean compatibles, las bacterias probióticas no deberían afectar, afectar significativamente ni inhibir por debajo de un grado útil, la capacidad de la vacuna para tener un efecto de vacunación en aves de corral. Para una vacuna atenuada esto se puede someter a ensayo, por ejemplo, evaluando el efecto de las bacterias probióticas y su diluyente (medio líquido, por ejemplo, el mismo diluyente que la vacuna) sobre la viabilidad celular o título de la vacuna (por ejemplo, los virus inoculados que constituyen la vacuna). Un ensayo adecuado se describe en la sección de Ejemplos donde, por ejemplo, se muestra que, 1 hora o 2 horas después de la reconstitución, la viabilidad celular de la vacuna (en este caso la cepa HVT o SB-1 de una vacuna para la enfermedad de Marek) en presencia de las bacterias probióticas (y diluyente de ensayo) es al menos un 95 % del nivel observado cuando las bacterias probióticas están ausentes (es decir, cuando la vacuna y el diluyente están presentes solos). En otras realizaciones con diferentes vacunas y/o bacterias probióticas, niveles de al menos el 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de viabilidad celular pueden ser adecuados pero esto puede determinarlo fácilmente el experto en la materia, por ejemplo, incluyendo también una comparación con una muestra de bacterias probióticas de control, por ejemplo, una muestra de bacterias probióticas de control con un diluyente incompatible. Si se utiliza un control de este tipo, entonces un % de viabilidad celular que sea mayor con la muestra de probiótico de ensayo que con la muestra de probiótico de control sería adecuado.
Cuando se utiliza el título como una medida de la compatibilidad, entonces de nuevo un ensayo adecuado se describe en la sección de Ejemplos, donde por ejemplo, se muestra que el título vírico a 0 horas (inmediatamente después de la reconstitución) cuando las bacterias probióticas (y el diluyente de ensayo) están presentes no se ve afectado o es al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % del nivel observado cuando las bacterias probióticas están ausentes (es decir, cuando la vacuna y su diluyente están presentes solos). Dichos títulos también pueden medirse en puntos temporales alternativos, por ejemplo, 1 hora después de la reconstitución, aunque generalmente se prefiere un punto temporal más temprano. En otras realizaciones con diferentes vacunas y/o bacterias probióticas, pueden ser adecuados otros % de niveles de título retenido, pero esto lo puede determinar fácilmente un experto en la materia. Nuevamente, en dichos ensayos para determinar el título también puede ser útil, por ejemplo, incluir una comparación con una muestra de bacterias probióticas de control, por ejemplo, una muestra de bacterias probióticas de control con un diluyente incompatible. Si se utiliza un control de este tipo, entonces un % de título que sea mayor con la muestra de probiótico de ensayo que con la muestra de probiótico de control sería adecuado.
En los ejemplos en los que la administración de los componentes de probiótico y de vacuna se hace de forma separada o secuencial, se prefiere que las administraciones se realicen dentro de un plazo de tiempo razonable de separación entre sí. Por ejemplo, las administraciones separadas se realizan preferentemente en horas (por ejemplo, una hora) o minutos (por ejemplo, en 15 o 30 minutos) de separación entre sí, con máxima preferencia dentro de un plazo de tiempo lo más corto posible (incluyendo la administración simultánea o eficazmente simultánea) dependiendo del método particular de administración en el huevo que se utilice.
Los componentes de bacterias probióticas y de vacuna para el uso de la presente invención se coadministran en una única composición, preferentemente con un único diluyente correspondiente al diluyente de vacuna. La composición debe administrarse a los huevos de aves de corral embrionados tan pronto como sea posible después de que se hayan mezclado entre sí el componente probiótico y el componente de vacuna. Por lo tanto, se prefiere generalmente que la administración a los huevos tenga lugar inmediatamente después de que las bacterias probióticas se mezclen con la vacuna, por ejemplo, una hora o dos horas después de la mezcla, más preferentemente una hora.
Los beneficios para la salud de una bacteria probiótica particular para las aves de corral son muy conocidos y reconocidos por un experto en la materia. De hecho, así como la compatibilidad con la vacuna, esto sería uno de los criterios de selección para elegir una bacteria probiótica Lactobacillus reuteri para su uso en los métodos de la invención. Por lo tanto, por ejemplo, la administración de bacterias probióticas puede dar como resultado niveles reducidos (por ejemplo, UFC) de patógenos enterobacterianos (por ejemplo, E. coli y/o Salmonella) en el tracto GI de las aves de corral, o la colonización (o colonización aumentada) de las aves de corral con dichas bacterias probióticas, por ejemplo, en comparación con aves de corral a las que no se les había administrado las bacterias probióticas en cuestión.
Las bacterias probióticas también han demostrado tener un efecto positivo sobre la eclosabilidad (el porcentaje de huevos que se espera que eclosione que de hecho eclosiona) y también un efecto positivo sobre la mortalidad (por ejemplo, la mortalidad temprana de los pavipollos), por ejemplo, la mortalidad a los 7 días. En los presentes Ejemplos, por ejemplo, se muestra que los huevos inyectados con L. reuteri dan como resultado un porcentaje aumentado de embriones vivos tras la eclosión (en comparación con los embriones no tratados o de control) y también un porcentaje aumentado de embriones/pavipollos que sobreviven el día 7 después de la eclosión (en comparación con los embriones no tratados o de control).
Preferentemente dichos aumentos (y de hecho otros aumentos o efectos positivos o disminuciones o efectos reducidos mencionados en otras partes de la presente) son aumentos medibles (o disminuciones, etc., según corresponda), más preferentemente son aumentos significativos (o disminuciones, etc., según corresponda), de forma preferente estadísticamente significativos, por ejemplo, con un valor de probabilidad de <0,05, en comparación con un nivel o valor de control adecuado.
Las bacterias probióticas Lactobacillus reuteri preferidas para su uso en la presente invención tienen un efecto positivo sobre la eclosabilidad (o menos preferentemente, no tienen un efecto negativo sobre la eclosabilidad), por ejemplo, en comparación con los embriones no tratados o tratados con control. Los porcentajes de eclosabilidad preferidos observados con las bacterias probióticas son de al menos el 95 % o al menos el 98 %.
Las bacterias probióticas Lactobacillus reuteri preferidas para su uso en la presente invención tienen un efecto positivo sobre la mortalidad, por ejemplo, mortalidad a los 7 días (o menos preferentemente no tienen un efecto negativo sobre la mortalidad), por ejemplo, en comparación con los embriones no tratados o tratados con control. Los porcentajes de mortalidad (por ejemplo, mortalidad a los 7 días) observados con las bacterias probióticas son de al menos el 85 %, 90 % o 95 %.
También se ha demostrado, por ejemplo, que la administración de bacterias probióticas a aves de corral contrarrestan diversas exposiciones a patógenos, por ejemplo, mediante la reducción del nivel (por ejemplo, UFC) de patógenos enterobacterianos tales como, por ejemplo, Salmonella o E. coli (por ejemplo, en comparación con los niveles observados en ausencia de bacterias probióticas o la presencia de una bacteria probiótica de control). Se sabe que en aves de corral la E. coli, por ejemplo, se asocia a una reducción de la eclosabilidad y una mortalidad precoz de los pavipollos.
Además, una ventaja importante es que la administración de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y vacuna para el uso de la presente invención puede eliminar la necesidad de administrar un antibiótico, tal como gentamicina. Por lo tanto, una cepa y una vacuna preferidas para su uso en la invención no implican la administración de un antibiótico.
La presente invención se puede utilizar, por lo tanto, para tratar o prevenir cualquier enfermedad o afección en un embrión de ave de corral, pavipollo o ave adulta que pueda beneficiarse del tratamiento con bacterias probióticas Lactobacillus reuteri. Las afecciones de ejemplo para el tratamiento se han analizado anteriormente. La presente invención también se puede utilizar para el tratamiento o la prevención de una enfermedad relacionada con la salud o afección asociada a embriones de aves de corral o pavipollos nacidos con una flora intestinal o un microbioma no óptimos.
Los usos terapéuticos de la presente invención, tal como se describen en la presente, generalmente producen la reducción o el alivio de la enfermedad o afección pertinente, o los síntomas de las mismas. Dicha reducción o alivio de una enfermedad o afecciones o síntomas de las mismas puede medirse mediante cualquier ensayo adecuado dependiendo de la enfermedad en cuestión. La reducción o el alivio de una enfermedad, afección o síntomas son preferentemente clínicamente significativos. Preferentemente, la reducción o el alivio de una enfermedad, afección o síntomas son estadísticamente significativos, preferentemente con un valor de probabilidad de <0,05. Dicha reducción o alivio de una enfermedad, afección o síntomas generalmente se determina en comparación con un individuo o población de control adecuados, por ejemplo, aves de corral sanas o no tratadas o aves de corral tratadas con placebo.
Como será evidente a partir de la descripción en otra parte de la presente, la cepa y la vacuna para el uso de la presente invención son adecuadas para la prevención de enfermedades, así como el tratamiento de enfermedades. Este es
especialmente el caso para los efectos de la vacunación de la cepa y la vacuna para el uso de la invención, que se basan en e implican la prevención de la enfermedad o al menos una incidencia reducida o un mayor control de la enfermedad. Por lo tanto, el tratamiento profiláctico también está abarcado por la cepa y la vacuna para el uso de la invención. Por esta razón, en los usos de la presente invención, el tratamiento también incluye la profilaxis o la prevención cuando sea adecuado. Los aspectos preferidos en los que se prevé la prevención se analizan en la presente e incluyen los aspectos de la vacunación.
Existen muchas enfermedades para las que se puede vacunar en las aves de corral y la presente invención utiliza una vacuna para la enfermedad de Marek y la cepa para el uso de la presente invención, siempre que la vacuna y la cepa para el uso de la presente invención puedan administrarse en el huevo. Las vacunas preferidas se analizan en otras partes de la presente.
La cepa y la vacuna para el uso de la presente invención se adaptan a cualquier tipo de aves de corral, por ejemplo, cualquier tipo de ave domesticada o criada comercialmente tal como pollos, pavos, gansos o patos. Se prefieren los pavos o pollos, se prefieren más los pollos.
Se describe un kit o envase farmacéutico que comprende
(i) una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus;
(ii) una vacuna de aves de corral y opcionalmente
(iii) un único diluyente de vacuna que es adecuado para su uso con (i) y (ii).
Las vacunas de aves de corral, diluyentes y bacterias probióticas preferidas y alternativas de ejemplo son como se describen en otra parte de la presente. Por lo tanto, se puede utilizar más de una cepa de bacterias probióticas en dichos ejemplos, en cuyo caso se proporcionan generalmente como componentes separados del kit o envase. Preferentemente, dichos kits o envases son para el uso en la vacunación en el huevo de aves de corral. El kit o envase también puede comprender instrucciones para la administración o el uso del kit/envase.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes:
Ejemplos
Ejemplo 1 Fabricación de una composición en el huevo congelada
El producto en el huevo de la presente invención puede estar tanto en forma congelada como en forma liofilizada. Comercialmente se denomina Reuteri InOvo™. Puede producirse desde lotes pequeños a volúmenes más grandes. Este es un ejemplo de la producción de productos congelados en viales:
Se utiliza la cepa T-1, ATCC 55149 (aislada de pavo) y la cepa 11284 ATCC 55148 (aislada de pollo) de Lactobacillus reuteri. (Las cepas se pueden adquirir en ATCC en Manassas, VA, EE. UU.) Las dos cepas se cultivan por separado en dos fermentadores diferentes y después se mezclan antes de la concentración de las células.
Los viales congelados se deben almacenar a -80 °C.
Materiales y métodos
Definiciones
Suspensión de bacterias = la suspensión de células después de la concentración de células y el lavado
Concentrado de bacterias = la suspensión de bacterias después de la adición del crio protector
Fermentación
Fermentador: CH014 (K3)- para la 11284,CH07 (LF2) - para la T1
Sustrato: Glucosa monohidratada 66.0 gramos/litro
Extracto de levadura 24,1 gramos/litro
Peptona de soja A2 20.0 gramos/litro
Acetato de Na x 3H2O 5.0 gramos/litro
Citrato de diamonio 2.0 gramos/litro
K2HPO4 80 mg/litro
MgSO4 x 7H2 O 200 mg/litro
MnSO4 x H2O 200 mg/litro
Tween 80 1.0 gramo/litro
Volumen: 10 litros - en CH014, 5 litros - en CH07
Esterilización: 121 0C durante 25 minutos, glucosa esterilizada por separado
Concentración de células
Las células se concentran en un microfiltro de flujo cruzado de Sartocon (0,22 |um, 0,6 m2). El factor de concentración (FC) es de aproximadamente 14 y el concentrado se lava con el diluyente de vacuna. La suspensión tiene un contenido de sólidos estimado de aproximadamente el 6 % de las células y del 6,8 % del diluyente proporcionando un contenido total de sólidos de aproximadamente el 13 %.
Diluyente de vacuna:
Composición: Sacarosa 51,25 g/litro
N.Z. Amina AS 15,00 g/litro
Fosfato de potasio, dibásico 1,25 g/litro
Fosfato de potasio, monobásico 0,46 g/litro
Rojo fenol 0,01 g/litro
Contenido de sólidos 6,8 %
pH 6,9-7,3
Llenado
El llenado del primer lote se realiza a mano con una pipeta manual. Del segundo lote se usa un Multipette de Eppendorf para el pipeteo repetitivo, con un cargador estéril que contiene 25 ml, para acelerar el llenado. Todos los viales se llenan con 1,00 ml. Lleva aproximadamente 30 segundos vaciar el cargador.
El concentrado de bacterias se mantiene en un frasco a aproximadamente 7 0C en un baño de hielo/agua durante el llenado. Cada 5 minutos la botella se retira del agua y se coloca en un agitador magnético durante un par de minutos. Después de eso, una porción del concentrado se carga en un vaso de precipitados de 100 ml que está constantemente en un agitador magnético, pero sin enfriamiento. Esta disposición se utiliza para mantener el concentrado de células refrigerado, pero también en movimiento, para minimizar la sedimentación de las células. Antes de llenar los viales se coloca una etiqueta y, después de llenarlos, se enrosca la tapa a mano.
El llenado se realizó en un banco LAF en una sala estéril.
Congelación
La congelación y el almacenamiento se realizan a -80 0C. Los productos a -80° se congelan en primer lugar a -40° y a continuación, después de 1 -4 días, se transfieren a -80 0C.
Análisis
Todos los análisis para Lactobacillus reuteri se realizan en agar MRS-cisteína. Las muestras se colocan en placas sobre el agar y se incuban anaeróbicamente durante dos días a 37 0C.
Las muestras congeladas se descongelan y se disuelven en caldo MRS y las diluciones en serie se realizan con NaCl al 0,9 %. En toda la prueba de estabilidad, el análisis de inicio se realiza después de 3-5 días después de la congelación.
Resumen
• La concentración por vial es demasiado baja pero se puede aumentar usando fermentadores más grandes, puesto que el factor de concentración está limitado por el tamaño del filtro.
• El nivel higiénico es bueno para los viales producidos, pero BGF puede no analizar todos los contaminantes que están en la especificación.
• Existen grandes variaciones en la concentración con el tiempo debido probablemente a la sedimentación de las células durante el llenado.
• La estabilidad a -80 0C varía en el orden de 60-124 % después de 45 días y 63-160 % después de 90 días.
• Hay indicios de que la estabilidad se ve afectada negativamente por el almacenamiento del concentrado de bacterias durante la noche a 8 0C antes de llenar los viales.
• Hay indicios de que la cepa de pollo tiene una menor estabilidad que la cepa de pavo.
• Se puede realizar una producción máxima de aproximadamente 1.250 viales por mes sin invertir en fermentadores de laboratorio nuevos. Para volúmenes de producción mayores también se debe comprar un equipo de llenado.
• Los viales congelados se deben almacenar a -80 0C.
Ejemplo 2 Eclosabilidad
Se perforan asépticamente huevos de pollos por encima de la célula de aire con una aguja, de forma preferente aproximadamente 2 días antes de la eclosión. Con una jeringa y una aguja, se inyecta en la célula de aire 100 ul de una suspensión mixta 50/50 de Lactobacillus reuteri, cepa T-I (aislada de pavos) o cepa 11284 (aislada de pollos) diluida en diluyente de vacuna para la vacuna de la enfermedad de Marek de Merial Inc, (Gainswille, GA, EE. UU.), que contenía aproximadamente 105, 107 o 108 células en total de las cepas.
La Tabla 1 muestra el efecto sobre la eclosabilidad con niveles variables de inoculación de Lactobacillus. Los datos presentados en la Tabla 1 para los pollos muestran que los cultivos puros de Lactobacillus reuteri se pueden introducir satisfactoriamente en huevos de aves de corral viables sin afectar negativamente a la eclosabilidad de los huevos.
Tabla 1
TRATAMIENTO % DE EMBRIONES VIVOS A LA ECLOSION / % DE SUPERVIVIENTES EN EL DIA 7 Embriones sin tratar 94/80
Inyectados con fosfato (control) 93/81
L. reuteri inyectado en célula de aire, 105 UFC 98/88
L. reuteri inyectado en célula de aire, 107 UFC 100/95
L. reuteri inyectado en célula de aire, 108 UFC 94/83
Este método en el huevo sirve como un nuevo medio para introducir microorganismos beneficiosos definidos, tales como una cepa pura de Lactobacillus reuteri, en el tracto gastrointestinal de aves de corral en una etapa temprana. El pollo embrionario o pavipollo se sumerge en líquido amniótico que está en contacto con el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, el microorganismo inoculado en el huevo puede llegar a establecerse en el tracto gastrointestinal del ave.
Ejemplo 3 Ensayo de campo
Administración de Lactobacillus reuteri industrial mediante inyección en el huevo: Colonización en la eclosión.
Lactobacillus reuteri se usa como probiótico en seres humanos y animales. Se ha demostrado que la colonización temprana mejora la eficacia de este probiótico. Las publicaciones anteriores de estudios han demostrado que la administración de L. reuteri en el huevo es segura y da como resultado una buena colonización. El potencial de colonización temprana mediante inyección en el huevo se ha demostrado en pollos y pavipollos. La administración de L. reuteri en el huevo aumenta su velocidad de colonización intestinal y disminuye la colonización de Salmonella y Escherichia Coli tanto en pollos como en pavipollos. La administración en el huevo de probióticos con actividad de exclusión competitiva es muy relevante porque existe un movimiento mundial para reducir los antibióticos en aves de corral debido al aumento de la resistencia microbiana a los antibióticos. Los presentes inventores publican los resultados de tres ensayos de administración de L. reuteri en el huevo a embriones de pollo utilizando el sistema “ Inovoject” (Embrex, Durham, NC, EE. UU.).
Objetivo: El objetivo de este estudio era determinar la administración de L. reuteri en el huevo a escala comercial en presencia y ausencia de gentamicina. Se usaron equipos modernos para la inyección en el huevo y la producción de L. reuteri con tecnología del estado de la técnica requeridos para el estudio.
Procedimientos: La raza utilizada en todos los ensayos fue Cobb/Cobb. Se colocaron pollos en alojamientos que contenían aproximadamente 21.000 aves cada uno.
Se suspendió inóculo celular concentrado producido asépticamente para la aplicación en el huevo en diluyente de vacuna para la enfermedad de Marek y la mezcla se congeló a -70 °C, o menor temperatura, hasta su uso. La preparación concentrada/inóculo se añadió a diluyente de vacuna para la enfermedad de Marek adicional. La dilución se realizó de manera de suministrar las unidades formadoras de colonias (UFC) deseables de L. reuteri en 50 pl de volumen. Este volumen se inyectó en cada huevo embrionado en la transferencia de las preincubadoras a las eclosionadoras por medio de la tecnología “ inovoject” . Dependiendo del objetivo del estudio, se suspendieron niveles diferentes de L. reuteri (de 1E+6 a 5E+6) en los 50 pl. La colonización se evaluó en la eclosión y en algunas ocasiones 4, 7 días después de la eclosión. En cada fecha de muestreo se muestrearon pollos y se extirpó el ciego asépticamente, se congeló y se almacenó a -70 °C hasta su análisis. También se registró la mortalidad en una semana como indicador del rendimiento.
Se realizaron tres ensayos como parte del estudio:
(i) Se incluyeron cinco tratamientos en este ensayo: 1 control negativo y 4 niveles de L. reuteri, 5E+5, 1E+6, 2E+6 y 5E+6 UFC por huevo embrionado. Se incluyó gentamicina en la preparación de vacuna. Se inyectaron veintiocho mil huevos con cada nivel de L. reuteri y se colocaron 20.500 aves de cada tratamiento en alojamientos separados.
(ii) Se incluyeron cuatro tratamientos en este ensayo: 1 control negativo y 3 niveles de L. reuteri, 2E+6, 5E+6 y 7E+6 UFC por huevo embrionado. No se incluyó gentamicina en la preparación de vacuna. Se inyectaron veintiocho mil huevos con cada nivel de L. reuteri y se colocaron 20.500 aves de cada tratamiento en alojamientos separados.
(iii) Se incluyeron dos tratamientos: 1- control negativo y 2- producto (mezcla de L. reuteri a 2E+6 UFC por huevo embrionado). No se incluyó gentamicina en la preparación de vacuna. Se inyectaron 150.000 en cada grupo de tratamiento. Se colocaron veintiún mil aves por alojamiento de pollo. Se asignaron siete alojamientos a cada grupo de tratamiento.
Resultados:
Ensayo (i). El día de la eclosión no se detectó colonización mediante siembra en placa directa en cualquiera de los niveles de tratamiento con L. reuteri. Sin embargo, tras el enriquecimiento, se detectó L. reuteri al nivel 2E+6 y en los niveles 2E+6 y 5E+6 a los 3 días de edad. El efecto de destrucción de la gentamicina se demostró durante el tiempo de retención en la preparación de vacuna. Ensayo (ii). Se descubrió que la colonización en la eclosión era dependiente de la dosis: El porcentaje de aves colonizadas con L. reuteri fue 0, 93, 73 y 33 (p<0,05, control frente a tratamientos); y el número promedio de L. reuteri encontrado en el ciego fue de 1,1, 4,1, 3,8, y 3,0 Log10 UFC (p<0,01) para el control negativo, dosis de 2E+6, 5E+6 y 7E+6 UFC por huevo embrionado, respectivamente. La mortalidad a los siete días fue del 1,8 %, 0,75 %, 0,76 % y 1,15 % para los mismos grupos de tratamiento.
Ensayo (iii). Los resultados en la eclosión, expresados como promedio de los 7 alojamientos para los grupos de control y de producto son: 0 frente a 82 % de aves colonizadas (p<0,05) y 0,18 frente a 4,3 ± 1,1 Log10 UFC/ciego (p<0,01). La mortalidad a los siete días fue de 1,55 frente a 1,36 %, respectivamente
Conclusiones. Los hallazgos indican que:
• La inyección en el huevo de Lactobacillus reuteri produce una buena colonización medida como porcentaje de pollitos colonizados en la eclosión y número de L. reuteri por ciego.
• Por lo tanto, la colonización con L. reuteri a través de inyección en el huevo es eficaz y dependiente de la dosis. Se determina que la dosis óptima es de 2E+6 UFC/huevo embrionado.
• Se encontró que el sistema “ inovojet” era eficaz para la coinyección de diluyente de vacuna para la enfermedad de Marek y L. reuteri cuando el probiótico estaba congelado en diluyente de vacuna.
• La gentamicina afecta negativamente a la colonización de L. reuteri a través de inyección en el huevo. • La administración de L. reuteri en el huevo y la posterior colonización disminuyen la mortalidad a una semana, por lo tanto, es posible evitar el uso de gentamicina.
Ejemplo 4 Compatibilidad de vacuna utilizando el probiótico producido como en la invención de la presente
El objetivo de este estudio es investigar el efecto de añadir una composición probiótica, que comprende cepa T-I (aislada de pavos) y cepa 11284 (aislada de pollos) de Lactobacillus reuteri diluida en diluyente de vacuna para la enfermedad de Marek de Merial Inc., (Gainswille, GA, EE. UU.), a vacunas comúnmente utilizadas para aves de corral (HVT y SB-1, ambas utilizadas para el tratamiento de la enfermedad de Marek). Como control se utiliza la misma composición probiótica que se diluye en agua (agua estéril) antes de congelar en lugar de diluirla en diluyente de vacuna.
Procedimiento:
• Dilución de tres viales de vacuna (cepas HVT y SB-1) (2.000 dosis cada uno: 6.000 dosis en total) en tres bolsas de diluyente (400 ml cada una: 1200 ml en total). La vacuna y el diluyente son proporcionados por Merial (N. ° de serie DM798 fecha de caducidad abril de 2016)
• 400 ml de la vacuna reconstituida permanece como tal y 400 ml se mezclan con un vial de probiótico, en un caso de acuerdo con la invención en la presente, y 400 ml se mezclan con el probiótico de control.
• Se realizan ensayos en placa para titulaciones por triplicado. Cada titulación tiene cuatro diluciones en serie con factor de dilución 10.
• Se realizan titulaciones en el momento 0 (tan pronto como la vacuna se reconstituye) y 1 hora después de su reconstitución
• La viabilidad celular se evalúa 1 h y 2 h después de reconstituir la vacuna
• Las placas de HVT se cuentan 3 días después de la inoculación
• Las placas de SB-1 se cuentan 5 días después de la inoculación
Resultados:
Viabilidad celular (%)
Titulación de HVT
Titulación de SB-1
Conclusión:
La composición probiótica no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular cuando se usa el diluyente de vacuna. Por el contrario, cuando se usa agua como diluyente (probiótico de control), se observa una menor viabilidad celular. La adición del probiótico diluido en el diluyente de vacuna (HVT prob o SB-1 prob) no tiene efecto sobre los títulos de HVT en los momentos 0 y los momentos 1 o sobre los títulos de SB-1 en el momento 0. Sin embargo, la adición del probiótico diluido en el diluyente de vacuna reduce los títulos de SB-1 cuando los títulos se miden 1 hora después de la reconstitución. Estos resultados muestran que el agua es significativamente menos compatible con la vacuna que el diluyente de vacuna o, en otras palabras, que el agua como diluyente tiene un efecto negativo sobre la viabilidad celular y el título en comparación con el uso de diluyente de vacuna. En este experimento, incluso una pequeña cantidad de agua (un vial de 1 ml de probiótico diluido en agua añadida a un volumen total de 400 ml de diluyente de vacuna) tuvo un efecto negativo sobre la viabilidad celular y el título de la vacuna. El efecto negativo del agua también se observa inmediatamente (es decir, 0 h después de la reconstitución), lo que significa que dicho efecto es rápido, así como negativo en comparación con los resultados en los que se usa un diluyente de vacuna. Sin embargo, idealmente, para los mejores resultados, la administración en el huevo del probiótico en diluyente de vacuna debería realizarse tan pronto como sea posible después de haber mezclado el probiótico con la vacuna reconstituida.
Claims (8)
1. Una cepa de bacterias probióticas Lactobacillus reuteri y una vacuna de aves de corral para su uso en la vacunación en el huevo de aves de corral, en donde dicha cepa y dicha vacuna se administran juntas a un huevo de ave de corral embrionado, en forma de una preparación combinada;
en donde dicha vacuna es para la enfermedad de Marek; y
en donde dicha vacuna comprende una cepa de virus del herpes de pavo o una cepa de virus del herpes de pollo, o una combinación de las mismas.
2. La cepa y vacuna para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho uso además da como resultado niveles reducidos de patógenos enterobacterianos en las aves de corral, colonización de las aves de corral con dichas bacterias probióticas, eclosabilidad de las aves de corral aumentada o mortalidad de las aves de corral reducida, preferentemente en donde los niveles de Salmonella o E. coli se reducen.
3. La cepa y vacuna para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho uso no implica la administración de un antibiótico.
4. La cepa y vacuna para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha cepa es la cepa T-1 de Lactobacillus reuteri definida por el número de depósito ATCC 55149,
o la cepa 11284 de Lactobacillus reuteri definida por el número de depósito 55148,
o una combinación de las mismas.
5. La cepa y vacuna para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha cepa de virus del herpes del pavo es la cepa FC-126 y/o en donde dicha cepa de virus del herpes del pollo es la cepa SB-1.
6. La cepa y vacuna para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde hay presente un diluyente de vacuna producido comercialmente.
7. La cepa y vacuna para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde hay presente un diluyente de vacuna que comprende uno o más de los componentes seleccionados del grupo que consiste en sacarosa, fosfato de potasio dibásico y fosfato de potasio monobásico, preferentemente en donde dicho diluyente de vacuna comprende todos estos componentes.
8. La cepa y vacuna para el uso de la reivindicación 7, en donde dicho diluyente de vacuna comprende adicionalmente rojo fenol y/o en donde dicho diluyente de vacuna tiene un pH de 6,9 a 7,3.
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