IT202100016055A1 - Composizione comprendente estratto secco di contenuto intestinale di polli adulti liofilizzato, relativo uso come integratore alimentare e relativo uso per stimolare il sistema immunitario - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: ?COMPOSIZIONE COMPRENDENTE ESTRATTO SECCO DI CONTENUTO INTESTINALE DI POLLI ADULTI LIOFILIZZATO, RELATIVO USO COME INTEGRATORE ALIMENTARE E RELATIVO USO PER STIMOLARE IL SISTEMA IMMUNITARIO?
La presente invenzione si riferisce a una composizione comprendente estratto secco di contenuto intestinale di polli adulti liofilizzato mediante tecnica spray e tindalizzato in modalit? a blocchi, al relativo uso come integratore alimentare e al relativo uso come stimolatore del sistema immunitario, in particolare per polli.
Stato dell?arte
L?utilizzo di dosi sub-terapeutiche di antibiotici nell?alimentazione animale ? stata pratica molto diffusa negli ultimi decenni. Nell?industria avicola ne ? stato fatto uso prevalentemente a scopo auxinico, cio? con la finalit? di favorire l?incremento ponderale degli animali. Tuttavia, si sono fatte strada preoccupazioni sulle conseguenze di questo utilizzo eccessivo soprattutto riguardo il tema dell?antibiotico-resistenza. Il pericolo derivante dall?acquisizione della resistenza agli antibiotici dei microrganismi ? rivolto non solo alla salute animale, ma soprattutto a quella umana, in quanto ? reale la possibilit? del trasferimento dei geni della resistenza antibiotica anche ai microrganismi patogeni per l?uomo. La progressiva riduzione dell?utilizzo degli antimicrobici in ambito zootecnico ha portato alla necessit? di cercare delle sostanze alternative per il controllo e la prevenzione delle patologie. Da qui deriva l?interesse per il ruolo del microbiota intestinale, di cui diversi studi hanno dimostrato la capacit? interattiva con il proprio ospite, influenzandone la morfologia e la fisiologia intestinale, nonch? stimolandone attivamente il sistema immunitario. Per questa ragione si ? pensato di agire dall?esterno per cercare di modulare in varie maniere il microbiota intestinale ed ottenere degli effetti benefici desiderati (Pan e Yu, 2014). Una strada che si ? rivelata promettente ? stata quella dei ?biotici? (prebiotici, probiotici, sinbiotici, postbiotici e para-probiotici) che sono stati studiati proprio per la capacit? di modulare il microbiota intestinale e conseguentemente influire sullo sviluppo, la fisiologia e la risposta immunologica dell?apparato gastroenterico. Tutti i ?biotici? agiscono riuscendo ad incrementare, anche potenzialmente, la resistenza dell?ospite nei confronti delle infezioni grazie alla loro interazione con la parete intestinale ed i tessuti linfoidi che costituiscono il GALT.
I probiotici vengono definiti dalla FAO e dall?OMS come ?micro-organismi vivi che, somministrati in quantit? adeguata, apportano un beneficio alla salute dell'ospite?. Sono presenti in bibliografia moltissimi studi che descrivono gli effetti benefici derivanti dall?utilizzo di probiotici in ambito avicolo, prevalentemente in aggiunta a cibo o acqua di bevanda. ? stato descritto come la somministrazione di probiotici garantisca un migliore utilizzo dei nutrienti ed incremento delle performance di crescita degli animali
. Inoltre, l?utilizzo dei probiotici permette di avere una colonizzazione intestinale con batteri non patogeni specifici e ottenere una protezione nei confronti dei patogeni (De Oliveira, 2014). In questo senso diversi studi hanno dimostrato, a seguito della somministrazione probiotica, una incrementata resistenza nei confronti di patogeni batterici, virali e protozoari quali ad esempio Salmonella spp., Clostridium spp., Eimeria spp.
Altro elemento fondamentale a favore dell?utilizzo di probiotici quali modulatori del microbiota intestinale ? l?influenza sul sistema immunitario sia nella componente innata che acquisita
I probiotici, insieme ai prebiotici, sono certamente tra le sostanze pi? studiate quali alternative agli antibiotici. Tuttavia, pi? recentemente, l?interesse si ? focalizzato proprio sull?utilizzo di altre componenti correlate ai probiotici. I termini paraprobiotici e postbiotici, sono emersi dall?idea che la vitalit? dei batteri non sia un elemento essenziale per ottenere degli effetti benefici . Il termine paraprobiotici ? stato proposto da Taverniti e Guglielmetti (2011) e si riferisce a cellule microbiche non vitali, intatte o lisate, che quando somministrate in quantit? sufficiente conferiscano effetti benefici al consumatore . Parlando di postbiotici si intendono invece i fattori solubili secreti dai batteri vivi o rilasciati dopo la lisi batterica e tra questi: acidi grassi a catena corta, enzimi, peptidi, endo ed eso polisaccaridi, proteine di superficie delle cellule, vitamine ed acidi organici e frammenti dei microrganismi stessi
Pur essendo dimostrati gli effetti benefici dei probiotici, il razionale dell?utilizzo di microrganismi non vitali deriva dall?idea che possano esserci maggiori vantaggi dal punto di vista della sicurezza riducendo rischio di infezioni sistemiche, eccessiva risposta infiammatoria locale, acquisizione di geni di resistenza antibiotica, dimostrate per alcuni probiotici
. Bench? ci sia sempre un maggiore interesse relativo l?utilizzo di para e post biotici, la letteratura in merito ? meno vasta, soprattutto per quanto riguarda lo specifico utilizzo in ambito zootecnico-avicolo. L?utilizzo di batteri inattivati dal calore ha dimostrato avere effetti immunomodulatori, antinfiammatori ed antimicrobici
Per quanto riguarda i postbiotici negli ultimi anni sono stati realizzati alcuni studi riguardanti gli effetti della somministrazione sul pollo. Questi ne hanno dimostrato il ruolo immunomodulatore e di difesa nei confronti di alcuni patogeni come il Clostridium perfringens o E. coli
ma anche di miglioramento delle performance produttive
modulazione della morfologia intestinale e risposta immunitaria in polli sottoposti a stress da temperatura Esistono diverse modalit? per ottenere l?inattivazione dei probiotici o per ottenere le componenti postbiotiche. I meccanismi principali riguardano l?inattivazione fisica (distruzione meccanica, trattamento con calore, raggi gamma o UV, congelamento, sonicazione) o quella chimica (disattivazione acida).
Tutti questi composti, sia che si parli di probiotici che di prebiotici o postbiotici, vengono tradizionalmente somministrati in acqua o cibo di bevanda dopo l?accasamento del pulcino. Questo porta tuttavia ad avere un margine di azione ridotto sulla prevenzione delle patologie del pollo e sulla capacit? di modulazione del microbiota intestinale. Infatti, in condizioni commerciali, l?ambiente dell?incubatoio rappresenta il primo fattore di rischio per la possibilit? di sviluppo di infezioni nel pulcino. A questo si aggiungono lassi di tempo pi? o meno lunghi che intercorrono tra il momento della schiusa e l?accasamento, causanti ingente stress nell?animale appena nato, anch?esso favorente lo sviluppo di infezioni causate da patogeni ?di campo? o ambientali presenti al momento dell?accasamento. Inoltre ? importante sottolineare come gli ultimi giorni prima della schiusa (dal 18?), ed i primi giorni successivi, rappresentino il periodo di transizione dalla nutrizione ovo dipendente all?inizio dell?alimentazione spontanea tramite l?assunzione del mangime somministrato in allevamento. Questi giorni sono per il pulcino i pi? critici per la sopravvivenza, infatti gli uccelli nascono con un apparato gastroenterico immaturo e subito dopo la nascita avvengono rapidi cambiamenti morfologici, biochimici e cellulari che permettono l?assorbimento dei nutrienti ingeriti. Nella prevenzione di queste problematiche nasce l?idea di utilizzare la tecnica in ovo. La somministrazione in ovo di probiotici, postbiotici o prebiotici ha lo scopo di permettere lo stabilirsi di un microbiota intestinale sano ed equilibrato ancora prima della nascita, fattore fondamentale nel favorire il corretto completamento dello sviluppo dell?apparato gastroenterico, oltre che nell?attuare una difesa nei confronti dei patogeni prima del contatto con gli stessi presenti nell?ambiente al momento dell?accasamento.
La tecnica in ovo nasce in origine per la somministrazione del vaccino per la malattia di Marek. Sharma e Burmester (1982) furono i primi a comprendere che la somministrazione del vaccino per la malattia di Marek in ovo potesse essere effettivamente utilizzata nel pollo per ottenere una immunit? precoce ed efficace nei confronti della malattia. Ancora oggi questa vaccinazione viene somministrata in ovo al 18? giorno di incubazione, utilizzando sistemi automatizzati di iniezione. Una ricca bibliografia si ? sviluppata intorno alla valutazione della possibilit? di somministrare probiotici in ovo. I primi studi risalgono agli anni ?90 con il lavoro realizzato da Cox et al. (1992), capostipite dell?argomento, ne seguono molti altri che differiscono per et?, sedi di somministrazione e miscele probiotiche utilizzate
In generale questi studi hanno ulteriormente accreditato gli effetti benefici derivanti dall?utilizzo di probiotici, osservando che questa modalit? di somministrazione ? realmente utilizzabile in quanto non si registra influenza sulla percentuale di schiusa dei pulcini. Sebbene la bibliografia riguardante la somministrazione di probiotici in ovo sia piuttosto vasta, non ci sono informazioni relative alla somministrazione di sostanze come paraprobiotici o postbiotici, n? tanto meno di un microbiota vero e proprio come proponiamo di fare con la presente invenzione. Da un punto di vista pratico l?unica via per rendere applicabile nell?industria avicola l?utilizzo della tecnica in ovo per la somministrazione della composizione secondo l?invenzione, sarebbe l?associazione con la vaccinazione per la malattia di Marek poich? risulterebbe poco pratico, oltre che dannoso, realizzare due somministrazioni separate.
La Malattia di Marek ? una patologia a carattere linfoproliferativo che colpisce il pollo sostenuta da un alphaherpesvirus, caratterizzata da presenza di infiltrati cellulari mononucleari di tipo linfocitario localizzati in vari tessuti e organi tra cui i nervi periferici, l?iride, i muscoli e la cute Questa patologia che si manifesta con lo sviluppo di linfomi, sintomatologia neurologica ed immunosoppressione, ? stata causa di gravi perdite economiche per l?industria del settore avicolo, che si sono notevolmente ridotte grazie allo sviluppo, nel 1969, della vaccinazione che ancora oggi viene comunemente somministrata in ovo, all?interno del liquido amniotico, al 18? giorno di incubazione
La vaccinazione per la malattia di Marek continua ad essere somministrata in ovo poich? ? stato dimostrato che questa ? la modalit? che fornisce la miglior protezione se paragonata all?iniezione sottocutanea alla nascita dello stesso vaccino
Nel caso della vaccinazione per la malattia di Marek, la scelta di effettuare la somministrazione in amnios al 18? giorno di incubazione, deriva anche dalla dimostrazione che proprio l?amnios sia risultata la sede pi? efficace di somministrazione in confronto con le altre
In linea generale, qualsiasi vaccino si utilizzi, la possibilit? di somministrare sostanze, quali probiotici, miscelate nel diluente del vaccino, va valutata in base al tipo di sostanze utilizzate, ma soprattutto ai dosaggi.
La procedura di somministrazione di sostanze in ovo pu? essere effettuata in diverse sedi e a differenti et? (es. corpo embrionale, amnios, camera d?aria), tuttavia la metodica pi? utilizzata ? quella brevettata da , (2003), che detta le modalit? per l?esecuzione della somministrazione in ovo di diverse sostanze in cavit? amniotica. ? noto che il pulcino nella fase di schiusa, prima del pipping esterno, degluitisca il residuo del contenuto liquido amniotico e quindi le sostanze in esso contenuto entrino direttamente a contatto con l?apparato gastro enterico e respiratorio del pulcino medesimo. La possibilit? di attuare la somministrazione di sostanze diverse, quali probiotici, postbiotici o prebiotici, mescolandoli al diluente per il vaccino, minimizza le perdite che si avrebbero effettuando una doppia somministrazione, rischiando il danneggiamento accidentale degli embrioni o la contaminazione con microrganismi presenti nell?ambiente di incubatoio.
Allo stato dell?arte attuale solo due studi hanno coniugato la somministrazione di probiotici con la vaccinazione per la malattia di Marek, con risultati positivi La schiusa di pulcini con un microbiota intestinale gi? pre-colonizzato e con un pH modificato (tendenzialmente pi? acido per l?effetto sia della flora lattica, ma anche per la grande presenza di acidi grassi volatili a corta catena) li rende maggiormente resistenti alle infezioni di campo e soprattutto alla colonizzazione protozoaria, problematica prevalente nell?industria avicola. In pi? si favorisce un corretto sviluppo dell?apparato gastroenterico che ? alla base della riduzione delle patologie che si sviluppano soprattutto nelle prime settimane di vita, permettendo una diminuzione dell?utilizzo di antibiotici a scopo terapeutico, aspetto fondamentale nell?ottica One Health.
La maturazione precoce dell?apparato gastroenterico permette un migliore utilizzo degli alimenti, un miglior indice di conversione alimentare e quindi una crescita pi? rapida e un peso alla macellazione pi? elevato, a parit? di alimento consumato (maggiore efficienza digestiva dei pulcini pre-colonizzati in ovo).
? pertanto uno scopo della presente invenzione fornire una composizione che stimoli il sistema immunitario del pulcino, che funzioni come probiotico/prebiotico/postbiotico, e che permetta di fornire al pulcino un vero e proprio microbiota intestinale completo ed equilibrato.
Questo scopo ? raggiunto dalla presente invenzione mediante una composizione come definito nella rivendicazione 1.
Definizioni
Per ?liofilizzato mediante tecnica spray? e simili si intende trattato secondo il processo di liofilizzazione descritto nella domanda di brevetto italiana N.
102021000002000.
Per ?tindalizzato in modalit? a blocchi? e simili si intende trattato secondo il processo di tindalizzazione descritto nella domanda di brevetto italiana N.
102021000002000.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Secondo la presente invenzione viene fornita una composizione comprendente estratto secco di contenuto intestinale di polli adulti liofilizzato mediante tecnica spray e tindalizzato in modalit? a blocchi.
I polli donatori del contenuto intestinale sono polli adulti, sani, allevati senza l?utilizzo di antibiotici. Il contenuto intestinale utilizzato per la produzione dell?estratto secco ? ottenuto da spremitura dell?intero tratto intestinale, esclusa la cloaca. Il pacchetto intestinale viene prelevato in fase di macellazione.
La liofilizzazione e la tindalizzazione in modalit? blocchi sono descritte nel dettaglio nella domanda di brevetto italiana N. 102021000002000.
La tindalizzazione avviene preferibilmente riscaldando ad una temperatura compresa tra 70-100?C e per un tempo compreso tra 15 e 30 minuti, seguito da incubazione a temperatura ambiente per un periodo di circa 24 ore, ripetuto due o tre volte. Pi? preferibilmente, la tindalizzazione include tre fasi di riscaldamento a 70?C per un massimo di 30 minuti, intervallate da un periodo di incubazione di circa 24 ore.
La liofilizzazione mediante tecnica spray avviene preferibilmente in quattro fasi successive in cui il prodotto liquido di partenza viene atomizzato in una forma spray, quindi le goccioline generate dallo spray vengono messe a contatto con aria riscaldata per l'evaporazione dell'umidit? e la formazione di particelle solide secche, quindi le particelle solide secche vengono separate dal flusso d'aria e raccolte.
Questo trattamento permette di ottenere un estratto secco, facile da diluire in qualsiasi liquido, compreso il diluente del vaccino per la malattia di Marek. Con questa tecnica si ottiene la disattivazione dei microrganismi presenti nel materiale di partenza, compresi i coccidi, garantendo la sicurezza del composto. Tuttavia la miscela fornir? tutti i principali composti batterici, virali e protozoari presenti nei donatori, a cui si aggiungono una componente postbiotica e prebiotica derivante dai microrganismi stessi, dal contenuto delle cellule lisate e dai prodotti batterici.
La composizione comprende preferibilmente anche almeno una specie batterica viva selezionata dal gruppo costituito da Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus reuteri, e Lactobacillus acidophilus. La percentuale di integrazione nell?estratto secco ? variabile ed ? stabilita in base all?et?, sede e alla via di somministrazione.
Per vaccino per la malattia di Marek si intende qualsiasi vaccino che si utilizzi per la protezione nei confronti del virus nel pollo. Il vaccino in questione potr? essere composto da virus appartenente ad uno dei tre sierotipi MDV-1, MDV-2, MDV-3 (o HVT) singolarmente come vaccino mono-valente, o in combinazione come bi o tri valente. I vaccini possono essere cellulo-associati, come per MDV-1 ed MDV-2, oppure liofilizzati per HVT-3. Nel caso dell?utilizzo di vaccini ricombinanti si considerano vaccini comprendenti HVT associato a virus della Bursite infettiva, della Newcastle, Influenza Aviaria o Laringotracheite Infettiva. Il vaccino deve essere approvato per la somministrazione in ovo.
Per diluente si intende una qualsiasi soluzione utilizzata per la somministrazione del vaccino per la malattia di Marek.
I dosaggi di vaccino utilizzati sono relativi alla tipologia di vaccino, et? di somministrazione, sede di iniezione e specie di riferimento. Si fa riferimento alle indicazioni del produttore.
I dosaggi della miscela proposta dal presente brevetto varieranno anche essi in base all?et? di somministrazione e sede di inoculazione.
La composizione secondo la presente invenzione pu? essere utilizzata per l?integrazione alimentare animale. Come integratore, la composizione viene preferibilmente somministrata nel cibo o nell?acqua di alimentazione dei polli.
La composizione secondo la presente invenzione pu? essere inoltre utilizzata per stimolare il sistema immunitario, con azione probiotica, prebiotica, e/o postbiotica.
Preferibilmente, la specie di destinazione ? il pollo. La composizione ? preferibilmente somministrata in ovo. Ancor pi? preferibilmente all?interno del sacco amniotico.
Ancor pi? preferibilmente, la somministrazione avviene dal 12? al 18? giorno di incubazione dell?uovo. In una forma di realizzazione preferita, la somministrazione avviene il 18? giorno di incubazione, et? di somministrazione della vaccinazione per la malattia di Marek, oltre che momento del trasferimento delle uova dai carrelli di incubazione a quelli di schiusa. E? inoltre assodato che dal 18? giorno in poi l?embrione di pollo inizia da avere un proprio sistema immunitario funzionante, capace di distinguere gli antigeni ?self? dai ?not self?.
Preferibilmente la somministrazione in ovo avviene in camera d?aria o in amnios.
La composizione ? somministrata preferibilmente in combinazione con il vaccino per la malattia di Marek. La sede ? preferibilmente l?amnios nel caso della somministrazione della composizione secondo la presente invenzione in concomitanza al vaccino per la malattia di Marek, per poter effettuare un?unica iniezione.
La modalit? di somministrazione include qualsiasi mezzo automatizzato o manuale. In entrambe le modalit? si prevede che l?uovo venga temporaneamente prelevato dalla macchina incubatrice. A seguito dell?operazione di speratura si individua la posizione della camera d?aria, normalmente localizzata a livello del polo ottuso dell?uovo. Si effettua opportuna disinfezione della superficie del guscio con alcool. Si realizza un foro guida attraverso il quale si procede poi all?inserimento dell?ago che permetter? di depositare il composto della presente invenzione a livello della camera d?aria direttamente oppure, previo passaggio attraverso la membrana testacea, in amnios. Questa tecnica pu? essere utilizzata indifferentemente per qualsiasi dosaggio della miscela proposta.
La presente invenzione propone una innovazione fondamentale dal punto di vista della composizione creata per la somministrazione in ovo. Lo scopo ? quello di ottenere con una unica iniezione in ovo, e precisamente a livello del sacco amniotico dell?embrione, l?immunizzazione precoce contro la malattia di Marek e contemporaneamente una immunostimolazione che va A) ad incrementare la riposta vaccinale; B) a maturare in maniera completa ed efficace il sistema linfoide gastroenterico del pollo o GALT; C) a integrare tutta la serie di metaboliti batterici (acidi grassi volatili a corta catena; amminoacidi e nucleosidi di derivazione batterica; vitamine del gruppo B e peptidi batterici ad azione immunomodulante) che normalmente sono prodotti dal microbiota intestinale maturo; D) ad integrare tutta la serie di antigeni derivanti dalle oocisti protozoarie inattivate che vanno a immunizzare il pulcino riducendo la successiva colonizzazione coccidica.
Esempi
Esempio 1
I due esperimenti descritti in seguito sono stati realizzati per verificare la sicurezza e l?efficacia della somministrazione in ovo delle due componenti della miscela proposta dal presente brevetto, iniettate singolarmente. Un primo esperimento ha previsto la somministrazione in ovo di tre differenti dosaggi della miscela probiotica viva. Un secondo esperimento, strutturato come il precedente, ? stato realizzato per verificare la sicurezza della somministrazione in ovo di tre concentrazioni di estratto secco. ? stata presa in considerazione la percentuale di schiusa a seguito della somministrazione per verificare l?eventuale influenza delle tecnica, o del dosaggio, sulla capacit? di schiusa degli animali. Nell?esperimento due si ? andati anche a controllare il peso dei soggetti inoculati alla macellazione, la carica coccidica finale, ed alcuni parametri morfologici dell?apparato gastrointestinale (altezza dei villi, profondit? delle cripte e area del tessuto linfoide o GALT nonch? della Borsa di Fabrizio) dei polli derivanti dai pulcini inoculati in amnios con la miscela oggetto d?invenzione, comparandoli con polli derivanti da pulcini non inoculati (gruppo di controllo). I risultati ottenuti permettono di affermare che tutti i dosaggi dell?estratto secco sono risultati sicuri in quanto non si ? verificata influenza sulla percentuale di schiusa. I dosaggi di miscela probiotica viva risultano sicuri a partire da una concentrazione di 1x10^5 UFC. I parametri alla macellazione indicano che i polli derivanti da pulcini inoculati in amnios con la miscela oggetto d?invenzione mostrano un Peso Vivo (PV) statisticamente superiore a quello dei controlli, cos? come risultano statisticamente significative le differenze dei parametri morfologici (Lunghezza villi, profondit? cripte, area di sviluppo del tessuto linfoide GALT) molto pi? sviluppati nei pulcini inoculati in amnios. Infine i polli derivanti da pulcini inoculati con la miscela, mostrano una carica coccidica (n? oocisti di coccidi per grammo di feci ? calcolate con metodo Flotac?) statisticamente molto pi? bassa rispetto ai polli controllo vaccinati dopo la nascita con vaccino anticoccidico Paracox?.
Esperimento 1:
Questo esempio descrive la somministrazione in ovo, nel liquido amniotico, della miscela probiotica composta da ceppi di: Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus.
Uova da cova di Ross 308 sono state incubate all?interno dell?incubatrice Fiem modello MG 100/150 (Como). Al diciottesimo giorno di incubazione 100 uova fertili di Ross-308 sono state divise in quattro gruppi, P1- P2- P3- C composti da 25 uova ciascuno.
Al gruppo P1 sono stati somministrati 0,05 ml di soluzione fisiologica contenenti 1 x 10^6 UFC di batteri probiotici vivi.
Al gruppo P2 sono stati somministrati 0,05 ml di soluzione fisiologica contenenti 1x10^5 UFC di batteri probiotici vivi.
Al gruppo P3 sono stati somministrati 0,05 ml di soluzione fisiologica contenenti 1x10^4 UFC di batteri probiotici vivi.
Al gruppo C sono stati somministrati solamente 0,05 ml di soluzione, senza alcuna aggiunta probiotica.
La somministrazione ? stata realizzata iniettando manualmente il composto nel liquido amniotico.
La percentuale di schiusa risulta lievemente ridotta in P1 per la maggiore concentrazione di batteri probiotici vivi. Non si osserva riduzione della schiudibilit? in P2, P3 e C fattore che porta a considerare la concentrazione di P2 pari ad 1x10^5 UFC di batteri probiotici vivi, sicura ed efficace Esperimento 2:
Questo secondo esperimento, strutturato come il precedente, ? volto a verificare gli effetti della somministrazione dell?estratto secco ottenuto dal contenuto intestinale di polli sani antibiotic-free, liofilizzato con tecnica spray e successivamente tindalizzato secondo la metodica domanda di brevetto italiana N. 102021000002000.
Uova da cova di Ross 308 sono state incubate all?interno dell?incubatrice Fiem modello MG 100/150 (Como). Al diciottesimo giorno di incubazione 100 uova fertili di Ross 308 sono state divise in quattro gruppi, tre gruppi E1- E2-E3- C, composti da 25 uova ciascuno.
Al gruppo E1 sono stati somministrati 0,05 ml di soluzione fisiologica contenenti 850 UFC di estratto secco.
Al gruppo E2 sono stati somministrati 0,05 ml di soluzione fisiologica contenenti 85 UFC di estratto secco.
Al gruppo E3 sono stati somministrati 0,05 ml di soluzione fisiologica contenenti 8,5 UFC di estratto secco.
Al gruppo C sono stati somministrati solamente 0,05 ml di soluzione, senza alcuna aggiunta probiotica.
La somministrazione ? stata realizzata iniettando manualmente il composto nel liquido amniotico.
Non si osserva riduzione della percentuale di schiusa. Esempio 2
In questo esempio si descrivono gli effetti della somministrazione in ovo di un vaccino per la malattia di Marek, suo diluente e differenti concentrazioni della miscela proposta dal presente brevetto.
Al diciottesimo giorno di incubazione 100 uova fertili di Ross 308 sono state suddivise in 5 gruppi.
Un primo gruppo N, composto da 10 uova, non ? stato sottoposto ad alcuna procedura di somministrazione.
Ad un secondo gruppo V, composto da 10 uova, ? stato somministrazione solo vaccino in quantit? di 0,05ml, opportunamente miscelato nel suo diluente.
Alle uova dei quattro gruppi dalla A alla D, composti rispettivamente da 20 uova, sono stati somministrati in amnios 0,05 ml della miscela comprendente il vaccino miscelato con il suo diluente, 1 x 10^5 di batteri probiotici vivi (? stata somministrata una miscela di Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus contenente un totale di 200 miliardi di batteri lattici per 1.5 grammi di prodotto) e rispettivamente 850, 85, 8.5 e 0.85 UFC derivanti dall?estratto secco.
L?estratto secco del contenuto intestinale derivato da polli sani antibiotic-free ? stato ottenuto con il trattamento di liofilizzazione con tecnica spray e tindalizzazione, secondo la metodica della domanda di brevetto italiana N. 102021000002000.
La procedura di somministrazione ? stata eseguita manualmente. Dopo opportuna disinfezione delle uova a livello del polo ottuso, ? stato realizzato un foro guida con l?utilizzo di un ago da 18G all?interno del quale ? stato inserito un ago da 22 G alla profondit? di 2.49 cm. La profondit? di somministrazione ? tale da depositare il contenuto direttamente nel liquido amniotico.
Dopo la somministrazione le uova sono state trasferite nella cassette di schiusa ed hanno regolarmente completato l?incubazione.
In tabella 1 sono indicate le percentuali di schiusa dei differenti gruppi.
Tabella 1
Le uova non schiuse a termine dei 21 giorni di incubazione sono state esaminate per verificare se la mortalit? fosse precoce o successiva alla somministrazione. Solo per gli embrioni del gruppo A e B si registra una mortalit? tardiva, sebbene non siano evidenti lesioni legate alla procedura di somministrazione in ovo.
Successivamente i pulcini sono stati accasati ed allevati in box separati per valutare le performances di crescita degli animali. A 28 giorni di et? sono stati regolarmente macellati per consumo umano. Al momento della macellazione ? avvenuto il prelievo di campioni degli organi per eseguire la valutazione morfologica dei diversi segmenti intestinali e dei principali organi linfoidi.
Dalla valutazione dei dati ottenuti dalle percentuali di schiusa la procedura di somministrazione in ovo della miscela proposta dal presente brevetto insieme al vaccino per la malattia risulta essere sicura poich? non si verifica incidenza sulla percentuale di schiusa se non nel gruppo A. La valutazione dell?efficacia del trattamento ? risultata dall?insieme dei parametri di crescita e morfologici.
Nello specifico il peso dei soggetti trattati ? risultato incrementato rispetto ai controlli (gruppi N e C) per tutta la durata dell?esperimento. (p < 0.05). A livello della morfologia intestinale si osserva un incremento dell?altezza, nonch? dello spessore dei villi intestinali, indice di una maggiore superficie assorbente a seguito del trattamento (p < 0.005). Inoltre risulta anche un aumento funzionale dei principali organi immunitari che conferma l?effetto immuno-stimolante del trattamento (p = 0.012).
Tutti i parametri considerati contribuiscono ad accreditare il trattamento in ovo secondo la presente invenzione, sottolineandone nuovamente l?efficacia ma soprattutto la sicurezza.
Vantaggi
La presente invenzione si propone di utilizzare contemporaneamente pi? di un approccio ?biotico?, ed in particolare di utilizzare l?approccio probiotico/prebiotico/postbiotico. L?estratto secco ottenuto dalla liofilizzazione e tindalizzazione del contenuto intestinale di polli adulti sani, fornisce in forma inattivata tutti i principali ?motivi antigenici? di natura batterica, virale, micotica e protozoaria che l?organismo del pulcino potr? acquisire successivamente alla schiusa, in forma viva e vitale, dall?ambiente in cui vive e dal contatto con le feci dei genitori e dei fratelli. A questo effetto tipicamente postbiotico (ovvero di presentazione alla mucosa intestinale di una miscellanea di antigeni inattivati, ovvero derivanti da microorganismi morti, ma fortemente stimolanti il sistema immunitario gastrointestinale) nella presente invenzione si aggiungono una componente probiotica (costituita da batteri lattici vivi e vitali) ed una componente prebiotica, derivante dai microrganismi stessi, dal contenuto delle cellule lisate e dai prodotti batterici che, insieme ai batteri probiotici vivi costituiscono il ?composto? che, unitamente al metodo di somministrazione, fa parte di questa invenzione. La somministrazione della composizione (liofilizzata/tindalizzata di contenuto intestinale ceppi batterici lattici vivi), permette di fornire al pulcino un vero e proprio microbiota intestinale completo ed equilibrato.
Dichiarazione secondo l?Art. 170bis del codice della propriet? intellettuale italiana
Il materiale biologico di origine animale che sta alla base dell?invenzione descritta nell?allegata domanda proviene dall?Italia ed ? di origine Gallus gallus domesticus.
Claims (10)
1. Composizione comprendente estratto secco di contenuto intestinale di polli adulti liofilizzato mediante tecnica spray e tindalizzato in modalit? a blocchi.
2. Composizione secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre almeno una specie batterica viva selezionata dal gruppo costituito da Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus reuteri, e Lactobacillus acidophilus.
3. Composizione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la tindalizzazione avviene riscaldando ad una temperatura compresa tra 70-100?C e per un tempo compreso tra 15 e 30 minuti, seguito da incubazione a temperatura ambiente per un periodo di circa 24 ore, ripetuto due o tre volte.
4. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la liofilizzazione mediante tecnica spray avviene in quattro fasi successive in cui il prodotto liquido di partenza viene atomizzato in una forma spray, quindi le goccioline generate dallo spray vengono messe a contatto con aria riscaldata per l'evaporazione dell'umidit? e la formazione di particelle solide secche, quindi le particelle solide secche vengono separate dal flusso d'aria e raccolte.
5. Uso della composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per l?integrazione alimentare animale.
6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 per uso per stimolare il sistema immunitario, con azione probiotica, prebiotica, e/o postbiotica.
7. Composizione per uso secondo la rivendicazione 6, in cui la specie di destinazione ? il pollo.
8. Composizione per uso secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui la composizione ? somministrata in ovo.
9. Composizione per uso secondo la rivendicazione 8, in cui la somministrazione avviene dal 12? al 18? giorno di incubazione dell?uovo.
10. Composizione per uso secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui la composizione ? somministrata in combinazione con il vaccino per la malattia di Marek.
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