WO2016018001A1 - 케모카인을 함유하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

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WO2016018001A1
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melanin
itac
interferon
skin
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PCT/KR2015/007721
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이은경
한지연
조은경
이태룡
최현정
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주식회사 아모레퍼시픽
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Definitions

  • the present invention contains a chemokine, in particular an interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant (ITAC) to reduce the gene expression of melanin pigment production-related factors in melanocytes, resulting in skin whitening effect It relates to a composition that can be.
  • ITAC interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant
  • Melanogenic cells are present in the basal epidermis of the skin epidermis, and produce melanin pigments by external factors such as UV to deliver melanin pigments to surrounding keratinocytes, thereby inhibiting DNA damage of the keratinocytes. It plays a role.
  • the activity of these melanin-forming cells is abnormally regulated according to genetic factors, hormones, and various disease factors, leading to excessive pigment production and hyperproliferation beyond normal pigment production, resulting in hyperpigmented disease such as blemishes or surpluses. Or low pigmented diseases such as vitiligo.
  • Activation of excessive melanin forming cells is a state in which homeostasis is broken in the production of melanin pigment due to chronic exposure of external stimuli such as ultraviolet rays.
  • the skin is a finely regulated immune organ that secretes various cytokines, chemokines, and other inflammatory mediators.
  • Ultraviolet rays stimulate the immune cells constituting such skin, such as keratinocytes, macrophages, T cells and the like, to induce the secretion of immune substances.
  • These immune substances not only create a chronic inflammatory state by accumulating immune cells in the microenvironment surrounding melanocytes, but also affect the melanocytes themselves, such as the proliferation, migration and overproduction of melanin pigments.
  • cytokines which are generally known as immune mediators
  • cytokines which have a selective chemotaxis and have the ability to induce cell migration and integration into target organs, are not well known for their role in skin physiology.
  • various immune substances have been studied for the immunomodulatory therapy for controlling hyperpigmentation disease due to hyperactivation of melanin forming cells, but the effect of ITAC, a skin immune cell-derived factor and chemokine, directly on melanocytes Is not well known.
  • Immune responses caused by infections or internal and external wounds are well known for their precise control mechanisms.
  • chronic inflammation occurs, and such a change in the microenvironment affects the activity of surrounding cells.
  • changes in cytokines that mediate immune responses alter genes by changing epigenetic patterns, and studies are being actively conducted to treat chronic inflammation through epigenetic regulators and even treatment of cancer caused by inflammation.
  • epigenetic approach to the regulation of melanin-forming cells themselves or their surrounding microenvironment by chemokines.
  • Patent Document 1 Domestic Patent Publication No. 10-2013-0056955 (Publication date: May 31, 2013)
  • the present inventors sought to find a way to regulate the activity of the melanin forming cells or the microenvironment around the cell through the regulation of the immune system, and found that the activation of melanin forming cells can be regulated by treating ITAC, especially of chemokines. It was completed.
  • an object of the present invention is to provide a composition that exhibits a skin whitening effect by controlling the activation of melanin forming cells using chemokines.
  • the present invention provides a composition for skin whitening containing interferon-induced T cell alpha chemotactic factor.
  • composition of the present invention may provide a skin whitening effect by regulating the activation of melanin forming cells, and is also effective in alleviating and treating the symptoms of hyperpigmented skin diseases such as blemishes or surpluses.
  • 1 is a graph showing the result of decreased gene expression of melanin production-related factors in human melanin forming cells treated with ITAC.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of increased gene expression and protein amount of HDAC5 and enzyme activity of HDAC5 in human melanin forming cells treated with ITAC.
  • Figure 3 is a graph showing the results of reduced melanin pigment formation in human melanin forming cells incorporating the HDAC5 overexpression system.
  • the present invention relates to a composition capable of providing a skin whitening effect by regulating the activation of melanin forming cells, by controlling the gene expression of melanin pigment production-related factors
  • the composition of the present invention is a chemokine, in particular ITAC (interferon-inducible T) -cell alpha chemoattractant; interferon-induced T cell alpha chemotactic factor; SEQ ID NO: 1) as an active ingredient.
  • ITAC interferon-inducible T
  • SEQ ID NO: 1 interferon-induced T cell alpha chemotactic factor
  • the ITAC used in the present invention can be obtained from a number of suitable sources (eg, human recombinant ITAC, product number 672-IT of the R & D system). This can be produced by recombinant DNA methodologies, for example, in which genes encoding human ITAC are cloned and expressed in a host system while allowing the production of large amounts of pure human ITAC. Biologically active ITAC units or fragments may also be used in the present invention.
  • composition of the present invention contains the ITAC used as an active ingredient in an amount of 0.0001 to 0.0005% by weight based on the total weight of the composition.
  • the content of less than 0.0001% by weight is not sufficient to inhibit the activity of tyrosinase for whitening of the skin, and the content of more than 0.0005% by weight is not suitable for the containment and formulation of other ingredients.
  • composition according to the present invention provides an excellent skin whitening effect and is also effective in alleviating and treating pigmentation after inflammation such as hyperpigmented skin diseases such as the appearance of blemishes or surpluses, acne and the like.
  • composition according to the present invention may be formulated into a topical external preparation, a conventional external preparation, a cosmetic formulation or a pharmaceutical formulation.
  • composition according to the invention may be formulated containing a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base.
  • a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base for example emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes) and non-obtained by dispersing an oil phase in solution, gels, solids, pasty anhydrous products, aqueous phases.
  • It may be provided in the form of an ionic vesicle dispersant or in the form of a cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or cone stick. It may also be used in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
  • These compositions can be prepared according to conventional methods in the art.
  • the composition according to the present invention is a fatty substance, an organic solvent, a dissolving agent, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, a surfactant, water, an ionic or nonionic.
  • a fatty substance an organic solvent, a dissolving agent, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, a surfactant, water, an ionic or nonionic.
  • adjuvants conventionally used in the
  • compositions according to the invention may be formulated as pharmaceutical compositions further containing appropriate pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents.
  • the pharmaceutical dosage form of the present invention is not particularly limited, but may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds.
  • compositions according to the invention can be used in any form suitable for pharmaceutical preparations, including transdermal formulations such as lotions, ointments, gels, creams, patches, sprays, respectively, according to conventional methods.
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on the subject's age, sex, weight, symptoms, extent of disease, drug form, route of administration and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in the range of 1 mg / kg / day to 5000 mg / kg / day, but is not limited thereto. Administration may be once a day or may be divided several times.
  • the dosage may be increased or decreased depending on age, sex, weight, degree of disease, route of administration, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • composition of the present invention may contain a skin absorption promoting substance to increase the skin lightening effect.
  • C-102-5C Normal Human Epidermal Melanocyte-Moderately Pigmented (C-102-5C), purchased from Cascade, was planted in 100 x 2 plates in 6 x 10 5 counts, and the basal medium was HMGS (Human Melanocyte Growth Supplement; 254 medium (No. M-254-500, Gibco) including No. S-002-5, Gibco) was used and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Subcultures were performed at a density of about 70-80%, and subsequent melanocytes were provided with melanin-forming cells.
  • HMGS Human Melanocyte Growth Supplement
  • ITAC used product no. 672-IT, manufactured in an R & D system.
  • Human melanin forming cells cultured in Reference Example 1 were treated with ITAC at a concentration of 200 ng / ml and were treated with non-treated melanin cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 48 hours. It was. Total mRNA of the cultured human melanocytes was extracted to synthesize cDNA, and real-time PCR (Real-time PCR, Applied biosystems, 7500 Fast) was performed using the synthesized cDNA.
  • the real-time PCR experiment was repeated 40 times in 15 seconds, 60 °C 60 seconds cycle at 95 °C, and measured the relative value of how the gene expression increased compared to the gene expression of the control group, a representative melanin production factor Tyrosinase (TYR), MITF, TYRP1, DCT, MART1, gp100 primers were used to determine relative gene expression differences between samples.
  • Primers are TaqMan products manufactured by Applied Biosystems, respectively: tyrosinase (TYR, product number: Hs01099965_m1), MITF (product number: Hs01117294_m1), TYRP1 (product number: Hs00167051_m1), DCT (product number: Hs01095856_m1) , MART1 (product number: Hs00194133_m1), gp100 (PMEL, product number: Hs00173854_m1). The measurement result is shown in FIG.
  • Human melanin forming cells cultured in Reference Example 1 were treated with 50ng / ml of ITAC (product number 672-IT, R & D system) for 48 hours.
  • CDNA was synthesized from RNA isolated therefrom, and the change in mRNA amount was measured by Q-PCR (Applied biosystems, 7500 Fast) using a primer of HDAC5 (Histone deacetylase 5; histone deacetylase).
  • HDAC5 Histone deacetylase 5; histone deacetylase
  • the HDAC5 primer used in the experiment was TaqMan manufactured by Applied Biosystems using the product number: Hs00608366_m1.
  • the human melanin forming cells cultured in Reference Example 1 were treated with 50ng / ml of ITAC (product number 672-IT, R & D system) for 48 hours. 30 ⁇ g of the lysate of the cells was loaded to confirm the protein expression level of HDAC5 by western blot.
  • ITAC product number 672-IT, R & D system
  • the experimental system was determined that the experimental system was effective when the HDAC5 enzyme activity was inhibited by 70 to 100% in the experimental group containing a wide range HDAC inhibitor TSA, HDAC5 enzyme activity was measured in the HDAC assay kit (17-) 374).
  • ITAC increases the enzyme activity of HDAC5 in a concentration-dependent range of 50 ⁇ 200ng / ml used in the present invention.
  • HDAC5 overexpression vector (HDAC5 overexpression vector) was used to centrifuge (eppendorf, centrifuge 5415R, Germany) melanin-forming cells that produce more protein in HDAC5 than control cells.
  • the contents of the pellets were dissolved with sodium hydroxide, and the absorbance was measured at OD490 specific for melanin pigment (BioTek, Synergy2) and corrected for total protein amount.
  • HDAC5 overexpression induces a decrease in the amount of melanin in a concentration-dependent manner.
  • SEQ ID NO: 1 shows the sequence of the ITAC.

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Abstract

본 발명은 케모카인, 특히 ITAC(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자)를 함유함으로써 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 색소 생성 관련 인자의 유전자 발현을 감소시켜 피부 미백 효과를 가져올 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

케모카인을 함유하는 피부 미백용 조성물
본 발명은 케모카인, 특히 ITAC(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자)를 함유함으로써 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 색소 생성 관련 인자의 유전자 발현을 감소시켜 피부 미백 효과를 가져올 수 있는 조성물에 관한 것이다.
멜라닌 형성 세포는 피부 표피의 기저막(basal epidermis)에 존재하며, UV와 같은 외부 인자에 의해 멜라닌 색소를 생성하여 생성된 멜라닌 색소를 주변 각질세포에 전달하고, 이에 의하여 해당 각질세포의 DNA 손상을 억제하는 역할을 한다. 그러나 이러한 멜라닌 형성 세포의 활성은 유전적인 요인, 호르몬 및 여러 질병 요인에 따라 비정상적으로 조절되어 정상적인 색소 생성단계를 벗어나 과다한 색소 생성 및 과증식을 일으키게 되고, 이로 인하여 기미 혹은 흑자와 같은 과색소성 질환이 생기거나 백반증 등의 저색소 질환의 요인이 된다.
과다한 멜라닌 형성 세포의 활성화는 자외선 등 외부 자극의 만성적 노출 등에 의해 멜라닌 색소의 생성에 있어 항상성이 깨진 상태이다. 피부는 정교하게 조절되는 면역 기관으로서, 여러 가지 사이토카인, 케모카인, 그 외 염증 매개 물질을 분비한다. 자외선은 이와 같은 피부를 구성하는 면역 세포, 예를 들면 각질 형성 세포, 대식세포, T 세포 등을 자극하여 면역 물질의 분비를 유도한다. 이와 같은 면역 물질은 멜라닌 형성 세포의 주위를 둘러싸고 있는 미세환경에 면역 세포를 집적시켜 만성 염증 상태를 만들 뿐만 아니라 멜라닌 형성 세포의 증식, 이동, 멜라닌 색소의 과다 생성 등 멜라닌 세포 자체에도 영향을 미친다. 일반적으로 면역 매개 물질로 잘 알려져 있는 사이토카인은 이미 아토피, 접촉성 피부염 등 피부 생리에 중요한 역할을 하고 있음이 잘 알려져 있는 반면, 8~14kD 정도의 작은 크기의 면역반응 매개 물질로 주변의 세포에 선택적인 화학 주성을 나타내어 세포의 이동 및 표적 기관으로의 집적을 유도하는 기능을 가지고 있는 케모카인은 피부 생리에 있어 그 역할이 잘 알려져 있지 않다. 마찬가지로 멜라닌 형성 세포의 과활성화로 인한 과색소성 질환을 조절하기 위한 면역 조절 요법을 위해 다양한 면역 물질에 대한 연구가 진행되고 있으나, 피부면역세포 유래 인자이자 케모카인인 ITAC가 멜라닌 형성 세포에 직접적으로 미치는 영향은 잘 알려져 있지 않다.
감염이나 내외부적인 상처에 의해 발생하는 면역 반응은 매우 정밀한 조절 기작이 잘 알려져 있다. 그러나 이러한 면역계의 정밀한 조절 능력에 문제가 생기면 만성 염증이 발생하게 되고 이와 같은 미세 환경의 변화는 주변 세포의 활성 등에 영향을 미치게 된다. 최근에는 면역 반응을 매개하는 사이토카인의 변화가 후성유전체 패턴을 변화시켜 유전자를 변화시킨다는 보고가 있으며 후성유전체 조절 물질을 통한 만성 염증, 더 나아가 염증으로 인한 암의 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 케모카인에 의한 멜라닌 형성 세포 자체 혹은 세포 주변 미세 환경 조절에 대한 후성유전적 접근은 전무한 상태이다.
[선행기술문헌]
(특허문헌 1) 국내 특허공개 제10-2013-0056955호(공개일: 2013년 5월 31일)
본 발명자들은 면역계의 조절을 통하여 멜라닌 형성 세포의 활성 또는 세포 주변 미세 환경을 조절할 수 있는 방법을 찾고자 하였으며, 케모카인 중 특히 ITAC를 처리함으로써 멜라닌 형성 세포의 활성화를 조절할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 케모카인을 이용하여 멜라닌 형성 세포의 활성화를 조절함으로써 피부 미백 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자를 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 멜라닌 형성 세포의 활성화를 조절함으로써 피부 미백 효과를 제공할 수 있으며, 이에 더하여 기미 또는 흑자와 같은 과색소성 피부 질환의 증상을 완화 및 치료하는 데에도 효과적이다.
도 1은 ITAC을 처리한 인간 멜라닌 형성 세포에서의 멜라닌 색소 생성 관련 인자의 유전자 발현이 감소한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 ITAC을 처리한 인간 멜라닌 형성 세포에서의 HDAC5의 유전자 발현과 단백질량, 그리고 HDAC5의 효소 활성이 증가한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 HDAC5 과발현 시스템을 도입한 인간 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 색소의 형성이 감소한 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 멜라닌 형성 세포의 활성화를 조절하여, 멜라닌 색소 생성 관련 인자의 유전자 발현을 조절함으로써 피부 미백 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 케모카인, 특히 ITAC(interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant; 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자; 서열번호 1)를 유효성분으로 함유한다.
본 발명에서 사용되는 ITAC는 다수의 적당한 기원(예: 인간 재조합 ITAC, R&D system의 제품번호 672-IT)으로부터 입수할 수 있다. 이는 재조합 DNA 방법론, 예를 들면 다량의 순수한 인간 ITAC의 생산을 허용하면서 인간 ITAC를 암호화하는 유전자가 클로닝되고 숙주 시스템에서 발현되는 방법에 의해 생산될 수 있다. 생물학적으로 활성인 ITAC의 구성단위 또는 단편 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로 사용되는 ITAC를 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~0.0005중량%의 양으로 함유한다. 0.0001중량% 미만으로 함유되면 피부의 미백을 위하여 티로시나제의 활성을 저해시키기에 충분하지 못하고, 0.0005중량%를 초과하여 함유되면 다른 성분의 함유 및 제형화에 있어서 적절하지 못하다.
본 발명에 따른 조성물은 우수한 피부 미백 효과를 제공하며, 또한 과색소성 피부 질환, 예를 들어 기미 또는 흑자의 증상, 여드름 등 염증 후의 색소 침착을 완화 및 치료하는 데에도 효과적이다.
본 발명에 따른 조성물은 피부 외용제 조성물로서, 통상의 외용 제제, 화장료 제형 또는 약학 제형으로 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용가능한 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 함유하여 약학 조성물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 투여 형태는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 로션, 연고, 겔, 크림, 패취, 분무제와 같은 경피투여형 제형을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 1mg/kg/일 내지 5000mg/kg/일의 범위로 투여할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 투여는 하루에 한번 할 수도 있고, 수회 나누어 할 수도 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 피부 미백 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예 및 시험예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[ 참고예 1] 멜라닌 형성 세포의 준비
Cascade 사에서 구입한 인간 멜라닌 형성 세포(Normal Human Epidermal Melanocyte-Moderately pigmented, 제품번호 C-102-5C)를 100㎠ 플레이트에 6 x 105 개수로 심고, 기본 배지는 HMGS(Human Melanocyte Growth Supplement; 제품번호 S-002-5, Gibco)를 포함한 254 배지(제품번호 M-254-500, Gibco)를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 배양하였다. 약 70~80%의 밀도가 되었을 때 계대 배양을 하였고, 이후 진행되는 실험들에 계대 배양한 멜라닌 형성 세포를 제공하였다.
[ 시험예 1] ITAC에 의한 인간 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 색소 생성 관련 인자의 유전자 발현 감소 여부
ITAC에 의해 멜라닌 형성 세포의 색소 생성이 감소되는지 여부를 확인하기 위하여 인간 멜라닌 형성 세포에 ITAC를 처리하였다. ITAC는 R&D system에서 제조된, 제품번호 672-IT를 사용하였다.
상기 참고예 1에서 배양된 인간 멜라닌 형성 세포에 ITAC를 200ng/ml 농도로 처리하고 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은(non-treated) 멜라닌 세포를 이용하여 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 인간 멜라닌 세포의 총 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 이용하여 실시간 PCR(Real-time PCR, Applied biosystems, 7500 Fast)을 수행하였다. 실시간 PCR실험은 95℃에서 15초, 60℃ 60초 싸이클을 총 40회 반복하여 수행하였으며, 대조군의 유전자 발현에 비해 해당 유전자 발현이 얼마나 증가하였는지 상대적인 값을 측정하였는데, 대표적 멜라닌 색소 생성 촉진 인자인 티로시나아제(TYR), MITF, TYRP1, DCT, MART1, gp100 프라이머를 이용하여 샘플간 상대적인 유전자 발현 차이를 측정하였다. 프라이머는 Applied Biosystems에서 제조한 TaqMan 제품으로 각각 다음과 같다: 티로시나아제 (TYR, 제품번호:Hs01099965_m1), MITF (제품번호:Hs01117294_m1), TYRP1 (제품번호:Hs00167051_m1), DCT (제품번호:Hs01095856_m1), MART1 (제품번호:Hs00194133_m1), gp100 (PMEL, 제품번호:Hs00173854_m1). 측정 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 결과를 통하여, ITAC의 처리에 의하여 색소 생성 촉진 인자의 유전자 발현량이 감소하였으며, 특히 티로시나아제(TYR), TYRP1, DCT, MART1, gp100의 발현양이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 이를 통하여, 이와 같은 기작으로 ITAC가 멜라닌 색소 생성 저해능을 가진다는 것을 알 수 있다.
[ 시험예 2] ITAC에 의한 히스톤 탈아세틸화 효소인 HDAC5의 발현량 및 효소 활성 증가
상기 참고예 1에서 배양된 인간 멜라닌 형성 세포에 50ng/ml의 ITAC(제품번호 672-IT, R&D system)를 48시간 동안 처리하였다. 이로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, HDAC5(Histone deacetylase 5; 히스톤 탈아세틸화 효소)의 프라이머를 이용하여 Q-PCR(Applied biosystems, 7500 Fast)로 mRNA양의 변화를 측정하였다. Q-PCR의 실험은 95℃에서 15초, 60℃ 60초 싸이클을 총 40회 반복하였으며, 대조군의 유전자 발현에 비해 해당 유전자 발현이 얼마나 증가하였는지 상대적인 값을 측정하였다. 상기 실험에 이용한 HDAC5프라이머는 Applied Biosystems에서 제조한 TaqMan 제품으로 제품번호: Hs00608366_m1을 사용하였다.
측정 결과를 나타낸 도 2의 A를 보면, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 50ng/ml의 ITAC를 처리한 경우는 HDAC5의 mRNA의 발현양을 현저하게 증가시킨다는 것을 알 수 있다.
또한, 상기 참고예 1에서 배양된 인간 멜라닌 형성 세포에 50ng/ml의 ITAC(제품번호 672-IT, R&D system)를 48시간 동안 처리하였다. 상기 세포의 용해물 30μg을 로딩하여 웨스턴 블랏(western blot)으로 HDAC5의 단백질 발현량을 확인하였다.
이에 대한 결과를 나타낸 도 2의 B를 보면, 대조군인 GAPDH의 발현에 있어서는 변화가 나타나지 않았으나, ITAC를 처리한 경우는 HDAC5의 단백질 발현량이 상당히 증가하였음을 확인할 수 있다.
또한, ITAC에 의한 HDAC5의 mRNA와 단백질 양의 증가가 실제 효소 활성에 미치는 영향을 검증하기 위해, 상기 참고예 1에서 배양된 인간 멜라닌 형성 세포에 50ng/ml 또는 200ng/ml의 ITAC(제품번호 672-IT, R&D system)를 48시간 동안 처리한 후, 용해물을 제조하였다. 상기 세포의 용해물은 실험 직전까지 저온을 유지하여 효소 활성을 유지하도록 하였다. HDAC 분석을 위한 조제 버퍼(HDAC assay buffer) 10μl 혹은 대조군인 HDAC 저해제 TSA(트리코스타틴 A, Trichostatin A) 4μM이 함유된 조제 버퍼 10μl를 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하였다. 세포 용해물 20μl를 첨가한 후, 최대 효소 활성이 나타나도록 37℃의 인큐베이터에서 10분 정도 보관하였다. 4mM의 기질을 10μl 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 20μl의 효소 활성 증폭 버퍼(activator solution)를 넣고, 상온에서 20분 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다(BioTek, Synergy2). 이때, 대조군 대비 활성(%)으로 효소 활성을 정량적으로 산출하였다. 한편, 이 실험계에서는 광범위 HDAC 저해제인 TSA가 포함된 실험군에서 HDAC5 효소 활성이 70~100% 저해될 때 본 실험계가 효과적으로 작동했다고 판단하였으며, HDAC5 효소 활성 측정은 upstate에서 제조한 HDAC assay kit(17-374)를 이용하여 측정하였다.
측정 결과를 나타낸 도 2의 C를 보면, ITAC는 본 발명에서 사용한 50~200ng/ml의 범위에서 농도 의존적으로 HDAC5의 효소 활성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.
[ 시험예 3] HDAC5에 의한 멜라닌 색소 생성 저해
HDAC5 과발현 벡터(HDAC5 overexpression vector)를 이용해 HDAC5의 단백질을 대조군 세포보다 과다하게 만들어내는 멜라닌 형성 세포를 원심분리(eppendorf, centrifuge 5415R, Germany)하여 그 펠렛을 분리해 색깔을 관찰하였다.
아무것도 처리하지 않은 군을 대조군으로 이용하여 비교한 결과, 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, HDAC5의 과발현은 농도 의존적으로 멜라닌 색소 생성량을 감소시켰다.
수산화나트륨으로 상기 펠렛 속의 내용물을 용해시키고, 멜라닌 색소에 특이적인 OD490에서 흡광도를 측정하였으며(BioTek, Synergy2), 전체 단백질 양으로 보정하였다.
이에 대한 결과를 나타낸 도 3을 보면, HDAC5 과발현은 농도 의존적으로 멜라닌 양의 감소를 유도한다는 것을 알 수 있다.
서열번호 1은 ITAC의 서열을 나타낸다.

Claims (11)

  1. 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~0.0005중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 색소 생성 관련 인자의 유전자 발현을 억제함을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 히스톤 탈아세틸화 효소의 유전자 발현을 증가시킴을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 HDAC5과색소성 피부 질환을 개선시키는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 과색소성 피부 질환은 기미 또는 흑자임을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 과색소성 피부 질환은 염증 후의 색소 침착에 의한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제 조성물임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물임을 특징으로 하는 조성물.
  10. 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자를 유효성분으로 함유하는 과색소증 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 인터페론 유도성 T 세포 알파 화학주성인자를 유효성분으로 함유하는 조성물의 피부 미백용으로서의 용도.
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