WO2015174446A1 - 高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４－ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法 - Google Patents

高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４－ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015174446A1
WO2015174446A1 PCT/JP2015/063738 JP2015063738W WO2015174446A1 WO 2015174446 A1 WO2015174446 A1 WO 2015174446A1 JP 2015063738 W JP2015063738 W JP 2015063738W WO 2015174446 A1 WO2015174446 A1 WO 2015174446A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
chorismate
pyruvate lyase
seq
dna
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/063738
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
湯川　英明
乾　将行
和三 平賀
雅子 須田
龍馬 橋本
Original Assignee
グリーンフェノール開発株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by グリーンフェノール開発株式会社 filed Critical グリーンフェノール開発株式会社
Priority to JP2016519285A priority Critical patent/JP6327654B2/ja
Priority to US15/309,332 priority patent/US10221409B2/en
Priority to CN201580024075.6A priority patent/CN106459958B/zh
Priority to EP15793452.2A priority patent/EP3147360B1/en
Priority to KR1020167032000A priority patent/KR102305413B1/ko
Publication of WO2015174446A1 publication Critical patent/WO2015174446A1/ja
Priority to US16/244,809 priority patent/US10738296B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/0304—Chorismate lyase (4.1.3.40)

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme variant modified to improve the productivity of 4-hydroxybenzoic acid or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as “4-HBA”), and highly expressing the enzyme variant.
  • 4-HBA 4-hydroxybenzoic acid or a salt thereof
  • 4-HBA is a useful chemical substance that is used as a polymer raw material for liquid crystals and a synthetic raw material for parabens, which are antibacterial agents.
  • a chemical 4-HBA production method includes, for example, a reaction method using phenol, potassium hydroxide, and carbon dioxide under high pressure conditions.
  • Non-patent Document 3 a colismate-pyruvate lyase gene (ubiC) derived from E. coli using Klebsiella pneumoniae, which is another microorganism, as a host.
  • ubiC colismate-pyruvate lyase gene
  • Non-patent Document 4 fermentative production of 4-HBA has been reported in Escherichia coli with enhanced shikimate pathway.
  • 4-HBA resistant strain selection and ion-exchange resin-added culture have been reported to attempt growth inhibition and toxicity avoidance by 4-HBA, the productivity of 4-HBA is not sufficient in practice (Non-patent literature) 2).
  • ubiC other than E. coli has been reported to be derived from Rhodobacter sphaeroides, but when the gene is highly expressed using E. coli as a host, or when the gene is highly expressed using Rhodobacter sphaeroides as a host. No matter which transformant is used, the production of 4-HBA is low and is not sufficient for practical use (Patent Document 3).
  • Patent Document 3 the ubiC gene-deficient strain of Escherichia coli is described as being capable of complementation, there is no description regarding enzyme activity values, enzyme properties, or comparison with enzymes derived from other organisms.
  • the UbiC enzyme derived from E. coli has been analyzed in detail and is known to be strongly inhibited (product inhibition) by the product 4-HBA (Non-patent Documents 2, 5). . Therefore, for high production of 4-HBA, acquisition of highly active UbiC and acquisition of UbiC resistant to product inhibition by 4-HBA are extremely important for the construction of a high production strain of 4-HBA.
  • the present invention relates to a mutant chorismate-pyruvate lyase enzyme having a sufficiently high 4-HBA production activity for practical use, a transformant capable of efficiently producing 4-HBA by highly expressing this enzyme, and this transformant. It is an object of the present invention to provide a method by which 4-HBA can be efficiently produced by using it.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following mutant chorismate-pyruvate lyase, a transformant, and a method for producing 4-HBA.
  • Item 1 The following (A) or (B) mutant chorismate-pyruvate lyase (A): In the chorismate-pyruvate lyase (ubiC) derived from Pantoea ananatis having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, valine of amino acid number 80 is 1 or Mutant chorismate-pyruvate lyase substituted with a plurality of other amino acids (B) In other chorismate-pyruvate lyases, one or a plurality of other amino acids is substituted for the amino acid at an enzymatically homologous position with valine.
  • A In the chorismate-pyruvate lyase (ubiC) derived from Pantoea ananatis having the amino acid sequence of SEQ
  • Mutant chorismate-pyruvate lyase term 2 The mutant chorismate-pyruvate lyase of (B) above is (i) a chorismate-pyruvate lyase derived from a Providencia bacterium, amino acid number 80 valine (V), (ii) in the colismate-pyruvate lyase from the genus Escherichia, isoleucine (I) of amino acid number 79, or (iii) Isoleucine of amino acid number 79 (I) in a chorismate-pyruvate lyase derived from a Cronobacter bacterium Item 2.
  • Item 3. Item 2. The mutant chorismate-pyruvate lyase according to item 1, which is the following (a), (b), or (c): (a) Collismate derived from Pantoea ananatis consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-Collismate derived from Providencia stuartii consisting of valine of amino acid number 80 of pyruvate lyase and amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Providencia rustigianii derived from valine of amino acid number 80 of pyruvate lyase, Providencia rustigianii derived from Providencia rustigianii, valine of amino acid number 80 of pyruvate lyase, Providencia snivia consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 sneebia) chorismate-pyruv
  • Mutant chorismate-pyruvate lyase in which isoleucine of amino acid number 79 is substituted with one or more other amino acids (b) a mutant chorismate-pyruvate lyase comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 while retaining the above-mentioned amino acid portion generated by substitution, and having a chorismate-pyruvate lyase activity (c) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 and having a chorismate-pyruvate lyase activity, the valine of any amino acid number 80 of SEQ ID NOs: 1 to 7 Or a variant chorismate-pyruvate lyase in which the amino acid at the position enzymatically homologous to isoleucine of amino acid number 79 of SEQ ID NO: 8 or 9 is substituted with one or more other amino
  • Item 4 The mutant chorismate-pyruvate lyase according to any one of Items 1 to 3, wherein one amino acid is generated by substitution, and the amino acid is alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine.
  • Item 5. A transformant in which a DNA encoding the mutant chorismate-pyruvate lyase according to any one of Items 1 to 4 is introduced into a host coryneform bacterium.
  • Item 6. The transformant according to item 5, wherein the host coryneform bacterium is a genus Corynebacterium.
  • Item 7. Item 7. The transformant according to Item 6, wherein the Corynebacterium glutamicum bacterium is Corynebacterium glutamicum R (FERM BP-18976), ATCC13032, or ATCC13869.
  • Item 8. A transformant in which the mutant DNA (C) or (D) below is introduced into a host coryneform bacterium.
  • gtc of base numbers 240 to 242 differ from the amino acid encoded by it Mutant DNA substituted with a DNA portion encoding one amino acid
  • D Mutation in which the DNA portion at the position corresponding to the above gtc is replaced with a DNA portion encoding one or more amino acids different from the amino acid encoded in the gene encoding other chorismate-pyruvate lyase DNA Item 9.
  • the mutant DNA of (D) above is (iv) gtc of base numbers 240 to 242 of the chorismate-pyruvate lyase gene derived from a Providencia bacterium, (v) atc of base numbers 237 to 239 of the colismate-pyruvate lyase gene derived from bacteria belonging to the genus Escherichia, or (vi) atc of base numbers 237 to 239 of the chorismate-pyruvate lyase gene derived from the genus Cronobacter Item 9.
  • the transformant according to Item 8 which is a mutant DNA in which is substituted with a DNA portion encoding one or more amino acids different from the amino acid encoded by Item 10.
  • Item 11. The transformant according to any one of Items 8 to 10, wherein the DNA generated by the substitution is gca, tgc, acc, tcc, or aac.
  • Item 12. The transformant according to any one of Items 8 to 11, wherein the host coryneform bacterium is a genus Corynebacterium.
  • Item 13 Item 13.
  • Corynebacterium glutamicum bacterium is Corynebacterium glutamicum R (FERM BP-18976), ATCC13032, or ATCC13869.
  • Item 14 Corynebacterium glutamicum HBA-47 (Accession number: NITE BP-01849) transformant.
  • Item 15. The transformant according to any one of Items 5 to 14, wherein the transformant is at least one raw material selected from the group consisting of a saccharide, a compound that the transformant can produce chorismate by metabolism, and chorismate, and a salt thereof.
  • a method for producing 4-hydroxybenzoic acid or a salt thereof comprising a step of culturing in a reaction solution containing a compound and a step of recovering 4-hydroxybenzoic acid or a salt thereof in the reaction solution.
  • Item 16. Item 16. The method according to Item 15, wherein the transformant is cultured under aerobic conditions where the transformant does not grow.
  • a saccharide, a compound capable of producing chorismate by metabolism of the transformant, 4-HBA can be produced practically sufficiently efficiently from chorismic acid or a salt thereof.
  • the mutant chorismate-pyruvate lyase of the present invention is: (A) Collismate derived from Pantoea ananatis having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 -Pyruvate lyase (ubiC) in which valine of amino acid number 80 is substituted with another amino acid, or (B) Other chorismates- In pyruvate lyase, an amino acid at an enzymatically homologous position with valine is substituted with another amino acid.
  • mutant chorismate-pyruvate lyase of (B) above (i) a chorismate-pyruvate lyase derived from a Providencia bacterium, amino acid number 80 valine (V), (ii) in the colismate-pyruvate lyase from the genus Escherichia, isoleucine (I) of amino acid number 79, or (iii) Isoleucine of amino acid number 79 (I) in a chorismate-pyruvate lyase derived from a Cronobacter bacterium Are substituted with other amino acids.
  • chorismate-pyruvate lyase derived from Providencia bacteria Corrismate-pyruvate lyase derived from Providencia stuartii consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, Chorismate-pyruvate lyase derived from Providencia rustigianii consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, Providencia sneebia consisting of amino acid sequence, chorismate-pyruvate lyase derived from Providencia sneebia, Providencia rettgeri consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, Providencia alkaline pyrucience consisting of amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (Providencia alcalifaciens) chorismate-pyruvate lyase, Providencia barhodo granariae consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • Examples of the colismate-pyruvate lyase derived from bacteria belonging to the genus Escherichia include colismate-pyruvate lyase derived from Escherichia coli consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • Examples of the chorismate-pyruvate lyase derived from the genus Cronobacter include chorismate-pyruvate lyase derived from Cronobacter sakazakii consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the valine or isoleucine may be substituted with another single amino acid, or substituted with another plural number of amino acids (for example, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 3, or 2) It is preferred that it is substituted with one amino acid.
  • the valine or isoleucine is preferably substituted with alanine (A), cysteine (C), threonine (T), serine (S) or asparagine (N), and alanine (A) or cysteine (C ) Is more preferable.
  • valine or isoleucine in place of the substitution of valine or isoleucine, deletion of the valine or isoleucine, one or more adjacent to the N-terminal side of the valine or isoleucine (for example, 2 to 8, 2 to 6, 2 Deletion of ⁇ 3 or 2 amino acids, or one or more (eg 2-8, 2-6, 2-3, or 2) to positions adjacent to the valine or isoleucine. ) Amino acid insertion can also increase the chorismate-pyruvate lyase activity.
  • mutant chorismate-pyruvate lyase of the present invention retains the above-mentioned amino acid part (for example, the above-mentioned alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine) generated by mutation, and any of SEQ ID NOS: 1 to 90. %, Preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and a mutant chorismate-pyruvate lyase comprising a polypeptide having a chorismate-pyruvate lyase activity.
  • amino acid part for example, the above-mentioned alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine
  • the amino acid at a position that is enzymatically homologous to valine of amino acid number 80 of SEQ ID NO: 1 to 7 or isoleucine of amino acid number 79 of SEQ ID NO: 8 or 9 is:
  • alanine, cysteine, threonine, serine or asparagine other than valine or isoleucine is:
  • “enzymatically homologous” means to contribute equally to the enzymatic function of the polypeptide.
  • Amino acids present at equivalent positions in the alignment of amino acid sequences are amino acids that contribute equally to enzyme function.
  • the identity of the amino acid sequence and the base sequence is a value calculated by GENETYX ver. 8 (manufactured by GENETYX® GENETICS).
  • Chorismate-pyruvate lyase is an enzyme that catalyzes the reaction of eliminating pyruvate from chorismate to produce 4-HBA and the reverse reaction.
  • the chorismate-pyruvate lyase activity can be measured by modifying the method described in “Microbiology, 140, 897-904 (1994)”. Briefly, add the test enzyme to the test solution, and add 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM chorismate Ba salt, 0.2 mM NADH, 0.2 M NaCl, 5 Unit lactate dehydrogenase and react at 33 ° C. The initial reaction rate is measured by following the decrease in absorbance at 340 nm derived from NADH.
  • chorismate-pyruvate lyase activity Perform the same reaction for the system to which chorismate Ba salt is not added to obtain the background value.
  • the difference between the two measurements is the chorismate-pyruvate lyase activity, and if there is a linear decrease in absorbance at 340 nm over time from NADH depending on the enzyme and substrate addition, it is determined to have the chorismate-pyruvate lyase activity.
  • One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that produces 1 micromole of 4-HBA per minute, and is calculated from the initial rate of the enzyme reaction.
  • mutant chorismate-pyruvate lyase of the present invention has 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity with any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and the chorismate-pyruvate lyase activity.
  • amino acid at the position that is enzymatically homologous to the valine of amino acid number 80 of SEQ ID NO: 1 to 7 or the isoleucine of amino acid number 79 of SEQ ID NO: 8 or 9 is substituted with another amino acid ( Examples include mutant chorismate-pyruvate lyase substituted with alanine, cysteine, threonine, serine or asparagine, particularly alanine or cysteine).
  • a mutant DNA in which a DNA portion encoding an amino acid is substituted is exemplified.
  • the chorismate-pyruvate lyase gene derived from the bacteria of the genus Providencia includes the chorismate-pyruvate lyase gene derived from the Providencia stealthii comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and the chorismate-pyruvate derived from Providencia rustigiani comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • Providencia Spybia-derived chorismate-pyruvate lyase gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 13 Providencia-pyruvate lyase gene derived from the base sequence of SEQ ID NO: 14 Providencia-pyruvate lyase gene derived from the base sequence of SEQ ID NO: 14 Providencia Verhodo granarie consisting of the base sequence of Enris-derived chorismate-pyruvate lyase gene, SEQ ID NO: 16 Origin of Korisumeto - such as pyruvate lyase gene and the like.
  • Examples of the colismate-pyruvate lyase gene derived from bacteria belonging to the genus Escherichia include the colismate-pyruvate lyase gene derived from Escherichia coli comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.
  • Examples of the chorismate-pyruvate lyase gene derived from the genus Cronobacter include the chorismate-pyruvate lyase gene derived from Cronobacter sakazaki comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
  • substitution with DNA encoding one amino acid is preferred.
  • substitution with DNA encoding alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine is preferred, and substitution with DNA encoding alanine or cysteine is preferred.
  • alanine-encoding DNA include gca, cysteine-encoding DNA includes tgc, threonine-encoding DNA includes acc, serine-encoding DNA includes tcc, and asparagine.
  • Examples of the DNA to be encoded include aac.
  • mutant DNA retains a DNA portion that is generated by the above substitution and encodes an amino acid other than valine or isoleucine (for example, alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine, particularly alanine or cysteine),
  • a mutant DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity with any of SEQ ID NOs: 10 to 18, and encoding a polypeptide having a chorismate-pyruvate lyase activity included.
  • the mutant DNA has a DNA sequence encoding an amino acid (for example, alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine, particularly alanine or cysteine) other than valine or isoleucine generated by the above substitution, Also included is a mutant DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising any one of the nucleotide sequences of Nos. 10 to 18 and encodes a polypeptide having a chorismate-pyruvate lyase activity.
  • an amino acid for example, alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine, particularly alanine or cysteine
  • stringent conditions refers to hybridization in a hybridization solution having a salt concentration of 6 ⁇ SSC at a temperature of 50 to 60 ° C. for 16 hours, and in a solution having a salt concentration of 0.1 ⁇ SSC. Refers to conditions for cleaning.
  • the mutant DNA has a base sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity with any one of SEQ ID NOs: 10 to 16, and has a colismate-pyruvate lyase activity.
  • the DNA encoding the peptide one or a plurality of DNA portions corresponding to gtc of base numbers 240 to 242 of any of SEQ ID NOs: 10 to 16 (for example, 2 to 8, 2 to 6, 2 to A mutant DNA substituted with a DNA portion encoding 3 or 2 amino acids other than valine, particularly one amino acid (for example, alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine, particularly alanine or cysteine); included.
  • the “DNA portion corresponding to gtc of any base number 240 to 242 of SEQ ID NOs: 10 to 16” is a chorismate-pyruvate lyase comprising an amino acid sequence encoded by a DNA comprising any of the base sequences of SEQ ID NOs: 10 to 16 A DNA portion encoding an amino acid at a position enzymatically homologous to valine of amino acid number 80.
  • the mutant DNA contains a polypeptide having a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more identity with SEQ ID NO: 17 or 18, and having a chorismate-pyruvate lyase activity.
  • the encoded DNA one or a plurality of DNA portions corresponding to atc of base numbers 237 to 239 of SEQ ID NO: 17 or 18 (for example, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 3, or 2 Mutated DNA substituted with a DNA portion encoding an amino acid other than isoleucine, particularly one amino acid (eg, alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine, particularly alanine, or cysteine).
  • an amino acid other than isoleucine particularly one amino acid (eg, alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine, particularly alanine, or cysteine).
  • DNA portion corresponding to atc of base numbers 237 to 239 of SEQ ID NO: 17 or 18 is an isoleucine of amino acid number 79 of chorismate-pyruvate lyase consisting of amino acid sequence encoded by DNA consisting of base sequence of SEQ ID NO: 17 or 18 And a DNA portion encoding an amino acid at a position that is enzymatically homologous.
  • mutant DNA may be any base of any of SEQ ID NOs: 10 to 16 in a DNA that hybridizes with any of SEQ ID NOs: 10 to 16 under a stringent condition and encodes a polypeptide having a chorismate-pyruvate lyase activity.
  • One or a plurality of (for example, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 3, or 2) amino acids other than valine, particularly one Included are mutant DNAs that are substituted with a DNA portion encoding an amino acid (eg, alanine, cysteine, threonine, serine, or asparagine, particularly alanine, or cysteine).
  • the mutant DNA is a DNA that hybridizes with SEQ ID NO: 17 or 18 under a stringent condition and encodes a polypeptide having a chorismate-pyruvate lyase activity, and has nucleotide numbers 237 to 239 of SEQ ID NO: 17 or 18.
  • Analog DNA encoding a polypeptide having 90% identity or more stringent conditions with a DNA encoding chorismate-pyruvate lyase and having a chorismate-pyruvate lyase activity for example, It can be selected from DNA libraries of other species by PCR or hybridization using primers or probes designed according to a conventional method based on the base sequence of the resulting DNA, and this allows highly probable chorismate-pyruvate lyase activity. A DNA encoding the polypeptide having is obtained.
  • a host coryneform bacterium is a group of microorganisms defined in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974), and is under normal aerobic conditions. If it grows in, it will not be specifically limited. Specific examples include Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, and the like. Among the coryneform bacteria, the genus Corynebacterium is preferable.
  • Corynebacterium glutamicum is preferable because it is safe and has high 4-HBA productivity.
  • Corynebacterium glutamicum R strain (FERM BP-18976), ATCC13032 strain, ATCC13869 strain, ATCC13058 strain, ATCC13059 strain, ATCC13060 strain, ATCC13232 strain, ATCC13286 strain, ATCC13287 strain, ATCC13655 strain, ATCC13745 Strains, ATCC13746 strain, ATCC13761 strain, ATCC14020 strain, ATCC31831 strain, MJ-233 (FERM BP-1497), MJ-233AB-41 (FERM BP-1498) and the like. These strains are deposited internationally under the Budapest Treaty and are publicly available. Among these, R strain (FERM BP-18976), ATCC13032 strain, and ATCC13869 strain are preferable.
  • coryneforms such as Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Corynebacterium lilium, etc.
  • the name of the bacterium is the same as Corynebacterium glutamicum [Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum” DSM 20411, “Brevibacterium lactofermentum” DSM 20412 and DSM 1412 , and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41: 255-260.
  • Brevibacterium ammoniagenes for example, ATCC6872 strain. This strain has been deposited internationally under the Budapest Treaty and is publicly available.
  • Arthrobacter examples include Arthrobacter globiformis (for example, ATCC 8010 strain, ATCC 4336 strain, ATCC 21056 strain, ATCC 31250 strain, ATCC 31738 strain, ATCC 35698 strain) and the like. These strains are deposited internationally under the Budapest Treaty and are publicly available.
  • Mycobacterium examples include Mycobacterium bovis (for example, ATCC19210 strain, ATCC27289 strain). These strains are deposited internationally under the Budapest Treaty and are publicly available.
  • Examples of the genus Micrococcus include Micrococcus freudenreichii (for example, No. 239 strain (FERM P-13221)), Micrococcus leuteus (for example, No. 240 strain (FERM P-13222)), Examples include Micrococcus ureae (for example, IAM1010 strain), Micrococcus roseus (for example, IFO3764 strain), and the like.
  • the coryneform bacterium may be a mutant strain or an artificial gene recombinant.
  • disrupted strains of genes such as lactate (lactate dehydrogenase: LDH), phosphoenolpyruvate carboxylase, malate dehydrogenase, and the like can be mentioned.
  • lactate dehydrogenase lactate dehydrogenase: LDH
  • phosphoenolpyruvate carboxylase phosphoenolpyruvate carboxylase
  • malate dehydrogenase and the like
  • a disrupted strain of lactate dehydrogenase gene is preferable. In this gene-disrupted strain, the metabolic pathway from pyruvate to lactic acid is blocked because the lactate dehydrogenase gene is disrupted.
  • a disrupted strain of Corynebacterium glutamicum particularly a lactate dehydrogenase gene of R (FERM BP-18976) strain is preferable.
  • a gene-disrupted strain can be prepared according to a conventional method by genetic engineering techniques.
  • WO2005 / 010182A1 describes a lactate dehydrogenase-disrupting strain and a method for producing the same.
  • coryneform bacteria have extremely high resistance to 4-HBA compared to other bacteria. Coryneform bacteria are less susceptible to lysis than other aerobic bacteria. In this respect, coryneform bacteria are suitable for 4-HBA production by the method of the present invention.
  • the plasmid vector may be any plasmid vector as long as it contains a gene that controls the autonomous replication function in coryneform bacteria. Specific examples thereof include pAM330 derived from Brevibacterium lactofermentum 2256 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-67699), [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric Biol. Chem.
  • Preferred promoters include the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A gene (gapA) promoter PgapA, the malate dehydrogenase gene (mdh) promoter Pmdh, and the lactate dehydrogenase A gene (ldhA) promoter PldhA derived from Corynebacterium glutamicum R. Among them, PgapA is preferable.
  • Preferred terminators include the rrnB T1T2 terminator of the E. coli rRNA operon, the trpA terminator of E. coli, the trp terminator of Brevibacterium lactofermentum, and the rrnB T1T2 terminator is preferred.
  • Transformation transformation methods can be used without limitation any known methods. Examples of such known methods include calcium chloride / rubidium chloride method, calcium phosphate method, DEAE-dextran mediated transfection, and electroporation. Among them, the electric pulse method is suitable for coryneform bacteria, and the electric pulse method can be performed by a known method (Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)).
  • a natural medium or a synthetic medium usually containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other nutrient substances can be used.
  • carbon sources examples include glucose, fructose, sucrose, mannose, maltose, mannitol, xylose, arabinose, galactose, starch, molasses, sorbitol, glycerin and other sugars or sugar alcohols; acetic acid, citric acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid Or organic acids, such as gluconic acid; Alcohol, such as ethanol and a propanol, is mentioned.
  • One carbon source can be used alone, or two or more carbon sources may be used in the future.
  • the concentration of these carbon sources in the medium is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • the nitrogen source examples include inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, and potassium nitrate. Further, corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can be used. As the nitrogen source, one kind may be used alone, or two or more kinds may be mixed and used.
  • the nitrogen source concentration in the medium is usually 10 (w / v%), although it varies depending on the nitrogen compound used.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate. These inorganic salts may be used alone or in a combination of two or more. The concentration of inorganic salts in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.1 to 1 (w / v%).
  • the nutritional substance examples include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, skim milk powder, defatted soy hydrochloride hydrolyzate, or animal and plant or microbial cell extracts and their degradation products. However, it is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary. Examples of vitamins include biotin, thiamine, pyridoxine, pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • a preferred microorganism culture medium is A medium (Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions.J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196 (2004)).
  • BT medium [Omumasaba, CA et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8: 91-103 (2004)].
  • the culture temperature may be about 15 to 45 ° C.
  • the culture time may be about 1 to 7 days.
  • the 4-hydroxybenzoate hydroxylase gene present on the chromosome is preferably disrupted or deleted. Metabolism of 4-HBA produced by destroying 4-hydroxybenzoate hydroxylase is suppressed, thereby improving 4-HBA productivity and reducing by-products.
  • a deletion type gene is created by deleting a partial sequence of the gene and modified so that it does not produce a normal functioning enzyme protein. By causing homologous recombination with this gene, the gene on the chromosome can be replaced with a deletion or destruction type gene.
  • the enzyme protein encoded by the deletion-type or disruption-type gene has a three-dimensional structure different from that of the wild-type enzyme protein, and its function is reduced or lost.
  • Gene deletion or destruction by gene replacement using such homologous recombination has already been established, and a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin, a plasmid capable of conjugation transfer, and a suspension without a replication origin in the host.
  • a method using a vector US Pat. No. 6,303,383, Japanese Patent Laid-Open No. 05-007491).
  • the transformant of the present invention described above is selected from the group consisting of saccharides, compounds that transformants can produce chorismic acid by metabolism, chorismic acid, and salts thereof 4-HBA can be produced by a method comprising a step of reacting in a reaction solution containing at least one raw material compound and a step of recovering 4-HBA in the reaction solution.
  • the raw material compound is required to be a compound that can be incorporated into cells by the transformant, and it is desirable that the raw material compound be industrially easily used, such as being contained in a large amount in plants.
  • Glucose is preferred as the saccharide, but saccharides that can produce glucose by metabolism can also be used.
  • Such saccharides include oligosaccharides or polysaccharides having glucose units.
  • Examples of such saccharides include monosaccharides such as fructose, mannose, arabinose, xylose and galactose; disaccharides such as cellobiose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose and xylobiose; polysaccharides such as dextrin and soluble starch Can be mentioned.
  • Examples of the compound capable of producing chorismic acid by metabolism include quinic acid and shikimic acid.
  • molasses can also be used as a raw material containing these raw material compounds.
  • non-edible agricultural waste such as straw (rice straw, barley straw, wheat straw, rye straw, oat straw), bagasse, corn stover, energy crops such as switchgrass, napiergrass and miscanthus, and wood chips
  • a saccharified solution containing a plurality of sugars such as glucose obtained by saccharifying used paper with a saccharifying enzyme or the like can also be used.
  • glucose, chorismic acid, quinic acid, and shikimic acid are preferable as the raw material compound.
  • the transformant Prior to the growth reaction of the microorganism , the transformant is preferably grown by culturing at a temperature of about 25 to 38 ° C. for about 12 to 48 hours under aerobic conditions.
  • a natural medium or a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other nutrient substances can be used.
  • carbon sources sugars (monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose, galactose; disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, cellobiose, xylobiose, trehalose; polysaccharides such as starch; molasses etc.), Sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol, glycerin; organic acids such as acetic acid, citric acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, and gluconic acid; alcohols such as ethanol and propanol; hydrocarbons such as normal paraffin Can also be used.
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in mixture of 2
  • inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can also be used.
  • a nitrogen source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types. The concentration of the nitrogen source in the medium varies depending on the nitrogen compound to be used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate.
  • One inorganic salt can be used alone, or two or more inorganic salts can be mixed and used.
  • the concentration of inorganic salts in the medium varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
  • the nutritional substance examples include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, skim milk powder, defatted soy hydrochloride hydrolyzate, animal and plant or microbial cell extracts, and their degradation products.
  • concentration of the nutrient substance in the medium varies depending on the nutrient substance used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary. Examples of vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • a medium (Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182- 196 (2004)), BT medium (Omumasaba, CA et al., Corynebacterium amicglutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Etc.
  • the saccharide concentration may be used within the above range.
  • reaction solution a natural reaction solution or a synthetic reaction solution containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like can be used.
  • carbon source the raw material compound described above or molasses or saccharified solution containing the same may be used.
  • a carbon source in addition to sugars, sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol, glycerin; organic acids such as acetic acid, citric acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, gluconic acid; ethanol, propanol, etc.
  • Non-alcoholic; hydrocarbons such as normal paraffin can also be used.
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • the concentration of the raw material compound in the reaction solution is preferably about 1 to 20 (w / v%), more preferably about 2 to 10 (w / v%), and even more preferably about 2 to 5 (w / v%). preferable.
  • the concentration of the total carbon source including the raw material compound may be about 2 to 5 (w / v%).
  • inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate, urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolyzate, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can also be used.
  • a nitrogen source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types. The concentration of the nitrogen source in the reaction solution varies depending on the nitrogen compound to be used, but is usually about 0.1 to 10 (w / v%).
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate.
  • One inorganic salt can be used alone, or two or more inorganic salts can be mixed and used.
  • the concentration of the inorganic salt in the reaction solution varies depending on the inorganic salt used, but is usually about 0.01 to 1 (w / v%).
  • vitamins can be added as necessary.
  • vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like.
  • the pH of the reaction solution is preferably about 6-8.
  • reaction solution for coryneform bacteria include the BT medium described above.
  • saccharide concentration may be used within the above range.
  • the reaction temperature that is, the survival temperature of the transformant is preferably about 20 to 50 ° C, more preferably about 25 to 47 ° C. If it is the said temperature range, 4-HBA can be manufactured efficiently.
  • the reaction time is preferably about 1 to 7 days, more preferably about 1 to 3 days.
  • the culture may be any of batch type, fed-batch type, and continuous type. Among these, the batch type is preferable.
  • the reaction may be carried out under aerobic conditions or under reducing conditions.
  • the transformant of the present invention itself has a higher 4-HBA production capacity under aerobic conditions. However, since the transformant grows under aerobic conditions, the raw material compound is consumed for growth, and the 4-HBA production efficiency is reduced accordingly.
  • Not proliferating in the present invention includes substantially not proliferating or hardly proliferating.
  • the growth of transformants can be avoided or suppressed by using a reaction solution that lacks or restricts one or more of vitamins such as biotin and thiamine, which are essential compounds for the growth of microorganisms, and nitrogen sources. .
  • the reduction condition is defined by the oxidation-reduction potential of the reaction solution.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction solution is preferably about ⁇ 200 mV to ⁇ 500 mV, more preferably about ⁇ 150 mV to ⁇ 500 mV.
  • the reduction state of the reaction solution can be estimated easily with a resazurin indicator (decolorization from blue to colorless in the reduction state), but using a redox potentiometer (for example, BROADLEY JAMES, ORP Electrodes) Can be measured.
  • an aqueous solution for reaction solution may be used as a liquid medium for the reaction solution instead of distilled water, etc.
  • the method for adjusting the aqueous solution for reaction solution is, for example, a culture solution preparation for absolute anaerobic microorganisms such as sulfate-reducing microorganisms.
  • an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions can be obtained by removing dissolved gas by heat treatment or decompression treatment of distilled water or the like.
  • distilled water or the like is treated for about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 40 minutes under reduced pressure of about 10 mmHg or less, preferably about 5 mmHg or less, more preferably about 3 mmHg or less.
  • the dissolved gas, particularly dissolved oxygen can be removed to prepare an aqueous solution for reaction solution under reducing conditions.
  • an appropriate reducing agent for example, thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, glutathione, sodium sulfide, etc.
  • An appropriate combination of these methods is a method for preparing an aqueous solution for reaction solution under effective reducing conditions.
  • the reaction system is made of an inert gas such as nitrogen gas or carbon dioxide gas.
  • the method of enclosing is mentioned.
  • a pH maintenance adjusting solution of the reaction system or various nutrient solution in such a case, it is effective to remove oxygen from the added solution in advance.
  • 4-HBA is produced in the reaction solution.
  • 4-HBA can be recovered by recovering the reaction solution, but 4-HBA can also be separated from the reaction solution by a known method.
  • Such known methods include crystallization methods, membrane separation methods, organic solvent extraction methods, various adsorption methods (using ion exchange resins, synthetic adsorbents, etc.) and the like.
  • a method for improving or increasing the activity of chorismate-pyruvate lyase by substituting one or more other amino acids at a homologous position The chorismate-pyruvate lyase and the mutation method are as described above.
  • the present invention includes embodiments in which the above configurations are combined in various ways within the technical scope of the present invention as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • Pantoea ananatis ubiC gene amplification primer (a-1); 5'- CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT -3 ' (SEQ ID NO: 19) (B-1); 5'- CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG -3 ' (SEQ ID NO: 20)
  • the NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-1) and (b-1).
  • Actual PCR was performed using a Veriti thermal cycler (Applied Biosystems) and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent under the following conditions.
  • Reaction solution PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U / ⁇ l) 1 ⁇ l 5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg 2+ plus) 10 ⁇ l dNTP Mixture (2.5mM each) 4 ⁇ l Template DNA 1 ⁇ l (DNA content 1 ⁇ g or less) 1 ⁇ l of each of the two primers described above (final concentration 0.2 ⁇ M) Sterile distilled water 32 ⁇ l The above was mixed, and 50 ⁇ l of the reaction solution was subjected to PCR. PCR cycle: Denaturation process: 98 ° C, 10 seconds Annealing process: 50 ° C, 5 seconds Extension process: 68 ° C 30 seconds or more were performed for 30 cycles.
  • Each component of DNA ligase 10 ⁇ buffer 1 ⁇ l and T4 DNA ligase (Takara Bio Inc.) 1 unit was added, made up to 10 ⁇ l with sterilized distilled water, reacted at 15 ° C. for 3 hours, and bound.
  • the resulting ligation solution was transformed into Escherichia coli HST02 by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% yeast extract , 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • Each of the growing strains on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and each plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment.
  • a restriction enzyme to confirm the inserted fragment.
  • an insertion fragment of about 0.5-kb of ubiC gene derived from Pantoea ananatis strain was observed.
  • a plasmid containing the ubiC gene derived from Pantoea ananatis strain was named pHBA22.
  • Pantoea ananatis ubiC gene mutation introduction primer (a-2); 5'- CGAGAAgcaATTCTCTACGGGGATG -3 '(SEQ ID NO: 21) (B-2); 5'-CAGCCAGAAACGCTGATCG-3 '(SEQ ID NO: 22) (A-3); 5'-tgcATTCTCTACGGGGATGAGG -3 '(SEQ ID NO: 23) (B-3); 5'- TTCTCGCAGCCAGAAACGCTG -3 '(SEQ ID NO: 24)
  • PCR was performed using a Veriti thermal cycler (Applied Biosystems) and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent under the following conditions.
  • Reaction solution PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U / ⁇ l) 1 ⁇ l 5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg 2+ plus ) 10 ⁇ l dNTP Mixture (2.5mM each) 4 ⁇ l Template DNA 1 ⁇ l (DNA content 1 ⁇ g or less) 2 primers as described above *) 1 ⁇ l each (final concentration 0.2 ⁇ M) Sterile distilled water 32 ⁇ l The above was mixed, and 50 ⁇ l of the reaction solution was subjected to PCR.
  • PCR cycle Denaturation process: 98 ° C., 10 seconds annealing process: 50 ° C., 5 seconds extension process: 68 ° C. 338 seconds or more was defined as one cycle, and 30 cycles were performed.
  • the obtained ligation solution was transformed with Escherichia coli HST02 by the calcium chloride method [J. Mol. Biol. 53: 159-162 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% % Yeast extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • the growing strain on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the nucleotide sequence of the plasmid was sequenced to confirm the introduction of the mutation into the V80 site of the ubiC gene.
  • the obtained plasmids were named pHBA23 and pHBA24. The outline of gene recombination of this plasmid is summarized in Table 1.
  • the growing strain on this medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture, and the plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted plasmid.
  • introduction of the plasmids pHBA22 to pHBA24 prepared above was observed.
  • the resulting strains were named Corynebacterium glutamicum HBA-22 to HBA-24.
  • the outline of gene recombination of this strain is summarized in Table 2.
  • Example 2 Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum HBA-22 (V80, wild type), and HBA-23 (V80A), HBA prepared in Comparative Example 1 of collismate-pyruvate lyase activity using a 4-hydroxybenzoic acid producing gene-introduced strain -24 (V80C) was compared for its chorismate-pyruvate lyase activity using ultrasonically disrupted cell lysate.
  • each of the above strains was added to A agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) Biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g, glucose 40 g, agar 15 g suspended in 1 L of distilled water] And left in the dark for 15 hours.
  • Each strain grown on the above plate was mixed with A liquid medium containing kanamycin 50 ⁇ g / ml [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) Biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g, glucose 40 g dissolved in 1 L of distilled water] Inoculated and aerobically shake cultured at 33 ° C for 15 hours.
  • Example 3 Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum HBA-22 (wild type) and HBA-23 (V80A) strains produced in Example 1 for producing 4-hydroxybenzoic acid from glucose using a 4-hydroxybenzoic acid-producing gene-introduced strain , HBA-24 (V80C) strain, agar medium containing kanamycin 50 ⁇ g / ml [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml, 0.02% (w / v) Biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g,
  • Corynebacterium glutamicum / 4-HBA production gene-introduced strain grown on the above plate was transformed into A liquid medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml , 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g and glucose 40 g dissolved in 1 L of distilled water] to 10 ml Furthermore, one platinum ear was inoculated into a test tube containing 2% calcium carbonate, and culture
  • the culture solution obtained by growing under the above conditions was centrifuged (4 ° C., 15,000 rpm, 10 minutes), and 4-HBA was quantified by HPLC using the obtained supernatant.
  • the HBA-23 (V80A) strain and the HBA-24 (V80C) strain were about 2.3 times and 1.6 times higher than the HBA-22 (wild type) strain, respectively.
  • the HBA production concentration is shown.
  • Example 4 Extraction of chromosomal DNA from bacteria belonging to the genus Providencia, cloning of 4-hydroxybenzoate production gene (chorismate-pyruvate lyase gene), construction of 4-hydroxybenzoate production gene expression plasmid, construction of 4-hydroxybenzoate production gene introduction strain Of site-directed mutagenesis of 4-hydroxybenzoic acid producing gene and production of 4-hydroxybenzoic acid from glucose by corynebacterium glutamicum 4-hydroxybenzoic acid producing gene introduced strain (1) Extraction of chromosomal DNA from microorganisms Extraction of chromosomal DNA from Providencia stuartii ATCC 25827 was performed using ATCC Medium No.
  • Extraction of chromosomal DNA from Providencia rustigianii JCM33953 is carried out by dissolving JCM Medium No.12 medium [Peptone 5 g, Beef extract 3 g, NaCl 5 g in 1 L of distilled water and adjusting the pH to 7.0. ] After inoculation using platinum ears, shake culture at 37 ° C until logarithmic growth, collect cells, and then extract DNA genome (Product name: GenomicPrepomicCells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) was used to collect chromosomal DNA from the collected cells according to the instruction manual.
  • Chromosomal DNA extraction from Escherichia coli K12KMG1655 was performed by inoculating LB mediumLB [Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 5 g in 1 ⁇ L of distilled water] using platinum ears and then logarithmically. After shaking culture at 37 ° C until the growth phase, the cells are collected and collected using the DNA genome extraction kit (trade name: GenomicPrepPCells and Tissue DNA Isolation Kit, manufactured by Amersham) according to the instruction manual Chromosomal DNA was recovered.
  • the gene sequence containing the ubiC gene to clone the ubiC gene SEQ ID NO: 11 (Providencia stuartii ubiC gene), SEQ ID NO: 12 (Providencia rustigianii ubiC gene), SEQ ID NO: 17 (Eshcerichia coli ubiC gene), and SEQ ID NO: Based on 18 (Cronobacter sakazakii ubiC gene), the following pairs of primers were synthesized and used respectively.
  • a-21 Providencia stuartii ubiC gene amplification primer (a-21); 5'- CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC-3 '(SEQ ID NO: 25) (B-21); 5'-CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-21) and (b-21).
  • Escherichia coli ubiC gene amplification primer (a-23); 5'- CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA -3 '(SEQ ID NO: 29) (B-23); 5'-CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • an NdeI restriction enzyme site is added to the primers (a-23) and (b-23).
  • Cronobacter sakazakii ubiC gene amplification primer (a-24); 5'- CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG -3 '(SEQ ID NO: 31) (B-24); 5'-CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • the primers (a-24) and (b-24) have an NdeI restriction enzyme site added.
  • chromosomal DNA extracted from Providencia rustigianii JCM 3953, Providencia stuartii ATCC 25827, Escherichia coli MG1655, and Cronobacter sakazakii JCM 1233 was used.
  • Actual PCR was performed using a Veriti thermal cycler (Applied Biosystems) and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent under the following conditions.
  • Reaction solution PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U / ⁇ l) 1 ⁇ l 5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg 2+ plus) 10 ⁇ l dNTP Mixture (2.5mM each) 4 ⁇ l Template DNA 1 ⁇ l (DNA content 1 ⁇ g or less) 2 primers as described above *) 1 ⁇ l each (final concentration 0.2 ⁇ M) Sterile distilled water 32 ⁇ l The above was mixed, and 50 ⁇ l of the reaction solution was subjected to PCR.
  • PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U / ⁇ l) 1 ⁇ l 5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg 2+ plus) 10 ⁇ l dNTP Mixture (2.5mM each) 4 ⁇ l Template DNA 1 ⁇ l (DNA content 1 ⁇ g or less) 2 primers as described above *) 1 ⁇ l each (final concentration 0.2 ⁇ M) Sterile distilled water 32 ⁇ l The above was mixed, and 50 ⁇ l of the reaction solution was subjected to PCR.
  • PCR cycle Denaturation process: 98 ° C 10 seconds Annealing process: 50 ° C 5 seconds Extension process: 68 ° C Providencia stuartii ubiC gene 32 seconds Providencia rustigianii ubiC gene 31 seconds Escherichia coli ubiC gene 30 seconds Cronobacter sakazakii ubiC gene 32 seconds The above was regarded as one cycle, and 30 cycles were performed.
  • the obtained ligation solution was transformed into Escherichia coli HST02 strain by the calcium chloride method [Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)], and an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [1% polypeptone, 0.5% yeast Extract, 0.5% sodium chloride, and 1.5% agar).
  • each of the growing strains on the medium was subjected to liquid culture by a conventional method, plasmid DNA was extracted from the culture solution, and each plasmid was cleaved with a restriction enzyme to confirm the inserted fragment.
  • the inserted fragment of about 0.5-kb in length is about 0.5-kb in the case of ubiC gene derived from Providencia rustigianii strain.
  • the inserted fragment was an ubiC gene derived from an Escherichia coli strain, an approximately 0.5-kb inserted fragment was observed, and when the inserted fragment was a ubiC gene derived from a Cronobacter sakazakii strain, an approximately 0.6-kb DNA fragment was observed.
  • the plasmid containing the ubiC gene from Providencia stuartii was named pHBA42
  • the plasmid containing the ubiC gene from Providencia rustigianii was named pHBA45
  • the plasmid containing the ubiC gene from Escherichia coli was named pHBA48
  • the plasmid containing the ubiC gene from Cronobacter sakazakii was named pHBA51. .
  • Providencia stuartii ubiC gene mutation introduction primer (a-25); 5'- gcaATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG -3 ' (SEQ ID NO: 33) (A-26); 5'- tgcATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG -3 ' (SEQ ID NO: 34) (B-25); 5'-TTCACGTAACCAATAATATTCACTGACAG-3 '(SEQ ID NO: 35)
  • pHBA48 a mutant in which the I (isoleucine) 79 site was replaced with A (alanine) and C (cysteine) was prepared by PCR to obtain a plasmid into which a site-specific mutation was introduced.
  • pHBA49 and pHBA50 were named pHBA49 and pHBA50, respectively.
  • SEQ ID NO: 17 Escherichia coli ubiC gene
  • Escherichia coli ubiC gene mutation introduction primer (a-29); 5'-gcaTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC-3 '(SEQ ID NO: 39) (A-30); 5'-tgcTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC-3 '(SEQ ID NO: 40) (B-29); 5'-TTCACGTAACCAGTAACGAGAC-3 '(SEQ ID NO: 41)
  • mutants in which the I79 site was replaced with A (alanine) and C (cysteine) were prepared by PCR, and plasmids into which site-specific mutations were introduced were obtained. They were named pHBA52 and pHBA53.
  • the following primers were synthesized and used based on SEQ ID NO: 18 (Cronobacter sakazakii ubiC gene) in order to introduce a mutation into the I79 site of the ubiC gene.
  • Cronobacter sakazakii ubiC gene mutation introduction primer (a-31); 5'-gcaCTGCTGTGCGGCGACG-3 '(SEQ ID NO: 42) (A-32); 5'-tgcCTGCTGTGCGGCGACG-3 '(SEQ ID NO: 43) (B-31); 5'- TTCGCGCAGCCAGTAGCG -3 '(SEQ ID NO: 44)
  • PCR was performed using a Veriti thermal cycler (Applied Biosystems) and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) as a reaction reagent under the following conditions.
  • Reaction solution PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U / ⁇ l) 1 ⁇ l 5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg 2+ plus) 10 ⁇ l dNTP Mixture (2.5mM each) 4 ⁇ l Template DNA 1 ⁇ l (DNA content 1 ⁇ g or less) 2 primers as described above *) 1 ⁇ l each (final concentration 0.2 ⁇ M) Sterile distilled water 32 ⁇ l The above was mixed, and 50 ⁇ l of the reaction solution was subjected to PCR.
  • PCR cycle Denaturation process: 98 ° C 10 seconds Annealing process: 50 ° C 5 seconds Extension process: 68 ° C Providencia stuartii (pHBA43, pHBA44) 339 seconds Providencia rustigianii (pHBA46, pHBA47) 338 seconds Escherichia coli (pHBA49, pHBA50) 337 seconds Cronobacter sakazakii (pHBA52, pHBA53) One cycle of 339 seconds or more was performed for 30 cycles.
  • the purified amplification product was phosphorylated using T4 Polynucleotide Kinase (Takara Bio Inc.) and then purified by NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up (Takara Bio Inc.).
  • the obtained phosphorylated DNA fragment was used for binding (self-ligation) with a DNA Ligation Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the obtained ligation solution was transformed with Escherichia coli HST02 by the calcium chloride method [J. Mol. Biol.
  • A represents a mutation to alanine
  • C represents a mutation to cysteine
  • V represents a valine mutation
  • I represents an isoleucine mutation
  • 80 represents amino acid number 80 and 79 represents amino acid number 79.
  • A represents a mutation to alanine
  • C represents a mutation to cysteine
  • V represents a valine mutation
  • I represents an isoleucine mutation
  • 80 represents amino acid number 80 and 79 represents amino acid number 79.
  • Corynebacterium glutamicum / 4-HBA production gene introduced strain obtained as described above (HBA-42, HBA-43, HBA-44, HBA-45, HBA-46, HBA-47, HBA-48, HBA-49, HBA-50, HBA-51, HBA-52, and HBA-53) are mixed with A agar medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H2O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml , 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g
  • Corynebacterium glutamicum / 4-HBA production gene-introduced strain grown on the above plate was transformed into A liquid medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin [(NH 2 ) 2 CO 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 7 g, KH 2 PO 4 0.5 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.5 g, 0.06% (w / v) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O + 0.042% (w / v) MnSO 4 ⁇ 2H 2 O 1 ml , 0.02% (w / v) biotin solution 1 ml, 0.01% (w / v) thiamin solution 2 ml, yeast extract 2 g, vitamin assay casamino acid 7 g and glucose 40 g dissolved in 1 L of distilled water] to 10 ml Furthermore, a platinum ear was inoculated into a test tube containing 2% calcium carbonate, followed
  • the recombinant HB-47 strain that highly expressed the V80C mutant of Providencia rustigianii-derived ubiC had the highest 4-HBA production ability in the culture supernatant. Based on the above, it was revealed by analysis of ubiC mutants derived from Pantoea ananatis, Providencia stuartii, Providencia rustigianii, and Cronobacter sakazakii that mutations in V80 (V80A, V80C) increased the activity of chorismate-pyruvate lyase.
  • the amino acid residue corresponding to V80 is I79 by homology comparison, but the same mutation (I79A, I79C) at the site is the same as above. It has been shown to increase chorismate-pyruvate lyase enzyme activity.
  • the above mutation at the site is an important mutation that increases the activity of many chorismate-pyruvate lyase enzymes, and a recombinant strain of Corynebacterium glutamicum that highly expresses the mutant is capable of producing 4-HBA. Proved to increase.
  • A represents a mutation to alanine
  • C represents a mutation to cysteine
  • V represents a valine mutation
  • I represents an isoleucine mutation
  • 80 represents amino acid number 80 and 79 represents amino acid number 79.
  • Corynebacterium glutamicum HBA-47 was deposited at the Patent Microbiology Depositary Center, Product Evaluation Technology Foundation, 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818) (Contract date: April 25, 2014, trust number: NITENBP-01849). This strain has been deposited internationally under the Budapest Treaty and is publicly available under the conditions set out in 37 CFR1.808.
  • 4-HBA can be produced from glucose or the like with practical efficiency using microorganisms.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

　下記の（Ａ）又は（Ｂ）の変異コリスメート－ピルベート リアーゼは、実用上十分に効率良く4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩を生産できるものである。 （Ａ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)においてアミノ酸番号８０のバリンが１又は複数個の他のアミノ酸に置換された変異コリスメート－ピルベート リアーゼ （Ｂ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、上記バリンと酵素学的に相同な位置のアミノ酸が１又は複数個の他のアミノ酸に置換された変異コリスメート－ピルベート リアーゼ

Description

高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４－ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
　本発明は、4－ヒドロキシ安息香酸又はその塩(以下、「4-HBA」と略称することがある)生産性を向上させるように改変された酵素変異体、この酵素変異体を高発現することにより4-HBA生産性が向上したコリネ型細菌形質転換体、及びこの形質転換体を用いた効率的な4-HBAの製造方法を提供する。
　地球温暖化や化石資源の枯渇問題を背景に、再生可能なバイオマス資源を原料とした化学品の製造は、低炭素社会の実現に向けた新しい産業として注目されている。
　4-HBAは、液晶のポリマー原料や、抗菌剤であるパラベンの合成原料等に利用されている有用な化学物質である。
　現在、4-HBAは、原油を原料として化学的に生産されている。化学的な4-HBAの製造方法は、たとえばフェノールと水酸化カリウムと二酸化炭素を用いて高圧条件下で反応させる方法などがある。
　こうした方法では、原料とするフェノールが化石原料に依存しているだけでなく、反応プロセス中で強アルカリや二酸化炭素、高温高圧条件を必要としており、製造過程において生じる有害な廃液が生じるなど、環境に多大な負荷を与えている。
　そのため、再生可能資源を原料として、省エネルギー、且つ、有害廃液を削減した、環境調和型のバイオ法による4-HBA製造技術の確立が強く望まれている。
　しかし、再生可能資源を原料としたバイオ法による4-HBA生産は、乳酸やエタノールの生産と比較して、原料となる糖からの代謝反応段数が非常に多いために生産性が低い。また、生産物である4-HBAによる菌の増殖阻害や、細胞毒性等の難点がある。このため、工業的生産は実現していない。
　4-HBAは、芳香族アミノ酸などの合成に関わるシキミ酸経路の中間体であるコリスミ酸からubiCによってコードされるコリスメート－ピルベート リアーゼによって合成されることが大腸菌を用いて明らかにされている（非特許文献1,2、特許文献1,2）。
　これまでに、大腸菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子(ubiC)を他種微生物であるKlebsiella pneumoniaeを宿主として導入し、4-HBAを生成する試みが報告されている（非特許文献3）。またシキミ酸経路を増強した大腸菌で4-HBAの発酵生産が報告されている（非特許文献4）。4-HBAによる増殖阻害や毒性回避を試みるため、4-HBA耐性株の選抜や、イオン交換樹脂添加培養が報告されているものの、4-HBAの生産性は実用上十分ではない（非特許文献2）。
　また、大腸菌以外のubiCについては、Rhodobacter sphaeroides由来のものが報告されているが、大腸菌を宿主として該遺伝子を高発現させた場合も、またRhodobacter sphaeroidesを宿主として該遺伝子を高発現させた場合も、いずれの形質転換体を用いても4-HBAの生成は低濃度であり実用上十分ではない（特許文献3）。また、大腸菌のubiC遺伝子欠損株を該遺伝子が相補可能と記載してあるが、酵素活性値や酵素諸性質に関する記述や他生物由来の酵素との比較に関する具体的な記述はいずれもない。
　大腸菌由来のUbiC酵素は、酵素学的な解析が詳細になされており、生成物である4-HBAによって強く阻害される（生成物阻害）ことが知られている（非特許文献2, 5）。したがって、4-HBA高生産のためには高活性なUbiCの取得、4-HBAによる生成物阻害に耐性なUbiCの取得が4-HBAの高生産株構築に極めて重要である。
J. Bacteriol., 174, 5309-5316 (1992) Microbiology, 140, 897-904 (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 985-988 (1995) Biotechnol. Bioeng., 76, 376-390 (2001) Biochimica et Biophysica Acta, 1594, 160-167 (2002)
米国特許6030819号 米国特許6114157号 特開2013-183048号
　本発明は、実用上十分に高い4-HBA生成活性を有する変異コリスメート－ピルベート リアーゼ酵素、この酵素を高発現することにより効率よく4-HBAを生産できる形質転換体、及び、この形質転換体を用いて効率よく4-HBAを製造できる方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、
（Ａ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)のアミノ酸番号８０のバリン、又は
（Ｂ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、上記バリンと酵素学的に相同な位置のアミノ酸
を他のアミノ酸に置換するような変異をこのubiC遺伝子に導入することにより、グルコースやコリスミ酸などから4-HBAを生産する能力が向上した変異コリスメート－ピルベート リアーゼが得られることを見出した。
　本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ、形質転換体、及び4-HBAの製造方法を提供する。
項１．　下記の（Ａ）又は（Ｂ）の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
（Ａ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)においてアミノ酸番号８０のバリンが１又は複数個の他のアミノ酸に置換された変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
（Ｂ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、上記バリンと酵素学的に相同な位置のアミノ酸が１又は複数個の他のアミノ酸に置換された変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
項２．　上記（Ｂ）の変異コリスメート－ピルベート リアーゼが、
(i)　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号８０のバリン（Ｖ）、
(ii)　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号７９のイソロイシン（Ｉ）、又は
(iii)　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号７９のイソロイシン（Ｉ）
が１又は複数個の他のアミノ酸に置換されたものである項１に記載の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ。
項３．　下記の(a)、(b)、又は(c)である項１に記載の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
(a)　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号２のアミノ酸配列からなるプロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号３のアミノ酸配列からなるプロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号４のアミノ酸配列からなるプロビデンシア スニービア（Providencia sneebia）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号５のアミノ酸配列からなるプロビデンシア レットゲリ（Providencia rettgeri）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号６のアミノ酸配列からなるプロビデンシア アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、若しくは配列番号７のアミノ酸配列からなるプロビデンシア バーホドグラナリエア（Providencia burhodogranariea）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、
　配列番号８のアミノ酸配列からなるエシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号７９のイソロイシン、又は
　配列番号９のアミノ酸配列からなるクロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号７９のイソロイシンを１個又は複数個の他のアミノ酸に置換した変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
(b)　置換により生成した上記アミノ酸部分を保持しつつ、配列番号１～９の何れかと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有する変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
(c)　配列番号１～９の何れかと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１～７の何れかのアミノ酸番号８０のバリン、又は配列番号８若しくは９のアミノ酸番号７９のイソロイシンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸を１個又は複数個の他のアミノ酸に置換した変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
項４．　置換により生成するアミノ酸が１個であり、このアミノ酸が、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギンである項１～３の何れかに記載の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ。
項５．　項１～４の何れかの変異コリスメート－ピルベート リアーゼをコードするＤＮＡを宿主のコリネ型細菌に導入した形質転換体。
項６．　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である項５に記載の形質転換体。
項７．　コリネバクテリウム　グルタミカム属細菌が、コリネバクテリウム　グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である項６に記載の形質転換体。
項８．　下記の（Ｃ）又は（Ｄ）の変異ＤＮＡを宿主のコリネ型細菌に導入した形質転換体。
（Ｃ）　配列番号１０の塩基配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)遺伝子において、塩基番号２４０～２４２のｇｔｃを、それがコードするアミノ酸とは異なる１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ
（Ｄ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼをコードする遺伝子において、上記ｇｔｃに対応する位置のＤＮＡ部分を、それがコードするアミノ酸とは異なる１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ
項９．　上記（Ｄ）の変異ＤＮＡが、
(iv)　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２４０～２４２のｇｔｃ、
(v)　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃ、又は
(vi)　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃ
を、それがコードするアミノ酸とは異なる１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡである項８に記載の形質転換体。
項１０．　下記の(d)、(e)、又は(f)である項８に記載の形質転換体。
(d)　配列番号１０の塩基配列からなるパントエア アナナティス由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１１の塩基配列からなるプロビデンシア スチュアルティイ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１２の塩基配列からなるプロビデンシア ラスティジアニイ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１３の塩基配列からなるプロビデンシア スニービア由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１４の塩基配列からなるプロビデンシア レットゲリ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１５の塩基配列からなるプロビデンシア アルカリファシエンス由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、若しくは配列番号１６の塩基配列からなるプロビデンシア バーホドグラナリエア由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２４０～２４２のｇｔｃをバリン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、
　配列番号１７の塩基配列からなるエシェリヒア コリ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃをイソロイシン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、又は
　配列番号１８の塩基配列からなるクロノバクター サカザキ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃをイソロイシン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、
(e)　置換により生成した上記ＤＮＡ部分を保持しつつ、配列番号１０～１８の何れかと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異ＤＮＡ、又は
(f)　配列番号１０～１８の何れかと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１０～１６の何れかの塩基番号２４０～２４２のｇｔｃをバリン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、又は配列番号１７若しくは１８の塩基番号２３７～２３９のａｔｃに対応するＤＮＡ部分をイソロイシン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ
（但し、配列番号１０～１６の何れかの塩基番号２４０～２４２のｇｔｃに対応するＤＮＡ部分は、配列番号１０～１６の何れかの塩基配列からなるＤＮＡがコードするコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸をコードするＤＮＡを指し、配列番号１７若しくは１８の塩基番号２３７～２３９のｇｔｃに対応するＤＮＡ部分は、配列番号１７若しくは１８の塩基配列からなるＤＮＡがコードするコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号７９のイソロイシンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸をコードするＤＮＡを指す）
項１１．　置換により生成するＤＮＡが、ｇｃａ、ｔｇｃ、ａｃｃ、ｔｃｃ、又はａａｃである項８～１０の何れかに記載の形質転換体。
項１２．　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である項８～１１の何れかに記載の形質転換体。
項１３．　コリネバクテリウム　グルタミカム属細菌が、コリネバクテリウム　グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である項１２に記載の形質転換体。
項１４．　コリネバクテリウム グルタミカム HBA-47（受託番号：NITE BP-01849）形質転換体。
項１５．　項５～１４の何れかに記載の形質転換体を、糖類、形質転換体が代謝によりコリスミ酸を生成しうる化合物、及びコリスミ酸、並びにそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の原料化合物を含む反応液中で培養する工程と、反応液中の4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩を回収する工程とを含む4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法。
項１６．　好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する項１５に記載の方法。
　本発明の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ、又はこの変異コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを導入したコリネ型細菌形質転換体を用いれば、糖類、形質転換体が代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物、コリスミ酸、又はそれらの塩から4-HBAを実用上十分に効率よく生産することができる。
4-ヒドロキシベンゾエートが４種の微生物（Corynebacterium glutamicum R、Escherichia coli JM109、Pseudomonas putida S12 ATCC700801、及びRhodobacter sphaeroides NBRC12203）の増殖に及ぼす影響を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（１）変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
　本発明の変異コリスメート－ピルベート リアーゼは、
（Ａ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)においてアミノ酸番号８０のバリンが他のアミノ酸に置換されたもの、又は
（Ｂ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、上記バリンと酵素学的に相同な位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたもの
である。
　上記（Ｂ）の変異コリスメート－ピルベート リアーゼとしては、
(i)　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号８０のバリン（Ｖ）、
(ii)　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号７９のイソロイシン（Ｉ）、又は
(iii)　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号７９のイソロイシン（Ｉ）
が他のアミノ酸に置換されたものが挙げられる。
　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼとしては、
配列番号２のアミノ酸配列からなるプロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ、配列番号３のアミノ酸配列からなるプロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ、配列番号４のアミノ酸配列からなるプロビデンシア スニービア（Providencia sneebia）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ、配列番号５のアミノ酸配列からなるプロビデンシア レットゲリ（Providencia rettgeri）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ、配列番号６のアミノ酸配列からなるプロビデンシア アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ、配列番号７のアミノ酸配列からなるプロビデンシア バーホドグラナリエア（Providencia burhodogranariea）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼなどが挙げられる。
　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼとしては、配列番号８のアミノ酸配列からなるエシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼなどが挙げられる。
　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼとしては、配列番号９のアミノ酸配列からなるクロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼなどが挙げられる。
　上記バリン又はイソロイシンは、他の１個のアミノ酸で置換されていてもよく、他の複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、又は２個）のアミノ酸で置換されてもよいが、１個のアミノ酸で置換されているのが好ましい。中でも、上記バリン又はイソロイシンが、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）又はアスパラギン(Ｎ)に置換されているのが好ましく、アラニン（Ａ）、又はシステイン（Ｃ）に置換されているのがより好ましい。
　また、上記バリン又はイソロイシンの置換に代えて、上記バリン又はイソロイシンの欠失、上記バリン又はイソロイシンのＮ末端側に隣接する１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、若しくは２個）のアミノ酸の欠失、又は上記バリン又はイソロイシンに隣接する位置への１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、若しくは２個）のアミノ酸の挿入によっても、コリスメート－ピルベート リアーゼ活性を増大させることができる。
　また、本発明の変異コリスメート－ピルベート リアーゼには、変異により生じた上記のアミノ酸部分（例えば、上記アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン）を保持しつつ、配列番号１～９の何れかと９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドからなる変異コリスメート－ピルベート リアーゼが含まれる。即ち、この変異コリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、配列番号１～７の何れかのアミノ酸番号８０のバリン、又は配列番号８若しくは９のアミノ酸番号７９のイソロイシンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸は、バリン又はイソロイシン以外の例えばアラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギンなどである。
　本発明において、「酵素学的に相同である」とは、当該ポリペプチドの酵素機能に対して同等に寄与することを意味する。アミノ酸配列のアラインメントにおいて同等の位置に存在するアミノ酸が、酵素機能に対して同等に寄与するアミノ酸となる。
　本発明において、アミノ酸配列、及び塩基配列の同一性は、GENETYX ver.8（GENETYX 株式会社ゼネティックス製）により算出した値である。
　コリスメート－ピルベート リアーゼは、コリスミ酸からピルビン酸を脱離させて4-HBAを生成する反応、及びその逆反応を触媒する酵素である。
　コリスメート－ピルベート リアーゼ活性は、「Microbiology,140, 897-904(1994)」に記載の方法を改変して測定できる。簡単に説明すると、試験用液に被験酵素を添加し、50mM トリス-HCl (pH 7.5)、0.5 mM chorismate Ba salt、0.2 mM NADH、0.2 M NaCl、5 Unitラクテートデヒドロゲナーゼを含ませ、33℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度の減少を追跡することにより反応初速度を測定する。chorismate Ba saltを添加しない系についても同様に反応を行い、バックグラウンド値とする。両測定値の差をコリスメート－ピルベート リアーゼ活性とし、酵素及び基質添加に依存したNADH由来の340 nmの経時的、直線的な吸光度減少が認められた場合に、コリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有すると判定する。酵素活性の1 unitは、1分間あたり1マイクロモルの4-HBAを産生せしめる酵素量と定義し、酵素反応の初速度から算出する。
　また、本発明の変異コリスメート－ピルベート リアーゼには、配列番号１～９の何れかと９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１～７の何れかのアミノ酸番号８０のバリン、又は配列番号８若しくは９のアミノ酸番号７９のイソロイシンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸を、他のアミノ酸（例えば、上記アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン、特に、アラニン、又はシステイン）に置換した変異コリスメート－ピルベート リアーゼが含まれる。
（２）コリネバクテリウム属細菌形質転換体
　上記説明した変異コリスメート－ピルベート リアーゼをコードする変異ＤＮＡを宿主のコリネ型細菌に導入することにより、4-HBAを高効率で生産できる形質転換体が得られる。
　このような変異ＤＮＡとしては、
（Ｃ）　配列番号１０の塩基配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)遺伝子において、塩基番号２４０～２４２のｇｔｃ、又は
（Ｄ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼをコードする遺伝子において、上記ｇｔｃに対応する位置のＤＮＡ部分
を、それがコードするアミノ酸とは異なる１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、又は２個）のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡが挙げられる。
　上記（Ｄ）の変異ＤＮＡとしては、
(iv)　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２４０～２４２のｇｔｃ、
(v)　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃ、又は
(vi)　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃ
を、１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、又は２個）の他のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡが挙げられる。
　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子としては、配列番号１１の塩基配列からなるプロビデンシア スチュアルティイ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１２の塩基配列からなるプロビデンシア ラスティジアニイ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１３の塩基配列からなるプロビデンシア スニービア由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１４の塩基配列からなるプロビデンシア レットゲリ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１５の塩基配列からなるプロビデンシア アルカリファシエンス由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１６の塩基配列からなるプロビデンシア バーホドグラナリエア由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子などが挙げられる。
　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子としては、配列番号１７の塩基配列からなるエシェリヒア コリ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子が挙げられる。
　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子としては、配列番号１８の塩基配列からなるクロノバクター サカザキ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子などが挙げられる。
　特に、１個のアミノ酸をコードするＤＮＡで置換するのが好ましい。中でも、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギンをコードするＤＮＡで置換するのが好ましく、アラニン、又はシステインをコードするＤＮＡで置換するのが好ましい。
　アラニンをコードするＤＮＡとしてはｇｃａが挙げられ、システインをコードするＤＮＡとしてはｔｇｃが挙げられ、トレオニンをコードするＤＮＡとしてはａｃｃが挙げられ、セリンをコードするＤＮＡとしてはｔｃｃが挙げられ、アスパラギンをコードするＤＮＡとしてはaacが挙げられる。
　また、変異ＤＮＡには、上記置換により生じた、バリン又はイソロイシン以外のアミノ酸（例えば、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン、特に、アラニン、又はシステイン）をコードするＤＮＡ部分を保持しつつ、配列番号１０～１８の何れかと９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異ＤＮＡも含まれる。
　また、変異ＤＮＡには、上記置換により生じたバリン又はイソロイシン以外のアミノ酸（例えば、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン、特に、アラニン、又はシステイン）をコードするＤＮＡ部分を保持しつつ、配列番号１０～１８の何れかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異ＤＮＡも含まれる。
　本発明において、「ストリンジェントな条件」は、6×SSCの塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50～60℃の温度条件下、16時間ハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCの塩濃度の溶液中で洗浄を行う条件をいう。
　また、変異ＤＮＡには、配列番号１０～１６の何れかと９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１０～１６の何れかの塩基番号２４０～２４２のｇｔｃに対応するＤＮＡ部分を、１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、又は２個）のバリン以外のアミノ酸、特に１個のアミノ酸（例えば、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン、特に、アラニン、又はシステイン）をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡが含まれる。
　「配列番号１０～１６の何れかの塩基番号２４０～２４２のｇｔｃに対応するＤＮＡ部分」は、配列番号１０～１６の何れかの塩基配列からなるＤＮＡがコードするアミノ酸配列からなるコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分をいう。
　また、変異ＤＮＡには、配列番号１７又は１８と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１７又は１８の塩基番号２３７～２３９のａｔｃに対応するＤＮＡ部分を、１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、又は２個）のイソロイシン以外のアミノ酸、特に１個のアミノ酸（例えば、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン、特に、アラニン、又はシステイン）をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡが含まれる。
　「配列番号１７又は１８の塩基番号２３７～２３９のａｔｃに対応するＤＮＡ部分」は、配列番号１７又は１８の塩基配列からなるＤＮＡがコードするアミノ酸配列からなるコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号７９のイソロイシンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分をいう。
　また、変異ＤＮＡには、配列番号１０～１６の何れかとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１０～１６の何れかの塩基番号２４０～２４２のｇｔｃに対応するＤＮＡ部分を、１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、又は２個）のバリン以外のアミノ酸、特に１個のアミノ酸（例えば、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン、特に、アラニン、又はシステイン）をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡが含まれる。
　また、変異ＤＮＡには、配列番号１７又は１８とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１７又は１８の塩基番号２３７～２３９のａｔｃに対応するＤＮＡ部分を、１個又は複数個（例えば、２～８個、２～６個、２～３個、又は２個）のイソロイシン以外のアミノ酸、特に１個のアミノ酸（例えば、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギン、特に、アラニン、又はシステイン）をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡが含まれる。
　コリスメート－ピルベート リアーゼをコードするＤＮＡと９０％以上の同一性を有するか、又はストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする類縁体ＤＮＡは、例えば、元となるＤＮＡの塩基配列に基づき常法に従い設計したプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーションにより、他生物種のＤＮＡライブラリーから選択することができ、これにより高確率でコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが得られる。
宿主
　コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
　コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム　グルタミカム、コリネバクテリウム　エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム　アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム　ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム　アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。
　中でも、安全でかつ4-HBA生産性が高い点で、コリネバクテリウム　グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
　中でも、R株（FERM BP-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
　なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
　ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。この株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
　アースロバクター属菌としては、アースロバクター　グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
　マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。これらの株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、公に利用可能である。
　マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス　フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス　ルテウス（Micrococcus leuteus）(例えばNo. 240株（FERM P-13222）)、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス　ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
　また、コリネ型細菌は、野生株の他に、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。例えば、ラクテート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：LDH）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、マレートデヒドロゲナーゼ（malate dehydrogenase）などの遺伝子の破壊株が挙げられる。中でも、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。この遺伝子破壊株は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されていることにより、ピルビン酸から乳酸への代謝経路が遮断されている。中でも、コリネバクテリウム グルタミカムの、特にR（FERM BP-18976）株のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊株が好ましい。
　このような遺伝子破壊株は、遺伝子工学的手法により常法に従い作製できる。例えば、WO2005／010182A1に、乳酸デヒドロゲナーゼ破壊株、及びその作製方法が記載されている。
　図１に示した通り、本発明者らは、コリネ型細菌が、他細菌に比べて、4-HBAに対する耐性が極めて高いことを見出した。また、コリネ型細菌は、他の好気性細菌に比べて、溶菌しにくい。この点で、コリネ型細菌は本発明方法による4-HBA製造に好適である。
形質転換体のためのベクターの構築
　PCRで増幅したコリスメート－ピルベート リアーゼ酵素をコードするDNAは、それぞれ、宿主で増幅できる適切なベクターにクローニングすればよい。
　プラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、ブレビバクテリウム　ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58－67699号公報〕、〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及び〔Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16:265-267（1985）〕、コリネバクテリウム　グルタミカム　ATCC3058由来のpHM1519　〔Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903（1984）〕及びpCRY30 〔Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57:759-764 （1991）〕、コリネバクテリウム　グルタミカム　T250由来のpCG4〔特開昭57－183799号公報〕、〔Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.、159:306-311 （1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50〔特開昭62-166890〕、pEK0、pEC5、pEKEx1 〔Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 （1991）〕等が挙げられる。
　好ましいプロモーターとしては、コリネバクテリウム　グルタミカムR由来のグリセルアルデヒド3－フォスフェートデヒドロゲナーゼＡ遺伝子(gapA)のプロモーターPgapA、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh）のプロモーターPmdh、ラクテートデヒドロゲナーゼA遺伝子（ldhA）のプロモーターPldhA等が挙げられ、中でも、PgapAが好ましい。
　好ましいターミネーターとしては、大腸菌rRNAオペロンのrrnB T1T2 ターミネーター、大腸菌のtrpA ターミネーター、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のtrp ターミネーター等が挙げられ、中でも、rrnB T1T2 ターミネーターが好ましい。
形質転換
　形質転換方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の方法として、例えば、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などがあげられる。なかでも、コリネ型細菌には、電気パルス法が好適であり、電気パルス法は公知の方法により行うことができる（Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54: 443-447 (1990)）。
　形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用いて培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類、及びその他の栄養物質等を含有する天然培地、または合成培地を用いることができる。
　炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、でんぷん、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質または糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコールが挙げられる。炭素源は、1種を単独で使用でき、または2種以上を今後してもよい。培地中のこれら炭素源の濃度は、通常、約0.1～10（w/v %）とすればよい。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機または有機アンモニウ化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ－アミン、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も利用できる。窒素源は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、10（w/v %）とすればよい。
　無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、または炭酸カルシウム等があげられる。これら無機塩は、1種を単独で使用してもよく、また2種以上を混合して使用してもよい。培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.1～1（w/v %）とすればよい。
　栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、または動植物もしくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が得られるが、通常、約0.1～10（w/v %）とすればよい。更に、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、例えばビオチン、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　培地のpHは約6～8が好ましい。
　好ましい微生物培養培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。
　培養温度は約15～45℃とすればよく、培養時間は約1～7日とすればよい。
宿主染色体遺伝子の破壊又は欠失
　宿主のコリネ型細菌は、その染色体上に存在する4-ヒドロキシベンゾエート ヒドロキシラーゼ遺伝子が、破壊され、又は欠失していることが好ましい。4-ヒドロキシベンゾエートヒドロキシラーゼを破壊することにより生成した4-HBAの代謝が抑えられて、4-HBAの生産性が向上すると共に副生成物が少なくなる。
　遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
（３）4-HBAの製造方法
　上記説明した本発明の形質転換体を、糖類、形質転換体が代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物、及びコリスミ酸、並びにそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の原料化合物を含有する反応液中で反応させる工程と、反応液中の4-HBAを回収する工程とを含む方法により4-HBAを製造することができる。
　原料化合物は形質転換体が細胞内に取り込める化合物であることが必要であり、また、植物に多く含まれる等、工業的に利用し易いものであることが望ましい。
　糖類としては、グルコースが好適であるが、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれる。このような糖類としては、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトースなどの単糖類；セロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオースなどの二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。
　また、代謝によりコリスミ酸を生成し得る化合物としては、キナ酸、シキミ酸などが挙げられる。
　また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙などを糖化酵素などで糖化した、グルコースなどの複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。中でも、原料化合物としては、グルコース、コリスミ酸、キナ酸、シキミ酸が好ましい。
微生物の増殖
　反応に先立ち、形質転換体を好気条件下で、温度約25～38℃で、約12～48時間培養して増殖させることが好ましい。
培養用培地
　反応に先立つ形質転換体の好気的培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。
　炭素源として、糖類（グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖；澱粉のような多糖；糖蜜等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
　炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ－アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。窒素源の培地中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1～10（w/v ％）とすればよい。
　無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（w/v ％）とすればよい。
　栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地中の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約0.1～10（w/v ％）とすればよい。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　培地のpHは約6～8が好ましい。
　具体的な好ましいコリネ型細菌用培地としては、A培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、BT培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
反応液
　反応液としては、炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する天然反応液または合成反応液を用いることができる。
　炭素源としては、上記説明した原料化合物又はそれを含む糖蜜や糖化液などを用いればよい。また、炭素源として、糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。
　炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
　反応液中の原料化合物の濃度は、約1～20（w/v ％）が好ましく、約2～10（w/v ％）がより好ましく、約2～5（w/v ％）がさらにより好ましい。
　また、原料化合物を含む全炭素源の濃度は、約2～5（w/v ％）とすればよい。
　窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用できる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、NZ-アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。窒素源の反応液中の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約0.1～10（w/v ％）とすればよい。
　無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩は、１種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の反応液中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常、約0.01～1（w/v ％）とすればよい。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　反応液のｐＨは約6～8が好ましい。
　具体的な好ましいコリネ型細菌用反応液としては、前述したBT培地等が挙げられる。これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
反応条件
　反応温度、即ち形質転換体の生存温度は、約20～50℃が好ましく、約25～47℃がより好ましい。上記温度範囲であれば、効率良く4-HBAを製造できる。
　また、反応時間は、約1～7日間が好ましく、約1～3日間がより好ましい。
　培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
　反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよい。本発明の形質転換体自体の4-HBA生産能力は、好気的条件下の方が高い。しかし、好気的条件下では形質転換体が増殖するため、原料化合物が増殖のために消費され、その分、4-HBA製造効率が低下する。
　従って、好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で反応を行うのが好ましい。本発明で増殖しないことには、実質的に増殖しないこと、又は殆ど増殖しないことが含まれる。例えば、微生物の増殖に必須の化合物であるビオチン、チアミンなどのビタミン類、窒素源などの１種以上を欠乏、或いは制限させた反応液を用いることにより、形質転換体の増殖を回避または抑制できる。
　また、還元条件では、コリネ型細菌は実質的に増殖しないため、原料化合物が増殖のために消費されない分、4-HBA製造効率が高くなる。
　還元条件は、反応液の酸化還元電位で規定される。反応液の酸化還元電位は、約－200 mV～－500 mVが好ましく、約－150 mV～－500 mVがより好ましい。
　反応液の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、BROADLEY　JAMES社製、ORP　Electrodes）を用いて測定できる。
　還元条件にある反応液の調整方法は、公知の方法を制限なく使用できる。例えば、反応液の液体媒体として、蒸留水などの代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate－reducing　bacteria，In The Prokaryotes，A Handbook on Habitats Isolation and　Identification of Bacteria，Ed．by Starr，M．P．et al., p926-940， Berlin，Springer Verlag．）や「農芸化学実験書　第三巻、京都大学農学部　農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望する還元条件下の水溶液を得ることができる。
　具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約10 mmHg以下、好ましくは約5 mmHg以下、より好ましくは約3 mmHg以下の減圧下で、約1～60分程度、好ましくは約5～40分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応液用水溶液を作成することができる。
　また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調整することもできる。
　これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調整方法である。
　還元条件下で反応させる場合は、反応中も反応液を還元条件に維持することが好ましい。反応途中での還元条件を維持するために、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明の好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のpH維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
4-HBAの回収
　上記のようにして培養することにより、反応液中に4-HBAが生産される。反応液を回収することにより4-HBAを回収できるが、さらに、公知の方法で4-HBAを反応液から分離することもできる。そのような公知の方法として、晶析法、膜分離法、有機溶媒抽出法、各種吸着法（イオン交換樹脂、合成吸着材などを使用）等が挙げられる。
（４）コリスメート－ピルベート リアーゼ活性の向上方法
　本発明は、
（Ａ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)においてアミノ酸番号８０のバリン、又は
（Ｂ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、上記バリンと酵素学的に相同な位置のアミノ酸
を１個又は複数個の他のアミノ酸に置換することにより、コリスメート－ピルベート リアーゼ活性を向上、又は増大させる方法を包含する。
　コリスメート－ピルベート リアーゼ、及び変異の方法は、上記説明した通りである。
　本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
　次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。
［実施例1］
4-HBA生産遺伝子のクローニングと発現系の構築(野生型、及び変異型)
(1) Pantoea ananatis由来の染色体DNAの抽出
　パントエア アナナティス（Pantoea ananatis）LMG 20103からの染色体DNA抽出は、LMG Bacteria Culture Medium No.1 培地 [Beef extract 1 g, Yeast extract 2 g, Peptone 5 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.4に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで28℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
(2) Pantoea ananatis由来の4-HBA生産遺伝子のクローニング
　4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべくubiC遺伝子を含む遺伝子配列、配列番号10（Pantoea ananatis ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記の一対のプライマーを合成し、使用した。

Pantoea ananatis ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-1）；　5’- CTCTCATATGACGCAAGACCCGCT -3’
（配列番号19）
（b-1）；　5’- CTCTCATATGTTAACCTTGATCACGATAGAGCG -3’
（配列番号20）
尚、プライマー（a-1）及び（b-1）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。

　実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl)　1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus)　　　　 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each)　　　　　　　　　4μl
鋳型DNA　　　　　　　　　　　　　　　　　　1μl（DNA含有量1μg以下）
上記記載の2種プライマー　　　　　　　　各々1μl（最終濃度　0.2μM）
滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　 32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。

PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃　10秒
アニーリング過程　　　：50℃　 5秒
エクステンション過程　：68℃　 31秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。

　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Pantoea ananatis株由来ubiC遺伝子約0.5-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
(3) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）発現プラスミドの構築
　上記項(2)に示したPCRにより増幅したPantoea ananatis株由来ubiC遺伝子を含む約0.5-kb DNA断片10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209 [国際公開 WO2012/033112]　2μlを各々制限酵素NdeIで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
　得られたライゲーション液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、Pantoea ananatis株由来ubiC遺伝子約0.5-kb の挿入断片が、認められた。
　Pantoea ananatis株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA22と命名した。
(4) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）導入株の構築
　上述のプラスミドpHBA22を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン 50 μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpHBA22の導入が認められた。
　得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）HBA-22と命名した。
(5) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）の部位特異的変異導入プラスミドの構築
　上述のプラスミドpHBA22を用いて、V80部位を2種のアミノ酸に置換した変異体をInverse PCR法によって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを得、これらをそれぞれpHBA23, pHBA24と命名した。
　PCRに際して、ubiC遺伝子のV80部位に変異を導入すべく、配列番号10（Pantoea ananatis ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記のプライマーを合成し、使用した。
Pantoea ananatis ubiC遺伝子変異導入用プライマー
（a-2）；　5’- CGAGAAgcaATTCTCTACGGGGATG -3’（配列番号21）
（b-2）；　5’- CAGCCAGAAACGCTGATCG -3’　　 （配列番号22）
（a-3）；　5’- tgcATTCTCTACGGGGATGAGG -3’　（配列番号23）
（b-3）；　 5’- TTCTCGCAGCCAGAAACGCTG -3’　（配列番号24）
　実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 　　　 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each)　　　　　　　　 4μl
鋳型DNA　　　　　　　　　　　　　　　　　 1μl（DNA含有量1μg以下）
上記記載の2種プライマー*)　　　　　　　　各々1μl（最終濃度　0.2μM）
滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pHBA23(V80A)を増幅する場合はプライマー(a-2)と(b-2)の組み合わせ、pHBA24(V80C)を増幅する場合はプライマー(a-3)と(b-3)の組み合わせで行った。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃　10秒
アニーリング過程　　　：50℃　5秒
エクステンション過程　：68℃　338秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Pantoea ananatis株由来ubiC遺伝子を含む約5.6-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。

　精製した増幅産物をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社製）を用いてリン酸化処理した後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。得られたリン酸化処理済みDNA断片を用いてDNA Ligation Kit（タカラバイオ株式会社製）により結合（セルフライゲーション）させた。得られたライゲーション液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析することにより、ubiC遺伝子のV80部位への変異導入を確認した。
　得られたプラスミドをpHBA23,pHBA24と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、表１にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
(6) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）導入株の構築
　上述のプラスミドpHBA22～pHBA24を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpHBA22～pHBA24の導入が認められた。
　得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）HBA-22～HBA-24と命名した。尚、本株の遺伝子組換えの概要は、表２にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例2］
コリネバクテリウム　グルタミカム　4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子導入株による、コリスメート－ピルベート リアーゼ活性比較
　実施例1において作製したコリネバクテリウム　グルタミカム HBA-22(V80, 野生型), 及びHBA-23(V80A), HBA-24(V80C)について、超音波破砕した細胞破砕液を用いて、コリスメート－ピルベート リアーゼ活性を比較した。
　具体的には、上記各株を、カナマイシン50 μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖した各株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解]10 mlの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて15時間、好気的に振とう培養を行った。
　このようにして培養増殖されたそれぞれの菌体を、遠心分離（4℃、8,000 rpm, 10分）により回収した。超音波処理で菌体細胞を破砕した後、遠心分離（4℃、15,000 rpm, 20分）によって得た細胞破砕上清を粗酵素液として用い、以下の方法によりコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を測定した。
　粗酵素液、50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 mM chorismate Ba salt, 0.2 mM NADH, 0.2 M NaCl, 5 Unit lactate dehydrogenaseを混合し、33℃で反応を行い、NADHに由来する340 nmの吸光度減少を追跡し、反応初速度を解析した。反応初速度とタンパク濃度から比活性を算出した（1分間あたり、1マイクロモルの4-HBAを産生せしめる酵素量を1 unitと定義した）。（なお、反応液をフィルター濾過後、生じた4-HBAはHPLCによって4-HBAのピークを直接検出し（Cosmosil C18 ARII（ナカライテスク）、移動相20%メタノール、0.07% 過塩素酸）、両アッセイ法による定量性に違いがないことを別途確認した。）
　その結果、表３に示すように、V80(野生型)と比較して、V80A変異体、及びV80C変異体が高い活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例3］
コリネバクテリウム　グルタミカム　4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子導入株による、グルコースからの4-ヒドロキシ安息香酸製造
　実施例1において作製したコリネバクテリウム　グルタミカム HBA-22（野生型）、及びHBA-23(V80A)株、HBA-24(V80C)株を、カナマイシン50 μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖したCorynebacterium glutamicum/4-HBA生産遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解]10 mlに更に2%炭酸カルシウムの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃、24時間、200 rpmの条件下にて好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖して得られた培養液を遠心分離（4℃、15,000 rpm, 10分）し、得られた上清液を用いて4-HBAをHPLCによって定量した。
　その結果、表４に示すように、HBA-23(V80A)株、HBA-24(V80C)株が、HBA-22(野生型)株よりも、それぞれ約2.3倍、約1.6倍の高い4-HBA生産濃度を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例4］
Providencia属細菌由来の染色体DNAの抽出、4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）のクローニング、4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子発現プラスミドの構築、4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子導入株の構築、4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子の部位特異的変異導入株の構築、及び、コリネバクテリウム　グルタミカム　4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子導入株による、グルコースからの4-ヒドロキシ安息香酸製造
(1) 微生物からの染色体DNAの抽出
　プロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）ATCC 25827からの染色体DNA抽出は、ATCC Medium No.3培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを6.8に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　プロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）JCM 3953からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.12培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　エシェリヒア コリ（Escherichia coli）K12 MG1655からの染色体DNA抽出は、LB培地 [Tryptone　10 g、Yeast extract　5 g、NaCl　5 gを蒸留水1 Lに溶解] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
　クロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）JCM 1233からの染色体DNA抽出は、JCM Medium No.12培地 [Peptone 5 g, Beef extract 3 g, NaCl 5 gを蒸留水1 Lに溶解後、pHを7.0に調整] に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで37℃で振盪培養し、菌体を集菌後、DNAゲノム抽出キット(商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製)を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体DNAを回収した。
(2) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）のクローニング
　4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）をコードするubiC遺伝子を含むDNA断片を以下のPCR法により増幅した。
　PCRに際して、ubiC遺伝子をクローン化するべくubiC遺伝子を含む遺伝子配列、配列番号11（Providencia stuartii ubiC遺伝子）、配列番号12（Providencia rustigianii ubiC遺伝子）、配列番号17（Eshcerichia coli ubiC遺伝子）、及び配列番号18（Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記の対のプライマーを合成し、それぞれ使用した。
Providencia stuartii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-21）； 5’- CTCTCATATGGATGAAACGCTTTTTATCTCTCAC -3’（配列番号25）
（b-21）； 5’- CTCTCATATGTCCCTCCATTTGTTGTGCTC -3’　 （配列番号26）
尚、プライマー（a-21）及び（b-21）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。
Providencia rustigianii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-22）；　5’- CTCTCATATGCATGAAACAATTTTTACCCATCATCC -3’
（配列番号27）
（b-22）；　5’- CTCTCATATGGATTATGTTAGATAGTTATCTATATGCAGGTG -3’
（配列番号28）
尚、プライマー（a-22）及び（b-22）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。
Escherichia coli ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-23）；　5’- CTCTCATATGTCACACCCCGCGTTAA -3’　（配列番号29）
（b-23）；　5’- CTCTCATATGTTAGTACAACGGTGACGCC -3’（配列番号30）
尚、プライマー（a-23）及び（b-23）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。
Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子増幅用プライマー
（a-24）；　5’- CTCTCATATGTCCCATCCCGCGCTGAG -3’　（配列番号31）
（b-24）；　5’- CTCTCATATGTATTCTGCGTCAGGCTCCAC -3’（配列番号32）
尚、プライマー（a-24）及び（b-24）にはNdeI制限酵素部位が付加されている。
　鋳型DNAは、Providencia rustigianii JCM 3953、 Providencia stuartii ATCC 25827、 Escherichia coli MG1655、Cronobacter sakazakii JCM 1233から抽出した染色体DNAを用いた。
　実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 　　　 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each)　　　　　　　　 4μl
鋳型DNA　　　　　　　　　　　　　　　　　 1μl（DNA含有量1μg以下）
上記記載の2種プライマー*)　　　　　　　　各々1μl（最終濃度　0.2μM）
滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*)　Providencia stuartii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-21) と (b-21) の組み合わせ、Providencia rustigianii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-22) と (b-22) の組み合わせ、Escherichia coli ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-23) と (b-23) の組み合わせ、Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子を増幅する場合はプライマー(a-24) と (b-24) の組み合わせで行った。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃　　　 10秒
アニーリング過程　　　：50℃　　　 5秒
エクステンション過程　：68℃
Providencia stuartii ubiC遺伝子　　32秒
Providencia rustigianii ubiC遺伝子  31秒
Escherichia coli ubiC遺伝子 　　　　30秒
Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子　　32秒

　以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子、Providencia rustigianii ubiC遺伝子、Escherichia coli ubiCの場合に約0.5-kbのDNA断片が検出できた。Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子の場合は約0.6-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
(3) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）発現プラスミドの構築
　上記項に示したPCRにより増幅したProvidencia stuartii株由来ubiC遺伝子、Providencia rustigianii ubiC遺伝子、Escherichia coli ubiC由来の約0.5-kbの各DNA断片、或いはCronobacter sakazakii ubiC遺伝子由来の約0.6-kbのDNA断片を含む10μl及びPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRB209 [国際公開 WO2012/033112]　2μlを各々制限酵素Nde Iで切断し、70℃で10分処理させることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにT4 DNAリガーゼ10×緩衝液　1μl 、T4 DNAリガーゼ　（タカラバイオ株式会社製） 1 unitの各成分を添加し、滅菌蒸留水で10μl にして、15℃で3時間反応させ、結合させた。
　得られたライゲーション液を、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)〕によりエシェリヒア コリHST02株を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。
　各々培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素でそれぞれ切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドpCRB209約5.1-kbのDNA断片に加え、Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Providencia rustigianii株由来ubiC遺伝子の場合、長さ約0.5-kb の挿入断片が、Escherichia coli 株由来のubiC遺伝子の場合、約0.5-kbの挿入断片が、Cronobacter sakazakii 株由来のubiC遺伝子の場合、約0.6-kbのDNA断片が認められた。
　Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA42、Providencia rustigianii 株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA45、Escherichia coli 株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA48、Cronobacter sakazakii株由来ubiC遺伝子を含むプラスミドをpHBA51と命名した。
(4) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の部位特異的変異導入プラスミドの構築
　また、上述のプラスミドpHBA42を用いて、V80部位をA(アラニン)、C(システイン)に置換した変異体をInverse PCR法によって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを得、これらをそれぞれpHBA43、pHBA44と命名した。
　PCRに際して、ubiC遺伝子のV80部位に変異を導入すべく、配列番号11（Providencia stuartii ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記のプライマーを合成し、使用した。
Providencia stuartii ubiC遺伝子変異導入用プライマー
（a-25）；　5’- gcaATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG -3’
（配列番号33）
（a-26）；　5’- tgcATTATGTATGGTGATAATATTCCATGGTTACTTG -3’
（配列番号34）
（b-25）；　5’- TTCACGTAACCAATAATATTCACTGACAG -3’   （配列番号35）
　同様に、上述のプラスミドpHBA45を用いて、V80部位をA(アラニン)、C(システイン)に置換した変異体をInverse PCR法によって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを得、これらをそれぞれpHBA46、pHBA47と命名した。
　PCRに際して、ubiC遺伝子のV80部位に変異を導入すべく、配列番号12（Providencia rustigianii ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記のプライマーを合成し、使用した。
Providencia rustigianii ubiC遺伝子変異導入用プライマー
（a-27）；　5’- ATTATGTATGGGGATAATATTCCGTGG -3’（配列番号36）
（b-27）；　5’- gcaTTCTCGCAACCAGTAACGTTG -3’　（配列番号37）
（b-28）；　5’- tgcTTCTCGCAACCAGTAACGTTG -3’　（配列番号38）
　同様に、上述のプラスミドpHBA48を用いて、I(イソロイシン)79部位をA(アラニン)、C(システイン)に置換した変異体をPCR法によって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを得、これらをそれぞれpHBA49、pHBA50と命名した。
　PCRに際して、ubiC遺伝子のI(イソロイシン)79部位に変異を導入すべく、配列番号17（Escherichia coli ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記のプライマーを合成し、使用した。
Escherichia coli ubiC遺伝子変異導入用プライマー
（a-29）；　5’- gcaTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC -3’（配列番号39）
（a-30）；　5’- tgcTTGTTATGTGCCGATGGTGAAC -3’（配列番号40）
（b-29）；　5’- TTCACGTAACCAGTAACGAGAC -3’（配列番号41）
　同様に、上述のプラスミドpHBA51を用いて、I79部位をA(アラニン)、C(システイン)に置換した変異体をPCR法によって作成し、部位特異的変異が導入されたプラスミドを得、これらをそれぞれpHBA52、pHBA53と命名した。
　PCRに際して、ubiC遺伝子のI79部位に変異を導入すべく、配列番号18（Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子）を基に、それぞれ下記のプライマーを合成し、使用した。
Cronobacter sakazakii ubiC遺伝子変異導入用プライマー
（a-31）；　5’- gcaCTGCTGTGCGGCGACG -3’（配列番号42）
（a-32）；　5’- tgcCTGCTGTGCGGCGACG -3’（配列番号43）
（b-31）；　5’- TTCGCGCAGCCAGTAGCG -3’ （配列番号44）
　実際のPCRは、Veritiサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.25 U/μl) 1μl
5x PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+ plus) 　　　 10μl
dNTP Mixture (2.5mM each)　　　　　　　　 4μl
鋳型DNA　　　　　　　　　　　　　　　　　 1μl（DNA含有量1μg以下）
上記記載の2種プライマー*)　　　　　　　　各々1μl（最終濃度　0.2μM）
滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　32μl
以上を混合し、この50μlの反応液をPCRにかけた。
*) pHBA43を増幅する場合はプライマー(a-25)と(b-25)の組み合わせ、pHBA44を増幅する場合はプライマー(a-26)と(b-25)の組み合わせ、pHBA46を増幅する場合はプライマー(a-27)と(b-27)の組み合わせ、pHBA47を増幅する場合はプライマー(a-27)と(b-28)の組み合わせ、pHBA49を増幅する場合はプライマー(a-29)と(b-29)の組み合わせ、pHBA50を増幅する場合はプライマー(a-30)と(b-29)の組み合わせ、pHBA52を増幅する場合はプライマー(a-31)と(b-31)の組み合わせ、pHBA53を増幅する場合はプライマー(a-32)と(b-31)の組み合わせで行った。
PCRサイクル：
デナチュレーション過程：98℃　10秒
アニーリング過程　　　：50℃　5秒
エクステンション過程　：68℃
Providencia stuartii（pHBA43, pHBA44）　　339秒
Providencia rustigianii（pHBA46, pHBA47） 338秒
Escherichia coli（pHBA49, pHBA50）　　　　337秒
Cronobacter sakazakii（pHBA52, pHBA53）　 339秒
以上を1サイクルとし、30サイクル行った。
　上記で生成した反応液10μlを0.8%アガロースゲルにより電気泳動を行い、Providencia stuartii株由来ubiC遺伝子の場合約5.7-kb、Providencia rustigianii株由来ubiC遺伝子の場合約5.6-kb、Escherichia coli株由来ubiC遺伝子の場合約5.6-kb、Cronobacter sakazakii株由来ubiC遺伝子の場合約5.7-kbのDNA断片が検出できた。各DNA断片はNucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。
　精製した増幅産物をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社製）を用いてリン酸化処理した後、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up （タカラバイオ株式会社製）によって精製した。得られたリン酸化処理済みDNA断片を用いてDNA Ligation Kit（タカラバイオ株式会社製）により結合（セルフライゲーション）させた。得られたライゲーション液を、塩化カルシウム法 [J. Mol. Biol. 53:159-162 (1970)] によりエシェリヒア コリHST02を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地〔1% ポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% 塩化ナトリウム、および1.5% 寒天〕に塗布した。培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドの塩基配列をシーケンス解析することにより、ubiC遺伝子のV80またはI79部位への変異導入を確認した。
　得られたプラスミドをpHBA43, pHBA44, pHBA46, pHBA47, pHBA49, pHBA50,pHBA52, pHBA53と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、表5にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　導入した変異の種類＊の欄のAはアラニンへの変異を表し、Cはシステインへの変異を表す。また、Vはバリンの変異を表し、Iはイソロイシンの変異を表す。また、80はアミノ酸番号８０を表し、79はアミノ酸番号７９を表す。
(5) 4-ヒドロキシ安息香酸生産遺伝子（コリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子）導入株の構築
　上述のプラスミドpHBA42, pHBA43, pHBA44, pHBA45, pHBA46, pHBA47, pHBA48, pHBA49, pHBA50, pHBA51,pHBA52、及び、pHBA53を用いて、電気パルス法 [Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447(1990) 及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185(1993)] により、コリネバクテリウム グルタミカムR株を形質転換し、カナマイシン 50μg/mlを含むA寒天培地に塗布した。
　この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドDNAを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入プラスミドを確認した。この結果、上記で作製のプラスミドpHBA42, pHBA43, pHBA44, pHBA45, pHBA46, pHBA47, pHBA48, pHBA49, pHBA50, pHBA51,　pHBA52、及び、pHBA53の導入が認められた。
　得られた株をコリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）HBA-42、HBA-43、HBA-44、HBA-45、HBA-46、HBA-47、HBA-48、HBA-49、HBA-50、HBA-51、HBA-52、及び、HBA-53と命名した。尚、本プラスミドの遺伝子組換えの概要は、表６にまとめて示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　導入した変異の種類＊の欄のAはアラニンへの変異を表し、Cはシステインへの変異を表す。また、Vはバリンの変異を表し、Iはイソロイシンの変異を表す。また、80はアミノ酸番号８０を表し、79はアミノ酸番号７９を表す。
　上記のように得られたCorynebacterium glutamicum/4-HBA生産遺伝子導入株（HBA-42、HBA-43、HBA-44、HBA-45、HBA-46、HBA-47、HBA-48、HBA-49、HBA-50、HBA-51、HBA-52、及び、HBA-53）を、カナマイシン50 μg/mlを含むA寒天培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 g、寒天 15 gを蒸留水1Lに懸濁]に塗布し、33℃、15時間暗所に静置した。
　上記のプレート上で増殖したCorynebacterium glutamicum/4-HBA生産遺伝子導入株をカナマイシン50 μg/mlを含むA液体培地[(NH2)2CO 2 g、(NH4)2SO4 7 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、0.06% (w/v) FeSO4・7H2O + 0.042% (w/v) MnSO4・2H2O 1 ml、0.02% (w/v) biotin solution 1 ml、0.01% (w/v) thiamin solution 2 ml、yeast extract 2 g、vitamin assay casamino acid 7 g、glucose 40 gを蒸留水1Lに溶解]10 mlに更に2%炭酸カルシウムの入った試験管に一白金耳植菌し、33℃にて24時間、好気的に振とう培養を行った。
　上記条件で増殖して得られた培養液を遠心分離（4℃、15,000 rpm, 10分）し、得られた上清液を用いて4-HBAをHPLCによって定量した。
　この結果、Corynebacterium glutamicum HBA-42～53株は、いずれも表７のように目的とする4-HBAを生成した。Providencia stuartii 由来のubiC変異導入株のうち、HBA-43(V80A), HBA-44(V80C)株による4-HBA生成能は、HBA-42(野生型)よりも増大し、優れていた。Providencia rustigianii 由来のubiC変異導入株のうち、HBA-46(V80A), HBA-47(V80C)株による4-HBA生成能は、HBA-45(野生型)よりも増大し、優れていた。Escherichia coli 由来のubiC変異導入株のうち、HBA-49(I79A), HBA-50(I79C)よる4-HBA生成能は、HBA-48（野生型)よりも増大し、優れていた。
　Cronobacter sakazakii由来のubiC変異導入株のうち、HBA-52(I79A), HBA-53(I79C)株による4-HBA生成能は、HBA-51(野生型)よりも増大し、優れていた。　また、同様の実験をCorynebacterium glutamicum野生株（空ベクターのみを有するコントロール）に対して行った際、4-HBA生成は認められなかった。
　培養上清中の4-HBA生成能が最も優れていたのは、Providencia rustigianii由来ubiCのV80C変異体を高発現させた組換え株であった（HBA-47株）。
　以上より、V80における変異(V80A, V80C)がコリスメート－ピルベート リアーゼ酵素活性を増大させることが、Pantoea ananatis、Providencia stuartii、Providencia　rustigianii、及びCronobacter sakazakii由来のubiC変異体解析により明らかとなった。
　更に、Escherichia coli、及び、Cronobacter sakazakii由来ubiCの場合は、相同性比較によって、上記V80に相当するアミノ酸残基がI79であるが、該部位における同様の変異(I79A, I79C)が、上記同様にコリスメート－ピルベート リアーゼ酵素活性を増大させることが明らかとなった。該部位における上記変異は、多くのコリスメート－ピルベート リアーゼ酵素活性を増大せしめる、重要な変異であり、且つ、該変異体を高発現させたコリネバクテリウム　グルタミカムの組み換え株は、4-HBAの生成能が増大することが証明された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　導入した変異の種類＊の欄のAはアラニンへの変異を表し、Cはシステインへの変異を表す。また、Vはバリンの変異を表し、Iはイソロイシンの変異を表す。また、80はアミノ酸番号８０を表し、79はアミノ酸番号７９を表す。
　コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）HBA-47は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託した（受託日：2014年4月25日、受託番号：NITE BP-01849）。この株は、ブダペスト条約の下で国際寄託されており、37 CFR1.808に規定される条件の下で公に利用可能である。
　本発明を利用すれば、微生物を用いて実用的な効率でグルコース等から4-HBAを製造することができる。

Claims (16)

  1. 　下記の（Ａ）又は（Ｂ）の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
    （Ａ）　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)においてアミノ酸番号８０のバリンが１又は複数個の他のアミノ酸に置換された変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
    （Ｂ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、上記バリンと酵素学的に相同な位置のアミノ酸が１又は複数個の他のアミノ酸に置換された変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
  2. 　上記（Ｂ）の変異コリスメート－ピルベート リアーゼが、
    (i)　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号８０のバリン（Ｖ）、
    (ii)　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号７９のイソロイシン（Ｉ）、又は
    (iii)　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼにおいて、アミノ酸番号７９のイソロイシン（Ｉ）
    が１又は複数個の他のアミノ酸に置換されたものである請求項１に記載の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ。
  3. 　下記の(a)、(b)、又は(c)である請求項１に記載の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
    (a)　配列番号１のアミノ酸配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号２のアミノ酸配列からなるプロビデンシア スチュアルティイ（Providencia stuartii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号３のアミノ酸配列からなるプロビデンシア ラスティジアニイ（Providencia rustigianii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号４のアミノ酸配列からなるプロビデンシア スニービア（Providencia sneebia）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号５のアミノ酸配列からなるプロビデンシア レットゲリ（Providencia rettgeri）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、配列番号６のアミノ酸配列からなるプロビデンシア アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、若しくは配列番号７のアミノ酸配列からなるプロビデンシア バーホドグラナリエア（Providencia burhodogranariea）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリン、
    　配列番号８のアミノ酸配列からなるエシェリヒア コリ（Escherichia coli）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号７９のイソロイシン、又は
    　配列番号９のアミノ酸配列からなるクロノバクター サカザキ（Cronobacter sakazakii）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号７９のイソロイシンを１個又は複数個の他のアミノ酸に置換した変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
    (b)　置換により生成した上記アミノ酸部分を保持しつつ、配列番号１～９の何れかと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有する変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
    (c)　配列番号１～９の何れかと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１～７の何れかのアミノ酸番号８０のバリン、又は配列番号８若しくは９のアミノ酸番号７９のイソロイシンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸を１個又は複数個の他のアミノ酸に置換した変異コリスメート－ピルベート リアーゼ
  4. 　置換により生成するアミノ酸が１個であり、このアミノ酸が、アラニン、システイン、トレオニン、セリン、又はアスパラギンである請求項１～３の何れかに記載の変異コリスメート－ピルベート リアーゼ。
  5. 　請求項１～４の何れかの変異コリスメート－ピルベート リアーゼをコードするＤＮＡを宿主のコリネ型細菌に導入した形質転換体。
  6. 　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である請求項５に記載の形質転換体。
  7. 　コリネバクテリウム　グルタミカム属細菌が、コリネバクテリウム　グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　下記の（Ｃ）又は（Ｄ）の変異ＤＮＡを宿主のコリネ型細菌に導入した形質転換体。
    （Ｃ）　配列番号１０の塩基配列からなるパントエア アナナティス（Pantoea ananatis）由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ(ubiC)遺伝子において、塩基番号２４０～２４２のｇｔｃを、それがコードするアミノ酸とは異なる１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ
    （Ｄ）　その他のコリスメート－ピルベート リアーゼをコードする遺伝子において、上記ｇｔｃに対応する位置のＤＮＡ部分を、それがコードするアミノ酸とは異なる１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ
  9. 　上記（Ｄ）の変異ＤＮＡが、
    (iv)　プロビデンシア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２４０～２４２のｇｔｃ、
    (v)　エシェリヒア属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃ、又は
    (vi)　クロノバクター属細菌由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃ
    を、それがコードするアミノ酸とは異なる１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡである請求項８に記載の形質転換体。
  10. 　下記の(d)、(e)、又は(f)である請求項８に記載の形質転換体。
    (d)　配列番号１０の塩基配列からなるパントエア アナナティス由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１１の塩基配列からなるプロビデンシア スチュアルティイ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１２の塩基配列からなるプロビデンシア ラスティジアニイ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１３の塩基配列からなるプロビデンシア スニービア由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１４の塩基配列からなるプロビデンシア レットゲリ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、配列番号１５の塩基配列からなるプロビデンシア アルカリファシエンス由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子、若しくは配列番号１６の塩基配列からなるプロビデンシア バーホドグラナリエア由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２４０～２４２のｇｔｃをバリン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、
    　配列番号１７の塩基配列からなるエシェリヒア コリ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃをイソロイシン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、又は
    　配列番号１８の塩基配列からなるクロノバクター サカザキ由来のコリスメート－ピルベート リアーゼ遺伝子の塩基番号２３７～２３９のａｔｃをイソロイシン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、
    (e)　置換により生成した上記ＤＮＡ部分を保持しつつ、配列番号１０～１８の何れかと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異ＤＮＡ、又は
    (f)　配列番号１０～１８の何れかと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつコリスメート－ピルベート リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１０～１６の何れかの塩基番号２４０～２４２のｇｔｃをバリン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ、又は配列番号１７若しくは１８の塩基番号２３７～２３９のａｔｃに対応するＤＮＡ部分をイソロイシン以外の１個又は複数個のアミノ酸をコードするＤＮＡ部分に置換した変異ＤＮＡ
    （但し、配列番号１０～１６の何れかの塩基番号２４０～２４２のｇｔｃに対応するＤＮＡ部分は、配列番号１０～１６の何れかの塩基配列からなるＤＮＡがコードするコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号８０のバリンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸をコードするＤＮＡを指し、配列番号１７若しくは１８の塩基番号２３７～２３９のｇｔｃに対応するＤＮＡ部分は、配列番号１７若しくは１８の塩基配列からなるＤＮＡがコードするコリスメート－ピルベート リアーゼのアミノ酸番号７９のイソロイシンと酵素学的に相同である位置のアミノ酸をコードするＤＮＡを指す）
  11. 　置換により生成するＤＮＡが、ｇｃａ、ｔｇｃ、ａｃｃ、ｔｃｃ、又はａａｃである請求項８～１０の何れかに記載の形質転換体。
  12. 　宿主のコリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である請求項８～１１の何れかに記載の形質転換体。
  13. 　コリネバクテリウム　グルタミカム属細菌が、コリネバクテリウム　グルタミカムR(FERM BP-18976)、ATCC13032、又はATCC13869である請求項１２に記載の形質転換体。
  14. 　コリネバクテリウム グルタミカム HBA-47（受託番号：NITE BP-01849）形質転換体。
  15. 　請求項５～１４の何れかに記載の形質転換体を、糖類、形質転換体が代謝によりコリスミ酸を生成しうる化合物、及びコリスミ酸、並びにそれらの塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の原料化合物を含む反応液中で培養する工程と、反応液中の4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩を回収する工程とを含む4-ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法。
  16. 　好気的、かつ形質転換体が増殖しない条件下で形質転換体を培養する請求項１５に記載の方法。
PCT/JP2015/063738 2014-05-14 2015-05-13 高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４－ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法 WO2015174446A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016519285A JP6327654B2 (ja) 2014-05-14 2015-05-13 高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４−ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
US15/309,332 US10221409B2 (en) 2014-05-14 2015-05-13 Highly active mutant enzyme for producing 4-hydroxybenzoic acid or salt thereof
CN201580024075.6A CN106459958B (zh) 2014-05-14 2015-05-13 使高活性突变型酶高表达的棒状细菌转化体及使用它的4-羟基苯甲酸或其盐的制造方法
EP15793452.2A EP3147360B1 (en) 2014-05-14 2015-05-13 Coryneform bacterium transformant having highly active mutant enzyme highly expressed therein, and process for producing 4-hydroxybenzoic acid or salt thereof using the same
KR1020167032000A KR102305413B1 (ko) 2014-05-14 2015-05-13 고활성 변이형 효소를 고발현시킨 코리네형 세균 형질 전환체 및 이를 이용하는 4-히드록시 벤조산 또는 그 염의 제조 방법
US16/244,809 US10738296B2 (en) 2014-05-14 2019-01-10 Transformant for producing 4-hydroxybenzoic acid or salt thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-100875 2014-05-14
JP2014100875 2014-05-14

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/309,332 A-371-Of-International US10221409B2 (en) 2014-05-14 2015-05-13 Highly active mutant enzyme for producing 4-hydroxybenzoic acid or salt thereof
US16/244,809 Division US10738296B2 (en) 2014-05-14 2019-01-10 Transformant for producing 4-hydroxybenzoic acid or salt thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015174446A1 true WO2015174446A1 (ja) 2015-11-19

Family

ID=54479983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/063738 WO2015174446A1 (ja) 2014-05-14 2015-05-13 高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４－ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10221409B2 (ja)
EP (1) EP3147360B1 (ja)
JP (1) JP6327654B2 (ja)
KR (1) KR102305413B1 (ja)
CN (1) CN106459958B (ja)
WO (1) WO2015174446A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017088708A (ja) * 2015-11-06 2017-05-25 住友ベークライト株式会社 ポリアミド樹脂およびポリアミド樹脂の製造方法
WO2017169399A1 (ja) * 2016-03-28 2017-10-05 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 形質転換体及びそれを用いるプロトカテク酸又はその塩の製造方法
EP3663277A1 (de) 2018-12-07 2020-06-10 Covestro Deutschland AG Verfahren zur herstellung einer hydroxyverbindung durch decarboxylierung
WO2020114925A1 (de) 2018-12-07 2020-06-11 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung einer hydroxyverbindung durch decarboxylierung in anwesenheit einer brönsted-base
WO2020114927A1 (de) 2018-12-07 2020-06-11 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung einer hydroxyverbindung durch decarboxylierung in abwesenheit eines katalysators
WO2024100776A1 (ja) * 2022-11-08 2024-05-16 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 ４－ヒドロキシ安息香酸を生成するヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3130664A4 (en) * 2014-04-08 2018-04-25 Green Phenol Development Co., Ltd. Coryneform bacterium transformant and method for producing 4-hydroxybenzoic acid or salt thereof used in same
CN108795968A (zh) * 2017-05-03 2018-11-13 华东理工大学 一种类球红细菌高产菌株的遗传转化方法
KR102334456B1 (ko) * 2020-06-08 2021-12-03 코스맥스 주식회사 판토에아 아나나티스 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012063862A1 (ja) * 2010-11-10 2012-05-18 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
JP2012183048A (ja) * 2011-03-08 2012-09-27 Kyowa Hakko Bio Co Ltd ４−ヒドロキシ安息香酸関連物質の製造法
KR20150054237A (ko) * 2013-11-11 2015-05-20 한국과학기술원 파라-하이드록시벤조익산 생성능이 향상된 코리스민산-파이루베이트 라이에이즈 변이 단백질 및 그 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6114157A (en) 1998-09-25 2000-09-05 General Electric Company Method for increasing total production of 4-hydroxybenzoic acid by biofermentation
US6030819A (en) 1998-09-28 2000-02-29 General Electric Company Genetically engineered microorganisms and method for producing 4-hydroxybenzoic acid

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012063862A1 (ja) * 2010-11-10 2012-05-18 グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合 コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
JP2012183048A (ja) * 2011-03-08 2012-09-27 Kyowa Hakko Bio Co Ltd ４−ヒドロキシ安息香酸関連物質の製造法
KR20150054237A (ko) * 2013-11-11 2015-05-20 한국과학기술원 파라-하이드록시벤조익산 생성능이 향상된 코리스민산-파이루베이트 라이에이즈 변이 단백질 및 그 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALLAGHER T.: "Protein packing interactions and polymorphy of chorismate lyase from E. Coli", JOURNAL OF CRYSTAL GROWTH, vol. 23 2, no. 1-4, November 2001 (2001-11-01), pages 215 - 20, XP004300514 *
SIEBERT M. ET AL.: "Formation of 4-hydroxybenzoate in Escherichia coli: characterization of the ubic gene and its encoded enzyme chorismate pyruvate-lyase", MICROBIOLOGY, vol. 140, no. 4, 14 April 1994 (1994-04-14), pages 897 - 904, XP055236711 *
SMITH N. ET AL.: "Structural analysis of ligand binding and catalysis in chorismate lyase", ARCH BIOCHEM BIOPHYS., vol. 445, no. 1, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 72 - 80, XP024942954 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017088708A (ja) * 2015-11-06 2017-05-25 住友ベークライト株式会社 ポリアミド樹脂およびポリアミド樹脂の製造方法
WO2017169399A1 (ja) * 2016-03-28 2017-10-05 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 形質転換体及びそれを用いるプロトカテク酸又はその塩の製造方法
JPWO2017169399A1 (ja) * 2016-03-28 2018-09-06 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 形質転換体及びそれを用いるプロトカテク酸又はその塩の製造方法
US20190119664A1 (en) * 2016-03-28 2019-04-25 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Transformant, and method for producing protocatechuic acid or salt thereof using same
US10961526B2 (en) 2016-03-28 2021-03-30 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Transformant, and method for producing protocatechuic acid or salt thereof using same
EP3663277A1 (de) 2018-12-07 2020-06-10 Covestro Deutschland AG Verfahren zur herstellung einer hydroxyverbindung durch decarboxylierung
WO2020114925A1 (de) 2018-12-07 2020-06-11 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung einer hydroxyverbindung durch decarboxylierung in anwesenheit einer brönsted-base
WO2020114928A1 (de) 2018-12-07 2020-06-11 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung einer hydroxyverbindung durch decarboxylierung
WO2020114927A1 (de) 2018-12-07 2020-06-11 Covestro Deutschland Ag Verfahren zur herstellung einer hydroxyverbindung durch decarboxylierung in abwesenheit eines katalysators
WO2024100776A1 (ja) * 2022-11-08 2024-05-16 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 ４－ヒドロキシ安息香酸を生成するヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体

Also Published As

Publication number Publication date
KR102305413B1 (ko) 2021-09-27
EP3147360B1 (en) 2021-11-17
EP3147360A1 (en) 2017-03-29
US10738296B2 (en) 2020-08-11
EP3147360A4 (en) 2017-10-11
KR20170002451A (ko) 2017-01-06
CN106459958B (zh) 2020-08-04
JP6327654B2 (ja) 2018-05-23
US20170073658A1 (en) 2017-03-16
US20190136222A1 (en) 2019-05-09
US10221409B2 (en) 2019-03-05
JPWO2015174446A1 (ja) 2017-04-20
CN106459958A (zh) 2017-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6327654B2 (ja) 高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４−ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
JP6327653B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４−ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
JP4451393B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法
JP5960701B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるバリンの製造方法
JP6564929B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４−アミノ安息香酸又はその塩の製造方法
JP5932649B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
CN103228784B (zh) 棒状细菌转化体及使用该转化体的苯酚的制造方法
JP5887277B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるフェノールの製造方法
JP5940985B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるアニリンの製造方法
JP7171759B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体およびそれを用いる２－フェニルエタノールの製造方法
JP6294309B2 (ja) アニリン生産性の向上したコリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるアニリンの製造方法
JP2007295809A (ja) コリネ型細菌形質転換体による高効率な有機化合物の製造方法
JP5296166B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体による高効率な有機化合物の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15793452

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016519285

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15309332

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20167032000

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015793452

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015793452

Country of ref document: EP