WO2015147251A1 - 発酵食品抽出組成物 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an extract composition extracted from fermented food and the like, for example, fermented buckwheat and the like. More specifically, the present invention relates to a fermented food extract composition containing at least acetylcholine and propionyl choline and exhibiting an antihypertensive effect and a vasodilator action upon oral administration and a method for extracting the same. The present invention also relates to a food or pharmaceutical composition containing the extract composition as an active ingredient.
  • the present inventors have conducted research on fermented foods, particularly fermented products of buckwheat germ extract, and found that freeze-dried powder of the fermented product exhibits ACE inhibitory action, functional food and functional consisting of the powder The beverage was reported (Patent Document 1), and also the method of fractionating this ACE inhibitor and the fraction separated by this method were also reported. (Patent Document 2) After that, the present inventor develops a lactic acid fermented product (fermented buckwheat flour) of a crushed product of buckwheat plant having higher functionality, and isolates and purifies the blood pressure lowering action and the vasodilator action active ingredient contained in the fermented matter.
  • Fermented buckwheat flour crushed product of buckwheat plant having higher functionality
  • Patent Document 3 On the other hand, so far, various reports have been made on buckwheat-derived compounds having a vasodilating action and compositions containing them.
  • the inventor further conducted intensive studies on the blood pressure lowering action and the vasodilator active ingredient contained in fermented buckwheat, and fractionated the vasodilator active ingredient different from the active ingredient of Patent Document 3 above. And as a result of identifying and confirming the component contained in the said fraction, it discovered that it contained the quaternary alkyl ammonium compound which mainly made the several choline ester which contains an acetylcholine and a propionyl choline at least.
  • acetylcholine is known to be an essential substance for life activity as a mammalian neurotransmitter. Also, in 1929, an antihypertensive substance different from histamine was isolated from the spleen of a horse, and it was chemically identified that the active substance was acetylcholine. (Non-patent document 1) Thus, the presence of acetylcholine in animal tissues has been known for a long time. Furthermore, it has been clarified that the ergot hypotensive substance is acetylcholine, and it has been confirmed that fungi produce acetylcholine.
  • Non-patent document 2 Acetylcholine is contained in food plants, edible fungi, royal jelly, milk, etc. Acetylcholine is also present in Bacillus subtilis and yeast, and Lactobacillus plantarum, a kind of lactic acid bacteria, produced acetylcholine. There is also a report that was confirmed by a biological assay. (Non-patent documents 3 to 7)
  • Butyrylcholine was discovered from brain extracts in 1954 (Non-patent Document 14) and has been shown to be present in arthropods and molluscs along with acetylcholine and propionyl choline. (Non-patent document 11)
  • urokanoyl choline is structurally determined from a kind of the oyster crayfish, ⁇ -dimethylacroyl choline (senecioyl choline) from one kind of a clam mussel, acroyl choline from a kind of anchovy, and imidazole propionyl choline from a kind of a clam mussel .
  • Non-patent documents 15 to 18 However, to date, the presence of choline esters in fermented food has not been chemically confirmed at all, and neither extraction nor fractionation methods have been reported or suggested.
  • Yoshiki Momoki Acetylcholine in plants, Chemical regulation of plants, 30 (1), 49-61 (1995) Yuichiro Kawashima, The roots of acetylcholine and non-neuronal acetylcholine, Basic aging study, 34 (4), 12-24 (2010) Masato Shibata et al., The factor for increasing blood flow in royal jelly, Pharmaceutical Journal, 98 (2), 139-145 (1978) Whittaker VP. Acetycholine in Milk. Nature 181: 856-857, 1958. Stephenson M, Rowatt E. The production of acetylcholine by a strain of Lactobacillus plantarum. J Gen Microbiol 1 (3): 279-298, 1947.
  • An object of the present invention is to provide a novel fermented food extract having an antihypertensive action and a vasodilating action and useful as a functional health food or pharmaceutical composition, or the active ingredient contained in the extract or the extract.
  • the present invention is to provide a functional health food or pharmaceutical composition containing at least a part thereof as an active ingredient.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems, and made the present invention. That is, as a result of repeating researches on fermented foods, in particular, components contained in lactic acid fermented product of buckwheat plant (fermented buckwheat), it succeeded in separating active components exhibiting extremely remarkable blood pressure lowering action and vasodilator action. Furthermore, several active ingredients in it were identified to complete the present invention.
  • a fermented food extract composition which contains at least acetylcholine and propionyl choline, and exhibits oral blood pressure lowering action and vasodilator action when administered orally
  • the fermented food is a kind selected from the group consisting of fermented buckwheat, black vinegar, yogurt, natto, and sake.
  • the present invention is [5] A food or pharmaceutical composition comprising the extract composition according to any one of [1] to [4] as an active ingredient, [6] The food or pharmaceutical composition according to [5], which further contains at least one member selected from the group of tyrosine and ⁇ -aminobutyric acid (GABA) as an active ingredient, and, [7] The food or pharmaceutical composition according to [5] or [6], further comprising at least one selected from the group of lactic acid, acetic acid and citric acid. About.
  • the present invention [8] (1) A step of suspending the supernatant obtained by centrifuging the suspension obtained by suspending the fermented buckwheat lyophilizate or concentrate in acetone, shaking and stirring (step 1), (2) a step of eluting the reduced-pressure concentrate using a solid phase extraction cartridge filled with a carrier to which a phenyl group is bound, using acid-containing water as an elution solution (step 2); (3) A step of fractionating and purifying the eluate using a column (PFP column) packed with a carrier to which a pentafluorophenyl group is bound and using acidic methanol-containing water as a mobile phase (step 3) A method for producing a fermented food extract composition according to [1], which comprises the steps of and, [9] (1) In step 2, using a solid phase extraction cartridge (GL Science InertSep) (registered trademark) as a solid phase extraction cartridge, using water containing 0.01% formic acid as an elution solution, (2)
  • a fermentation comprising at least acetylcholine and propionyl choline, which is produced by the production method according to [8] or [9], and is characterized by having an antihypertensive action and a vasodilator action in oral administration. It relates to a food extract composition.
  • the novel fermented food extract of the present invention has remarkable blood pressure lowering action and vasodilation action, and is useful as an active ingredient of functional health food or pharmaceutical composition.
  • FIG. 1 is a chart of detection peaks showing a change in elution behavior of acetylcholine associated with a change in methanol content in the component separation condition examination test of a fermentation buckwheat solid phase extract using a PFP column.
  • FIG. 2 is a chart of detection peaks showing a change in elution behavior of acetylcholine accompanying a change in acid content in the component separation condition examination test of a fermentation buckwheat solid phase extract using a PFP column.
  • FIG. 1 is a chart of detection peaks showing a change in elution behavior of acetylcholine associated with a change in methanol content in the component separation condition examination test of a fermentation buckwheat solid phase extract using a PFP column.
  • FIG. 2 is a chart of detection peaks showing a change in elution behavior of acetylcholine accompanying a change in acid content in the component separation condition examination test of a fermentation buckwheat solid phase
  • FIG. 3 is a chart of detected peaks showing the elution behavior of acetylcholine in the purified fermented buckwheat with a change in methanol content under fixed conditions of acid content (0.01%) in the component separation condition examination test of the fermented buckwheat solid phase extract, similarly is there.
  • FIG. 4 similarly shows that when the methanol content is further finely varied (38%, 36%, 33%) under the acid content (0.01%) fixed condition in the component separation condition examination test of the fermented fowl fern solid phase extract.
  • It is a chart of a detection peak which shows the elution behavior of acetylcholine in a fermentation buckwheat purified material with changes in methanol content under fixed conditions of acid content (0.01%).
  • FIG. 5 similarly, when separation temperatures in water containing 0.01% formic acid and 33% methanol were set to 30 ° C. and 40 ° C., in the component separation condition examination test of the fermentation buckwheat flour solid phase extract, It is a chart which shows the elution behavior of the acetylcholine in the fermentation buckwheat refined
  • FIG. 6 is a graph showing the results of the blood vessel isometric tension measurement test of the identified choline compound.
  • FIG. 7 is a graph showing systolic blood pressure change after administration of an identified choline compound.
  • FIG. 8-1 is a mass spectrum of lactylcholine in LC-MS analysis of gel filtrate.
  • FIG. 8-2 is a mass spectrum of lactylcholine in an LC-MS / MS analysis test of gel filtrate.
  • FIG. 9-1 is also a mass spectrum of levrylcholine in the LC-MS analysis test of the gel filtrate.
  • FIG. 9-2 is also a mass spectrum of levrylcholine in a LC-MS / MS analysis test of gel filtrate.
  • the inventor further conducted research on the vasodilator component in fermented buckwheat, developed a new fractionation and purification method, and succeeded in fractionating and purifying the vasodilator component in fermented buckwheat.
  • the fermented buckwheat used in fractionation and purification according to the present invention is acidic at pH 3.6 and exhibits vasodilator activity from 0.5 ⁇ g / mL to a 12-week-old male SHR thoracic aortic vessel preparation with an EC 50 of 8.30 ⁇ g / mL Met.
  • sodium hydroxide solution was added to the fermented buckwheat and left at pH 12 at room temperature, the vasodilator activity was lost in 0.5 hours.
  • the crude acetone extract of fermented buckwheat lyophilizate was purified by gel filtration chromatography to compare the activity. As a result, a vasodilator action was observed in the fraction containing substances of relatively low molecular weight as judged from the elution time. Since the vasodilator component of fermented buckwheat is basic and inactivated, purification with a cation exchange resin operated under acidic conditions was examined. As a result, a relatively strong vasodilator action was observed in the hydrochloric acid-eluted fraction in the strongly acidic cation exchange resin treatment. This result is presumed to be due to the fact that the fermented buckwheat vasodilation component interacts with the sulfonic acid group, which is the exchange group having a negative charge on the resin, because it has a positive charge.
  • a step of suspending the supernatant obtained by suspending the fermented buckwheat lyophilizate or concentrate in acetone and centrifuging after shaking and stirring (step 1), the vacuum concentrate is treated with phenyl group Eluting using an acid-containing water as an eluent using a solid phase extraction cartridge packed with a bound carrier (Step 2), Subsequently, the eluate is fractionated and purified using a column (PFP column) packed with a carrier to which a pentafluorophenyl group is bound and using acidic methanol-containing water as a mobile phase (Step 3).
  • a fermented food extract composition is produced which exhibits antihypertensive action and vasodilator action.
  • the fermented buckwheat used in the production method of the present invention can be produced according to the production method described in JP-A-2012-162503 (Patent Document 3). Specifically, Soba sprouts from which the culture bed and seed shells have been removed are immersed in 100 ppm sodium hypochlorite for 10 minutes for sterilization, and then cut and crushed, and the ground material is put in a sealed container, and the ground material 1.0 is crushed.
  • solid phase extraction cartridge used in step 2 examples include solid phase extraction cartridges (HyperSep Phenyl SPE Columns, Shimadzu STRATA Phenyl, Agilent Bond Elut PH) and the like, and the solid phase extraction cartridge (GL Science InertSep) ( Most preferred is a registered trademark).
  • solid phase extraction cartridges HyperSep Phenyl SPE Columns, Shimadzu STRATA Phenyl, Agilent Bond Elut PH
  • GL Science InertSep GL Science InertSep
  • acid-containing water used as an eluate hydrochloric acid-containing water, acetic acid-containing water, trifluoroacetic acid (TFA) -containing water, phosphoric acid-containing water, etc.
  • formic acid-containing water is preferable, and 0.01% formic acid-containing water is preferable. Water is most preferred.
  • Examples of the reverse phase column used in step 3 include phenyl columns (Imtakt Unison UK-Phenyl, GL Science Inert Sustain Phenyl, GL Science Inertsil Ph-3, COSMOSIL 5 PFP Packed Column) and the like, and PFP columns (YMC) -Triart PFP) is most preferred.
  • Examples of the acidic methanol-containing water used as the mobile phase include hydrochloric acid / methanol-containing water, acetic acid / methanol-containing water, TFA / methanol-containing water, phosphoric acid / methanol-containing water, etc. Preferably, 0.01% formic acid-33% methanol-containing water is most preferred.
  • acetylcholine, propionyl choline and butyryl choline can be isolated with high purity, and the structure was determined by NMR and mass spectrometry.
  • lactyl choline in addition to these three types of choline esters, lactyl choline, levryl choline, carnitine and its methyl ester, trimethylglycine (betaine) and its methyl ester, ethyl ester and propionyl ester Phosphocholine was identified.
  • lactyl choline is identified as a natural product, and furthermore, levulinyl isolated by the fractionation and purification method of the present invention has not been reported or suggested at all.
  • hydrochloride isolated and purified by the purification method of acetylcholine, propionyl choline, butyryl choline blood vessel isometric tension test using thoracic aortic preparation of SHR and single oral administration to SHR The test was done.
  • acetylcholine showed a vasodilator effect from 10 ⁇ 9 M, and the maximum dilation rate was 89.9% at 10 ⁇ 6 M, and the EC 50 was 2.72 ⁇ 10 ⁇ 8 M.
  • Propionyl choline showed an expansion reaction from 10 ⁇ 7 M, and at 10 ⁇ 4 M, the maximum expansion rate was 95.2%, and EC 50 was 2.27 ⁇ 10 ⁇ 6 M.
  • Butyrylcholine had a 7.14% dilation and a weak vasodilator effect at 10 -4 M addition.
  • the test was carried out at a dose of 10 -11 mol / kg in consideration of the single oral test result and content of fermented buckwheat.
  • a significant blood pressure lowering effect was caused at 9 hours after administration as compared with the control group.
  • Fermented buckwheat flour contains other quaternary alkyl ammonium compounds (butyrylcholine, lactylcholine, levulinylcholine, phosphocholine, carnitine and its methyl ester, trimethylglycine (betaine) and its methyl ester, ethyl ester and propionyl ester) in excellent blood vessels.
  • These compounds together with acetylcholine and propionyl choline, synergistically contribute to blood pressure lowering action even if they are weak alone, even if the vasodilator action and blood pressure lowering action are weak, because they are presumed to cause a dilation action and a blood pressure lowering action. It is thought that
  • organic acids contained in fermented buckwheat contribute to stabilize the solution such as choline ester such as acetylcholine and propionyl choline by keeping the solution acidic and to exert effects by oral administration.
  • amino acids tyrosine, GABA
  • GABA amino acids
  • the fermented food material of the present invention is not particularly limited as long as it is edible, such as plant-derived stems and leaves, seeds (grains, beans), and animal-derived milk. Moreover, as a microbe used for fermentation of the fermented food of this invention, if it is a thing which is not pathogenic, what kind of thing may be used and it is not specifically limited.
  • the inventor examined similar fractions and purifications of fermented foods other than fermented buckwheat, and as a result of examining acetylcholine, propionyl choline, lactyl choline, phosphocholine, carnitine, trimethyl glycine and its methyl ester and ethyl ester, yogurt, black vinegar It was found to be contained in various fermented foods such as natto and sake. In particular, it was possible to confirm that propionyl choline shows a relatively high content in the above-mentioned fermented food. This finding is a new finding that has never been reported or suggested so far.
  • butyrylcholine, lactylcholine, phosphocholine, carnitine, trimethylglycine (betaine) and its methyl ester and ethyl ester are used for black vinegar, and lactylcholine, phosphocholine, carnitine and its methyl ester, trimethylglycine (betaine) and its methyl ester for yogurt Esters, ethyl esters and propionyl esters, but for natto are butyrylcholine, lactylcholine, phosphocholine, carnitine and its methyl ester, trimethylglycine (betaine) and its methyl ester, ethyl ester and propionyl ester; for sake, butyrylcholine, lactylcholine, phosphocholine, Carnitine and its methyl ester, trimethylglycine (betaine) and its methyl ester and ethyl ester We have found that it is.
  • the extract composition of the present invention can be used as an active ingredient of various functional health foods or pharmaceutical compositions.
  • it can be used as a food composition in combination with appropriate food additives.
  • it is not limited to such a composition for food, and it is blended in green tea, black tea, oolong tea, millet tea, etc. and blended as a beverage, or blended in biscuit, bread, straw, etc.
  • it is also possible to provide Moreover, it is also possible to utilize as what is called a supplement as a suitable dosage form according to the preparation of the following pharmaceutical.
  • Such dosage forms include, for example, orally administered agents such as solid preparations such as powders, granules, capsules, pills, tablets and the like, liquids such as aqueous solutions, suspensions and emulsions, and the like.
  • orally administered agents such as solid preparations such as powders, granules, capsules, pills, tablets and the like, liquids such as aqueous solutions, suspensions and emulsions, and the like.
  • the extract of the present invention When used as a food, it may be used not only as a general food and drink, but also as a functional health food that exerts a specific function to promote health.
  • Specific forms in this case include capsules, tablets, powders, granules and the like containing the composition of the present invention as an active ingredient, bakery foods such as bread, cake and cookies, sauces, Soup, dressing, seasonings such as mayonnaise, dairy products such as milk, yogurt, cream etc., confections such as chocolate, candy or green tea, black tea, oolong tea, barley tea, millet tea, fruit juice, vegetables, milk drink, Examples include various beverages such as soft drinks and carbonated drinks.
  • the dose when using the extract composition of the present invention as the active ingredient of the pharmaceutical composition also varies depending on the ratio of each ingredient, and also depends on various factors such as the patient's age, weight, sex, symptoms, administration method, etc. Although different, in the case of oral administration per day for adults, it can be selected generally in the range of 0.1 mg to 100 g, and in the case of parenteral administration, it can be selected generally in the range of 0.1 mg to 1000 mg. Moreover, it can also increase / decrease suitably according to the degree of symptom improvement. The frequency of administration can be divided into once to several times a day.
  • the intake when using the extract composition of the present invention as a food can be selected according to the case of oral administration of the above-mentioned pharmaceutical. However, in the case of food and drink, unlike medicines, the dosage and frequency of administration are not particularly limited, so the purpose of maintaining health, taste, and palatability are considered, unless serious symptoms occur. Then, the intake may be selected without being limited to the above range.
  • lactic acid bacteria starter Lactobacillus plantarum
  • the mixture was centrifuged to obtain fermented buckwheat as a reddish brown liquid (6.8 kg). This was subjected to lyophilization or vacuum concentration according to a conventional method to obtain a lyophilizate or vacuum concentrate of fermented buckwheat, which was subjected to isolation and purification of the vasodilator component.
  • Fermentation buckwheat (liquid) used in this condition study is acidic at pH 3.6 and exhibits vasodilator activity from 0.50 ⁇ g / mL to a 12-week-old male SHR thoracic aortic vessel specimen with an EC 50 of 8.30. It was microgram / mL.
  • pH stability test Fermentation buckwheat (liquid) used in this condition study is acidic at pH 3.6 and exhibits vasodilator activity from 0.50 ⁇ g / mL to a 12-week-old male SHR thoracic aortic vessel specimen with an EC 50 of 8.30. It was microgram / mL.
  • pH stability test Fermentation buckwheat (liquid) used in this condition study is acidic at pH 3.6 and exhibits vasodilator activity from 0.50 ⁇ g / mL to a 12-week-old male SHR thoracic aortic vessel specimen with an EC 50 of 8.30. It was microgram
  • a solution obtained by dissolving the fermented buckwheat lyophilizate (10 mg) in purified water (1 mL) was used as a control sample (pH 4.0).
  • a control sample pH 4.0
  • the vasodilator action of each solution at a fermented buckwheat concentration of 50 ⁇ g / mL was confirmed in a blood vessel isometric tension measurement test.
  • pH 7.0 the vasodilator action disappeared after 0.5 hour at pH 12.0 after 6 hours at pH 9.0.
  • each organic solvent extract was 975 ⁇ g (0.98%) of ethanol extract, 512 ⁇ g (0.51%) of acetone extract, and 210 ⁇ g (0.21%) of ethyl acetate extract.
  • the blood vessel isometric tension measurement test confirmed the vasodilator action of each solution at a concentration of 50 ⁇ g / mL of each extract.
  • the vasodilation rates of the ethanol extract, the acetone extract and the ethyl acetate extract were 22%, 49% and 0%, respectively.
  • Gel filtration fraction 4 showed an expansion rate of 2.74% with the addition of 1.0 ng / mL, and the maximum expansion rate was 71.2% with the addition of 5.0 ⁇ g / mL. It was found that gel filtration fractions 3 and 4 initiate vasodilation at a concentration as low as 1/500 of fermented buckwheat and contain substances that exhibit strong vasodilation. On the other hand, gel filtration fraction 5 exhibited a vasoconstrictor response in a dose-dependent manner, and the fermented buckwheat contained not only a vasodilator component but also a vasoconstrictor component. It was considered that the vasoconstrictor component contained in the gel filtration fraction 5 was removed by gel filtration chromatography and the vasodilator was concentrated.
  • the washed resin was added with 2N HCl (30 mL), treated at room temperature for 30 minutes with gentle stirring to elute the adsorbed component, and filtered to separate hydrochloric acid eluate and resin. Furthermore, the operation of treating the obtained treated solution with an ion exchange resin was repeated twice, and the eluates obtained in each operation were all mixed.
  • the treatment solution (99 mL) and the hydrochloric acid eluate (90 mL) were each made up to 300 mL, diluted 4-fold, and the vasodilator action was confirmed in a blood vessel isometric tension measurement test.
  • the fermented buckwheat concentration at this time corresponds to 10 ⁇ g / mL.
  • the treatment solution did not show any vasodilator effect.
  • Treatment with weakly acidic cation exchange resin Dissolve fermented buckwheat lyophilisate (2000 mg) with pure water (5 mL), adjust to pH 7 with 1N NaOH, and centrifuge (3220 g, 4 ° C, 20 minutes) The purified solution was collected and made up to 10 mL. The supernatant (2.5 mL) was added to a suspension of sodium-type weakly acidic cation exchange resin (Amberlight IRC 76, 5 mL) and pure water (2 mL), and treated at room temperature for 2 hours while gently stirring After that, it was filtered to separate the treatment solution and the resin. The resin was washed twice with pure water (15 mL) and combined with the treatment solution.
  • sodium-type weakly acidic cation exchange resin Amberlight IRC 76, 5 mL
  • pure water 2 mL
  • the washed resin was added with 2N HCl (30 mL), treated at room temperature for 30 minutes with gentle stirring to elute the adsorbed component, and filtered to separate hydrochloric acid eluate and resin. Furthermore, the operation of treating the obtained treated solution with an ion exchange resin was repeated twice, and the eluates obtained in each operation were all mixed.
  • the treatment solution (94 mL) and the hydrochloric acid eluate (90 mL) were each made up to 300 mL, diluted 4-fold, and the vasodilator action was confirmed in a blood vessel isometric tension measurement test.
  • vasodilation was observed in both the treated solution and the hydrochloric acid-eluted fraction, and the vasodilation rate was 7.3% when 100 ⁇ L of the treated solution was added and 23.3% when 100 ⁇ L of the hydrochloric acid eluted fraction was added.
  • the adsorption of fermented buckwheat vasodilator component to weakly acidic cation exchange resin was considered to be insufficient.
  • Solid phase extraction Solid phase extraction cartridge (GL Science InertSep PH, 5 g) (R) is activated with methanol (30 mL), washed with water containing 0.01% formic acid (30 mL), and equilibrated with pure water (30 mL) After the reaction, the fermented buckwheat acetone extract (1.0 g) was dissolved in pure water (2.5 mL) and applied, and elution was performed with pure water (30 mL) and water containing 0.01% formic acid (30 mL). The pure water elution fraction and the water elution fraction containing 0.01% formic acid were freeze-dried, and the vasodilator action was confirmed in a blood vessel isometric tension measurement test.
  • vasodilation action was observed in the water elution fraction containing 0.01% formic acid, and the vasodilation rate was 35.6% at 0.5 ⁇ g / mL. No vasodilator action was observed in the pure water elution fraction.
  • Acetone 300 mL was further added to the residue, and after thorough grinding with a pestle for 5 minutes, the supernatant was similarly recovered. This operation was repeated 12 times in total.
  • the resulting acetone solution was concentrated under reduced pressure using a rotary evaporator to give a crude acetone extract.
  • the acetone crude extract (about 60 g) and ethyl acetate (about 200 mL) were added to a 500 mL eggplant flask and stirred well with a glass rod for 5 minutes, ice-cooled for 10 minutes, and then the supernatant was removed.
  • solid phase extraction cartridge (GL Science InertSep (registered trademark) PH, 50 g) with methanol (300 mL) as solid phase extraction purification of fermented buckwheat angiosperm component and pretreatment of fractionated gel filtration chromatography by gel filtration chromatography And wash with 0.01% formic acid-containing water (300 mL) and equilibrate with pure water (300 mL), and then apply Fermented Anthracis acetone extract (10 g) in pure water (20 mL) and apply Contaminants were eluted with pure water (300 mL) and then the vasodilator was eluted with water containing 0.01% formic acid (300 mL).
  • Fermented Anthracis acetone extract (10 g) in pure water (20 mL) and apply Contaminants were eluted with pure water (300 mL) and then the vasodilator was eluted with water containing 0.01% formic acid (300
  • the obtained eluate was concentrated using a rotary evaporator under reduced pressure conditions to obtain a solid phase extract.
  • the column (4.2 cm ⁇ 50 cm) is filled with Sephadex G-15 (230 g), and after injection of a solid phase extract (2 mL) prepared to 500 mg / mL with pure water The mixture was eluted with pure water, and the eluate of 410-485 mL was collected. The fractionated eluate was concentrated under reduced pressure and lyophilized to give a gel filtrate.
  • LC-MS of fermented buckwheat vasodilation component, LC-MS / MS analysis LC-MS analysis of gel filtrate and LC-MS / MS analysis were performed.
  • Ionization mode ESI + flow rate 0.5 mL / min (LC) and 0.3 mL / min (MS), separation temperature 40 ° C, injection volume 10 ⁇ L, Capillary voltage 3500 V, N 2 gas flow (cone) 50 L / h, N 2 source temp is 120 ° C., N 2 desolvation temp is 350 ° C.
  • the ionization voltage was examined at 10 to 60 V for each peak to be analyzed, and the conditions of Cone voltage 10 V and Collision voltage 30 V where ionization was most favorable were used.
  • acetylcholine, propionyl choline, butyryl choline, lactyl choline, levryl choline, carnitine and its methyl ester, trimethylglycine (betaine) and its methyl ester, ethyl ester, propionyl ester, and phosphocholine were identified as quaternary alkyl ammonium compounds.
  • vasodilator component contained in the gel filtrate was subjected to HPLC purification to isolate the vasodilator component, referring to the above-mentioned LC-MS analysis results.
  • Gel filtrate and HPLC analysis solvent were added to a 1.5 mL microtube to prepare a sample solution with a concentration of 100 mg / mL, which was passed through a Millex-LH filter (0.45 ⁇ m) (registered trademark) as a separated sample .
  • the analysis conditions are as follows: 0.01% formic acid-33% methanol-containing water as the mobile phase, flow rate 5.671 mL / min, separation temperature 40 ° C., detection wavelength 215 nm, injection amount 50 ⁇ L of gel filtrate.
  • NMR Analysis of Fermented Buckwheat Vasodilator The NMR analysis was performed on three HPLC purified products. The obtained fractions were dissolved in lyophilizate (1.6 mg) by adding heavy water (D 2 O, 0.16 mL) to obtain NMR samples. The number of integrations was 128 using an NMR apparatus with 1 H resonance frequency of 500 MHz (ADVANCE DRX 500, Bruker Biospin Ltd., Yokohama). As a result, the NMR charts of the three HPLC purified products were identical to commercially available special grade acetylcholine hydrochloride, synthesized propionylcholine and butyrylcholine, and were identified as acetylcholine, propionylcholine and butyrylcholine.
  • Mass spectrometric analysis of fermented buckwheat vasodilation component MALDI-TOF / MS analysis was performed on three HPLC purified products.
  • the obtained lyophilizate (0.01 mg) was dissolved in 50% acetonitrile (15 ⁇ L) containing 0.1% TFA to obtain a sample for measurement.
  • the sample and Matrix were each mixed with 1 ⁇ L each of 50% acetonitrile solution (7500, 1500, 750 ⁇ g / mL) of 2,5-dihydroxybenzoic acid as Matrix on a plate and dried in a desiccator.
  • MALDI-TOF MS analysis using a MALDI-TOF MS mass spectrometer (AB SCIEX TOF / TOF 5800, Abb Siex Co., Tokyo), reflector mode, scan range 10 to 300 m / z, laser intensity 5500 eV I went there.
  • 146.1182 m / z (theoretical value: 146.1176), 160.1337 m / z (theoretical value: 160.1332), 174.1497 m / z (theoretical value: 174.1489) corresponding to the exact mass of acetylcholine, propionyl choline and butyryl choline respectively It was observed.
  • acetylcholine is commercially available special grade acetylcholine hydrochloride
  • propionyl choline and butyryl choline are synthesized in our laboratory and purified by HPLC. The salt used was freeze-dried.
  • Propionyl choline and butyryl choline can be synthesized according to the synthesis charts shown by the following formulas (1) and (2).
  • butyrylcholine hydrochloride Choline hydrochloride (0.42 g, 3.0 mmol) is dissolved in DMF (6.0 mL), butyryl chloride (0.62 g, 6.0 mmol), and DIPEA (0.78 g, 4.5 mmol) are added to 0 ° C. The temperature was returned to room temperature and allowed to react for 1 hour. After completion of the reaction, DMF was distilled off and the product was precipitated with DCM-ethyl acetate (1: 1). The precipitate was recrystallized with DCM-ethyl acetate (5: 1) and further recrystallized with DCM to give butyrylcholine hydrochloride as a white powder.
  • SHR spontaneously hypertensive rats
  • NCrlCrlj Japan Charles River, Yokohama
  • SHR were reared in individual cages in a breeding room controlled at room temperature 22-23 ° C., with a 12 hour light / dark cycle.
  • rat standard feed MF; Charles River Co., Ltd.
  • tap water were used ad libitum.
  • SHR is a rat strain isolated in 1963 by selective mating among Wistar-Kyoto rats kept at the Animal Experiment Center of Kyoto University.
  • the systolic blood pressure of the isolated mother Wistar-Kyoto which is called spontaneously hypertensive rat or essential hypertensive rat, is about 135 mmHg for adult males and about 132 mmHg for females, while SHR blood pressure is 2 years old. By month almost all cases are above 150 mm Hg and almost peak at 4-5 months, mostly 180-210 mm Hg.
  • As a model animal of essential hypertension which is generally considered to account for about 90% of human hypertension, it is used to elucidate the pharmacological action, food function, and blood pressure elevation mechanism.
  • Blood vessel tension was measured by UFER UM-203 transducer (Ishishi and Kishimoto Medical Industries). After incubation for 60 minutes from mounting, ring specimens were contracted using the contracting agent phenylephrine (final concentration 0.30 ⁇ M). A commercially available acetylcholine (final concentration 100 ⁇ M), which is an endothelium-dependent vasodilator, was added to the contracted ring preparation, and the presence or absence of vascular endothelium was determined by the presence or absence of the vasodilator action. The ring specimens were then washed with Krebs solution to remove drug, incubated in static tension for 10 minutes, and then contracted again with 0.30 ⁇ M phenylephrine.
  • the purified acetylcholine showed an expansion rate of 1.52% after addition of 10 -9 M, and showed a dose-dependent expansion response up to 10 -6 M, but slightly contracted at higher concentrations. The maximum expansion rate was confirmed to be high expansion at a low dose of 89.9% with the addition of 10 -6 M.
  • the EC 50 was 2.72 ⁇ 10 ⁇ 8 M.
  • purified propionyl choline showed an expansion reaction from 10 ⁇ 7 M, and at 10 ⁇ 4 M, the maximum expansion rate was 95.2%, and EC 50 was 2.27 ⁇ 10 ⁇ 6 M.
  • butyrylcholine had a 7.14% increase at 10 -4 M addition, and a weak dilation effect as compared with acetylcholine and propionyl choline.
  • Commercially available acetylcholine and synthetic propionyl choline, butyryl choline also showed similar vasodilator action. From the above results, it became clear that acetylcholine and propionyl choline isolated and purified from fermented buckwheat have a strong vasodilator action.
  • Single oral administration test of fermented buckwheat vasodilator component-containing single oral administration test was conducted using a male 12-week-old SHR weighing 280-320 g. After one week of acclimatization, the animals were fasted for 12 hours, and the samples were orally administered once. Dose samples were dissolved in pure water and dosed orally at a dose of 10 -11 mol / kg (bw) to 6 SHRs each in a single dose. The pH of the purified aqueous solution of purified acetylcholine, propionyl choline and butyryl choline was 4.7, 4.3 and 4.4, respectively. Pure water was administered to the control group.
  • the systolic blood pressure and diastolic blood pressure changes are measured by the tail cuff method using the non-invasive blood pressure measuring instrument Softron BP-98A (Softon Corporation, Tokyo) before sample administration and 3, 6, 9, 24 hours after administration. It was measured.
  • Softron BP-98A Softon Corporation, Tokyo
  • the acetylcholine administration group caused a significant systolic blood pressure lowering action (p ⁇ 0.01) compared to the control group 9 hours after administration, and the maximum blood pressure lowering action at this time was 24.7 mmHg.
  • significant systolic blood pressure reduction (p ⁇ 0.05) was confirmed up to 8.05 mmHg at 9 hours after administration.
  • the butyrylcholine administration group no significant decrease in blood pressure could be confirmed at 10 ⁇ 11 mol / kg.
  • Commercially available acetylcholine and synthetic propionyl choline and butyryl choline also exhibited similar hypotensive effects.
  • Lactylcholine was identified as the first natural product.
  • the mass spectrum in LC-MS analysis test of lactyl choline is shown in FIG. 8-1, and the mass spectrum in LC-MS / MS analysis test is shown in FIG. 8-2.
  • levrylcholine represented by the following formula (3) which is considered to be a novel compound, was isolated and purified.
  • FIG. 9-1 The mass spectrum in LC-MS analysis test of lebrylcholine is shown in FIG. 9-1, and the mass spectrum in LC-MS / MS analysis test is shown in FIG. 9-2.
  • LC-MS / MS analysis of quaternary alkyl ammonium compounds in fermented buckwheat and other fermented foods LC-MS analysis of quaternary alkyl ammonium compounds contained in fermented buckwheat, black vinegar, yogurt and sake was carried out.
  • Each freeze-dried product (1 g of fermented buckwheat, black vinegar, yogurt, natto and sake 10 g each) was weighed in a mortar and 1 mg of carbachol was added as an internal standard. After adding 30 mL of acetone and stirring for 3 minutes, the supernatant was collected in a 50 mL centrifuge tube and centrifuged (4 ° C., 1811 g, 10 min) to obtain a supernatant.
  • the residue was again added with 30 mL of acetone and stirred, and operations of centrifugation and supernatant collection were repeated four more times to obtain an acetone extract.
  • the acetone extract was concentrated under reduced pressure, lyophilized, dissolved in pure water (2.5 mL), and subjected to solid phase extraction using a solid phase extraction cartridge (GL Science InertSep PH, 5 g) (registered trademark).
  • GL Science InertSep PH, 5 g registered trademark
  • the sample was activated with methanol (30 mL), washed with 0.01% formic acid-containing water (30 mL), equilibrated with pure water (30 mL), and then added to the sample.
  • Contaminants were removed with pure water (30 mL) and eluted with 0.01% formic acid-containing water (30 mL) to obtain a solid phase extract containing a quaternary alkyl ammonium compound.
  • the solid phase extract was concentrated under reduced pressure, lyophilized, and then dissolved in an analysis solvent (0.01% formic acid-33% methanol-containing water, 1 mL) for LC-MS analysis.
  • the quantification of the compound was performed by specifying the mass-to-charge ratio of the quaternary alkyl ammonium compound specified by Fermentation buckwheat in single ion monitoring (SIM) mode.
  • SIM single ion monitoring
  • the mass-to-charge ratio specified for the compound is: acetylcholine: 146.1, propionyl choline: 160.1, butyrylcholine: 174.2, lactyl choline: 176.1, levrylcholine: 202.1, phosphocholine: 184.1, carnitine: 162.1, methyl carnitine: 176.1, trimethylglycine: 118.1, methyltrimethyl Glycine: 132.1, ethyltrimethylglycine: 146.1, propionyltrimethylglycine: 160.1.
  • the other analysis conditions are the same as those of LC-MS analysis of the above-mentioned fermented buckwheat anastomotic component.
  • the fermented food extract of the present invention has a remarkable blood pressure lowering action, and by including this as an active ingredient, it is possible to produce functional health food or a therapeutic drug such as hypertension.

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Abstract

　血圧降下作用を有し、機能性健康食品あるいは医薬品組成物として有用な発酵食品抽出物を提供する。　発酵食品、好ましくは発酵キョウバク凍結乾燥物を、アセトン抽出し、当該発酵キョウバクアセトン抽出物を、フェニル基が結合した樹脂を充填した固相抽出カートリッジを用い、溶出液として、ギ酸含有水を用いて溶出し、当該溶出物を、ペンタフルオロフェニル基が結合した担体を充填したカラム（PFPカラム）を用い、移動相として、ギ酸・メタノール含有水を用いて分画、精製して得られる発酵食品抽出物、当該抽出物または少なくともその一部を有効成分として含有する機能性健康食品あるいは医薬品組成物に関する。

Description

発酵食品抽出組成物
　本発明は、発酵食品等、例えば、発酵キョウバク等から抽出される、抽出組成物に関する。より詳細には、少なくともアセチルコリンおよびプロピオニルコリンを含有し、経口投与において、血圧降下作用および血管拡張作用を示す、発酵食品抽出組成物およびその抽出方法に関する。
　また本発明は、当該抽出組成物を活性成分として含有する食品または医薬組成物に関する。
　本発明者らは、発酵食品、特にソバ発芽体搾汁の発酵物について研究を進め、当該発酵物の凍結乾燥粉末がACE阻害作用を示すことを見出し、当該粉末からなる機能性食品や機能性飲料を報告し（特許文献１）、さらに、このACE阻害物質の分画方法および当該方法で分離された画分についても報告した。（特許文献２）
　その後、本発明者は、より高い機能性を有するソバ植物体粉砕物の乳酸発酵物（発酵キョウバク）を開発し、当該発酵物に含まれる血圧降下作用および血管拡張作用活性成分を単離、精製すべく研究を重ね、その活性成分として、いくつかの新規なペプチドを含有する発酵ソバ抽出物を見出し、特許出願を行った。（特許文献３）
　一方、これまでに、血管拡張作用を有するソバ由来化合物およびそれらを含有する組成物については、種々報告されている。（特許文献４～７）
　本発明者は、さらに、発酵キョウバクに含まれる血圧降下作用および血管拡張作用活性成分について鋭意研究を行い、上記特許文献３の活性成分とは別の、血管拡張作用成分を分画した。
　そして、当該分画に含まれる成分を同定確認した結果、少なくともアセチルコリンとプロピオニルコリンを含む、複数のコリンエステルを主体とした第4級アルキルアンモニウム化合物を含有していることを見出した。
　コリンエステルの中で、アセチルコリンは哺乳類の神経伝達物質として生命活動に不可欠な物質であることが知られている。また、1929年に、ウマの脾臓からヒスタミンとは異なる血圧降下物質が単離され、その活性物質がアセチルコリンであることが化学的に同定された。（非特許文献１）
　このように動物組織中にアセチルコリンが存在することは古くから知られている。さらに、麦角の血圧降下物質がアセチルコリンであることが解明され、菌類がアセチルコリンを産生することが確認されている。（非特許文献２）
　アセチルコリンは、食用植物、食用菌類、ローヤルゼリー、牛乳等に含まれており、枯草菌、酵母にもアセチルコリンが存在し、乳酸菌の一種であるラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）がアセチルコリンを生産したことを生物アッセイで確認したという報告もある。（非特許文献３～７）
　また、アセチルコリンの他、複数のコリンエステル類も発見されている。
アセチル基より1つ炭素鎖が長いプロピオニル基を有するプロピオニルコリンは、1953年に牛の脾臓から発見されている。（非特許文献８，９）
　その後、牡牛の精液中、ヨーロッパザリガニ、アメリカカブトガニ、ヨーロッパザルガイ、オオノガイ、ムラサキイガイ、ホンドブガイ、リンゴマイマイ中の血リンパと平滑筋中、シビレエイの電気発生組織培養中の他、ヘンヨウボク、緑豆、オオバコ、ポプラ、シラカバ中などに、プロピオニルコリン産生が確認されている。（非特許文献１０～１３）
　しかしながら、これまでに、発酵食品中にプロピオニルコリンが存在することは報告も示唆もされていない。
　また、ブチリルコリンについては、1954年に脳抽出物から発見され（非特許文献１４）、節足動物、軟体動物中に、アセチルコリン、プロピオニルコリンと共に存在することが示されている。（非特許文献１１）
　さらに、プロピオニルコリン、ブチリルコリン以外にも軟体動物から、いくつかのコリンエステル類が確認されている。たとえば、ウロカノイルコリンがアクキガイの一種から、ββ-ジメチルアクロイルコリン（セネシオイルコリン）がレイシガイの一種から、アクロイルコリンがエゾバイの一種から、イミダゾールプロピオニルコリンがレイシガイの一種から構造決定されている。（非特許文献１５～１８）
　しかしながら、これまでに、発酵食品中にコリンエステル類が存在することは化学的には全く確認されておらず、その抽出、分画方法についても報告も示唆もされていない。
特開２００５－３０４３５５号公報 特開２００８－２３９４９８号公報 特開２０１２－１６２５０３号公報 特開２００７－２５４４１０号公報 特開２００６－７６９０３号公報 特開２００６－７６９０４号公報 特開平５－９７７９８号公報
Dale HH, Dudley HW. The presence of histamine and acetylcholine in the spleen of the ox and the horse. J Physiol 68:97-123, 1929. Ewins AJ. Acetylcholine, a new active principle of ergot. Biochem J 8: 44-49, 1914. 桃木芳枝, 植物におけるアセチルコリン, 植物の化学調節, 30(1), 49-61 (1995) 川島紘一郎, アセチルコリンのルーツと非神経性アセチルコリン, 基礎老化研究, 34(4), 12-24 (2010) 篠田雅人ら、ローヤルゼリー中の血流増加因子について, 薬学雑誌, 98(2), 139-145 (1978) Whittaker VP. Acetylcholine in Milk. Nature 181:856-857, 1958. Stephenson M, Rowatt E. The production of acetylcholine by a strain of Lactobacillus plantarum. J Gen Microbiol 1(3):279-298, 1947. Banister J, Whittaker VP, Wijesundera S. The occurrence of homologues of acetylcholine in ox spleen. J Physiol 121(1):55-71, 1953. Gardiner JE, Whittaker VP. The identification of propionylcholine as a constituent of ox spleen. Biochem J 58(1):24-29, 1954. Bishop MR, Sastry BV, Stavinoha WB. Identification of acetylcholine and propionylcholine in bull spermatozoa by integrated pyrolysis, gas chromatography and mass spectrometry. Biochim Biophys Acta 500(2):440-444, 1977. Wolfgang W, Jutta N, Dettmar W. Distribution of cholinesters and cholinesterases in haemolymphs and smooth muscles of molluscs. Comp Biochem Phys C 61(1):121-131,1978. O'Regan S. The synthesis, storage, and release of propionylcholine by the electric organ of Torpedo marmorata. J Neurochem 39(3):764-772, 1982. Miural GA, Shin TM. Identification of proprionylcholine in higher plants. Physiol Plant 62:341-343, 1984. Holtz P, Schumann HJ. Butyrylcholine in brain extracts. Naturwissenschaften 41:306, 1954. Erspamer V, Benati O. Identification of murexine as β-[imidazolyl-(4)]acrylcholine. Science 117:161-162, 1953. Keyl MJ, Michaelson IA, Whittaker VP. Physiologically active choline esters in certain marine gastropods and other invertebrates. J Physiol 139:434, 1957. Whittaker VP. Acrylylcholine: a new naturally occurring pharmacologically active choline ester from Buccinum undatum. Biochem Pharmacol 1(4):342-346, 1959. Roseghini M. Occurrence of dihydromurexine (imidazole propionylcholine) in the hypobranchial gland of Thais (purpura) haemastoma. Experientia 27(9):1008-1009, 1971.
　本発明の目的は、血圧降下作用および血管拡張作用を有し、機能性健康食品あるいは医薬品組成物として有用な、新規な発酵食品抽出物、当該抽出物または当該抽出物に含まれている活性成分の少なくともその一部を有効成分として含有する機能性健康食品あるいは医薬品組成物を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、本発明を成した。すなわち、発酵食品、特に、ソバ植物体の乳酸発酵物（発酵キョウバク）に含まれる成分について研究を重ねた結果、極めて顕著な血圧降下作用および血管拡張作用を発揮する活性成分を分離することに成功し、さらに、その中のいくつかの活性成分を同定し、本発明を完成した。
　より詳細には、本発明は、
[１]　発酵食品抽出組成物であって、少なくとも、アセチルコリンおよびプロピオニルコリンを含有し、経口投与において、血圧降下作用および血管拡張作用を示す、発酵食品抽出組成物、
[２]　発酵食品が、発酵キョウバク、黒酢、ヨーグルト、納豆、日本酒の群から選ばれる一種である、[１]に記載の抽出組成物、
[３]　発酵食品が、発酵キョウバクである、[２]に記載の抽出組成物、
および、
[４]　さらに、ブチリルコリン、ラクチルコリン、レブリルコリン、カルニチン、メチルカルニチン、トリメチルグリシン（ベタイン）、メチルトリメチルグリシン、エチルトリメチルグリシン、プロピオニルトリメチルグリシンおよびホスホコリンの群から選ばれる少なくとも1種を含有する、[１]に記載の抽出組成物、に関する。
　また、本発明は、
[５]　 [１]～[４]の何れかに記載の抽出組成物を活性成分として含有する食品または医薬品組成物、
[６]　さらに、チロシンおよびγ-アミノ酪酸（GABA）の群から選ばれる少なくとも1種を活性成分として含有する[５]に記載の食品または医薬品組成物、
および、
[７]　さらに、乳酸、酢酸およびクエン酸の群から選ばれる少なくとも1種を含有する[５]または[６]に記載の食品または医薬品組成物、
に関する。
　さらに、本発明は、
[８]　（１）発酵キョウバク凍結乾燥物または濃縮物をアセトンに懸濁し、振とう撹拌後、遠心分離して得た上清を減圧濃縮する工程（工程１）、
（２）当該減圧濃縮物を、フェニル基が結合した担体を充填した固相抽出カートリッジを用い、溶出液として、酸含有水を用いて溶出する工程（工程２）、
（３）当該溶出物を、ペンタフルオロフェニル基が結合した担体を充填したカラム（PFPカラム）を用い、移動相として、酸性メタノール含有水を用いて分画、精製する工程（工程３）
を含む工程からなることを特徴とする、[１]に記載の発酵食品抽出組成物の製造方法、
　および、
[９]　（１）工程２で、固相抽出カートリッジとして、固相抽出カートリッジ（GL Science InertSep）（登録商標）を用い、溶出液として、0.01%ギ酸含有水を用い、（２）工程３で、逆相カラムとして、PFPカラム（YMC-Triart PFP）を用い、移動相として、0.01%ギ酸-33%メタノール含有水を用いることを特徴とする、［８］に記載の製造方法、
に関する。
　さらにまた、本発明は、
[１０]　 [８]または[９]に記載の製造方法によって製造される、少なくとも、アセチルコリンおよびプロピオニルコリンを含有し、経口投与において、血圧降下作用および血管拡張作用を示すことを特徴とする、発酵食品抽出組成物、に関する。
　本発明の新規な発酵食品抽出物は、顕著な血圧降下作用および血管拡張作用を有しており、機能性健康食品あるいは医薬品組成物の有効成分として有用である。
図１は、PFPカラムを用いた、発酵キョウバク固相抽出物の成分分離条件検討試験における、メタノール含量変化に伴うアセチルコリンの溶出挙動変化を示す検出ピークのチャートである。 図２は、PFPカラムを用いた、発酵キョウバク固相抽出物の成分分離条件検討試験における、酸含量変化に伴うアセチルコリンの溶出挙動変化を示す検出ピークのチャートである。 図３は、同じく、発酵キョウバク固相抽出物の成分分離条件検討試験における、酸含量(0.01%)固定条件下メタノール含量変化に伴う発酵キョウバク精製物中アセチルコリンの溶出挙動を示す検出ピークのチャートである。 図４は、同じく、発酵キョウバク固相抽出物の成分分離条件検討試験における、酸含量(0.01%)固定条件下で、さらにメタノール含量を細かく変動（38%、36%、33%）させたときの、酸含量(0.01%)固定条件下メタノール含量変化に伴う発酵キョウバク精製物中アセチルコリンの溶出挙動を示す検出ピークのチャートである。 図５は、同じく、発酵キョウバク固相抽出物の成分分離条件検討試験において、0.01%ギ酸-33%メタノール含有水での分離温度を30℃と40℃に設定して分離を検討したときの、分離温度に伴う発酵キョウバク精製物中アセチルコリンの溶出挙動を示すチャートである。 図６は、同定コリン化合物の血管等尺性張力測定試験結果を示すグラフである。 図７は、同定コリン化合物投与後の収縮期血圧変化を示すグラフである。 図８－１は、ゲルろ過物のLC-MS分析試験におけるラクチルコリンのマススペクトルである。 図８－２は、ゲルろ過物のLC-MS/MS分析試験におけるラクチルコリンのマススペクトルである。 図９－１は、同じく、ゲルろ過物のLC-MS分析試験におけるレブリルコリンのマススペクトルである。 図９－２は、同じく、ゲルろ過物のLC-MS/MS分析試験におけるレブリルコリンのマススペクトルである。
　ソバ植物体を乳酸発酵させた「発酵キョウバク」は、高血圧自然発症ラット（SHR）に対して優れた血圧降下作用を有している。
　本発明者は、この発酵キョウバク中の血圧降下物質について研究を行い、いくつかの新規なペプチドを含有する発酵ソバ抽出物を見出し、特許出願を行った。（特許文献３）
　発明者は、さらに、発酵キョウバク中の血管拡張成分に関する研究を進め、新たな分画、精製方法を開発し、当該、発酵キョウバク中の血管拡張成分を分画、精製することに成功した。
　本発明の分画、精製で用いた発酵キョウバクはpH3.6の酸性であり、雄性12週齢SHRの胸部大動脈血管標本に対し0.5 μg/mLから血管拡張作用を示しEC50は8.30 μg/mLであった。
　この発酵キョウバクに水酸化ナトリウム溶液を添加してpH12で室温で放置すると、0.5時間で血管拡張活性は失われた。
　また、発酵キョウバク凍結乾燥物の有機溶媒抽出物の血管拡張作用を調べたところ、酢酸エチル抽出物には血管拡張作用が無く、エタノールとアセトン抽出物に活性があり、アセトン抽出物の血管拡張作用が最も強かった。
　以上の結果から、発酵キョウバク血管拡張成分は、酸性または中性条件で精製や投与を行う必要があり、アセトンで効果的に抽出できることを見出した。
　次に、クロマトグラフィによる血管拡張成分の精製条件を検討した。まず、発酵キョウバク凍結乾燥物のアセトン粗抽出物をゲルろ過クロマトグラフィで精製して活性を比較した。その結果、溶出時間から判断して比較的低分子量の物質を含む画分に血管拡張作用が見られた。
　発酵キョウバクの血管拡張成分は塩基性で失活するため、酸性条件で操作を行う陽イオン交換樹脂での精製を検討した。その結果、強酸性陽イオン交換樹脂処理における塩酸溶出画分に比較的強い血管拡張作用が見られた。この結果は、発酵キョウバク血管拡張成分がプラス電荷を有するため、樹脂上のマイナス電荷を有する交換基であるスルホン酸基と相互作用したためと推察された。
　しかし、血管拡張成分の陽イオン交換樹脂への吸着はかなり強く、十分な血管拡張成分を回収するための塩酸溶出操作の繰り返しによって生じた大量の溶出液から塩酸と溶媒を除去する操作が煩雑であった。そこで、血管拡張成分のプラス電荷とπ電子を有するフェニル基とのカチオン-π相互作用を利用した分離が有効であると考え、フェニル基結合担体を用いた固相抽出を行ったところ、血管拡張成分だけが濃縮された画分を分離することが出来た。
　このことは、血管拡張物質が共存する他の化合物に比べて特に強いカチオン-π相互作用を形成するためと考え、より強いカチオン-π相互作用が期待されるペンタフルオロフェニル基が結合した担体を充填したカラム（PFPカラム）を用いたHPLC分離条件の検討を行ったところ、さらに、血管拡張成分を濃縮、分離することができた。
　以上のような知見に基づいて、以下に示す、本発明の発酵食品抽出物の製造方法を確立した。
　すなわち、例えば、発酵キョウバク凍結乾燥物または濃縮物をアセトンに懸濁し、振とう撹拌後、遠心分離して得た上清を減圧濃縮する工程（工程１）、当該減圧濃縮物を、フェニル基が結合した担体を充填した固相抽出カートリッジを用い、溶出液として、酸含有水を用いて溶出する工程（工程２）、
次いで、当該溶出物を、ペンタフルオロフェニル基が結合した担体を充填したカラム（PFPカラム）を用い、移動相として、酸性メタノール含有水を用いて分画、精製する工程（工程３）ことにより、経口投与において、血圧降下作用および血管拡張作用を示す、発酵食品抽出組成物を製造する。
　本発明の製造方法において用いる発酵キョウバクは、特開2012－162503号公報（特許文献３）記載の製造方法に従って製造することができる。具体的には、栽培床および種殻を取り除いたソバスプラウトを100 ppmの次亜塩素酸ナトリウムに10分間浸漬し殺菌した後、切断、破砕し、当該粉砕物を密封容器に入れ、破砕物1.0 kgあたり25 mLの乳酸菌スターター（ラクトバチルス・プランタラム）を添加し、窒素置換後、室温で6日間静置発酵させたものをろ過または遠心分離して赤褐色の液体として発酵キョウバクを得、これを凍結乾燥または減圧濃縮して、発酵キョウバクの凍結乾燥物または減圧濃縮物を得ることができる。
　工程２で用いる、固相抽出カートリッジとしては、例えば、固相抽出カートリッジ（HyperSep Phenyl SPE Columns、Shimadzu STRATA Phenyl、Agilent Bond Elut PH）等を挙げることができ、固相抽出カートリッジ（GL Science InertSep）（登録商標）が最も好ましい。また、溶出液として用いる酸含有水としては、塩酸含有水、酢酸含有水、トリフルオロ酢酸（TFA）含有水、リン酸含有水等を挙げることができ、ギ酸含有水が好ましく、0.01%ギ酸含有水が最も好ましい。
　工程３で用いる、逆相カラムとしては、例えば、フェニルカラム（Imtakt Unison UK-Phenyl、GL Science InertSustain Phenyl、GL Science Inertsil Ph-3、COSMOSIL 5PFP Packed Column）等を挙げることができ、PFPカラム（YMC-Triart PFP）が最も好ましい。また、移動相として用いる酸性メタノール含有水としては、塩酸・メタノール含有水、酢酸・メタノール含有水、TFA・メタノール含有水、リン酸・メタノール含有水等を挙げることができ、ギ酸・メタノール含有水が好ましく、0.01%ギ酸-33%メタノール含有水が最も好ましい。
　上記のような分画、精製方法により、発酵キョウバクの血管拡張作用成分を分離したところ、アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンを純度よく単離することができ、NMRおよび質量分析で構造を決定した。
　また、PFPカラムを用いたLC-MS/MS分析では、これら3種類のコリンエステルの他にラクチルコリン、レブリルコリン、カルニチンとそのメチルエステル、トリメチルグリシン（ベタイン）とそのメチルエステル、エチルエステルおよびプロピオニルエステルとホスホコリンが特定された。
　本知見は、ラクチルコリンを天然物として特定した初めての事例であり、さらに、本発明の分画、精製方法で単離されたレブリルコリンは、これまでに、全く報告も示唆もされていない。
　本発明の分画、精製方法により単離、精製されたアセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンの塩酸塩を用いて、SHRの胸部大動脈標本を用いた血管等尺性張力試験およびSHRへの単回経口投与試験を行った。
　血管等尺性張力試験では、アセチルコリンは10-9 Mから血管拡張作用を示し、最大拡張率は10-6 Mで89.9%、EC50は2.72×10-8 Mであった。
　プロピオニルコリンは 10-7 Mから拡張反応を示し、10-4 Mで最大拡張率は95.2%、EC50は2.27×10-6 Mであった。
　ブチリルコリンは10-4 M添加で7.14%拡張と弱い血管拡張作用であった。
　単回経口投与試験では、発酵キョウバクの単回経口試験結果および含量を考慮し投与量10-11 mol/kgで試験を行った。
　その結果、アセチルコリン投与群およびプロピオニルコリン投与群で、投与9時間後にコントロール群と比較して有意な血圧降下作用を引き起した。
　本結果は、アセチルコリンは経口投与では生理活性を引き起こさないとするこれまでの定説を覆すものである。
　また、プロピオニルコリンが経口投与で生理活性を引き起すという知見は、これまで全く報告も示唆もされていない。
　発酵キョウバクには、その他の第4級アルキルアンモニウム化合物（ブチリルコリン、ラクチルコリン、レブリルコリン、ホスホコリン、カルニチンとそのメチルエステル、トリメチルグリシン（ベタイン）とそのメチルエステルとエチルエステルおよびプロピオニルエステル）が混在し優れた血管拡張作用、血圧降下作用を引き起すことが推察されることから、例え単独で血管拡張作用、血圧降下作用が弱くとも、これらの化合物はアセチルコリンやプロピオニルコリンと共に相乗的に血圧降下作用に寄与していると考えられる。
　また、発酵キョウバクに含まれる有機酸類（乳酸、酢酸、クエン酸）は、溶液を酸性に保つことでアセチルコリンやプロピオニルコリンなどのコリンエステルを安定化させて経口投与で効果を発揮させるために寄与しており、既知の血圧降下成分であるアミノ酸類（チロシン、GABA）などもアセチルコリンおよびプロピオニルコリンなどと共に血圧降下作用に寄与しているものと考えられる。
　本発明の発酵食品原料としては、植物由来の茎葉、種子（穀類、豆類）など、動物由来の乳など、可食なものであれば特に限定されない。また、本発明の発酵食品の発酵に用いる菌としては、病原性のないものであればどのようなものでもよく、特に限定されない。
　本発明者は、発酵キョウバク以外の発酵食品について、同様な分画、精製を検討した結果、アセチルコリン、プロピオニルコリン、ラクチルコリン、ホスホコリン、カルニチン、トリメチルグリシンとそのメチルエステルおよびエチルエステルが、ヨーグルト、黒酢、納豆、日本酒中など様々な発酵食品に含まれていることを見出した。
　特に、上記発酵食品中に、プロピオニルコリンが比較的高い含有量を示すことを確認することができた。本知見は、これまでに全く報告も示唆もされていない新しい知見である。
　その他、黒酢にはブチリルコリン、ラクチルコリン、ホスホコリン、カルニチン、トリメチルグリシン（ベタイン）とそのメチルエステルおよびエチルエステルが、ヨーグルトには、ラクチルコリン、ホスホコリン、カルニチンとそのメチルエステル、トリメチルグリシン（ベタイン）とそのメチルエステル、エチルエステルおよびプロピオニルエステルが、納豆にはブチリルコリン、ラクチルコリン、ホスホコリン、カルニチンとそのメチルエステル、トリメチルグリシン（ベタイン）とそのメチルエステル、エチルエステルおよびプロピオニルエステルが、日本酒にはブチリルコリン、ラクチルコリン、ホスホコリン、カルニチンとそのメチルエステル、トリメチルグリシン（ベタイン）とそのメチルエステルおよびエチルエステルが含まれていることを見出した。
　この事から、少なくとも、上記、ヨーグルト、黒酢、納豆、日本酒等の発酵食品において、本発明の発酵キョウバク抽出組成物の製造方法に準じて、活性成分の分画、精製を行うことにより、発酵キョウバク抽出組成物と同様な活性を示す抽出組成物が得られるものと推測される。
　本発明の抽出組成物は、各種の機能性健康食品あるいは医薬品組成物の有効成分として用いることができる。
　食品の場合、適当な食品添加物と組み合わせて、食品用組成物として用いることができる。また、このような食品用組成物に限らず、緑茶、紅茶、烏龍茶、雑穀茶等に配合して飲料として、あるいはビスケット、パン、飴等に配合して食品として、日常的に摂取可能な形態で提供することも可能である。また、下記医薬品の調剤に準じて適当な剤形として、所謂サプリメントとして利用することも可能である。
　医薬品とする場合は、適当な医薬品添加剤と組み合わせて、通常の調剤の手法に従って各種の剤形として用いることができる。このような剤形としては、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等の経口投与剤が挙げられる。
　本発明の抽出物を食品として用いる場合、一般的な飲食品としてだけでなく、特定の機能を発揮して健康増進を図る機能性健康食品としての使用が挙げられる。
　この場合の具体的な形態としては、本発明の組成物を有効成分として含有するカプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤等からなるサプリメント類、パン、ケーキ、クッキー等のベーカリー食品類、ソース、スープ、ドレッシング、マヨネーズ等の調味料類、牛乳、ヨーグルト、クリーム類等の乳製品類、チョコレート、キャンデー等の菓子類、あるいは緑茶、紅茶、烏龍茶、麦茶、雑穀茶、果汁、野菜、乳飲料、清涼飲料および炭酸飲料等の各種飲料類等が挙げられる。
　本発明の抽出組成物を医薬品組成物の有効成分として使用する場合の投与量は、各成分の比率によっても異なり、また、患者の年齢、体重、性別、症状、投与方法などの種々の要因によって異なるが、成人で、１日当たり、経口投与の場合は、概ね、0.1 mg～100 g、非経口投与の場合は、概ね0.1 mg～1000 mgの範囲で選択することができる。また、症状改善の度合いによって、適宜増減することもできる。投与回数としては、１日１回～数回に分けて投与することができる。
　本発明の抽出組成物を食品として使用する場合の摂取量は、上記医薬品の経口投与の場合に準じて選択することができる。但し、飲食物の場合は医薬品とは異なり、投与用量および投与回数が特に制限されないことから、特に重篤な症状を発生しない限りにおいて、健康維持という目的、並びに、呈味性、嗜好性を考慮して、上記の範囲に限定されずに摂取量を選択してもよい。
　以下に、本発明の実施の態様について実施例および試験例を挙げて説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
発酵キョウバクの製造
　発酵キョウバクは、特開2012－162503号公報（特許文献３）記載の製造方法に従って製造した。
ソバスプラウトは、播種から約10日栽培し収穫されたものをサラダコスモ株式会社から購入した。栽培床および種殻を取り除いたソバスプラウト（10 kg）を100 ppmの次亜塩素酸ナトリウム（20 L）に10分間浸漬し殺菌した後、約2.0 cmの長さに切断したものを細かく破砕した。
　粉砕物を密封容器（10 L）に入れ、破砕物1.0 kgあたり25 mLの乳酸菌スターター（ラクトバチルス・プランタラム）を添加し、窒素置換後、室温で6日間静置発酵させたものをろ過または遠心分離し赤褐色の液体として発酵キョウバクを得た（6.8 kg）。これを、常法に従い、凍結乾燥または減圧濃縮を行って発酵キョウバクの凍結乾燥物または減圧濃縮物を得、これを、血管拡張成分の単離精製に供した。
発酵キョウバク血管拡張成分の分画
[試験例１]
血管拡張成分の精製条件検討
　まず、2 kgの発酵キョウバクから得られた凍結乾燥物を用いて、発酵キョウバク血管拡張物質の化学的性質を明らかにすると共に精製条件検討を行った。発酵キョウバク（2 kg）を遠心分離（3220 g、30 min、4℃）後、残渣を取り除き、得られた上清を凍結乾燥し、濃赤色、吸湿性の発酵キョウバク凍結乾燥物を得た（収率2.05%）。
　各条件検討では、各精製段階で血管等尺性張力測定試験により血管拡張作用を示す画分の特定を行うことで、活性成分の濃縮を確認した。
pH安定性試験
　本条件検討に用いた発酵キョウバク(液体)はpH3.6の酸性であり、雄性12週齢SHRの胸部大動脈血管標本に対し0.50 μg/mLから血管拡張作用を示しEC50は8.30 μg/mLであった。
　発酵キョウバクのpH安定性を試験するために、発酵キョウバク凍結乾燥物（10 mg）を精製水に溶解させ1N水酸化ナトリウムを添加してpH7.0、pH9.0、pH12.0に調整した後精製水を1 mLになるまで加えた。発酵キョウバク凍結乾燥物（10 mg）を精製水（1 mL）に溶解させたものを対照試料とした（pH4.0）。0.5、1、3、6、12、24時間室温で放置後、血管等尺性張力測定試験で、発酵キョウバク濃度50 μg/mLにおける各溶液の血管拡張作用を確認した。その結果、対照試料、pH7.0では24時間後も血管拡張作用が維持されたものの、pH9.0では6時間後に、pH12.0では0.5時間後に血管拡張作用が消失した。
有機溶媒抽出試験
　発酵キョウバク凍結乾燥物（100 mg）を、それぞれ1 mLのエタノール、アセトン、酢酸エチルに懸濁し、シェイキングインキュベーターで振とう（1811 g、6時間、室温）後、遠心分離（3220 g、30 min、4℃）して上清と沈殿に分けた。
　沈殿は再び各有機溶媒に懸濁し、同様に遠心分離して上清と沈殿に分けた。上清は、合わせて減圧濃縮後、真空ポンプで溶媒を完全に除去した。
　各有機溶媒抽出物収量は、エタノール抽出物975 μg (0.98%)、アセトン抽出物512 μg (0.51%)、酢酸エチル抽出物210 μg (0.21%)であった。
血管等尺性張力測定試験で、各抽出物濃度50 μg/mLにおける各溶液の血管拡張作用を確認した。その結果、エタノール抽出物、アセトン抽出物、酢酸エチル抽出物の血管拡張率は、それぞれ、22%、49%、0%であった。
ゲルろ過クロマトグラフィ
　発酵キョウバク凍結乾燥物（1.25 g）を純水(10 mL)に溶解させ、分画分子量700～1500のSephadex G-15（30 g）を充填したオープンカラム（4.2 cm×50 cm）に注入した。ボイドボリューム300 mLを除いた後、50 mLずつ分取し、ゲルろ過画分1～8を得た。分取した各画分は凍結乾燥し、凍結乾燥物は血管等尺性張力測定試験に供した。ゲルろ過クロマトグラフィにより分画した際の各画分の収量と収率を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　血管等尺性張力測定試験で各画分25 μg/mLにおける血管拡張作用を確認した結果、ゲルろ過画分3、4で血管拡張作用が見られた。累積添加によってゲルろ過画分3～5の血管拡張作用を調べた結果、ゲルろ過画分3は1.0 ng/mLの添加で4.80%の拡張率を示し、用量依存的な血管拡張反応が認められ、最大拡張率は5.0 μg/mL添加時の61.9%であった。ゲルろ過画分4は、1.0 ng/mLの添加で2.74%の拡張率を示し、最大拡張率は5.0 μg/mL添加時の71.2%であった。ゲルろ過画分3および4には発酵キョウバクの1/500という低濃度で血管拡張を開始し、強い血管拡張作用を示す物質が含まれていることが分かった。一方、ゲルろ過画分5は用量依存的に血管収縮反応が認められ、発酵キョウバク中には血管拡張成分だけでなく血管収縮成分も含まれていた。ゲルろ過クロマトグラフィでゲルろ過画分5に含まれる血管収縮成分が除去され血管拡張物質が濃縮されたと考えられた。
イオン交換処理
強酸性陽イオン交換樹脂処理
　発酵キョウバク凍結乾燥物（2000 mg）を純水（5 mL）で溶解し、1N NaOHでpH7に調整した後、遠心分離（3220 g、4℃、20分間）で上清を回収し10 mLにメスアップした。この上清（2.5 mL）をプロトン型強酸性陽イオン交換樹脂（アンバーライトIR120B、5 mL）と純水（2 mL）との懸濁液に加えて緩やかに撹拌しながら室温2時間処理した後、ろ過して処理溶液と樹脂を分離した。樹脂を純水（15 mL）で2回洗浄し、処理溶液と合わせた。洗浄した樹脂に2N HCl（30 mL）を加え、緩やかに撹拌しながら室温で30分間処理して吸着成分を溶出させ、ろ過して塩酸溶出液と樹脂を分離した。さらに得られた処理溶液をイオン交換樹脂で処理する操作を2回繰り返し、各操作で得られた溶出液は全て混合した。処理溶液（99 mL）と塩酸溶出液（90 mL）はそれぞれ300 mLにメスアップ後、4倍希釈して血管等尺性張力測定試験で血管拡張作用を確認した。その結果、塩酸溶出画分に血管拡張作用が見られ、塩酸溶出画分100 μL添加時に56.0%であった。発酵キョウバク中の全ての血管拡張成分がイオン交換樹脂に吸着されたと仮定すると、この時の発酵キョウバク濃度は10 μg/mLに相当する。処理溶液には血管拡張作用はみられなかった。
弱酸性陽イオン交換樹脂処理
　発酵キョウバク凍結乾燥物（2000 mg）を純水（5 mL）で溶解し、1N NaOHでpH7に調整した後、遠心分離（3220 g、4℃、20分間）で上清を回収し10 mLにメスアップした。この上清（2.5 mL）をナトリウム型弱酸性陽イオン交換樹脂（アンバーライトIRC76、5 mL）と純水（2 mL）との懸濁液に加えて緩やかに撹拌しながら室温で2時間処理した後、ろ過して処理溶液と樹脂を分離した。樹脂を純水（15 mL）で2回洗浄し、処理溶液と合わせた。洗浄した樹脂に2N HCl（30 mL）を加え、緩やかに撹拌しながら室温で30分間処理して吸着成分を溶出させ、ろ過して塩酸溶出液と樹脂を分離した。さらに得られた処理溶液をイオン交換樹脂で処理する操作を2回繰り返し、各操作で得られた溶出液は全て混合した。処理溶液（94 mL）と塩酸溶出液（90 mL）はそれぞれ300 mLにメスアップ後、4倍希釈して血管等尺性張力測定試験で血管拡張作用を確認した。その結果、処理溶液および塩酸溶出画分共に血管拡張作用が見られ、処理溶液100 μL添加時に血管拡張率は7.3%、塩酸溶出画分100 μL添加時に血管拡張率は23.3%であった。弱酸性陽イオン交換樹脂への発酵キョウバク血管拡張成分の吸着は不十分であると考えられた。
固相抽出
　固相抽出カートリッジ（GL Science InertSep PH、5 g）（登録商標）をメタノール（30 mL）で活性化し、0.01%ギ酸含有水（30 mL）で洗浄し純水（30 mL）で平衡化した後、発酵キョウバクアセトン抽出物（1.0 g）を純水（2.5 mL）に溶かしてアプライし、純水（30 mL）と0.01%ギ酸含有水（30 mL）で溶出を行った。純水溶出画分と0.01%ギ酸含有水溶出画分を凍結乾燥し、血管等尺性張力測定試験で血管拡張作用を確認した。その結果、0.01%ギ酸含有水溶出画分に血管拡張作用が見られ、0.5 μg/mL時に血管拡張率は35.6%であった。純水溶出画分に血管拡張作用はみられなかった。
HPLC分離条件
　ペンタフルオロフェニル基が結合した逆相カラム（YMC-Triart PFP、5 μm、4.6 mm×250 mm）を用いて発酵キョウバク固相抽出物（1 mg/mL）中の血管拡張成分分離条件を検討した。まず、血管拡張成分候補であるアセチルコリン標品を用い、溶離液のメタノール含量と酸含量を変化させて条件検討を行った。すなわちアセチルコリン標品（0.1 mg/mL）を60 μL注入、流速0.5 mL/minで、分離温度30℃で、溶離液に0、5、15、30、50、60%メタノール含有水および0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.015%ギ酸含有50%メタノールを用いてアセチルコリンの溶出挙動変化を調べた。その結果、メタノール含量が高くなるにつれて、アセチルコリンの溶出時間は早まると共にピーク形状が良好になった。また、ギ酸含量はアセチルコリンの保持時間にあまり影響を及ぼさないものの酸含量が多いほどバックグラウンドの上昇によって検出ピークが小さくなった。以上の結果から、0.01%ギ酸-50%メタノール含有水がアセチルコリンの分析に最も適していることがわかった。メタノール含量変化に伴うアセチルコリンの溶出挙動の変化を図１に、酸含量変化に伴うアセチルコリンの溶出挙動の変化を図２に示した。
　次に、発酵キョウバク固相抽出物の分離条件を検討した。アセチルコリン分析条件での結果を基に、ギ酸含量を0.01%、メタノール含量を25、30、35、40、45、50%と変化させてHPLC分析を行った。その結果、メタノール含量35%での分離が良好であった。酸含量(0.01%)固定条件下メタノール含量変化に伴う発酵キョウバク精製物の挙動を図３に示した。
　さらにメタノール含量を細かく変動（38、36、33%）させたところ、クロマトグラム後半の分離が33%メタノールのとき最良であった。酸含量(0.01%)固定条件下メタノール含量変化に伴う発酵キョウバク精製物の挙動を図４に示した。
　最後に、0.01%ギ酸-33%メタノール含有水での分離温度を30℃と40℃に設定して分離を検討したところ、40℃の方がより分離が良かった。分離温度に伴うクロマトグラム変化を図５に示した。
　以上の結果から、最適分離条件は以下のとおり決定した。
カラム：YMC-Triart（登録商標） PFP、5 μm、4.6 mm×250 mm
注入量：発酵キョウバク固相抽出物（0.1 mg/mL）60 μL
移動相：0.01%ギ酸-33%メタノール含有水（アイソクラティック）
流速：0.5 mL/min
温度：40℃
発酵キョウバク血管拡張成分の精製
　発酵キョウバク100 kgを減圧濃縮し、アセトン抽出、固相抽出、ゲルろ過クロマトグラフィ、HPLCで発酵キョウバク中の血管拡張成分を精製した。
発酵キョウバク血管拡張成分のアセトン抽出
　発酵キョウバクを遠心分離（3220 g、30 min、4℃）し、遠心分離後残渣を取り除いた。得られた上清は、減圧条件下でロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、発酵キョウバク濃縮物とした。2 L乳鉢に発酵キョウバク濃縮物（約120 g）とアセトン（300 mL）を加え、乳棒で5分間すりつぶしながら血管拡張成分を抽出し、上清を吸引器で回収した。残渣にさらにアセトン（300 mL）を加え、乳棒で5分間十分にすりつぶした後、同様に上清を回収した。この操作を計12回繰り返した。得られたアセトン溶液を減圧条件下でロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、アセトン粗抽出物とした。500 mLナスフラスコにアセトン粗抽出物（約60 g）と酢酸エチル（約200 mL）を加え、ガラス棒で5分間よく撹拌後、10分間氷冷してから上清を除去した。残渣に再び酢酸エチル（約200 mL）を加え、ガラス棒で5分間よく攪拌し、同様にして上清を除去した。この操作を計12回繰り返し、得られた残渣をデシケーターで3時間以上減圧乾燥させアセトン抽出物とした。
発酵キョウバク血管拡張成分の固相抽出精製とゲルろ過クロマトグラフィによる分画
　ゲルろ過クロマトグラフィの前処理として、固相抽出カートリッジ（GL Science InertSep（登録商標） PH、50 g）をメタノール（300 mL）で活性化し、0.01%ギ酸含有水（300 mL）で洗浄し純水（300 mL）で平衡化した後、発酵キョウバクアセトン抽出物（10 g）を純水（20 mL）に溶解してアプライし、純水（300 mL）で夾雑物を溶出させた後0.01%ギ酸含有水（300 mL）で血管拡張物質の溶出を行った。得られた溶出液は減圧条件下でロータリーエバポレーターを用いて濃縮し固相抽出物とした。
　続いて、ゲルろ過クロマトグラフィでは、カラム（4.2 cm×50 cm）にSephadex G-15（230 g）を充填し、純水で500 mg/mLに調製した固相抽出物（2 mL）を注入後、純水で溶出して410-485 mLの溶出液を分取した。分取した溶出液は減圧濃縮・凍結乾燥後、ゲルろ過物とした。
発酵キョウバク血管拡張成分のLC-MS、LC-MS/MS分析
　ゲルろ過物のLC-MS分析およびLC-MS/MS分析を行った。1.5 mL容マイクロチューブにゲルろ過物と分析溶媒を加えて1 mg/mLの濃度のサンプル溶液を調製し、Millex-LHフィルター（0.45 μm）（登録商標）を通したものをLC-MS分析サンプルとした。カラムにはPFP基が結合した逆相カラムYMC-Triart（登録商標） PFP（5 μm、4.6 mm×250 mm）を用い、移動相に0.01%ギ酸-33%メタノール含有水を使用した。イオン化モード ESI+、流速は0.5 mL/min（LC）および0.3 mL/min（MS）、分離温度が40℃、注入量が10 μL、Capillary 電圧が3500 V、N2 gas flow（cone）が50 L/h、N2 source tempが120℃、N2 desolvation tempが350℃である。また、イオン化電圧は分析を行うピークごとに10～60 Vで検討を行い、最もイオン化が良好であったCone voltage 10 V、Collision voltage 30 Vの条件を用いた。LC-MS分析で観測された主要なイオンピークに対して、ニュートラルロススキャンを実施し第4級アルキルアンモニウム化合物としてトリメチルアンモニウム基（質量電荷比59）を有するものを特定した。そして、特定された第4級アルキルアンモニウム化合物の質量電荷比をプリカーサーイオンとしてLC-MS/MS分析を行った。その結果、第4級アルキルアンモニウム化合物として、アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリン、ラクチルコリン、レブリルコリン、カルニチンとそのメチルエステル、トリメチルグリシン（ベタイン）とそのメチルエステル、エチルエステルおよびプロピオニルエステルとホスホコリンが特定された。
アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンの単離、精製
発酵キョウバク血管拡張成分のHPLC精製
　前述のLC-MS分析結果を参照し、ゲルろ過物に含まれる血管拡張成分をHPLC精製し、血管拡張成分を単離した。1.5 mL容マイクロチューブにゲルろ過物とHPLC分析溶媒を加えて100 mg/mLの濃度のサンプル溶液を調製し、Millex-LHフィルター（0.45 μm）（登録商標）を通したものを分離サンプルとした。分析システムにはProminence HPLC system、カラムにはYMC-Triart PFP（5 μm、20 mm×250 mm）（登録商標）を使用した。分析条件は、移動相に0.01%ギ酸-33%メタノール含有水、流速が5.671 mL/min、分離温度が40℃、検出波長が215 nm、注入量がゲルろ過物50 μLである。血管拡張成分が含まれるフラクションを分取し、必要であれば同様の精製を繰り返して3種類の純粋な成分を得た。最終的な精製物には塩酸を加えて減圧濃縮、凍結乾燥して塩酸塩とし、構造決定および試験に用いた。
発酵キョウバク血管拡張成分のNMR分析
　3種類のHPLC精製物に対しNMR分析を行った。得られた分取物について、それぞれ凍結乾燥物（1.6 mg）に重水（D2O、0.16 mL）を加えて溶解したものをNMRサンプルとした。 1H共鳴周波数500 MHzのNMR装置（ADVANCE DRX500、ブルカー・バイオスピン株式会社、横浜）を用い積算回数は128回とした。その結果、3種類のHPLC精製物のNMRチャートは、市販の特級アセチルコリン塩酸塩、合成したプロピオニルコリン、ブチリルコリンと同一であり、アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンであると同定された。
発酵キョウバク血管拡張成分の質量分析
　3種類のHPLC精製物に対しMALDI-TOF/MS分析を行った。得られた分取物について、それぞれの凍結乾燥物（0.01 mg）を0.1%TFA含有50%アセトニトリル（15 μL）で溶解し測定用サンプルとした。サンプルとMatrixである2,5-ジヒドロキシ安息香酸の0.1%TFA含有50%アセトニトリル溶液(7500、1500、750 μg/mL)をそれぞれ1 μLずつプレート上で混合しデシケーターで乾燥させた。MALDI-TOF MS分析は、MALDI-TOF MS質量分析装置(AB SCIEX TOF/TOF 5800、株式会社エービー・サイエックス、東京)を用い、リフレクターモード、スキャンレンジ10～300 m/z、レーザー強度5500 eVで行った。その結果、アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンの精密質量に該当する、146.1182 m/z（理論値：146.1176）、160.1337 m/z（理論値：160.1332）、174.1497 m/z（理論値：174.1489）がそれぞれ観測された。
発酵キョウバク血管拡張物質の特徴付け
標準物質合成
　単離、精製されたアセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンの各塩酸塩の標準物質として、アセチルコリンは市販の特級アセチルコリン塩酸塩を、プロピオニルコリン、ブチリルコリンは当研究室で合成しHPLCで精製し塩酸塩として凍結乾燥したものを用いた。プロピオニルコリンおよびブチリルコリンは、下記、式（１）および式（２）で示される合成チャートに従って合成することができる。
プロピオニルコリンの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　プロピオニルコリンの合成：コリン塩酸塩（0.42 g、3.0 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド（DMF、6.0 mL）に溶解させ、プロピオン酸クロライド（0.56 g、6.0 mmol）、およびジイソプロピルエチルアミン（DIPEA、0.78 g、4.5 mmol）を加えて0℃から室温に戻し、1時間反応させた。反応終了後、DMFを留去し、ジクロロメタン（DCM）-酢酸エチル（1:1）で生成物を沈殿させた。沈殿をDCM-酢酸エチル（5:1）で再結晶したものをさらにDCMで再結晶し、白色粉末のプロピオニルコリン塩酸塩を得た。収率92％、1H NMR （500 MHz, D2O）δ（ppm）: 0.96（3H, t, J = 7.8 Hz, CH3）, 2.32（2H, q, J = 7.5 Hz, CH2）, 3.08（9H, s, CH3）, 3.60（2H, t, J =2.5 Hz, CH2）, 4.42（2H, t, J = 2.3 Hz, CH2）
ブチリルコリンの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ブチリルコリンの合成：コリン塩酸塩（0.42 g,3.0 mmol）をDMF（6.0 mL）に溶解させ、ブチリル酸クロライド（0.62 g、6.0 mmol）、およびDIPEA（0.78 g, 4.5 mmol）を加えて0℃から室温に戻し、1時間反応させた。反応終了後、DMFを留去し、DCM-酢酸エチル（1:1）で生成物を沈殿させた。沈殿をDCM-酢酸エチル（5:1）で再結晶したものをさらにDCMで再結晶し、白色粉末のブチリルコリン塩酸塩を得た。収率89％、1H NMR（500 MHz, D2O）δ（ppm）: 0.78（3H, t, J = 7.5 Hz, CH3）, 1.49（2H, 6, J = 7.5 Hz, CH2）, 2.29（2H, t, J = 7.5 Hz,　CH2）, 3.08（9H, s, CH3）, 3.60（2H, t, J = 2.3 Hz, CH2）, 4.43（2H, t, J = 2.3 Hz, CH2）
使用実験動物
　動物実験は、信州大学動物実験ガイドラインに従って行った。本試験では、実験動物として雄性10-13週齢の高血圧自然発症ラット（SHR/NCrlCrlj、日本チャールスリバー、横浜）を用いた。SHRは、個別のケージ中で、明暗周期12時間、室温22-23℃に制御された飼育室で飼育した。順化飼育では、ラット用標準飼料（MF；チャールスリバー株式会社）および水道水を自由摂取とした。SHRは、京都大学の動物実験センターで飼育されていたWistar-Kyoto系ラットの中から選択交配で1963年に分離されたラット系統である。高血圧自然発症ラットもしくは本態性高血圧ラットと呼ばれ、分離母体であるWistar-Kyotoの収縮期血圧は成熟雄が約135 mmHg、同雌が約132 mmHgであるのに対し、SHRの血圧は生後2ヶ月までにほぼ全例が150 mmHg以上となり、4-5ヶ月でほぼ最高に達し、多くは180-210 mmHgを示す。一般的にはヒトの高血圧の約90%を占めるとされる本態性高血圧のモデル動物として、薬理作用や食品機能、血圧上昇メカニズムの解明に用いられている。
発酵キョウバク血管拡張成分含有物の血管等尺性張力測定
　試験に用いた胸部大動脈は雄性10-12週齢SHRから摘出し、結合組織を除去後、長さ2-3 mmに切断してリング標本を作製した。作製したリング標本は、95%O2-5%CO2混合ガスを通気した37℃のクレブス溶液（119 mM NaCl/4.7 mM KCI/1.1 mM KH2PO4/1.2 mM MgSO4/25 mM NaHCO3, pH7.4）を満たしたオーガンバスに取り付け、1.5 gの静止張力を負荷した（UFER UC-05A; いわしや岸本医科産業, 京都）。血管張力は、UFER UM-203トランスデューサー（いわしや岸本医科産業）により計測した。取り付けから60分間のインキュベーション後、リング標本は収縮剤であるフェニレフリン（終濃度0.30 μM）を用いて収縮させた。収縮させたリング標本には内皮依存性血管拡張剤である市販アセチルコリン（終濃度100 μM）を添加し、血管拡張作用の有無により血管内皮の有無を判断した。その後、薬剤を除去するためクレブス液でリング標本を洗浄し、10分間静止張力でインキュベートした後、再び0.30 μMフェニレフリンにより収縮させた。この操作を2回繰り返した後、0.30 μMフェニレフリンを再度添加し、収縮が最大に達したことを確認して、クレブス溶液に溶解させた各サンプルを終濃度10-9、10-8、10-7.5、10-7、10-6.5、10-6、10-5、10-4 Mになるように累積添加した。血管拡張作用（拡張率、%）は、フェニレフリンにより収縮した際の血管張力を基準として表した。精製アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンの血管等尺性張力試験結果を図６に示した。
　精製アセチルコリンは10-9 Mの添加で1.52%の拡張率を示し、それ以降10-6 Mまで用量依存の拡張反応を示したが、それ以上の高濃度ではやや収縮した。最大拡張率は10-6 Mの添加で89.9%と低用量で高い拡張を確認した。EC50は2.72×10-8 Mであった。また、精製プロピオニルコリンは 10-7 Mから拡張反応を示し、10-4 Mで最大拡張率は95.2%、EC50は2.27×10-6 Mであった。一方、精製ブチリルコリンは10-4 M添加で7.14%拡張と、アセチルコリンやプロピオニルコリンと比較すると、弱い拡張作用であった。市販アセチルコリンおよび合成プロピオニルコリン、ブチリルコリンも同様な血管拡張作用を示した。以上の結果から、発酵キョウバクから単離精製したアセチルコリンおよびプロピオニルコリンは強い血管拡張作用を有していることが明らかとなった。
発酵キョウバク血管拡張成分含有物の単回経口投与試験
　単回経口投与試験は、体重280-320 gの雄性12週齢SHRを用いて行った。1週間の馴化飼育後、12時間絶食させ、サンプルを単回経口投与した。投与サンプルは純水に溶解させ、10-11 mol/kg（b.w.）の用量でそれぞれ6匹のSHRに単回経口投与した。精製アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリン投与サンプル水溶液のpHは、それぞれ4.7、4.3、4.4の酸性であった。対照群には純水を投与した。収縮期血圧および拡張期血圧変化は非観血式血圧測定器Softron BP-98A（ソフトロン株式会社、東京）を用いてテイルカフ法により、試料投与前および投与後3、6、9、24時間後に測定した。精製アセチルコリン、プロピオニルコリン、ブチリルコリンの単回経口投与試験結果を図７に示した。
　その結果、アセチルコリン投与群は投与9時間後にコントロール群と比較して有意な収縮期血圧低下作用（p<0.01）を引き起し、この時の最大血圧降下作用は24.7 mmHgであった。また、プロピオニルコリン投与群では、投与9時間後に最大8.05 mmHgの有意な収縮期血圧低下（p<0.05）が確認された。一方、ブチリルコリン投与群では、10-11 mol/kgでは有意な血圧低下を確認することができなかった。市販アセチルコリンおよび合成プロピオニルコリン、ブチリルコリンも同様な降圧作用を示した。
ラクチルコリン、レブリルコリンの単離精製
　実施例３に記載の方法により、天然物としては初の、ラクチルコリンを特定した。
　ラクチルコリンのLC-MS分析試験におけるマススペクトルを図８－１に、LC-MS/MS分析試験におけるマススペクトル図８－２に、それぞれ示した。
　さらに、新規化合物であると考えられる、下記、式（３）で表されるレブリルコリンを単離、精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　レブリルコリンのLC-MS分析試験におけるマススペクトルを図９－１に、LC-MS/MS分析試験におけるマススペクトル図９－２に、それぞれ示した。
発酵キョウバクおよび他の発酵食品中の第４級アルキルアンモニウム化合物のLC-MS/MS分析
　発酵キョウバク、黒酢、ヨーグルト、日本酒に含まれる第４級アルキルアンモニウム化合物のLC-MS分析を行った。各凍結乾燥物（発酵キョウバク1 g、黒酢、ヨーグルト、納豆、日本酒各10 g）を乳鉢に量り取り、内部標準としてカルバコールを1 mg加えた。アセトンを30 mL加え3分間撹拌し、上清を50 mL容遠沈管に採取後、遠心分離（4℃、1811 g、10min）し、上清を得た。残渣に再びアセトン30 mLを加え撹拌し、遠心分離、上清採取という操作をさらに4回繰り返し、アセトン抽出物を得た。アセトン抽出物を減圧濃縮後、凍結乾燥し、純水（2.5 mL）で溶解し固相抽出カートリッジ（GL Science InertSep PH、5 g）（登録商標）を用いて固相抽出を行った。固相抽出では、まず、メタノール（30 mL）で活性化、0.01%ギ酸含有水（30 mL）で洗浄し、純水で平衡化（30 mL）後、サンプルを添加した。純水（30 mL）で夾雑物を除去し、0.01%ギ酸含有水（30 mL）で溶出して第４級アルキルアンモニウム化合物を含む固相抽出物を得た。固相抽出物は、減圧濃縮、凍結乾燥した後、分析溶媒（0.01%ギ酸-33%メタノール含有水、1 mL）に溶解させLC-MS分析を行った。化合物の定量は、発酵キョウバクで特定された第4級アルキルアンモニウム化合物の質量電荷比をシングルイオンモニタリング（SIM）モードで指定して行った。化合物で指定した質量電荷比は、アセチルコリン：146.1、プロピオニルコリン：160.1、ブチリルコリン：174.2、ラクチルコリン：176.1、レブリルコリン：202.1、ホスホコリン：184.1、カルニチン：162.1、メチルカルニチン：176.1、トリメチルグリシン：118.1、メチルトリメチルグリシン：132.1、エチルトリメチルグリシン：146.1、プロピオニルトリメチルグリシン：160.1である。その他の分析条件は、前出の発酵キョウバク血管拡張成分のLC-MS分析と同様である。第４級アルキルアンモニウム化合物の定量結果を表２に示す。各化合物含量は、内部標準の定量結果を用いて精製過程での物質損失を補正し、新鮮重量100 g（100gFW）中の各第４級アルキルアンモニウム化合物含量をアセチルコリン当量で表した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明の発酵食品抽出物は、顕著な血圧降下作用を有しており、これを活性成分として含有させることにより、機能性健康食品あるいは高血圧症等の治療用医薬品を製造することができる。
 

Claims (10)

  1. 　発酵食品抽出組成物であって、少なくとも、アセチルコリンおよびプロピオニルコリンを含有し、経口投与において、血圧降下作用および血管拡張作用を示す、発酵食品抽出組成物。
  2. 　発酵食品が、発酵キョウバク、黒酢、ヨーグルト、納豆、日本酒の群から選ばれる一種である、請求項１に記載の抽出組成物。
  3. 　発酵食品が、発酵キョウバクである、請求項２に記載の抽出組成物。
  4. 　さらに、ブチリルコリン、ラクチルコリン、レブリルコリン、カルニチン、メチルカルニチン、トリメチルグリシン（ベタイン）、メチルトリメチルグリシン、エチルトリメチルグリシン、プロピオニルトリメチルグリシンおよびホスホコリンの群から選ばれる少なくとも1種を含有する、請求項１に記載の抽出組成物。
  5. 　請求項１～４の何れかに記載の抽出組成物を活性成分として含有する食品または医薬品組成物。
  6. 　さらに、チロシンおよびγ-アミノ酪酸（GABA）の群から選ばれる少なくとも1種を活性成分として含有する請求項５に記載の食品または医薬品組成物。
  7. 　さらに、乳酸、酢酸およびクエン酸の群から選ばれる少なくとも1種を含有する請求項５または６に記載の食品または医薬品組成物。
  8. （１）発酵キョウバクの凍結乾燥物または濃縮物をアセトンに懸濁し、振とう撹拌後、遠心分離して得た上清を減圧濃縮する工程（工程１）、
    （２）当該減圧濃縮物を、フェニル基が結合した担体を充填した固相抽出カートリッジを用い、溶出液として、酸含有水を用いて溶出する工程（工程２）、
    （３）当該溶出物を、ペンタフルオロフェニル基が結合した担体を充填したカラム（PFPカラム）を用い、移動相として、酸性メタノール含有水を用いて分画、精製する工程（工程３）
    を含む工程からなることを特徴とする、請求項1記載の発酵食品抽出組成物の製造方法。
  9. （１）工程２で、固相抽出カートリッジとして、固相抽出カートリッジ（GL Science InertSep PH）（登録商標）を用い、溶出液として、0.01%ギ酸含有水を用い、
    （２）工程３で、逆相カラムとして、PFPカラム（YMC-Triart PFP）を用い、移動相として、0.01%ギ酸-33%メタノール含有水を用いることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
  10. 請求項８または９に記載の製造方法によって製造される、少なくとも、アセチルコリンおよびプロピオニルコリンを含有し、経口投与において、血圧降下作用および血管拡張作用を示すことを特徴とする、発酵食品抽出組成物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017187335A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Abergavenny Nv Food supplement and composition comprising choline butyrate salt and/or butyrylcholine
BE1024195B1 (nl) * 2016-04-27 2017-12-12 Abergavenny Nv Voedingssupplement en farmaceutische samenstelling omvattende butyrylcholine
WO2018070545A1 (ja) * 2016-10-14 2018-04-19 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6734585B2 (ja) * 2016-08-03 2020-08-05 パワフル健康食品株式会社 トマト乳酸発酵食品の製造方法
JP7337363B2 (ja) * 2019-02-28 2023-09-04 株式会社ウェルナス 睡眠を改善するための経口摂取用組成物
CN110568119B (zh) * 2019-10-09 2021-07-02 山东省化工研究院 一种同时检测甜菜碱盐酸盐和氯乙酸甲酯季铵盐的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04334323A (ja) * 1991-05-11 1992-11-20 Orion Mach Co Ltd そばを原料とする飲食品とその製造方法
JP2005304355A (ja) * 2004-04-20 2005-11-04 Kaiyo Bokujo:Kk そば芽抽出エキスを含有する食品
JP2007143473A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Nitsukoku Seifun Kk ソバを原料として使用した飲食品及びその製造方法
JP2008239498A (ja) * 2007-03-24 2008-10-09 Shinshu Univ 発芽発酵ソバからａｃｅ阻害活性画分を分画する方法
JP2012162503A (ja) * 2011-02-09 2012-08-30 Shinshu Univ 発酵ソバ抽出物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5070544B2 (ja) * 2006-05-22 2012-11-14 国立大学法人島根大学 形質転換イネ、血圧降下をもたらす米、および、イネ用ベクター
CN102994350B (zh) * 2012-12-21 2014-01-01 劲牌有限公司 一种具有降血脂功能苦荞酒的制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04334323A (ja) * 1991-05-11 1992-11-20 Orion Mach Co Ltd そばを原料とする飲食品とその製造方法
JP2005304355A (ja) * 2004-04-20 2005-11-04 Kaiyo Bokujo:Kk そば芽抽出エキスを含有する食品
JP2007143473A (ja) * 2005-11-28 2007-06-14 Nitsukoku Seifun Kk ソバを原料として使用した飲食品及びその製造方法
JP2008239498A (ja) * 2007-03-24 2008-10-09 Shinshu Univ 発芽発酵ソバからａｃｅ阻害活性画分を分画する方法
JP2012162503A (ja) * 2011-02-09 2012-08-30 Shinshu Univ 発酵ソバ抽出物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOYAMA M. ET AL.: "Blood pressure-lowering peptides from neo-fermented buckwheat sprouts:A new approach to estimating ACE-inhibitory activity.", PLOS ONE, vol. 9, no. e105802, September 2014 (2014-09-01), pages 9 *
KOYAMA M. ET AL.: "Purification and identification of antihypertensive peptides from fermented buckwheat sprouts.", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 61, no. 12, 2013, pages 3013 - 3021, XP055224922, ISSN: 0021-8561 *
MASAHIRO KOYAMA ET AL.: "Hakko Kyobaku ni Fukumareru Yuko Seibun no Dotei to Koatsu Sayo", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY TAIKAI KOEN YOSHISHU (WEB, vol. 2013, 2013, pages 2A15 P08 *
MASAHIRO KOYAMA ET AL.: "Koketsuatsu Shizen Hassho Rat ni Okeru Hakko Kyobaku no Ketsuatsu Josho Yokusei Sayo", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY TAIKAI KOEN YOSHISHU (WEB, vol. 2014, 5 March 2014 (2014-03-05), pages 3B03a16 *
MASAHIRO KOYAMA ET AL.: "Soba Shokubutsutai o Genryo to shita Hakko Shokuhin ga Seitainai ACE Kassei ni Oyobosu Eikyo", JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY TAIKAI KOEN YOSHISHU, vol. 2010, 2010, pages 176 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017187335A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Abergavenny Nv Food supplement and composition comprising choline butyrate salt and/or butyrylcholine
BE1024195B1 (nl) * 2016-04-27 2017-12-12 Abergavenny Nv Voedingssupplement en farmaceutische samenstelling omvattende butyrylcholine
US11007159B2 (en) 2016-04-27 2021-05-18 Abergavenny Nv Food supplement and composition comprising choline butyrate salt and/or butyrylcholine
US11642322B2 (en) 2016-04-27 2023-05-09 Abergavenny Nv Food supplement and composition comprising choline butyrate salt and/or butyrylcholine
US12239616B2 (en) 2016-04-27 2025-03-04 Abergavenny Nv Food supplement and composition comprising choline butyrate salt and/or butyrylcholine
WO2018070545A1 (ja) * 2016-10-14 2018-04-19 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物
JPWO2018070545A1 (ja) * 2016-10-14 2019-07-25 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物
JP2022121616A (ja) * 2016-10-14 2022-08-19 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物
JP7362098B2 (ja) 2016-10-14 2023-10-17 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物
JP7515907B2 (ja) 2016-10-14 2024-07-16 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物
JP2024114843A (ja) * 2016-10-14 2024-08-23 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物
JP7726553B2 (ja) 2016-10-14 2025-08-20 国立大学法人信州大学 経口摂取用コリンエステル含有組成物

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