WO2015125752A1 - 脳循環障害検出マーカー、それを用いた脳循環障害検出方法、及び脳循環障害抑制剤 - Google Patents

脳循環障害検出マーカー、それを用いた脳循環障害検出方法、及び脳循環障害抑制剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2015125752A1
WO2015125752A1 PCT/JP2015/054199 JP2015054199W WO2015125752A1 WO 2015125752 A1 WO2015125752 A1 WO 2015125752A1 JP 2015054199 W JP2015054199 W JP 2015054199W WO 2015125752 A1 WO2015125752 A1 WO 2015125752A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
cerebral circulation
circulation disorder
cerebral
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/054199
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雅之 伊藤
智久 赤松
Original Assignee
独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター filed Critical 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
Priority to JP2016504093A priority Critical patent/JPWO2015125752A1/ja
Publication of WO2015125752A1 publication Critical patent/WO2015125752A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker capable of detecting cerebral circulation disorder, a method for detecting cerebral circulation disorder in a subject using the biomarker, and a cerebral circulation disorder inhibitor.
  • Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (hereinafter often referred to as “neonatal HIE” or “neonatal HIE”) is severe neonatal asphyxia, acute respiratory circulatory failure, fetal hypoxia, etc.
  • Neonatal HIE is a disease with a poor prognosis, with an incidence of 0.1 to 0.6%, a fatality rate of 10 to 60%, and occurrence of neurological sequelae such as cerebral palsy and epilepsy The rate is very high at 25% (Non-Patent Documents 1 to 3.)
  • the pathological condition includes hypoxia and neurotoxicity of the excitatory neurotransmitter glutamate released into the nerve cell space due to ischemia and inflammation such as cytokines.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 the treatment of neonatal HIE involves a latent phase before irreversible cell damage, ie, usually, 6 hours after birth Treatment of the inner is important.
  • Non-Patent Documents 6 to 11 Non-Patent Documents 6 to 11
  • hypothermia therapy requires special equipment such as a cooling device, a ventilator, and an electroencephalogram monitor, and is very complicated and difficult to manage, so it can be performed only at a specific advanced medical institution.
  • neonatal asphyxia and neonatal HIE can occur unexpectedly in any birthing facility, and neonatal transport to advanced medical institutions is necessary to perform hypothermia therapy.
  • neonatal HIE has progressed before or at birth, and even if it is hypothermic therapy, it will not be effective unless treatment is started within 6 hours after birth as described above.
  • Non-patent Document 12 Furthermore, even when hypothermia therapy can be performed, rebound elevation of brain pressure may occur during rewarming after surgery (Non-patent Document 12). Therefore, in developmental brains such as newborns, measures against brain edema after hypothermia therapy are very important (Non-patent Document 13). Thus, hypothermia therapy, which is currently most effective for neonatal HIE, has various problems.
  • hypothermia therapy instead of hypothermia therapy, after the onset of neonatal HIE, its pathology can be detected quickly and accurately, and it can be performed quickly and easily at any birthing facility, and brain edema due to increased rebound of brain pressure Development of a new treatment method with a low risk of occurrence of the disease is desired.
  • the present invention provides a method for early and chemically detecting cerebral circulatory disturbance in a subject, and can be rapidly implemented after detection for cerebral circulatory disorder such as neonatal HIE, and requires hypothermia therapy.
  • the purpose is to develop and provide a simple cerebral circulatory disorder inhibitor.
  • the present inventors made a model rat of a newborn HIE, the expression significantly increased or decreased at the onset of newborn HIE, and conversely, the increase or decrease was eliminated by hypothermia treatment treatment
  • the genes were identified.
  • the function of a gene translation product whose expression was significantly increased during the onset of neonatal HIE was suppressed with a neutralizing antibody against the gene product, apoptosis of brain neurons and cerebral edema due to cerebral circulation disorder could be significantly suppressed. did it.
  • the present invention is based on these experimental results and provides the following.
  • a cerebral circulation disorder detection marker comprising a gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12, a gene product of a mutant gene thereof, or a part thereof.
  • the detection marker according to (1), wherein the cerebral circulation disorder is neonatal hypoxic ischemic encephalopathy.
  • a method for detecting cerebral circulatory disturbance in a subject wherein the amount of the cerebral circulatory disorder detection marker described in (1) is measured per unit amount of a sample obtained from the subject and a healthy subject.
  • the cerebral circulation disorder detection marker is a product of a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 12 or a part thereof.
  • the method comprising a comparative differentiation step of identifying that the subject has a cerebral circulation disorder when the measured value is significantly high in the subject.
  • a cerebral circulation disorder detection kit comprising a probe, a primer set, an aptamer, and / or an antibody for measuring one or more cerebral circulation disorder detection markers according to (1) or (2).
  • the apoptosis inhibitor according to (7) which is composed of an antibody, aptamer or low molecular weight compound against the gene translation product and suppresses the function of the gene translation product.
  • the apoptosis inhibitor according to (8) comprising a low-molecular compound that suppresses the function of the gene translation product consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10,
  • the apoptosis inhibitor, wherein the low molecular weight compound is selected from the group consisting of PLAzPC, ginkgolide B, Spiro, kappa-carragreenan, resveratol, pterostibene, polyinosonic acid and Angiotensin (1-7).
  • the apoptosis inhibitor according to (7), wherein the suppression of gene expression comprises an RNA interference agent, antisense nucleic acid, nucleic acid enzyme, or U1 adapter for a gene transcription product, and suppresses the expression of the gene.
  • a cerebral circulation disorder inhibitor comprising the apoptosis inhibitor according to (11) as an active ingredient.
  • cerebral circulation disorder in a subject can be chemically detected early.
  • an inhibitor that can be quickly and easily performed after detection for cerebral circulation disorders such as neonatal HIE and has a low risk of occurrence of cerebral edema.
  • HIE group Hypoxic ischemic encephalopathy group (HIE group) model rat, hypothermia therapy group (HT group) model rat and control group (CTL group) rat, and further, the HIE treatment group (HIE + anti-LOX) with the cerebral circulation disorder inhibitor of the present invention -1 antibody group)
  • HIE treatment group HIE + anti-LOX
  • Rats and PBS group HIE + PBS group rats for the control are shown. It is the result of in situ hybridization showing the expression site of LOX-1.
  • A is a coronal cross-sectional view of the brain
  • B is a 20-fold enlarged view in the black frame of FIG.
  • the site indicated by the arrow is the site showing LOX-1 expression.
  • FIG. B the site indicated by the arrow is the site showing LOX-1 expression.
  • FIG. 2 shows coronal sectional views of Nissl-stained brains of each group shown in FIG.
  • a region surrounded by a broken-line frame of the infarct side left hemisphere (L) indicates the area of the damaged tissue.
  • staining figure which shows the apoptotic cell in the cerebral infarction side left hemisphere of each group shown in FIG.
  • the result of evaluating the expression level of active caspase 3 which is an apoptosis-inducing protein is shown. * Indicates p ⁇ 0.05.
  • the cerebral water content ratio of the cerebral infarction side left brain water content to the right brain water content is shown.
  • Cerebral circulation disorder detection marker 1-1 Outline
  • summary The 1st aspect of this invention is a cerebral circulation disorder detection marker.
  • the cerebral circulatory disorder detection marker of the present invention comprises a gene product of a specific gene or a mutant gene thereof, or a part thereof, and measures the amount present in a sample derived from the subject, whereby the brain in the subject is measured. Circulation failure can be detected.
  • Cerebral circulation disorder refers to cerebral nerve cell damage caused by fluctuations in blood circulation in the brain such as a decrease in cerebral blood flow, and cerebral dysfunction or brain cell damage caused thereby.
  • Examples include neonatal hypoxic ischemic encephalopathy (neonatal HIE), cerebral infarction, cerebral embolism, cerebrovascular dementia and the like.
  • the cerebral circulation disorder is not particularly limited, but the preferred cerebral circulation disorder in each embodiment of the present invention is neonatal HIE.
  • the “cerebral circulation disorder detection marker” refers to a biomarker comprising 12 gene genes or gene products of mutant genes thereof, or a part thereof, and capable of detecting cerebral circulation disorder in a subject.
  • the configuration of the cerebral circulation disorder detection marker will be specifically described below.
  • the “12 types of genes” are human-derived genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 shown in Table 1 whose expression increases or decreases significantly with the onset of cerebral circulation disorder.
  • the Lox-1 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is preferable as the cerebral circulation disorder detection marker of the present invention.
  • the gene shown in SEQ ID NO: 1 is a gene whose expression is significantly decreased with the onset of cerebral circulation disorder
  • the genes shown in SEQ ID NOS: 2 to 12 are with the onset of cerebral circulation disorder.
  • the “mutant gene thereof” refers to a gene having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the human-derived gene having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12, SEQ ID NO: From a nucleotide sequence having 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90%, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity to the nucleotide sequence shown in 1-12 Or a gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12.
  • the “several” refers to 2 to 10, for example, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, and 2 to 3.
  • the “identity” refers to the ratio of the number of identical bases to the total number of bases shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 when two base sequences are aligned with or without introducing an appropriate gap. (%).
  • the “stringent conditions” refers to conditions under which specific hybrids are formed with the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 and non-specific hybrids are not substantially formed. Usually, conditions of low stringency to high stringency can be mentioned, but conditions of high stringency are preferable. Low stringent conditions are conditions in which, for example, washing is performed at 42 ° C. to 50 ° C. using a buffer containing 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS in the post-hybridization washing.
  • the highly stringent conditions are conditions in which, for example, washing is performed at 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS in the post-hybridization washing.
  • the lower the salt concentration and the higher the temperature the higher the stringent conditions.
  • the low salt concentration here refers to, for example, 15 to 750 mM, preferably 15 to 500 mM, 15 to 300 mM, or 15 to 200 mM.
  • the high temperature here is specifically, for example, 50 to 68 ° C. or 55 to 70 ° C.
  • mutated gene in the present invention include a mutated gene based on a polymorphism such as SNP (single nucleotide polymorphism) of a human-derived gene comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12, a splice variant, and amino acid degeneracy.
  • a polymorphism such as SNP (single nucleotide polymorphism) of a human-derived gene comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12, a splice variant, and amino acid degeneracy.
  • orthologous genes in other biological species of human-derived genes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 can be mentioned.
  • the “gene product” is a product generated by the expression of a human-derived gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 or a mutant gene thereof, and specifically, a gene transcription product comprising RNA (however, , Including cDNA obtained by reverse transcription), and gene translation products consisting of peptides.
  • the gene transcript is composed of, for example, mRNA (including mRNA precursor) of a gene comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 and 8 to 11 and nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 12. Examples include small nuclear RNA that is a transcription product of a gene.
  • the gene translation product corresponds to, for example, a protein that is a translation product of a gene having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 and 8 to 11.
  • a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • An example of a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • Examples of the translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 include a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • Examples of the translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 include a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • An example of a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • An example of a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • An example of a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18.
  • An example of a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • An example of a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • An example of a translation product of the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • the “part” refers to a part of the gene product.
  • the “part” here means a fragment. That is, it corresponds to a fragment of a gene product generated by the expression of a human-derived gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 or a mutant gene thereof.
  • an mRNA fragment that is a gene transcription product consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 and 8 to 11, or a nuclear transcript that is a gene transcription product consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 12 examples include small RNA fragments.
  • the gene product may be present in a fragmented state by being degraded by a nuclease, protease, peptidase or the like present in the living body. Therefore, a part of the gene product can be a marker for detecting cerebral circulation disorder.
  • the cerebral circulation disorder detection marker of the present invention can be a biomarker for accurately detecting the pathological condition after the onset of cerebral circulation disorder. 2.
  • the 2nd aspect of this invention is a cerebral circulation disorder detection method.
  • the method for detecting cerebral circulation of the present invention measures the amount of the cerebral circulation disorder detection marker of the first aspect present in a sample derived from a subject, and the amount of the cerebral circulation disorder detection marker present in a sample derived from a healthy subject. Cerebral circulation disorder in a subject can be detected.
  • the cerebral circulation disorder detection method of the present invention includes (1) a measurement step and (2) a comparative differentiation step as essential steps. Hereinafter, each step will be specifically described.
  • Measurement step refers to measuring the amount of the cerebral circulation disorder detection marker according to the first aspect contained in a unit amount of a sample obtained from a subject and a healthy subject, and obtaining the measured value. It is a process.
  • the “subject” refers to an individual animal that is subjected to the method of this embodiment for the purpose of detecting cerebral circulation disorder.
  • the animal here is a mammal, preferably a human.
  • “healthy body” refers to an animal individual that does not have a cerebral circulation disorder, preferably a healthy animal individual that does not have any disease or abnormality.
  • the healthy body used in this embodiment is the same species as the subject.
  • various physical conditions such as age (weeks and ages), height (body length), and body weight are the same or similar to the subject.
  • the obtained sample refers to a sample collected from each of the subject and the healthy subject.
  • sample refers to body fluid, tissue and / or cell.
  • body fluid refers to a biological fluid that may contain a marker for detecting cerebral circulation disorder.
  • blood includes whole blood, plasma and serum.
  • the whole blood may be venous blood or arterial blood.
  • tissue refers to a tissue constituting a living body that can include a cerebral circulation disorder detection marker.
  • the type of tissue is not particularly limited, and examples thereof include mucosa, submucosa, connective tissue, and the like.
  • the sample is preferably of the same type or approximate to the subject and the healthy subject.
  • the “unit amount” is a predetermined unit of volume or weight, and examples thereof include microliter, milliliter, microgram, milligram, gram and the like.
  • the “measured value” is a value indicating the amount of the cerebral circulation disorder detection marker measured in this step.
  • the measured value may be an absolute value such as volume or weight, or a relative value such as concentration, ionic strength, absorbance or fluorescence intensity.
  • the amount of a cerebral circulation disorder detection marker contained in each of a sample derived from a subject (referred to as “subject sample”) and a sample derived from a healthy sample (referred to as “healthy sample”) is measured.
  • the cerebral circulatory disorder detection marker to be measured may be any one of the cerebral circulatory disorder detection markers described in the first embodiment, but may be measured in combination of two or more. By measuring in combination with a plurality of cerebral circulatory disorder detection markers, the false positive rate or false negative rate of cerebral circulatory disorder can be lowered and the detection accuracy can be increased.
  • the method for measuring the cerebral circulation disorder detection marker is not particularly limited as long as it is a known nucleic acid or peptide quantification method.
  • quantitative nucleic acid amplification methods are used for nucleic acids
  • immunological detection methods or mass spectrometry methods are used for peptides.
  • Quantitative nucleic acid amplification methods include, for example, quantitative PCR methods (including gel electrophoresis, SYBR green method, and real-time PCR method).
  • immunological detection methods include enzyme immunoassay (including ELISA and EIA methods), fluorescence immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, surface plasmon resonance (SPR method) , Quartz crystal microbalance (QCM) method, immunoturbidimetric method, latex agglutination immunoassay method, latex turbidimetric method, erythrocyte agglutination reaction, particle agglutination reaction method, colloidal gold method, capillary electrophoresis, Western blotting or immunization Histochemical method (immunostaining method) can be mentioned.
  • Mass spectrometry includes high performance liquid chromatograph mass spectrometry (LC-MS), high performance liquid chromatograph tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), gas chromatograph mass spectrometry (GC-MS), and gas chromatograph tandem mass. Analytical methods (GC-MS / MS), capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS) and ICP mass spectrometry (ICP-MS) can be mentioned.
  • the measurement value of the healthy body in the measurement step is obtained by measuring the amount of each cerebral circulation disorder detection marker in a sample obtained from a healthy body having various physical conditions in advance and creating a database of it. May be.
  • Comparative differentiation process is a process in which the measured value of a cerebral circulation disorder detection marker in a subject and a healthy body is compared, and the subject identifies the presence or absence of cerebral circulation disorder from the result. .
  • the measured values of the same kind of cerebral circulation disorder detection marker in the subject and healthy subject obtained in the measurement step are compared.
  • a known nucleic acid or protein that is expected to have no quantitative difference in the sample per unit amount may be used as the endogenous control.
  • endogenous control nucleic acids include ⁇ -actin, GAPDH, and ⁇ -glucronidase (GUS), and examples of endogenous control proteins include albumin.
  • the comparison results are identified as follows according to the type of cerebral circulation disorder detection marker.
  • the cerebral circulatory disorder detection marker is a gene product consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof, if the measured value of the subject is significantly lower than that of a healthy subject, the subject is cerebral circulatory disorder Are identified as having Conversely, if it is significantly higher, it is determined that the subject is unlikely to have cerebral circulation disorder.
  • the cerebral circulatory disorder detection marker is a gene product comprising a base sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 12 or a part thereof, when the measured value of the subject is significantly higher than that of a healthy subject, the subject Is identified as having cerebral circulation disorder. Conversely, if it is significantly low, the subject is unlikely to have a cerebral circulation disorder.
  • the cerebral circulation disorder detection marker of the present invention can be used to detect a cerebral circulation disorder easily, accurately and quickly in any medical facility. 3. Cerebral circulation disorder detection kit 3-1.
  • the 3rd aspect of this invention is a cerebral circulation disorder detection kit.
  • the cerebral circulation disorder kit of the present invention is a kit containing a sample, a reagent, an instruction, etc. necessary for detecting and / or measuring a cerebral circulation disorder detection marker in a sample in an appropriate combination or comprehensively, It can be used in the measurement step or the like in the cerebral circulation disorder detection method of the second aspect.
  • This kit includes at least one of a probe, a primer set, an aptamer, and an antibody as an essential component. Any of these can specifically detect the specific cerebral circulation disorder detection marker described in the first embodiment.
  • the probe and primer set is a nucleic acid containing a base sequence complementary to a specific region of the base sequence constituting the cerebral circulation disorder detection marker when the cerebral circulation disorder detection marker to be detected is a gene transcription product. is there.
  • mRNA or cDNA that is a Lox-1 gene transcription product comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10
  • a primer set comprising a nucleotide sequence capable of specifically amplifying the Lox-1 gene using the cDNA as a template.
  • the nucleic acid constituting the probe or primer is a naturally occurring nucleic acid (DNA and RNA), a chemically modified nucleic acid (for example, methylphosphonate DNA / RNA, phosphorothioate DNA / RNA, phosphoramidate DNA / RNA) , 2'-O-methyl DNA / RNA, etc.), artificially constructed or artificially modified artificial nucleic acids having similar properties and / or structures to natural nucleic acids, nucleic acid analogues (peptide nucleic acids) (PNA: Peptide Nucleic Acid), Peptide Nucleic Acid (PHONA) with Phosphate Group, Cross-linked Nucleic Acid (BNA / LNA: Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid), Morpholino Nucleic Acid (including Formolino Oligo), etc.
  • DNA and RNA naturally occurring nucleic acid
  • a chemically modified nucleic acid for example, methylphosphonate DNA / RNA,
  • the nucleic acid constituting the probe or primer may be labeled with a phosphate group, a sugar and / or a base, if necessary.
  • a labeling substance known in the art can be used.
  • radioisotopes eg, 32 P, 3 H, 14 C
  • DIG dimethyl methacrylate
  • biotin e.g, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493 , NBD, TAMRA
  • a luminescent substance for example, acridinium ester.
  • Aptamers and antibodies can be used when the cerebral circulation disorder detection marker to be detected is a gene translation product, ie, a peptide. These basic structures will be described in detail in “4. Apoptosis inhibitors” in the next chapter.
  • the aptamer and antibody which can be included in the kit of this aspect may be labeled as needed. For example, if it is a nucleic acid aptamer, the labeling substance well-known in the said field
  • fluorescent dyes Alexa, fluorescein, FITC, rhodamine, Texas red, Cy3, Cy5
  • fluorescent proteins eg, PE, APC, GFP
  • enzymes eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase
  • a radioisotope for example, 3 H, 14 C, 35 S
  • a known labeling substance such as biotin or (strept) avidin
  • the kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody, a substrate necessary for detection of the label, a positive control or negative control, or a buffer used for dilution or washing of the sample, if necessary. Can do.
  • instructions for using the kit can be included. 4).
  • summary The 4th aspect of this invention is an apoptosis inhibitor.
  • the apoptosis inhibitor of the present invention suppresses the function of a marker for detecting cerebral circulation disorder, thereby suppressing apoptosis of cells, particularly nerve cells damaged by inflammatory substances such as glutamate neurotoxicity and cytokines. it can. 4-2.
  • the expression level of the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 12 or a mutant gene thereof is increased at the onset of cerebral circulation disorder, and as a result, apoptosis of neurons is induced. Therefore, if the expression of those genes or their mutant genes and / or the function of the gene consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 6 and 8 to 11 or the gene translation product of any one of the mutant genes is suppressed, Apoptosis can be suppressed.
  • the apoptosis inhibitor of the present invention utilizes this principle, and is any one gene consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 12 shown in Table 1 or a mutant gene thereof (hereinafter referred to as “target gene”). ) Expression, or the function of any one of the gene consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 6 and 8 to 11 or a mutant gene thereof (hereinafter referred to as “target protein”), The cerebral circulation disorder detection marker according to the first aspect is suppressed.
  • Apoptosis is caspase-dependent programmed cell death in multicellular organisms.
  • the cells undergoing apoptosis are not particularly limited. Nerve cells, particularly brain cells are preferred.
  • apoptosis inhibitor that suppresses the expression of the target gene translates the mRNA of the gene transcription product (hereinafter referred to as “target mRNA”) after transcription of the target gene.
  • target mRNA the gene transcription product
  • a substance that inhibits or suppresses mRNA splicing of the target mRNA a substance that inhibits or suppresses target mRNA extra-nuclear transport, and degrades the target mRNA outside the nucleus like gene silencing Examples include substances that inhibit the translation of a substance or target mRNA.
  • a substance that degrades the target mRNA or a substance that inhibits translation of the target mRNA for example, an RNA interference agent, antisense nucleic acid, nucleic acid enzyme, or U1 adapter of the target gene is applicable.
  • each apoptosis inhibitor will be specifically described.
  • RNA interference agent refers to a substance that induces RNA interference (RNAi) in vivo.
  • RNA interference is sequence-specific post-transcriptional gene silencing that suppresses the expression of a gene through degradation of the targeted gene transcript.
  • target gene RNA interference agent in the present specification refers to a substance capable of inducing specific silencing with respect to a gene transcription product comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 12. For example, siRNA or shRNA can be mentioned.
  • RNA interference see, for example, Bass BL, 2000, Cell, 101, 235-238; Sharp PA, 2001, Genes Dev., 15, 485-490; Zamore PD, 2002, Science, 296, 1265-1269; Dernburg, AF & Karpen, GH, 2002, Cell, 111,159-162.
  • Zamore PD 2002, Science, 296, 1265-1269
  • Dernburg AF & Karpen
  • GH GH
  • siRNA small interference RNA
  • siRNA small interference RNA
  • RNA sense strand
  • passenger strand a sense strand
  • guide strand a small double-stranded RNA.
  • siRNA can induce RNA interference by introduction into a subject's cells (eukaryotic cells) (Fire A. et al., 1998, Nature, 391, 806-811).
  • SiRNA may be designed by a known method based on the base sequence of the target gene. For example, the method of Ui-Tei et al. (Nucleic Acids Res., 2004, 32: 936-948), the method of Reynolds et al. (Nat. Biotechnol., 2004, 22: 326-330), the method of Amarzguioui et al. (Biochem. Biophys It can be designed based on the method of (.Res. (Communication), 2004, (316): (1050-1058).
  • siRNA design examples include RNA derived from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 to 12 or any one of its mutant genes (for example, the nucleotide sequence of Lox-1 gene shown in SEQ ID NO: 10).
  • the base sequence of the sense strand a continuous base sequence of 15 to 35 bases, preferably 15 to 30 bases, or 18 to 25 bases is selected as the selection region. Attention should be paid so that the base sequence of the region to be selected is completely matched with the base sequence of the target gene to be targeted. Therefore, it is preferable to design the selection region so as not to include a known mutation site (for example, including SNP) of the target gene.
  • the base sequence of the RNA antisense strand is a base sequence complementary to the selected base sequence of the RNA sense strand.
  • the T (thymine) base in the selected region is converted to U (uracil) base in both the sense strand and the antisense strand.
  • the selection region of the RNA sense strand is not particularly limited as long as it is a sequence specific to the target gene.
  • the region is preferably at least 50 bases from the start codon, more preferably a region downstream from 70 bases to 100 bases. Furthermore, it is preferable to select a base sequence region having AA (adenine-adenine) on the 5 'side in the RNA sense strand candidate region.
  • the GC (guanine-cytosine) content in the selected region is preferably 20-80%, more preferably 30-70% or 40-60%. Numerous siRNA designs are available on the website, and if a base sequence of a target gene is input, an effective and appropriate siRNA can be designed on the web.
  • siRNA design websites include siDirect (http://design.RNAi.jp/), siDESIGN Center (http://www.dharmacon.com/designcenter/designcenterpage.aspx), siRNA Selection Server (http: //jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) etc.
  • siRNA Even if one or both ends of siRNA have a base sequence consisting of one or more DNA, RNA, and / or nucleic acid analogues not related to the base sequence of the target gene or a base sequence complementary thereto Good.
  • the number of bases present at the end of such siRNA is not particularly limited, but is preferably in the range of 1-20. Specifically, for example, TT (thymine-thymine) or UU (uracil-uracil) is added to the 3 ′ end of the siRNA sense strand and siRNA antisense strand (Tuschl T et al). ., 1999, Genes Dev, 13 (24): 3191-7).
  • shRNA short hairpin RNA refers to a single-stranded RNA in which the siRNA is linked by an appropriate short spacer sequence. Therefore, shRNA has a hairpin-type stem-loop structure as a whole molecule by forming a stem structure by pairing the sense region and the antisense region with each other within one molecule and further forming a loop structure of the spacer sequence. Have. When shRNA is introduced into a cell, the loop structure is cleaved to generate a double-stranded RNA molecule, ie, siRNA. The resulting siRNA can suppress the expression of the target gene by the same RNA interference mechanism as the siRNA described in the previous section.
  • the 3 ′ end of the sense region in the siRNA and the 5 ′ end of the antisense strand are linked by a spacer sequence.
  • the spacer sequence is usually 3 to 24 bases, preferably 4 to 15 bases.
  • the spacer sequence is not particularly limited as long as siRNA can be base-paired.
  • Antisense nucleic acid refers to mRNA that is a transcription product of a target gene, has a base sequence complementary to all or part of its base sequence, and hybridizes to the target mRNA.
  • the nucleic acid is mainly composed of DNA, but can include, for example, nucleic acid analogs such as PNA and LNA and RNA.
  • Nucleic acid enzyme is a nucleic acid molecule having catalytic activity, which specifically binds using a target mRNA as a substrate and has a catalytic function of cleaving a specific site in the target mRNA.
  • Known nucleic acid enzymes include deoxyribozymes composed of DNA and ribozymes composed of RNA, also called riboenzymes, but any nucleic acid enzyme in the present specification may be used.
  • U1 adapter has a 5′-side “target domain” complementary to the 3 ′ end exon in the mRNA precursor of the target gene and a sequence complementary to the 5 ′ region of U1 snRNA. It is a bifunctional single-stranded nucleic acid consisting of about 25 bases including a 3 ′ “U1 domain” (Goraczniak R. et al., 2009, Nat Biotechnol., Vol 27, p257-263).
  • U1 small nuclear ribonucleoprotein (U1 snRNP) containing U1 snRNA binds around the poly A signal in the mRNA precursor of the target gene, specifically polyadenylation of the mRNA. Inhibit. As a result, the mRNA precursor of the target gene is destabilized and then degraded in the nucleus, resulting in gene silencing. 4-2-2.
  • An apoptosis inhibitor that suppresses the function of the gene translation product of the target gene refers to a gene consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 6 and 8 to 11 or its It is a substance that acts on the target protein, which is a gene translation product of any one of the mutant genes, and can specifically suppress its function.
  • an inhibitor that can inactivate the target protein by binding to the active site of the target protein such as an antagonist or a competitor, is applicable.
  • Specific examples include an antibody against the target protein, an aptamer, or a low molecular weight compound.
  • Antibody anti-target protein antibody
  • the antibody of this embodiment includes a framework region (FR) derived from an immunoglobulin and a complementarity determining region (CDR), specifically binds to a target protein that is an antigen, and functions thereof A polypeptide having a function as a neutralizing antibody that inhibits or suppresses.
  • FR framework region
  • CDR complementarity determining region
  • the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 6 and 8 to 11 or the gene translation product of the mutant gene for example, any one of the proteins consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 21 It is a neutralizing antibody that specifically binds to its target protein and inhibits or suppresses its function as a protein.
  • the LOX-1 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 which is the translation product of the Lox-1 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is used as a target protein, and this protein is specifically bound to the LOX- 1 Anti-LOX-1 antibody that inhibits or suppresses the function of the protein.
  • the antibodies of this embodiment include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibodies, synthetic antibodies, and antibody fragments.
  • the “specific binding” means binding only to a target antigen (for example, human LOX-1 or a fragment thereof in the case of an anti-human LOX-1 antibody).
  • the immunoglobulin molecule can be of any class (eg, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and IgY), or any subclass (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1). IgA2).
  • the antibody to be administered is derived from animals including mammals and birds. Examples include mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, donkeys, sheep, camels, horses, chickens or humans.
  • an antibody derived from the same species as the species to which the apoptosis inhibitor of the present invention is administered is preferable.
  • the monoclonal antibody or polyclonal antibody as the apoptosis inhibitor is preferably a human-derived antibody.
  • “Recombinant antibody” refers to a chimeric antibody, a humanized antibody, or a multispecific antibody.
  • a “chimeric antibody” is an antibody prepared by combining amino acid sequences of antibodies derived from different animals, and is an antibody in which the variable region (V region) of one antibody is replaced with the V region of another antibody.
  • V region variable region
  • “Humanized antibody” replaces the complementarity determining region (CDR; CDR1, CDR2, and CDR3) in the variable region (V region) of a non-human mammal, for example, an appropriate mouse antibody, with the CDR of a human monoclonal antibody Grafted antibody.
  • the chimeric antibody and humanized antibody have a heavy chain and light chain V region, or a complementarity determining region in the heavy chain and light chain V region derived from a non-human animal antibody such as a mouse, but the C region or V region. Since the framework region (FR; FR1, FR2, FR3, and FR4) and the C region of heavy chain and light chain are derived from human antibodies, immune responses to the antibodies in the human body can be reduced.
  • Multispecific antibody refers to a multivalent antibody, that is, an antibody having a plurality of antigen-binding sites in one molecule, each antigen-binding site binding to a different epitope.
  • bispecific antibodies that have two antigen-binding sites, such as IgG, that bind to different epitopes on each antigen-binding site can be mentioned.
  • “Synthetic antibody” refers to an antibody synthesized chemically or by using recombinant DNA methods.
  • an antibody newly synthesized using a recombinant DNA method can be mentioned.
  • single chain antibodies scFv: s ingle c hain F ragment of v ariable region
  • diabodies diabodies
  • triabody triabody
  • tetrabodies tetrabody
  • the “antibody fragment” corresponds to, for example, Fab, F (ab ′ 2 ), Fv and the like.
  • Antibody modifications include functional modifications or label modifications.
  • Functional modifications include, for example, glycosylation, acetylation, formylation, amidation, phosphorylation, or PEGylation.
  • Modifications on the label include fluorescent dyes (fluorescein, FITC, rhodamine, Texas red, Cy3, Cy5), fluorescent proteins (eg, PE, APC, GFP), enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase) And labeling with a radioisotope (eg 3 H, 14 C, 35 S) or biotin or (strept) avidin.
  • a radioisotope eg 3 H, 14 C, 35 S
  • biotin or (strept) avidin eg 3 H, 14 C, 35 S
  • anti-target protein antibodies that can be used in the present invention, investigation of brain edema, cerebral infarction, or brain tissue damage by head echo, CT, MRI, etc., or cerebrospinal fluid examination for neuronal damage By examining it, the severity of cerebral circulation disorder can be evaluated.
  • the anti-target protein antibody may be prepared by a method known in the art. For example, the method described in Green, MR and Sambrook, J., (2012; mentioned above) may be referred to. Moreover, when the antibody with respect to a target protein is marketed from the manufacturer, it can also be utilized.
  • An “aptamer” is a ligand molecule that has the ability to bind firmly and specifically to a target substance through a three-dimensional structure and specifically inhibit the function of the target substance. Aptamers can be broadly classified into nucleic acid aptamers and peptide aptamers according to the types of molecules.
  • the aptamer as an apoptosis inhibitor of the present invention uses a gene translation product of any one of the genes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 6 and 8 to 11 or a mutant gene thereof as a target protein, and specifically functions thereof. Any can be used as long as it can be suppressed.
  • a nucleic acid aptamer is preferable.
  • aptamers see, for example, Janasena, Clin. Chem. 45: 1628-1650 (1999).
  • Nucleic acid aptamer refers to an aptamer composed of nucleic acids.
  • the nucleic acid constituting the nucleic acid aptamer may be any of DNA, RNA, or a combination thereof. If necessary, a chemically modified nucleic acid such as PNA, LNA / BNA, methylphosphonate DNA, phosphorothioate DNA, 2′-O-methyl RNA may be included.
  • the aptamer may be labeled as necessary.
  • any nucleic acid labeling substance known in the art can be used.
  • radioisotopes eg, 32 P, 3 H, 14 C
  • DIG diatomic layer indicator
  • biotin e.g., glutathione
  • fluorescent dyes eg, FITC, Texas, cy3, cy5, cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493 , NBD, TAMRA
  • a luminescent substance for example, acridinium ester
  • An aptamer labeled with such a labeling substance can be a useful tool for detecting an aptamer bound to a target protein.
  • Such a labeled aptamer can also be used as an aptamer for detecting a cerebral circulation disorder detection marker in the cerebral circulation disorder detection kit of the third aspect.
  • Aptamers can be prepared by methods known in the art using any one target protein as a target molecule. For example, it may be produced by in-vitro sorting using a SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • the SELEX method is to select an RNA molecule bound to a target molecule from an RNA pool composed of a large number of RNA molecules having a random sequence region and primer binding regions at both ends thereof, and after recovery and amplification by RT-PCR reaction, Transcription using the obtained cDNA molecule as a template and making it into the RNA pool of the next round is repeated several to several tens of rounds to select RNA with stronger binding force to the target molecule Is the method.
  • the base sequence lengths of the random sequence region and the primer binding region are not particularly limited. Generally, the random sequence region is 20 to 80 bases, and the primer binding region is 15 to 40 bases.
  • a molecule composed of RNA molecules that have not been bound to the molecule may be used by mixing a molecule similar to the target molecule and an RNA pool.
  • the RNA molecule finally obtained by the above method is used as a VHSV-binding RNA aptamer.
  • the SELEX method is a known method, and a specific method may be performed according to, for example, Pan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513).
  • a peptide aptamer is an aptamer composed of amino acids, and is a 1-6 kD peptide molecule that recognizes the surface structure of a specific target molecule and specifically binds like an antibody. It can be produced using a phage display method or a cell surface display method. What is necessary is just to produce the manufacturing method of a peptide aptamer based on a well-known method in the said field
  • the “low molecular weight compound” refers to a ligand molecule having a molecular weight of 10,000 or less, which binds to a target substance and has an action of specifically suppressing its function. Normally, only chemical substances are applicable, but in the present specification, the concept includes peptide molecules other than antibodies or aptamers, and nucleic acid molecules other than nucleic acid aptamers.
  • the kind of low molecular compound is not particularly limited. Any kind may be used as long as it has an inhibitory effect on the target substance.
  • Lox-1 represented by SEQ ID NO: 10 the chemical substances PLAzPC, ginkgolide B, Spiro, kappa-carragreenan, resveratol, pterostibene, polyinosonic acid, etc., and the peptide Angiotensin (1-7) are accepted. Since it becomes an antagonist of Lox-1, which is a body, when the target substance is Lox-1, any of these can be a low molecular weight compound in the present specification. 4-3. Effect The apoptosis inhibitor of the present invention can suppress apoptosis of cells, particularly nerve cells damaged by inflammatory substances such as glutamate neurotoxicity and cytokines, by suppressing the function of the cerebral circulation disorder detection marker. it can.
  • the apoptosis inhibitor of the present invention can be used as a progression inhibitor of diseases caused by apoptosis of brain neurons, such as HIE (including neonatal HIE), Parkinson's disease and Alzheimer's disease. 5.
  • summary The 5th aspect of this invention is a cerebral circulation disorder inhibitor.
  • a cerebral circulation disorder inhibitor of the present invention is a pharmaceutical composition comprising the apoptosis inhibitor as described in the fourth aspect as an active ingredient and capable of suppressing the onset or progression of cerebral circulation disorder such as neonatal HIE. is there. 5-2. Configuration 5-2-1. Active ingredient
  • the cerebral circulation disorder inhibitor of the present invention includes the apoptosis inhibitor described in the fourth aspect as an active ingredient.
  • the cerebral circulation disorder inhibitor of the present invention can contain two or more different apoptosis inhibitors described in the fourth aspect.
  • the content of the apoptosis inhibitor described in the fourth aspect to be blended with the cerebral circulation disorder inhibitor includes the type and / or effective amount of the apoptosis inhibitor, the type of cerebral circulation disorder, the dosage form of the drug composition, and the below-mentioned Since it differs depending on the type of carrier to be used, it may be appropriately determined in consideration of each condition.
  • the “effective amount” is an amount necessary for the apoptosis inhibitor to exert a function as an active ingredient in a cerebral circulation disorder inhibitor, and a side effect harmful to a living body to which the inhibitor is applied. Refers to an amount that imparts little or no. This effective amount may vary depending on various conditions such as subject information, route of administration, and number of doses.
  • subject information refers to various individual information of a living body to which a cerebral circulation disorder inhibitor is applied.
  • a cerebral circulation disorder inhibitor when suffering from a general health condition, a disease or a disease, Including progression and severity, age, weight, sex, diet, drug sensitivity, presence of concomitant drugs and resistance to treatment.
  • the cerebral circulation disorder is a neonatal HIE, it is determined based on the elapsed time after birth, the degree of progression or severity of HIE, and the like.
  • the final effective amount and the amount applied once or per day calculated based on the final effective amount are determined based on the judgment of a doctor or veterinarian based on the information of the subject.
  • the cerebral circulation disorder inhibitor of the present invention can include a pharmaceutically acceptable simple substance as necessary.
  • the carrier is mainly used for facilitating formulation and administration of a cerebral circulation disorder inhibitor and maintaining the dosage form and the drug effect.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to solvents and / or additives that can be used ordinarily in the field of pharmaceutical technology because they have no or very little adverse effects such as side effects on humans and other animals. An agent.
  • solvents that can be usually used in the formulation technical field include water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. These are preferably sterilized and preferably adjusted to be isotonic with blood as necessary.
  • additives that can be usually used in the field of pharmaceutical technology include, for example, excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, fluid addition modifiers, lubricants and the like.
  • Excipients include, for example, sugars (including but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, dextrin, maltodextrin, starch and cellulose), metal salts (eg, sodium chloride , Sodium phosphate, calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate, calcium carbonate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium, high molecular weight polyethylene glycol (PEG), pluronic, kaolin, silicic acid, or combinations thereof It is done.
  • sugars including but not limited to glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, dextrin, maltodextrin, starch and cellulose
  • metal salts eg, sodium chloride , Sodium phosphate, calcium phosphate, calcium sul
  • binder examples include starch paste, syrup, glucose solution, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, shellac and / or polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrants examples include starch, lactose, carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, alginic acid or sodium alginate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride Or a salt thereof.
  • the filler examples include the sugar and / or calcium phosphate (for example, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
  • emulsifier examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, and propylene glycol fatty acid ester.
  • Examples of the flow addition regulator and lubricant include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • the pharmaceutically acceptable carrier of the present invention may contain, as necessary, isotonic agents, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspending agents, diluents, surfactants, and stabilizers.
  • Agents absorption enhancers (eg, quaternary ammonium salts, sodium lauryl sulfate), extenders, pH adjusters, humectants (eg, glycerin, starch), adsorbents (eg, starch, lactose, kaolin, bentonite, colloids) Silica), disintegration inhibitors (eg, sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil), coating agents, colorants, preservatives, antioxidants, flavors, flavors, sweeteners, buffers, soothing agents.
  • absorption enhancers eg, quaternary ammonium salts, sodium lauryl sulfate
  • extenders pH adjusters
  • humectants eg, glycer
  • Etc. can also be included. 5-3. Dosage Form of Cerebral Circulation Disorder Inhibitor
  • the dosage form of the cerebral circulation disorder inhibitor varies depending on the administration method, and is appropriately selected according to the prescription conditions. Although the administration method will be described later, it can be roughly classified into oral administration and parenteral administration.
  • the dosage form suitable for oral administration examples include tablets, dragees, pills, capsules, drops, sublinguals, powders, powders, granules, liquids, lozenges and the like.
  • the tablet can be a tablet coated with a coating known in the art, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric tablet, a film-coated tablet, a double tablet or a multilayer tablet, if necessary.
  • dosage forms suitable for parenterals include injections, suspensions, emulsions, eye drops, nasal drops, creams, powders, pastes, gels, ointments, plasters or suppositories. Can be mentioned. These can be made into dosage forms suitable for the administration method, such as intra-tissue administration, local administration, or rectal administration.
  • dosage forms suitable for intra-tissue administration include injections.
  • dosage forms suitable for topical administration include solutions, creams, powders, pastes, gels, ointments, plasters, eye drops, and nasal drops.
  • a dosage form suitable for transrectal administration for example, a suppository can be mentioned.
  • each dosage form are not particularly limited as long as they are within the range of dosage forms known in the art.
  • the preferred method is injection.
  • the cerebral circulatory disorder inhibitor of the present invention is administered orally, intra-tissue (eg, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration), local administration (eg, transdermal administration) or It can be administered rectally.
  • the cerebral circulation disorder inhibitor is preferably administered in a dosage form suitable for these administration methods. For example, in the case of a preparation for oral administration, it can be administered in a solid, powder or liquid dosage unit.
  • any method such as subcutaneous administration, intramuscular administration or intravenous administration can be used. Administration via the bloodstream is preferred. Therefore, the preferred method of administration is injection.
  • the administration method by injection is particularly preferred when administering to neonatal HIE.
  • the injection site is not particularly limited. Examples include intravenous, intraarterial, intrahepatic, intramuscular, intraarticular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, percutaneous, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intranasal, intestinal, or sublingual. .
  • Intravenous injection such as intravenous injection or intraarterial injection is preferable.
  • the cerebral circulatory disorder inhibitor of the present invention can be immediately distributed to the whole body including the brain via the bloodstream, and is relatively less invasive and has a small burden on the subject. 5-5. Effect According to the cerebral circulatory disorder inhibitor of the present invention, special devices and equipment used for hypothermia therapy and the like are not required, and it can be performed early on patients, and the onset and progression of cerebral circulatory disorder can be easily performed And it can suppress efficiently.
  • Example 1. Preparation of each model animal for neonatal HIE, hypothermia therapy, and neonatal HIE treatment Rice et al. (Rice JE 3rd, et al., 1981, Ann Neurol.
  • HIE group hypoxic ischemic encephalopathy group
  • HT group hypothermia therapy group
  • SD day-old Sprague-Dawley rat
  • CTL group control group
  • PBS group HIE + PBS group
  • hypoxic-ischemic insult for the creation of a newborn HIE model (HIE group) is anesthetized in 220 neonates and unilateral carotid artery ligation is performed in the midline of the neck An incision was made, the left common carotid artery was identified, double ligated, and the artery was cut between ligations.
  • icHI load for the newborn HIE model was maintained at 8% hypoxia for 2 hours.
  • the body temperature of all rats was kept at 36 ° C. during HI loading. The body temperature was monitored by rectal temperature in one rat randomly selected in one experiment and controlled by a body temperature controller (ACT-101B, Unique Medical) using a heat mat.
  • Rats in the CTL group maintained their body temperature at 36 ° C for 3 hours at 7 days of age and did not undergo any other surgery or treatment.
  • Rats in the HIE group were subjected to HI load at 7 days of age, then maintained body temperature at 36 ° C. for 3 hours and returned to their mothers.
  • Rats in the HT group were subjected to HI loading at the age of 7 days, rapidly cooled to 28 ° C by external temperature and ice pack, kept at 28 ° C for 3 hours, and then returned to their mothers.
  • Anti-LOX-1 neutralizing antibody (R & D Systems) was used as a new therapeutic agent.
  • HI load was applied at the age of 7 days after birth, treatment was started immediately after HI load, and at the same time, the body temperature was maintained at 36 ° C. for 3 hours and then returned to the mother.
  • Anti-LOX-1 neutralizing antibody was dissolved in PBS and administered intraperitoneally at a dose of 6 ⁇ g / kg or 60 ⁇ g / kg.
  • LOX-1 Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1
  • ox-LDL oxidized low-density lipoprotein
  • ligands such as ox-LDL, apoptotic cells, C-reactive protein (CRP), and various stresses such as angiotensin II, CRP, interleukin-1 ⁇ and oxidant species. Expression is induced.
  • LOX-1 activation leads to apoptosis / dysfunction of vascular endothelial cells, adhesion of monocytes to vascular endothelial cells, proliferation / apoptosis of vascular smooth muscle cells, foam cell formation of macrophages, platelet aggregation (Mehta JL, et al., 2006, Cardiovasc Res. 69 (1): 36-45; Chen XP, et al., 2007, Cardiovasc Drug Rev. 25 (2): 146- 161; Dunn S, et al., 2008, Biochem J. 409 (2): 349-355; Navarra T, et al., 2010, J Atheroscler Thromb.
  • Lox-1 is one of the cerebral circulation disorder detection markers and apoptosis inhibitors of the present invention shown in Table 1, and was used as an example showing the effect in this example.
  • a PBS treatment group was prepared as a control, and PBS was intraperitoneally administered at 0.1 mL / dose. Each was dosed twice daily for up to 72 hours until the rats were sacrificed.
  • Rats were maintained in a room with a 12-hour light-dark cycle until sacrifice. 2. Preparation of brain tissue Rats are HI, phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) or 4% paraformaldehyde under anesthesia under anesthesia at 3, 6, 24, 48, and 72 hours after loading The brain was immediately removed after perfusion.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the brain for microarray analysis and quantitative polymerase chain reaction (PCR) was perfused with PBS and then cut in a coronal direction 1 mm in front of the pituitary stalk.
  • the lesion of the left cerebral cortex at the back of the cut surface was excised, frozen in liquid nitrogen, and stored at ⁇ 80 ° C. All procedures were performed with RNase free treatment.
  • Brains for Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were perfused with PBS, the cerebrum was divided into left and right hemispheres, frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 ° C. 3. Evaluation of infarct area The infarct area was evaluated by measuring the total area of normal tissue on the infarct side (left) hemisphere and the area on the whole hemisphere on the healthy side (right) with Nissl staining, and the ratio (normal tissue area on the infarct side (Area on the healthy side) was calculated and used to evaluate the infarct area. The area was measured with Image J software. 4).
  • Apoptosis was evaluated by TUNEL analysis on hippocampal and thalamic sections. TUNEL analysis was performed using the Apop Tag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore) according to the protocol. In addition, in order to confirm apoptosis in neurons, double staining was performed with an anti-NeuN mouse antibody (Millipore). In double staining, after fluorescence-labeled anti-digoxigenin antibody reaction, it was washed with PBS and blocked with 2% bovine serum albumin (BSA) in PBS. The mixture was reacted overnight at 4 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • RNA concentration of the extracted total RNA was measured with NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.).
  • Microarray analysis was performed using rats 3 hours after HI loading. Equal amounts of total RNA extracted separately from two rats were mixed to prepare one sample, and two samples were prepared for each group. Analysis was performed according to the attached protocol using Ambion®WT®Expression®Kit and GeneChip®WT®Terminal®Labeling®Kit®and Controls®Kit (Affymetrix, Santa Clara). The average value of 2 samples was calculated for each group, and the expression levels were compared between groups. The change in gene expression due to HI loading was considered to be a significant change when the increase was more than 3-fold, or the decrease was less than 1/2. As a result, 12 genes whose expression changed significantly before and after HI loading were isolated. These genes are shown in Table 2.
  • In situ hybridization In situ hybridization was performed to identify the expression site of Lox-1 (or Olr1), which was a candidate treatment target by gene expression analysis.
  • PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche) is used to amplify template DNA by PCR using the Lox-1 primer set (forward (F) primer: SEQ ID NO: 22; reverse (R) primer: SEQ ID NO: 23) Then, a probe labeled with digoxigenin (DIG) was prepared. The paraffin section of the coronal section at the hippocampus / thalamus level was deparaffinized and then re-fixed with 4% paraformaldehyde for 20 minutes.
  • Tris-buffered saline TBS, pH 7.5
  • protein denaturation was performed with 200 mM HCl for 10 minutes.
  • TBS Tris-buffered saline
  • 100 mM Tris (pH 8.0) containing 0.5% acetic anhydride for 10 minutes.
  • TBS Tris-buffered saline
  • a proteinase K solution (2 mM CaCl 2 , 20 ⁇ g / mL proteinase K in TBS) at 37 ° C. for 20 minutes, washed, dehydrated with ethanol after stopping the reaction. Thereafter, the section and the probe were hybridized at 55 ° C. for 16 hours.
  • Astrason Ultrasonic Processor XL (Misonix) in tissue lysate 50mM Tris-HCl, pH7.4, 0.15M NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% deoxycholic acid was used to dissolve and extract the protein.
  • the protein concentration of the extract was measured using BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.).
  • Anti-active-caspase 3 rabbit antibody (1000-fold diluted) (Sigma-Aldrich Corporate), anti-occludin rabbit antibody (250-fold diluted) (Zymed Laboratories Inc.), anti-ZO-1 rabbit antibody (500-fold diluted) as primary antibodies (Zymed Laboratories Inc.), an anti-Gapdh rabbit antibody (diluted 1000 times) (Abcam) was used. After detecting a specific band, the relative expression level was evaluated by Image Quant TL (GE Healthcare). Gapdh was corrected as a reference protein. The results are shown in FIG.
  • Rat MDA ELISA Kit (CUSABIO) was used and ELISA was performed according to the protocol. The MDA level was corrected by the protein concentration of the sample. All specimens were detected in duplicate, and the average value was used. 8). Evaluation of cerebral edema As an evaluation of cerebral edema, cerebral water content was evaluated. Rats were anesthetized with diethyl ether inhalation 24, 48, and 72 hours after HI loading, and the brain was immediately removed. Immediately afterwards, the left and right cerebral hemispheres were cut and weighed (weight before drying). Thereafter, the brain was dried in an oven at 85 ° C.
  • FIG. 2 shows the expression site of LOX-1 by in situ hybridization.
  • FIG. B shows that LOX-1 is expressed in neurons in the cerebral cortex.
  • Fig. 3 shows coronal sectional views of each group stained with Nissl.
  • anti-LOX which is one of the cerebral circulatory disorder inhibitors of the present invention in this HIE group.
  • the area of the injured tissue decreased.
  • FIG. 4 shows the cells in the left hemisphere on the side of cerebral infarction stained with TUNEL in each group.
  • TUNEL-positive cells that have undergone apoptosis are the HIE + anti-LOX-1 antibody group in which the anti-LOX-1 antibody, which is one of the cerebral circulatory disorder inhibitors of the present invention, is administered to the HIE group as in the result of Nissl staining in FIG. Decreased.
  • FIG. 5 shows the results of evaluating the expression level of active caspase 3 which is an apoptosis-inducing protein.
  • the increase in apoptosis-inducing protein observed at 48 and 72 hours after HI loading observed in the HIE group was significantly suppressed by administration of anti-LOX-1 antibody.
  • FIGS. 3 to 5 show that the cerebral circulation disorder inhibitor of the present invention is effective as an inhibitor of cerebral circulation disorder such as neonatal HIE.
  • FIG. 6 shows the cerebral water content ratio of the left cerebral water content to the right cerebral water content.
  • the left brain water content increased 48 hours after HI loading, but this increase was significantly suppressed by administration of anti-LOX-1 antibody. This result shows that the cerebral circulation disorder inhibitor of the present invention can suppress the occurrence of cerebral edema due to cerebral circulation disorder.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

　被験体における脳循環障害を早期に、化学的に検出する方法、また、新生児HIE等の脳循環障害に対して、早期に施行可能で、かつ低体温療法を必要としない簡便な抑制剤を提供する。　配列番号１～１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部からなる脳循環障害検出マーカーを用いて脳循環障害を検出する。

Description

脳循環障害検出マーカー、それを用いた脳循環障害検出方法、及び脳循環障害抑制剤
　本発明は、脳循環障害を検出できるバイオマーカー及びそれを用いた被験体における脳循環障害を検出する方法、並びに脳循環障害抑制剤に関する。
　新生児低酸素性虚血性脳症（neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy；nHIE）（以下、しばしば「新生児HIE」又は「新生仔HIE]と表す）は、重症新生児仮死、急性呼吸循環不全、又は胎児低酸素症等により予期せず発症する脳循環障害である。新生児HIEは、予後不良の疾患で、発生頻度は0.1～0.6%、致死率は10～60％、脳性麻痺やてんかん等の神経学的後遺症の発生率は25％と非常に高い（非特許文献１～３）。その病態には、低酸素及び虚血によって神経細胞間隙に放出される興奮性神経伝達物質グルタミン酸の神経毒性やサイトカイン等の炎症性物質による神経細胞傷害及び脳浮腫が深く関わっている（非特許文献４及び５）。したがって、新生児HIEの治療には、不可逆的な細胞傷害を生じる前の潜伏期（latent phase）、すなわち、通常、出生後6時間以内での処置が重要となる。
　現在までのところ新生児HIEに対して神経保護作用が証明されているのは、低体温療法のみである（非特許文献６～１１）。しかし、低体温療法を行うには冷却装置、人工呼吸器、脳波モニター等の特別な機器を必要とし、手技、管理が非常に煩雑であるため、特定の高度医療機関でしか行うことができない。ところが、新生児仮死及び新生児HIEは、あらゆる出産施設において予期せずに起こり得るものであり、低体温療法を行うためには高度医療機関への新生児搬送が必要となる。一方、新生児HIEは、出生前又は出生時から進行しており、低体温療法であっても前述のように出生後6時間以内に施術を開始しなければ効果がない。さらに、低体温療法を施術できた場合であっても、施術後の復温時に脳圧のリバウンド上昇を生じる場合がある（非特許文献１２）。それ故に、新生児のような発達段階の脳においては、低体温療法後の脳浮腫に対する対策が非常に重要となっている（非特許文献１３）。このように新生児HIEに対して現在最も有効とされる低体温療法も様々な問題を抱えている。
　そこで、低体温療法に代わり、新生児HIEの発症後、その病態を迅速かつ正確に検出することができ、またあらゆる出産施設で迅速かつ簡便に実施可能であり、さらに脳圧のリバウンド上昇による脳浮腫の発生リスクが低い新たな治療方法の開発が望まれている。
Shankaran S, 2009, J Neurotrauma. 26(3):437-443. doi: 10.1089/ neu.2008.0678. Gunn AJ., 2000, Curr Opin Pediatr. 12(2):111-115. Vannucci RC & Perlman JM, 1997, Pediatrics. 100(6):1004-1014. Drury PP, et al., 2010, Semin Fetal Neonatal Med. 15(5):287-292. doi: 10.1016/j.siny.2010.05.005. Johnston MV, et al., 2011, Lancet Neurol. 10(4):372-82. doi: 10.1016/S1474-4422(11)70016-3. Gluckman PD, et al., 2005, Lancet. 365(9460):663-670. Shankaran S, et al., 2005, N Engl J Med. 353(15):1574-1584. Azzopardi DV, et al., 2009, N Engl J Med. 361(14):1349-1358. doi: 10.1056/NEJMoa0900854. Simbruner G, et al., 2010, Pediatrics. 126(4):e771-778. doi: 10.1542/peds.2009-2441. Zhou WH, et al., 2010, J Pediatr. 157(3):367-372, 372.e1-3. doi: 10.1016/j.jpeds.2010.03.030. Jacobs SE, et al., 2011, Arch Pediatr Adolesc Med. 165(8):692-700. doi: 10.1001/archpediatrics.2011.43. Wu TC & Grotta JC, 2013, Lancet Neurol. 12(3):275-284. doi: 10.1016/S1474-4422(13)70013-9. Baburamani AA, et al., 2012, Front Physiol. 3:424. doi: 10.3389/fphys.2012.00424.
　本発明は、被験体における脳循環障害を早期に、化学的に検出する方法、また、新生児HIE等の脳循環障害に対して、検出後、迅速に実施可能で、かつ低体温療法を必要としない簡便な脳循環障害抑制剤を開発し、提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、新生児HIEのモデルラットを作製して、新生児HIE発症時に発現が有意に増減し、逆に低体温療法処置によってその増減が解消された12種類の遺伝子を同定した。また、新生児HIE発症時に発現が有意に増加した遺伝子翻訳産物の機能をその遺伝子産物に対する中和抗体で抑制したところ、脳循環障害による脳神経細胞のアポトーシスや脳浮腫の発生を有意に抑制することができた。本発明は、これらの実験結果に基づくもので、下記を提供する。
（１）配列番号１～１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部からなる脳循環障害検出マーカー。
（２）前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、（１）に記載の検出マーカー。
（３）被験体の脳循環障害を検出する方法であって、被験体及び健常体から入手した試料の単位量あたりに含まれる（１）に記載の脳循環障害検出マーカーの量を測定してその測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた被験体及び健常体における脳循環障害検出マーカーの測定値を比較して、脳循環障害検出マーカーが配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部であって、その測定値が被験体で有意に低い場合、又は脳循環障害検出マーカーが配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部であって、その測定値が被験体で有意に高い場合、その被験体が脳循環障害を有していると鑑別する比較鑑別工程を含む前記方法。
（４）前記測定工程で、試料中の二以上の脳循環障害検出マーカーの量を測定する、（３）に記載の検出方法。
（５）前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、（３）又は（４）に記載の検出方法。
（６）（１）又は（２）に記載の一以上の脳循環障害検出マーカーを測定するためのプローブ、プライマーセット、アプタマー、及び／又は抗体を含む、脳循環障害検出キット。
（７）前記配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子の発現又は前記配列番号２～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤。
（８）前記遺伝子翻訳産物に対する抗体、アプタマー又は低分子化合物で構成され、遺伝子翻訳産物の機能を抑制する、（７）に記載のアポトーシス抑制剤。
（９）配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子翻訳産物に対して、その機能を抑制する低分子化合物からなる、（８）に記載のアポトーシス抑制剤であって、
　前記低分子化合物がPLAzPC、ginkgolide B、Spiro、kappa-carragreenan、resveratol、pterostibene、polyinosonic acid及び Angiotensin(1-7)からなる群から選択される前記アポトーシス抑制剤。
（１０）前記遺伝子発現の抑制が遺伝子転写産物に対するRNA干渉剤、アンチセンス核酸、核酸酵素又はU1アダプターで構成され、該遺伝子の発現を抑制する、（７）に記載のアポトーシス抑制剤。
（１１）神経細胞のアポトーシスを抑制する、（７）～（１０）のいずれかに記載のアポトーシス抑制剤。
（１２）（１１）に記載のアポトーシス抑制剤を有効成分として包含する脳循環障害抑制剤。
（１３）前記アポトーシス抑制剤を二以上包含する、（１２）に記載の脳循環障害抑制剤。
（１４）前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、（１２）又は（１３）に記載の脳循環障害抑制剤。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-031109号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、被験体における脳循環障害を早期に、化学的に検出することができる。また、新生児HIE等の脳循環障害に対して、検出後、迅速かつ簡便に実施可能で、脳浮腫の発生リスクが低い抑制剤を提供することができる。
低酸素性虚血性脳症群（HIE群）モデルラット、低体温療法群（HT群）モデルラット及びコントロール群（CTL群）ラット、さらに本発明の脳循環障害抑制剤によるHIE治療群（HIE＋抗LOX-1抗体群）ラットとその対照用であるPBS群（HIE＋PBS群）ラットの作製概念図を示す。 LOX-1の発現部位を示すin situ hybridizationの結果である。Ａは脳の冠状断面図、ＢはＡ図黒枠内の20倍拡大図である。Ｂ図中、矢印で示す部位がLOX-1の発現を示す部位である。 図１に示した各群のNissl染色した脳の冠状断面図を示す。梗塞側左半球（L)の破線枠で囲んだ領域は、傷害組織の面積を示す。 図１に示した各群の脳梗塞側左半球におけるアポトーシス細胞を示すTUNEL染色図である。 アポトーシス誘導タンパク質であるactive caspase 3の発現量を評価した結果を示す。図中の※印は、p＜0.05を示す。 右脳水分率に対する脳梗塞側左脳水分率の脳水分率比を示す。図中の※印は、p＜0.05を示す。
１．脳循環障害検出マーカー
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、脳循環障害検出マーカーである。本発明の脳循環障害検出マーカーは、特定の遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部で構成され、被験体由来の試料中に存在する量を測定することで、その被験体における脳循環障害を検出することができる。
１－２．構成
　本明細書において「脳循環障害」とは、脳血流の低下等の脳内血液循環の変動によって引き起こされる脳神経細胞傷害、及びそれによって発症する脳機能障害や脳細胞傷害をいう。例えば、新生児低酸素性虚血性脳症（新生児HIE）、脳梗塞、脳塞栓、脳血管性認知症等が挙げられる。本明細書において脳循環障害は、特に限定はしないが、本発明の各態様において好ましい脳循環障害は、新生児HIEである。
　本明細書において「脳循環障害検出マーカー」とは、12種類の遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部からなり、被験体における脳循環障害を検出可能なバイオマーカーをいう。以下、脳循環障害検出マーカーの構成について具体的に説明をする。
　前記「12種類の遺伝子」とは、脳循環障害の発症に伴い有意に発現が増減する表１に示す配列番号１～１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子である。特に、配列番号１０に示す塩基配列からなるLox-1遺伝子は、本発明の脳循環障害検出マーカーとして好ましい。なお、表１において、配列番号１に示す遺伝子は、脳循環障害の発症に伴い発現が有意に減少する遺伝子であり、また、配列番号２～１２に示す遺伝子は、脳循環障害の発症に伴い発現が有意に増加する遺伝子である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前記「その変異遺伝子」とは、前記配列番号１～１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子、配列番号１～１２に示す塩基配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％、95％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号１～１２に示す塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子をいう。前記「数個」とは、2～10個、例えば、2～7個、2～5個、2～4個、2～3個をいう。また、前記「同一性」とは、2つの塩基配列を適当なギャップを導入して又は導入しないでアラインメントしたときに、配列番号１～１２に示す塩基配列の全塩基数に対する同一塩基数の割合（％）をいう。前記「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１～１２に示す塩基配列と特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。通常は低ストリンジェント～高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば5×SSC、0.1% SDSを含むバッファを用いて42℃～50℃で洗浄する条件である。また高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。一般に、低塩濃度で、かつ高温であるほど高ストリンジェントな条件となる。ここでいう低塩濃度は、具体的には、例えば、15～750mM、好ましくは15～500mM、15～300mM又は15～200mMをいう。また、ここでいう高温は、具体的には、例えば、50～68℃、又は55～70℃である。
　本発明における変異遺伝子の具体例としては、配列番号１～１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子のSNP（一塩基多型）等の多型に基づく変異遺伝子、スプライスバリアント、アミノ酸縮重に基づく変異遺伝子の他、配列番号１～１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子の他生物種におけるオルソログ遺伝子等が挙げられる。
　前記「遺伝子産物」とは、前記配列番号１～１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子又はその変異遺伝子の発現によって生じる産物であって、具体的には、RNAからなる遺伝子転写産物（ただし、逆転写によって得られるcDNAを含む）、及びペプチドからなる遺伝子翻訳産物が該当する。遺伝子転写産物には、例えば、配列番号１～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子の転写産物であるmRNA（mRNA前駆体を含む）、及び配列番号７及び１２に示す塩基配列からなる遺伝子の転写産物である核内低分子RNAが挙げられる。遺伝子翻訳産物には、例えば、配列番号１～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物であるタンパク質が該当する。具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号５に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号８に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号９に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、配列番号１１に示す塩基配列からなる遺伝子の翻訳産物の例として配列番号２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
　前記「その一部」とは、前記遺伝子産物の一部をいう。ここでいう「一部」とは、断片を意味する。すなわち、前記配列番号１～１２に示す塩基配列からなるヒト由来の遺伝子又はその変異遺伝子の発現によって生じる遺伝子産物の断片が該当する。具体的には、例えば、配列番号１～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子転写産物であるmRNAの断片、又は配列番号７及び１２に示す塩基配列からなる遺伝子転写産物である核内低分子RNAの断片が挙げられる。また、例えば、配列番号１３～２１に示すアミノ酸配列からなる遺伝子翻訳産物であるタンパク質の断片が挙げられる。前記遺伝子産物は、生体内に存在するヌクレアーゼ、プロテアーゼ、又はペプチダーゼ等によって分解され、断片化された状態で存在し得る。それ故、前記遺伝子産物の一部も脳循環障害検出マーカーとなり得る。
１－３．効果
　本発明の脳循環障害検出マーカーは、脳循環障害の発症後、その病態を正確に検出するバイオマーカーとなり得る。
２．脳循環障害検出方法
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、脳循環障害検出方法である。本発明の脳循環検出方法は、被験体由来の試料中に存在する第１態様の脳循環障害検出マーカーの量を測定し、健常者由来の試料中に存在するその脳循環障害検出マーカーの量と比較することによって、被験体における脳循環障害を検出することができる。
２－２．方法
　本発明の脳循環障害検出方法は、（１）測定工程、及び（２）比較鑑別工程を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
（１）測定工程
　「測定工程」とは、被験体及び健常体から入手した試料の単位量あたりに含まれる第1態様に記載の脳循環障害検出マーカーの量を測定してその測定値を得る工程である。
　本態様において「被験体」とは、脳循環障害の検出を目的として本態様の方法に供される動物個体をいう。ここでいう動物とは、哺乳動物、好ましくはヒトである。
　本態様において「健常体」とは、脳循環障害を有さない動物個体、好ましくはいずれの疾患や異常も有さない健康な動物個体をいう。本態様で用いる健常体は、前記被験体と同種である。さらに、同性で、年齢（週齢、月齢）、身長（体長）、及び体重等の各種身体的条件が被験体と同一又は近似であることが好ましい。
　「入手した試料」とは、前記被験体及び健常体のそれぞれから採取された試料をいう。本態様において「試料」とは、体液、組織及び／又は細胞をいう。本明細書において「体液」は、脳循環障害検出マーカーを含み得る生物学的流動体をいう。例えば、髄液、血液、リンパ液、腹水等が含まれる。ここでいう「血液」とは、全血、血漿及び血清を含む。全血は、静脈血、又は動脈血を問わない。本明細書において「組織」とは、脳循環障害検出マーカーを含み得る生体を構成する組織をいう。組織の種類は、特に限定はしないが、例えば、粘膜、粘膜下組織、結合組織等が挙げられる。本態様において試料は、被験体と健常体とで同種又は近似のものが好ましい。
　「単位量」は、容量又は重量の所定の単位であって、例えば、マイクロリットル、ミリリットル、マイクログラム、ミリグラム、グラム等が挙げられる。
　本明細書において「測定値」とは、本工程で測定される脳循環障害検出マーカーの量を示す値である。測定値は、容量又は重量のような絶対値であってもよく、また濃度、イオン強度、吸光度又は蛍光強度のような相対値であってもよい。
　本工程では、被験体由来の試料（「被験体試料」という）と健常体試料由来の試料（「健常体試料」という）のそれぞれに含まれる脳循環障害検出マーカーの量を測定する。測定する脳循環障害検出マーカーは、第１態様に記載の脳循環障害検出マーカーのいずれか1つでよいが、2つ以上を組み合わせて測定することもできる。複数の脳循環障害検出マーカーを組み合わせて測定することによって、脳循環障害の偽陽性率又は偽陰性率を下げ、検出精度を高めることができる。
　脳循環障害検出マーカーの測定方法は、公知の核酸又はペプチドの定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、核酸であれば定量的核酸増幅法が、またペプチドであれば免疫学的検出法又は質量分析法が挙げられる。
　定量的核酸増幅法には、例えば、定量PCR法（ゲル電気泳動法、SYBRグリーン法、リアルタイムPCR法を含む）が挙げられる。
　免疫学的検出法には、例えば、酵素免疫測定法（ELISA法、EIA法を含む）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（RIA）、発光免疫測定法、表面プラズモン共鳴法（SPR法）、水晶振動子マイクロバランス（QCM）法、免疫比濁法、ラテックス凝集免疫測定法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応法、金コロイド法、キャピラリー電気泳動法、ウェスタンブロット法又は免疫組織化学法（免疫染色法）が挙げられる。
　質量分析法には、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）が挙げられる。
　上記分析法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Christopher J., et al., 2005, Chemical Review,105:1103-1169；Iijima Y. et al., 2008,.The Plant Journal, 54,949-962；Hirai M. et al.,2004, Proc Natl Acad Sci USA, 101(27) 10205-10210；Sato S, et al., 2004,,The Plant Journal, 40(1)151-163； Shimizu M. et al., 2005, Proteomics, 5,3919-3931に記載の方法に準じて行うことができる。また、各メーカーから各種核酸又はペプチド定量キットが市販されており、それらを利用することもできる。
　なお、前記測定工程における健常体の測定値は、予め様々な身体的条件の健常体から得られた試料中の各脳循環障害検出マーカー量を測定しておき、それをデータベース化したものを使用してもよい。
（２）比較鑑別工程
　「比較鑑別工程」とは、被験体及び健常体における脳循環障害検出マーカーの測定値を比較して、その結果から被験体が脳循環障害の有無を鑑別する工程である。
　本工程では、前記測定工程で得られた被験体と健常体における同種の脳循環障害検出マーカーの測定値を比較する。このとき、被験体及び健常体の定量結果を補正するために、単位量あたりの試料において量的差異のないことが期待される公知の核酸又はタンパク質を内在性コントロールとして用いてもよい。このような内在性コントロール用核酸として、例えば、β-アクチン、GAPDH、及びβ-glucronidase(GUS)等が、また内在性コントロール用タンパク質として、例えば、アルブミンが挙げられる。
　比較の結果は、脳循環障害検出マーカーの種類に応じて以下のように鑑別する。
　脳循環障害検出マーカーが配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部の場合には、被験体の測定値が健常体よりも有意に低い場合に、その被験体が脳循環障害を有していると鑑別する。逆に有意に高い場合は、その被験体が脳循環障害を有している可能性は低いと鑑別する。
　一方、脳循環障害検出マーカーが配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部の場合には、被験体の測定値が健常体よりも有意に高い場合に、その被験体が脳循環障害を有していると鑑別する。逆に有意に低い場合は、その被験体が脳循環障害を有している可能性は低いと鑑別する。
　本明細書において「有意」とは、統計学的に有意の意味であり、被験体と健常体の測定値の差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法を用いることができる。
２－３．効果
　本発明の脳循環障害検出方法によれば、本発明の脳循環障害検出マーカーを用いることで、あらゆる医療施設において簡便かつ正確に、また迅速に脳循環障害を検出することができる。
３．脳循環障害検出キット
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、脳循環障害検出キットである。本発明の脳循環障害キットは、試料中の脳循環障害検出マーカーを検出及び／又は測定するために必要な試料、試薬、説明書等を適当な組み合わせで、又は包括的に含むキットであり、前記第２態様の脳循環障害検出方法における測定工程等で用いることができる。
３－２．構成
　本キットは、プローブ、プライマーセット、アプタマー、及び抗体のいずれか一以上を必須の構成要素として包含する。これらは、いずれも第１態様に記載の特定の脳循環障害検出マーカーを特異的に検出することができる。
　プローブ及びプライマーセットは、検出すべき脳循環障害検出マーカーが遺伝子転写産物の場合に、その脳循環障害検出マーカーを構成する塩基配列の特異的な領域に対して相補的な塩基配列を含む核酸である。例えば、配列番号１０に示す塩基配列からなるLox-1の遺伝子転写産物であるmRNA又はcDNAにおいて、Lox-1遺伝子に特異的な塩基配列に相補的な塩基配列を含むDNAや、Lox-1遺伝子のcDNAを鋳型としてLox-1遺伝子を特異的に増幅可能な塩基配列を含むプライマーセットが挙げられる。
　前記プローブ又はプライマーを構成する核酸は、自然界に存在する天然型核酸（DNA及びRNA）、化学修飾核酸（例えば、メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2'-O-メチル型DNA/RNA等）、天然型核酸に類似の性質及び／又は構造を有する人工的に構築された又は人工的に化学修飾された人工核酸、核酸類似体（ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルフォリノ核酸（ホルフォリノオリゴを含む）等）及びそれらの組合せを含んでいてもよい。プローブ又はプライマーを構成する核酸は、必要に応じて、リン酸基、糖及び／又は塩基が標識されていてもよい。標識は、当該分野で公知の標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。
　アプタマー及び抗体は、検出すべき脳循環障害検出マーカーが遺伝子翻訳産物、すなわちペプチドの場合に用いることができる。これらの基本構成については、次章の「４．アポトーシス抑制剤」で詳述する。なお、本態様のキットに包含され得るアプタマー及び抗体は、必要に応じて標識されていてもよい。例えば、核酸アプタマーであれば、標識は、上述した当該分野で公知の標識物質を利用することができる。また抗体であれば、蛍光色素（Alexa、フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン等の公知の標識物質を利用することができる。
　上記の他にも、本発明のキットには、必要に応じて標識二次抗体、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、又は試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を含むことができる。さらに、そのキットの使用説明書を包含することもできる。
４．アポトーシス抑制剤
４－１．概要
　本発明の第４の態様は、アポトーシス抑制剤である。本発明のアポトーシス抑制剤は、脳循環障害検出マーカーの機能を抑制し、それによって細胞の、特にグルタミン酸の神経毒性やサイトカイン等の炎症性物質によって傷害を受けた神経細胞のアポトーシスを抑制することができる。
４－２．構成
　配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子は、脳循環障害発症時にその発現量が増加し、その結果、神経細胞のアポトーシスが誘導される。したがって、それらの遺伝子又はその変異遺伝子の発現、及び／又は配列番号２～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物の機能を抑制すれば、アポトーシスを抑制することができる。本発明のアポトーシス抑制剤は、この原理を利用したもので、前記表１に記載の配列番号２～１２に示す塩基配列からなるいずれか一の遺伝子又はその変異遺伝子（以下「標的遺伝子」とする）の発現、又は前記配列番号２～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物（以下「標的タンパク質」とする）の機能を抑制する、つまり、第１態様に記載の脳循環障害検出マーカーを抑制する特徴を有する。
　「アポトーシス」とは、多細胞生物におけるカスパーゼ依存型のプログラムされた細胞死である。本明細書においてアポトーシスを受ける細胞は、特に制限はしない。好ましくは神経細胞、特に脳細胞である。
　以下、標的遺伝子の発現を抑制するアポトーシス抑制剤と、その遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤のそれぞれについて説明をする。
４－２－１．標的遺伝子の発現を抑制するアポトーシス抑制剤
　「標的遺伝子の発現を抑制するアポトーシス抑制剤」は、標的遺伝子の転写後、その遺伝子転写産物であるmRNA（以下、「標的mRNA」とする）が翻訳されるまでの間に、標的遺伝子の発現を抑制することのできる物質である。例えば、核内において標的遺伝子の転写後、標的mRNAのmRNAスプライシングを阻害又は抑制する物質、標的mRNAの核外輸送を阻害又は抑制する物質、遺伝子サイレンシングのように核外において標的mRNAを分解する物質又は標的mRNAの翻訳を阻害する物質が挙げられる。このうち、標的mRNAを分解する物質や標的mRNAの翻訳を阻害する物質としては、例えば、標的遺伝子のRNA干渉剤、アンチセンス核酸、核酸酵素、又はU1アダプターが該当する。以下、各アポトーシス抑制剤について具体的に説明をする。
（１）RNA干渉剤
　「RNA干渉剤」とは、生体内においてRNA干渉（RNA inteference：RNAi）を誘導する物質をいう。RNA干渉とは、標的とする遺伝子転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制する配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングである。本明細書における「標的遺伝子のRNA干渉剤」は、配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子転写産物に対して特異的なサイレンシングを誘導することのできる物質をいう。例えば、siRNA、又はshRNAが挙げられる。RNA干渉については、例えば、Bass B.L., 2000, Cell, 101, 235-238；Sharp P.A., 2001, Genes Dev., 15 ,485-490；Zamore P.D., 2002, Science, 296, 1265-1269；Dernburg ,A.F. & Karpen, G.H., 2002, Cell, 111,159-162に詳述されている。以下、各RNA干渉剤について詳細に説明をする。
　（ｉ）siRNA
　「siRNA」（短分子干渉RNA:small interference RNA）とは、標的遺伝子の塩基配列の一部に相当する塩基配列で構成されるセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖RNAである。siRNAは、被験体の細胞（真核細胞）へ導入することによってRNA干渉を誘導することができる（Fire A. et al．，1998，Nature，391, 806-811）。
　siRNAは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて公知の方法により設計すればよい。例えば、Ui-Teiらの方法（Nucleic Acids Res., 2004, 32:936-948）、Reynoldsらの方法（Nat. Biotechnol., 2004, 22:326-330）、Amarzguiouiらの方法（Biochem. Biophys. Res. Commun.,2004, 316: 1050-1058）の方法に基づいて、設計することができる。
　siRNA設計の具体例を挙げると、配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の塩基配列（例えば、配列番号１０で示すLox-1遺伝子の塩基配列）からRNAセンス鎖の塩基配列として、15塩基以上35塩基以下、好ましくは15塩基以上30塩基以下、又は18塩基以上25塩基以下の連続した塩基配列を選択領域として選択する。このとき選択する領域の塩基配列は、標的とする標的遺伝子の塩基配列と完全に一致させるように留意する。それ故、選択領域内には標的遺伝子の既知の変異箇所（例えば、SNPを含む）を包含しないように設計することが好ましい。ただし、意図的にそのような変異塩基を有する標的遺伝子を特異的に抑制することを目的とする場合は、この限りではない。RNAアンチセンス鎖の塩基配列は、選択した前記RNAセンス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列とする。なお、siRNAの調製に際しては、センス鎖及びアンチセンス鎖共に選択領域内のT（チミン）塩基をU（ウラシル）塩基に変換しておく。
　前記RNAセンス鎖の選択領域は、標的遺伝子に特異的な配列であれば特に限定はしない。好ましくは開始コドンから少なくとも50塩基、より好ましくは70塩基～100塩基よりも下流の領域である。さらに、RNAセンス鎖の候補領域内においてAA（アデニン‐アデニン）を5’側に有する塩基配列領域を選択することが好ましい。選択した領域内のGC（グアニン‐シトシン）含有量は、好ましくは20～80％、より好ましくは30～70％又は40～60％である。siRNAの設計は、ウェブサイト上でも多数公開されており、標的遺伝子の塩基配列を入力すれば、有効かつ適切なsiRNAをウェブ上で設計することができる。代表的なsiRNA設計ウェブサイトとしては、siDirect（http://design.RNAi.jp/）、siDESIGN Center（http://www.dharmacon.com/designcenter/designcenterpage.aspx）、siRNA Selection Server （http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/）等が挙げられる。
　siRNAの一方の末端又は両末端には、標的遺伝子の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列とは関連しない一以上のDNA、RNA、及び／又は核酸類似体からなる塩基配列が存在していてもよい。このようなsiRNAの末端に存在する塩基数は、特に限定はしないが、1～20個の範囲内であることが好ましい。具体的には、例えば、siRNAのセンス鎖側及びsiRNAアンチセンス鎖側の3’末端側にTT（チミン‐チミン）又はUU（ウラシル‐ウラシル）等を付加する場合が挙げられる（Tuschl T et al., 1999, Genes Dev, 13(24):3191-7）。
　（ｉｉ）shRNA
　「shRNA」（short hairpin RNA）とは、前記siRNAが適当な短いスペーサ配列で連結された一本鎖RNAをいう。したがって、shRNAは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、さらにスペーサ配列がループ構造をとることによって、分子全体としてヘアピン型のステム－ループ構造を有する。shRNAが細胞内に導入されると、ループ構造部分が切断されて二本鎖RNA分子、すなわちsiRNAが生成される。生じたsiRNAは、前項で述べたsiRNAと同様のRNA干渉機構によって標的遺伝子の発現を抑制することができる。
　shRNAの設計は、例えば、前記siRNAにおけるセンス領域の3’末端と前記アンチセンス鎖の5’末端とをスペーサ配列で連結する。スペーサ配列は、通常3～24塩基、好ましくは、4～15塩基あればよい。スペーサ配列については、siRNAが塩基対合することができる配列であれば、特に制限はない。
（２）アンチセンス核酸
　「アンチセンス核酸」とは、標的遺伝子の転写産物であるmRNAを標的とし、その塩基配列の全部又は一部に対して相補的な塩基配列を有し、標的mRNAにハイブリダイズしてその翻訳を阻害する核酸分子である。核酸は、主としてDNAで構成されるが、例えば、PNAやLNAのような核酸類似体やRNAも含むことができる。
　アンチセンス核酸は、当該分野における公知の核酸合成技術を用いて作製することができる。例えば、前述のGreen, M.R. and Sambrook, J.（2012）を参照されたい。
（３）核酸酵素
　「核酸酵素」とは、触媒活性を有する核酸分子で、標的mRNAを基質として特異的に結合し、標的mRNAにおける特定の部位を切断する触媒機能を有する。核酸酵素には、DNAで構成されるデオキシリボザイム、及びリボ酵素とも呼ばれRNAで構成されるリボザイムが知られているが、本明細書における核酸酵素は、いずれであってもよい。デオキシリボザイム及びリボザイムは、いずれも構成塩基に化学修飾核酸、人工核酸及び／又は核酸類似体を一部に含むことができる。
（４）U1アダプター
　「U1アダプター」とは、標的遺伝子のmRNA前駆体における3'末エクソンに相補的な5'側の「標的ドメイン」と、U1 snRNAの5’領域に相補的な配列を有する3'側の「U1ドメイン」を含む二機能性の約25塩基からなる一本鎖核酸である（Goraczniak R. et al., 2009, Nat Biotechnol., Vol 27, p257-263,）。生体内にU1アダプターを導入すると、U1 snRNAを含むU1核内低分子リボ核蛋白質(U1 snRNP)が標的遺伝子のmRNA前駆体におけるポリAシグナル周辺に結合し、該mRNAのポリアデニル化を特異的に阻害する。その結果、標的遺伝子のmRNA前駆体が不安定化し、その後、核内で分解されることによって、遺伝子のサイレンシングが生じる。
４－２－２．標的遺伝子の遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤
　「標的遺伝子の遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤」は、配列番号２～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物である標的タンパク質に作用して、その機能を特異的に抑制することのできる物質である。例えば、アンタゴニストや競合物質のように標的タンパク質の活性部位に結合して標的タンパク質を失活させることのできる阻害物質が該当する。具体例としては、標的タンパク質に対する抗体、アプタマー、又は低分子化合物が挙げられる。以下、各アポトーシス抑制剤について具体的に説明をする。
（１）抗体（抗標的タンパク質抗体）
　本態様の抗体は、免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域（FR：frame work region）及び相補性決定領域(CDR:complementarity determining region)を含み、抗原である標的タンパク質に特異的に結合し、その機能を阻害又は抑制する中和抗体としての機能を有するポリペプチドをいう。具体的には、配列番号２～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子翻訳産物、例えば、配列番号１３～２１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれか一を標的タンパク質とし、その標的タンパク質に特異的に結合してその機能を阻害又は抑制する中和抗体である。例えば、配列番号１０に示す塩基配列からなるLox-1遺伝子の翻訳産物である配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるLOX-1タンパク質を標的タンパク質とし、このタンパク質に特異的に結合して、LOX-1タンパク質の機能を阻害又は抑制する抗LOX-1抗体が挙げられる。
　本態様の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体、及び抗体フラグメントを含む。前記「特異的に結合」とは、標的抗原（例えば、抗ヒトLOX-1抗体であればヒトLOX-1又はその断片）のみと結合することを意味する。
　抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）でよい。一般にモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いる場合、投与する抗体は、哺乳動物及び鳥を含めた動物由来である。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はヒト等が挙げられる。しかし、投与による拒絶反応を回避するために本発明のアポトーシス抑制剤を投与する生物種と同種由来の抗体であることが好ましい。例えば、アポトーシス抑制剤をヒトに投与する場合、アポトーシス抑制剤としてのモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、ヒト由来の抗体であることが好ましい。
　「組換え抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は多重特異性抗体をいう。「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の可変領域（V領域）を他の抗体のV領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のV領域をヒト抗体のV領域と置き換え、可変領域（V領域）がマウス由来、C領域がヒト由来となった抗体が該当する。「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物、例えば、適当なマウス抗体の可変領域（V領域）における相補性決定領域（CDR；CDR1、CDR2及びCDR3）をヒトモノクローナル抗体のCDRとを置換したグラフト抗体である。キメラ抗体とヒト化抗体は、重鎖及び軽鎖のV領域、又は重鎖及び軽鎖のV領域における相補性決定領域がマウス等の非ヒト動物抗体由来ではあるが、C領域、又はV領域におけるフレームワーク領域（FR；FR1、FR2、FR3及びFR4）と重鎖及び軽鎖のC領域がヒト抗体由来であることから、ヒト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。
　「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、IgGのように2つの抗原結合部位を有する抗体で、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。
　「合成抗体」とは、化学的に又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、単鎖抗体（scFv：single chain Fragment of variable region）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。
　「抗体フラグメント」とは、例えば、Fab、F(ab’2）、Fv等が該当する。
　抗体は、修飾されていてもよい。抗体の修飾には、機能上の修飾又は標識上の修飾を含む。機能上の修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、又はPEG化が挙げられる。標識上の修飾には、蛍光色素（フルオレセイン、FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。
　本発明で用いることができる抗標的タンパク質抗体を用いて、頭部エコーやCT、MRI等による脳浮腫、脳梗塞、又は脳組織障害の広がりを調べたり、脳脊髄液検査で神経細胞の障害を調べることによって、脳循環障害の重症度を評価することができる。
　抗標的タンパク質抗体は、当該分野で公知の方法によって作製すればよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J.,（2012；前述）に記載の方法を参考にすればよい。また、標的タンパク質に対する抗体がメーカーから市販されている場合には、それを利用することもできる。
（２）アプタマー
　「アプタマー」とは、立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の機能を特異的に抑制する能力を持つリガンド分子である。アプタマーは、その分子の種類により、核酸アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができる。本発明のアポトーシス抑制剤としてのアプタマーは、配列番号２～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物を標的タンパク質とし、その機能を特異的に抑制することができれば、いずれであってもよい。好ましくは核酸アプタマーである。アプタマーに関しては、例えば、Janasena, Clin. Chem. 45:1628-1650 (1999)を参照されたい。
　核酸アプタマーとは、核酸で構成されるアプタマーをいう。核酸アプタマーを構成する核酸は、DNA、RNA又はそれらの組合せのいずれであってもよい。必要に応じて、PNA、LNA／BNA、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等の化学修飾核酸を含むこともできる。
　アプタマーは、必要に応じて標識されていてもよい。標識は当該分野で公知のあらゆる核酸用標識物質を利用することができる。例えば、放射性同位元素（例えば、32P、3H、14C）、DIG、ビオチン、蛍光色素（例えば、FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA）、又は発光物質（例えば、アクリジニウムエスター）が挙げられる。このような標識物質で標識されたアプタマーは、標的タンパク質と結合したアプタマーを検出する際に有用なツールとなり得る。このような標識されたアプタマーは、前記第３態様の脳循環障害検出キットにおいて脳循環障害検出マーカーを検出するアプタマーとしても利用できる。
　アプタマーは、いずれか一の標的タンパク質を標的分子として、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いて試験管内選別により作製してもよい。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のRNA分子によって構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択し、回収後にRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、それを次のラウンドのRNAプールにするという一連のサイクルを数～数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いRNAを選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、20～80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15～40塩基の範囲である。標的分子への特異性を高めるためには、標的分子に類似する分子とRNAプールとを混合し、その分子と結合しなかったRNA分子からなるプールを用いればよい。以上の方法によって最終的に得られたRNA分子をVHSV結合性RNAアプタマーとして利用する。なお、SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
　ペプチドアプタマーとは、アミノ酸で構成されるアプタマーで、抗体と同様に、特定の標的分子の表面構造を認識して、特異的に結合する1～6kDのペプチド分子である。ファージディスプレイ法や細胞表層ディスプレイ法を用いて製造することができる。ペプチドアプタマーの製造法は、当該分野で公知の方法に基づいて作製すればよい。例えば、Whaley,S.R., et al., 2000, Nature, 405, 665-668を参照することができる。
（３）低分子化合物
　本明細書において「低分子化合物」は、分子量1万以下の化合物であって、標的物質に結合し、その機能を特異的に抑制する作用を持つリガンド分子をいう。通常は化学物質のみが該当するが、本明細書では、抗体又はアプタマー以外のペプチド分子、及び核酸アプタマー以外の核酸分子も包含する概念とする。
　低分子化合物の種類は、特に限定しない。標的物質に対して抑制作用を有する限り、いかなる種類であってもよい。例えば、配列番号１０で示すLox-1の場合、化学物質であるPLAzPC、ginkgolide B、Spiro、kappa-carragreenan、resveratol、pterostibene、polyinosonic acid等や、ペプチドであるAngiotensin (1-7)等が、受容体であるLox-1のアンタゴニストになることから、標的物質がLox-1の場合には、これらのいずれも本明細書における低分子化合物となり得る。
４－３．効果
　本発明のアポトーシス抑制剤は、脳循環障害検出マーカーの機能を抑制することによって、細胞、特にグルタミン酸の神経毒性やサイトカイン等の炎症性物質によって傷害を受けた神経細胞のアポトーシスを抑制することができる。
　本発明のアポトーシス抑制剤によれば、脳神経細胞のアポトーシスに起因する疾患、例えば、HIE（新生児HIEを含む）、パーキンソン病やアルツハイマー病の進行抑制剤になり得る。
５．脳循環障害抑制剤
５－１．概要
　本発明の第５の態様は、脳循環障害抑制剤である。本発明の脳循環障害抑制剤は、前記第４態様に記載のアポトーシス抑制剤を有効成分として包含し、新生児HIEのような脳循環障害の発症又はその進行を抑制することができる医薬組成物である。
５－２．構成
５－２－１．有効成分
　本発明の脳循環障害抑制剤は、前記第４態様に記載のアポトーシス抑制剤を有効成分として包含する。ここで、本発明の脳循環障害抑制剤は、第４態様に記載の異なる二以上のアポトーシス抑制剤を含むことができる。
　脳循環障害抑制剤に配合される第４態様に記載のアポトーシス抑制剤の含有量は、アポトーシス抑制剤の種類及び／又はその有効量、脳循環障害の種類、薬物組成物の剤形、並びに後述する担体の種類によって異なるため、それぞれの条件を勘案して適宜定めればよい。
　本明細書において「有効量」とは、脳循環障害抑制剤においてアポトーシス抑制剤が有効成分としての機能を発揮する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の様々な条件によって変化し得る。
　本明細書において「被験体の情報」とは、脳循環障害抑制剤を適用する生体の様々な個体情報であって、例えば、全身の健康状態、疾患・病害に罹患している場合にはその進行度や重症度、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性、併用薬物の有無及び治療に対する耐性等を含む。例として、脳循環障害が新生児HIEであれば、生後経過時間、HIEの進行度や重症度等に基づいて決定される。最終的な有効量、及びそれに基づいて算出される１回又は１日あたりの適用量は、前記被験体の情報等に基づいて、医師、又は獣医師等の判断によって決定される。
５－２－２．担体
　本発明の脳循環障害抑制剤は、必要に応じて薬学的に許容可能な単体を包含し得る。担体は、主として脳循環障害抑制剤の製剤化や投与を容易にし、また剤形及び薬剤効果を維持するために用いられるものである。
　「薬学的に許容可能な担体」とは、ヒトをはじめとする動物に対して、副作用等の有害な影響がないか又は非常に小さいことから製剤技術分野において通常使用し得る溶媒及び／又は添加剤をいう。
　製剤技術分野において通常使用し得る溶媒には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
　また、製剤技術分野において通常使用し得る添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、例えば、糖（例えば、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム)、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　結合剤としては、例えば、デンプン糊、シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、デンプン、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
　充填剤としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
　乳化剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
　流動添加調節剤及び滑沢剤としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
　本発明の薬学的に許容可能な担体は、上記の他、必要に応じて、等張化剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム）、増量剤、pH調整剤、保湿剤（例えば、グリセリン、デンプン）、吸着剤（例えば、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、無痛化剤等を含むこともできる。
５－３．脳循環障害抑制剤の剤型
　脳循環障害抑制剤の剤型は、その投与方法によって異なり、また処方条件に応じて適宜選択される。投与方法については後述するが、通常は経口投与及び非経口投与に大別することができる。
　経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、末剤、散剤、顆粒剤、液剤、トローチ剤等を挙げることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠又は多層錠とすることができる。
　非経口剤に適した剤型としては、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、点鼻剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤又は座剤等が挙げられる。これらは、組織内投与、局所投与又は経直腸的投与のように、その投与方法に適した剤型にすることができる。
　組織内投与に適した剤型としては、例えば、注射剤を挙げることができる。
　局所投与に適した剤型としては、例えば、液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤、点眼剤又は点鼻剤等を挙げることができる。
　経直腸的投与に適した剤型としては、例えば、坐剤を挙げることができる。
　前記各剤型の形状、大きさについては、いずれも当該分野で公知の剤型の範囲内にあればよく、特に限定はしない。新生児に投与する場合、好ましい方法は注射である。
　注射剤として調製する場合には、第４態様に記載のアポトーシス抑制剤を溶媒で溶解し、好ましくは血液と等張にした希釈剤を用いて当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
５－４．脳循環障害抑制剤の投与方法
　本発明の脳循環障害抑制剤は、経口投与、組織内投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与）、局所投与（例えば、経皮投与）又は経直腸的投与で投与することができる。上記の脳循環障害抑制剤は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることが好ましい。例えば、経口投与用製剤であれば、固形、粉末又は液剤の用量単位で投与することができる。
　組織内投与の場合、皮下投与、筋肉内投与又は静脈内投与等のいずれの方法も使用できる。血流を介した投与が好ましい。それ故、好ましい投与方法は注射である。特に新生児HIEに投与する場合に注射による投与方法は好ましい。注射の場合、注入部位は特に限定しない。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。血流を介して本発明の脳循環障害抑制剤を直ちに脳を含む全身に行き渡らせることが可能であり、また比較的侵襲性が低く、被験体に与える負担が小さいからである。
５－５．効果
　本発明の脳循環障害抑制剤によれば、低体温療法等で用いる特殊な装置や設備を必要とせず、患者に対して早期に施行が可能であり、脳循環障害の発症及び進行を簡便かつ効率的に抑制することができる。
[実施例]
１．新生仔HIE、低体温療法、及び新生仔HIE治療の各モデル動物の作製
　Riceらの方法（Rice JE 3rd, et al., 1981, Ann Neurol. 9(2):131-41）に従って、生後7日齢のSprague-Dawley（SD）ラット（CLEA Japan Inc.）を使用し、低酸素性虚血性脳症群（HIE群）、低体温療法群（HT群）のモデルラット、及び本発明の脳循環障害抑制剤によるHIE治療群（HIE＋抗LOX-1抗体群）ラットを作製した。対照用としてコントロール群（CTL群）ラット及びPBS群（HIE＋PBS群）ラットを作製した。各群の作製概念図を図１に示す。
　新生仔HIEモデル（HIE群）作成のための低酸素・虚血負荷（hypoxic-ischemic insult: HI負荷）は、前記新生仔220匹に麻酔後、片側性頸動脈結紮を行うため頸部正中に切開を入れ、左総頸動脈を同定、二重結紮し、結紮間にて動脈を切断した。2時間の母仔飼育後、新生仔HIEモデルのための低酸素・虚血負荷（hypoxic-ischemic insult: HI負荷）として8％の低酸素状態に2時間保持した。HI負荷の間、全てのラットの体温を36℃に保持した。体温は、一実験の中で無作為に選ばれた一匹のラットで、直腸温にてモニターし、ヒートマットを利用した体温コントローラー（ACT-101B, Unique Medical）によって管理した。CTL群のラットは生後7日齢に体温を36℃に3時間保ち、その他の手術や治療は行わなかった。HIE群のラットは、生後7日齢にHI負荷を施したのち、体温を36℃で3時間保持し、母親のもとに返した。HT群のラットは生後7日齢にHI負荷を施し、速やかに外気温とice packによって体温を28℃に冷却し、体温を28℃で3時間保持した後に母親のもとに返した。新たな治療薬として、抗LOX-1中和抗体（R&D Systems）を用いた。各種治療群では、生後7日齢にHI負荷を施し、HI負荷直後から治療を開始し、同時に体温を36℃で3時間保持してから母親のもとに返した。抗LOX-1中和抗体は、PBSに溶き、6μg/kgあるいは60μg/kgの用量で腹腔内投与した。
　LOX-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1)は、oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)の受容体として同定されたが（Sawamura T, et al., 1997, Nature. 386(6620):73-77.）、そのリガンドにはox-LDL、アポトーシス細胞、C-reactive protein (CRP)など様々なものがあり、angiotensin II、CRP、interleukin-1β、oxidant speciesなど様々なストレスにて発現が誘導される。粥状硬化症において、LOX-1の活性化は血管内皮細胞のアポトーシス・機能不全、血管内皮細胞への単球の接着、血管平滑筋細胞の増殖・アポトーシス、マクロファージの泡沫細胞形成、血小板の凝集を引き起こすことが知られている（Mehta JL, et al., 2006, Cardiovasc Res. 69(1):36-45；Chen XP, et al., 2007, Cardiovasc Drug Rev. 25(2):146-161；Dunn S, et al., 2008, Biochem J. 409(2):349-355；Navarra T, et al., 2010, J Atheroscler Thromb. 17(4):317-331；Yan M, et al., 2011, Cardiovasc Drugs Ther. 25(5):451-459. doi: 10.1007/s10557-011-6342-4；Xu S, et al., 2013, Cell Mol Life Sci. 70(16):2859-2872. doi: 10.1007/s00018-012-1194-z.）。Lox-1は、表１に示した本発明の脳循環障害検出マーカー及びアポトーシス抑制剤の一つであり、本実施例において、その効果を示す例として使用した。対照としてPBS治療群を作り、PBSを0.1mL/回にて腹腔内投与した。それぞれ、ラットが屠殺されるまで最大72時間、1日2回投与された。ラットは屠殺するまで12時間毎の明暗サイクルの部屋で管理した。
２．脳組織の準備
　ラットはHI、負荷後3、6、24、48、及び72時間に麻酔下で経心室的にリン酸緩衝食塩水（phosphate buffer saline : PBS, pH 7.4）又は4％パラフォルムアルデヒドで十分に灌流後、速やかに脳を摘出した。
　病理組織学的解析のために、4％パラフォルムアルデヒドで灌流後、4℃で24時間4％パラフォルムアルデヒドにて後固定した。その後、エタノールで脱水し、パラフィン包埋した。脳のパラフィンブロックは、ミクロトーム (NS-400, SAKURA, Alphen aan den Rijn) にて冠状方向で厚さ4μmの切片にした後、Nissl染色、TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)解析、及びin situ hybridizationに使用した。
　発現解析のために、マイクロアレイ解析と定量polymerase chain reaction（PCR）用の脳をPBSにて灌流後、脳下垂体茎の1mm前方で冠状方向に切断した。切断面の後部の左大脳皮質の病巣部を切除し、液体窒素にて凍結後、－80℃にて保存した。全ての手技は、RNase free処置した状態で行った。
　ウェスタンブロットとenzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）用の脳は、PBSにて灌流後、大脳を左右半球に分けて液体窒素にて凍結後、－80℃にて保存した。
３．梗塞面積の評価
　梗塞面積の評価は、Nissl染色で、梗塞側（左）半球の正常な組織面積の合計と健側（右）半球全体の面積を測定し、その比（梗塞側の正常組織面積／健側の面積）を計算して梗塞面積の評価に使用した。面積の測定はImage Jソフトにて行った。
４．アポトーシスの評価
　アポトーシスの評価は、海馬・視床レベルの切片においてTUNEL解析にて行った。TUNEL解析は、Apop Tag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)を使用し、プロトコールに従って染色を行った。また、神経細胞でのアポトーシスを確認するため、抗NeuNマウス抗体 (Millipore)にて二重染色した。二重染色においては、蛍光標識抗digoxigenin抗体反応後、PBSにて洗浄し、2% bovine serum albumin（BSA）in PBSにてブロッキングした。1000倍希釈の抗NeuNマウス抗体と4℃で一晩反応させ、二次抗体として蛍光標識抗マウスIgG抗体と室温で60分間反応させた後にDAPI染色を行った。染色した切片の写真は、蛍光顕微鏡（BX51 ; Olympus）にて200倍率の拡大にて撮影した。1x1mm2に観察されるTUNEL陽性細胞とDAPI陽性細胞を数え、その比（TUNEL陽性細胞数／DAPI陽性細胞数）を計算した。これを梗塞側大脳新皮質4か所で行い、その平均値を計算し、アポトーシスの評価を行った。
５．マイクロアレイと定量PCRによる遺伝子発現解析
　RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を使用し、－80℃に保存されていた梗塞側大脳皮質のサンプルから総RNAを抽出した。DNase I（QIAGEN）にてDNAを分解処理した。NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc.)にて、抽出した総RNAのRNA濃度を測定した。
　マイクロアレイ解析は、HI負荷後3時間のラットを用いて行った。2匹のラットから別々に抽出した総RNAを等量ずつ混合し、1つのサンプルとし、各群2サンプルずつ準備した。Ambion WT Expression Kit及びGeneChip WT Terminal Labeling Kit and Controls Kit（Affymetrix, Santa Clara）を使用し、添付のプロトコール通りに解析を行った。各群で2サンプルの平均値を計算し、群間の発現量の比較を行った。HI負荷による遺伝子発現の変化は3倍以上の上昇、又は1/2以下の低下を有意な変化とした。その結果、HI負荷前後で発現が有意に変化する12種類の遺伝子を単離した。これらの遺伝子を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
６．In situ hybridization
　遺伝子発現解析によって治療ターゲットの候補となったLox-1(又はOlr1）の発現部位を同定するために、in situ hybridizationを行った。PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche)を使用して、Lox-1のプライマーセット（forward(F)プライマー: 配列番号２２；reverse(R)プライマー:配列番号２３）を用い、PCRにてテンプレートDNAを増幅し、digoxigenin（DIG）に標識したプローブを作成した。海馬・視床レベルの冠状断のパラフィン切片を脱パラフィン後、4％パラフォルムアルデヒドにて20分間再固定を行った。Tris-buffered saline（TBS, pH 7.5）にて洗浄後、200mM HClにて10分間タンパク変性を行った。TBSで洗浄後、非特異的バックグラウンドを減らすため、0.5%無水酢酸を含む100mM Tris（pH 8.0）にて10分間処理した。TBSにて洗浄後、プロテナーゼK溶液（2mM CaCl2、20μg/mLプロテナーゼK in TBS）にて37℃、20分間処理し、洗浄、反応停止後にエタノールにて脱水した。その後、切片とプローブを55℃、16時間ハイブリダイズさせた。洗浄後、10% BSA in TBSにてブロッキングを行い、アルカリフォスファターゼ標識の抗DIG抗体と60分間反応させ、4-nitro blue tetrazolium chloride(NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate（BCIP）にて発色させた。全ての手技は、ヌクレアーゼフリーの状態で行った。
７．ウェスタンブロットとELISA
　低体温療法及び新たな治療法の分子動態を調べるため、梗塞側半球でのアポトーシス、酸化ストレス、tight junction proteins (TJPs)の量的評価をウェスタンブロットとELISAによって行った。梗塞側の半球全体を組織溶解液（50mM Tris-HCl, pH7.4, 0.15M NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% deoxycholic acid）の中で、Astrason Ultrasonic Processor XL (Misonix)を使用して溶解し、タンパク質を抽出した。BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて、抽出液のタンパク質濃度を測定した。
　ウェスタンブロットでは、sodium dodecyl sulfate (SDS)ポリアクリルアミドゲル（12％）に各レーン20μgずつのタンパク質をのせ、125Vで電気泳動後にポリビニリデンジフルオリド膜に2mA/cm2、1時間にて転写した。5%スキムミルクin PBS-Tweenにて37℃、20分間のブロッキング後、ポリビニリデンジフルオリド膜を4℃で一晩、一次抗体と反応させた。二次抗体（5000倍希釈の抗ウサギIgG抗体）と室温で60分間反応後、膜上の目的タンパク質はECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare)にて検出した。一次抗体として、抗active-caspase 3ウサギ抗体（1000倍希釈）（Sigma-Aldrich Corporate）、抗occludinウサギ抗体（250倍希釈）（Zymed Laboratories Inc.）、抗ZO-1ウサギ抗体（500倍希釈）（Zymed Laboratories Inc.）、抗Gapdhウサギ抗体（1000倍希釈）（Abcam）を用いた。特異的バンドを検出後、Image Quant TL (GE Healthcare)にて相対的発現量を評価した。Gapdhをレファランスタンパクとして補正を行った。結果を図５に示す。
　Malondialdehyde（MDA）の量的評価を行うために、Rat MDA ELISA Kit (CUSABIO)を使用し、プロトコール通りにELISAを行った。MDAレベルはサンプルのタンパク質濃度にて補正した。全ての検体は二重に検出を行い、その平均値を用いた。
８．脳浮腫の評価
　脳浮腫の評価として、脳水分率の評価を行った。HI負荷後24、48、72時間にラットをジエチルエーテル吸入にて麻酔し、速やかに脳を取り出した。直後に左右大脳半球を切断し、それぞれ重量を測定した（乾燥前重量）。その後、オーブンにて85℃で72時間、脳を乾燥させ、左右半球それぞれの重量を測定した（乾燥後重量）。各半球で脳水分率を｛（乾燥前重量－乾燥後重量）／（乾燥前重量）｝として計算し、健側半球を対照として、梗塞側半球／健側半球の比を算出した。この比を脳浮腫の評価に使用した。
９．統計解析
　全てのデータは平均値±標準偏差で表した。Statcel 2（OMS Publication）を用いて、多群間の比較にはanalysis of variance（ANOVA）解析を、2群間の比較にはt検定又はMann-Whitney’s U検定を行った。p＜0.05を有意差とした。
１０.結果
　上記実施例の結果を以下に示す。
　図２に、in situ hybridizationによるLOX-1の発現部位を示す。Ｂ図から、LOX-1は大脳皮質の神経細胞で発現していることが示された。
　図３に各群のNissl染色した冠状断面図を示す。破線枠で囲んだ梗塞側左半球（L)の傷害組織の面積は、HIE群では左半球の大部分を占めるが、このHIE群に本発明の脳循環障害抑制剤の一つである抗LOX-1抗体を投与したHIE＋抗LOX-1抗体群では、傷害組織の面積が減少した。
　図４に各群のTUNEL染色した脳梗塞側左半球の細胞を示す。アポトーシスを生じたTUNEL陽性細胞は、図２のNissl染色の結果と同様にHIE群に本発明の脳循環障害抑制剤の一つである抗LOX-1抗体を投与したHIE＋抗LOX-1抗体群で減少した。
　図５は、アポトーシス誘導タンパク質であるactive caspase 3の発現量を評価した結果である。HIE群で観察されたHI負荷48時間、及び72時間後のアポトーシス誘導タンパク質の増加は、抗LOX-1抗体の投与によって有意に抑制された。
　図３～５の結果は、本発明の脳循環障害抑制剤が新生仔HIEのような脳循環障害の抑制剤として有効であることを示している。
　図６は、右脳水分率に対する脳梗塞側左脳水分率の脳水分率比を示す。HIE群ではHI負荷48時間後に左脳水分率が増加しているが、この増加は、抗LOX-1抗体の投与によって有意に抑制された。この結果は、本発明の脳循環障害抑制剤が脳循環障害による脳浮腫の発生を抑制できることを示している。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (14)

  1. 　配列番号１～１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子の遺伝子産物、又はその一部からなる脳循環障害検出マーカー。
  2. 　前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、請求項１に記載の検出マーカー。
  3. 　被験体の脳循環障害を検出する方法であって、
    　被験体及び健常体から入手した試料の単位量あたりに含まれる請求項１に記載の脳循環障害検出マーカーの量を測定してその測定値を得る測定工程、
    　前記測定工程で得られた被験体及び健常体における脳循環障害検出マーカーの測定値を比較して、
    　　脳循環障害検出マーカーが配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部であって、その測定値が被験体で有意に低い場合、又は
    　　脳循環障害検出マーカーが配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子の産物又はその一部であって、その測定値が被験体で有意に高い場合、
    　その被験体が脳循環障害を有していると鑑別する比較鑑別工程
    を含む前記方法。
  4. 　前記測定工程で、試料中の二以上の脳循環障害検出マーカーの量を測定する、請求項３に記載の検出方法。
  5. 　前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、請求項３又は４に記載の検出方法。
  6. 　請求項１又は２に記載の一以上の脳循環障害検出マーカーを測定するためのプローブ、プライマーセット、アプタマー、及び／又は抗体を含む、脳循環障害検出キット。
  7. 　前記配列番号２～１２に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子の発現又は前記配列番号２～６及び８～１１に示す塩基配列からなる遺伝子又はその変異遺伝子のいずれか一の遺伝子翻訳産物の機能を抑制するアポトーシス抑制剤。
  8. 　前記遺伝子翻訳産物に対する抗体、アプタマー、又は低分子化合物で構成され、その機能を抑制する、請求項７に記載のアポトーシス抑制剤。
  9. 　配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子翻訳産物に対して、その機能を抑制する低分子化合物からなる、請求項８に記載のアポトーシス抑制剤であって、
    　前記低分子化合物がPLAzPC、ginkgolide B、Spiro、kappa-carragreenan、resveratol、pterostibene、polyinosonic acid及び Angiotensin (1-7)からなる群から選択される前記アポトーシス抑制剤。
  10. 　前記遺伝子発現の抑制が遺伝子転写産物に対するRNA干渉剤、アンチセンス核酸、核酸酵素又はU1アダプターで構成され、該遺伝子の発現を抑制する、請求項７に記載のアポトーシス抑制剤。
  11. 　神経細胞のアポトーシスを抑制する、請求項７～１０のいずれか一項に記載のアポトーシス抑制剤。
  12. 　請求項１１に記載のアポトーシス抑制剤を有効成分として包含する脳循環障害抑制剤。
  13. 　前記アポトーシス抑制剤を二以上包含する、請求項１２に記載の脳循環障害抑制剤。
  14. 　前記脳循環障害が新生児低酸素性虚血性脳症である、請求項１２又は１３に記載の脳循環障害抑制剤。
PCT/JP2015/054199 2014-02-20 2015-02-17 脳循環障害検出マーカー、それを用いた脳循環障害検出方法、及び脳循環障害抑制剤 WO2015125752A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016504093A JPWO2015125752A1 (ja) 2014-02-20 2015-02-17 脳循環障害検出マーカー、それを用いた脳循環障害検出方法、及び脳循環障害抑制剤

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014031109 2014-02-20
JP2014-031109 2014-02-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015125752A1 true WO2015125752A1 (ja) 2015-08-27

Family

ID=53878254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/054199 WO2015125752A1 (ja) 2014-02-20 2015-02-17 脳循環障害検出マーカー、それを用いた脳循環障害検出方法、及び脳循環障害抑制剤

Country Status (2)

Country Link
JP (2) JPWO2015125752A1 (ja)
WO (1) WO2015125752A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019189725A1 (ja) 2018-03-30 2019-10-03 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 新生児低酸素性虚血性脳症の重症度判定方法と予後予測方法

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AM J PATHOL., vol. 4, no. 6, 18 June 2014 (2014-06-18), pages 1843 - 1852 *
APOPTOSIS, vol. 17, 2012, pages 25 - 36 *
BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 148, no. 3, 1987, pages 1412 - 1427 *
BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 438, 2013, pages 340 - 345 *
BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1783, no. 5, 2008, pages 941 - 952 *
CYTOKINE, vol. 59, 2012, pages 433 - 441 *
DATABASE genbank [O] 15 March 2015 (2015-03-15), FLOYEL T, ET AL: "Homo sapiens cathepsin H (CTSH), mRNA", XP055224306, retrieved from ncbi Database accession no. NM_004390 *
DATABASE genbank [O] 15 March 2015 (2015-03-15), retrieved from ncbi Database accession no. NM_ 003407 *
DATABASE genbank [O] 15 March 2015 (2015-03-15), XP055223126, retrieved from ncbi Database accession no. NM_000019 *
DATABASE genbank [O] 16 October 2008 (2008-10-16), EBERT,L: "Homo sapiens full open reading frame cDNA clone RZPDo834B0914D for gene IL1A, interleukin 1, alpha; complete cds, incl. stopcodon", XP055223128, retrieved from ncbi Database accession no. CR457414 *
DATABASE genbank [O] 16 October 2008 (2008-10-16), HALLECK,A: "Homo sapiens full open reading frame cDNA clone RZPDo834D0323D for gene CCL4, chemokine (C-C motif) ligand 4; complete cds, incl. stopcodon", XP055223128, retrieved from ncbi Database accession no. CR542119 *
DATABASE genbank [O] 16 October 2008 (2008-10-16), XP055223128, retrieved from ncbi Database accession no. CR456704 *
DATABASE genbank [O] 21 May 2015 (2015-05-21), DEL PUERTO A ET AL: "Homo sapiens purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 13 (P2RY13), mRNA", XP055224186, retrieved from ncbi Database accession no. NM_176894 *
DEV NEUROSCI., vol. 36, no. 1, 11 February 2014 (2014-02-11), pages 64 - 72 *
ENDOCRINOL, vol. 147, no. 8, 2006, pages 3851 - 3860 *
EXP BIOL MED (MAYWOOD)., vol. 237, no. 9, 2012, pages 1093 - 1100 *
INFLAMM RES, vol. 62, 2013, pages 219 - 228 *
J CEREB BLOOD FLOW METAB., vol. 31, no. 3, 2011, pages 842 - 854 *
J MOL NEUROSCI, vol. 49, no. 2, 2013, pages 320 - 327 *
NEUROSCI LETT, vol. 558, 13 January 2014 (2014-01-13), pages 143 - 148 *
PHARMACOL REP, vol. 62, no. 2, 2010, pages 311 - 318 *
REPRODUCTIVE SCI, vol. 20, no. 3 , Supp.1, 2013, pages 300A *
vol. 23, no. 8, 2007, pages 1464 - 1469 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019189725A1 (ja) 2018-03-30 2019-10-03 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 新生児低酸素性虚血性脳症の重症度判定方法と予後予測方法
US20210041468A1 (en) * 2018-03-30 2021-02-11 National Center Of Neurology And Psychiatry Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy severity determining method and prognosis predicting method
JPWO2019189725A1 (ja) * 2018-03-30 2021-05-13 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 新生児低酸素性虚血性脳症の重症度判定方法と予後予測方法
JP7185947B2 (ja) 2018-03-30 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 新生児低酸素性虚血性脳症の重症度判定方法と予後予測方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2015125752A1 (ja) 2017-03-30
JP6941888B2 (ja) 2021-09-29
JP2020072701A (ja) 2020-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ceccarelli et al. LPS-induced TNF-α factor mediates pro-inflammatory and pro-fibrogenic pattern in non-alcoholic fatty liver disease
JP6074049B2 (ja) ｃ−ＭＡＦを用いた前立腺がん転移の診断、予後診断および処置のための方法
JP2016539625A (ja) 乳がんに由来する骨の転移がんの予後診断および処置のための方法
JP7467355B2 (ja) 黄斑変性症を評価するための方法
JP6155533B2 (ja) Ｔｄｐ−４３細胞内存在量関連疾患の認定方法
JP2016536303A (ja) 末梢循環腫瘍細胞クラスターおよび癌処置に関する方法
WO2016135772A1 (ja) がんの脳転移の診断、予防及び治療方法、並びに血液脳関門を通過させるための医薬送達システム
BR112020007139A2 (pt) tratamento de doença mediada por smc
JP6941888B2 (ja) 脳循環障害検出マーカー、それを用いた脳循環障害検出方法、及び脳循環障害抑制剤
Sachs et al. ADAM10-mediated ectodomain shedding is an essential driver of podocyte damage
Zhao et al. Vascular endothelium deploys caveolin-1 to regulate oligodendrogenesis after chronic cerebral ischemia in mice
US20080318241A1 (en) Methods and Systems for Detecting Antiangiogenesis
JP7175526B2 (ja) 細胞遊走調節に関する疾患の予防・治療剤および肺間質の疾患の疾患活動性判定・予後評価
US9187787B2 (en) Method of diagnosing and treating cancer
WO2011107939A1 (en) Methods of predicting efficacy of an anti-vegfa treatment for solid tumors
JP7122016B2 (ja) グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物
US20150368650A1 (en) Use of vegfr1 as a biomarker
WO2017091952A1 (zh) Akt2在诊断和治疗肿瘤中的用途
Du et al. Long non-coding RNA GAS5/miR-520-3p/socs3 axis regulates inflammatory response in lipopolysaccharide-induced macrophages
JP6941688B2 (ja) 神経節膠腫が誘導された動物モデルならびに神経節膠腫およびこれに関連する疾患の診断用組成物
Nowicka Szyma nska
JP2017171641A (ja) 前立腺癌治療剤、前立腺癌診断マーカー及びそれを用いた前立腺癌罹患鑑別方法
JP2013533458A (ja) 前立腺癌におけるホルモンエスケープのマーカーとしてのｃｘｃｌ５
JP6924506B2 (ja) がんの脳転移の診断、予防及び治療方法、並びに血液脳関門を通過させるための医薬送達システム
ES2924499T3 (es) Método de selección de terapia para pacientes que padecen glioblastoma

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15752834

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016504093

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15752834

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1