JP7122016B2 - グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物 - Google Patents

グリオーマの予後、遠隔部再発リスク及び浸潤を判定する方法及びキット並びにグリオーマを処置するための医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、グリオーマの予後、グリオーマの遠隔部再発リスク、グリオーマ細胞の浸潤能又は試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在を判定する方法、当該判定方法に用いるためのキット及びグリオーマを処置するための医薬組成物に関する。
グリオーマ（神経膠腫）は脳に発生する悪性腫瘍であり、脳腫瘍の多くを占めている。グリオーマは世界保健機関（ＷＨＯ）の基準に従って４つのグレード（グレードＩ～ＩＶ）に分類される。グレードＩＩＩ及びＩＶのグリオーマは高悪性度グリオーマと呼ばれ、高い増殖能、浸潤能を持つ。高悪性度グリオーマのうち、最も悪性度が高いのは、グレードＩＶに分類されるグリオブラストーマ（多形性膠芽腫、ＧＢＭ）であり、その５年生存率はわずか１０％前後である。
グリオーマは、腫瘍細胞が脳に浸み込むように浸潤し正常組織との境界が不鮮明であること、また腫瘍の発生位置によっては手術による摘出が困難であることから、手術による完全摘出が困難な疾患である。したがって、グリオーマ、特に高悪性度グリオーマ及びグリオブラストーマの治療としては、手術により可能な限り腫瘍を摘出した後、再発を予防又は遅延させるために放射線療法及びテモゾロマイドによる化学療法を行うことが標準的である。しかしながら、これらの治療を適切に行った場合であっても、グリオブラストーマはその高い浸潤能のために原発部位から離れた遠隔部での再発が頻繁に生じ易く、これがグリオブラストーマの予後不良の原因の一つとなっている。したがって、グリオーマが高悪性度グリオーマさらにはグリオブラストーマであるかどうかに関する情報、及びグリオーマが高悪性度グリオーマさらにはグリオブラストーマへと進展しやすいか否かに関する情報は、グリオーマ患者の治療方針の策定において有益である。
グリオーマの予後に関連する因子として、多くの遺伝因子、例えばＰＴＥＮ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ欠失、ＭＤＭ２、ＥＧＦＲ、ＴＰ５３などが報告されている。特にＩＤＨ変異は高悪性度グリオーマの予後良好因子であり、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化はテモゾロマイド応答性の予測因子であると考えられている。これらの他、さらなるグリオーママーカーについて研究が進められている（例えば非特許文献１など）。
Ｖｉｇｎｅｓｗａｒａｎ Ｋ１ら、Ａｎｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１５；３（７）：９５
本発明は、グリオーマの予後や遠隔部再発のリスク、グリオーマ細胞の浸潤能などを発見時若しくは治療の早期段階で知ることができる、又はグリオーマの摘出手術の際にオンサイト診断に利用することができる新規バイオマーカーを提供することを目的とする。
本発明者らは、細胞の運動に関与するアクチンファミリーの一つであるａｃｔｉｎ，ａｌｐｈａ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ １（ＡＣＴＣ１）に着目して研究を進めた結果、ＡＣＴＣ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が検出されたグリオーマではそれが検出されないグリオーマに比べて予後が不良であることを見出し、下記の各発明を完成させた。
（１）患者から採取したグリオーマを含む試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する工程、並びに
前記工程においてＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡが検出された場合、前記グリオーマは予後不良であると判定する工程
を含む、グリオーマの予後を判定する方法。
（２）患者から採取したグリオーマを含む試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する工程、並びに
前記工程においてＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡが検出された場合、前記グリオーマは遠隔部再発のリスクが高いと判定する工程
を含む、グリオーマの遠隔部再発リスクを判定する方法。
（３）グリオーマ細胞を含む試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する工程、並びに
前記工程においてＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡが検出された場合、前記グリオーマ細胞は浸潤能が高いと判定する工程
を含む、グリオーマ細胞の浸潤能を判定する方法。
（４）患者のグリオーマ病変部又はその近傍から採取した試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する工程、並びに
前記工程においてＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡが検出された場合、前記試料には浸潤能の高いグリオーマが含まれると判定する工程
を含む、前記試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在を判定する方法。
（５）患者から採取したグリオーマを含む試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する手段を含む、グリオーマの予後及び／又は遠隔部再発リスクを判定するためのキット。
（６）グリオーマ細胞を含む試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する手段を含む、グリオーマ細胞の浸潤能を判定するためのキット。
（７）患者のグリオーマ病変部又はその近傍から採取した試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する手段を含む、前記試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在を判定するためのキット。
（８）ＡＣＴＣ１タンパク質を検出するための特異抗体又はＡＣＴＣ１をコードするｍＲＮＡを検出するためのプライマー核酸若しくはプローブ核酸のいずれかを少なくとも含む、（５）から（７）のいずれかに記載のキット。
（９）ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／又は機能を抑制する物質を含む、グリオーマを処置するための医薬組成物。
（１０）ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／又は機能を抑制する物質が、ＡＣＴＣ１タンパク質をコードする遺伝子に対する阻害性核酸である、（９）に記載の医薬組成物。
（１１）ＡＣＴＣ１タンパク質をコードする遺伝子に対する阻害性核酸を発現可能な組換えウイルスである、（９）又は（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／又は機能を抑制する物質が、ＡＣＴＣ１タンパク質に対する中和抗体である、（９）に記載の医薬組成物。
本発明によれば、ＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡという新規なバイオマーカーを利用することで、グリオーマの予後、遠隔部再発リスク、グリオーマ細胞の浸潤能などの判定を行うことができる。また、開頭手術の際に、視認可能な病変部又はその近傍において本発明にかかるバイオマーカーの発現を確認することにより、浸潤能の高いグリオーマの疑いがある部位を残すことのない、適切な範囲での切除が可能となる。さらに、ＡＣＴＣ１タンパク質はグリオーマ特に悪性度の高いグリオーマの治療ターゲットであり、その発現及び／又は機能を抑制する物質はグリオーマの処置のための医薬として利用することができる。
グリオーマ組織中のＡＣＴＣ１の発現率（図１Ａ）及び発現量（図１Ｂ）をＷＨＯグレード毎に示すグラフである。図１Ｂにおいて、エラーバーは平均値の標準誤差を、縦軸は相対的発現量（倍率変化、ＦＣ）を示す。 グリオーマ組織中のＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡ相対的発現量（倍率変化、ＦＣ）と全生存期間との関係を示す散布図である。上段はグレードＩを除く全グリオーマを、下段はグレードＩＶのグリオーマを対象としている。 ＡＣＴＣ１陽性又は陰性のグリオーマ患者についての全生存期間（図３Ａ及びＣ）及び無増悪生存期間（図３Ｂ及びＤ）のカプランマイヤー曲線を示すグラフである。上段のＡ及びＢはグレードＩを除く全グリオーマを、下段のＣ及びＤはグレードＩＶのグリオーマを対象としている。図中、実線はＡＣＴＣ１陽性群、破線はＡＣＴＣ１陰性群を示す。 ＡＣＴＣ１陽性グリオブラストーマ（図４Ａ～Ｃ）及びＡＣＴＣ１陰性グリオブラストーマ（図４Ｄ～Ｆ）の診断時の代表的ＭＲＩ所見を示す造影Ｔ１強調画像である。 ＡＣＴＣ１陽性グリオブラストーマ（図５Ａ～Ｄ）及びＡＣＴＣ１陰性グリオブラストーマ（図５Ｅ～Ｈ）の再発時の代表的ＭＲＩ所見を示す画像である。図中、上段のＡ、Ｃ、Ｅ、ＧはＦＬＡＩＲ画像、下段のＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈは造影Ｔ１強調画像である。 ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡ相対的発現量（倍率変化、ＦＣ）と患者年齢（図６Ａ）、カルノフスキー活動指標（ＫＰＳ）（図６Ｂ）及びＭＩＢ－１インデックス（図６Ｃ）との関係を示す散布図である。 グリオブラストーマ組織におけるＡＣＴＣ１タンパク質の発現を表す免疫染色写真である。左図は核、中央の図はＡＣＴＣ１を染色した写真であり、右図はそれらを融合したものである。 グリオブラストーマ細胞株Ｕ８７におけるＡＣＴＣ１タンパク質の発現を表す免疫染色写真である。左図は核、中央の図はＡＣＴＣ１を染色した写真であり、右図はそれらを融合したものである。 ｓｉＲＮＡ処理したグリオブラストーマ細胞株Ｕ８７におけるＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現量（図９Ａ）、及び同細胞の遊走能（図９Ｂ）を表すグラフである。
本発明の第一の態様である方法は、グリオーマの予後若しくは遠隔部再発リスク、グリオーマ細胞の浸潤能又はグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在を判定する方法に関するものであり、これらはそれぞれ、患者から採取したグリオーマを含む試料、グリオーマ細胞を含む試料又は患者のグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する工程を含む。
以下、本発明において、ＡＣＴＣ１タンパク質及びこれをコードするｍＲＮＡを検出対象となるバイオマーカーの意味で表すときは「本バイオマーカー」と記し、タンパク質及びｍＲＮＡの意味で表すときは「ＡＣＴＣ１タンパク質」「ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡ」とそれぞれ記すこととする。
ＡＣＴＣ１タンパク質は、骨格筋で発現するαアクチンのアイソフォームタンパク質であり、心筋節（ｃａｒｄｉａｃ ｓａｒｃｏｍｅｒｅｓ）において発現し、心臓の拍動における筋収縮に関与することが知られている。ヒトのＡＣＴＣ１のアミノ酸配列及びこれをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＡＨ０９９７８及びＢＣ００９９７８として登録されている。これまで、ＡＣＴＣ１タンパク質は心筋における発現及び機能に着目した研究が行われているが、脳における発現、特にグリオーマの悪性度とＡＣＴＣ１タンパク質の発現との関連性は知られていない。
本発明の第一の態様は、ＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡを、グリオーマの予後若しくは遠隔部再発リスク、グリオーマ細胞の浸潤能又はグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在の各判定のためのバイオマーカーとして利用するものである。具体的には、患者から採取したグリオーマを含む試料、グリオーマ細胞を含む試料、又は患者のグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料における本バイオマーカーの発現の有無を、それぞれグリオーマの予後若しくは遠隔部再発リスク、グリオーマ細胞の浸潤能又はグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在の判定のための指標とするものである。
本発明において検出対象とされるＡＣＴＣ１タンパク質のアミノ酸配列及びＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの塩基配列は、前記アクセッション番号ＡＡＨ０９９７８及びＢＣ００９９７８として登録されているアミノ酸配列及び塩基配列には限定されず、例えば一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）を有する塩基配列からなるｍＲＮＡ及びかかる塩基置換によって生じ得るアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列からなるＡＣＴＣ１タンパク質も検出対象に包含される。
本バイオマーカーは、患者から採取したグリオーマを含む試料、グリオーマ細胞を含む試料又は患者から採取したグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取された試料を対象にして検出される。これらの試料は、患者から採取したそのままの状態若しくは細胞そのままの状態で検出対象として用いてもよく、タンパク質若しくはｍＲＮＡの検出を目的とした一般的な処置を施した後に用いてもよく、又はホルマリン固定などの一般的な保存方法によって処置した後に用いてもよい。
本発明に係る本バイオマーカーの検出は、ＡＣＴＣ１タンパク質又はＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡのいずれか一方のみを検出しても、又は両方を検出してもよい。
試料中の本バイオマーカーは、公知の方法によって検出することができる。例えば、ＡＣＴＣ１タンパク質の場合は、これに特異的な抗体を用い、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析等の周知の方法によってＡＣＴＣＴ１タンパク質を検出してもよい。この場合、特異抗体は由来する動物種により制限されず、またポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、免疫グロブリン全長からなる抗体又はＦａｂ断片若しくはＦ（ａｂ’）２断片などの部分断片などでもよい。
ＡＣＴＣ１タンパク質に対する特異抗体は、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの検出は、その塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いたＰＣＲ法、ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなる核酸が固定化されたチップを用いたマイクロアレイ法その他の、ｍＲＮＡの発現を検出することができる公知の方法により行うことができる。前記核酸は、用いられる方法に応じて、蛍光物質、放射性同位体、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
本発明の第一の態様である方法は、グリオーマの予後若しくは遠隔部再発リスク、グリオーマ細胞の浸潤能又はグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在をそれぞれ判定する方法にかかるものであり、試料中で本バイオマーカーが検出された場合、グリオーマの予後が不良である若しくは遠隔部再発リスクが高い、グリオーマ細胞の浸潤能が高い又は当該試料中に浸潤能の高いグリオーマが存在すると判定する工程をそれぞれ含む。なお、本発明の第一の態様である方法は、グリオーマの予後若しくは遠隔部再発リスク、グリオーマ細胞の浸潤能又はグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在をそれぞれ判定するための、あるいは判定に供するための、試料中のＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡの発現に関するデータを収集又は提供する方法と表すこともできる。
後の実施例に示されるように、ＷＨＯグレードＩからＩＶと診断されたグリオーマ患者計５０人の病理組織における本バイオマーカーの発現の有無の確認と、各患者の処置後の生存期間、遠隔部再発の有無、及び診断時のＭＲＩ所見による浸潤の程度に関する記録との相関が解析された。その結果、本バイオマーカーの発現が、短い生存期間、遠隔部の再発及び高度の浸潤と統計学的に有意な正の相関を示すことが確認された。
このことから、グリオーマ患者において本バイオマーカーの発現の有無を確認することによって、医師がそのグリオーマの悪性度を知り、その影響を予測することが可能となる。また、本バイオマーカーが検出された患者については、グリオーマが悪性であることを前提とした治療方針の策定及び実行を医師が講ずることが可能となる。また、グリオーマの切除を目的とした開頭手術の際に、視認可能な病変部又はその近傍において本バイオマーカーの発現を確認することによって、病変部又はその近傍に浸潤能の高いグリオーマが存在するか否かを知ることができる。これにより、かかる浸潤能の高いグリオーマが存在するときはその病変部又はその近傍は切除すべき領域であると決定する、いわゆるオンサイト診断が可能となり、その結果手術後のグリオーマの再発のリスクを低減することができる。
また、同じく後の実施例に示されるように、ＷＨＯグレードが上昇するにつれて本バイオマーカーの発現率は上昇するが、グレードＩＶであっても発現率は過半数に留まることから、本バイオマーカーとＷＨＯグレードとは、密接に相関するものではないと考えられる。したがって、本発明の第一の態様である方法は、悪性度の高いＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶのグリオーマ（高悪性度グリオーマ）、グリオブラストーマのみならず、全てのグレードのグリオーマを対象とする。なお、本明細書では、用語「グリオーマ」は単独で用いられたときは、全てのグレードのグリオーマ、高悪性度グリオーマ及びグリオブラストーマを包含するものとする。
なお、本発明における判定は本バイオマーカーの発現の有無を検出できれば足りる。発現の有無は、用いた検出方法毎の検出感度において本バイオマーカーが発現しているとは事実上認められないか又は検出限界以下であった場合に発現無し又は陰性と判定し、かかる程度を越える場合に発現有り又は陽性と判定すればよい。
本バイオマーカーの発現が事実上認められないとは、本バイオマーカーの検出自体は可能であるものの、その定量値が一定のカットオフ値を下回ることを指す。かかるカットオフ値は、例えば、ＡＣＴＣ１を発現しないことが知られている試料におけるＡＣＴＣ１の発現量に基づいて設定することができる。
具体的には、ＡＣＴＣ１を発現しないことが知られている正常なグリア細胞又はグリオーマに罹患していない正常な脳組織などを基準試料として用いてＡＣＴＣ１の発現量を測定し、得られた値をカットオフ値として設定する。次いで、判定対象試料におけるＡＣＴＣ１の発現量を同じ方法で測定し、得られた値を前記カットオフ値と比較して、前記カットオフ値未満の値であれば発現無し又は陰性と、前記カットオフ値以上の値であれば発現有り又は陽性と判定することができる。
本バイオマーカーの発現は、リアルタイムＰＣＲにおいて比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法、サイクル比較法とも呼ばれる）により定量することもできる。具体的には、ＡＣＴＣ１を発現しないことが知られている正常なグリア細胞又はグリオーマに罹患していない正常な脳組織などに由来するｍＲＮＡをキャリブレータとして用い、これと判定対象試料由来のｍＲＮＡとをそれぞれリアルタイムＰＣＲに供し、ＡＣＴＣ１遺伝子及び内在性コントロール遺伝子の増幅曲線から対応するＣｔ値を得る。次いで、判定対象試料、キャリブレータのそれぞれについて、ＡＣＴＣ１遺伝子のＣｔ値と内在性コントロール遺伝子のＣｔ値との差としてΔＣｔを算出する。判定対象試料のΔＣｔとキャリブレータのΔＣｔとの差として求められるΔΔＣｔから、ＡＣＴＣ１遺伝子の相対的発現量であるＦＣ＝２－ΔΔＣｔを算出する。算出されたＦＣをカットオフ値と比較して、ＦＣがカットオフ値未満の値であれば発現無し又は陰性と、カットオフ値以上の値であれば発現有り又は陽性と判定することができる。
ＦＣのカットオフ値は、特に好ましくは１である。ＦＣ＝１は、判定対象試料のΔＣｔとキャリブレータのΔＣｔとの差が０であること、すなわち判定対象試料中のＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡとキャリブレータ中のＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの量に差がないことを意味する。
また、後の実施例に示すように、本バイオマーカーの発現量とグリオーマのグレードとの間にも一定の相関があることから、本バイオマーカーの定量的な発現量を判定の判断材料として補助的に使用してもよい。
本発明の第二の態様は、患者から採取したグリオーマを含む試料中の本バイオマーカーであるＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する手段を含む、グリオーマの予後及び／又は遠隔部再発リスクを判定するためのキットに関する。
本発明の第三の態様は、グリオーマ細胞を含む試料中の本バイオマーカーであるＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する手段を含む、グリオーマ細胞の浸潤能を判定するためのキットに関する。本態様のキットは、患者から採取された試料に含まれるグリオーマ細胞の他に、株化されたグリオーマ細胞の浸潤能の判定にも用いることができる。
本発明の第四の態様は、患者のグリオーマ病変部若しくはその近傍から採取した試料中の本バイオマーカーであるＡＣＴＣ１タンパク質及び／又はこれをコードするｍＲＮＡを検出する手段を含む、当該試料中の浸潤能の高いグリオーマの存在を判定するためのキットに関する。本態様のキットは、前述のオンサイト診断に有用である。
前記第二から第四の態様のキットは、いずれも前記第一の態様において用いることができる。これらの態様のキットは、本バイオマーカーの検出に利用可能な物質、例えばＡＣＴＣ１タンパク質に対する特異抗体又はＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡを検出するためのプライマー核酸若しくはプローブ核酸などのいずれかを少なくとも含むことが好ましく、また免疫学的反応又はＰＣＲ反応等を行う際に用いられる緩衝液、発色試薬、ｄＮＴＰその他の任意の試薬類を含んでいてもよい。
本発明の第五の態様は、ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／又は機能を抑制する物質を含む、グリオーマを処置するための医薬組成物に関する。
アクチンは細胞の運動及び形状の制御に関与する分子であることが知られており、がん細胞では特に浸潤能又は転移に関与することが報告されている。グリオーマに関しても、その浸潤及び遠隔部再発の原因の１つは、アクチンフィラメント、微小管及び中間径フィラメントの３つの主要構成成分からなる細胞骨格フィラメントによりもたらされる細胞運動の亢進であると考えられる。したがって、グリオーマの予後不良、遠隔部再発及び高浸潤能とその発現とが正の相関関係にあるＡＣＴＣ１タンパク質は、グリオーマの予後不良、遠隔部再発及び高浸潤能をもたらし得る分子である可能性が高く、ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／又は機能を抑制する物質及び又はこれを含む組成物は、グリオーマの遠隔部再発及び浸潤能を抑制することができ、ひいてはグリオーマを処置するための医薬又は医薬組成物として利用することができると期待される。
ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／又は機能を抑制する物質の例としては、ＡＣＴＣ１タンパク質に対する中和抗体、ＡＣＴＣ１タンパク質に結合してその機能を阻害する化合物、ＡＣＴＣ１タンパク質をコードする遺伝子からの転写又は翻訳を阻害し得るｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡなどの阻害性核酸などを挙げることができる。
本発明にかかる医薬組成物は、ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／又は機能を抑制する物質を単独で含んでいても複数種含んでいてもよく、さらに他の医薬成分及び／又は薬学的に許容される任意の賦形剤その他の成分を含んでいてもよい。
本発明にかかる医薬組成物は、経口製剤又は非経口製剤のいずれの形態であってもよいが、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いるのが好ましい。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトールなどを含む等張液といった細胞製剤において通常用いられる水性担体が挙げられる。
また、本発明にかかる医薬組成物は、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、マイクロスフェア及びナノスフェアなどの適切なＤＤＳに封入及び／又は固定されていてもよい。
さらに、本発明にかかる医薬組成物が阻害性核酸を含む場合、任意の既知の細胞導入手法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルス等）を利用する方法、又はマイクロインジェクション法等を用いることによって、グリオーマ細胞内に導入することができる。
ウイルスベクターを利用する場合、すなわち医薬組成物がＡＣＴＣ１タンパク質をコードする遺伝子に対する阻害性核酸を発現可能な組換えウイルスを含む場合、その用量範囲は、例えば、ヒト対象１人あたり、１×１０３～１×１０１４、好ましくは１×１０５～１×１０１２、より好ましくは１×１０６～１×１０１１、最も好ましくは１×１０７～１×１０１０のプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）である。
本発明にかかる医薬組成物の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、腫瘍内又はその近傍への局所投与などを挙げることができる。好ましい態様の一つにおいて、本発明にかかる医薬組成物は、静脈内投与又は腫瘍内若しくはその近傍への局所投与により対象に投与される。
本発明にかかる医薬組成物は、グリオーマ、好ましくは浸潤能の高いグリオーマ、より好ましくは高悪性度グリオーマの処置のために用いられる。本発明にかかる医薬組成物は、グリオーマを処置するための他の医薬又は医薬組成物と組み合わせて用いてもよい。
本明細書において用いられる「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解又は予防などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的及び／又は治療的介入を包含する。すなわちグリオーマの処置とは、グリオーマの進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
さらに、本発明にかかるＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／若しくは機能を抑制する物質又は該物質を含む医薬組成物をグリオーマ患者に投与することにより、グリオーマを処置することができることが期待される。このように、本発明は、ＡＣＴＣ１タンパク質の発現及び／若しくは機能を抑制する物質又は該物質を含む医薬組成物の有効量をグリオーマ患者に投与することによる、グリオーマを処置する方法も提供する。ここで「有効量」とは、グリオーマを処置するのに効果的な量を意味し、かかる量はグリオーマの悪性度、処置の内容、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
本発明はさらに、試料中のグリオーマの存否を判定するための本バイオマーカーの使用を提供する。ＡＣＴＣ１は正常なグリア細胞では発現がほとんど認められないことが知られており、したがって本バイオマーカーはグリオーマの検出に有用である。
本発明はさらに、生体外部から検出可能なシグナルを発する物質で標識されたＡＣＴＣ１に対して特異的に結合し得る化合物、例えば蛍光物質で標識された抗ＡＣＴＣ１抗体などを生体に投与して、前記シグナルを検出することによる、グリオーマの有無、位置、病変部の拡がり等を画像的に確認するグリオーマの画像診断方法も提供する。
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
１．材料と方法
（１－１）患者及び組織
臨床研究は、札幌医科大学の治験審査委員会の承認を受けて実施した。札幌医科大学付属病院でＷＨＯグレードＩからＩＶのグリオーマと診断された２歳から８４歳の患者を本研究の適格とし、各患者から施設の倫理指針に従って同意文書を取得した。全ての腫瘍は神経機能を保った範囲で最大限に摘除し、高悪性度グリオーマの場合はその後に放射線化学療法を実施した。２００６年１０月から２０１４年１０月までの期間に手術室で採取したグリオーマ組織を緩衝ホルマリン液中で固定し、ＷＨＯグレードＩの４例、グレードＩＩの１３例、グレードＩＩＩの７例、グレードＩＶの２６例、合計５０のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料について、以下の手順でＡＣＴＣ１の発現を解析した。
（１－２）ＡＣＴＣ１の発現解析
Ａ．遺伝子発現解析
ＦＦＰＥ試料をミクロトームを用いて薄片に切り分け、２ｍＬのマイクロチューブ内に回収した。Ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ）及びＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってＲＮＡ抽出を行った。全ＲＮＡ濃度及びＡ２６０／Ａ２８０比は、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて測定した。Ａ２６０／Ａ２８０比が１．８未満の試料を除外した。ＲＮＡ濃度が４０ｎｇ／μＬ未満の試料を、遠心濃縮機を用いて調製した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、５００ｎｇの全ＲＮＡを逆転写した。２μＬのｃＤＮＡを１：５に希釈して１０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ ｗｉｔｈ ＵＮＧ及びグリセルアルデヒド ３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）、ＡＣＴＣ１（Ｈｓ００６０６３１６＿ｍ１）用のＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から購入した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＰＲＩＳＭ７５００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて２連で行った。ＰＣＲ条件は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後に９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を６０サイクルであった。発現量の定量は、比較Ｃｔ法により行った。すなわち目的遺伝子のＣｔ値を内在性コントロールＧＡＰＤＨのＣｔ値と比較してΔＣｔ値を算出した後、各試料の倍率変化（ＦＣ）をキャリブレータに対する相対値として式２＾（－ΔΔＣｔ）を用いて決定した。キャリブレータとしては、グリオーマに罹患していない正常な脳組織（ｎ＝５）から抽出されたｍＲＮＡをプールしたｐｏｏｌｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｍＲＮＡにおけるΔＣｔ値を平均化した数値を用いた。以下にＦＣを算出する式を表す。
Figure 0007122016000001
 上記式により算出されたＦＣがカットオフ値である１．０未満である場合はＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現を陰性と判定し、１．０以上の場合は陽性と判定した。
Ｂ．タンパク質発現解析
グリオブラストーマの１症例のＦＦＰＥ試料を薄片に切り分け、脱パラフィンした後、一次抗体として抗ＡＣＴＣ１抗体（ａｌｐｈａ Ｃａｒｄｉａｃ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＧｅｎｅＴｅｘ）を，二次抗体として蛍光抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて免疫組織染色を行った。ＤＡＰＩを用いて細胞核を染色した後、共焦点顕微鏡で観察した。また、ＡＴＣＣより購入したグリオブラストーマ細胞株であるＵ８７についても、同様に免疫染色を行ってＡＴＣＴ１タンパク質の発現を解析した。
（１－３）患者のサーベイランス及び追跡
患者の全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）をカプランマイヤー法により解析した。腫瘍の進行は、腫瘍サイズ、新たな腫瘍領域又は明瞭な神経変質の増加により定義した。全ての患者を最長１５．４年まで追跡した。
（１－４）ＭＩＢ－１インデックスの測定
ＦＦＰＥブロックをスライド上に薄片に切り分け、脱パラフィンした。ＢＧＸ－Ｋｉ６７（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を製造業者の説明書に従って用いて、抗－Ｋｉ６７モノクローナル抗体により切片を免疫染色した。高度に免疫染色された領域における陽性染色腫瘍細胞核のパーセンテージとしてＭＩＢ－１インデックスを算出した。
（１－５）ＡＣＴＣ１のノックダウン
ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現を抑制するようデザインされたｓｉＲＮＡ（Ｓｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡｓ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてグリオブラストーマ細胞株Ｕ８７に導入し、ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡを（１－２）Ａ．と同様の方法で測定して、ｓｉＲＮＡによる発現抑制を確認した。
（１－６）Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ
ｓｉＲＮＡによりＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現を抑制したＵ８７の遊走能を評価するため、ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ（登録商標） ２４－Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａａｓａｙ Ｋｉｔ（ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＡＢＳ， ＩＮＣ．）を用いて、製造業者の説明書に従ってＭｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを行った。培地を分注したアッセイプレートの各ウェルにポリカーボネート膜の底部を持つチャンバーを設置し、チャンバー内に細胞懸濁液を入れ、６時間静置して細胞を遊走させた。膜を透過した遊走細胞をＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで染色し、５６０ｎｍの波長における吸光度を測定した。
（１－７）統計解析
群間の差は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定及びＳｐｅａｒｍａｎ検定を用いて評価した。全ての統計解析は、ＳＰＳＳ（バージョン２２）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。ｐ＜０．０５である場合に統計的に有意な差であると判定した。生存率の比較は、ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定により行った。
２．結果
（２－１）ＡＣＴＣ１の発現解析
遺伝子発現解析の結果を図１及び図２に示す。定性的評価としてのＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡ発現率は、ＷＨＯグレードが上がるにつれて上昇した（図１Ａ）。ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡが検出された症例を対象とした定量的評価としてのＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現量は、低悪性度グリオーマ（グレードＩ及びＩＩ）に比べて高悪性度グリオーマ（グレードＩＩＩ及びＩＶ）で有意に上昇していた（図１Ｂ、ｐ＝０．０２４）。さらに、ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡが検出された症例を対象として、ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡ発現量と予後との関連性を評価した（図２）。グレードＩを除くグリオーマ（グレードＩＩ～ＩＶ）、グレードＩＶのグリオーマのいずれにおいても、ＡＣＴＣ－ｍＲＮＡの発現量と全生存期間（ＯＳ）との間に相関は認められなかったことから、ＡＣＴＣ１は、その発現量の多寡ではなく、発現の有無が予後に関係するものと考えられる。
タンパク質発現解析の結果を図７及び図８に示す。グリオブラストーマ組織、グリオブラストーマ細胞株のいずれにおいても、ＡＣＴＣ１タンパク質の発現が観察された。
（２－２）カプランマイヤー法による全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）の解析
患者の全生存期間（ＯＳ）及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）のカプランマイヤー曲線を図３に、これらの中央値についてＣｏｘ比例ハザードモデルへの当てはめによりハザード比を解析した結果を表１に示す。
Figure 0007122016000002
グレードＩを除くグリオーマ、グリオブラストーマのいずれについても、ＡＣＴＣ１陽性群のｍＯＳ及びｍＰＦＳは、ＡＣＴＣ１陰性群のそれらよりも統計的に有意に短かった。このことは、ＡＣＴＣ１がグリオーマの予後不良因子であることを示している。
なお、本研究において腫瘍を最大限摘出した後にテモゾロマイドを用いて化学放射療法を施したグリオブラストーマのｍＯＳは、近年の報告と同程度の１８．４月（１．５３年）であった。さらに、既知の予後良好因子として知られるＩＤＨ変異による生存ベネフィットは、１６月（１．３３年）と報告されている（Ｙａｎ Ｈら（２００９）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６０（８）：７６５－７７３）。本研究におけるＡＣＴＣ１陰性による生存ベネフィットは、これらの化学療法又はＩＤＨ変異による生存ベネフィットよりも長いことが示された。
（２－３）診断時のＭＲＩ所見
診断時、ＡＣＴＣ１陽性グリオブラストーマの３１．６％で対側大脳半球への浸潤が認められた一方、ＡＣＴＣ１陰性グリオブラストーマでは浸潤は観察されなかった（ｐ＝０．０２０）。診断時のＡＣＴＣ１陽性グリオブラストーマの代表的なＭＲＩ所見を図４Ａ～Ｃに示す。深在性及び対側大脳半球への浸潤が観察され、典型的な浸潤パターンは脳梁を介した進行であった。頭痛及び悪心の症状を有する６０歳女性患者（図４Ａ）及びてんかん発作の症状を有する５３歳男性患者（図４Ｂ）の両方において、脳梁膝及び脳梁前部の１／３を介して対側の大脳半球に向けて浸潤した腫瘍が認められた。頭痛の症状を有する７１歳女性患者のＭＲＩは、脳梁膨大部を介したグリオブラストーマの浸潤を示した（図４Ｃ）。
診断時のＡＣＴＣ陰性グリオブラストーマの代表的なＭＲＩ所見を図４Ｄ～Ｆに示す。腫瘍は皮質表面近くで発生し、組織分布的に均一であった。進行性感覚性失語症の症状を有する１９歳女性患者の腫瘍の最大径は６２ｍｍであったが、浸潤は観察されなかった（図４Ｄ）。感覚性失語症の症状を有する６３歳女性患者（図４Ｅ）、左半側麻痺の症状を有する６１歳女性（図４Ｆ）の腫瘍も同様の所見であった。
（２－４）グリオブラストーマ再発時のＭＲＩ所見
再発時、高悪性度グリオーマでは、ＡＣＴＣ１陽性症例の９０．９％で遠隔部再発が観察されたが、ＡＣＴＣ陰性症例では遠位再発は示されなかった（ｐ＝０．０００）。グレードＩＩＩグリオーマの場合、再発は７１．４％の症例で観察され、ＡＣＴＣ１陽性症例は全て遠隔部再発を示したが、ＡＣＴＣ１陰性症例では再発は全て局部領域にとどまった（ｐ＝０．０２５）。グリオブラストーマの場合、ＡＣＴＣ１陽性症例の８７．５％で遠隔部再発を示したが、ＡＣＴＣ１陰性症例では遠隔部再発は観察されなかった（ｐ＝０．００７）。
再発時のＡＣＴＣ陽性グリオブラストーマの代表的なＭＲＩ所見を図５左側に示す。診断時、左半身の感覚障害の症状があった５７歳男性患者の腫瘍は、左被殻から発生し、周囲脳浮腫を伴って不均一な環状増強効果（リング・エンハンスメント）を呈していた（図５Ａ及びＢ）。同症例における再発は、最初の外科手術から２０．３月後に右側頭葉で観察された（図５Ｃ及びＤ）。原発巣の対側に再発性病変が生じており、交連神経路を介した腫瘍の拡散が推定された。
再発時のＡＣＴＣ陰性グリオブラストーマの代表的なＭＲＩ所見を図５右側に示す。診断時、進行性感覚性失語症の症状があった１９歳女性患者の腫瘍は、後部側頭葉において周囲脳浮腫を伴って生じていた（図５Ｅ及びＦ）。本症例においては腫瘍が表在位置にとどまったため、強調された腫瘍の全摘出が行われた。初回の処置から１３．３月後、多脳葉に対する浸潤又は遠隔部再発を伴わない局所再発のみが観察された（図５Ｇ及びＨ）。
（２－５）ＡＣＴＣ１発現と患者の年齢、カルノフスキー活動指標（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔａｔｕｓ：ＫＰＳ）及びＭＩＢ－１インデックスとの関連性
グレードＩからＩＶまでの全グリオーマ症例を対象として、グリオーマの予後因子として知られる患者年齢及びＫＰＳ、細胞増殖能の指標であるＭＩＢ－１インデックスのそれぞれと、ＡＣＴＣ１発現との関連を評価した。結果を図６に示す。ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡ発現量と患者年齢（図６Ａ）、ＫＰＳ（図６Ｂ）及びＭＩＢ－１インデックス（図６Ｃ）との間に相関は認められなかった。
（２－６）ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡ発現抑制が細胞遊走能に及ぼす影響の評価
グリオブラストーマ細胞株Ｕ８７を用いて、ＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現抑制が細胞遊走能に及ぼす影響を評価した。ｓｉＲＮＡは、Ｕ８７におけるＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現を顕著に抑制した（図９Ａ）。Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙの結果、ｓｉＲＮＡ処理していないＵ８７の遊走能と比べて、ｓｉＲＮＡ処理によりＡＣＴＣ１－ｍＲＮＡの発現が抑制されたＵ８７に遊走能は大きく低下していることが見出された（図９Ｂ）。
（２－１）～（２－５）の結果から、ＡＣＴＣ１は患者年齢及びＫＰＳから独立したグリオーマの予後因子であることが示された。さらに、ＡＣＴＣ１とＭＩＢ－１インデックスとの間に相関が認められなかったことから、ＡＣＴＣ１陽性グリオブラストーマの予後不良は、細胞増殖によるものではなく、神経線維に沿った腫瘍細胞の浸潤によるものであると推測された。ＡＣＴＣ１は増殖から独立した浸潤マーカーであると考えられる。
また、（２－６）の結果から、ＡＣＴＣ１の発現を抑制することによりグリオーマ細胞の遊走が阻害されること、すなわちグリオーマの浸潤及び遠隔部再発を抑制し得ることが示された。

Claims (3)

  1. ＡＣＴＣ１タンパク質をコードする遺伝子に対する阻害性核酸を含む、グリオーマを処置するための医薬組成物。
  2. 阻害性核酸がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 阻害性核酸を発現可能な組換えウイルスを含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
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