WO2015111953A1 - 퓨코스테롤을 함유하는 피부 미백 또는 보습용 조성물 - Google Patents

퓨코스테롤을 함유하는 피부 미백 또는 보습용 조성물 Download PDF

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WO2015111953A1
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moisturizing
fucosterol
skin
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황재관
우선욱
김창희
김미보
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Definitions

  • Skin whitening containing fucoste or: Composition for moisturizing skin.
  • the present invention relates to a novel use of fucosterol, and more particularly to a composition for skin whitening or moisturizing, containing fucoste. [Technique to become background of invention]
  • Human skin color is influenced by several factors, including the activity of melanocytes that make melanin pigment, the distribution of blood vessels, the thickness of the skin and the presence or absence of pigments in and outside the body, such as carotenoids and hemoglobin. Is determined.
  • the formation of melanin pigments is influenced by genetic factors, physiological factors related to hormone secretion, stress, and environmental factors such as UV irradiation (Annu. Rev. Genet. 37: 67-90, 2003).
  • tyrosinase An important influence on the mechanism of production of melanin is an enzyme called tyrosinase, which is involved in the oxidation process of tyrosine in melanosomes within melanocytes.
  • the tyrosinase is activated by ultraviolet exposure and acts on tyrosine Melanin polymers were synthesized during the oxidation process to produce dopa (DOPA; 3,4-dihydroxyphenylalanine) and dopaquinone (J. Eriviron. Sci. Health. 23 (2): 105-161, 2005) .
  • DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine
  • Ascorbic acid, kojic acid, arbutin, hydro in order to cure or alleviate excessive melanin pigmentation caused by sun exposure and sunburn symptoms such as blemishes, freckles and pigmentation.
  • Hydroquinone, glutathione, or derivatives thereof, which have tyrosinase inhibitory activity, are used in cosmetics and medicines.
  • their use is limited due to their uneven whitening effect, safety issues on the skin, formulation and stability problems when formulated in cosmetics (Dermatol. Ther. 20 (5): 308-313, 2007). Therefore, in order to solve the problems of the active ingredients, there is a need for an active ingredient derived from natural products that have been proven to be safe and stable.
  • the stratum corneum of the skin is present in the outermost shell of the skin and is in direct contact with the external environment and plays an important barrier function to protect our body from external physical and chemical stress. This barrier function is maintained by the epidermal homeostasis.
  • Epidermal homeostasis is to maintain a continuous skin barrier function by forming a skin barrier called the stratum corneum through terminal differentiation through growth division and differentiation of keratinocytes in the basal layer (Korean J) Sci. Techno 1. 43: 458-463, 2011).
  • keratinocytes As keratinocytes differentiate, they create two factors that affect moisturization. First, during keratinocyte differentiation, the cell membrane is replaced by a construct called the cornified envelope. The keratinocyte membrane contains loricrin, invohicr in, and fi laggrin. Including: . : rescue . ⁇ ⁇ Membrane structure cross-linked by an enzyme called transglutaminases S: ⁇ For the external environment. ⁇ ::: Provides a protecting group, etc., while suppressing water evaporation in keratinocytes. Mol.Cel 1 Biol. 6 (4): 328-340, 2005).
  • Keratin protein membrane structure and transport glue Tommy tyrosinase is ⁇ of keratinocytes: eu under minute: it starts to be expressed in accordance with is used as the differentiation factors (differentiation marker) (Nat Rev. Mol Cell Biol 6 (4):.. 328- 340, 2005).
  • differentiation factors differentiation marker
  • keratinocytes produce a natural moisturizing factor (NMF) while retaining their function as a skin barrier.
  • NMF natural moisturizing factor
  • An important source for the production of natural moisturizing factors is filaggrin, which is broken down into hydrophilic amino acids by caspase 14 to form natural moisturizing factors.
  • Natural moisturizers function to maintain moisture in the skin by providing water holding capacity and moisture absorption in the air (J. Cell Sci. 122: 1285-1294, 2009). Therefore, maintaining the proper level of natural moisturizing factor for the skin is a very important factor for skin health through the skin barrier function.
  • Fucoste is a substance mainly found in seaweed, and is found in seaweeds in coastal areas of Asia such as Korea, China, and Japan. To date, the activity of fucoste is anti-cancer (Pharmacogn. Mag. 8 (29): 60-64, 2012), antidiabetic (Arch. Pharm. Res. 27 (11): 1120-1122, 2004), antioxidant (Bioorg Med. Chem. 17 (5): 1963-1973, 2009), improved blood lipid composition (Biochem. Biophys. Res. Co. un. 369 (2): .363-368, 2008), metabolism of cholesters (New Phytol. 183 (2): 291-300, 2009), antibacterial (J. Pharm. Biomed. Anal.
  • the present inventors completed the present invention by clarifying that the fucoste contained in the seaweed has excellent whitening activity and moisturizing function while searching for a material having a whitening activity or a moisturizing function derived from natural products.
  • an object of the present invention is to provide a cosmetic composition for whitening, characterized in that it contains the fucosteol of the chemical formula 1 below.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for whitening, characterized in that it contains the fucoste of the formula (1).
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for whitening, characterized in that containing the fucoste of the formula (1).
  • Another object of the present invention to provide a moisturizing cosmetic composition, characterized in that it contains the fucosterol of the formula (1).
  • Another object of the present invention is to provide a moisturizing food composition comprising the fucoste of formula (1).
  • Another object of the present invention is to provide a moisturizing pharmaceutical composition comprising the fucoste of formula (1).
  • Other objects and advantages of the invention are set forth in the following detailed description and claims . Made it clearer. , ' :
  • the present invention relates to a composition for skin mercury having excellent whitening efficacy, and more particularly, to a cosmetic, food and pharmaceutical composition for skin whitening, characterized in that it contains a fucosterol represented by the formula ⁇ s as an active ingredient. will be.
  • the present invention relates to a composition for moisturizing skin having excellent moisturizing function, and more particularly, for moisturizing skin, comprising fucoste represented by the following Chemical Formula 1 as an active ingredient.
  • a composition for moisturizing skin having excellent moisturizing function and more particularly, for moisturizing skin, comprising fucoste represented by the following Chemical Formula 1 as an active ingredient.
  • Cosmetics, foods and pharmaceutical compositions comprising fucoste represented by the following Chemical Formula 1 as an active ingredient.
  • the fucostere represented by the formula (1) is extracted from a natural raw material such as seaweed and can be separated or synthesized by a chemical synthesis method.
  • the fucosterol is a moxibustion
  • the fucosterol is liquor leek (Al / j ' schoenoprasum), mahogany (5k / eie7? / S macrophyl la), hazel (irs 1 avellana), ⁇ ⁇ - ⁇ "(Azadirachta indie a), ⁇ - ⁇ (Osmanthus fragrans var. Aurantiacus), ⁇ iFructus broussonetiae), f3 ⁇ 4 "i r (Saccharum officinarwi), ⁇ (Setar / a italica), etc.
  • the fucoste of the present invention can be extracted from the moxibustion (see ⁇ Example 1>).
  • Separation and purification of the fucoste of the present invention can be used alone or in combination with column chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC) filled with various synthetic resins such as silica gel or activated alumina. Extraction and separation and purification methods are not necessarily limited to the above methods.
  • the melanocyte stimulating hormone (a-melanocyte stimulating hormone; ⁇ -MSH) in B16F10 melanoma cells to promote melanin production and then administered the fucoste of the present invention to inhibit melanin production Whether or not was measured.
  • a-melanocyte stimulating hormone a-melanocyte stimulating hormone; ⁇ -MSH
  • the fucoste of the present invention effectively inhibits the production of melanin (see ⁇ Examples 3 and 4>).
  • the present invention and fucoste were administered to determine whether tyrosinase activity was inhibited.
  • the fucoste of the present invention effectively inhibits the activity of tyrosinase (see ⁇ Example 5>).
  • the protein expression of tyrosinase was increased by ⁇ -MSH in B16F10 melanoma cells, followed by the administration of the fucoste of the present invention to determine whether the protein expression of tyrosinase was inhibited. As a result, it was confirmed that the fucoste of the present invention effectively inhibits the expression of tyrosinase protein (see ⁇ Example 6>).
  • the protein expression of TRP-1 and TRP-2 by administering the fucoste of the present invention after increasing the protein expression of TRP-1 and TRP-2 with ⁇ -MSH in B16F10 melanoma cells It was measured whether or not to inhibit. As a result, it was confirmed that the fucoste of the present invention effectively inhibits the expression of TRP-1 and TRP-2 proteins (see ⁇ Example 7>).
  • the fucoste is excellent in the whitening activity can be used as an effective ingredient of the cosmetic composition, food composition or pharmaceutical composition.
  • the fucosterol of the present invention promotes the formation of keratinocyte membranes, promotes the differentiation of keratinocytes, and provides skin moisturizing efficacy by forming natural moisturizing factors.
  • keratinocytes were treated with the fucoste of the present invention, and then keratinocyte membrane formation was measured. As a result, it was confirmed that the fucoste of the present invention effectively promotes the formation of keratinocyte membrane (see ⁇ Example 9>).
  • balmyeongwa Pew ⁇ stacking the green pillar and caspase was treated in the keratinocytes it was measured whether or not: if spilled increase expression of '14'. As a result, it was confirmed that the fucosterol of the present invention effectively increased the expression of filaggrin and caspase 14 (see ⁇ Example 12> ⁇ Example13>).
  • the fucoste is excellent in moisturizing function can be used as an effective component of the cosmetic composition, food composition or pharmaceutical composition.
  • Fucoste may be contained as an active ingredient of the skin whitening cosmetic composition and the skin moisturizing cosmetic composition of the present invention, the amount is not particularly limited to an amount effective to achieve a whitening or moisturizing function, but the total composition It is preferably 0.001 to 10% by weight, more preferably 0.01 to 5% by weight based on the weight. If the content is less than 0.001% by weight, the desired whitening or moisturizing effect cannot be expected, and if it is more than 10% by weight, there is a difficulty in preparing safety or formulation.
  • the skin whitening cosmetic composition and the skin moisturizing cosmetic composition containing the fucosterol of the present invention as an active ingredient are not particularly limited in the formulation.
  • softening water, astringent makeup, nourishing cream, nourishing cream massage cream It may be formulated into cosmetics such as essence, eye cream, eye essence, cleansing cream, cleansing product, cleansing water, pack, gel, powder, body lotion, body cream, body oil, body essence and the like.
  • the cosmetic composition for skin whitening of the present invention may further contain other whitening components, such as arbutin, ascorbic acid derivatives, in addition to the aforementioned fucoste in order to enhance the whitening effect, these
  • whitening components such as arbutin, ascorbic acid derivatives
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the nutritional supplement may be prepared by adding the fucoste to capsules, tablets, pills, and the like, but is not limited thereto.
  • the fucosterol itself can be ingested in the form of tea, juice and drink can be consumed by special liquefaction, granulation, encapsulation and powdered.
  • the fucoste in the form of a food additive it can be prepared in powder or concentrate form.
  • it can be prepared in the form of a composition by mixing with the fucosterol and known active ingredients known to have a whitening or moisturizing effect.
  • Fucoste may be contained as an active ingredient of the skin whitening food composition and the skin moisturizing food composition, the amount is not particularly limited to an amount effective to achieve a whitening or moisturizing function, but with respect to the total weight of the total composition It is preferably from 0.01 to 100 weight 3 ⁇ 4.
  • the food composition of the present invention may be prepared in combination with fucosterol along with other active ingredients known to have a whitening or moisturizing effect.
  • Coste the fuser of the present invention is that jjyache: can be: or salts or pharmaceutically acceptable salts in the form of "used".
  • 'pharmaceutically acceptable refers to a physiologically acceptable and, when administered to the eye, typically does not cause allergic reactions or similar reactions, and the salts include pharmaceutically acceptable free acid.
  • the acid portion giyeom Haram preferable formed by the ⁇ organic Seen in the hyuri? - and: - may be a mineral acid Edition.
  • the organic acid is not limited thereto, but citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-lluenesulfonic acid, Glutamic acid and aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the fucoste alone or further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may further include, for example, carriers for oral administration or carriers for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • Carriers for parenteral administration may also include water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol dung, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preserving agents include benzalkonium chloride al benzamide, methyl-or propyl-paraben, and chlorobutanol has a ".
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referenced in the literature (Remington's Pharmaceut i cal Sciences, 19th ed., Mack Publ i shing Com any, Easton, PA, 1995) .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to any mammal, including humans.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration.
  • the pharmaceutical ancestors of the present invention may be formulated into preparations for oral or parenteral administration according to the route of administration as described above.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art as powders, granules, tablets, pills, dragees, capsulants, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions and the like.
  • oral preparations can be obtained by tablets or dragees by mixing the active ingredients with solid excipients and crushing them, adding them with suitable auxiliaries, and then processing them into a waxy mixture.
  • suitable excipients include sugars and corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, including lactose, dextrose, sucrose, solbi, mannitol, xili, erysri and malty, etc.
  • Layered agents such as starch, cellulose, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and hydroxypropylmethyl-celrose, and the like, such as salose, gelatin, polyvinylpyridone, and the like.
  • crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier and a preservative.
  • Formulations for parenteral administration may be formulated by methods known in the art in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, humectants, gels, aerosols and nasal inhalants. These formulations are formulated commonly known in all pharmaceutical chemistry (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack.
  • the total effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose, and administered by a fract ionated treatment protocol administered for a long time in a mul t iple dose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the extent of the disease.
  • Parenteral administration is preferably administered in an amount of preferably 0.01 to 50 mg, more preferably 0.1 to 30 mg per kg of body weight per day based on the fucoster, and oral administration based on the fucosterol Divided into 1 to several times to be administered in an amount of preferably 0.01 to 100 mg, more preferably 0, 1 to 50 mg per kg of body weight per day It can be administered: A. But the mall: of Fucoste .
  • the pharmaceutical composition is not particularly limited to its formulation, route of administration, and method of administration as long as the effects of the present invention are shown. [effect ⁇
  • the fucoste of the present invention has excellent whitening effect by inhibiting melanin production and tyrosinase activity, so it can be used as an effective component of a cosmetic composition, food composition or pharmaceutical composition for whitening.
  • the fucosterol of the present invention has an excellent moisturizing function by forming a keratinocyte membrane, promoting the differentiation of keratinocytes, and generating a natural moisturizing factor, so that it can be used as an effective ingredient of a moisturizing cosmetic composition, food composition or pharmaceutical composition.
  • a moisturizing cosmetic composition food composition or pharmaceutical composition.
  • Figure 1 shows the results of the cytotoxicity according to the fucosterol treatment in B16F10 melanoma cells.
  • Figure 2 is a result of quantitatively measuring the melanin production inhibitory effect according to the fucosterol treatment in B16F10 melanoma cells.
  • Figure 4 is the result of measuring the inhibitory effect of tyrosinase activity according to the treatment with fucoste in B16F10 melanoma cells.
  • Figure 5 is the result of measuring the protein expression reduction of tyrosinase following treatment with fucosterol in B16F10 melanoma cells.
  • Figure 6 is the result of measuring the amount of TRP-1 and TRP-2 and protein expression according to the treatment of fucoste in B16F10 melanoma cells.
  • FIG: 7 is a result of measuring the B16F10 melanoma cells in the pareun pyuko ⁇ te in cheokri MITF and mRNA expression level decreases...
  • Figure 9 is the result of measuring the mRNA expression increase of differentiation factor, leucine, involukrin, transglomitase according to the treatment of fucoste in HaCaT human keratinocytes.
  • Figure 10 is the result of measuring the increase in the amount of protein expression of differentiation factor, leucine, involukrin, transglomitase according to the treatment of fucoste in HaCaT human keratinocytes.
  • FIG. 11 shows the results of measuring mRNA expression levels of filaggrin and caspase 14 following treatment with fucosterol in HaCaT human keratinocytes.
  • Example 2 Safety Effect of Fucoste Treatment in Melanoma Cells 24-well after incubation of B16F10 melanoma cells in DMEM (dulbecco's modified eagle's media) containing 10% fetal bovine serum Plates (24-well plat) were placed at 2.5 ⁇ 10 4 cell / mL (final volume 1 mL). 0.1, 1, 5, 10, 20 ⁇ M of fucoste were treated with B16F10 melanoma cells, respectively. After 48 hours of treatment, the medium was removed, and 0.5 mg / mL MTT solution was added to each well of 0.3 mL, followed by incubation for 4 hours in an incubator. After 4 hours, the ⁇ solution was removed, and the resulting formazan was dissolved by adding DMSC dimetyl sulfoxide, and the absorbance was measured at 570 nm. The results are shown in FIG. 1.
  • Example 3 Melanin Inhibitory Effect of Melanoma Cells Treated with Fucoste B16F10 melanoma cells were incubated in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and then placed in a 6-well plate at 2 ⁇ 10 cell / mW volume 3 mL. 2 After 4 hours of incubation, the medium was removed. Green 3 ⁇ 41 fucosterol was treated in DMEM medium containing 200 nM ⁇ -MSH at concentrations of 5, 10 and 20 ⁇ , respectively.
  • trypsin-ethylene dia things acetate (ti) sm EDTA processing 3 ⁇ 4 open the liquid: the cell pellet collected (pel let) and 1.5mL tube (tube ), And the supernatant was removed by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes. The obtained pellet was dried at 60 ° C., and then 100 uL of IN NaOH was added to dissolve intracellular melanin. The solution was diluted with PBS phosphate buffered saline and absorbance at 405 nm was measured with an ELISA reader (Versa max, Sunnyvale, CA USA) to determine the melanin content of the sample treatment group.
  • B16F10 melanoma cells were incubated in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and then placed in 6-well plates at 2 ⁇ 10 5 cells / mL (final volume 3 mL). After incubation for 24 hours, the medium was removed, and treated with Fucoste dissolved in DMEM medium containing 200 nM ⁇ -MSH at a concentration of 5 and 20 ⁇ , respectively. 6-well after 72 hours Cultured medium in the plate was removed and B16F10 melanoma cells were photographed using a microscope (Olympus 1 ⁇ 71 Model) and the results are shown in FIG. 3.
  • fucoster significantly inhibited melanin production of B16F10 melanoma cells induced by a-MSH.
  • B16F10 melanoma cells were incubated in DMEM medium containing 10% fetal calf serum and then placed in 6-well plates at 2 ⁇ 10 5 cel l / mL (final volume 3 mL). After incubation for 24 hours, the medium was removed and the fucoste dissolved in DMEM medium containing 200 nM a -MSH was treated at 5, 10, and 20 ⁇ M concentrations, respectively. After 48 hours, cultured medium was removed from 6-well plates and cells were recovered by adding PBS containing 1% Triton X-XKTri ton X-100).
  • the recovered cells were centrifuged at 10, 000 rpm for 10 minutes, and 150 i L of the supernatant was placed in a 96-weU plate and 50 u of L-dopa (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-D0PA). L was added. After incubation at 37 ° C. for 30 minutes, the absorbance was measured at 475 ran using the microplate reader (Versa max, Sunnyvale, CA, USA). At this time, the cells without addition of the fucosterol as a control, and the degree of tyrosinase activity of the control and cells treated with the fucosteol was measured. To calculate the tyrosinase activity compared to the control group according to the following equation 2 shown in Figure 4 the results.
  • Example 6 Tyrosinase Protein Expression Reduction Effect of Melanoma Cells Treated with Fucoste B16F10 melanoma cells from a baeing DMEM medium with 10% fetal bovine serum-containing: were placed in a 6-well Opole art after: 2 X:: 10 5 ceH / mL (3mL end Buffa). After incubation for 24 hours, the medium was removed, and the treated DMEM medium containing 200 nM ⁇ -MSH: was treated with green fucoste at concentrations of 5 and 20 ⁇ M, respectively.
  • the nitrocell membrane was washed three times for 10 minutes using TBST tr i s-buffer sal ine tween20). After washing, the secondary antibody (ant i-goat horseradish) recognizing the primary antibody was reacted with 2.5% bovine serum albumin to 1: 5000 and reacted with nitrocell membrane for 2 hours in silver. And washed three times for 10 minutes. Protein band was developed using ECL western blotting detect ion reagent s (Amer sham, Tokyo, Japan), using G; B0X EF imaging system (Syngene, Cambridge, UK). The developed protein band was confirmed. As a result, protein expression of tyrosinase was confirmed, and the protein loading to a -tubul in was constant.
  • fucosterol decreased the protein expression of the melanogenesis enzyme tyrosinase in B16F10 melanoma cells.
  • Example 7 Protein Expression Reduction Effect of Tyrosinase-related TRP-1 and TRP-2 by Melanoma Cells
  • B16F10 melanoma cells were incubated in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and then placed in 6-well plates at 2 X 10 5 cel l / mL (final volume 3 mL). After incubation for 24 hours, the medium was removed, and the fucoste dissolved in DMEM medium containing 200 nM ⁇ -MSH was treated at 5 and 20 ⁇ M concentration, respectively. After 24 hours, the cells were lysed with NP40 complete solution containing proteinase inhibi tor cocktai. The amount of protein extracted from the cells was quantified using Bradford reagent.
  • the quantified protein was removed by boiling for 5 minutes and electrophoresed with 10% SDS-PAGE, and the separated proteins were transferred to a nitrocellulose mower.
  • Primary antibodies of TRP-1 and TRP-2 were reacted with 2.5% bovine serum albumin at a ratio of 1: 1000 and reacted with the protein delivered to the nitrocellulose membrane at room temperature for 20 hours.
  • Primary antibodies were banung following the TBST was washed three times, using a sodium selreul Ross' film for 10 minutes.
  • a secondary antibody (anti-goat horseradish) recognizing the primary antibody was diluted 1: 5000 in 2.5% bovine serum albumin and reacted with nitrocellulose membrane at room temperature for 2 hours, using TBST. And washed three times for 10 minutes.
  • Protein bands were developed using ECL western blotting detection reagents (Amer sham, Tokyo, Japan), and the protein bands were identified using G; B0X EF imaging system (Syngene, Cambridge, UK). As a result, the expression of TRP-1 and TRP-2 was confirmed, and the protein loading was constant with a-tubulin.
  • fucosterol decreased the protein expression of melanogenesis enzymes TRP-1 and TRP-2 in B16F10 melanoma cells.
  • B16F10 melanoma cells were incubated in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and then placed in 6-well plates at 2 ⁇ 10 5 cells / mL (final volume 3 mL). After incubation for 24 hours, the medium was removed and the fucoste dissolved in DMEM medium containing 200 nM a-MSH was treated at 5 and 20 ⁇ concentrations, respectively. After 24 hours, total RNA was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Total RNA isolated was quantified using nanodrop (ND-1000). Quantified RNA was synthesized by cDNA using reverse transcriptase and PCR machines (Applied biosystems, Foster city, CA, USA) and then PCR was performed using the following specific primers:
  • Reverse primer 5 '-CCACCCGAGCCACATCGCTC-3' (SEQ ID NO: 2) MITF-
  • Reverse primer 5'-CGTGTTCATACCTGGGCACT-3 '(SEQ ID NO: 4) PCR showed that heavy cDNA was isolated by electrophoresis with: 1.51 agarose; gel and G; B0X; EF :: imaging ⁇ system (Syngene Cambridge UK) The cDNA band was confirmed and the results are shown in FIG. 7.
  • Fucoste reduced the amount of mRNA of MITF that regulates the protein expression of tyrosinase, TRP-1, TRP-2 in B16F10 melanoma cells.
  • HaCaT human keratinocytes were incubated in Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) medium containing 10% fetal bovine serum, then in 6-well plates at 2 X 10 5 cells / ml (final volume 3 ml). Put it in. After incubation for 24 hours, the medium was removed and the fucoste dissolved in DMEM medium was treated at 5, 10, 20 ⁇ concentrations, respectively. After 96 hours of incubation, the culture medium was removed from the 6-well plate, and pellets of cells were collected, transferred to a 1.5 ml tube, and centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Media
  • the obtained pellet was boiled by adding Tris complete layer solution containing 2% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) and 20 mM Dithiothre (Dithiothreitol, DTT), and absorbance was measured at 340 nm to form keratinocyte membrane. The effect was evaluated. According to Equation 1 below, the degree of formation of keratinocyte membranes compared to the control group was calculated and the results are shown in FIG. 8.
  • fucoster has excellent keratinocyte membrane forming effect and excellent moisturizing effect (*: ⁇ 0.05).
  • Example 10 Increased mRNA expression of leucine, involucrine, and transglutaminase according to fucosterol treatment in HaCaT human keratinocytes
  • RT-PCR reverse transcript ion polymerase chain reaction
  • Reverse primer 5 -CCACCCGAGCCACATCGCTC-3 '(SEQ ID NO: 6) loriclean
  • Reverse primer 5 -ACTGAGGCACTGGGGTTGGGA-3 '(SEQ ID NO: 8) Involukrin
  • Reverse primer 5 -GAGACGGGCCACCTAGCGGA-3 '(SEQ ID NO: 10) transglutaminase
  • Reverse primer 5'-AGGCACAAACGACTGGCGCA-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • mRNA expression of leucine, involukrin, and transglutaminase increased in HaCaT human keratinocytes following treatment with fucoste. I could confirm it. So fucoste The moisturizing effect is excellent by promoting differentiation in keratinocytes (*: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01). .
  • aCaT human keratinocytes - 10 fetal bovine serum (fe ar bovine s ruiii) a "containing a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media ) were cultured in medium 2 X 10 5 cell / ml (final volume in 6-well plates 3 ml). 24 hours incubation after removing the culture medium, and processing the fuser Coste dissolved in DMEM medium with respectively 5, 10, 20 ⁇ concentration. After 24 hours, HaCaT human keratinocytes were lysed with NP40 complete solution containing proteinase inhibitor cocktail. The amount of protein extracted from HaCaT human keratinocytes was quantified using the Bradford method. After boiling the sample for 5 minutes, the same amount of protein (20 g) was separated by electrophoresis by 10% SDS-PAGE. After electrophoresis, the separated proteins were transferred to nitrocell membrane and subjected to western blot.
  • DMEM Dulbecco'
  • the cells were washed three times for 10 minutes using TBSTCTris-buffer Saline Tween20). At this time, the type and the dilution rate of the primary hanger used in the present invention is 1: 1000.
  • the secondary antibody reaction is applied to the membrane on which the primary antibody reaction is performed.
  • the secondary antibody was added and reacted for 2 hours at room temperature. At this time, the dilution rate of the secondary antibody was 1: 5000. Protein bands were developed using ECL western blotting detect ion reagents (Amer sham, Tokyo, Japan). The protein expression of loriclean, involuclin, transglutaminase was confirmed, and the protein loading was constant with a-tubulin.
  • fucoster has excellent moisturizing function by promoting differentiation in keratinocytes.
  • Example 12 mRNA Expression Increase of Filaggrin and Caspase 14 by Fucoste Treatment in HaCaT Human Keratinocytes
  • HaCaT human keratinocytes were incubated in Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) medium containing 10% fetal bovine serum, followed by 2 ⁇ 10 5 cells / mi (final volume 3 ml) in 6-well plates. After incubation for 24 hours, the medium was removed, and the fucosterol dissolved in DMEM medium was treated at 5, 10, and 2 ⁇ concentrations, respectively.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Media
  • Reverse primer 5 -CCGGC1TGGCCGTAATGTGT-3 '(SEQ ID NO: 14) Caspase 14
  • Reverse primer 5: -GGGTCCCTTTGTTCTCCTCG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • fucoster has excellent moisturizing effect by generating natural moisturizing factor through increasing expression of filaggrin and caspase 14 in keratinocytes (*: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01).
  • HaCaT human keratinocytes are incubated in DMEKDulbecco's Modified Eagle's Media medium containing 10% fetal bovine serum and placed in 6-well plates at 2 ⁇ 10 5 cells / ml (final volume 3 ml). Incubated for 24 hours Gig the removal of the medium and Pugh Coste dissolved in DMEM culture medium after the "each 5, 10, 20 ⁇ ⁇ was treated at the concentration 0.24 sigap after HaCaT. Human gig" quality cell comprising ah proteinase inhibitor cocktai l MO wancheung solution was dissolved. The amount of protein extracted from HaCaT human keratinocytes was quantified using the Bradford method.
  • the cells were washed three times for 10 minutes using TBSKTri s-buf fer Sal ine Tween20). At this time, the type and the dilution rate of the primary antibody used in the present invention is 1: 1000.
  • the secondary antibody reaction is applied to the membrane on which the primary antibody reaction is performed.
  • the secondary antibody was added and reacted for 2 hours at room temperature. At this time, the dilution rate of the secondary antibody was 1: 5000. Protein band was color "with" the ECL western blott ing detect ion reagent s (Amer sham, Tokyo, Japan). Protein expression of filaggrin and caspase 14 was confirmed, and the protein loading was constant with a- ibul in.
  • fucosterol has excellent moisturizing effect by generating natural moisturizing factors through increasing expression of filaggrin and caspase 14 in keratinocytes.
  • the skin whitening cosmetic composition of Formulation Examples 1 to 6 was prepared according to a conventional method according to the following composition ingredients and composition ratios with excellent fucoste.
  • the nutrient cosmetic lotion was prepared according to a conventional method using the fucosterol of ⁇ Example 1> in the nutrient cosmetic formula formulation ratio of Table 1 below. [Table 1]
  • the flexible cosmetics according to the conventional method was prepared using the fucosterol of ⁇ Example 1> in the following table.
  • Carboxy vinyl polymer : 0.1
  • the nutrition cream was prepared according to a conventional method using the fucoste of ⁇ Example 1> in the nutrition cream formulation ratio of Table 3 below.
  • the pack was prepared according to a conventional method using the fucoste of ⁇ Example 1> according to the pack formulation ratio of Table 5.
  • the gel was prepared according to a conventional method using the fucoste of ⁇ Example 1> according to the gel formulation rate of Table 6 below.
  • the fucoste of Example 1 is 1000 mg, vitamin A acetate 70 ug, vitamin E 1.0 mg, vitamin B1 0.13 mg, vita 3 ⁇ 4 B2 0.15 mg, vitamin B6 () .5 mg, vitamin B12 0.2 ug, vitamin C 10 mg, biotin 10 ug, nicotinamide 1.7 mg, folic acid 50 ug, calcium pantothenate 0.5 mg, ferrous sulfate 1.75 mg, zinc oxide 0.82 mg, magnesium carbonate 25.3 mg, potassium monophosphate 15 mg, first Calcium diphosphate 55 mg, potassium citrate 90 mg, calcium carbonate 100 mg, magnesium chloride 24.8 mg can be prepared in combination, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients according to the general health food manufacturing method After mixing, the granules may be prepared and used to prepare a health food composition according to a conventional method.
  • Purified water was added to 1000 mg of fucosterol, 1000 mg of citric acid, 100 g of loligosaccharide, 2 g of plum concentrate, and 1 g of taurine of ⁇ Example 1>, and the above-mentioned ingredients were common according to the general method of preparing a 900 mL healthy beverage. Combined, then stirred and heated at 85 for about 1 hour, the resulting solution is filtered, taken in a sterile 2 L container, sealed and sterilized and then refrigerated and then used in the manufacture of a healthy beverage composition.
  • Chewing gum was prepared in a conventional manner by combining 20 wt% of gum base, 76.9 wt% of sugar, 1 wt% of fragrance, and 2 wt% of water and 0.01 wt% of the fucoste of ⁇ Example 1>.
  • the tablets were prepared by mixing 50 mg of the fucoste of ⁇ Example ⁇ , 400 mg of crystalline cells, 5 mg of magnesium stearate, and then tableting according to a conventional tablet preparation method. ⁇ 3-3> capsules
  • the active ingredient was dissolved in distilled water for injection according to a conventional injection method, and the pH was adjusted to about 7.5. Then, 100 mg of fucoste of ⁇ Example 1>, distilled water for injection, and a pH adjuster were mixed to prepare an ampoule of 2 mL. Injections were made by stratification and sterilization.
  • Fucoste of Formula 1 has an excellent merbag effect by inhibiting melanin production and tyrosinase activity, so that the cosmetic composition, food composition, or pharmaceutical composition for whitening can be prepared.
  • 1 of fucose cholesterol are keratinocytes mix "form, keratinocytes Four differentiation catalyst ⁇ and: natural beam Domain; fattening by life characters; this exceptional group ⁇ : you can prepare a moisturizing cosmetic composition, food composition or a pharmaceutical composition It is highly industrially available.

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Abstract

본 발명은 퓨코스테롤(fucosterol)의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 퓨코스테롤을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물 또는 피부 보습용 조성물에 관한 것이다. 하기 화학식 1의 퓨코스테롤은 멜라닌(melanin) 생성 및 티로시나제(tyrosinase) 활성을 억제하는 탁월한 미백 효과가 있으므로 미백용 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다. 또한, 하기 화학식 1의 퓨코스테롤은 각질세포막을 형성, 각질세포의 분화 촉진 및 천연보습인자를 생성함으로써 탁월한 보습기능이 있으므로 보습용 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다. [화학식 1]

Description

【명세서】
【발명와명칭】 .
퓨코스테를을 :함유하는 피부 미백;또는:피부 보습용 조성물 【기술분야】
. 본 ■발명은 ■ 대한민국 ' : 해양수산부의 지원 '하에서 : 과체번호' D10906112H320000170에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국해양연구원， 연구사업명은 "해외 해양생물자원 개발 맟 활용기반 구축" ， 연구과제명은 "인도네시아 해양바이오 자원의 확보 및 기초 생리활성 분석" ， 주관기관은 연세대학교 산학협력단， 연구기간은 2009.11.01~2012.06.30이다.
본 특허출원은 2014 년 1 월 23 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0008415 호 및 제 10-2014-0008430 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 퓨코스테를 (fucosterol )의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 퓨코스테를을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는보습용 조성물에 관한 것이다. 【발명의 배경이 되는 기술】
사람의 피부색은 멜라닌 (melanin) 색소를 만드는 멜라노사이트 (melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드 (carotenoid) , 헤모글로빈 (hemoglobin) 등 인체 내외의 색소 함유 유무와 같은 여러 요인들에 의해 결정된다. 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인， 호르몬 분비， 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인이 영향을 미친다 (Annu. Rev. Genet . 37 :67-90, 2003) .
멜라닌의 생성 메커니즘에 중요한 영향을 미치는 것은 티로시나제 (tyrosinase)라는 효소로, 이는 멜라노사이트 내의 멜라노좀 (melanosome)에서 티로신 (tyrosine)의 산화 과정에 관여한다. 자외선 노출 등에 의해 상기 티로시나제가 활성화되어 티로신에 작용하여 도파 (DOPA; 3,4-dihydroxyphenylalanine) 및 도파퀴논 (DOPAquinone)을 생성시키는 산화 과정에 하여, 멜라닌 증합체가 합성돤다 (J. Eriviron. Sci. Health. 23(2) :105-161, 2005).
멜라닌은 피부의 의각인 표피층에 존재하여 자외쟌 등으로부터 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부： 생체 ᅫ에 겨난 '자유라디킬: 잡아주는 역할 하여 :피羊 ^내■ :단백질 유전차들을
중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉생산 되면 기미, 주근깨 등을 형성할 뿐 아니라 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에도 중요한 작용올 하는 것으로 알려져 있다 (FASEB J. 21(4)： 976-994, 2007).
기미， 주근깨， 색소침착 등과 같은꾀부색소 이상침착 증상과 자외선 노출 등에 의해 발생된 과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시켜주기 위해서 이전부터 아스코르빈산， 코지산 (kojic acid), 알부틴 (arbutin)， 하이드로퀴논 (hydroquinone), 글루타치온 (glutathione) 또는 이들의 유도체 티로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 쎄합하여 사용하고 있다. 그러나 이들은 불층분한 미백효과， 피부에 대한 안전성 문제， 화장료에 배합 시 제형 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다 (Dermatol. Ther. 20(5) :308-313, 2007) . 따라서 상기 유효성분들의 문제점을 해결하기 위하여 안전성과 안정성이 입증된 천연물 유래의 유효성분에 대한 요구가 제기되고 있다.
피부의 각질층 (Stratum corneum)은 피부에서 최외각 충에 존재하고， 외부환경에 직접 접하고 있어 외부의 물리적 화학적 스트레스로부터 우리 몸올 보호하는 데 중요한 장벽기능 (barrier function)을 담당하고 있다. 이러한 장벽기능은 표피의 항상성 (homeostasis)에 의하여 유지된다. 표피 항상성은 기저층의 각질형성세포 (keratinocytes)의 성장분열과 세포이동에 따른 분화 과정을 통해 최종 분화 (terminal differentiation)를 거쳐 각질층으로 불리는 피부장벽을 형성함으로써 지속적인 피부 장벽 기능을 유지하는 것이다 (Korean J. Food. Sci. Techno 1. 43:458-463, 2011).
각질형성 세포가 분화함에 따라서 보습에 영향을 미치는 두 가지 요인을 생성한다. 첫째로, 각질형성세포가 분화하는 동안 그 세포막은 각질세포막 (cornified envelope)이라는 구조물로 대체된다. 각질세포막은 로리크린 (loricrin), 인볼루크린 ( invohicr in) , 필라그린 (f i laggrin)을 비롯한 여러： . . : 구조 . ^^ 트랜스글루타미네이즈 (transglutaminases)라는 효소에 의해 가교를 형성한 막 구조물 S서 ：외부환경에.. 대한녜부 : :보호기등을 : 제공함과 동시에 각질세포내의 수분증발을 억제한 (Nat . Rev. Mol . Cel 1 Biol . 6(4) :328- 340, 2005) . 각질 세포막 구조 단백질과 트랜스글루타미네이즈는 각질형성세포의 ■ :분하에ᅳ : 따라 발현되기 시작하므로 분화인자 (differentiation marker)로서 사용된다 (Nat. Rev. Mol . Cell Biol 6(4) :328-340, 2005). 따라서 각질 세포막과 분화인자는 보습의 지표로써 사용된다.
또한 각질세포의 분화 과정 중에 각질형성세포는 천연보습인자 (Natural Moisturizing Factor; NMF)를 생성하면서 피부장벽 (skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다. 천연보습인자들의 생성에 중요한 원천이 되는 단백질은 필라그린으로서， 필라그린은 카스파아제 14(caspase 14)에 의해 친수성 아미노산으로 분해되어 천연보습인자을 형성한다. 천연보습인자는 수분 보유 능력 (water holding capacity)과 대기 중의 수분 흡습력 (moisture absorption)을 제공함으로써 피부 내 보습력을 유지하는 기능을 한다 (J. Cell Sci. 122:1285-1294, 2009). 따라서 피부에 적절한 수준의 천연보습인자를 유지하는 것은 피부 장벽 기능을 통한 피부 건강에 매우 중요한 요소이다.
퓨코스테를은 주로 해조류에 많이 함유되어 있는 물질로 한국, 중국， 일본 등 아시아 지역의 해안에 서식하는 해조류에서 많이 발견되고 있다. 지금까지 퓨코스테를의 활성은 항암 (Pharmacogn. Mag. 8(29)： 60-64, 2012), 항당뇨 (Arch. Pharm. Res. 27(11)： 1120-1122, 2004), 항산화 (Bioorg. Med. Chem. 17(5)： 1963-1973, 2009), 혈중 지질성분 개선 (Biochem. Biophys. Res. Co隱 un. 369(2)： .363-368, 2008), 콜레스테를 대사 개선 (New Phytol. 183(2)： 291-300, 2009)， 항균 (J. Pharm. Biomed. Anal. 51(2)： 450-4555, 2010)， 항곰광이 (Nat. Prod. Res. 24(15)： 1481-1487, 2010), 항노화 (Phot ochem. Photobiol. 89(4) :911-918, 2013) 등이 보고되어 있다. 그러나 퓨코스테롤의 피부 미백 활성 및 보습 활성에 대해서는 지금까지 보고된 바가 없다. 본 명세서 전체에 걸쳬다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인^된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그: 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 ^다 확하게 ^명된다..
/【발 의' 내용 Γ :': ：^
[해결하고자 하는 과제】
이에 본 발명자들은 천연물 유래의 미백 활성 또는 보습 기능이 있는 물질을 탐색하던 중， 해조류에 함유되어 있는 퓨코스테를에 우수한 미백 활성 및 보습 기능이 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 하기 화학삭 1 의 퓨코스테를올 함유하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
[화학식 1]
Figure imgf000006_0001
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1의 퓨코스테를을 함유하는것을 특징으로 하는 미백용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1 의 퓨코스테를을 함유하는 것을 특징으로 하는 미백용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1 의 퓨코스테롤을 함유하는 것을 특징으로 하는 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1 의 퓨코스테를을 함유하는 것을 특징으로 하는 보습용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1의 퓨코스테를을 함유하는 것을 특징으로 하는 보습용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 .의해 보다 명확하게 됬다. , '：；
【과제와해결 수단】 ；
. 본 발명은 미백 효능이 우수한 피부 머백용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 하기 화학식 Γ s 표시되는 퓨코스테롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료， 식품 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 보습기능이 우수한 피부 보습용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 하기 화학식 1 로 표시되는 퓨코스테를을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 보습용 화장료， 식품 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure imgf000007_0001
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 피부 미백 또는 피부 보습용 화장료， 식품 및 약학적 조성물에 있어서, 상기 화학식 1 로 표시되는 퓨코스테를은 해조류 등 천연원료로부터 추출되어 분리되거나 화학적 합성방법에 의하여 합성될 수 있다.
본 발명의 조성물에서， 상기 퓨코스테롤은 뜸부기
si liquosa) , ν} ( Saccharina japonica) , 71 ι Λ1 v\{Kjel Iwaniel la crassi folia) , 미역 ( Undaria pinnatifida) , 큰실말( Cladosiphon okamuranus) , Ceratophyl 1 urn demersum) ,
Figure imgf000007_0002
cava) , ^{Hizikia fusiformis) , ^ ^(Eisenia bi eye lis) ,
Figure imgf000008_0001
또한， 상기 퓨코스테롤은 양주부추 (Al/j' schoenoprasum) , 마호가니 (5k/eie7?/s macrophyl la) , 개암나무 (i r s1 avellana) , ^ Μ-τ" ( Azadirachta indie a) , ^-^^ ( Osmanthus fragrans var. aurantiacus) , ^ iFructus broussonetiae) , f¾"ir ( Saccharum officinarwi) , ^(Setar/a italica) 등의 식물로부터 추출되어 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 퓨코스테를은 뜸부기로부터 추출될 수 있다 (<실시예 1> 참조).
본 발명의 퓨코스테를와 분리 및 정제는 실리카겔 (silica gel)이나 활성 알루미나 (alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있으나, 추출 및 분리정제 방법이 반드시 상기 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는 퓨코스테롤의 세포 독성을 알아보기 위해
B16F10 멜라노마 세포에 퓨코스테롤을 처리한 후 MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl )-2,5-diphenyltetrazol ium bromide) 분석을 통해 세포 안전성을 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테를은 0-20μΜ 의 농도에서 B16F10 멜라노마 세포에 대한 독성을 나타내지 않았다 (<실시예 2〉 참조).
본 발명의 다른 일실시예에서는 B16F10 멜라노마 세포에서 α- 멜라닌세포자극호르몬 ( a -melanocyte stimulating hormone； α-MSH)으로 멜라닌 생성을 촉진시킨 후 본 발명의 퓨코스테를을 투여하여 멜라닌 생성의 억제 여부를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테를은 멜라닌의 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (<실시예 3, 4> 참조). 본 발명의 다른 일실사예에서는 B16F10 멜라노 _마 세포에서 α - MSH 으로 티로시나제 활성을증가시킨 후 본 발명와 퓨코스테를을 투여하여 티로시나제 활성을 억제사키는只ᅵ 여부를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테를은 티로시나제의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (<실시예 5〉 참조) .
'본 발명의 다른 일실시예에서는 B16F10 멜라노마 세포에서 α— MSH 으로 티로시나제의 단백질 발현을 증가시킨 후 본 발명의 퓨코스테를을 투여하여 티로시나제의 단백질 발현을 억제시키는지 여부를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테를은 티로시나제의 단백질 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (<실시예 6〉 참조) .
본 발명의 다른 일실시예에서는 B16F10 멜라노마 세포에서 α - MSH 으로 TRP— 1 과 TRP-2 의 단백질 발현을 증가시킨 후 본 발명의 퓨코스테를을 투여하여 TRP-1 , TRP-2의 단백질 발현을 억제시키는지 여부를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테를은 TRP-1 , TRP-2 의 단백질 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (<실시예 7> 참조) .
본 발명의 다른 일실시예에서는 B16F10 멜라노마 세포에서 α - MSH 으로 MITF 의 단백질 발현을 증가시킨 후 본 발명의 퓨코스테를을 투여하여 MITF의 mRNA 발현을 억제시키는지 여부를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테를은 MITF 의 mRNA 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (<실시예 8> 참조) .
따라서， 상기 퓨코스테를은 미백 활성이 우수하므로 화장료 조성물， 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.
본 발명의 퓨코스테롤은 각질세포막의 형성을 촉진하며, 각질세포 분화를 촉진하고, 천연보습인자를 형성함으로써 뀌어난 피부 보습 효능을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 각질형성세포에 본 발명의 퓨코스테를을 처리한 후 각질세포막 형성 여부를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테를은 각질세포막 형성을 효과적으로 촉진시키는 것을 확인하였다 (〈실시예 9〉 참조) .
본 발명의 다른 일실시예에서는 각질형성세포에서 본 발명의 퓨코스테를을 처리하여 로리크린, 인볼루크린, 트랜스글루타미네이즈를 포함하는 분화인자의：발현^ 증가시키는지 여부를; 측정하였다, 그 결과 ¥ 발명의 퓨코스테 은 로리크란， 인볼루크린， 트랜스글루타미네이즈와 같은 피부 보습 관련 분화인자의 현을 효과적으로 증가시키는 것을 확인하였다 (〈실시예 10>, 실시예 11> 참조) .
본 발명의 다른 일실시예에서는 각질형성세포에서 본 발명와 퓨^스테를을 처리하여 필라그린과 카스파아제 :' 14 '의 발현흘 증가시키는지 : 여부를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 퓨코스테롤은 필라그린과 카스파아제 14 발현을 효과적으로 증가시키는 것을 확인하였다 (<실시예 12> 〈실시예 13〉 참조) .
따라서, 상기 퓨코스테를은 보습기능이 우수하므로 화장료 조성물， 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.
퓨코스테를은 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물 및 피부 보습용 화장료 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데, 그 양은 미백 작용 또는 보습 기능을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량 %인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 5 중량 %로 함유될 수 있다. 함량이 0.001 증량 % 미만에서는 목적하는 미백 또는 보습 효과를 기대할 수 없고， 10 중량 % 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있다.
본 발명의 퓨코스테롤을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 및 피부 보습용 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으몌 예를 들면 유연화장수， 수렴화장수， 영양화장수, 영양크림 마사지크림， 에센스， 아이크림, 아이에센스， 클렌징크림, 클렌징품， 클렌징워터, 팩, 젤， 파우더， 보디로션, 보디크림， 보디오일， 보디에센스 등의 화장료로 제형화 될 수 있다.
또한， 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 미백 효과를 상승시키기 위해 상기한 퓨코스테를 이외에 다른 기존의 미백 성분들， 예를 들어 알부틴， 아스코빅산 유도체 등과 같은 미백성분들을 더 함유할 수도 있으며， 이들 기존의 미백성분들의 종류 및 함량은 당업자에게 주지되어 있다. ■
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건강기능식품 (heal th funct ion foods) , 식품 첨가제 ( food addi t ives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며， 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면， 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료 (알콜성 음료 포함) , 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림， 잼， 마아말레이드 등)， 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지 콘비이프 등) , 빵류 및 면류 (예: 우동， 메밀국수, 라면， 스파게이트, 마카로니 둥) , 과즙， 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터， 치이즈 등) , 식용식물 유지， 마아가린， 식물성 단백질， 레토르트 식품, 넁등식품, 각종 조미료 (예: 된장， 간장， 소스 등) 등에 상기 퓨코스테롤을 첨가하여 제조할 수 있다 . 또한， 영양보조제로는 이에 한정되지 않지만 캡슐， 타블렛， 환 등에 상기 퓨코스테를을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한， 건강기능식품으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 상기 퓨코스테롤 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용할 수 있도특 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한， 상기 퓨코스테를을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 또한， 상기 퓨코스테롤과 미백 또는 보습 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 흔합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
퓨코스테를은 피부 미백용 식품 조성물 및 피부 보습용 식품 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있는데， 그 양은 미백 작용 또는 보습 기능을 달성하기에 유효한 양으로 특별히 한정되는 것은 아니나, 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량 ¾인 것이 바람직하다. 본 발명의 식품 조성물은 퓨코스테롤과 함께 미백 또는 보습 효과가 있는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 함께 흔합하여 제조될 수 있다. 본 발명의 퓨코스테를은 그 쨔체 ：또는 염 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로' ：사용될 '수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용 가능한 '이란 생리학적으로 허용되고 안간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반웅 또는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 것을 말하며， 상기 염으로는 약제학적으로 허용 가능한 유리산 ( free acid)에 의하여 형성된 산 부기염이 하람직하다: 상기 휴리^^로^ 유기신―과 :무기산을-자용할 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산， 젖산, 주석산， 말레인산, 푸마르산 포름산， 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산， 벤조산， 글루콘산， 메타술폰산， 글리콜산， 숙신산， 4-를루엔술폰산， 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브름산, 황산 및 인산을 포함한다.
한편, 상기 본 발명의 약학적 조성물은 상기 퓨코스테를을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 , 부형제 또는 회석제를 추가로 함유 할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스， 전분 , 셀를로스 유도체 , 마그네슘 스테아레이트 , 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물， 적합한 오일， 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 둥을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필- 파라벤 및 클로로부탄올이 '있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington ' s Pharmaceut i cal Sci ences , 19th ed . , Mack Publ i shing Com any , Easton , PA, 1995) .
본 발명의 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내， 근육내， 동맥내， 골수내, 경막내， 심장내, 경피， 피하， 복강내, 비강내， 장관， 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 본 발명의 약학 조상물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제， 환제， 당의정제, 캡술제， 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법올 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다흠 이흩 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과랍 흔합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로즈, 솔비를， 만니틀, 자일리를， 에리스리를 및 말티를 등을 포함하는 당류와 옥수수 쟌분, 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀를로즈， 메틸 셀를로즈, 나트륨 카르복시메틸셀를로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀를로즈 등을 포함하는 샐를로즈류， 젤라틴， 폴리비닐피를리돈 등과 같은 층전제가 포함될 수 있다.. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈， 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.
나아가， 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제， 윤활제 , 습윤제 , 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제， 외용연고제， 오일제, 보습제， 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 (Remington ' s Pharmaceut ical Science , 15th Edi t ion, 1975. Mack.
Publ i shing Company , East on, Pennsylvania 18042 , Chapter 87： Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (mul t iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 비경구 투여시는 상기 퓨코스테를을 기준으로 하루에 체중 1 kg 당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여시는 상기 퓨코스테롤을 기준으로 하루에 체중 1 kg 당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0, 1 내지 50 mg 의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수:있다. 그러나 상가:퓨코스테를의. 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 흿宁뿐만 ：이■니라 환자의 연령， 체중， ：건강 상태， 성별， : 질환의 중증도， 식이 및 배설율 등 다양한 요인블을 고려하여 환자에 대한 : 유효 투여량이: 결정되는： 것：이므로， 이러한; :점을 고려할 때 당 분야의 ,통상적인 지식을. 가진 자라면 기: 퓨코스테;를을 미백: 위한. 특정한 : : 용 £어 Γ따른 적 ¾¾ Ϋ ¥석량 :Λ ¾할
약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. [효과】
이상 살펴본 바와 같이， 본 발명의 퓨코스테를은 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제함으로써 탁월한 미백 효과가 있으므로 미백용 화장료 조성물， 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.
또한， 본 발명의 퓨코스테롤은 각질세포막을 형성하고 각질형성세포의 분화를 촉진하며 천연보습인자를 생성함으로써 탁월한 보습기능이 있으므로 보습용 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1 은 B16F10 멜라노마 세포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 세포 독성을 축정한 결과이다.
도 2 는 B16F10 멜라노마 세포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 멜라닌 생성 저해효과를 정량적으로 측정한 결과이다.
도 3 은 B16F10 멜라노마 세포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 멜라닌 생성 저해효과를 현미경으로 관측한 결과이다.
도 4 는 B16F10 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 티로시나제 활성 저해효과를 측정한 결과이다.
도 5 는 B16F10 멜라노마 세포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 티로시나제의 단백질 발현양 감소를 측정한 결과이다. 도 6 은 B16F10 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처;리에 따른 TRP-1 과 TRP-2와 단백질 발현양 김 ^를 측정한 결과이다 Ϊ .
도 : 7 은 B16F10.멜라노마 세포에서 .퓨코^테를 척리에 파른 MITF 와 mRNA 발현양 감소를 측정한 결과이다.
도 8 은 HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 각질세포막 형성 과를측정한 결과이다：싀 ■
도 9 는 HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 분화인자, 로리크린, 인볼루크린, 트랜스글로타미네이즈의 mRNA 발현양 증가를 측정한 결과이다.
도 10 은 HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 분화인자， 로리크린, 인볼루크린, 트랜스글로타미네이즈의 단백질 발현양 증가를 측정한 결과이다.
도 11 은 HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 필라그린과 카스파아제 14의 mRNA 발현양 증가를 측정한 결과이다.
도 12 는 HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 필라그린과 카스파아제 M의 단백질 발현양 증가를 측정한 결과이다.
【발명을 실시하가위한 구체적인 내용】
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이것들로만 한정되는 것은 아니다.
이하의 모든 시험 결과에 있어 활성 분석은 3 회 이상 반복 수행하였으며, 그 결과는 평균士표준편차로 표시하였다. 통계분석은 AN0VA 분석법 (Schef f test )을 사용하였으며 , *P 값이 0.05 이하인 경우나 ##P 값과 "P 값이 0.01 이하인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
[실시예 1] 퓨코스테를의 추출 및 분리정제
건조 뜸부기 500 g 을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 뜸부기 시료를 4배 용적의 n-핵산에 넣고 48 시간 상온에서 냉침 하여 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 (Whatman) 2 번 여과지로 여과하고， 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 약 15.0 g 의 뜸부기 n-핵산 추출물을 얻었다. n-헥산 가용 추출물 15 g 을 실리카겔 오픈컬럼 (70- 230mesh, Mer ck&Co . , Wh i t ehouse Stat i on , J, USA)에 적재하고 핵산 및 쎄틸 아세테이트의 흔합한 용매시스템을 이용하여 분취하였다. 상기 분취순서에 따라서 농도구배 S 40 개와 하부 분획물로 나눈 후， 그 중 10 번과 30 번 사이의 분획물에서 하기 화학식 1 의 화합물인 퓨코스테를을 …분리 (210 mg)하였다. ; 一
[화학식 1]
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[실시예 2] 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 안전성 효과 B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum)이 함유된 DMEM(dulbecco's modified eagle's media) 배지에서 배양한 후 24- 웰 플레이트 (24- well plat)에 2.5 x 104 cell/mL (최종 부피 lmL)으로 넣었다. 0.1， 1, 5, 10， 20μΜ 의 퓨코스테를을 B16F10 멜라노마 세포에 각각 처리하였다. 48 시간 처리 후, 배지를 제거하고 0.5mg/mL MTT 용액을 0.3mL 씩 각 웰에 넣은 후 배양기에서 4 시간 배양하였다. 4 시간 후， ΜΊΤ 용액을 제거하고 생성된 포르마잔 (formazan)을 DMSC dimetyl sulfoxide)를 첨가하여 용해시킨 후 570nm 에서 흡광도를 측정하였고， 그 결과를 도 1 에 나타냈다.
도 1 에 나타난 바와 같이, 퓨코스테를을 B16F10 멜라노마 세포에 처리한 결과 0~20μΜ농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
[실시예 3] 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 멜라닌 억제 효과 B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양한 후 6-웰 플레이트 (6-well plate)에 2 X 10 cell/mW 부피 3mL)으로 넣었다 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 200nM α-MSH 가 든 DMEM 배지에 녹 ¾1 퓨코스테롤을 각각 5， 10, 20 μ Μ 농도로 처리하였다. 72 시간 경과 후 6-웰 플레이트에서 배—양된 배지를 제거하고 0.25% 트립신- 에틸렌디아만사아세트산 (t i)sm EDTA : 액을 처리 ¾여: 세포 펠렛 (pel let)을 회수하고 1.5mL 튜브 (tube)로 옮겨 10,000rpm 으로 10 분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 얻어진 펠렛을 60°C에서 건조시킨 후 IN NaOH 100 uL 를 넣어 세포내 맬라닌을 녹였다. 이 용액올 PBS phosphate buffered saline)로 회석시킨 다음 ELISA 판독기 (Versa max, Sunnyvale, CA USA)로 405nm 에서 흡광도를 측정하여 시료 처리군의 멜라닌 함량을 구하였다. 이 때 퓨코스테롤을 첨가하지 않은 세포를 대조군으로 하였으며, 대조군과 퓨코스테롤을 처리한 세포의 멜라닌 생성 정도를 측정하였다. 하기 수학식 1 에 따라 대조군 대비 멜라닌 함량을 계산하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[수학식 1]
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도 2 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테를은 매우 우수한 멜라닌 생성 저해효과를 보였다 0*: p<o.oi).
[실시예 4] 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 멜라닌 생성 억제 효과 현미경 관측
B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양한 후 6—웰 플레이트에 2 X 105 cell/mL (최종 부피 3mL)으로 넣었다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 200nM α-MSH 가 든 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 각각 5， 20 μΜ 농도로 처리하였다. 72 시간 경과 후 6-웰 플레이트에서 배양된 배지를 제거하고 현미경 (Olympus 1X71 Model )을 이용해 B16F10 멜라노마 세포를 촬영하였으며 그 결과를 도 3에 나타냈다.
. 도 3 에 :나타낸 바와：같이 퓨코스테를은: a -MSH 으로 유도된 B16F10 멜돠노마 세포의 멜라닌 생성을 크게 저해하였다.
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[실시예 5] 델라노마 세 에서 퓨^스테롤 처리쎄 따른 티로시나제 활성 억제 효과
B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cel l/mL (최종 부피 3mL)으로 넣었다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 200nM a -MSH 가 든 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 각각 5 , 10， 20 μ Μ 농도로 처리하였다. 48 시간 경과 후 6-웰 플레이트에서 배양된 배지를 제거하고 1% 트리톤 X- XKTri ton X-100)이 함유된 PBS 를 첨가하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 10, 000rpm 으로 10 분간 원심 분리하였으며, 상등액 중 150 i L 을 96-웰 플레이트 (96-weU plate)에 넣고 L-도파 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine , L-D0PA) 50 u L 를 첨가하였다. 37°C에서 30 분간 배양한 후 생성된 도파크름와 양을 microplate reader (Versa max, Sunnyvale , CA, USA)를 이용하여 475 ran에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 퓨코스테롤을 첨가하지 않은 세포를 대조군으로 .하였으며 , 대조군과 퓨코스테를을 처리한 세포의 티로시나제 활성 정도를 측정하였다. 하기 수학식 2 에 따라 대조군 대비 티로시나제 활성올 계산하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
[수학식 2] 대조군 티로시나제 W 프 X珊 도 4 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테롤은 매우 우수한 티로시나제 저해효과를 보였다 (** : P<0.01) .
[실시예 6] 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 티로시나제 단백질 발현 감소 효과 B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배잉:한 후 6-웰 폴레아트에 : 2 X： 105 ceH/mL (최종 부파： 3mL)으로 넣었다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 200nM α -MSH ：가 든 DMEM 배지에 녹안 퓨코스테를을 각각 5 , 20 μ Μ 농도로 처리하였다. 24 시간 경과 후 세포를 proteinase inhibi tor cocktai l 이 포함된 NP40 완층용액으로 용해하였으며， 세포에서 추출한 '단백질 양을 브래^호드 (Bi0-Rad proe in assay dye reagent , Bradford) 시약을 이용하여 정량하였다. 정량된 단백질을 5 분간 끓인 후 10% SDS-PAGE 로 전기영동하여 분리하였으며, 분리된 단백질들을 니트로셀를로스 막 (ni trocel lular membrane)으로 전달하였다. 티로시나제의 1 차 항체를 2.5% 소혈청알부민 (bovine serum albumin)에 1 : 1000 의 비율로 회석하여 니트로셀를로스 막에 전달된 단백질과 20 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 1 차 항체를 반웅시킨 다음 TBST tr i s-buffer sal ine tween20)를 이용하여 니트로셀를로스 막을 10 분간 3 회 세척하였다. 세척 후， 1 차 항체를 인지하는 2 차 항체 (ant i-goat horseradish)를 2.5% 소혈청알부민에 1 : 5000 이 되도록 회석하여 니트로셀를로스 막과 2 시간 동안 상은에서 반웅시켰으며, TBST 를 이용하여 10 분씩 3 회에 걸쳐 세척하였다. Protein band 는 ECL western blott ing detect ion reagent s(Amer sham, Tokyo , Japan)를 사용하여 발색하였으며， G;B0X EF imaging system(Syngene, Cambridge, UK)을 이용하여. 발색된 protein band 를 확인하였다. 측정 결과 티로시나제의 단백질 발현을 확인하였으며, a -tubul in으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다.
도 5 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테롤은 B16F10 멜라노마 세포에서 멜라닌 생성 효소인 티로시나제의 단백질 발현을 감소시켰다. [실시예 7] 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 티로시나제 관련 TRP-1과 TRP-2의 단백질 발현 감소 효과
B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양 한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cel l/mL (최종 부피 3mL)으로 넣었다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 200nM α -MSH 가 든 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 각각 5， 20 μ Μ 농도로 처리하였다. 24 시간 경과 후 세포를 proteinase inhibi tor cocktai l 이 포함된 NP40 완층용액으로 용해하였으며, 세포에서 추출한 단백질 양을 브래드포드 시약을 용하여 정량하였다. 정량된 단백질을ᅵ 5 분간 끓인 후 10% SDS-PAGE 로 전기영동하여 분리하였으며, 분리된 단백질들을 니트로셀롤로스 깍으로 전달하였다. TRP- 1 과 TRP-2 의 1 차 항체를 2.5%소혈청알부민에 1:1000의 비율로 회석하여 니트로셀를로스 막에 전달된 단백질과 20 시간 동안 상온에서 반웅시켰다. 1 차 항체를 반웅시킨 다음 TBST 를'이용하여 나트로셀를로스' '막을 10 분간 3 회 세척하였다. 세척 후， 1 차 항체를 인지하는 2 차 항체 (anti-goat horseradish)를 2.5% 소혈청알부민에 1:5000 이 되도톡 회석하여 니트로셀를로스 막과 2 시간 동안 상온에서 반웅시켰으며， TBST를 이용하여 10 분씩 3 회에 걸쳐 세척하였다. Protein band 는 ECL western blotting detection reagent s (Amer sham , Tokyo , Japan)를 사용하여 발색하였으며, G;B0X EF imaging system(Syngene, Cambridge, UK)을 이용하여 발색된 protein band 를 확인하였다. 측정 결과 TRP-1 과 TRP-2 의 발현을 확인하였으며 , a-tubulin으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다.
도 6 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테롤은 B16F10 멜라노마 세포에서 멜라닌 생성 효소인 TRP-1과 TRP-2의 단백질 발현을 감소시켰다.
[실시예 8] 멜라노마 세포에서 퓨코스테를 처리쎄 따른 MITF 의 mRNA 발현 감소 효과
B16F10 멜라노마 세포를 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cell/mL (최종 부피 3mL)으로 넣었다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 200nM a-MSH 가 든 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 각각 5, 20μΜ 농도로 처리하였다. 24 시간 후에， TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA 를 분리하였다. 분리한 총 RNA 는 나노드랍 (nano—drop, ND-1000)을 이용하여 정량 하였다. 정량된 RNA 를 역전사효소 (reverse transcriptase)와 PCR 기계 (Applied biosystems, Foster city, CA, USA)를 이용하여 cDNA 로 합성한 후 다음의 특정 프라이머로 PCR을 수행하였다:
GAPDH
Forward primer: 5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC- 3' (서열번호 1)
Reverse primer: 5' -CCACCCGAGCCACATCGCTC- 3' (서열번호 2) MITF -
Forward primer: 5' -AGTCAACCTCTGAAGAGCA- 3' (서열번호 3)
Reverse primer: 5' -CGTGTTCATACCTGGGCACT- 3' (서열번호 4) PCR 결과 중폭된 cDNA 를 :1.51 agarose； gel 로 전기영동 하여 분리하였으며 G;B0X； EF ：： imaging ^ system(Syngene Cambridge UK)을 이용하여 cDNA band를 확인해 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테를은 B16F10 멜라노마 세포에서 티로시나제， TRP-l, TRP-2 의 단백질 발현을 조절하는 MITF 의 mRNA 양을 감소시켰다.
[실시예 9] HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 각질세포막 형성 효과
HaCaT 인간각질형성세포를 10 % 우태아 혈청 (fetal bovine serum)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cell/ml(최종 부피 3 ml)으로 넣는다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 각각 5, 10， 20 μΜ 농도로 처리하였다. 96 시간 배양 후 6-웰 플레이트에서 배양된 배지를 제거하고 세포의 펠렛 (pel let)을 회수하고 1.5 ml 튜브 (tube)로 옮겨 10,000rpm 으로 10 분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 얻어진 펠렛을 2% 소듐 도데실 설페이트 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)와 20mM 농도의 디티오트레이를 (Dithiothreitol, DTT)을 함유한 트리스 완층용액을 가하여 보일링하여 주었고 340nm 에서 흡광도를 측정하여 각질세포막 형성 효과를 평가하였다. 하기 수학식 1 에 따라 대조군 대비 각질세포막의 형성 정도를 계산하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
Figure imgf000021_0001
도 8 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테를은 각질세포막 형성효과가 우수하여 보습효과가 우수함을 알 수 있다 (*: <0.05).
[실시예 10] HaCaT 인간각질형성 쎄포에서 퓨코스테롤 처리에 따른 로리크린， 인볼루크린， 트랜스글루타미네이즈의 mRNA 발현 증가 효과
HaCaT 인간각질형성 세포를 10 % ;우태아 혈청 (fetal bovine serum)아 함유된 DMEMCDulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cell/ml (최종 부피 3 ml)으로 넣는다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 각각 5, 10, 20 μΜ 농도로 처리하였다. 24 시간 경과 후 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA 를 수확하여 역전사 시킨 후, RT-PCR( reverse transcript ion一 polymerase chain reaction) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA 를 역전사 효소 (reverse transcriptase)로 역전사 시켰다. RT-PCR 은 다음의 특정 프라이머로 수행하여 그 결과를 도 9에 나타내었다:
GAPDH
Forward primer: 5 -TGACCTTGGCCAGGGGTGCT- 3' (서열번호 5)
Reverse primer: 5 -CCACCCGAGCCACATCGCTC- 3' (서열번호 6) 로리크린
Forward primer： 5 -GGGTACCACGGAGGCGAAGGA- 3' (서열번호 7)
Reverse primer： 5 -ACTGAGGCACTGGGGTTGGGA- 3' (서열번호 8) 인볼루크린
Forward primer： 5 -GGGGCAGCTGAAGCACCTGG- 3' (서열번호 9)
Reverse primer： 5 -GAGACGGGCCACCTAGCGGA - 3' (서열번호 10) 트랜스글루타미네이즈
Forward primer: 5' CTTCCGTCTGCGCACCCCAG-3' (서열번호 11)
Reverse primer: 5' -AGGCACAAACGACTGGCGCA- 3' (서열번호 12) 도 9 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테를 처리에 따라 HaCaT 인간각질형성 세포에서 로리크린, 인볼루크린， 트랜스글루타미네이즈의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 퓨코스테를은 각질형성세포에서 분화를촉진함으로써 보습효과가 우수함을 알 수 있다 (*: p<0.05, **： p<0.01). .
[실시예 11] HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 로리크란， 인볼루크린， 트랜스글루타미네이즈와 단백질 발현 증가 효과
aCaT 인간각질형성 세포를— 10 우태아 혈청 (fe ar bovine s ruiii)이' 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cell/ml (최종 부피 3 ml)으로 넣는다. 24 시간 배양한 후 배지를'제거하고 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 각각 5, 10, 20 μΜ 농도로 처리하였다. 24 시간 경과 후 HaCaT 인간각질 세포를 proteinase inhibitor cocktail 이 포함된 NP40 완층용액으로 용해시켰다. HaCaT 인간각질 세포에서 추출한 단백질 양은 브래드포드 (Bradford)법을 이용하여 정량하였다. 상기시료를 5 분간 끓인 후， 동량의 단백질 (20 g)을 10% SDS- PAGE 로 전기영동하여 분리하였다. 전기영동 후 분리된 단백질들을 니트로셀를로스 막으로 전달하고 웨스턴 블롯 (western blot)을 수행하였다.
1 차 항체에 반웅시킨 다음 TBSTCTris-buffer Saline Tween20)를 이용하여 10 분간 3 회 세척하였다. 이때， 본 발명에서 사용된 1 차 항쎄의 종류와 회석률은 1:1000 이다. 2 차 항체반응은 상기 1 차 항체반응을 수행한 막에
2 차 항체를 넣고 상온에서 2 시간 동안 반웅하였다. 이때 2 차 항체의 회석률은 1:5000 으로 하였다. Protein band 는 ECL western blotting detect ion reagent s ( Amer sham , Tokyo , Japan)를 사용하여 발색하였다. 로리크린， 인볼루크린， 트랜스글루타미네이즈의 단백질 발현을 확인하였으며， a-tubulin으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다.
도 10 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테를 처리에 따라 HaCaT 인간각질 세포에서 로리크린, 인볼루크린， 트랜스글루타미네이즈의 단백질 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 퓨코스테를은 인각각질형성세포에서 분화를 촉진함으로써 보습기능이 우수함을 알 수 있다.
[실시예 12] HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 필라그린과 카스파아제 14의 mRNA 발현 증가 효과 HaCaT 인간각질형성 세포를 10 % 우태아 혈청 (fetal bovine serum)아 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지쎄서 배양한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cell/mi (최종 부피 3 ml)으로 넣는다 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테롤을 각각 5， 10， 2 μΜ 농도로 처리하였다. 24시간 경과 후 TRIzol 시꺅 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 자용하여 총 RNA 를 수확하여 역전사 시킨 후， RT-PCR( reverse transcript ion一： polymerase chain reaction) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 cDNA 합성을 위해 상기 RNA 를 역전사 효소 (reverse transcriptase)로 역전사 시켰다. RT-PCR 은 다음의 특정 프라이머로 수행하여 그 결과를 도 11에 나타내었다:
GAPDH
Forward primer： 5 -TGACCTTGGCCAGGGGTGCT- 3' (서열번호 5)
Reverse primer： 5 -CCACCCGAGCCACATCGCTC- 3' (서열번호 6) 필라그린
Forward primer： 5 -AGTGCACTCAGGGGGCTCACA- 3' (서열번호 13)
Reverse primer： 5 -CCGGC1TGGCCGTAATGTGT- 3' (서열번호 14) 카스파아제 14
Forward primer： 5 -CGGGACTCACAACCAAAGGA-3' (서열번호 15)
Reverse primer： 5： -GGGTCCCTTTGTTCTCCTCG- 3' (서열번호 16) 도 11 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테를 처리에 따라 HaCaT 인간각질형성 세포에서 필라그린， 카스파아제 14 의 mRNA 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 퓨코스테를은 각질형성세포에서 필라그린과 카스파아제 14 발현양 증가를 통해 천연보습인자를 생성함으로써 보습효과가 우수함을 알 수 있다 (*: p<0.05, **: p<0.01).
[실시예 13] HaCaT 인간각질형성 세포에서 퓨코스테를 처리에 따른 필라그린과 카스파아제 14의 단백질 발현 증가 효과
HaCaT 인간각질형성 세포를 10 % 우태아 혈청 (fetal bovine serum)이 함유된 DMEKDulbecco's Modified Eagle's Media) 배지에서 배양한 후 6-웰 플레이트에 2 X 105 cell/ml (최종 부피 3 ml)으로 넣는다. 24 시간 배양한 후 배지를 제거하고 DMEM 배지에 녹인 퓨코스테를을 긱 "각 5, 10， 20 μ Μ 농도로 처리하였다. 24 시갚 경과 후 HaCaT .인간긱 "질 세포를 proteinase inhibitor cocktai l 아 포함된 M O 완층용액으로 용해시켰다. HaCaT 인간각질 세포에서 추출한 단백질 양은 브래드포드 (Bradford)법을 이용하여 정량하였다. 상기시료 # 5 분간 끓인 후, 동량의 단백질 (20 g)을 1 SDS- : PAGE 로 전기영동하여 : : :분리하였다 : 기 동 Λ¥ : ¥리된 단백 ¾¾¾： 니트로셀를로스 막으로 전달하고 웨스턴 블롯 (western blot )을 수행하였다.
1 차 항체에 반응시킨 다음 TBSKTri s-buf fer Sal ine Tween20)를 이용하여 10 분간 3 회 세척하였다. 이때， 본 발명에서 사용된 1 차 항체의 종류와 회석률은 1 : 1000 이다. 2 차 항체반웅은 상기 1 차 항체반웅을 수행한 막에
2 차 항체를 넣고 상온에서 2 시간 동안 반웅하였다. 이때 2 차 항체의 회석률은 1 : 5000 으로 하였다. Protein band 는 ECL western blott ing detect ion reagent s(Amer sham, Tokyo , Japan)를' 사용하여' 발색하였다. 필라그린， 카스파아제 14 의 단백질 발현을 확인하였으며， a- ibul in 으로 단백질 로딩량이 일정함을 나타내었다.
도 12 에 나타낸 바와 같이 퓨코스테를 처리에 따라 HaCaT 인간각질형성 세포에서 필라그린, 카스파아제 14 의 단백질 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 퓨코스테롤은 각질형성세포에서 필라그린과 카스파아제 14 발현양 증가를 통해 천연보습인자를 생성함으로써 보습효과가 우수함을 알 수 있다. 본 발명에 따른 퓨코스테롤을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료의 제형예를 설명하나， 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 구체적으로 설명하고자 함이다. 상기 피부 미백 효과가 우수한 퓨코스테를을 가지고 하기와 같은 조성성분 및 조성비에 따라 제형예 1 내지 6의 피부 미백용 화장료 조성물을 통상적인 방법에 따라서 제조하였다.
<제형예 1 - 화장품〉
<1-1> 영양화장수 (밀크로션)
상기 <실시예 1>의 퓨코스테롤을 하기 표 1 의 영양화장수 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 영양화장수를 제조하였다. 【표 1]
Figure imgf000026_0001
<1-2>유연화장수 (스킨로션)
상기 <실시예 1>의 퓨코스테롤을 하기 표 2 의 유연화장수 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 유연화장수를 제조하였다.
【표 2]
Figure imgf000026_0002
프로필렌글리콜 2.0 .
카르복시비닐폴리머： ； ： 0. 1
PEG 12 노닐페닐에테르 ： 0.2
폴리솔베이트 80 - 0.4 . :
에탄올 10.0
트리에탄을아민 '0；1 "
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 to 100
<1-3> 영양크림
상기 <실시예 1>의 퓨코스테를을 하기 표 3 의 영양크림 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 영양크림을 제조하였다.
【표 3]
Figure imgf000027_0001
to 100
<l-4>마사지크림 ： .
상기 〈실시예 Ί>의 .퓨코스테롤을 하기 표 . 4 의 마사지크림 제형 비휼대로 하석 통장적 'ᅳ빙법에 :r£하^사지 ¾¾
【표 4]
Figure imgf000028_0001
<ι-5> ^
상기 <실시예 1>의 퓨코스테를을 하기 표 5의 팩 제형 비을대로 하여 통상적인 방법에 따라 팩을 제조하였다. 【표 5】
Figure imgf000029_0001
<1-6> 젤
상기 <실시예 1>의 퓨코스테를을 하기 표 6 의 젤 제형 바율대로 하여 통상적인 방법에 따라 젤을 제조하였다.
【표 6】
Figure imgf000029_0002
정제수 to 100
<제형예 2 - 식품〉 .
<2-1> 건강식훔의 제조
상기 <실시예 1>의 퓨코스테를 1000 mg, 비타민 A 아세테이트 70 ug, 비타민 E 1.0 mg , 비타민 B1 0. 13 mg， 비타 ¾ B2 0. 15 mg， 비타민 B6 () .5 mg, 비타민 B12 0.2 ug, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 ug, 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 ug, 판토텐산 칼슘 0.5 mg, 황산제 1 철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제 1인산칼륨 15 mg, 제 2인산칼슘 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg 를 흔합하여 제조할 수 있으며， 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며， 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음， 과립을 제조하고， 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<2-2> 건강음료의 제조
상기 <실시예 1>의 퓨코스테롤 1000 mg, 구연산 1000 mg, 을리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 에 정제수를 가하여 전체 900mL 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음, 약 1 시간동안 85 에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 껴과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강음료 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<2-3>츄잉껌
껌 베이스 20 중량 ¾>, 설탕 76.9 중량 %， 향료 1 중량 % 및 물 2 증량 % 와 상기 <실시예 1>의 퓨코스테를 0. 1 중량 %를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.
<2-4> 캔디
설탕 60 중량 %， 물엿 39.8 중량 ¾> 및 향료 0. 1 중량 ¾>와 상기 <실시예 1>의 퓨코스테를 0. 1 증량 ¾»를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다. <2-5> 비스켓
박력 1 급 25.59 중량 %， 중력 1 급 22.22 중량 ¾, 정백당 4.80 중량 ¾>， 식염 0.73 중량 %, 포도당 0.78 중량%， 팜쇼트닝 11.78 중량 ¾，： 암모늄 ύ .54 중량 %， 증조 0. 17 증량 중아황산나트륨 0. 16 중량 #가루 1.45 중량 %, 비타민 Β 0.0001 중량)， 밀크향 0.04 중량 >， 물 20.6998 증량 %, 전지분유 — 1. 16 중량 %, 대용 ¥휴 0 : 29 층량 ¾;^제 인산칼 0 : 03 증
중량 % 및 분무유 7.27 증량 %와 상기 <실시예 1>의 퓨코스테를 중량 %를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다. 〈제형예 3 - 의약품〉
<3-1>산제
상기 <실시예 1>의 퓨코스테를 50 mg, 결정셀를로오즈 2 g 을 흔합한 후 통상의 산제 제조방법에 따라서 기밀포에 층진하여 산제를 제조하였다. <3-2> 정제
상기 <실시예 ^의 퓨코스테를 50 mg , 결정셀를로오즈 400 mg, 스테아린산 마그네슘 5 mg 을 흔합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다. <3-3> 캡슐제
상기 <실시예 1>의 퓨코스테를 30 mg, 유청단백질 100 mg, 결정셀를로오즈 400 mg, 스테아린산 마그네슘 6 mg 을 흔합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡술에 층전하여 캡슐제를 제조하였다. <3-4>주사제
통상의 주사제 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH 를 약 7.5 로 조절한 다음 상기 <실시예 1>의 퓨코스테를 100 mg , 주사용 증류수， pH 조절제를 혼합하여 2mL 용량의 앰플에 층진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다.
【산업상 이용가능성】 상기 화학식 1 의 퓨코스테를은 멜라닌 생성 및 티로시나제 활성을 억제함으로써 탁월한 머백 효과가 있어, 미백용 화장료 조성물， 식품 조성물 또는 약학적 조성물을 제 ：할 수 있으 S로 산업상 이용가능성이 또한， 상기 화학식 1 의 퓨코스테롤은 각질세포믹"형성， 각질형성 포 분화 촉^ 및 ：천연보^인 ;자를 생 함으로쪄 ;탁월한 기 ¥이 :있 보습용 화장료 조성물， 식품 조성물 또는 약학적 조성물을 제조 할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

Figure imgf000033_0001
【청구항 2】
하기의 화학식 1 로 표시되는 퓨코스테를을 유효성분으로 피부 미백용 식품 조성물.
1]
Figure imgf000033_0002
【청구항 3]
하기의 화학식 1 로 표시되는 퓨코스테를을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 약학적 조성물,
1]
Figure imgf000033_0003
스테: :유호성분으로 함유하는
Figure imgf000034_0001
【청구항 5】
하기의 화학식 1 로 표시되는 퓨코스테를을 유효성분으로 피부 보습용 식품 조성물.
Figure imgf000034_0002
【청구항 6】
하기의 화학식 1 로 표시되는 퓨코스테를을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 약학적 조성물.
[화학식 1]
Figure imgf000035_0001
【청구항 7】
유효성분으로서 하기의 화학식 1 로 표시되는 퓨코스테를을 포함하는 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태 (skin condition) 개선 방법으로 상기 피부 상태 개선은 피부 미백 또는 피부 보습인 것을 특징으로 하는 방법.
[화학식 1]
Figure imgf000035_0002
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